药典2000版一部P55记载：升麻为毛茛科植物大三叶升麻Cimicifuga heracleifolia Kom.\兴安升麻Cimicifuga dahurica(Turcz.)Maxim.\ 或升麻Cimicifu foetida L.的干燥根茎。秋季采挖。性味与归经：辛、微 甘，微寒。归肺、胃、大肠经。功能与主治：发表透疹，清热解毒，升举阳 气。用于风热头痛，齿痛，口疮，咽喉肿痛，麻疹不透，阳毒发斑；脱肛， 子宫脱垂。用法与用量：3-9克。
乙型肝炎又称为血清性肝炎、乙型病毒性肝炎(简称乙肝)，是由乙型 肝炎病毒(HBV)引起的、以肝脏炎性病变为主并可引起多器官损害的一种 传染病。通过血液与体液传播，具有慢性携带状态。中国是乙型肝炎最流行 的国家，人群感染率高，在某些地区感染率达到35％以上，是当前危害人民健 康最严重的传染病.我国HBsAg携带人口在1亿以上，占全世界HBsAg携带 人口的50％。根据我国肝炎调查结果，估计我国乙肝病人约有2700万人，每 年新发病人约有900万。
乙肝临床表现多样化，易发展为慢性肝炎和肝硬化，少数病人可转化为 原发性肝癌.肝纤维化是诸多慢性肝病发展为肝硬化过程的共有病理变化， 而慢性、持续性肝损伤是肝纤维化形成的前提。造成肝损伤的因素很多，一 般因药物、大量酒精、过敏等造成急性肝损伤，乙肝、肝硬化、长服某些药 物等可导致急慢性肝损伤。
目前市场上用于乙肝的药物中，干扰素是首选药，是国内外公认的较为 有效的抗病毒药物。由于机体对干扰素的反应存在较大个体差异，不少研究 结果表明，欧美国家患者疗效较佳，而东方(如中国、日本)患者疗效较差， 大多数患者在干扰素治疗期间均有不同程度的副作用。另核苷类药物具改善 肝组织学病变和肝功能的作用，其安全性和耐受性较好，但在长期应用过程 中出现病毒基因的变异，从而降低对药物的敏感产生耐药现象，停药以后发 病率相当高。
我国中药治疗乙肝的疗效已被大量的临床所证实，中药在抗病毒、降低 转氨酶、调整机体免疫力、保护肝细胞等方面都可发挥较好的疗效，但是目 前上市药物多为中药复方制剂，本发明治疗乙肝的药物为单味中药提取物制 剂，副作用小，同时具有多方面的药理作用。

本发明的一个目的在于公开升麻有机酸的提取方法；本发明的另一个目 的在于公开升麻有机酸抗乙肝病毒，预防和治疗乙型肝炎的新用途。
本发明目的是通过如下技术方案实现的：
A：脂溶性有机酸：取升麻药材1000重量份，加70-80％乙醇使液面漫过 药材，浸泡0-16小时后加热回流2-4次，每次6000-8000体积份，过滤； 滤液浓缩、干燥，得提取物100-140重量份；取该提取物25-35重量份，以 600-1000体积份50-70℃蒸馏水分2-6次将其溶解并转移到分液装置中，加 入5-10体积份28-37％盐酸并搅拌均匀；以醋酸乙酯萃取2-6次，每次200-500 体积份，合并上层相溶液；上层相溶液以2-6％氢氧化钠溶液200-600体积份 萃取2-5次，取下层碱液；下层碱液以28-37％盐酸溶液调节pH至2-3后， 每次200-500体积份的醋酸乙酯萃取，萃取2-6次；合并上层相溶液，以蒸 馏水洗涤，每次50-200体积份，直至最后的蒸馏水洗出液呈pH4-6；该有 机层相溶液除去醋酸乙酯后得到升麻脂溶性有机酸3-6重量份；
B：水溶性有机酸：取升麻药材1000重量份，加蒸馏水5000-8000体积 份，加热煮沸1-4次，每次保持5000-8000体积份，沸腾1-3小时；沸腾期 间经常增补蒸馏水以保持水的用量不少；过滤，取滤液，浓缩到800-1200 体积份，放冷后，加入2000-4000体积份的90-100％乙醇，边加边搅拌使混 合均匀，静置8-48小时，以1500-4000rpm离心10-50分钟，倾出滤液；滤 液回收乙醇至无醇味，加蒸馏水调节体积到800-1200体积份；取该提取液， 通过已预处理过的阳离子交换树脂柱，以蒸馏水洗脱，收集流出液直至流出 液呈pH6-7为止；此流出液全部通过已预处理过的阴离子交换树脂柱，以 蒸馏水洗脱，待流出液呈pH8-7后，改用0.3-0.7N盐酸溶液洗脱，并开始 收集流出液直至流出液呈pH1-2时为止；该流出液经减压蒸干后，加入 10-100体积份蒸馏水并减压蒸干，反复加蒸馏水并反复蒸干，直至最后产物 呈pH4-6为止，即得水溶性有机酸5-15重量份。
本发明所称的升麻有机酸是指由上述方法所得的脂溶性有机酸和(或) 水溶性有机酸。本发明的升麻有机酸加上药剂学接受的辅料制成临床可接受 的各种剂型，如片剂、胶囊、颗粒剂、注射剂、冻干粉针剂、皮下给药制剂、 栓剂等剂型。
本发明中重量份/体积份与克/毫升相对应。
升麻有机酸经药理作用研究，证明具有良好的抗乙肝病毒作用，可缓解 乙肝的进一步发展。升麻有机酸制成的药物具有比较显著的对抗乙肝病毒、 保护肝功能作用。以下实验例的药效学研究用于进一步说明但不限于本发明 的新用途。
药效学研究
实验例1：体外对乙型肝炎病毒的抑制作用试验
受试药物：升麻有机酸(脂溶性有机酸、水溶性有机酸)由中国中医 研究院中药研究所提供。体外实验前用高纯水配制成10mg/ml的母液， 过滤除菌，4℃保存备用。2.2.15细胞：乙型肝炎病毒DNA克隆转染的 人肝癌细胞(Hep-G2)的2.2.15系，由北京大学第一附属医院病毒室 提供。试剂：乙型肝炎表面抗原检测试剂盒、乙型肝炎e抗原检测试剂 盒，为华美生物工程公司产品；乙型肝炎病毒DNA荧光定量PCR检测试 剂盒安达基因诊断中心产品，G418；Engls培养液，日本产品。酶标仪 750，Bayer公司产品；ABI5700荧光定量PCR仪。阳性对照药：拉米呋 啶，葛兰史克制药有限公司产品实验前用高纯水配成20mg/ml的原药 液，过滤消毒备用。
对2.2.15细胞培养系分泌HBsAg、HBeAg的影响
取已长成单层细胞的2.2.15细胞培养板(24孔)，倒掉培养液， 加入无毒浓度以下相应稀释度的药液，浓度分别为：0.625、0.312、0.156 和0.078mg/ml，1ml/孔，每个稀释度做6个复孔，同时设拉米呋啶对 照药及细胞对照。置37℃5％CO2培养箱中培养，第8天收集上清， 二批实验所收集的上清同时测定HBsAg、HBeAg。采用酶联免疫吸附方 法测定，计算抑制率。
结果显示：对2.2.15细胞分泌HBsAg，在二批实验中升麻提取物所试的 4个剂量均有明显的抑制作用，与对照组比较有显著性差异(P＜0.01>，且 呈现良好的量效相关性。阳性对照药拉米呋啶对2.2.15细胞分泌HBsAg无 抑制作用。结果见表1。
对2.2.15细胞分泌HBeAg，在二批实验中升麻提取物所试的4个剂量 均有明显的抑制作用，第一批实验组与对照组比较有显著性差异(P ＜0.05>，第二批实验由于个别对照空细胞生长状态差抑制率较低，统 计学无意义。阳性对照药拉米呋啶对2.2.15细胞分泌HBeAg无抑制作 用。结果见表2。
                                          表1升麻提取物对2.2.15培养细胞分泌HBsAg的影响 批 次  药物       指标                                       不同浓度药物的细胞病变(CPE)                            625(ug/ml)    312(ug/ml)    156(ug/ml)    78(ug/ml)    16(ug/ml)    7.8(ug/ml)    3.9(ug/ml) 第 一 批  脂溶性     OD值           0.25±0.06**  0.84±0.09**  1.00±0.09*   0.90±0.04**             抑制率％       72.00         32.47         19.53         27.86  拉米呋啶   OD值                                                     0.20±0.05   0.14±0.01   0.13±0.02    0.12±0.06             抑制率％                                                 -39.97       0.36         12.58         13.81  细胞对照                  1.25±0.17                                0.14±0.06 第 二 批  脂溶性     OD值           1.33±0.23**  1.59±047**   2.05±0.29**  2.22±0.18**             抑制率％       50.06         40.24         23.32         17.01  拉米呋啶   OD值                                                     0.15±0.03   0.17±0.04   0.10±0.02    0.08±0.03             抑制率％                                                 -3.89        -16.89       28.83         41.38  细胞对照                  2.67±0.28                                0.14±0.06  水溶性                    7.8(ug/ml)    3.9(ug/ml)    1.95(ug/ml)   0.98(ug/ml)             OD值           0.08±0.00**  0.10±0.04**  0.09±0.03**  0.09±0.01**             抑制率％       64            54.8          62.27         61.79  细胞对照                  0.24±0.07
与细胞对照组比较：**P＜0.01  *P＜0.05
表中结果显示：在二批实验中升麻提取物所试的4个剂量对2.2.15细胞分泌HBsAg均有明显的抑制作用， 与对照组比较有显著性差异(P＜0.01>，且呈现良好的量效相关性。阳性对照药拉米呋啶对2.2.15细胞分泌 HBsAg无抑制作用。
                              表2升麻提取物对2.2.15培养细胞分泌HBeAg的影响     批     次                                 不同浓度药物的细胞病变(CPE) 药物      指标      625(ug/ml)   312(ug/ml)   156(ug/ml)   78(ug/ml)   16(ug/ml)  7.8(ug/ml)  3.9(ug/ml)     第     一     批 脂溶性    OD值      0.26±0.13*  0.45±0.10   0.43±0.23   0.25±0.09**           抑制率％  57.14        27.89        30.96        59.33 拉米呋啶  OD值                                             0.50±0.11  0.37±0.11 0.36±0.12  0.27±0.08           抑制率％                                         19.83       39.70      41.18       55.34 细胞对照            0.62±0.16                             0.62±0.16     第     二     批 脂溶性    OD值      0.27±0.13   0.34±0.04   0.35±0.09   0.37±0.12           抑制率％  39.00        25.43        23.19        18.10 拉米呋啶  OD值                                             0.47±0.12  0.48±0.15 0.36±0.06  0.28±0.15           抑制率％                                         -3.28       -7.00      19.14       37.85 细胞对照            0.45±0.18                             0.45±0.18 水溶性              7.8(ug/ml)   3.9(ug/ml)   1.95(ug/ml)  0.98(ug/ml)           OD值      0.59±0.16** 0.21±0.58** 0.81±0.31** 0.69±0.23**           抑制率％  61.38        21.18        47.13        54.60 细胞对照            1.53±0.48
与细胞对照组比较：**P＜0.01  *P＜0.05
表中结果显示：在二批实验中升麻提取物所试的4个剂量对2.2.15细胞分泌HBeAg均有明显的抑制作用， 第一批实验组与对照组比较有显著性差异(P＜0.05>，第二批实验由于个别对照空细胞生长状态差抑制率较 第，统计学无意义。阳性对照药拉米呋啶对2.2.15细胞分泌HBeAg无抑制作用。
实验例2：升麻提取物抗鸭乙型肝炎病毒的药效学试验
受试药物：升麻有机酸(脂溶性有机酸、水溶性有机酸)，由中国中 医研究院中药研究所提供，棕色粉末，用2号胶囊包装3mg～12mg/粒 胶囊。阳性对照药物：拉米呋啶，葛兰素威康英国行动有限公司生产， 压碎后自制成5mg/粒的胶囊。动物：采用健康成年的重庆麻鸭产的蛋 孵化的1日龄雏鸭，经腹腔接种0.1mlDHBV DNA阳性病毒血清。接种1 周后，分别颈外静脉抽血，用地高辛标记的DHBV DNA探针经斑点杂交 检测筛选出感染阳性鸭，饲养至2周龄作为实验动物。
试验方法：
将感染阳性鸭55只随机分为5组：病毒对照组(11只)：用淀粉 胶囊，每日口腔灌喂1次，剂量为500mg/只。阳性药物对照组(12只)： 用拉米夫定胶囊，每日口腔灌喂1次，剂量为50mg.Kg-1.D-1。提取物小剂 量组(10只)：每日口腔灌喂1次，剂量为60mg.Kg-1.D-1。提取物大剂 量组(12只)：每日口腔灌喂1次，剂量为120mg.Kg-1.D-1。
实验用药时间为28天，停药观察7天。观察指标如下：
血清DHBV DNA改变情况：
于用药前、用药7天、14天、21天、28天、停药7天分别颈外静 脉抽血，分离血清于-20℃保存待检。采用斑点杂交法，用罗氏公司的地 高辛标记试剂盒制备DHBV DNA探针统一检测，用Vuego Scan(Brisa-620ST)扫描仪进行膜片扫描；用the Discovery Series Quantity One软件对斑点进行定量分析，斑点值为volume (volume＝intensity×mm2)。统计学采用spss软件，配对t检验。
血清DHBsAg改变情况：于用药前、用药7天、14天、21天、28 天、停药7天分别颈外静脉抽血，分离血清于-20℃保存待检。将用药前 后的血清统一对比检测，采用ELISA快速法、酶标阅读仪(Bio-TEK公 司)490nm读取O.D值。统计学采用spss软件，配对t检验。
各组用药前、中、后血清DHBsAg O.D值改变情况：
随着时间的推移，各组DHBsAg O.D值呈现下降趋势，经统计学比较病 毒对照组血清DHBsAg O.D值的改变无统计学意义；而拉米呋啶组及提 取物各剂量组不同用药时间均出现血清DHBsAg O.D值明显降低 (P＜0.01)，至停药7天血清DHBsAg O.D值用药前比较仍有持续降低 (P＜0.01)。结果见表3：
                                         表3各组用药前后血清DHBsAgO.D值改变情况( X±S)     组别              用药前             用药7天             用药14天            用药21天            用药28天            停药7天     病毒对照组        0.503±0.423       0.595±0.540        0.556±0.472        0.438±0.338        0.331±0.281        0.232±0.137     拉米夫定组        0.479±0.278       0.392±0.196        0.425±0.194        0.272±0.130**      0.213±0.097**      0.161±0.072**     脂溶性大剂量      0.896±0.623       0.842±0.508        0.891±0.750        0.769±0.381        0.597±0.198**      0.491±0.353**     小剂量            1.583±0.748       1.008±0.3200**     0.8710±0.560**     0.806±0.54**       0.7258±0.577**     0.356±0.364**     水溶性大剂量      0.996±0.265       0.833±0.604        0.567±0.464**      0.445±0.679**      0.441±0.311**      0.302±0.129**
注：上表所列为各组DHBsAgO.D值平均数及标准差，统计学采用配 对t检验。(″*″：P＜0.05，″*″：P＜0.01)，为不同时间DHBsAgO.D值与同 组用药前DHBsAg0.D值的比较
用药前、中、后血清DHBV DNA滴度改变情况：
病毒对照组用药前后血清DHBV DNA滴度无明显降低，并呈现轻微 上升趋势。拉米夫定组用药7天后开始出现血清DHBV DNA滴度降低 (P＜0.01)，停药后有DHBV DNA回升现象。提取物各剂量组分别于用 药14天开始出现血清DHBV DNA滴度降低(P＜0.05、P＜0.01)，停药后 DHBV DNA回升现象不明显；结果见表4：
                                       表4升麻提取物用药前后血清DHBV DNA滴度变化( X±S)                                                            DHBV DNA(volume) 组别         用药前             用药7天            用药14天             用药21天             用药28天             停药7天              1167.01±208.39    1184.44±282.22    1233.14±262.75      1272.21±260.11      1241.69±249.30      1347.79±236.66 病毒对照组              1092.79±256.75    908.20±221.82**   947.99±317.20*      920.43±161.61**     931.59±97.63*       1207.23±247.09 拉米夫定组   1229.65±146.82    1163.37±264.28    1098.57±247.97*     1011.17±222.00*     1042.86±134.81**    1037.36±121.14* 小剂量       1161.08±158.85    867.44±82.73**    844.16±121.07**     798.18±78.86**      722.94±112.37**     770.48±133.12** 脂溶性大剂量 1545.27±183.92    1270.02±222.10    1200.65±124.54**    1034.64±254.77**    1009.86±213.21**    980.06±75.14 小剂量       1451.08±144.85    1356.44±81.72     1025.16±103.07**    912.18±98.86**      900.94±122.37**     900.48±183.22**
注：上表所列为各组DNA斑点volume值的平均数及标准差，统计学采用配对t检验(″*″：P＜0.05： ″**″：P＜0.01)，为不同时间DNA斑点值与同组用药前DNA斑点值的比较。
实施例1：升麻脂溶性有机酸的制备
取升麻药材1000克，加75％乙醇使液面漫过药材，浸泡5小时后加热回 流2次，每次6500毫升，过滤，取滤液。浓缩，干燥，得提取物120克。取 该提取物30.0克，以850毫升60℃蒸馏水分4次将之尽可能溶解并转移到 2000毫升分液漏斗中，加入8毫升36％盐酸并搅拌均匀。以醋酸乙酯萃取5 次，每次300毫升，合并上层相溶液。上层相溶液以3％氢氧化钠溶液500 毫升、400毫升和300毫升共萃取3次。合并下层碱液，以36％盐酸调节pH 至2-3后，以醋酸乙酯萃取4次，每次350毫升。合并澄清的上层相溶液， 以蒸馏水反复洗涤，每次140毫升，直至最后的蒸馏水洗出液呈pH4-5。该 有机层相溶液经除去醋酸乙酯后得到脂溶性有机酸4.6克，收率1.84％。
实施例2：升麻水溶性有机酸的制备
取升麻药材1000克，加6000毫升蒸馏水，加热煮沸2小时。沸腾期间 经常增补蒸馏水以保持水的用量不少。过滤，取滤液。药渣加5000毫升蒸 馏水进行第二次加热煮沸2小时，过滤，取滤液。合并滤液，浓缩到1000 毫升，慢慢加入2.8倍体积(2800毫升)的95％乙醇，边加边搅拌使混合均 匀，静置16小时，以3000rpm离心20分钟，取滤液。该滤液经减压回收乙 醇至无醇味，加蒸馏水调节体积到1000毫升。取该提取液600毫升，通过 已预处理过的732型强酸性阳离子交换树脂柱(H型)，以蒸馏水洗脱，收集 流出液直至流出液呈pH中性为止，共收集流出液约5000毫升。此流出液全 部通过已预处理过的717型强碱性阴离子交换树脂柱(OH型)，以蒸馏水洗 脱，待流出液呈pH中性后，改用0.5N盐酸溶液洗脱，并开始收集流出液直 至流出液呈pH1-2时为止。该流出液经减压蒸干后，加入少量蒸馏水并减 压蒸干，反复加蒸馏水并反复蒸干，直至最后产物呈pH4-5为止，即得水溶 性有机酸5.7克，得率0.95％。
实施例3：升麻脂溶性有机酸的制备
取升麻药材1000kg，加75％乙醇使液面漫过药材，浸泡5小时后加热回 流3次，每次7000升，过滤；滤液浓缩，干燥，得提取物110kg；取该提取 物30kg，以800升60℃蒸馏水分3次将其溶解并转移到分液装置中，加入 9.6升30％盐酸并搅拌均匀；以醋酸乙酯萃取4次，每次300升，合并上层 相溶液；上层相溶液以3％氢氧化钠溶液300升萃取5次，取下层碱液；下层 碱液以30％盐酸调节pH至2-3后，每次300升的醋酸乙酯萃取，共萃取3 次；合并上层相溶液，以蒸馏水反复洗涤，每次100升，直至最后的蒸馏水 洗出液呈pH5；该有机层相溶液除去醋酸乙酯后得到升麻脂溶性有机酸4kg。
实施例4：升麻脂溶性有机酸的制备
取升麻药材1000kg，加80％乙醇使液面漫过药材，浸泡10小时后加热 回流4次，每次7500升，过滤；滤液浓缩，干燥，得提取物120kg；取该提 取物35kg，以900升65℃蒸馏水分5次将其溶解并转移到分液装置中，加 入8升35％盐酸并搅拌均匀；以醋酸乙酯萃取5次，每次400升，合并上层 相溶液；上层相溶液以4％氢氧化钠溶液500升萃取4次，取下层碱液；下层 碱液以35％盐酸调节pH至3后，每次400升的醋酸乙酯萃取，共萃取4次； 合并上层相溶液，以蒸馏水反复洗涤，每次150升，直至最后的蒸馏水洗出 液呈pH6；该有机层相溶液除去醋酸乙酯后得到升麻脂溶性有机酸5kg。
实施例5：升麻水溶性有机酸的制备
取升麻药材1000kg，加蒸馏水，加热煮沸2次，每次保持6000升，沸 腾2小时；沸腾期间经常增补蒸馏水以保持水的用量不少；过滤，取滤液， 浓缩到1000升，放冷后，慢慢加入3000升的95％乙醇，边加边搅拌使混合 均匀，静置15小时，以2500rpm离心20分钟，倾出滤液；该滤液回收乙醇 至无醇味，加蒸馏水调节体积到1000升；取该提取液，通过已预处理过的 阳离子交换树脂柱，以蒸馏水洗脱，收集流出液直至流出液呈pH6为止； 此流出液全部通过已预处理过的阴离子交换树脂柱，以蒸馏水洗脱，待流出 液呈pH8-7后，改用0.4N盐酸溶液洗脱，并开始收集流出液直至流出液呈 pH1时为止；该流出液经减压蒸干后，加入30升蒸馏水并减压蒸干，反复 加蒸馏水并反复蒸干，直至最后产物呈pH6为止，即得水溶性有机酸8kg。
实施例6：升麻水溶性有机酸的制备
取升麻药材1000kg，加蒸馏水，加热煮沸3次，每次保持7000升，沸 腾2.5小时；沸腾期间经常增补蒸馏水以保持水的用量不少；过滤，取滤液， 浓缩到1100升，放冷后，慢慢加入3500升的95％乙醇，边加边搅拌使混合 均匀，静置30小时，以3500rpm离心40分钟，倾出滤液；该滤液回收乙醇 至无醇味，加蒸馏水调节体积到1100升；取该提取液，通过已预处理过的 阳离子交换树脂柱，以蒸馏水洗脱，收集流出液直至流出液呈pH7为止； 此流出液全部通过已预处理过的阴离子交换树脂柱，以蒸馏水洗脱，待流出 液呈pH7后，改用0.6N盐酸溶液洗脱，并开始收集流出液直至流出液呈pH2 时为止；该流出液经减压蒸干后，加入60升蒸馏水并减压蒸干，反复加蒸 馏水并反复蒸干，直至最后产物呈pH5为止，即得水溶性有机酸12kg。
实施例7：制备脂溶性有机酸
取升麻药材，按上述脂溶性有机酸提取方法得脂溶性有机酸100-300克， 按常规方法制成胶囊1000粒，肝炎患者服用，按成人60公斤体重计算，每 次1-2粒，每日2次。
实施例8：制备水溶性有机酸
取升麻药材，按上述水溶性有机酸提取方法得水溶性有机酸100-300克， 按常规方法制成片剂1000片，肝炎患者服用，按成人60公斤体重计算，每次 1-2片，每日2次。
实施例9：制备脂溶性有机酸
取升麻药材，按上述脂溶性有机酸提取方法得脂溶性有机酸100-300克， 按常规方法制成颗粒剂1000袋，肝炎患者服用，按成人60公斤体重计算， 每次1-2袋，每日2次。
实施例10：制备水溶性有机酸
取升麻药材，按上述水溶性有机酸提取方法得水溶性有机酸100-300克， 按常规方法制成注射液1000支，10-20毫升/支，肝炎患者静脉滴注，按成人 60公斤体重计算，每次1-2支，每日1次。
实施例11：制备脂溶性有机酸
取升麻药材，按上述脂溶性有机酸提取方法得脂溶性有机酸100-300克， 按常规方法制成冻干粉针1000支，肝炎患者静脉滴注，按成人60公斤体重 计算，每次1-2支，每日1次。
实施例12：制备水溶性有机酸
取升麻药材，按上述水溶性有机酸提取方法得水溶性有机酸100-300克， 按常规方法制成栓剂1000支，肝炎患者肛门给药，按成人60公斤体重计算， 每次1支，每日1-2次。