本发明涉及一种重组MBL及其制备方法与应用，特别涉及一种重组高分子型MBL及其制备方法与应用。

MBL(mannose binding lectin，甘露糖结合凝集素)是涉及先天免疫的血清蛋白。其分子量为32KD，包括羧基末端糖结合域(CRD)，胶原蛋白域和氨基末端富半胱氨酸区。三个MBL分子的胶原蛋白域形成三股螺旋，导致形成三聚体，三聚体的六个单元通过氨基末端半胱氨酸的分子内二硫键形成大分子。MBL可与其它蛋白缔合，如MBL相关丝氨酸蛋白酶(MASP 1，MASP 2，或MASP 3)或MBL相关蛋白(Map19)。MBL的整个分子形状与补体系统的第一组分(C1q)相似。活性MBL的功能也与C1q相似，但是，与C1q不同的是，它通过裂解C4和C2激活补体系统。MBL的活化需要在它们的表面蛋白上结合具有独特糖基化模式的微生物。在该过程中，MBL相关丝氨酸蛋白酶被激活，且C4和C2以相同方式被裂解，使得C1q相关丝氨酸蛋白酶(C1r和C1s)通过裂解C3触发补体系统而激活。与微生物结合的MBL也有助于微生物的有效吞噬作用，就好像MBL是调理素。
目前，MBL基因已经被表达在各种细胞系中，包括CHO细胞(Katsuki Ohtani，etal.J.of Immunol.Methods 222，135-144，1999)或HLF肝癌细胞系或HEK 293 EBNA细胞系(T.Vorup-Jensen，etal.International Immunopharmacology 1，677-687，2001)。在CHO细胞系中，高产率表达是可能的，但回收的MBL主要是单体和二聚体，没有显著量的寡聚体。MBL基因在转化的人细胞系中的表达产生了明显更多的寡聚体，但总产率低于1μg/mL培养基。只有高分子量形式的MBL复合物能激活补体系统。
补体系统的激活对于抵御微生物感染是非常重要的。它不仅为侵入微生物的有效吞噬和直接裂解做准备，而且有助于有效诱导适应性免疫。到目前为止，还没有人为处理微生物感染的病人而调动补体系统的尝试。
血清中MBL的水平在不同个体上变化很大，范围在50ng/mL或更低到超过3μg/mL血清之间变化，这主要是由于遗传性变异。遗传性变异包括外显子上的点突变和启动子区突变。通常低水平MBL的个体易受微生物感染。尤其是，那些具有低水平MBL的新生婴儿会非常危险地受微生物感染。根据一项调查(Y.Hakozaki，etal.Liver，22，29-34，2002)，由于乙型肝炎病毒感染而经受肝功能衰竭的病人的死亡率依赖于MBL的血清水平。高水平MBL(3μg/mL)的病人不会死亡，而80％的低MBL水平的病人会死亡。因此，那些低MBL水平的个体可能因MBL补充而受益。
本发明的发明人已经构建了一个重组酵母细胞系，其可以产生乙型肝炎病毒包膜蛋白的pre-S区(PCT/韩国专利申请号：02/00820；中国专利03102363.0)。
发明创造内容：本发明的目的是提供一种用于治疗病毒、细菌或真菌感染的重组高分子型MBL。
本发明所提供的重组高分子型MBL，是由pMSG-MBL转化宿主细胞系后表达得到的寡聚体MBL。
其中，pMSG-MBL是从pMSG(韩国专利：KCCM10202)DNA序列构建的，该序列包括β-球蛋白序列的核基质附着体区域成分，SV40聚腺苷酸，胃泌素基因和MBL cDNA的转录终止序列。MBL cDNA是用PCR方法从人肝脏cDNA文库制备的。宿主细胞系是动物细胞；优选为中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，人肝细胞，和/或人胚肾(HEK)细胞；最优选为中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
本发明的第二个目的是提供一种制备重组高分子型MBL的方法。
本发明所提供的制备重组高分子型MBL的方法，是用pMSG-MBL转化宿主细胞系，被转化的宿主细胞系经培养筛选出重组高分子型MBL表达克隆，得到重组高分子型MBL。
其中，宿主细胞系是动物细胞，优选为中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，人肝细胞，和/或人胚肾(HEK)细胞。宿主细胞系的培养方法包括悬浮培养、将细胞固定在培养烧瓶或瓶子或生物反应器上培养等。
所筛选出的重组高分子型MBL表达克隆是CHO MBL/D1-3KCTC 10472BP。所述CHOMBL/D1-3是通过在培养基中加入增量氨甲喋呤(MTX)选择得到的。
本发明还提供了纯化重组高分子型MBL的方法。可以使用重组pre S或任何其它糖基化蛋白纯化重组高分子型MBL。例如，首先将重组pre S(recombinant pre S fromYeast，patent；PCT/KR02/00820)固定在适当的柱基质上，接着装柱，然后用适当的缓冲液平衡该柱，最后在存在钙离子的情况下将带有重组高分子型MBL的培养基加样到该柱上，用含有EDTA或EGTA的缓冲液洗脱重组高分子型MBL。该柱基质可以是任何合适的基质，例如琼脂糖。该柱的平衡可以用提供重组高分子型MBL与pre S的最佳结合的缓冲液进行。该缓冲液所含钙离子的范围在2mM-20mM之间。该被纯化的重组高分子型MBL的来源可以是人血清或任何其它含有重组高分子型MBL的物质，如CHO MBL/D1-3的培养基。从柱上洗脱重组高分子型MBL可以用任何含有EDTA或EGTA的溶液进行，其中所述溶液所含EDTA或EGTA的浓度范围在5mM-10mM之间。如果有必要，可以重复该亲和柱步骤。
本发明的第三个目的是提供重组高分子型MBL的两种用途。
本发明所提供的重组高分子型MBL第一种用途是以纯化的重组高分子型MBL为活性成分治疗微生物(如SARS病毒)感染和/或增强零或低水平血清MBL的个体免疫力的药物。
该药物可以包括水，缓冲液，和/或稳定剂。稳定剂包括3％到30％的至少一种下述物质：甘油，葡萄糖，蔗糖，山梨醇，海藻糖，麦芽糖，白蛋白，和氨基酸。
该药物还可以包括MBL缔合蛋白，如MASP 1，MASP 2，MASP 3，和/或Map19。这些MBL缔合蛋白可以是天然源或重组蛋白。
该药物可以是油悬浮液、溶液或固体形式。如该药物为固体，可以在给药之前将该药物溶解于上述溶液(具体为哪些溶液)中。
该药物的给药途径可以是腹腔注射，皮下腹腔注射，肌肉注射或静脉内注射或一个组合方法。
上述药物的建议用量一般为0.2-0.5mg/kg/day疗程为15至30天。
本发明所提供的重组高分子型MBL的第二种用途是作为补体激活触发物。
本发明所提供的补体激活触发物是以重组高分子型MBL为活性成分的复合物。该复合物是可通过pre S或任何与MBL结合的糖基化蛋白或肽或甘露糖包被在脂质体或PLGA[聚(D，L-乳酸-共-羟基乙酸)]纳米颗粒上，然后再与重组高分子型MBL结合得到的。该复合物优选为重组高分子型MBL-pre S-PLGA复合物，它是通过包被有pre-S的PLGA纳米颗粒结合重组高分子型MBL得到的，且在存在无MBL的血清的情况下激活补体。纳该米颗粒的直径在10nM-10μM之间。
该补体激活触发物可以被广泛地用于治疗微生物如病毒、细菌和/或真菌感染。
本发明的重组高分子型MBL与从人血清纯化的天然MBL相似，表现出高分子量多聚体型。而且，本发明的CHO细胞系尤其是CHO MBL/D1-3产生了大量功能性MBL，这使得将该克隆用于工业生产MBL成为可能。
附图说明
图1A为纯化的重组高分子型MBL的聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)图图1B为纯化的重组高分子型MBL的Western印迹分析图图2A为人血浆MBL与糖基化蛋白或甘露聚糖的结合曲线图2B为人重组高分子型(rhMBL)与糖基化蛋白或甘露聚糖的结合曲线图3为rhMBL的补体激活曲线图4A为pre S结合PLGA纳米颗粒示意图图4B为pre S包被的PLGA纳米颗粒在水相中的示意图图5A为PLG-pre S结合到包被rhMBL免疫板上的PLG结合体积-OD曲线图5B为rhMBL结合到PLG-pre S包被免疫板上的rhMBL结合浓度-OD曲线图6为PLG-pre S的C4激活曲线图7为在逐渐增加量的rhMBL存在下SARS冠状病毒对FRhk-4细胞的感染柱状图图8A为FRhK-4细胞在2.5ug/ml的rhMBL中感染SARS病毒的显微镜观察图图8B为FRhK-4细胞在0.63ug/ml的rhMBL中感染SARS病毒的显微镜观察图图8C为FRhK-4细胞在0.16ug/ml的rhMBL中感染SARS病毒的显微镜观察图图8D为FRhK-4细胞在0.02ug/ml的rhMBL中感染SARS病毒的显微镜观察图图8E为FRhK-4细胞在0.0024ug/ml的rhMBL中感染SARS病毒的显微镜观察图图8F为FRhK-4细胞在对照中感染SARS病毒的显微镜观察图具体实施方式实施例1、重组高分子型MBL的CHO细胞系的构建(1)表达载体的构建MBL cDNA是使用人肝脏cDNA文库通过PCR方法制备的，它可以被克隆进pEZ载体，pEZ-MBL2-5中。核苷酸序列是用储存在基因库中的序列(Gene Bank NM_000242)验证的。使用该pEZ-MBL2-5DNA作为模板，通过PCR方法用正引物(ctagctagccaccatgtccctgtttccatcactc)和反引物(gaagatctcagatagggaactcacagacg)制备的用于MBL表达的750bp MBL cDNA。这对引物包括用于克隆的Kozak序列和限制性内切核酸酶位点。该cDNA被克隆进pMSG载体中以制备pMSG-MBL。MBL的序列通过基因库序列再次得到验证。
(2)pMSG-MBL转染进表达宿主中①pMSG-MBL DNA的制备在pMSG-MBL DNA转染进DH5α[supE44，ΔlacU169(Φ80 lacZΔM15)，hsdR17，recA1，endA1，gyrA96，thi-1，relA1]大肠杆菌中之后，在含有100μg/mL氨苄青霉素的100mL LB培养基中培养转化体。通过使用QUIAPREP质粒Midi试剂盒(Quiagen，USA)，从该培养物中制备pMSG-MBL。该pMSG-MBL线性DNA是用Sca I进行消化制备得到的。
②制备宿主细胞将CHO DG44(dhfr-/dhfr-)在含有10％cFBS的α-MEM培养基中培养，用血细胞计数器确定细胞数。然后调节细胞数，成为在含有10％cFBS的α-MEM中2×105个/mL细胞，在CO2培养箱中培养24小时。
③转化在室温下将含有2μg的pMSG-MBL DNA，5.3μL DosperTM，和16ng pDCHlP(Plasmid with DHFR gene，Venolia，etal.1987，Somat.Cell Mol.Genet.13，491-501)的混合物培养45分钟。然后将该混合物加入到宿主细胞中，于37摄氏度培养6小时。培养后，去除培养基，加入3mL含cFBS的新鲜α-MEM。然后在3天后，当转化的细胞增加到足够多时，通过胰蛋白酶(trypsine)处理收获细胞，且于2mL无核苷的含有10％透析FBS的α-MEM中培养。转化细胞培养大约10天，培养基每2天换一次。
(3)MBL生产细胞的选择和MBL基因的扩增通过在培养基中逐渐加入增量的MTX，扩增在转化细胞中转导的MBL基因。把转化细胞数调节到4×105个/孔，且在存在10nM MTX的情况下培养，直到细胞达到融合状态。然后通过类似方式将MTX的浓度增加到1μM。在每一步，使用抗MBL抗体通过Western印迹分析确定MBL表达水平。MBL的水平随着MTX浓度的增加而增加，单克隆选自适合于1μM MTX的细胞。
(4)单个最佳细胞的选择(克隆)对于单细胞克隆，将1μM MTX适应细胞分配到96孔板中，0.5个细胞/孔。该平板在含有10％透析FBS和1μM MTX的α-MEM中培养。大约2周后，当单细胞集落形成时，将细胞转移到24孔板中。当细胞增加到足够时，在分析表达水平后，将细胞冷冻。所选择的细胞系是CHO MBL/D1-3。
按照传统方法在还原和非还原条件下对重组细胞系产生的MBL进行聚丙烯酰胺电泳和Western印迹分析，结果如图1A和B所示，表明产生的人重组高分子型(rhMBL)(rhMBL)与天然的MBL的聚丙烯酰胺电泳和Western印迹分析图谱一致。图1A中，泳道1为非还原条件，rhMBL(1.2μg)；泳道2为还原条件，rhMBL(6μg)；泳道3为非还原条件，血浆MBL(0.3μg)；泳道4为还原条件，血浆MBL(1.5μg)；泳道M为分子量标记物。在Western印迹分析中，第一抗体是抗人MBL(1∶1，500稀释)多克隆抗体，第二抗体是抗小鼠IgG-HRP(1∶5，000稀释)抗体；图中泳道1为rhMBL，非还原条件；泳道2为rhMBL，还原条件；泳道3为血浆MBL，非还原条件；泳道4为血浆MBL，还原条件；泳道M为分子量标记物。
(5)重组高分子型MBL表达水平的估算使用CHO MBL/D1-3细胞系，通过比较来自人血清的已知量的纯化MBL估算MBL表达水平。将5×105个细胞在T25烧瓶中培养，T25烧瓶装有无核苷含有10％透析FBS的α-MEM。当细胞密度达到90％融和度时，用3mL含有5％透析FBS的相同培养基取代上述培养基。4天后，将培养基稀释10倍，经估计培养基中重组高分子型MBL的量为50μg/106个细胞/天。
实施例2、重组高分子型(rMBL)的纯化(1)pre S琼脂糖柱的制备将1克CNBr活化的琼脂糖4B悬浮于1mM HCl溶液中，用相同溶液清洗数次。在pH 8.3的含有0.2M NaHCO3和0.5M NaCl的联合缓冲液中，将6.4mg pre S与清洗后的琼脂糖混合，以得到pre S的终浓度为0.5-10mg/mL。于室温下培养2小时后，加入含有0.1M tris的封闭缓冲液，pH 8.0，并于室温下保留2小时。然后用封闭缓冲液清洗pre S-琼脂糖，通过Western印迹分析评估固定化pre-S的量。
(2)通过使用pre S-琼脂糖柱纯化rMBL通过使用pre S与MBL结合的性质进行纯化。pre S可以利用本发明的发明人构建的重组酵母细胞系(PCT/韩国申请号：02/00820；中国申请号：03102363.0)，进行规模化生产。pre S-琼脂糖被填充到柱上，用含有20mM Tris pH 7.6，150mM NaCl，10mM CaCl2，和0.05％Tween 20的MBL结合缓冲液平衡。将CHO细胞培养基中或者血清中的MBL加到该柱上，并且用加样缓冲液进行粗放清洗。然后用含有20mM TrispH 7.6，150mM NaCl，5mM EDTA，和0.05％Tween 20的洗脱缓冲液从该柱中洗脱MBL。用这种方式，仅一步就可以产生99.9％的纯MBL，如图1A和1B所示。
实施例3、rMBL(重组高分子型MBL)功能的证实rMBL的生物活性已经通过两种不同功能确定：(1)rMBL特异性以钙依赖方式结合到糖基化蛋白上，和(2)在存在糖基化蛋白和MASPs的情况下激活补体(C4裂解)。
(1)rMBL与糖基化蛋白的结合①甘露聚糖结合将在50mM碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液中的甘露聚糖溶液，加样到Nunc Maxisorp免疫板中，使每孔1μg。于4摄氏度过夜培养，以便用甘露聚糖包被平板。将其用含有20mM Tris pH 7.6，150mM NaCl，10mM CaCl2，和0.05％Tween-20的冲洗缓冲液冲洗4次，并且用0.2％BSA处理1小时。在用冲洗缓冲液冲洗平板3次后，在含有20mM Tris pH 7.6，1M NaCl，10mM CaCl2，0.1％BSA，0.05％Tween-20的100μL结合缓冲液中加入1μg MBL/孔。于室温温育2小时后，用冲洗缓冲液将平板冲洗6次，并且显色。首先，将平板用小鼠抗人MBL单克隆抗体(Dobeel，MBL8F6，1∶100稀释)于室温温育2小时。接着加入抗小鼠IgG-HRP抗体(1∶1500稀释)，并于室温下温育1小时。最后通过OPD(Sigma，USA)显色，150μl/孔。通过加入3M HCl终止显色，50μl/孔。用自动ELISA平板阅读器(酶标仪)于492nm测量OD。
用天然MBL比较甘露聚糖与rMBL的结合活性。结果如图2A和B所示，表明rMBL与从人血清纯化的天然MBL的结合活性相似。两者都同样以剂量依赖的方式结合甘露聚糖，但不能与BSA结合。
②rMBL与pre S的结合使用与MBL和甘露聚糖结合相同的方法，使用1μg pre S完成MBL与pre S的结合。用天然MBL比较甘露聚糖与rMBL的结合活性。结果如图2A和B所示，表明rMBL与从人血清纯化的天然MBL的结合活性相似。两者都同样以剂量依赖的方式结合preS，但不能与BSA结合。
(2)rMBL的补体激活①用甘露聚糖包被板进行补体激活如(1)中①所述用1μg/孔甘露聚糖包被Nunc Maxisorp免疫板孔，将该平板于室温下用rMBL温育。不含血清的MBL被用作MASPs(MBL相关丝氨酸蛋白酶)的来源。在温育2小时后，用清洗缓冲液将平板清洗6次，并且于室温下用500ng/孔C4温育。然后，将其于室温下用抗C4抗体-HRP温育1小时，通过加入150μL OPD显色。20分钟后，加入3M HCl终止显色反应，50μL/孔，于492nm测量OD值。该实验显示了rMBL具有相对于C4裂解血清MBL的可相比美的活性。
②用pre S包被板进行补体激活用与(2)中①类似的方式，用pre S包被(1μg/孔)板确定MBL补体激活活性。结果如图3所示，表明pre S在MBL相关丝氨酸蛋白酶的激活上比甘露聚糖好。
实施例4、作为补体激活触发物的重组高分子型MBL复合物(1)pre S包被纳米颗粒的制备①PLGA纳米颗粒的制备将分子量范围为1,000-100,000的聚(D，L-lactic-co-glycolic acid)[PLGA]溶解于有机溶剂中，如甲醇或二氯甲烷中。然后将其分散到SDS或Tween溶液中，在猛烈搅拌的同时保持过夜。从中回收纳米颗粒。
②PEG与纳米颗粒的共轭使用具有杂官能反应基团(X-PEG-Y)的聚(乙二醇)[PEG]。在有机溶剂或水溶液中，反应基团X被激活，然后在纳米颗粒上与反应基团(-OH，-COOH)共轭。在该共轭中所用的连接物(X-)可以是如下述化学基团：--S--S--
③pre S与共轭到PEG上的纳米颗粒的共轭pre S的共轭可以通过赖氨酸或精氨酸上的ε-胺或N-末端胺实现。C-末端或ε-羧酸也可以被使用，以进行pre S与共轭到纳米颗粒上的PEG的共轭。在这些游离Y反应基团中，PEG可以被共轭到pre S上的羧酸或胺上。其中连接物(Y-)可以是下述化学基团：--S--S--pre S与共轭到PEG上的纳米颗粒的共轭示意图如图4A和图4B所示。关于蛋白质与PLGA纳米颗粒结合的详细操作程序在以前的出版物中有描述(H.S.Yoo et al，J.Controlled Release，82，17-27，2002 and S.H.Choi and T.G.Park，Intl.J.Pharmaceutics，203，193-202，2000)。pre S与一个PLGA颗粒结合的数量为100,000-300,000个。
(2)pre S-PLGA作为MBL激活的功能分子按照实施例3中pre S与rhMBL结合的方法完成rhMBL与pre S-PLGA的结合，以及通过rhMBL-pre S-PLGA复合物实现补体激活。结果分别如图5A和B及图6所示，图5A表明补体激活由PLG-pre S的量决定；图5B表明补体激活由rhMBL的增加量决定；图6表明随着PLG-pre s数量的增加，rhMBL缔合的MASPs被激活到分裂C4上。图5A和B及图6中，PLG-pre S<C>表示PEG被共轭到pre S的羧基上；PLG-preS<N>表示PEG被共轭到pre S的胺基上。在此，发现MBL包被板不能用于补体激活作用大概由于阻滞了MASPs与被固定的MBL在固体表面的缔和。因此，还在水相中进行了补体激活作用的测定，PLGA-pre S与共轭到PEG上的纳米颗粒的共轭、MBL、MASPs和C4。从这个试验中发现，单体的pre S与共轭到PEG上的纳米颗粒的共轭，不同于PLGA-pre S与共轭到PEG上的纳米颗粒的共轭，不能稳定的与MBL复合，也不能激活MBL与MASPs联合的补体活化作用。
实施例5、rhMBL对SARS冠状病毒的中和作用用不同数量的含rhMBL培养基进行胎儿恒河猴肾细胞(FRhk-4)感染SARS冠状病毒的试验，结果如图7和图8A-F所示，图7表明2.5ug/ml的rhMBL能阻滞病毒的感染，与没有rhMBL存在的细胞相比，能降低病毒感染至15％以下。图8A-F表明，在2.5ug/ml的MBL存在下，显微镜图显示有健康的细胞。而无MBL存在下，感染病毒的细胞只显示有死亡和肿大的细胞。考虑到人类血清中正常的MBL水平为2.5ug/ml，rhMBL在生理浓度下阻滞SARS冠状病毒。关于SARS冠状病毒的生长和通过RT-PCR病毒检测的详细实验在以前的出版物中已有描述(Ksiazek T.G.et al，N.Engl.J.Med.2003；348，20：1953-66and Peiris J.S.et al，Lancet 2003；361，9366：1319-25)。