发明领域

此申请涉及用基本不含腺苷的反义寡核苷酸治疗肺病的方 法。

                      发明背景

反义寡核苷酸作为治疗人类疾病的潜在有用的药物制剂，在 理论上受到了相当的重视。R.Wagner，《自然》372，333-335 (1994)。然而，有关这些分子对现实人类疾病模型的实际应用尚 不明了。对这些分子的药理学应用，值得重要考虑的是它们的给 药途径。大部分在体应用反义寡核苷酸的实验均涉及直接应用它 到脑(参见C.Wahlestedt，《药理科学进展》15，42-46(1994)；J.Lai 等，《神经报告》5，1049-1052(1994)；K.Standifer等，《神经 元》12，805-810(1994)；A.Akabayashi等，《脑研究》21，55-61 (1994))或脊髓液(参见L.Tseng等，《欧洲药理学杂志》258，R1-3 (1994)；R.Raffa等，《欧洲药理学杂志》258，R5-7(1994)；F. Gillardon等，《欧洲神经科学杂志》6，880-884(1994))的有限 区域。鉴于这些方法的侵入性，在临床上存在应用局限。

全身性给予反义寡核苷酸也引起药理学应用的明显问题，不 只是难以到达疾病侵害的组织。相反，肺脏是应用反义寡核苷酸 的极好的潜在靶器官，因为它的进入方式是非侵入性的并且具有 组织特异性。另外，可能由于肺脏布满主要由阳离子脂类构成的 表面活性剂，而众所周知阳离子脂类在其它系统中可促进细胞对 ODN的摄取，所以与其它活体靶器官或组织相比，肺脏可作为反 义ODN治疗的极合适的靶器官。然而，输送反义制剂到达肺部的 技术有待发展，而在肺部应用反义制剂可能存在的问题尚有待探 索。

腺苷是参与中间代谢和调节生理活性的一种嘌呤，被认为是 一种神经调节因子。这种核苷参与多种局部调节机制，尤其是在 CNS的突触和外周神经元效应器的连接部。在CNS，腺苷被认为 可抑制多种神经递质(去甲肾上腺素，5-羟色胺，GABA，乙酰 胆碱，多巴胺，谷氨酸盐等)的释放，抑制神经传导，减弱神经元 放电，诱导脊髓痛觉缺失，并且具有抗焦虑的特性(E.S.Ben- Soreket等，《内科学文献》153，2701-2702(1993))。在心脏中， 已知腺苷可降低房室(AV)传导，抑制起搏活性，具有抗心律失常 效应，调节自主控制，并且触发前列腺素的合成与释放。M.K. Church等，《变态反应和临床免疫学杂志》92，190-194(1993)。 它还具有很强的血管舒张效应，并可调节血管的紧张性。S.T. Holgate等，《纽约科学院年鉴》629，227-236(1991)。

作为治疗用药，腺苷用作治疗室上型心动过速的抗心律失常 剂近来取得了相当成功。参见C.G.Degroff和M.J.Silka，《儿科 杂志》125，822-823(1994)；I.Drake等，《人体实验毒理学》 13，263-265(1994)。然而，有文献报道腺苷治疗存在许多副作 用。参见A.Aggarwal等，《麻醉学》79，1132-1135(1993)；K.K. Burkhart，《美国急诊医学杂志》11，249-250(1993)；S.K. Srinivasan和P.J.Iversen，《临床实验分析杂志》9，129-137(1995)； C.A.Stein等，《药理和治疗》52，365-384(1991)；B.B.Fredholm 等，《药理学综述》46，143-156(1994)；H.Saito等，《血液》 66，1233-1240(1985)。特别是哮喘患者显示对腺苷和腺苷单磷 酸非常敏感。参见J.H.Butterfield等，《白血病研究》12，345 -355 (1988)；CLONETICS：标准人体细胞系统手册(1995)；R.W. Wagner，《自然》372，333-335(1994)。用腺苷治疗室上型心 动过速的哮喘患者会诱导产生严重至几乎致命的支气管痉挛。参 见S.Tabor，《当代分子生物学最新方法》卷1，Section3.10.2(John Wiley&Sons，1987)；J.H.Weiss，同前，Section6.2.2。

与之类似，使用对尘螨过敏的人类哮喘的兔模型，也对雾化 吸入腺苷产生明显的支气管收缩反应；而非哮喘型兔子则对腺苷 无反应。S.Ali等，《药剂与作用》37，165-176(1992)。最近采 用这种模型的研究提示，哮喘过程中由腺苷诱导的支气管收缩和 支气管过度应答主要是通过刺激腺苷受体来介导。S.Ali等，《药 理学实验治疗杂志》268，1328-1334(1994)；S.Ali等，《美国生 理杂志》266，L271-277(1994)。

因此腺苷禁用于有哮喘者(占美国成年人口的10％和美国儿 童人口的15％)的肺部。由于各种反义ODN一般包含所有四种碱 基对，即腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶，因此在这些发生 过度应答的呼吸道中，它们的降解产物会产生游离的脱氧腺苷单 磷酸。脱氧腺苷单磷酸与腺苷单磷酸的差别仅在于前者含糖部分 的3’碳缺失了一个氧原子。

                      发明概述

本发明第一方面是给需要治疗的患者治疗呼吸道疾病的方 法。该方法包括向患者肺部给予有效治疗呼吸道疾病剂量的反义 寡核苷酸，反义寡核苷酸基本不含腺苷。

本发明第二方面是药物组合物，包括基本不含腺苷的反义寡 核苷酸，其剂量足以有效治疗呼吸道疾病，同时还包括适合药用 的载体。

本发明第三方面是使用上述基本不含腺苷的反义寡核苷酸制 备药物，治疗需要接受此种方法治疗的患者的呼吸道疾病。

                      附图简述

图1-4证明了反义寡核苷酸能够被利用作为治疗或预防呼吸 道疾病的有效药物。

图1：阐明了A1腺苷受体反义寡核苷酸和错配的对照反义寡 核苷酸对兔子模型中支气管道的动力顺应性的不同作用。图2：以 经A1腺苷受体反义寡核苷酸治疗后的呼吸道组织中A1和A2腺苷 受体表达数目作为参考，阐明了A1腺苷受体反义寡核苷酸的特异 性。图3：用图形方式说明，雾化吸入的脱氧腺苷单磷酸盐对于过 敏性兔子患有哮喘的呼吸道是一种强力的支气管收缩剂。图4：以 图形方式说明，雾化吸入含有腺苷的硫代磷酸脱氧寡核苷酸具有 支气管收缩效应，而不含有腺苷的脱氧寡核苷酸则无此效应。

                        发明详述

核苷酸序列在此仅以从5’端到3’端方向、从左至右，以单链 形式表示。核苷酸和氨基酸在此按照IUPAC-IUB生物化学命名 委员会推荐的方式，或(对氨基酸)按照37CFR ξ1.822及已建立方 法，以三字符表示。参见，例如《专利申请者手册》99-102(1990 年11月)(美国专利与商标局，Office of the Assistant commissioner for Patents，Washington，D.C.20231)；Hudson等的美国专利号 4,871,670 Col.3 20-43行(申请人明确指出在此公开的此专利文 献和所引用的其它专利文献均作为参考)。

本发明的方法可被用于对各种原因的患者进行呼吸道疾病治 疗。其目的在于反义化合物的腺苷含量被除去或减少，以防止反 义化合物降解时释放出腺苷。这种释放可能会导致呼吸道过度反 应的病人产生严重的、甚至是威胁生命的支气管收缩。可用于本 发明方法治疗的呼吸道疾病的实例包括囊性纤维变、哮喘、慢性 阻塞性肺病、支气管炎和其它具有炎症反应特点的呼吸道疾病。

A1和A3受体的反义寡核苷酸据证明有下调细胞A1或A3的作 用。与治疗腺苷诱导支气管收缩的传统方法相比，此种治疗的一 个新特征是药物对肺部用药。另外，受体蛋白不仅与药物作用， 且其本身数量减少，毒性也被降低。其它可在治疗肺病时作为反 义药物的目标的蛋白包括但不限于：人A2a腺苷受体，人A2b腺苷 受体，人IgE受体β，人Fc-ε受体CD23抗原，人组氨酸脱羧酶， 人β类胰蛋白酶，人类胰蛋白酶-I，人前列腺素D合酶，人环加氧 酶-2，人嗜酸性粒细胞阳离子蛋白，人嗜酸性粒细胞衍生神经毒 素，人嗜酸性粒细胞过氧化物酶，人细胞间粘附分子-1(ICAM- 1)，人血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)，人内皮白细胞粘附分子 (ELAM-1)，人P选择素，人内皮单核细胞激活因子，人IL-3，人 IL-4，人IL-5，人IL-6，人IL-8，人单核细胞衍生中性粒细胞趋 化因子，人中性粒细胞弹性蛋白酶，人中性粒细胞氧化酶因子， 人组织蛋白酶G，人防卫素1，人防卫素3，人巨嗜细胞炎性蛋白 -1-α，人毒蕈碱性乙酰胆碱受体HM1，人毒蕈碱性乙酰胆碱受体 HM3，人纤连蛋白，人GM-CSF，人肿瘤坏死因子α，人白三烯 C4合酶，人体主要碱性蛋白，以及人内皮素1。对这些靶蛋白和 通常的靶基因来说，特别有必要去除或减少相应的反义寡核苷酸 中腺苷含量，以防止反义寡核苷酸的降解产物释放出腺苷。

在此使用的术语“治疗”肺病一词特指可减少接受这种此疗 法者出现肺病症状的可能性的治疗。术语“下调”特指诱导细胞 内靶蛋白的产生、分泌或有效性水平降低(并因此导致浓度减 少)。

本发明主要是关于对人类患者的治疗，但出于兽医应用的目 的，也可以用于治疗其它哺乳类动物，如狗和猫。这些靶蛋白优 选属于哺乳类的蛋白，更优选与受治者为同种。

通常术语“反义”一词指使用小的类似单链DNA的合成寡核 苷酸，通过抑制目标信使RNA(mRNA)功能来抑制基因表达。 Milligan，J.F.等，《医药化学杂志》36(14)，1923-1937(1993)。 对于本发明，是期望抑制A1或A3腺苷受体的基因表达。基因表达 的抑制是通过按照Watson-Crick碱基配对法则，对特定信使RNA (mRNA)的编码(正义)序列进行杂交完成的。反义抑制的机制 在于使用外源性的寡核苷酸，降低靶基因mRNA或蛋白水平，或 使细胞生长特点或形态发生改变。同上，亦参见Helene，C.和 Toulme，J.，《生物物理和生物化学周刊》1049，99-125(1990)； Cohen，J.S.编辑，《脱氧寡核苷酸作为基因表达的反义抑制剂》 CRC出版：Boca Raton，FL(1987)。

在此应用的术语“反义寡核苷酸”被定义为短序列的人工合 成核苷酸。它们(1)按照后面描述的杂交条件与编码靶蛋白的 mRNA的任一编码序列杂交，(2)通过杂交减少靶蛋白的基因表 达。

A1或A3腺苷受体的mRNA序列来自A1或A3腺苷受体表达基 因的DNA碱基序列。人类基因组A1腺苷受体序列是已知的，并由 G.Stiles等的美国专利5,320,963号公开。A3腺苷受体已经被克 隆、测序并在大鼠(参见F.Zhou等《美国国家科学院院报》89：7432 (1992))和人体(参见M.A.Jacobson等，英国专利申请号 9304582.1(1993))中表达。因此，按照标准技术可以生产下调A1 或A3腺苷受体表达的反义寡核苷酸。

本发明一个方面在于，反义寡核苷酸具有一定的序列，能与 编码呼吸道疾病相关蛋白的mRNA分子的任何序列特异性结合， 从而阻止mRNA分子的翻译。

寡核苷酸的化学类似物(例如，寡核苷酸的磷酸二酯键被修 饰，形成诸如甲基磷酸酯键、磷酸三酯键、硫代磷酸酯键、二硫 代磷酸酯键或氨基磷酸酯键，使寡核苷酸在体内更稳定)也是本 发明的一个方面。寡核苷酸中的天然磷酸二酯键容易被细胞内源 性产生的核酸酶所降解，而许多类似物的键对核酸酶的降解作用 是高度耐受的。参见Milligan等，和Cohen J.S.，同上。采用“3’ 末端加帽”的策略，用抗核酸酶的键去替代寡核苷酸3’端的磷酸 二酯键，可以防止寡核苷酸的降解。参见Tidd D.M.和Warenius H.M.，《英国癌症杂志》60，343-350(1989)；Shaw J.P.等，《核 酸研究》19，747-750(1991)。氨基磷酸酯键、硫代磷酸酯键和 甲基磷酸酯键都可以此方式产生作用。更广泛地修饰磷酸二酯骨 架已显示出可提高稳定性，并且可能增强寡核苷酸的亲和力和细 胞渗透性。参见Milligan等，同上。许多不同的化学手段被用来 将整个磷酸二酯骨架替换为新的键。同上。骨架类似物包括硫代 磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基磷酸酯、氨基磷酸酯、甲硼烷磷酸 酯、磷酸三酯、甲缩醛、3’-硫甲缩醛、5’-硫甲缩醛、5’-硫醚、 碳酸酯、5’-N-氨基甲酸酯、硫酸酯、磺酸酯、氨基磺酸酯、 氨磺酰、砜、亚硫酸酯、亚砜、硫化物、羟胺、亚甲基(甲基亚氨 基)(MMI)或亚甲氧基(MOMI)键。经硫代磷酸酯键和甲基磷酸酯 修饰的寡核苷酸由于可以自动化合成，所以是特别优选的。同上。 适当的情况下，反义寡核苷酸可采用它们适合药物应用的盐类的 形式进行给药。

依照所结合的特定靶目标和因此所采用的输送方式，反义寡 核苷酸可以具有任何适当的长度(例如从大约10至60个核苷酸长 度)。反义寡核苷酸优选直接作用于含有内含子与外显子连接部的 mRNA区域。反义寡核苷酸直接作用于内含子/外显子连接部时， 它或者可能完全覆盖连接部，或者可能充分接近连接部，从而抑 制在mRNA前体变为成熟mRNA的加工过程中间插外显子的剪 接。(举例来说，反义寡核苷酸的3’或5’末端覆盖内含子/外显子连 接部大约10、5、3或2个核苷酸的范围)。

当使用本发明时，所使用的反义寡核苷酸可能与被给药的生 物物种具有相关性。当治疗人类时，希望使用人类反义寡核苷酸。

本发明的另一方面是包含上述反义寡核苷酸的药物组合物， 该药物组合物可有效减少A1或A3腺苷受体的表达，此过程是通过 药物组合物穿过细胞膜并与细胞内编码A1或A3腺苷受体的 mRNA特异性结合，从而阻止mRNA转译。这些组合物用适当的 药用载体配制(例如无热源的无菌生理盐水)。反义寡核苷酸可用 能穿过细胞膜的疏水性载体进行配制(例如使用脂质体，而脂质体 又以药用的含水载体作为载体)。寡核苷酸也可以与灭活mRNA的 物质偶联，如核酶。给予此种寡核苷酸用于抑制患者的A1或者A3 腺苷受体活化，患者需要接受此种治疗由于任何在此讨论的原 因。此外，药物制剂也可能包括嵌合分子，它包含的反义寡核苷 酸吸附在一种据知被细胞内化的分子上。这些寡核苷酸结合体利 用细胞摄取途径增加细胞内寡核苷酸的浓度。采用这种方式的大 分子的实例包括转铁蛋白、去唾液酸糖蛋白(通过聚赖氨酸与寡核 苷酸结合)和链亲合素。

对于药物制剂，反义化合物可以包含于脂质微粒或微囊中， 例如脂质体或微晶体。微粒可以是任何适合的结构，象单层或多 层片状结构，以便反义寡核苷酸可以被容纳于其中。带正电荷的 脂类如N-[1-(2，3-二油氧基)丙基]-N，-N，N-三甲基-铵甲基硫酸盐， 或“DOTAP”，特别优选作为这种微粒或微囊。制备这种脂质微 粒的方法是众所周知的。参见Janoff等的美国专利号4,880,635； Kurono等的4,906,477；Wallach的4,911,928；Wallach的 4,917,951；Allen等的4,920,016；Wheatley等的4,921,757及其它 文献。

患者接受有活性组合物的用药可通过各种输送反义核苷酸组 合物到达肺部的途径进行。在此公开的反义化合物可经各种适当 的方法用于病人的肺脏，但优选的用药方式为产生包括可吸入的 微粒的气雾剂，该可吸入的微粒包含有反义化合物，患者吸入该 微粒。它们可以是液态或固态的，微粒中还可任选包含其它治疗 成分。

本发明使用的含反义化合物的微粒应包括适于吸入的大小的 微粒：这意味着，微粒小到足以随吸气通过口腔和咽部进入到肺 支气管和肺泡。通常微粒在0.5到10微米大小的范围适于吸入。气 雾剂中不适于吸入尺寸的微粒容易沉积在喉部被吞咽掉，优选气 雾剂中这种微粒的含量最小。对于鼻吸入法，优选微粒在10-500 微米范围内，以使其易于滞留在鼻腔中。

反义化合物与适当的赋形剂，比如无菌无热源的水结合，可 做成包含活性化合物用于产生气雾剂的液体药物组合物。也可任 选含有其它的治疗用化合物。

固体微粒组合物含有适于吸入的微化反义化合物干颗粒，它 可通过下面的方法来制备，即使用臼和杵研磨干燥的反义化合 物，然后将细颗粒通过400目筛网进行打碎或分离出大的结块。包 含反义化合物的固体微粒组合物可任选地含有分散剂，它具有促 进气雾形成的作用。较适合的分散剂是乳糖，它可与反义化合物 按任意适当比例进行混合(比如按重量1∶1的比例)。此外，也可添 加其它的治疗用化合物。

给予反义化合物的剂量是依据所治疗疾病、患者状况、特定 的制剂、用药途径以及用药时间等因素来决定。一般细胞内寡核 苷酸浓度应从0.05到50μM，或更具体而言从0.2到5μM。对于象 人体的用药，一般应用的剂量从大约0.01，0.1或1mg/kg到50，100或 150mg/kg或更高。根据所用的活性物质的特定制剂的可溶性，每 日用药剂量可一次或分次完成。给予反义化合物可作为治疗(即作 为抢救治疗)或预防目的使用。

含反义化合物液体微粒的气雾剂可用各种相应方法制造，例 如使用喷雾器。例如参见美国专利No.4,501,729。喷雾器是可商 购的产品，它将具有活性成分的溶液或悬液转变成可用于治疗的 气雾，其原理是使压缩气体加速通过狭窄的喷口，气体一般为空 气或氧气；或采用超声振荡的方法。较适合应用于喷雾器的制剂 为液相载体包容的活性成分，活性成分占制剂比例可高达40％ w/w，但优选小于20％w/w。载体一般为水或是用水稀释的乙醇 溶液，优选添加如氯化钠等以使之与体液等渗。如果该制剂不是 制备成无菌的，任选的添加物可包括防腐剂，比如甲基羟基苯甲 酸盐以及抗氧化剂、调味剂、挥发油、缓冲剂和表面活性剂。

含活性化合物固体微粒的气雾剂可同样用各种固体微粒药物 气雾发生器产生。用于给予患者固体微粒药物的气雾发生器可以 产生如前所述的可吸入微粒，并产生一定体积的气雾，其中含有 预先设定剂量、适于人类用药比例的药物。一种示例性的固体微 粒气雾发生器是吹入器。适合吹入给药的制剂中包含磨成细粉的 药粉，可以经吹入器导入或通过鼻吸到达鼻腔。在吹入器中，药 粉(可有效产生在此表述的治疗作用的一定剂量的药物)被放置于 胶囊或药筒中，胶囊或药筒通常用明胶或塑料制成，或被刺破或 在原位置被打开，药粉通过吸气随流经该装置的气流传送或通过 手动泵传送。吹入器中使用的药粉或者仅含活性成分，或者由包 含活性成分、适当的稀释剂(例如乳糖)和可选择添加的表面活性 剂的混合药粉组成。活性成分在制剂中所占比例通常从0.1到100 w/w。另一种示例性的气雾发生器由可度量吸入器构成。可度量 吸入器是一种气雾加压输送装置，通常在液化推进剂中含有活性 成分的悬液或溶液制剂。使用这些装置时，通过控制阀门来调节 一定量体积药物的输送，一般为10到150μl，从而产生含有活性 成分的微粒喷雾。适合使用的推进剂包括某些氯氟烃化合物，例 如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷和它们的混合物。 制剂中可另外含有一种或更多的辅助溶剂，例如乙醇、油酸或脱 水山梨醇三硬脂酸酯等表面活性剂、抗氧化剂和合适的调味剂。

气雾剂无论是以固体还是液体微粒的形式存在，均可由气雾 发生器以一定速率制造出来，该速率从每分钟大约10至150升，更 优选每分钟30至150升，最优选每分钟大约60升。气雾剂中所含药 物含量越多，则可被更快速地用药。

以下实例用于解释本发明，不应被理解为限制本发明。在这 些实例中，μM代表微摩尔，mL代表毫升，μm代表微米，mm 代表毫米，cm代表厘米，℃代表摄氏度，μg代表微克，mg代表 毫克，g代表克，kg代表千克，M代表摩尔，h代表小时。

                       实例1

              反义寡核苷酸的设计与合成

设计对应于A1和A3腺苷受体的反义寡核苷酸，可能需要弄清 A1和A3靶受体mRNA复杂的二级结构。获得这种结构后，可设计 出靶向mRNA的特定区域的反义核苷酸，这些区域被认为决定 mRNA的功能活性或稳定性，反义核苷酸最好可覆盖起始密码 子。其它的靶位点也是可用的。为证明反义作用的特异性，其它 不能与靶mRNA完全互补，但按照w/w比例含有同样的核苷酸组 成的寡核苷酸在反义实验中被用来作为对照。

对腺苷A1受体mRNA二级结构进行了分析，并按以上所述用 于设计硫代磷酸酯反义寡核苷酸。所合成的反义寡核苷酸被称为 HAdA1AS，它具有以下序列：

5’-GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG-3’(SEQ ID NO： 1)

作为对照，合成了称为HAdA1MM的错配的硫代磷酸酯反义 核苷酸，其序列如下：

5’-GTA GCA GGC GGG GAT GGG GGC-3’(SEQ ID NO：2)

每种寡核苷酸都具有同样的碱基含量和通用的序列结构°在 GENBANK(85.0版)和EMBL(40.0版)中同源检索结果表明，反义 寡核苷酸对人体和兔子的腺苷A1受体基因具有特异性，而错配的 对照物与任何已知基因序列不存在杂交特性。

腺苷A3受体mRNA的二级结构同样进行了分析，并如上所述 设计出两种硫代磷酸酯反义寡核苷酸。合成的第一种反义寡核苷 酸(HAdA3AS1)具有下面的序列：

5’-GTT GTT GGG CAT CTT GCC-3’(SEQ ID NO：3)

作为对照，合成了错配的硫代磷酸酯反义寡核苷酸 (HAdA3MM1)，它具有以下序列：

5’-GTA CTT GCG GAT CTA GGC-3’(SEQ ID NO：4)

另一种硫代磷酸酯反义寡核苷酸(HAdA3AS2)也被设计并合 成，它具有以下序列：

5’-GTG GGC CTA GCT CTC GCC-3’(SEQ ID NO：5)

它的对照寡核苷酸(HAdA3MM2)具有以下序列：

5’-GTC GGG GTA CCT GTC GGC-3’(SEQ ID NO：6)

硫代磷酸酯寡核苷酸是用Applied Biosystems 396型寡核苷 酸合成仪合成，并采用NENSORB色谱仪(DuPont，MD)纯化。

                      实例2

         A1-腺苷受体反义寡核苷酸的体外检测

通过使用肺腺癌细胞HTB-54作为体外模型，对前面叙述的抗 人A1受体的反义寡核苷酸(SEQ ID NO：1)进行了有效性鉴定。采 用标准的northern印迹方法和实验室设计并合成的受体探针， HTB-54肺腺癌细胞被证明表达A1腺苷受体。

HTB-54人肺腺癌细胞(106/100毫米组织培养皿)用5.0μM HAdA1AS或HAdA1MM处理24小时，并在孵育12小时后更换新 鲜的培养基和寡核苷酸。寡核苷酸处理24小时后，细胞被收获并 按照标准方法提取它们的RNA。一种相应于反义药物作用的靶 mRNA区域的21聚体的探针(因而与反义核苷酸具有同样的序 列，但没有硫代磷酸化)被合成，并被作为经过HAdA1AS处理、 HAdA1MM处理、HAdA1MM处理和无处理的HTB-54细胞中所 制备RNA的探针，用于northern印迹。这些印迹清楚地显示， HAdA1AS而非HAdA1MM能有效(＞50％)减少人腺苷受体 mRNA。该结果表明，HAdA1AS是作为抗哮喘药物的良好候选 者，因为它能减少同哮喘有关的胞内腺苷A1受体的mRNA。

                       实例3

          A1腺苷受体反义寡核苷酸的在体功效

在覆盖起始密码子的腺苷A1基因中，兔与人的DNA序列存在 偶然的同源性，这就允许在兔子模型中使用最初为人腺苷A1受体 而设计的硫代磷酸酯反义寡核苷酸。

新生的无巴斯德菌新西兰白兔，在出生24小时内用312抗原单 位/mL的家居尘螨(D.farinae)提取物(Berkeley Biologicals， Berkeley，CA)与10％的白陶土混合，进行腹膜内免疫。在第一个 月每周重复免疫一次，而随后的两个月每两周进行一次免疫。在3 -4月龄时，8只致敏的兔子经肌肉注射盐酸氯胺酮(44mg/kg)和马 来酸乙酰丙嗪(0.4mg/kg)的混合物进行麻醉和松弛。

然后让兔子放松地仰卧于小的动物模块垫板上，并且用4.0- mm气管插管(Mallinkrodt，Inc.，Glens Falls，NY)进行插管。将一 根外径为2.4mm带有乳胶气囊的聚乙烯导管穿入食管，并在实验 的全过程中与口部保持同样的距离(大约16cm)。气管插管与加热 式Fleisch呼吸速度描记器(size 00；DOM Medical，Richmond，VA) 相连，流量通过由Gould输送放大器(型号11-4113，Gould Electronic，Cleveland，OH)控制的Validyne差异压力换能器(型 号DP-45161927；Validyne Engineering Corp.，Northridge，CA) 来计量。食道气囊与差异压力换能器的一端相连，而气管插管的 外流口与压力换能器的另一端相接，以便记录通过肺部的压力。 流量通过求积分变为连续的波动量，并且全肺耐受性(RL)和动力 顺应性(Cdyn)是在等容和流量零点分别进行计算，该计算通过自 动呼吸分析仪(型号6；Buxco，Sharon，CT)完成。

实验动物经随机选择，在实验第一天测定实验前雾化腺苷的 PC50值。反义(HAdA1AS)或错配对照(HAdA1MM)寡核苷酸溶解 于无菌生理盐水，浓度为5000μg(5mg)/1.0ml。实验动物随后通 过气管插管给予雾化的反义或错配寡核苷酸(大约5000μ g/1.0ml)，每日两次共两天。雾化的盐水、腺苷、反义或错配寡核 苷酸均使用超声喷雾器(DeVilbiliss，Somerset，PA)产生，产生的 雾化液滴80％直径都小于5μm。

实验的第一部分，随机选择4只致敏兔子给予反义寡核苷酸， 另4只给予错配对照寡核苷酸。第三天早晨取得PC50值(与基础值 相比减少支气管呼吸道动力顺应性50％所需雾化腺苷以mg/ml表 示的浓度)，同这些动物未用寡核苷酸前的PC50值进行比较。

间隔一周后动物被互换，以前给予错配对照寡核苷酸的动物 现在给予反义寡核苷酸，而那些以前给予反义寡核苷酸的改为使 用错配对照寡核苷酸。治疗方法与测量方法同第一部分相同。值 得注意的是，8只用反义寡核苷酸治疗的动物中，有6只在腺苷溶 解饱和(20mg/ml)时未出现腺苷诱导的支气管收缩。为了便于计 算，这些动物的PC50值被设定为20mg/ml。此时的测量值因而体 现了反义效应的最小情况。实际效应要高一些。本实验的结果以 图1和表1表示。

表1.腺苷A1受体反义寡核苷酸对哮喘兔子PC50值的作用

    错配对照                     A1受体反义寡核苷酸 寡核苷酸治疗前 寡核苷酸治疗后 寡核苷酸治疗前 寡核苷酸治疗后  3.65±1.02  5.16±1.93  2.36±0.68 ＞19.5±0.34**

结果以平均值(N＝8)±标准误表示。显著性通过重复测量值 方差分析(ANOVA)和Tukey’s protected t检验确定。**代表与 所有其它组相比有显著差异，P＜0.01。

在实验的两部分中，雾化腺苷剂量为使肺动力顺应性减少 50％时，用反义寡核苷酸治疗的动物表现出明显的增加；而错配 对照寡核苷酸未发现对PC50值有影响。任何接受反义或对照寡核 苷酸吸入的动物也未观察到中毒现象。

这些结果清楚地表明，肺脏具有极大潜力可作为基于反义寡 核苷酸的介入治疗的靶器官。这些结果进一步说明，在模拟人类 哮喘的模型中，下调腺苷A1受体能在很大程度上消除在哮喘呼吸 道中由腺苷诱导的支气管收缩。由于参与支气管过度应答的组织 接近雾化寡核苷酸的作用位点，所以在人哮喘的过敏性兔子模型 中，这种反应是反义物质介入治疗时极好的终点，并且该模型能 很好地模仿这种很重要的人类疾病。

                        实例4

           A1-腺苷受体反义寡核苷酸的特异性

总结实例3中的互换实验，所有兔子的呼吸道肌肉都进行了腺 苷A1受体数目的定量分析。作为反义寡核苷酸特异性的对照受体 -腺苷A2受体，其数目也作了定量分析，这种受体不应受到影响。

每只兔子的呼吸道肌肉组织经解剖，其膜部分按以下描述的 方法(J.Kleinstein和H.Glossmann《Naunyn-Schmiedeberg’s药 理学进展》305，191-200(1978))制备，只作少量的改变。粗质膜 制备物储存在-70℃直到分析时使用。蛋白含量采用 Bradford(M.Bradford，《分析生物化学》72，240-254(1976)) 方法测定。冷冻的质膜在室温解冻，与0.2U/ml腺苷脱氨酶一起37 ℃孵育30分钟，以去除内源性的腺苷。按以前描述的方法测定 [3H]DPCPX(A1受体特异)或[3H]CGS-21680(A2受体特异)结合， 参见S.Ali等，《药理学实验治疗杂志》268，1328-1334(1994)； S.Ali等，《美国生理学杂志》266，L271-277(1994)。

如图2和表2所示，利用A1特异拮抗剂DPCPX分析特异性结 合，在互换实验中用腺苷A1反义寡核苷酸治疗的动物与对照组相 比，A1受体数目减少了将近75％，而用A2受体特异拮抗剂2-[对(2- 羧乙基)-苯乙氨基]-5’-(N-乙羧酰氨基)腺苷(CGS-21680)分析，腺 苷A2受体数目无变化。

表2.腺苷A1受体反义寡核苷酸作用的特异性

            错配对照寡核苷酸 A1反义寡核苷酸 A1-特异结合 1105±48**  293±18 A2-特异结合 302±22  442±171

结果以平均值(N＝8)±标准误表示。显著性通过重复测量值 方差分析(ANOVA)和Tukey’s protected t检验确定。**代表与错 配对照相比有显著差异，P＜0.01。

以上证明了反义寡核苷酸治疗呼吸道疾病的作用。因为上述 反义寡核苷酸消除了引起腺苷介导的支气管收缩的受体系统，因 而不必迫切地去除其中的腺苷。然而，较优选从这些寡核苷酸中 去除腺苷。这类无腺苷寡核苷酸的例子在下述实例5中提供。

                        实例5

本发明的方法也被用于下述与对应靶蛋白作用的反义寡核苷 酸，与前述方法基本上一致，以治疗肺部的各种疾病。下述一系 列的反义寡核苷酸，是以参与炎症的蛋白的mRNA为目标。这些 寡核苷酸中去除了腺苷，以免降解时释放腺苷。

在后文中，炎症相关蛋白名称后所给出的第一段序列，是靶 向起始密码子的反义序列，其中天然腺苷被以下情况之一所代替 (1)非腺苷的普通碱基，(2)腺苷类似物，但缺少与腺苷A1和/或 A3受体的结合能力，或(3)一段“间隔区”。所有这三种情况在序 列中都以字母B表示，并经IUPAC-IUB命名委员会确认为“无- A”。参见《专利使用者手册》99页(1990年11月)。在靶向起始密 码子的反义序列后列出的是附加反义寡核苷酸序列，它针对靶蛋 白mRNA的其它部位。这些附加序列是“脱-腺苷反义序列”， 在序列中不含有腺苷。

以下序列的片段至少是10个、更优选至少是12个核苷酸长 度，它们也属于本发明的一个方面，可用于实施本发明。以下所 示片段跨越多个检验行，“5’-”表示始端，“-3’”表示末端。 人A1腺苷受体：

      5′-GGC GGC CTG GBB BGC TGB GBT GGB GGG CGG CBT

      GGC GGG CBC BGG CTG GGC-3′

      脱-腺苷反义序列

      TTT TCC TTC CTT TGT CTC TCT TC

      GCT CCC GGC TGC CTG

      CTC GGC CGT GCG GCT CTG TCG CTC CCG GT

      CCG CCG CCC TCC GGG GGG TC

      TGC TGC CGT TGG CTG CCC

      CTT CTG CGG GTC GCC GG

      TGC TGG GCT TGT GGC

      GGC CTC TCT TCT GGG

      CCT GGT CCC TCC GT

      GGT GGC TCC TCT GC

      GCT TGG TCC TGG GGC TGC

      TGC TCT CCT CTC CTT 人A2a腺苷受体：

     GTBCBCCGBGGBGCCCBTGBTGGGCBTGCCBCBGBCGBCBGGC

     脱-腺苷反义序列：

     HSA2ARECAS1：TGC TTT TCT TTT CTG GGC CTC(SEQ

         ID NO ：7)

     HSA2ARECAS2：TGT GGT CTG TTT TTT TCT G

     HSA2ARECAS3：GCC CTG CTG GGG CGC TCT CC

     HSA2ARECAS4：GCC GCC CGC CTG GCT CCC

     HSA2ARECAS5：GGB GCC CBT GBT GGG CBT GCC

     HSA2ARECAS6：GTG GTT CTT GCC CTC CTT TGG CTG

     HSA2ARECAS7：CCG TGC CCG CTC CCC GGC

     HSA2ARECAS8：CTC CTG GCG GGT GGC CGT TG

     HSA2ARECAS9：GGC CCG TGT TCC CCT GGG

     HSA2ARECAS10：GCC TGG GGC TCC CTT CTC TC

     HSA2ARECAS11：GCC CTT CTT GCT GGG CCT C

     HSA2ARECAS12： TGC TGC TGC TGG TGC TGT GGC CCCC 人A2b腺苷受体：

     5′-BCBGCGCGTCCTGTGTCTCCBGCBGCBTGGCC

         GGGCCBGCTGGGCCCC-3′

     脱-腺苷反义序列：

     HSA2BRECAS1：5′-GGC GCC GTG CCG CGT CTT GGT GGC

               GGC GG-3′(SEQ ID NO：8)

     HSA2BRECAS2：5′-GTT CGC GCC CGC GCG GGG CCC CTC

               CGG TCC-3′

     HSA2BRECAS3：5′-TTG GCC CGC GCG CCC GCC CGT CTC

               GGG CTG GGC GG-3′

     HSA2BRECAS4：CGG GTC GGG GCC CCC CGC GGC C

     HSA2BRECAS5：5′-GCC TCG GGG CTG GGG CGC TGG TGG

               CCG GG-3′

     HSA2BRECAS6：CCG CGC CTC CGC CTG CCG CTT CTG

     HSA2BRECAS7：GCT GGG CCC CGG GCG CCC CCT

     HSA2BRECAS8：CCC CTC TTG CTC GGG TCC CCG TG 人A3腺苷受体：

     5′-BCB GBG CBG TGC TGT TGT TGG GCB TCT TGC CTT

     CCC BGG G-3′

     脱-腺苷反义寡核苷酸：

     CCC TTT TCT GGT GGG GTG

     GTG CTG TTG TTG GGC

     TTT CTT CTG TTC CC 人IgE受体β：

     5′-BTTTGCTCTCCTBTTBCTTTCTGTGTCCBTTTTTT

         CBTTBBCCGBGCTGT-3′

     脱-腺苷反义序列：

     HUMIgEβrAS1：TTT CCC CTG GGT CTT CC (SEQ ID

               NO：9)

     HUMIgEβrAS2：CTC CTG CTC TTT TTT C 人Fc-ξ受体CD23抗原(IgE受体)：

     5′-TCTCTGBBTBTTGBCCTTCCTCCBTGGCGGTCCTGCTT

         GGBTTCTCCCGB-3′

     脱-腺苷反义序列：

     HUMIgErCD23AS1：GCC TGT GTC TGT CCT CCT(SEQ

                    ID NO：10)

     HUMIgErCD23AS2：GCT TCG TTC CTC TCG TTC

     HUMIgErCD23AS3：CTG CTT GGT GCC CTT GCC G

     HUMIgErCD23AS4：GTC CTG CTC CTC CGG GCT GTG G

     HUMIgErCD23AS5：5′-GTC GTG GCC CTG GCT CCG

          GCTGGT GGG CTC CCC TGG-3′

     HUMIgErCD23AS6：CCT TCG CTG GCT GGC GGC GTG C

     HUMIgErCD23AS7：GGG TCT TGC TCT GGG CCT GGC TGT

     HUMIgErCD23AS8：GGC CGT GGT TGG GGG TCT TC

     HUMIgErCD23AS9：GCT GCC TCC GTT TGG GTG GC 人IgE受体，α亚单位：

     5′-BCBGTBGBGTBGGGGBTTCCBTGGCBGGBGCCBTC

         TTCTTCBTGGBCTCC- 3′

     及

     5′-TTC BBG GBG BCC TTB GGT TTC TGB GGG BCT GCT

     BBC BCG CCB TCT GGB GC-3′

     脱-腺苷反义序列：

     HUMIgErαAS1：GCCTTTCCTGGTTCTCTT(SEQ ID NO：11)

     GTT GTT TTT GGG GTT TGG CTT 人IgE受体，FcξR：

     5′-GBT CTC TGB BTB TTGB CCT TCC BTG GCG GTC CTG

     CTT GGB-3′

     脱-腺苷反义序列：

     HSJGEBFRAS1：GCC TGT GTC TGT CCT CCT(SEQ ID

              NO：12)

     HSJGEBFRAS2：GCT TCG TTC CTC TCG TTC

     HSJGEBFRAS3：CTG CTT GGT GCC CTT GCC G

     HSJGEBFRAS4：GTC CTG CTC CTC CGG GCT GTG G

     HSJGEBFRAS5：5′-GTC CTC GCC CTG GCT CCG GCT GGT

               GGG CTC CCC TGG-3′

     HSJGEBFRAS6：CCT TCG CTG GCT GGC GGC GTG C

     HSJGEBFRAS7：CCC BGB BCG BGB CCC GGB CCG BCB

     HSJGEBFRAS8：GGC CGT GGT TGG GGG TCT TC

     HSJGEBFRAS9：GCT GCC TCC GTT TGG GTG GC 人组氨酸脱羧酶：

     5′-CTC TGT CCC TCT CTC TCT GTB CTC CTC BGG CTC

     CBT CBT CTC CCT TGG GC-3′

     脱-腺苷反义序列：

     HUMHDCAS1：TCT CCC TTG GGC TCT GGC TCC TTC TC

               (SEQ ID NO：13)

      HUMHDCAS2：TCT CTC TCC CTC TCT CTC TGT

      HUMHDCAS3：CGCCTCCGCCCTGGCTGCTGGGGTGGTGGTGC

      HUMHDCAS4：TTT TGT TCT TCC TTG CTG CC

      HUMHDCAS5：GCC CCG CTG CTT GTC TTC CTC G 人β类胰蛋白酶：

      5′-GGG CCT GGC CTG GGG CBG GGG CCG CGT BGG CGC

      GGC TCG CCB GGB CGG GCB GCG CCB GCB GCB GCB GBT

      TCB GCB TCC TGG-3′

      脱-腺苷反义序列：

      HUMBTRYPAS1：CTTGCTCCTGGGGGCCTCCTG(SEQ ID

          NO：4)

      HUMBTRYPAS2：GTC CCT CCG GGT GTT CCC GGC 人类胰蛋白酶-I：

     5′-CCT GGB CTG GGG CBG GGG CCG CGT BGG CGC GGC

     TCG CCB GGB CGG GCB GCG CCB GCB GCB GCB GGC TCB

     GCB TCC TGG CCB CGG BBT TCC-3′

     脱-腺苷反义序列：

     HUMTRYAS1：CTTGCTCCTGGGGGCCTCCTG(SEQ ID NO：15)

     HUMTRYAS2：GTC CCT CTG GCT G TT CCC GGC 人前列腺素D合酶：

     5′-CCC CBG CBG GBC CBG TCC CBT CCB CBG CGT GTG

     BTG BGT BGC CBT TCT CCT GCB GCC GBG-3′

     脱-腺苷反义序列：

     HUMPROSYNAS1：GGTGTGCGGGGCCTGGTGCC(SEQ ID NO：16)

     HUMPROSYNAS2：CCT GGG CCT CGG GTG CTG CCT GT

     HUMPROSYNAS3：GCG CTG CCT TCT TCT CCT GG

     HUMPROSYNAS4：5′-GTC CTC GCC GGG GCC CTT GCT

                   GCC CTG GCT GT -3′

     HUMPROSYNAS5：GCC CTG GGG GTC TGG GTT CGGCTGT 人环加氧酶-2：

     5′-TGB GCG CCB GGB CCG CGC BCB GCB GCB GGG  CGC

     GGG CGB GCB TCG CBG CGG CGG GCB GGG-3′

     脱-腺苷反义序列：

     HUMCYCLOXAS1：GGGCGCGGGCGBGCBTCGC(SEQ ID NO：17)

     HUMCYCLOXAS2：TTT GGG CTT TTC TCC TTT GGT T 人嗜酸性粒细胞阳离子蛋白：

     5′-CBG BCB BBT TTG GGB BGT GBB CBG TTT TGG BBC

     CBT GTT TCC CBG TCT CTG BGC TGT GGC-3′

     脱-腺苷反义序列：

     HSECPAS1：CCTCCTTCC TGG TCT GTC TGC(SEQ ID

              NO：18) 人嗜酸性粒细胞衍生神经毒素：

     5′-CCC CBB CBG BBG BBG CBG BCB BBT TTG GGB BGT

     GBB CBG TTT TGG BBC CBT GTT TCC TGT-3′

     脱-腺苷反义序列：

     HSEOSDNAS1：GCC CTG CTG CTC TTT CTG CT(SEQ ID

          NO：19)

     HSEOSDNAS2：TCC CTT GGT GGG TTG GGC C

     HSEOSDNAS3：GCT GGT TGT TCT GGG GTT C

     HSEOSDNAS4：TTG CTG CCC CTT CTG TCC C

     HSEOSDNAS5：TGT TTG CTG GTG TCT GCG C 人嗜酸性粒细胞主要碱性蛋白：

     GGG GGB GTT TCB TCT TGG CTT T

     脱-腺苷反义序列：

     TCT CCC CTT GTT CCT CCC C

     TCT CCT GCT CTG GTG TCT CCT C

     TTC CCT CCC TCC CCT GCC

     GTG TTG TCT GTG GGT GTC C

     GTT TCG CTC TTG TTG CCC

     TGG GCC CTT CCC TGC TGG 人嗜酸性粒细胞过氧化物酶：

     5′-GCB CCG TCC BGT GBT GGT GCG GTB CTT GTC GCT

     GCB GCG CTC GGC CTG GTC CCG GBG BGC-3′

     脱-腺苷反义序列：

     HSEPAS1：GCGCTCGGCCTGGTCCCGG (SEQ ID NO：20)

     HSEPAS2：GGG TCT CCT CTT GTT GTT GC

     HSEPAS3：TTG CGC CTC CTG CTG GGG GT CC

     HSEPAS4：CTC TGT TCT TGT TTT GGG GGC

     HSEPAS5：GGG CCC GGC CGT TGT CTT G

     HSEPAS6：GTT TGG GGG TTT CCG TTG

     HSEPAS7：GGG TTC TCC TGG CCC GGG CCT TGC CC

     HSEPAS8：GGC CGT GGT CCC GGC TTC GTT GC

     HSEPAS9：CCT GTC TCC GTC TCG GCT CTT CTG

     HSEPAS10：GGG CCT TGC GCT GTC TTT GGT G 人细胞间粘附分子-1(CAM-1)

     5′-CGG BGC CTC CCC GGG GCB GGB TGB CTT TTG BGG

     GGG BCB CBG BTG TCT GGG CBT TGC CBG GTC CTG GGB

     BCB GBG CCC CGB GCB GGB CCB GGB GTG CGG GCB GCG

     CGG GCC GGG GGC TGC TGG GBG CCB TBG CGB GGC TGB

     G-3′

     脱-腺苷反义序列：

     HSICAM1AS1：GCGCGGGCCGGGGGCTGCTGGG(SEQ ID

              NO：21)

     HSICAM1AS2：GGT TGG CCC GGG GTG CCC C

     HSICAM1AS3：GCC GCT GGG TGC CCT CGT CCTCTGCGGTC

     HSICAM1AS4：GTG TCT CCT GGC TCT GGT TCC CC

     HSICAM1AS5：5′-GCT GCG CCC GTT GTC CTC TGG GGT

          GGCCTTC-3′

       HSICAM1AS6：GCT CCC GGG TCT GGT TCT TGT GT

       HSICAM1AS7：TGG GGG TCC CTT TTT GGG CCT GTT GT

       HSICAM1AS8：GGC GTG GCT TGT GTG TTC GGT TTC

       HSICAM1AS9：TGC CCT GTC CTC CCG COT CCC 人血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)：

       5′-CTG BGC BBG BTB TCT BGB TTC TGG GGT GGT CTC

       GBT TTT BBBB GCT TGB GBB GCT GCB BBC BTT BTC

       CBB BGT BTB TTT GBG GCT CCB BGG BTC BCG BCC BTC

       TTC CCB GGC BTT TTB BGT TGC TGT CGT-3′

       脱-腺苷反义序列：

       HSVCAM1AS1：CCTCTTTTCTGTTTTTCCC(SEQ ID NO：22)

       HSVCAM1AS2：CTC TGC CTT TGT TTG GGT TCG

       HSVCAM1AS3：CTT CCT TTC TGC TTC TTC C

       HSVCAM1AS4：CTGTGTCTCCTGTCTCCGCTTTTTTCTTC

       HSVCAM1AS5：GTC TTT GTT GTT TTC TCT TCC TTG 人内皮白细胞粘附分子(ELAM-1)：

       5′-BBG TGB GBG CTG BGB GBB BCT GTG BBG CBB TCB

       TGB CTT CBB GBG TTC TTT TCB CCC-3′

       脱-腺苷反义序列：

       HUMELAM1AAS1：GTTCTTGGCTTCTTCTGTC(SEQ ID NO：23)

       HUMELAM1AAS2：CGT TGG CTT CTC GTT GTC CC

       HUMELAM1AAS3：TGT GGG CTT CTC GTT GTC CC

       HUMELAM1AAS4：CCC TTC GGG GGC TGG TGG

       HUMELAM1AAS5：GGC CGT CCT TGC CTG CTG G 人P选择素：

       脱-腺苷反义序列：

       HUMPSELECTAS1：CTCTGCTGGT TTTCTGCCTT CTGCCC

                      (SEQ ID NO：24) 人内皮单核细胞激活因子：

       脱-腺苷反义序列：

       HUMEMAPIIAS1：5′-TTT TCT CTT TCG CTT TCT TTT

            CGTCTCCTGTTCCTCCTTTT-3′(SEQ ID NO

              ：25)

       HUMEMAPIIAS2：5′-TTG CTG TTT TTT CTC CTT CTT

                 CTC TCC TTT CTT TTC-3′ 人IL3：

       5′-GGCGGBCCBGGBGTTGGBGCBGGBGCBGGBCGGGCB

           GGCGGCTCBTGTTTGGBTCGGCBGGBGGCBCTC-3′

       脱-腺苷反义序列：

       HUMIL3AAS1：5′-CTC TGT CTT GTT CTG GTC CTT CGT

            GGG GCT CTG (SEQ ID NO：26)-3′

       HUMIL3AAS2：TGT CGC GTG G GTG CGG CCG TGG CC 人IL3受体：

       5′-GCBGGBGBCBGGGCBGGGCGBTCBCGGBGCBGCGT

           GBGCCBBBGGBGGBCCBTCGGGBBCGCBGCTCCG

           GBBCGCBGGBCBGBGGTGCC-3′

  脱-腺苷反义序列：

  TCTGGGGTGTCCTG

  GCCTTCGTGGTTCC

  TCTTCCTTCGTTTGC

  CGTCCGCGGGGGCCCCCGGGCCT

  GGCTGCGCTCCTGCCCCGC

  CTCTTTCCCGGGCTCTT

  GCGCTGGGGGGTGCTCC

  CGTGTGTTTGCGCCCTCCTCCTGGTCGC

  GCTTGTCGTTTTGG

  GGCCGGCTTTGCCCGCCTCCC

  GGCGCCTGGCCCGGCC

  TTCCTGGGCTGCGTGCGC

  GTTCTGTTCTTCTTCCTGGC 人IL4：

  5′-GCCGGCBCBTGCTBGCBGGBBGBBCBGBGGGGGB

  BGCBGTTGGGBGGTGBGBCCCBTTBBTBGGTGTCGB-3′

  脱-腺苷反义序列：

  HUMIL4AS1：CTC TGG TTG GCT TCC TTC-3′

  (SEQ ID NO：27) 人IL4受体：

 5′-GTTCCCBGBGCTTGCCBCCTGCBGCBGGBCCBGGCBGCTC

     BCBGGGBBCBGGBGCCCBGBGCBBBGCCBCCCCBTTGGGBG

     BTGCCBBGGCBCCBGGCTG-3′

  脱-腺苷反义序列：

  TCTGCGCGCCCCTGCTCC

  CGCCCGGCTTCTCT

  CGTGTGGGCTTCGG

  CCCCGCGCCTCCGTTGTTCTC

  TGCTCGCTGGGCTTG

  GGTTTCCTGGGGCCCTGGGTTTC

  TCTGCCGGGTCGTTTTC

  GGGTGCTGGCTGCG

  CTTGGTGCTGGGGCTCC

  GGCGGCTGCGGGCTGGGTTGGG

  CTTGGCTGGTTCCTGGCCTCGGG

  CCTCCTCCTCCTCCTC

  GCTCCCTTTTTCTTCCTCT

  TCCCTGCTGCTCTC

  TGCCCTCCCTTCCCTCCTGG

  GGTGCCTCCTTGGGCCCTGC

  GGCTGCTCCTTGCCCC

  CTCTGGGTCGGGCTGGC

  GGGGCGTCTCTGTGC

  CTGGCCTGGGTGCC

  GCCTCTCCTGGGGG

  GGTGGCTCCCTGTCC

  CCTTTTCCCCCGGCTCC

  GTGGGGGCTTTGGC

  GGGGGTCTGTGGCCTGCTCCTGGGG

  AGGGGTCTGGGGCCCTC

  TTTTGGGGGTCTGGCTTG

  GCCTGGCTGCCTTCC

  GGGGCCTGCCGTGGGGC

  TGTCCTCTGTTGCTCCCCTT

  TGCCTGCTGTCTGG

  GGTTCCCGCCTTCCCT 人IL5：

  5′-GTGGGBBTTTCTGTGGGGBTGGCBTBCBCGTBGGCB

      GCTCCBBGBGCTBGCBBBCTCBBBTGCBGBBGCBTC

      CTCBTGGCTCTGBBBCG-3′

     脱-腺苷反义序列：

     HUMIL5AS1：TCC CTG TTT CCC CCC TTT(SEQ ID

              NO：28)

     HUMIL5AS2：CGT TCT GCG TTT GCC TTT GGC

     HUMIL5AS3：GTT TTT TGT TTG TTT TCT

     HUMIL5AS4：CTC TCC GTC TTT CTT CTC C

     HUMIL5AS5：CCT CCT GCC TGT GTC CCT GCT CCC C

     HUMIL5AS6：GAG GGT TTC TGG CTT CCT CTC T

     HUMIL5AS7：TGT CTC TCT GTC CTT TTG TT

     HUMIL5AS8：5′-TGT TGT GCG GCC TGG TGC TGC CCT

                GCCCCG GG-3′ 人IL5受体反义寡核苷酸：

     5′-CTCBGTGGCCCCCBBBBGGBT

         GBGTBBTBCBTGCGCCBCGBT

         GBTCBTBTCCTTTTTBCTBTGBGG-3′

     脱-腺苷反义序列：

     CCGTGTCTGTCGTGTCT

     TTCCTTTGCTCTTG

     GTGTGTCTTTGCTGT

     GCCCTGCCTCTCTGC 人IL6：

     5′-CTCCTGGGGGTBCTGGGGCBGGGBB

         GGCBGCBGGCBBCBCCBGGBGCBGC

         CCCBGGGBGBBGGCBBCTGGBCCGB

         BGGCGCTTGTGGBGBBGGBGTTCBT

         BGCTGGGCTCCTGGBGGGGBGBTBGBGC-3′

     脱-腺苷反义序列：

     HUMIL6AS1：GCT TCT CTT TCG TTC CCG GTG GGC TCG

          (SEQ ID NO：29)

     HUMIL6AS2：GTG GCT GTC TGT GTG GGG CGG CT

     HUMIL6AS3：GTG CCT CTT TGC TGC TTT C

     HUMIL6AS4：GAT TCT TTG CCT TTT TCT GC 人IL6受体反义寡核苷酸：

     5′-GCBCGCCTCTTGCCBCCTCCTGCGCBGGGCB

     GCGCCTTGGGGCCBGCGCCGCTCCCGGCGCG

     GCCBGCBGGGCBGCCBGCBGCGCGCBGCCGB

     CGGCCBGCBTGCTTCCTCCTCGGCTBCCBCT

     CCBTGGTCCCGCBGBGGCGGBCBGGC-3′

     脱-腺苷反义序列：

     GGGGGTGGCTTCCTGCC

     GCGTCTCTGGGCCGTCCC

     GTCCCTCGGCCCCGCGCCGCGCTCGGCTCCTCTCCC

     TCTGGCCCGGCTC

     GGGGCGGGGCGGGGCGGTGGGCGGGC

     GGCGCTGCCCTGCGC

     GCGGCGCTGGCCCC

     TGCTGGCCGTCGGCTGCGCGCTGCTGGCTGCCCT

     GCTGGCCGCGCCGGG

     GCCTGTCCGCCTCTGCGGG

     CGCTGTCTCCTGGC

     TTGTCTTCCGGCTCT

     TCTGCTGGGGTGGG

     GCTGGGCGGCCGGCCCGGT

     GCTGGGGCTCCTCGGGGGG

     GGGGGCTCTTCCGG

     GCTGTCTCCCTCCGGG

     GCGGGGGTTTCTGGCC

     GTGGGGGTCTTGCC

     TGGCCTCCGGGCTCC

     TGCTTGTCTTGCCTTCCTTC

     TCTGGTCGGTTGTGGCTCG

     GGGCTCCGTGGGTCCCTGGC

     GCCCGTTTGTGTTTTGTC

     TTTTCCCCTGGCGT

     CCCTGTGCCCCTCTCCTCTCCTTCCTCTGCTTCTC

     GCTCTCCTTTGTGGG

     GCCCTCCCTGCTGCT

     CTTGGTTTTGGGCT

     TTTTTTCTCTTCCTCCTTTTTC

     GTGCGTGGGCCTCC 人单核细胞衍生中性粒细胞趋化因子：

     5′-GGGGTGGBBBGGTTTGGBGTBTGTCTTTBTGCBCTGB

     CBTCTBBGTTCTTTBGCBCTCCTTGGCBBBBCTGCBC

     CTTCBCBCBGBGCTGCBGBBBTCBGGBBGGCTGCCBB

     GBGBGCCBCGGCCBGCTTGGBBGTCBTGTTTBCBCBC

     BGTGBGBTGGTTCCTTCCGG-3′

     脱-腺苷反义序列：

     HSMDNCFAS1：GCT TGT GTG CTC TGC TGT CTC T(SEQ

          ID NO：30)

     HSMDNCFAS2：5′-TGG TTC CTT CCG GTG GTT TCT TCC

          TGG CTC TTG TCC T -3′

     HSMDNCFAS3：TTC TCT TGG CCC TTG GC 人中性粒细胞弹性蛋白酶(medullasin)：

     5′-GGGCTCCCGCCGCGBGBGGTTBTGGGCTCCCBGGBCCBC

     CCGCBCCGCGCGGBCGTTTBCBTTCGCCBCGCBGTGCGC

     GGCCGBCBTGBCGBBGTTGGGCGCBBTCBGGGTGGCGCC

     GCBGBBGTGGCCTCCGCGCBGCTGCBGGGBCBCCBTGBB

     GGGCCBCGCGTGGGGCCGCGCTCGCCGGCCCCCCBCBBT

     CTCCGBGGCCBGCGCGGTGCCCCCCBGCBGCBBGGCCGG

     CBGGBCBCBGGCGBGGBGBCBCGCGBGTCGGCGGCCGBG

     GGTCBTGGTGGGGCTGGGGCTCCGGGGTCTCTGCCCCTC

     CGTGC-3′

     脱-腺苷反义寡核苷酸：

     HSMEDURAS1：5′-TGG TGG GGC TGG GGC TCC GGG GTC

               TCT GCC CCT CCG TGC-3′(SEQ ID NO：31)

     HSMEDURAS2：CGC GTG GGG CCG CGC TCG CCG GCCCCCC

     HSMEDURAS3：CCT GCC GGG TGG GCT CCC GCC GCG

     HSMEDURAS4：CGC CGG CCT GCC GGC CCC TC

     HSMEDURAS5：5′-GTG GGT CCT GCT GGC CGG GTC CGG

               GTC CCG GGG GTG GGG-3′

     HSMEDURAS6：CGC GBG TCG GCG GCC GBG GGT C 人中性粒细胞氧化酶因子：

     5′-CGGGBGTGGGGGTCCTGGBCGGCBCTGBBGGCBTCCBGGG

     CTCCCTTCCBGTCCTTCTTGTCCGCTGCCBGCBCCCCTTC

     BTTCCBGBGGCTGBTGGCCTCCBCCBGGGBCBTGBTTBGG

     TBGBBBCTBGGBGGCC-3′

     脱-腺苷反义序列：

     HUMNOXFAS1：GGC CTC CBC CBG GGB CBT G(SEQ ID

          NO：32)

     HUMNOXFAS2：GTC CTT CTT GTC CGC TGC C

     HUMNOXFAS3：TCT CTG GGG TTT TCG GTC TGG GTG G

     HUMNOXFAS4：GCT TTC CTC CTG GGG CTG CTG CTG

     HUMNOXFAS5：5′-GGC TCT TCT TTT TGT TTC TGG CCT

          GGTG-3′

     HUMNOXFAS6：CTC TCT CGT GCC CTT TCC

     HUMNOXFAS7：CTT GGG TGT CTT GTT TTT GT

     HUMNOXFAS8：5′-GGCCTCCBCCBGGGBCBTGGTCCTTCTT

                GTCCGCTGCC-3′ 人组织蛋白酶G：

      5′-CCCTCCBCBTCTGCTCTGBCCTGCTGGBCTCTG

          GBTCTGBBGBTBCGCCBTGTBGGGGCGGGBGTG

          GGGCCTGCTCTCCCGGCCTCCGBTGBTCTCCCCT

          GCCTCBGCCCCBGTGGGTBGGBGBBBGGCCBGCB

          GBBGCBGGBGTGGCTGCBTCTTTCCTG-3′

      脱-腺苷反义序列：

      HUMCTHGAS1：GTG GGG CCT GCT CTC CCG GCC TCC G

           (SEQ ID NO：33)

      HUMCTHGAS2：TGTGTTGCTGGGTGTTTTCCCGTCTCTGG

      HUMCTHGAS3：TCT GCC TTC GGG GGT CGT 人防卫素1：

     5′-CCGGGGCTGCBGCBBCCTCBTCBGCTCTTGCCT

     GGBGTGGCTCBGCCTGGGCCTGCBGGGCCBCCB

     GGBGBBTGGCBGCBBGGBTGGCGBGGGTCCTCB

     TGGCTGGGGTCBCBGBTCCTCTBGCTBGGCBGG

     GTGBCCBGBGBGGGC-3′

     脱-腺苷反义序列：

     HUMDEF1AAAS1：GGG TCC TCB TGG CTG GGG(SEQ ID

          NO：34)

     HUMDEF1AAAS2：GCC TGG GCC TGC BGG GCC

     HUMDEF1AAAS3：GCT CTT GCC TGG BGT GGC TC

     HUMDEF1AAAS4：GCC CBG BGT CTT CCC TGG T 人防卫素3：

     5′-CGCTGCBBTCTGCTCCGGGGCTGCBGCBBCCTCBTC

     BGCTCTTGCCTGGBGTGGCTCBGCCTGGGCCTGCBG

     GGCCBCCBGGBGBBTGGCBGCBBGGBTGGCGBGGGT

     CCTCBTGGCTGGGGTCBCCTGGBGGBGGGBGBGCBGG-3′

     脱-腺苷反义序列：

     HUMNTRIIIAS1：GGG TCC TCB TGG CTG GGG TC(SEQ

          ID NO：35)

     HUMNTRIIIAS2：CCT CTC TCC CGT CCT 人巨嗜细胞炎性蛋白-1-α：RANTES受体：

     5′-GBGGGGGCBGCBGTTGGGCCCCBBBGGCCCTCTCGT

     TCBCCTTCTGGCBCGGBGTTGCBTCCCCBTBGTCBB

     BCTCTGTGGTCGTGTCBTBGTCCTCTGTGGTGTTTG

     GBGTTTCCBTCCCGGCTTCTCTCTGGTTCCBBGGGB-3′

     脱-腺苷反义序列：

     HUMRANTESAS1：GTC TTT GTT TCT GGG CTC GTG CC

               (SEQ ID NO：36)

     HUMRANTESAS2：CCB TCC CGG CTT CTC TCT GGT TCC

     HUMRANTESAS3：GTC CTC TGT GGT GTT TGG

     HUMRANTESAS4：5′-CCC TGC TTC CTT TTG CCT GTT

          TCTTTGTTT CTGGGCTCGT GCC -3′ RANTES：

     5′-GGGCBCGGGGCBGTGGGCGGGCBBTGTBGGC

     BBBGCBGCBGGGTGTGGTGTCCGBGGBBTBTGGG

     GBGGCBGBTGCBGGBGCGCBGBGGGCBGTBGCBB

     TGBGGBTGBCBGCGBGGCGTGCCGCGGBGBCCTTC

     BTGGTBCCTGTGGBGBGGCTGTCGGBGG-3′

     脱-腺苷反义序列：

     GGGTGTGGTGTCCG

     CTTGGCGGTTCTTTCGGGTG

     TTTCTTCTCTGGGTTGGC

     CTGCTGCTCGTCGTGGTC

     GCTCCGCTCCCGGGTTC

     GTCTCGCTCTGTCGCCC

     CTTCCTTCCTTGTC

     GTGTTCCTCCCTTCCTTGCCTCT 人毒蕈碱性乙酰胆碱受体HM1：

     脱-腺苷反义序列：

     HSHM1AS1：GTT CBT GGT GGC TBG GTG GGG C(SEQ ID

              NO：37)

     HSHM1AS2：GCT GCC CGG CGG GGT GTG CGC TTG GC

     HSHM1AS3：GCTCCCGTG CTC GGT TCT CTG TCTCCCGGT

     HSHM1AS4：CCC CCT TTG CCT GGC GTC TCG G

     HSHM1AS5：GCC TTC GTC CTC TTC CTC TTC TTC CTTCC

     HSHM1AS6：5′-GCT CCG TGG GGG CTG CTTGGTGGG

               GGCCTG TGC CTC GGG GTC C-3′

     HSHM1AS7：CGG GGC TTC TGG CCC TTG CC 人毒蕈碱性乙酰胆碱受体HM3：

     脱-腺苷反义序列：

     HSHM3AS1：GGG GTG GGT BGG CCG TGT CTG GGG(SEQ

              ID NO：38)

     HSHM3AS2：GTT GGC CBT GTT GGT TGC C

     HSHM3AS3：TCT TGG TGG TGC GCC GGG C

     HSHM3AS4：5′-GCG TCT TGG CTT TCT TCT CCT TCG

               GGC CCT CGG GCC GGT GCT TGT GG-3′

     HSHM3AS5：5′-GCT CCT CCC GGG CGG CCT CCC CGG

               GCG GGG GCT TCT TG-3′

     HSHM3AS6：GCG CTG GCG GGG GGG CCT CCT CC

     HSHM3AS7：5′-GCT CTG TGG CTG GGC GTT CCT TGG

               TGT TCT GGG TGG C-3′

     HSHM3AS8：TGG CGG GCG TGG TGG CCT CTG TGG TGG

     HSHM3AS9：GGG CCC GCG GCT GCB GGG G

     HSHM3AS10：TTG CCT GTC TGC TTC GTC

     HSHM3AS11：CTT TGC GCT CCC GGG CCG CC 人纤连蛋白：

      脱-腺苷反义序列：

      HUMFNA/HSFIB1AS1：CGG TTT CCT TTG CGG TC(SEQ

           ID NO：39)

      HUMFNA/HSFIB1AS2：TTG GCC CGG GCT CCG GGT G

      HUMFNA/HSFIB1AS3：CCC GCC CGC CCG CCG GCC GCCGC

      HUMFNA/HSFIB1AS4：5′-CCC GCC GGG CTG TCC CCG

                          CCC CGC CCC-3′

      HUMFNA/HSFIB1AS5：GGC CCG GGG CGC GGG GG

      HUMFNA/HSFIB1AS6：CGG CCC TCC CGC CCC TCT GG

      HUMFNA/HSFIB1AS7：GCC GGC GCG GGC GTC GG

      HUMFNA/HSFIB1AS9：5′-CCG CTC GCG CCT GGG GTT

                          CCC TCT CCT CCCCCTGTGC-3′

      HUMFNA/HSFIB1AS10：GCC TGC CTC TTG CTC TTC

      HUMFNA/HSFIB1AS11：TGC GTC CGC TGC CTT CTC CC

      HUMFNA/HSFIB1AS12：CTC TCC TCG GCC GTT GCCTGTGC

      HUMFNA/HSFIB1AS13：5′-TGT CCG TCC TGT CGC CCT

                           TCC GTG GTG C-3′

      HUMFNA/HSFIB1AS14：TGT TGT CTC TTC TGC CCT C

      HUMFNA/HSFIB1AS15：GGT GTG CTG GTG CTGGTGGTGGTG

      HUMFNA/HSFIB1AS16：CCT CTG CCC GTG CTC GCC

      HUMFNA/HSFIB1AS17：CTG CCT GGG CTG GCCTCTTCGGGT

      HUMFNA/HSFIB1AS18：5′-GTG GCT TTG GGG CTC TCT

                           TGG TTG CCC TTT-3′

      HUMFNA/HSFIB1AS19：5′-CTT CTC GTG GTG CCT CTC

                           CTC CCT GGC TTG GTC GT-3′

      HUMFNA/HSFIB1AS20：TGT CTG GGG TGG TGCTCCTCTCCC

      HUMFNA/HSFIB1AS21：TTT CCC TGC TGG CCG TTT GT

      HUMFNA/HSFIB1AS22：CCT GTT TTC TGT CTT CCT CT

      HUMFNA/HSFIB1AS23：TTC CTC CTG TTT CTC CGT

      HUMFNA/HSFIB1AS24：5′-TTG GCT TGC TGC TTG CGG

                           GGC TGT CTC C-3′

      HUMFNA/HSFIB1AS25：CTT GCC CCT GTG GGC TTT CCC

      HUMFNA/HSFIB1AS26：TGG TCC GGT CTTCTCCTTGGGGGTC

      HUMFNA/HSFIB1AS27：GCC CTT CTT GGT GGG CTG

      HUMFNA/HSFIB1AS28：GCT CGT CTG TCT TTT TCC TTCC

      HUMFNA/HSFIB1AS29：5′-TGG GGG TGG CCG TTG TGG

                          GCG GTG TGG TCC GCC T-3′

      HUMFNA/HSFIB1AS30：TGC CTC TGC TGG TCT TTC 人白细胞介素8：

      5′-GBTGTTTGTTBCCBBBGCBTCBBGBBTBGCTTTGC

      TBTCTBBGGBTCBCBTTTBGBCBTBGGBBBBCGC

      TGTBGGTCBGBBBGBTGTGCTTBCCTTCBCBCBG

      BGCTGCBGBBBTCBGGBBGGCTGCCBBGBGBGCC

      BCGGCCBGCTTGGBGTCBTGTTTBCBCBCBGTGBG-3′

      脱-腺苷反义序列：

      HUMIL8AAS1：GTG CTC CGG TGG CTT TTT(SEQ ID

               NO：40)

      HUMIL8AAS2：GCT TGT GTG CTC TGC TGT CTC TG

      HUMIL8AAS3：5′-TTC CTT CCG GTG GTT TCT TCC TGG

               CTC TTG TCC T-3′

      HUMIL8AAS4：TTC TCT TGG CCC TTG GCC C 人IL-8受体-α：

    5′-BCBGGGGCTGTBBTCTTCBTCTGCBGGTGGCB

    TGCCBGTGBBBTTTBGBTCBTCBBBBTCCCBCBT

    CTGTGGBTCTGTBBTBTTTGBCBTGTCCTCTTC

    BGTTTCBGCBBTGGTTTGBTCTBBCCTGBBGCBCCG

    GCCBGG-3′

    脱-腺苷反义序列：

    TGGCTCGGTGCTTCTGCCCC

    TGTTGTTGCGGCGCTC

    GGTTGGTGTGGCCCCTG

    TGGTGCTTCGTTTCC

    CCCTCTTTCTCTTTGTTC

    GGGGGTTCTTGTGGC

    GGGCTGCTTGTCTCGTTCC 人GM-CSF：

    5′-CTTGBGCBGGBBGCTCTGGGGCBGGGBGCTGGCBG

    GGCCCBGGGGGGTGGCTTCCTGCBCTGTCCBGBGT

    GCBCTGTGCCBCBGCBGCBGCTGCBGGGCCBTCBG

    CTTCBTGGGGCTCTGGGTGGCBGGTCCBGCCBTGG

    GTCTGGGTGGGGCTGGGCTGCBGGCTCCGGGC-3′

    脱-腺苷反义序列：

    HUMGCSFAS1：GGT CCB GCC BTG GGT CTG GG(SEQ ID

        NO：41)

    HUMGCSFAS2：GGC TGG GCT GCB GGC TCC GG

    HUMGCSFAS3：GCG GGC GGG TGC GGG CTG CGT GCT GGG

    HUMGCSFAS4：GGC TGC CCC GCA GGC CCT GC 人肿瘤坏死因子α：

    5′-CBCCGCCTGGBGCCCTGGGGCCCCCCTGTCTTCTTGGG

    GBGCGCCTCCTCGGCCBGCTCCBCGTCCCGGBTCBTGCTTT

    CBGTGCTCBTGGTGTCCTTTCCBGGGGBGBGBGGG-3′

    脱-腺苷反义序列：

    HSTNFAAS1：GCT GGT CCT CTG CTG TCC TTG CTG (SEQ

         ID NO：42)

    HSTNFAAS2：GTG CTC BTG GTG TCC TTT CC

    HSTNFAAS3：GCC CTG GGG CCC CCC TGT CTT CTT GGGG

    HSTNFAAS4：CCT CTT CCC TCT GGG GGC CG

    HSTNFAAS5：TCT CTC TCC CTC TCT TGC GTC TCT C

    HSTNFAAS6：TCT TTC TCT CTC TCT CTT CCC C

    HSTNFAAS7：TTT CCC GCT CTT TCT GTC TC

    HSTNFAAS8：GGT GTC TGG TTT TCT CTC TCC

    HSTNFAAS9：GCT GGC TGCCTG TCTGGC CTG CGC TCTT

    HSTNFAAS10：GGC CTG TGC TGT TCC TCC

    HSTNFAAS11：TCC GGT TCC TGT CCT CTC TGT CTG TC

    HSTNFAAS12：GCC CCC TCT GGG GTC TCC CTC TGG C

    HSTNFAAS13：GTG GTG GTC TTG TTG CTT

    HSTNFAAS14：GGG CTG GGC TCC GTG TCT C

    HSTNFAAS15：CBG TGC TCB TGG TGT CC

    HSTNFAAS16：GCT GBG GGB GCG TCT GCT GGC 人白三烯C4合酶：

    5′-CTCGGTBGBCGCGCTCGBBCTCGGGTGGGCCGGTGGTG

    BGCGGCGGCGBCBCGCGGBBGGCCCTGCGCGCCGBGBTCBC

    CTGCBGGGBGBBGTBGGCTTGCBGCBGGBCTCCCBGGBGGG

    TGBCBGCBGCCBGTBGBGCTBCCTCGTCCTTCBTGGTBCCG

    TCGGTGTGGTGGCBCGGGCTGTGTGTGBBGGCGBGCTGG-3′

    脱-腺苷反义序列：

    HSU11552AS1：GCC CCG TCT GCT GCT CCT CGT GCC G

              (SEQ ID NO：43)

    HSU11552AS2：5′-CCT CGT CCT TCA TGG TAC CGT

                   CGGTGT GGT GGC-3′

    HSU11552AS3：CTC GGG TGG GCC GGT GGT G

    HSU11552AS4：GGG CGC GCG CGC TCG CGT

    HSU11552AS5：5′-GGC TCC GGC TCT TCT TTC CCG

              GCTCCG TCG GCC CGG GGG CCTTGGTCTC-3′

    HSU11551AS6：CCT CGT CCT TCB TGG TBC CG 人内皮素-1：

    5′-BCCGGCGGBGCCGCCBGGGTGGBCTGGGBGTGGGTT

    TCTCCCCGCCGTTCTCBCCCBCCGCGCTGBGCTCBGCGC

    CTBBGBCTGCTGTTTCTGGBGCTCCTTGGCBBGCCBCBB

    BCBGCBGBGBGBBBBTCBTGBGCBBBTBBTCCBTTCTGB

    BBBBBBGGGBTCBBBBBCCTCCCGT-3′

    脱-腺苷反义序列：

    CCCGTTCGCCTGGCGC

    GCGCTGCGGGTTCCTC

    GTGGGTTTCTCCCCGCCGTTCTC

    CGGTCTGTTGCCTTTGTGGG

    CTTCTTGTCTTTTTGGCT

    GTTCTTTTCCTGCTTGGC

    GTCTTTTCCTTTCTT

    TGTGCTCGGTTGTGGGTC

    CGCTGGTCCTTTGCC

    CTGTGTGTTTCTGCTG 内皮素受体ET-B反义寡核苷酸：

    5′-GCCCTGTCGGGCGGGBBGCCTCTCTCCTCTCCCCBG

    BTCCGCGBCBGGCCGCBGGCBBGBBCCBGCGCBBCCBGG

    GCGCGTCCGCBCBGBCTTGGBGGCGGCTGCBTGCTGCTB

    CCTGCTCCBGBBGCGTCCGGTGGCCGCCGC-3′

    脱-腺苷反义序列：

    GCGTCCGGTGGCCGCCGC

    GCCTCTCTCCTCTCCCC

    GTGGCCCTGTCGGGCGGG

    TCCTGCCGTCCTGTCTCCTTT

    TCTTTTGCTGTCTTGT

    CTTCCCGTCTCTGCTTT 内皮素ETA受体反义寡核苷酸：

    5′-CBTCCBCBTGBTTGCTTBGBTTTGTGCTGTBTCTCTCB

    GGBTTBTCBCTGBTTBCBCBTCCBBCCBGTGCCBGCCBBBB

    GGBTGCCCTGBGGCBBBGGGTTTCCBTCTTGBGGCBBBTTT

    GBGGB-3′

    脱-腺苷反义序列：

    GTCTGTCCTCCCCGTCTCCTCCC

    ACTGCTTCTCCCGGGG

    GCTTCCCCGGCTTC

    GGGTGGCCGGTGTCCCGGGCTCCGGCGCGGCGGC

    GGCTTCGGCTGC

    GGGTGGGTGGCGCGG

    GCTGCCGGGTCCGCGCGGCGCCTGGGCC

    CTTGTGCTGCTTTT

    TGCTTGTTCCGTTC

    TGGCTGCTCCGGTCTGTGTTGTGGTTGTTTTG

    TTTCTTCTTGGGTGTGGG

    CCTTGCGGTTTTGG

    CTGTGGGCCCTTTG

    GGGCCTTGGCTTCTGGCTC P物质反义寡核苷酸：

    5′-CTGCTGBGGCTTGGGTCTCCGGGCGBTTCTCTGCBGBBGBT

    GCTCBBBGGGCTCCGGCBGTTCCTCCTTGBTCTGGTCGCTGTCG

    TBCCBGTCGGBCCBGTBBTTCBGBTCBTCBTTGGCTCCTBTTTC

    TTCTGCBBBCBGCTGBGTGGBGBCBBGBBBBBBGBCTGCCBBGG

    CCBCGBGGBTTTTCBTGTTGGBTTTTGCGBCGGBCBGTCCCGCG

    GGGTGCTGAGTTTCTCTGGTTCCTCCGBGCGCB-3′

     脱-腺苷反义序列：

     CGTGGTCGCTCCGC

     TTTCTCTGGTTCCTCCG

     GTCCCGCGGGGTGCTG

     TCTGGTCGCTGTCGT

     GGCTTGGGTCTCCGGGCG

     GTTTCCTTCCTTTTCCGC P物质受体反义寡核苷酸：

     5′-GGCTBBGBTGBTCCBCBTCBCTBCCBCGTTGCCCBCCBCB

     GBGGTCBCCBCBBTGBCCGTGTBGGCBGCTGCCCBBBGGBCBB

     TTTGCCBGGCTGGTTGCBCGBBCTGBTTGGGTTCCGBGGTGTT

     BGTGGBGBTGTTTGGGGBGBGGTCTGBGTCCBCCGGGBGGBCG

     TTBTCCBTTTCGBBGCTBGGCGGTBBBGCCCTBCTBTCTGTBC

     BCBBCCCCCCTCTGCBGCBGBGTCCTGTCGTGGCGCCTGGGGC

     TCBGGGTCC-3′

     脱-腺苷反义序列：

     GTCCTGTCGTGGCGCCTGGGGCTC

     TTCTTTTGTGGGCT

     CTTTGGTGGCTGTGGCTG

     TGGTCTCTGTGGTTG

     CTGCCCTGGGTCTGG

     GGGTGTGGCCTTGGGGCCGTCCTCTGGCTCCTCCTCGTGGGCCCCC 食糜酶：

     5′-GGBGCTGBTBCTGCBGATTTCBGBGGGBBGBBCCCT

     GBTBCTCBCCBGCTTCBGCTCTGGBGCBCBBGBGBBBGB

     GCBGCBGGGGGBGBGGBBGBBGCBGCBTCTTCCCBGBGB

     GGCTGCCTGBGCBBBTGCTGGTTTTCCTTTCCBGTCTTG

     GGTTTTBTBBCTCCCBGBBGGCBBGBGBGGGGCBBGG-3′

     脱-腺苷反义序列：

     CGTTTTCTTCTCTC

     TGCTGGTTTTCCTTTCC

     TGGCAGTGGGTGGGGGTGGGGGTGGGGTGGC

     TTCCTTGTTCCTGGGGGTGTCCT

     CTTGCTCTGGGCTTTTCT

     CCCCTTTTCCTTCC

     TGTCTGTTTTCCTGGGG

     CTCTCCTCTGTCTCTGTGT

     CCTTGCCCTGGCCC

     TCTTCCCTCTCCTGTCTCCTGT

     CCCTGTGTTCCGCCC

     GTCTTCCCTCTCCTG

     ACCTCCTTTTCCTCCG

     CTGGGTGGGGCCCTG

     CCTGTTCTCTGCTCCC

     TGGCTTGGGGTTTCTTCTG

     TGTGTCTTCTTCCTCTGTT

     GGCTGGCTTTCTCCTTC

     TTTTGTCTTCCTGGG

     TGCCCCTTCTTCCTTTCTTGGG

     TCCTTGGTGCTTGGGCTGGG 内皮氧化氮合酶：

     5′-GCGTCTTGGGGTGCBGGGCCCBTCCTGCTGCGCCTGGGCG

     CTGBGGGTGTCBTBGGTGBTGCTCCCCBCCTCCCBGTTCTTCB

     CBCGBGGGBBCTTGGGCCCCTCTGGGGGCTGGGTTBGCGGGGB

     GCTCGGGGGGCTGTGTTCTGGCGCTGGTGGGBGTBGGGBTGCT

     GGGGCCCGGCTGGGCTCBGGGGCCGGGGTGGCTGGGCCCTGCT

     TGCCGCBCBGCCCBBGGCCCBGCCCCBGCCCCBGGCCGCBGGG

     TGGCCCBGGCTCCTGGGCCBCGCTCTTCBBGTTGCCCBTGTTB

     CTGTGCGTCCGTCTGCTGGBGCBGGCBGCBGBGTGGGBBTTC-3′

     脱-腺苷反义序列：

     CTGTGCGTCCGTCTGCTGG

     GGGGCCGGGGTGGCTGGGCCCTGCTTGCCGC

     ACGACCCCGGGCCGACCCGAG

     GCTCGGGGGGCTGTGTTCTGGCGCTGGTGGG

     CTTGGGCCCCTCTGGGGGCTGGGTT

     TCCTGCTGCGCCTGGGCGCTG

     GCGTCTTGGGGTGC

     GGGGCCGGGGGGCCGGGGG

     GCCGCTGTTCGTGGGCCTGGG

     GGTGCCTGTGGCTGCC

     GGTTGCCCCGGTTGGTGGC

     GCCGTCCTGCTGCCGGT

     CGTTGGCTGGGTCCCCCCGC

     CCGTTTCCTGGGGTCC

     GCGTGGGGTGCTCC

     GGTTCCTCGTGCCG

     CTGCTGCCTTGTCTTTCC

     GGCCGTGGCGGCGTGGTGGTCC

     GCCCCCCCTGGCCTTCTGCTC

     GGGGTCTGGCTGGT

     TGCCGGTGCCCTTGGCGGC

     GGTCTTCTTCCTGGTG

     GCTCTGGGCCCGGCCGGTCTCGG

     GCGTCTCGTGTTCG

     CTCTTGTGCTGTTCCGGCCG

     CTCCTTCCTCTTCCGCCGCC

     GCCGCTCCCCGCCC

     GCTCGTCGCCCTGGCCC

     GGCCTCCTCCTGGCCGC

     TGTCTCGGGCGGCGGCCTTGGC

     GCTCCGTTTGGGGCTG

     CCTCTGGCGCTTCC

     GGCCCTCGGCCTGGGCGCTC

     TCTTCCGCCTGTGC

     TGGTGGCCCTCGTGG

     GCCCCTCCTGGCCTCCGGTGTCC

     TGTGGTCCCCCGGCTGGT

      GGCCGGGCCGGTTGGGCGGGC

      GTGGGCGCCGGCGGGTCCTCC

      GGGCTGCCCTTCTCC

      GCCGGGGGTCCCGC

      GCTCCTGCTGTTCCCTGGGCTCTTCTGCC

      TCTCTCCTGGGTGGGTGCTGGGTGCCG

      GGGTCTCCGGGCTTG

      CCCCGCGCTGCTGGGCGTTCTGC

      GGTCTTGGGGTTGTC

      TGTGGCCCCGCTCG

      TGTCGCCCTCCGTCGCC

      CGTCGCCGGCCTCGTCC

      CCTCCTGGGTGCGC

      GGCGGGCTGGTCCT

      GGCGTTTTGCTCCTTCCTGG 诱导性氧化氮合酶：

      5′-CTGCCCCBGTTTTTGBTCCTCBCBTGCCGTGGGGBGGB

      CBBTGGGGTTGCBTCCBGCTTGBCCBGBGBTTCTGGBG

      BCTTCTTTCCCGTCTCCBCGBGGGGCTGCGGGGBCTCB

      TTCTGCTGCTTGCTGBGGTTGTGBTBCTGBGGTCBTCC

      TGTGTCBCTGGBCTGGBGGTGGCBCBGGGGGCTTTCTC

      CBCBTTGTTGTTGBTGTCTTTTTCCCCBTTCBTTGCBT

      BCTGGTGGBBTTTGGTCTTGBBCBGBBBTTTCCBBGGB

      CBGGCCBTCTCTBTGGCTTTBCBBBGCBGGTCBCTTBT

      GTCBCTTBTCTGGBTTTGBGCTCBGBTGTTCTTCBCTG

      TGGGGCTTGCGGCTGGCTGCBCTGCCTCCCCGGGGTB-3′ 人主要碱性蛋白：

      GTTTCATCTT GGCTTTATCC(SEQ ID NO：44)

                       实例6

现转到图3，哮喘兔子2只给予腺苷，2只给予dAMP，浓度如 图标识，吸入方法按前述实例3的方法。结果(图3中以顺应性改变 来表示)表明，dAMP作为一种含腺苷的反义脱氧寡核苷酸的降解 物，对于哮喘兔子过度应答的呼吸道，与腺苷同样强效诱导支气 管收缩。

                       实例7

雾化硫代磷酸酯21聚体反义ODN，由50％腺苷和50％随机比 例的鸟嘌呤加胞嘧啶组成，如图4所示，对哮喘兔子的过度应答呼 吸道具有很强的支气管收缩效应。该研究的对照分子为硫代磷酸 酯21聚体反义ODN，由50％鸟嘌呤和50％随机比例的胸苷加胞嘧 啶组成(脱-腺苷ODN)，它对同样的动物无支气管收缩或任何其 它作用。

本研究中，支气管收缩效应以支气管顺应性的百分比变化来 测定。每组包括2只过敏性兔子，显示的是第二阶段用喷雾器每日 两次给予雾化ODN 5mg后的数据。

这些结果表明，尽管反义寡核苷酸被修饰以减少降解，其产 生的腺苷代谢物仍能对用药的哮喘呼吸道产生强力的支气管收 缩。

前述的实例均用于说明本发明，不应被理解为限制本发明。 本发明由下述权利要求限定，包括等同于权利要求的叙述。

本发明是在国立癌症研究所基金RO1CA47217-06的政府资 助下完成的。政府对此发明拥有某些权利。

                     序列表 (1)一般资料：   (i)申请人：Nyce.Jonathan W. (ii)发明题目：使用反义寡核苷酸治疗肺病的方法 (iii)序列数目：44 (iv)通信地址：   (A)  收件人：Kenneth D.Sibley   (B)  街道：Post Office Drawer 34009   (C)  城市：Charlotte   (D)  州：NC   (E)  国家：美国   (F)  邮编：28234 (v) 计算机可读形式：   (A)  载体类型：软盘   (B)  计算机：IBM PC兼容   (C)  操作系统：PC-DOS/MS-DOS   (D)  软件：PatentIn Release#1.0，Version #1.30 (vi)当前申请资料：   (A)  申请号：   (B)  申请日：   (C)  分类： (viii)代理人/事务所资料：   (A)  姓名：Sibley，Kenneth D.    (B)  登记号：31,665   (C)  参考/摘要号：5218-32 (ix)电讯资料：   (A)  电话：(919)881-3140   (B)  传真：(919)881-3175   (C)  电传：575102 (2)SEQ ID NO：1资料：  (i) 序列特性：   (A)长度：21碱基对   (B)类型：核酸   (C)链型：单链   (D)拓扑结构：线性  (ii)分子类型：DNA(基因组)  (xi)序列表述：SEQ ID NO：1： GATGGAGGGC GGCATGGCGG G (2)SEQ ID NO：2资料：  (i)序列特性：   (A)长度：21碱基对   (B)类型：核酸   (C)链型：单链   (D)拓扑结构：线性  (ii)分子类型：DNA(基因组)  (xi)序列表述：SEQ ID NO：2： GTAGCAGGCG GGGATGGGGG C (2)SEQ ID NO：3资料： (i)序列特性：   (A)长度：18碱基对   (B)类型：核酸   (C)链型：单链   (D)拓扑结构：线性  (ii)分子类型：DNA(基因组)  (xi)序列表述：SEQ ID NO：3： GTTGTTGGGC ATCTTGCC (2)SEQ ID NO：4资料：  (i)序列特性：   (A)长度：18碱基对   (B)类型：核酸   (C)链型：单链   (D)拓扑结构：线性  (ii)分子类型：DNA(基因组)  (xi)序列表述：SEQ ID NO：4： GTACTTGCGG ATCTAGGC (2)SEQ ID NO：5资料：  (i)序列特性：   (A)长度：18碱基对   (B)类型：核酸   (C)链型：单链   (D)拓扑结构：线性  (ii)分子类型：DNA(基因组)  (xi)序列表述：SEQ ID NO：5： GTGGGCCTAG CTCTCGC C (2)SEQ ID NO：6资料：  (i)序列特性：   (A)长度：18碱基对   (B)类型：核酸   (C)链型：单链   (D)拓扑结构：线性  (ii)分子类型：DNA(基因组)  (xi)序列表述：SEQ ID NO：6： GTCGGGGTAC CTGTCGGC (2)SEQ ID NO：7资料：   (i)序列特性：    (A)长度：21碱基对    (B)类型：核酸    (C)链型：单链    (D)拓扑结构：线性  (ii)分子类型：DNA(基因组)  (xi)序列表述：SEQ ID NO：7： TGCTTTTCTT TTCTGGGCCT C (2)SEQ ID NO：8资料：  (i)序列特性：   (A)长度：29碱基对   (B)类型：核酸   (C)链型：单链   (D)拓扑结构：线性  (ii)分子类型：DNA(基因组)  (xi)序列表述：SEQ ID NO：8： GGCGCCGTGC CGCGTCTTGG TGGCGGCGG (2)SEQ ID NO：9资料：  (i)序列特性：   (A)长度：17碱基对   (B)类型：核酸   (C)链型：单链   (D)拓扑结构：线性  (ii)分子类型：DNA(基因组)  (xi)序列表述：SEQ ID NO：9： TTTCCCCTGG GTCTTCC (2)SEQ ID NO：10资料：  (i)序列特性：   (A)长度：18碱基对   (B)类型：核酸   (C)链型：单链   (D)拓扑结构：线性  (ii)分子类型：DNA(基因组)  (xi)序列表述：SEQ ID NO：10： GCCTGTGTCT CTCCTCCT (2)SEQ ID NO：11资料：  (i)序列特性：   (A)长度：18碱基对   (B)类型：核酸   (C)链型：单链   (D)拓扑结构：线性 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  (D)其它资料：/标准名称＝“Reduced A” (xi)序列表述：SEQ ID NO：17： GGGCGCGGGC GAGCATCGC (2)SEQ ID NO：18资料：  (i)序列特性：   (A)长度：21碱基对   (B)类型：核酸   (C)链型：单链   (D)拓扑结构：线性  (ii)分子类型：DNA(基因组)  (xi)序列表述：SEQ ID NO：18： CCTCCTTCCT GGTCTGTCTG C (2)SEQ ID NO：19资料：  (i)序列特性：   (A)长度：20碱基对   (B)类型：核酸   (C)链型：单链   (D)拓扑结构：线性  (ii)分子类型：DNA(基因组)  (xi)序列表述：SEQ ID NO：19： GCCCTGCTGC TCTTTCTGCT (2)SEQ ID NO：20资料：  (i)序列特性：   (A)长度：19碱基对   (B)类型：核酸   (C)链型：单链   (D)拓扑结构：线性  (ii)分子类型：DNA(基因组)  (xi)序列表述：SEQ ID NO：20： GCGCTCGGCC TGGTCCCGG (2)SEQ ID NO：21资料：  (i)序列特性：   (A)长度：22碱基对   (B)类型：核酸   (C)链型：单链   (D)拓扑结构：线性  (ii)分子类型：DNA(基因组)  (xi)序列表述：SEQ ID NO：21： GCGCGGGCCG GGGGCTGCTG GG (2)SEQ ID NO：22资料：  (i)序列特性：   (A)长度：19碱基对   (B)类型：核酸   (C)链型：单链   (D)拓扑结构：线性  (ii)分子类型：DNA(基因组)  (xi)序列表述：SEQ ID NO：22： CCTCTTTTCT GTTTTTCCC (2)SEQ ID NO：23资料：  (i)序列特性：   (A)长度：19碱基对   (B)类型：核酸   (C)链型：单链   (D)拓扑结构：线性  (ii)分子类型：DNA(基因组)  (xi)序列表述：SEQ ID NO：23： GTTCTTGGCT TCTTCTGTC (2)SEQ ID NO：24资料：  (i)序列特性：   (A)长度：26碱基对   (B)类型：核酸   (C)链型：单链 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