一种用于区别检测禽类重要经济病毒的mRT-PCR试剂盒及其
应用
技术领域
[0001] 本
发明涉及可用于多种禽病毒检测的试剂盒，特别涉及
一种用于区别检测禽类重要经济病毒的mRT-PCR试剂盒及其应用，本发明属于病毒检测技术领域。
背景技术
[0002] 禽流感(Avian influenza，AI)是全球性传播
疾病，由正粘病毒科的禽流感病毒引起，按病毒表面血凝素分类，已经发现有18个H亚型，按病毒神经
氨酸酶分类已发现有10个亚型。由于该两种蛋白存在高度变异，因此自然界中有许多不同种亚型的禽流感病毒。
[0003] 许多禽流感病毒在禽的
呼吸道、消化道定居引起轻微症状或无症状，但高致病性禽流感H5、H7、H9亚型的病毒能够感染人类并致病。H5、H7、H9禽流感在禽类流行，H5、H7亚型引起人的感染和死亡。禽流感和其他禽类呼吸道病毒混合感染，产生特征相似的临床症状，例如禽流感
病毒感染和传染性喉气管炎病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒感染的临床特征难以区别，因此使病原分离和
鉴别异常困难。
[0004] 在中国禽类养殖中，传染性喉气管炎病毒、传染性支气管炎病毒、新城疫病毒、传染性法氏囊病毒、减蛋综合症病毒的流行率较为普遍。尽管有减毒和灭活
疫苗上市控制流行，但对于疾病防控检测和养殖企业的
生物安全仍是不够的。通常病毒感染诊断采用病毒分离、鉴别和血清学试验的方法，但这些方法费时耗
力，特别是疫苗的大规模免疫使禽呼吸道病原分离和鉴别异常困难。因此，有必要开发灵敏、特异、快速的诊断技术区分这6种病原。
[0005] 最近几年，核酸扩增技术如环介导等温扩增技术(LAMP)、重组酶复制酶扩增技术(RPR)、实时RT-qPCR、多重RT-PCR(mRT-PCR)技术在病毒检测和诊断方面被广泛应用，其优点在于一个反应就可检测多种微量的病原分子，快速，准确性高。
发明内容
[0006] 本发明所要解决的技术问题是提供一种能够区别检测3种亚型禽流感病毒以及在国内流行的其他禽常见呼吸道感染5种病原的试剂盒，同时建立一种使用该试剂盒进行检测的方法。
[0007] 为达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
[0008] 本发明的一种用于区别检测禽类重要经济病毒的mRT-PCR试剂盒，包括分别用于检测禽流感病毒(Avian Influenza virus，AIV)M基因、禽流感病毒H7、H9、H5亚型、新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)、传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus，IBV)、传染性喉气管炎病毒(Infectious laryngotracheitis virus，ILTV)、传染性法氏囊病毒(Infectious bursal disease virus，IBDV)以及减蛋综合症病毒(Egg drop syndrome virus 76，EDS 76)的引物对；
[0009] 其中，用于检测禽流感病毒M基因的引物对如下所示：
[0010] M-WSN F：5′-GAA GGTAGATATTGAAAGATG-3′(SEQ ID NO.1)
[0011] M-1023R：5′-GAA ACAAGGTAGTTTTTTACTC-3′(SEQ ID NO.2)
[0012] 其中，用于检测禽流感病毒H7亚型的引物对如下所示：
[0013] H7-397F：5′-ACA TAC AGT GGG ATA AGA ACC-3′(SEQ ID NO.3)
[0014] H7-391R：5′-TCT CCT TGT GCA TTT TGA TGC C-3′(SEQ ID NO.4)
[0015] 其中，用于检测禽流感病毒H9亚型的引物对如下所示：
[0016] H9-1F：5′-AGC AAA AGC AGG GGA AYW WC-3′(SEQ ID NO.5)
[0017] H9-808R：5′-CCA TAC CAT GGG GCA ATT AG-3′(SEQ ID NO.6)
[0018] 其中，用于检测禽流感病毒H5亚型的引物对如下所示：
[0019] H5-1：5′ACT ATG AAG AAT TGA AAC ACC T-3′(SEQ ID NO.7)
[0020] H5-2：5′-GCAATGAAATTT CCA TTA CTCTC-3′(SEQ ID NO.8)
[0021] 其中，用于检测传染性支气管炎病毒的引物对如下所示：
[0022] IBV-F：5′-GCT TTT GAG CCT AGC GTT-3′(SEQ ID NO.9)
[0023] IBV-R：5′-GCC ATG TTG TCA CTG TCT ATT-3′(SEQ ID NO.10)
[0024] 其中，用于检测新城疫病毒的引物对如下所示：
[0025] NDV-F：5′-GCAGCTGCAGGGATTGGGT-3′(SEQ ID NO.11)
[0026] NDV-R：5′-TCTTTGAGCAGGAGGATGTTG-3′(SEQ ID NO.12)
[0027] 其中，用于检测传染性喉气管炎病毒的引物对如下所示：
[0028] ILTV-F：5′-ACG ATG ACT CCG ACT TTC-3′(SEQ ID NO.13)
[0029] ILTV-R：5′-CGT TGG AGG TAG GTG GTA-3′(SEQ ID NO.14)
[0030] 其中，用于检测传染性法氏囊病毒的引物对如下所示：
[0031] VP2-F：5′-ACTGCCCAGAACCTACC-3′(SEQ ID NO.15)
[0032] VP2-R：5′-ACCRAGYCTCACATACC-3′(SEQ ID NO.16)
[0033] 其中，用于检测减蛋综合症病毒的引物对如下所示：
[0034] Hexon-F：5′-CAARTTCAGRCAGACGGT-3′(SEQ ID NO.17)
[0035] Hexon-R：5′-TAGTGATGMCGSGACATCAT-3′(SEQ ID NO.18)。
[0036] 在本发明中，优选的，所述的试剂盒中还包括反应
混合液，逆转录酶和Taq DNA多聚酶混合液以及不含RNase的双蒸
水。
[0037] 使用本发明所述的试剂盒，用于区别和检测禽类重要经济病毒时需进行三次mRT-PCR反应：
[0038] 第一次，称为三价mRT-PCR，使用检测禽流感病毒H7、H9、H5亚型的引物对，以待检病毒DNA/RNA为模板，进行mRT-PCR扩增；
[0039] 第二次，称为六价mRT-PCR，使用检测禽流感病毒M基因、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒、传染性法氏囊病毒以及减蛋综合症病毒的引物对，以待检病毒DNA/RNA为模板，进行mRT-PCR扩增；
[0040] 第三次，称为八价mRT-PCR，使用检测禽流感病毒H7、H9、H5亚型、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒、传染性法氏囊病毒以及减蛋综合症病毒的引物对，以待检病毒DNA/RNA为模板，进行mRT-PCR扩增。
[0041] 第一次mRT-PCR的反应DNA产物通过琼脂糖
电泳观察包括300bp的H7扩增
片段、456bp的H5扩增片段、808bp的H9扩增片段。第二次mRT-PCR的反应DNA产物通过琼脂糖电泳观察包括1个长约1023bp的禽流感病毒M基因扩增片段、149bp的IBV扩增片段、356bp的NDV扩增片段、647bp的ILTV扩增片段、212bp的IBDV扩增片段以及897bp的EDS-76扩增片段。第三次mRT-PCR的反应DNA产物通过琼脂糖电泳观察包括149bp的IBV扩增片段、356bp NDV扩增片段、647bp ILTV扩增片段、300bp的H7扩增片段、456bp的H5扩增片段、808bp的H9扩增片段、212bp的IBDV片段以及897bp的EDS-76扩增片段。
[0042] 在本发明中，优选的，所述的三次mRT-PCR反应均在热循环仪中进行，反应条件为：45℃45min合成cDNA，96℃变性5min，95℃变性1min,53℃
退火5min，70℃延伸1min，共进行
40个循环，完成循环后72℃延伸10min，保存于4℃。
[0043] 进一步的，本发明还提出了所述的试剂盒在制备区别检测禽类重要经济病毒的试剂中的用途，所述的禽类重要经济病毒包括禽流感病毒H7、H9、H5亚型、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒、传染性法氏囊病毒以及减蛋综合症病毒。
[0044] 本发明提供了一种快速鉴别和区别混合感染中禽流感病毒以及禽类5种经常流行呼吸道病原的方法，使用本发明所建立的方法检测禽流感病毒和呼吸道其他病毒具有灵敏度高、特异性强等特点，可及时检测和区别禽流感中最重要的亚型和在国内最普遍流行的5种禽呼吸道病原，对
人畜共患病控制混合感染病原的监测、防控、养殖场生物安全、减少养殖业损失、
食品安全和检疫有着重要意义。
[0045] 与传统RT-PCR技术相比，采用本发明的方法可直接检测临床上的各种样本，省时节力省材料试剂，可用于病毒感染的诊断和筛选、禽病监测。一次反应、一步程序，省去了cDNA扩增后再反应的步骤，检测结果即时可见。特别是该方法对仪器设备要求低，省去了昂贵仪器，如实时定量PCR仪的购买，普通的PCR循环仪和琼脂糖电泳设备就能满足检测条件，适合我国动物养殖和生物安全的检测需要。
具体实施方式
[0046] 下面通过实验并结合
实施例对本发明做进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。
[0047] 实施例1、试剂盒的制备和组装
[0048] 1、引物的设计及合成
[0049] 参照基因库中国流行株已经发表的序列、通过
软件对比优化，设计并合成了分别用于检测禽流感病毒(Avian Influenza virus，AIV)M基因、禽流感病毒H7、H9、H5亚型、新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)、传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus，IBV)、传染性喉气管炎病毒(Infectious laryngotracheitis virus，ILTV)、传染性法氏囊病毒(Infectious bursal disease virus，IBDV)以及减蛋综合症病毒(Egg drop syndrome virus 76，EDS 76)的引物对，具体引物序列如下表1所示，各引物按100pmol/μL稀释贮存-20℃备用。
[0050] 表1多重逆转录多聚酶连反应(mRT-PCR)所涉及引物序列
[0051]
[0052]
[0053] 其中混合编码位点表示：Y＝C/T；R＝A/G；W＝A/T；M＝A/C；S＝C/G。
[0054] 2、其他成分
[0055] RT-PCR反应混合液，Superscript II逆转录酶、PlatinumTaq DNA多聚酶混合液、dNTP混合物以及不含RNase的双蒸水。
[0056] 实施例2本发明的mRT-PCR试剂盒在区别和检测禽类重要经济病毒中的应用[0057] 1、病毒和样本
[0058] 下列病毒用于标化多重逆转录多聚酶链反应：
[0059] H7N9分离毒
[0060] 1.A/Chicken/威县/中国2013-4/03(H7N9)
[0061] 2.A/Chicken/威县/中国/2013-5/04(H7N9)
[0062] 3.A/Chicken/威县/中国/2014-4/04(H7N9)
[0063] H9N2分离毒
[0064] 1.A/Chicken//邢台/中国/2014-6/01(H9N2)
[0065] 2.A/Chicken/邢台/中国/2013-1/05(H9N2)
[0066] 3.A/Chicken/威县/中国/2013-1/06(H9N2)
[0067] H5N2分离毒
[0068] 1.A/Chicken/威县/中国/2013/03(H5N2)
[0069] 2.A/Chicken/邢台/中国/2013/04(H5N2)
[0070] 3.A/Chicken/邢台/中国/2013/06(H5N2)
[0071] 以上这些毒株分离用9日龄鸡胚分离、鉴定、传至3代，并冻干保存。
[0072] 从梅里亚公司的冻干活疫苗中提取新城疫病毒(NDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、传染性喉气管炎病毒(ILTV)、传染性法氏囊病毒(IBDV，Georgia)、减蛋综合症病毒EDS76(EDS76/ADS/92)标化检测方法。
[0073] 从公司养殖场样本能被本发明的技术所鉴别的NDV、IBV、ILTV病毒如下：
[0074] 1.Chicken/邢台/中国/WZL1303/05(IBV M-41)
[0075] 2.Chicken/邢台/中国/WZL-2013/06(IBV M-41)
[0076] 3.Chicken/邢台/中国/WZL-2013/05(NDV)
[0077] 4.Chicken/邢台/中国/WZL-2013/07(NDV)
[0078] 5.Chicken/邢台/中国/WZL-2013/06(ILTV)
[0079] 6.Chicken/邢台/中国/WZL-2013/07(ILTV)
[0080] 样本来自显示有呼吸道感染症状病鸡组织包括气管、
肺、脾、小肠，组织和器管和在一起提取RNA和DNA。
[0081] 2、RNA和DNA的提取
[0082] 使用QIAamp病毒RNA小提试剂盒Viral RNA Mini Kit(52906，Qiagen公司产品)按厂商提供的
说明书提取器官匀浆、鸡胚尿囊液、疫苗的病毒RNA。ILTV和EDS76DNA用Easy DNA试剂盒(美国Invitrogen公司产品)提取。RNA或DNA浓度用生物光度计测定(Eppendorf公司产品).
[0083] 3、引物设计和优化
[0084] 4对特异扩增禽流感病毒M基因、禽流感H7、H9、H5亚型基因以及用于扩增IBV、ILTV、NDV、IBDV、EDS76基因的引物见表1，H7、H9、H5亚型病毒和其他病毒引物是根据基因库中国流行株已经发表的序列、通过软件对比优化，设计合成，按100pmol/μL稀释贮存-20℃备用。
[0085] 3、mRT-PCR优化
[0086] 逆转录和扩增一步法：
[0087] 发明采用试剂盒RT-PCR kit(美国Invitrogen公司产品)，按厂商提供的说明书进行，反应体积50微升。优化包括RT-PCR扩增的混合液，优化Mg2+浓度、dNTP、稳定剂的浓度。不同模板RNA稀释，进行多次mRT-PCR试验获得优化模板浓度。
[0088] 分别进行三次mRT-PCR，第一次，称为三价mRT-PCR，使用检测H7、H9、H5亚型的引物和不同血凝亚型的病毒DNA/RNA作为模板，第二次mRTPCR，称为六价mRT-PCR，使用检测禽流感病毒M基因、NDV、IBV、ILTV、IBDV、EDS76的引物和特异性的病毒DNA/RNA作为模板，按优化条件进行mRT-PCR。第三次，称为八价mRT-PCR，使用检测H7、H9、H5、NDV、IBV、IBDV、ILTV、EDS76的引物和特异性的病毒DNA/RNA作为模板，确定优化的扩增条件。
[0089] mRT-PCR产物
[0090] DNA复制产物、1-kbDNA分子量标记物、溴乙锭用2％琼脂糖电泳、
电压120V，时间20分钟，使用凝胶成像系统拍照。
[0091] 4、mRT-PCR灵敏性和特异性
[0092] 使用产生相同临床症状禽病原和各亚型禽流感病毒样品混合，使用优化的mRT-PCR在同一反应中检测和区别禽流感病毒和禽其它病原的能力。
[0093] 禽流感H7、H9、H5、NDV、IBV、ILTV、IBDV、EDS76的DNA-RNA混合，使最终模板含量在10fg-500ng的范围。为确定灵敏性，使DNA-RNA模板100ng按照10倍体积进行稀释，按优化了的循环程序进行检测。
[0094] 该法特异性通过检测禽流感病毒和区别禽流感亚型H7、H9、H5以及其他呼吸道病毒NDV、IBV、ILTV、IBDV、EDS76的能力确定。病毒DNA-RNA 10fg-500ng范围内，检测禽流感、H7、H9、H5的亚型引物进行优化了mRT-PCR扩增反应，观察结果中是否有NDV、IBV、ILTV IBDV、EDS76的扩增产物。同样用NDV、IBV、ILTV、IBDV、EDS76的引物进行优化模式的扩增，观察反应产物是否有AIV、H7、H9、H5的扩增产物。
[0095] 5、结果
[0096] 5.1mRT-PCR优化
[0097] 在反应的退火
温度、延伸时间、循环数量、探针浓度、模板稀释和浓度做了多次
修改和优化，用优化的操作程序进行反应，优化后的反应体系及反应参数如下：
[0098] 配制反应体系：1μL模板，用于扩增禽流感病毒M基因、H7、H9、H5、IBV、ILTV、NDV、IBDV、EDS76的正反引物(100pmol/μL)各1微升(根据需要选择引物对)，加入2.5μL酶混合液(含优化Superscript II逆转录酶和PlatinumTaq DNA多聚酶)，RT-PCR扩增的2X反应混合液25μL，dNTP(各10mM)5μL，用无核酸酶水补足50微升体积。
[0099] 在热循环仪(GeneAmp PCR System 9700,AB生物系统公司产品)中进行：45℃45min合成cDNA，96℃变性5min,40个循环，每次循环包括：
[0100] 95℃变性1min，53℃退火5min，70℃延伸1min，完成循环后72℃延伸10min，保存于4℃。阴性对照不含模板cDNA，含主混合液、所有的引物对和无核酸酶水。
[0101] 反应产物用琼脂糖电泳观察：第一次mRT-PCR的反应DNA产物通过琼脂糖电泳观察包括300bp的H7扩增片段、456bp的H5扩增片段、808bp的H9扩增片段。第二次mRT-PCR的反应DNA产物通过琼脂糖电泳观察包括1个长约1023bp的禽流感病毒M基因扩增片段、149bp的IBV扩增片段、356bp的NDV扩增片段、647bp的ILTV扩增片段、212bp的IBDV扩增片段以及897bp的EDS-76扩增片段。第三次mRT-PCR的反应DNA产物通过琼脂糖电泳观察包括149bp的IBV扩增片段、356bp NDV扩增片段、647bp ILTV扩增片段、300bp的H7扩增片段、456bp的H5扩增片段、808bp的H9扩增片段、212bp的IBDV片段以及897bp的EDS-76扩增片段。
[0102] 5.2mRT-PCR灵敏性和特异性
[0103] 本发明方法的敏感性用检测极限说明，对禽流感、禽流感病毒血凝素基因(H7、H9、H5)扩增产物可视最小极限值为1ng，对IBV、NDV、ILTV、IBDV、EDS76的检测可视极限值为100pg。检测AIV H7、H9、H5亚型和其他呼吸道病原时，不同的DNA-RNA混合物(病毒模板)，阴性对照不含DNA-RNA(病毒模板)、含引物和缓冲液和酶)并没有产生非特异反应。
[0104] 检测和区别禽流感H7、H9、H5亚型以及对IBV、NDV、ILTV、IBDV、EDS76具有特异性，H7、H9、H5亚型病毒扩增产物用2％琼脂糖、电压120V电泳时间20分钟在1-kbDNA分子量标记物、溴乙锭
染色观察到300bp、808bp、456bp的片段；IBV、NDV、ILTV、IBDV、EDS76扩增产物分别显示149bp、356bp、647bp、212bp、897bp片段。采用检测禽流感、H7、H9、H5的亚型引物进行优化了的mRT-PCR扩增反应，观察结果中没有发现NDV、IBV、ILTV IBDV、EDS76的扩增产物。同样用NDV、IBV、ILTV、IBDV、EDS76的引物进行优化模式的扩增，观察反应产物中没有发现有AIV、H7、H9、H5的扩增产物。说明本发明设计的引物对特异性良好。
[0105] 以上所述仅为本发明的优选实施例，对本发明而言仅是说明性的，而非限制性的；本领域普通技术人员理解，在本发明
权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围内。
