一种日本血吸虫病树枝状载体-DNA疫苗及其制备方法
专利汇可以提供一种日本血吸虫病树枝状载体-DNA疫苗及其制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且一种日本血吸虫病树枝状载体-DNA 疫苗 及其制备方法，涉及 人畜共患病 核酸疫苗，特别针对血吸虫病的核酸疫苗，属于 生物 技术领域。本 发明 由血吸虫病DNA疫苗pJW4303-SjC23和改性的树枝状载体PAMAM-Lys结合，即为血吸虫病树枝状载体-DNA疫苗PAMAM-Lys/pJW4303-SjC23复合物。其制备方法，包括以下步骤：(1)DNA疫苗pJW4303-SjC23的构建和制备，(2)聚酰胺-胺树枝状高分子：乙二胺为 内核 的PAMAM的端基改性，(3)树枝状载体-DNA疫苗的制备。日本血吸虫病DNA疫苗pJW4303-SjC23与PAMAM-Lys结合构建成的树枝状载体-DNA疫苗，具有明显提高宿主的免疫 反应性 和免疫保护作用，而且与宿主组织细胞具有良好的 生物相容性 。该疫苗具有十分广阔的应用前景。，下面是一种日本血吸虫病树枝状载体-DNA疫苗及其制备方法专利的具体信息内容。
1.一种日本血吸虫病树枝状载体-DNA疫苗，其特征在于由血吸虫病DNA疫苗pJW4303-Sj23和改性的树枝状载体PAMAM-Lys结合，即为血吸虫病树枝状载体-DNA疫苗，即PAMAM-Lys/pJW4303-SjC23复合物。
2.权利要求1所述的血吸虫病树枝状载体-DNA疫苗的制备方法，其特征在于它包括以下步骤：
(1)DNA疫苗pJW4303-SjC23的构建和制备
1)根据SjC23基因序列设计一对引物：
p1：5’-GC GCTAGC ATG GCG ACT TTG GGTACT-3’
p2：5’-GC GGATCC AAC ATT CTG ATAATCG-3’
p1、p2分别引入限制性酶切位点Nhe I和BamH I；
2)日本血吸虫总RNA的提取：取100mg日本血吸虫中国大陆株成虫，加入1mL TRIzol，用一次性研磨杵充分匀浆，在Ependorf管中，室温放置5min，4℃、12,000rpm离心10min，取上清；加入200μL氯仿，剧烈振荡混匀后室温放置3-5min使其自然分相，4℃、12,000rpm离心10-15min后分成三层：黄色的有机相，中间层和无色的水相，RNA主要在水相中，把水相小心转移到新Ependorf管中，加入550μL冰冷的异丙醇，室温放置10-20min，4℃、12,000rpm离心10min，RNA沉淀于管底，弃上清；在RNA沉淀中加入1mL用RNase-free水配制的75％乙醇，轻轻颠倒混匀，以清洗RNA沉淀，室温放置1-2min晾干沉淀后加入100μL RNase-free水充分溶解，其浓度及纯度经BECKMAN DU-600核酸蛋白测定仪测定，-70℃保存备用；
3)cDNA第一链的合成
在Ependorf管中加RNA 1μg，75℃变性5min，迅速置于冰浴中；加入2μL10×反转录缓冲液、4μL 25m mol/L MgCl2溶液、2μL 10m mol/L dNTP液、1μL RNA酶抑制剂、0.5μg反转录引物Oligo dT和20单位的AMV反转录酶，用RNase-free水补充到
20μL，充分混匀，42℃反应1～3h后加pH 8.0的0.5mol/L EDTA 2μL终止反应；95℃加热5min灭活AMV反转录酶，置冰浴5min，合成的cDNA第一链保存于-20℃备用；
4)RT-PCR
RT-PCR反应体系如下：cDNA第一链10μL、10×Buffer 10μL、25mmol/L MgCl2溶液6μL、10m mol/L dNTP液2μL、引物p1 2μL、引物p2 2μL、Taq DNA聚合酶2.5单位、加ddH2O至总体积100μL；
反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，进行
30个循环；末次循环后72℃延伸10min；取5μL反应产物行1％琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统鉴定RT-PCR产物片段大小与目的片段SjC23大小相同，即657bp；
5)DNA疫苗的构建
采用pJW4303真核表达质粒作为血吸虫抗原基因SjC 23的表达载体，取含真核表达质粒pJW4303的大肠杆菌XL1-blue单菌落于含终浓度100μg/mL氨苄青霉素的3mL培养基中，37℃、250rpm振荡培养16h，按照Promega公司质粒DNA小量抽提试剂盒抽提质粒；
限制性内切酶Nhe I和BamH I双酶切质粒pJW4303：pJW4303 16μL、Nhe I 1μL、BamH I 1μL、Buffer B 2μL，总体积20μL，37℃水浴4h；
将所得的SjC23在相同条件下用限制性内切酶Nhe I和BamH I酶切；
将酶切纯化后的SjC23与pJW4303用T4 DNA连接酶进行连接，连接反应如下：
pJW4303 6μL、SjC23 2μL、T4 DNA连接酶1μL、10×缓冲液1μL，总体积10μL，
16℃水浴过夜12～16h；
连接产物转化大肠杆菌XL1-blue后，鉴定阳性重组子，通过双酶切及DNA测序鉴定，得到的阳性重组子即为重组质粒pJW4303-SjC23；
6)DNA疫苗的大量制备
pJW4303-SjC23质粒DNA的大量制备按Qiagen公司Qiagen-2500操作说明进行，制备的质粒DNA溶解于无菌生理盐水，其浓度及纯度经BECKMAN DU-600核酸蛋白测定仪测定，所制备DNA的A260/A280为1.85～1.95，浓度均调整为1mg/mL；
(2)聚酰胺-胺树枝状高分子乙二胺为内核的PAMAM的端基改性
1)缩合反应
对4.0代PAMAM进行改性：以无水N，N-二甲基甲酰胺为溶剂，将4.0代PAMAM
1g，和氨基保护的L-赖氨酸Fmoc-Lys(Boc)-OH 4g，加入50mL三颈瓶中，加入1-羟基苯并三唑HOBt、苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯HBTU和N，N-二异丙基乙胺DIPEA，HOBt∶HBTU∶DIPEA质量比为1∶1∶2组成的缩合剂0.1g，通氮气，室温搅拌反应4h；加入乙醚使产物沉淀析出，离心去除上层清液，用过量乙醚洗涤沉淀，离心收集得到氨基保护的L-赖氨酸改性聚酰胺-胺树枝状高分子PAMAM-Lys(Boc)-Fmoc淡黄色沉淀；
2)芴甲氧羰基Fmoc-保护基的脱除
用14mL无水DMF溶解PAMAM-Lys(Boc)-Fmoc，再加入6mL哌啶，哌啶∶无水DMF体积比为30∶70，然后在室温下冷凝回流1h，反应完成后，产物在大量乙醚中沉淀，离心去除上层清液；并用过量乙醚多次洗涤沉淀，离心收集沉淀物，得到白色粉末状沉淀；
3)叔丁氧羰基Boc-保护基的脱除
以三氟乙酸和无水DMF脱除Boc-官能团，三氟乙酸∶无水DMF体积比为1∶9，先用9mL无水DMF溶解步骤2)所得脱除Fmoc-保护基后的产物，再加入1mL三氟乙酸，室温冷凝回流1h，反应完成后，产物在大量乙醚中沉淀，离心去除上层清液，并用过量乙醚多次洗涤沉淀，离心收集沉淀物，得到白色粗产品沉淀，即为L-赖氨酸改性聚酰胺-胺树枝状高分子PAMAM-Lys；
4)产物纯化
将步骤3)所得产物PAMAM-Lys溶于水并在4℃条件下用截留分子量为14000的透析膜透析12h，冷冻干燥条件下收集产物，得白色粉末PAMAM-Lys；
(3)树枝状载体-DNA疫苗的制备
将PAMAM-Lys树枝状载体聚合物溶于生理盐水中，配成1mg/mL备用；用移液枪分别量取10μL质粒DNA溶液和所需体积的树枝状高分子PAMAM-Lys溶液，高分子外层正电荷的摩尔数与DNA中磷酸基团负电荷的摩尔数之比，即电荷比R+/-为0.5、1、2、
4、8或10.时所需要的聚合物体积用量计算公式为：
上式中，Cplasmid为质粒浓度mg/mL，Vplasmid为质粒体积μL，330为质粒单核苷酸分子量，Mpolymer为聚合物相对分子质量，Cpolymer为聚合物浓度mg/mL，Npolymer为聚合物表面基团数，V为需要加入的聚合物体积μL；
然后在Eppendorf管中混合均匀，振荡10s，37℃静置10min，即为血吸虫病树枝状载体-DNA疫苗；即PAMAM-Lys/pJW4303-SjC23复合物。
一种日本血吸虫病树枝状载体-DNA疫苗及其制备方法
技术领域
背景技术
水平，因此如何提高日本血吸虫疫苗的保护力成为当前血吸虫病疫苗亟待解决的问题，也是当今血吸虫病DNA疫苗的研究热点。
同时，只有载体系统有效地通过生物体内的一系列生物屏障(靶向目的细胞、组织和器官)，DNA才能进入细胞。因此，建立安全有效的DNA载体系统对提高疫苗的保护作用
尤为重要。树枝状高分子(dendrimers)是一类三维的、高度有序的人工合成的新型纳米载体。 其中，聚酰胺-胺型树枝状高聚物(PAMAM dendrimers)是研究较为广泛和成熟的类型，分子表面带正电荷的大量氨基能够与抗体、核酸或荧光团发生静电作用而形成复合物，鉴于树枝状高分子的纳米结构特点，因此是一类非常理想的生物分子转运载体。 近年来，提高树枝状高分子的细胞黏附能力并降低其细胞毒性成为当前研究的热点。 哺乳动物细胞膜表面带负电荷，因此带正电荷的材料表面与细胞膜表面由于静电吸附，有利于细胞黏附，而带负电荷的材料表面由于静电排斥，不利于细胞黏附。 研究发现，将含有丰富正电荷基团的氨基酸接枝在树枝状高分子表面，可以增加黏附细胞的数量、增强细胞的黏附力。本发明将经改性的树枝状载体与血吸虫病DNA疫苗结合构建成树枝状载体-DNA疫苗。
发明内容
的PAMAM-赖氨酸接枝共聚物(PAMAM-Lys)，增加PAMAM表面氨基基团数目，增强
PAMAM的正电性，从而便于和更多的DNA负电荷相互作用，携带更多的DNA。 将新
型载体PAMAM-Lys与日本血吸虫pJW4303-SjC 23DNA疫苗结合，构建成一种新型的树
枝状载体-DNA疫苗，以增强血吸虫病DNA疫苗的免疫保护作用。
体-DNA疫苗，即PAMAM-Lys/pJW4303-SjC23复合物。
5min，4℃、12,000rpm离心10min，取上清；加入200μL氯仿，剧烈振荡混匀后室温放置3-5min使其自然分相，4℃、12,000rpm离心10-15min后分成三层：黄色的有机相，中间层和无色的水相，RNA主要在水相中，把水相(约550μL)小心转移到新Ependorf管
中，加入550μL冰冷的异丙醇，室温放置10-20min，4℃、12,000rpm离心10min，RNA
沉淀于管底，弃上清；在RNA沉淀中加入1mL用RNase-free水配制的75％乙醇，轻轻颠
倒混匀，以清洗RNA沉淀，室温放置1-2分钟晾干沉淀后加入100μL去RNA酶双蒸水
(RNase-free水)溶解，其浓度及纯度经BECKMAN DU-600核酸蛋白测定仪测定，-70℃
保存备用；
RNA酶抑制剂、0.5μg反转录引物Oligo dT(12～18个核苷酸组成)和20单位的AMV
反转录酶(Invitrogen公司)，用RNase-free水补充到20μL，充分混匀，42℃反应1～3h后加pH 8.0的0.5mol/L EDTA 2μL终止反应；95℃加热5min灭活AMV反转录酶，置冰
浴5min，合成的cDNA第一链保存于-20℃备用；
酶2.5单位、加ddH2O至总体积100μL；
序列为：SEQ ID NO：1
16h，按照Promega公司质粒DNA小量抽提试剂盒(Wizard Plus Minipreps DNA Purification System)抽提质粒；
16℃水浴过夜12～16h；
白测定仪测定，所制备DNA的A260/A280为1.85～1.95，浓度均调整为1mg/mL；
(DMF)为溶剂，将4.0代PAMAM 1g和氨基保护的L-赖氨酸(Fmoc-Lys(Boc)-OH)4g加入
50mL三颈瓶中，加入1-羟基苯并三唑(HOBt)、苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基
脲六氟磷酸酯(HBTU)和N，N-二异丙基乙胺(DIPEA)(HOBt∶HBTU∶DIPEA质量比
为1∶1∶2)组成的缩合剂(0.1g)，通氮气，室温搅拌反应4h；加入大量乙醚使产物沉
淀析出，离心去除上层清液，然后用过量乙醚洗涤沉淀，离心收集得到氨基保护的L-赖氨酸改性聚酰胺-胺树枝状高分子(PAMAM-Lys(Boc)-Fmoc)淡黄色沉淀。
冷凝回流1h。 反应完成后，产物在大量乙醚中沉淀，离心去除上层清液；并用过量乙醚多次洗涤沉淀，离心收集沉淀物，得到白色粉末状沉淀。
可以看出，改性后PAMAM-Lys内层结构不发生变化，表面基团增多，末端氨基数目比
4.0代PAMAM增加一倍，分子半径明显增大。
Magna 750型傅立叶变换红外光谱仪对PAMAM-Lys进行结构表征；同时用德国Bruker公
1
司Avance300核磁共振仪对PAMAM-Lys进行 H-NMR结构表征。观测频率为399Hz，重
水(D2O)做溶剂。红外光谱和核磁共振光谱表征的结果说明：赖氨酸改性4.0代PAMAM
树枝状高分子的合成是成功的。
质粒单核苷酸在水溶液中通常带单个负电荷，因此选用电荷比(R+/-)，即聚合物外层正电荷的摩尔数与DNA中磷酸基团负电荷的摩尔数之比作为确定整代PAMAM树枝状高分子
与质粒DNA配比的标准。 计算公式为：
宿主组织细胞具有良好的生物相容性。 该疫苗具有十分广阔的应用前景。
附图说明
具体实施方式
力达到最强。
用滤纸将溶剂吸干；再用10μL2％醋酸双氧铀滴在铜网上进行负染色，吸附2min后，再用滤纸吸干。 待晾干后放置于电镜下观测。 结果质粒DNA与树枝状载体结合后，较纯质粒直径变小，树枝状载体-DNA疫苗的粒径趋向于平均化；PAMAM-Lys/DNA复合物
(R+/-＝4)形成的复合物图像上呈现出规则排列的粒子形态，粒径在50～100nm之间(图
2)。
PAMAM-Lys聚合物溶液及PAMAM/DNA复合物溶液按照2μL、10μL、50μL三组用量
加入到96孔板中，每组作3个复孔。 培养4h后加入100μL 5％小牛血清(FCS)DMEM
培养基(GIBCO)，于37℃、5％CO2细胞培养箱中继续分别培养12h、24h和48h。 显微
镜观察细胞的形态变化，噻唑蓝(MTT)比色法测定细胞相对增殖率，考察不同加药量和用药时间对细胞形态及细胞活性的影响。 细胞相对增殖率：
基、MTT、二甲基亚砜(DMSO)，不含细胞。 各复孔的OD值取平均数。
细胞相对增殖率为80.2％，而阳离子聚合物PLL相对增殖率仅为27.6％；PAMAM-Lys细
胞毒性明显低于5.0G PAMAM；与4.0G PAMAM相比，PAMAM-Lys增加了末端氨基基
团数目，即表面正电荷数目，从而提高了与DNA的结合效率；与具有相同末端基团数目的5.0G PAMAM相比，PAMAM-Lys可降低因多步合成所造成的细胞毒性，证实了所合成
树枝状载体PAMAM-Lys具有良好的生物相容性，可以用于生物体内实验。
纯化的pJW4303、PAMAM-Lys、pJW4303-SjC23和复合物PAMAM-Lys/pJW4303-SjC23
于小鼠股四头肌，每鼠100μg，左右腿各50μg。 每隔2周加强免疫1次，剂量和方法
相同，共免疫3次。首次免疫前及末次免疫后4周分别经尾静脉采血，分离血清置-20℃保存备用。 采用间接ELISA法检测免疫后小鼠的抗体，评价经疫苗免疫后小鼠产生特异性抗体的水平。
pJW4303-SjC23相比，PAMAM-lys/pJW4303-SjC23的抗体水平显著升高(P＜0.05)，对照组1(pJW4303)和对照组2(PAMAM-Lys)均未检测到特异性抗体(图3)。
细胞浓度为6×10 个/mL。
疫苗组pJW4303-SjC23组和PAMAM-Lys/pJW4303-SjC23组均有所升高，且PAMAM-Lys/
pJW4303-SjC23组明显高于pJW4303-SjC23组(表1)。 各组的IL-4和IL-5的水平均低于
检测限。
射pJW4303、PAMAM-Lys、pJW4303-SjC23及PAMAM-Lys/pJW4303-SjC23于小鼠股四
头肌，每鼠100μg，左右各50μg。每隔2周加强免疫1次，剂量和方法相同，共免疫3
次。 第3次免疫后4周每只小鼠经腹部皮肤感染(40±1)条尾蚴。 攻击感染后42d剖杀
小鼠，用枸橼酸生理盐水灌冲，在门静脉收集成虫并计数，取出肝脏称重后剪碎置5mL
5％KOH溶液中，37℃消化过夜，计数虫卵。 按下列公式计算减虫率及减卵率：
PAMAM-Lys/pJW4303-SjC23组减虫率显著高于pJW4303-SjC23组，P＜0.05；对照组1
与对照组2差异无显著性(P＞0.05)各组小鼠检获的成虫数见表2。
pJW4303-SjC23组减卵率分别为40.14％和59.61％，PAMAM-Lys/pJW4303-SjC23组减卵
率显著高于pJW4303-SjC23组，P＜0.05；对照组1与对照组2差异无显著性(P＞0.05)。
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