使用MNTF肽及其类似物治疗神经紊乱的方法
阅读：992发布：2020-05-15
专利汇可以提供使用MNTF肽及其类似物治疗神经紊乱的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开涉及使用运动神经元营养因子(MNTF)或其肽类似物来 治疗 神经元紊乱的方法。本发明公开进一步涉及通过施用运动神经元营养因子(MNTF)或其肽类似物来治疗受试者中脊髓损伤、神经退行性 疾病 、中 风 和脑缺血、亨廷顿氏疾病、帕金森氏疾病、多发性硬化、 肌萎缩 性侧索硬化(ALS)、阿兹海默氏疾病和糖尿病神经病变的方法。，下面是使用MNTF肽及其类似物治疗神经紊乱的方法专利的具体信息内容。
1.氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的多肽、或该多肽的盐在制备用于治疗动物中的神经元紊乱的药物中的用途，其中所述多肽或盐以静脉内的方式施用并且能够渗透过血脑屏障，并且其中所述的紊乱选自：脊髓损伤、脑缺血、亨廷顿氏疾病、帕金森氏疾病、多发性硬化(MS)、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、阿兹海默氏疾病。
2.权利要求1所述的用途，其中所述的紊乱为脊髓损伤。
3.权利要求1所述的用途，其中所述的紊乱为脑缺血。
4.权利要求1所述的用途，其中所述的紊乱为亨廷顿氏疾病。
5.权利要求1所述的用途，其中所述的紊乱为帕金森氏疾病。
6.权利要求1所述的用途，其中所述的紊乱为MS。
7.权利要求1所述的用途，其中所述的紊乱为ALS。
8.权利要求1所述的用途，其中所述的紊乱为阿兹海默氏疾病。
9.权利要求1所述的用途，其中所述的动物是人。
使用MNTF肽及其类似物治疗神经紊乱的方法
背景技术
[0001] 本发明公开总体上涉及使用MNTF肽及其类似物治疗神经紊乱的组合物和方法。
[0002] 下文包括了可以用于理解本发明公开的信息。并非承认，本文所提供的任何信息对于本发明公开而言是现有技术或相关技术，或者并非承认，以明确的或隐含的方式引用的任何出版公开或文件是现有技术。
[0003] 已经发现，胚胎运动神经元的存活取决于由相关的、发育中的骨骼肌衍生而来的特定的营养物质。已经报道，某些骨骼肌产生能够通过防止胚胎神经元发生退化以及随后的自然细胞死亡来增强神经元的存活和发育的物质。这些物质已经被广泛地描述为神经营养因子(NTF)，其为这样一类专门的蛋白质，这些蛋白质发挥作用以促进所选的多群神经元的存活、生长、维持和功能的能力(例如Chau，R.M.W.，et al.，6 Chin.J Neuroanatomy129，1990)。
[0004] 影响中枢和/或外周神经系统的多种神经退行性、神经肌肉和神经元的疾病、紊乱或病况可以完全地或部分地表征为功能神经组织的急性或进行性丧失。其包括诸如脊髓损伤(SCI)、神经退行性疾病、中风或缺血(例如脑缺血)、亨廷顿氏疾病(HD)、帕金森氏疾病(PD)、多发性硬化(MS)、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、阿兹海默氏疾病(AD)和糖尿病神经病变之类的病况。
[0005] US6309877、US7183373、US6841531、US6759389和US20060052299报道了被称为运动神经元营养因子(MNTF)的特定神经营养因子(NTF)，所述的因子具有对运动神经元以营养作用的能力。所述文献的内容在此以引用方式全文并入本文。
[0006] 发明概述
[0007] 本文描述了具有许多特征和实施方案的技术，这些特征和实施方案包括，但不限于在本发明概述中列出、描述或引用的那些。无意于将所有的特征和实施方案都包括在内，并且权利要求也不限于本发明概述中所表明的特征或实施方案，这些特征和实施方案仅是为了说明的而并非为了限制的目的被包括在本说明中的。
[0008] 因此，在一个方面中，本发明公开涉及包含MNTF分子的部分的新型肽和组合物，其中所述的MNTF分子可用于调节神经元细胞的生存能力和增殖，从而提供了可以容易地合成的并且在治疗中枢和/或外周神经系统中的多种神经退行性、神经肌肉的疾病、紊乱或病况中具有治疗有效性的神经营养肽。
[0009] 在一个方面中，提供了治疗受试者运动神经缺陷和/或神经元紊乱的方法，该方法包括向有此需要的受试者施用运动神经元营养因子(MNTF)类似物，其中所述的神经元紊乱选自：脊髓损伤、神经退行性疾病、中风或缺血、亨廷顿氏疾病、帕金森氏疾病、多发性硬化、ALS、阿兹海默氏疾病和糖尿病神经病变，其中所述的运动神经元营养因子(MNTF)以足以治疗所述的神经元紊乱的量来施用。
[0010] 在一个方面中，本发明公开涉及合成的和/或纯化的MNTF肽类似物，其中所述的MNTF肽类似物包含WMLSAFSRYAR结构域的部分(包括WMLSAFS，FSRYAR，以及SEQ ID NO：1-142的其他结构域)，并且本发明公开还涉及模拟了上述类似物的结构和/或功能的、用于诱导或调节神经元细胞的生存能力和生长的分子，包括截短的序列同源物和类似物。
[0011] 在某些实施方案中，MNTF肽类似物可以包括含有SEQ ID NO：1-7以及SEQ ID NO：8-142的序列类似物(参见图25)。
[0012] LGTFWGDTLN CWMLSAFSRY ARCLAEGHDG PTQ(SEQ ID NO：1)
[0013] FSRYAR(SEQ ID NO：2)
[0014] WMLSAFS(SEQ ID NO：3)
[0015] MLSAFSRYAR(SEQ ID NO：4)
[0016] FSRYARCLAE G(SEQ ID NO：5)
[0017] CWMLSAFSRY ARC(SEQ ID NO：6)
[0018] MLSAFSRYAR CLAEGHDGPT Q(SEQ ID NO：7)
[0019] 本文中所描述的MNTF肽类似物为衍生自MNTF的多肽(即，得自SEQ ID NO：1)以及此类衍生多肽的类似物。这些化合物包括具有SEQID NO：1-142中的一条序列(例如SEQ ID NO：2-7中的任一条)的氨基酸序列的多肽。此外，所述的化合物还包括SEQ ID NO：1-7中所述的MNTF肽类似物的功能衍生物。上文所述多肽的盐、酯和其他普通剂型也可用于本文所述的技术中，如其中一个或多个氨基酸残基已经被非天然(例如D-异构体)的氨基酸残基替代的多肽一样。如本文所述，其他类似物(包括保守性地替代SEQ ID NO：1中所公开的那些氨基酸残基的氨基酸残基)可以用于替代一个或多个这些残基。
[0020] 在另一方面中，提供了这样的组合物和方法，其通过体外向细胞培养物施用MNTF肽类似物或者体内向患有神经损伤或神经退行性紊乱的个体施用MNTF肽类似物以促进细胞增殖或稳定不适当的细胞死亡、和/或在上述任一种情况下以恢复正常细胞的行为，来调节神经元细胞的生存能力和/或生长。
[0021] 在一个方面中，提供了一种修复受试者中损害的神经通路的方法，该方法包括向有此需要的受试者施用运动神经元营养因子(MNTF)类似物，其中所述损害的神经通路与脊髓损伤、神经退行性疾病、中风或缺血、亨廷顿氏疾病、帕金森氏疾病、多发性硬化、ALS、阿兹海默氏疾病和糖尿病神经病变有关，其中所述的运动神经元营养因子(MNTF)类似物以足以治疗所述的神经元紊乱的量来进行施用，从而在所述的受试者中损害的神经通路得以修复。
[0022] 在一个方面中，提供了一种改善患有神经通路损害症状的受试者的运动功能的方法，该方法包括向有此需要的患者施用运动神经元营养因子(MNTF)类似物，其中所述的损伤的神经通路与脊髓损伤、神经退行性疾病、中风或缺血、亨廷顿氏疾病、帕金森氏疾病、多发性硬化、ALS、阿兹海默氏疾病和糖尿病神经病变有关，其中所述的运动神经元营养因子(MNTF)类似物以足以治疗所述受试者中所述损害的神经通路的量来进行施用，从而运动功能得以改善。附图说明
[0023] 图1。示出了野生型小鼠的脑中示例性MNTF-6聚体肽类似物(GM6；FSRYAR，SEQ ID NO：2)的水平。野生型小鼠：载体对照(盐水)，0.2mg的MNTF或者2mg/kg的MNTF。在时间0时，施用所示的测试制品，并在4小时后收集脑以便通过ELISA进行分析。
[0024] 图2A。示出了在发生暂时性缺血的小鼠中，示例性MNTF-6聚体肽(FSRYAR，GM602或SEQ ID NO：2)对梗塞体积的作用。所有的小鼠都经历了1小时的脑缺血、及其后的24小时的再灌注。在缺血结束时，以1mg/kg或5mg/kg的量对动物静脉内注射载体(对照)或者GM602。在第2天处死动物，并进行处理以测定梗塞体积。
[0025] 图2B。其为经历缺血/再灌注损伤、然后经历IV注射一个剂量的GM602或载体的两个脑的图像，其中GM602(左侧，经治疗的脑的4个部分)显示出极小的损伤(白色区域)，而载体(右侧，对照脑的4个部分)显示出脑中过度的损伤。其为得自经历1小时缺血及24小时再灌注的小鼠脑的代表性照片。在缺血结束时，对动物注射GM602(5mg/kg)或载体。
[0026] 图3。示出了得自脑血流量的估测的数据，其中所述的脑血流量得自经历缺血/再关注损伤的动物。所有的小鼠都经历了1小时的脑缺血、及其后的24小时的再灌注。在缺血结束时，以1mg/kg或5mg/kg的量对动物静脉内注射载体(对照)或者GM602。对于各研究组而言，在发生缺血之前(第一根柱)、在缺血过程中(第二根柱)以及在注入测试制品之后(第三根柱)，测定血流量。
[0027] 图4。其为在经历缺血/再灌注损伤的小鼠中的血压测定值。所有的小鼠都经历了1小时的脑缺血、及其后的24小时的再灌注。在缺血结束时，以1mg/kg或5mg/kg的量对动物静脉内注射载体(对照)或者GM602。对于各研究组而言，在发生缺血之前(第一根柱)、在缺血过程中(第二根柱)以及在注入测试制品之后(第三根柱)，测定血流量。
[0028] 图5。其为在经历缺血/再灌注损伤的小鼠中的心率测定值。所有的小鼠都经历了1小时的脑缺血、及其后的24小时的再灌注。在缺血结束时，以1mg/kg或5mg/kg的量对动物静脉内注射载体(对照)或者GM602。对于各研究组而言，在发生缺血之前(第一根柱)、在缺血过程中(第二根柱)以及在注入测试制品之后(第三根柱)，测定心率。
[0029] 图6。其为在经历缺血/再灌注损伤的小鼠中的血气测定值。所有的小鼠都经历了1小时的脑缺血、及其后的24小时的再灌注。在缺血结束时，以1mg/kg或5mg/kg的量对动物静脉内注射载体(对照)或者GM602。对于各研究组而言，在发生缺血之前(第一根柱)、在缺血过程中(第二根柱)以及在注入测试制品之后(第三根柱)，测定血液气体(pO2和pCO2)。
[0030] 图7。其为在经历缺血/再灌注损伤的小鼠中的pH测定值。所有的小鼠都经历了1小时的脑缺血、及其后的24小时的再灌注。在缺血结束时，以1mg/kg或5mg/kg的量对动物静脉内注射载体(对照)或者GM602。对于各研究组而言，在发生缺血之前(第一根柱)、在缺血过程中(第二根柱)以及在注入测试制品之后(第三根柱)，测定pH。
[0031] 图8。其为在经历缺血/再灌注损伤的小鼠中的神经缺损测定值。所有的小鼠都经历了1小时的脑缺血、及其后的24小时的再灌注。在缺血结束时，以1mg/kg或5mg/kg的量对动物静脉内注射载体(对照)或者GM602。在再灌注的末期测定神经缺损情况。
[0032] 图9。示出了在发生脊髓损伤后的小鼠中，示例性MNTF肽类似物GM603(FSRYAR，SEQ ID NO：2)对病变体积的作用。所有的小鼠都经历了脊髓损伤、及其后的14天的恢复。在损伤后，并在在每天都对动物静脉内注射载体(对照)和GM603，直至处死。在第14天将动物处死，然后进行处理以测定病变体积。
[0033] 图10。其为在经历脊髓损伤(SCI)之后脊髓的损害区域。所有的小鼠都经历了脊髓损伤、及其后的14天的恢复。切除组织切片，并进行处理以用于评价损害区域。A：经载体治疗的患有SCI的小鼠。B：使用5mg/kg GM603治疗的小鼠。损害的区域染成了红色，而未受损害的区域被染成了蓝色。如图所示，在GM603治疗的动物中，图B所示的损害区域明显较小。
[0034] 图11。示出了经历脊髓损伤的动物的转棒踏车(Rota-RodTreadmill)测试的结果。所有的小鼠都经历了脊髓损伤、及其后的图中指示的天数。在损伤之后测定行为分析情况。
[0035] 图12。其为在经历脊髓损伤的小鼠中的旷场(open-field)行为测定情况。所有的小鼠都经历了脊髓损伤、及其后的图中指示的天数。在损伤之后测定行为分析情况。
[0036] 图13。其为在ALS小鼠中，示例性MNTF肽类似物GM604(FSRYAR，SEQ ID NO：2)对疾病发作年龄的作用。在第80天，并且在直至处死前每天都对所有的小鼠静脉内注射载体(对照)或GM604。针对疾病发作的时间对动物进行记录。
[0037] 图14。其为在ALS小鼠中，示例性MNTF肽类似物GM604对死亡年龄的作用。在第80天，并且在直至处死前每天都对所有的小鼠静脉内注射载体(对照)或GM604。基于后肢瘫痪的情况，针对疾病发作的时间对动物进行记录。
[0038] 图15。其为对ALS动物的转棒踏车测试情况。所有的小鼠都是转基因的，发生了G93A SOD突变，并如指示的使用盐水或者示例性MNTF肽类似物GM604进行治疗。在指示的时间测定行为分析情况。
[0039] 图16。其为对ALS动物的抓力测试。所有的小鼠都是转基因的，发生了G93A SOD突变，并如指示的使用盐水或者GM604进行治疗。对ALS动物进行临床评分。所有的小鼠都是转基因的，发生了G93A SOD突变，并如指示的使用盐水或者GM604进行治疗。按照在方法部分中概括的那样，在指示的时间测定临床评分。未见虚弱迹象(0)；颤抖和丧失张开反射(1)；一只后肢轻瘫(2)；两只后肢轻瘫(3)；一只或两只后肢瘫痪(4)(参见图16B)。
[0040] 图17。其为在经历猪毛菜酚(salsolinol)治疗后的SH-SY5Y神经元细胞中，示例性MNTF肽类似物(GB测试制品)对细胞生存能力的作用。按照在方法部分中所概况的那样，所有的培养物都生长在培养基中。将培养物与载体(对照)、各种浓度的MNTF肽类似物GM6、+/-猪毛菜酚(Sal)温育。此外，将多个培养物与渥曼青霉素(W)温育，从而测定作用的机制。将培养物与多种化合物温育24小时，并分析细胞的生存能力。
[0041] 图18。通过CSF，在原代神经元细胞培养物中诱导细胞死亡。在培养12天后，将得自对照和各种神经紊乱的CSF应用到原代大鼠神经元细胞培养物中，为期2天。在时间0时施用所示的测试制品，并通过MTT分析测定培养物的细胞生存能力。
[0042] 图19。其为在CSF诱导的细胞死亡中，示例性MNTF肽对抗神经元细胞损失的保护性作用。在培养12天后，将得自对照和各种神经紊乱的CSF应用到原代大鼠神经元细胞培养物中，为期2天。加入MNTF(+M)，2小时后加入CSF。在时间0时施用所示的测试制品，并通过MTT分析测定培养物的细胞生存能力。
[0043] 图20A和20B。其为在PD诱导和GM6处理后，小鼠中的行为测定情况。对雄性C57BL/6小鼠注射MPTP，然后以所示的剂量注射GM6，为期5天。评价动物的行为变化情况。
[0044] 图21A、21B和21C。示出了在经历MPTP治疗后一元胺和代谢物的水平。对雄性C57BL/6小鼠注射MPTP，然后以所示的剂量注射GM6，为期5天。在所述研究结束时评价动物中一元胺和代谢物的水平。
[0045] 图22。其为在PD诱导和GM6处理后，小鼠的黑质致密部(Substantia nigra pars compacta)中细胞的数量。对雄性C57BL/6小鼠注射MPTP，然后以所述的剂量注射GM6，为期5天。在所述研究结束时，评价动物中的细胞计数。
[0046] 图23。其为在MS诱导和GM6处理后，小鼠中的平均临床分数。对雌性JJL/J小鼠注射PLP，然后以所示的剂量注射GM6，为期7天。每隔一天评价动物的临床分数。
[0047] 图24A和24B。24A：其为在MS诱导和GM6处理后，小鼠的脑中的病变的数量。对雌性JJL/J小鼠注射PLP，然后以指示的剂量注射GM6，为期7天。在所述研究结束时，评价动物中的脑病变情况。24B：其为在MS诱导和GM6处理后，小鼠脊髓中的病变的数量。对雌性JJL/J小鼠注射PLP，然后以指示的剂量注射GM6，为期7天。在所述研究结束时，评价动物中的脊髓病变情况。
[0048] 图25，其由图25A、25B、25C、25D、25E、25F和25G构成，为示例性MNTF肽类似物的部分列表。与各个SEQ ID NO相应的序列被突出表示。
[0049] 图26。示出了在经历瞬时缺血的小鼠中GM602对梗塞体积的作用的研究中得到的数据。所有的小鼠都经历了1小时的脑缺血、及其后14天的再灌注。在缺血后，在指示的时间(3、6、12、24小时)，以5mg/kg的量对动物静脉内注射载体(对照)或者GM602。此外，在损伤后的3天中每天都对动物进行注射。在第14天处死动物，并对其进行处理以测定梗塞体积。
[0050] 图27。示出了在经历缺血/再灌注损伤的动物中脑血流量研究中得到的数据。所有的小鼠都经历了1小时的脑缺血、及其后14天的再灌注。在缺血发作后的第3、6、12和24小时施用测试制品。在发生缺血前、在缺血后以及再灌注后测定血流量。
[0051] 图28。其为在经历缺血/再灌注损伤的小鼠中的血压测定值。所有的小鼠都经历了1小时的脑缺血、及其后14天的再灌注。在缺血发作后的第3、6、12和24小时施用测试制品。在发生缺血前、在缺血过程中以及在缺血结束时之后测定血压。
[0052] 图29。其为在经历缺血/再灌注损伤的小鼠中的心率测定值。所有的小鼠都经历了1小时的脑缺血、及其后14天的再灌注。在缺血发作后的第3、6、12和24小时施用测试制品。在发生缺血前、在缺血过程中以及在缺血结束时之后测定心率。
[0053] 图30A和30B。其为在经历缺血/再灌注损伤的小鼠中的血液气体测定值。所有的小鼠都经历了1小时的脑缺血、及其后14天的再灌注。在缺血发作后的第3、6、12和24小时施用测试制品。在发生缺血前、在缺血过程中以及在缺血结束时之后测定血液气体pO2(30A)和pCO2(30B)。
[0054] 图31。其为在经历缺血/再灌注损伤的小鼠中的pH测定值。所有的小鼠都经历了1小时的脑缺血、及其后14天的再灌注。在缺血发作后的第3、6、12和24小时施用测试制品。在发生缺血前、在缺血过程中以及在缺血结束时之后测定pH。
[0055] 图32。其为在经历缺血/再灌注损伤的小鼠中神经缺损的测定值。所有的小鼠都经历了1小时的脑缺血、及其后14天的再灌注。在缺血发作后的第3、6、12和24小时施用测试制品。在再灌注结束时，测定神经缺损情况。
[0056] 图33。其为在经历缺血之后的大鼠中，GM602对梗塞体积的作用。所有的大鼠都经历的为期28天的持续的脑缺血。在缺血开始之后的3小时，以0，2.5，10或20mg/kg的量对动物静脉内注射载体(对照)或GM602。在第28天处死动物，并对其进行处理以测定梗塞体积。
[0057] 图34。其为得自经历缺血的动物的脑血液。所有的大鼠都经历了脑缺血，及其后28天的恢复。在缺血发作后的3小时，以2.5、10或20mg/kg的量对动物静脉内注射载体(对照)或GM602。对于各研究组而言，在发生缺血前(第一根柱，缺血前基线下的CBF)，在缺血过程中(第二根柱，在持续缺血之后、但在施用测试制品之前3小时的CBF)，以及在注射了测试制品之后(第三根柱，在施用测试制品之后1小时的CBF)测定血液流量。
[0058] 图35。其为在经历缺血的大鼠中的血液测定值。所有的大鼠都经历了脑缺血，及其后28天的恢复。在缺血发作后的3小时，以2.5、10或20mg/kg的量对动物静脉内注射载体(对照)或GM602。对于各研究组而言，在发生缺血之前(第一根柱)、在缺血过程中(第二根柱)以及在注入测试制品之后(第三根柱)，测定血压。
[0059] 图36。其为在经历缺血的大鼠中的心率测定值。所有的大鼠都经历了脑缺血，及其后28天的恢复。在缺血发作后的3小时，以2.5、10或20mg/kg的量对动物静脉内注射载体(对照)或GM602。对于各研究组而言，在发生缺血之前(第一根柱)、在缺血过程中(第二根柱)以及在注入测试制品之后(第三根柱)，测定心率。
[0060] 图37A和37B。其为在经历缺血的大鼠中的血液气体测定值。所有的大鼠都经历了持续的脑缺血，及其后28天的恢复。在缺血发作后的3小时，以2.5、10或20mg/kg的量对动物静脉内注射载体(对照)或GM602。对于各研究组而言，在发生缺血之前(第一根柱)、在缺血过程中(第二根柱)以及在注入测试制品之后(第三根柱)，测定血液气体pO2(参见图37A)和pCO2(参见图37B)。
[0061] 图38。其为在经历缺血的大鼠中的pH测定值。所有的大鼠都经历了持续的脑缺血，及其后28天的恢复。在缺血发作后的3小时，以2.5、10或20mg/kg的量对动物静脉内注射载体(对照)或GM602。对于各研究组而言，在发生缺血之前(第一根柱)、在缺血过程中(第二根柱)以及在注入测试制品之后(第三根柱)，测定pH。
[0062] 图39。其为在经历缺血的大鼠中的神经缺损测定值。所有的大鼠都经历了持续的脑缺血，及其后28天的恢复。在缺血发作后的3小时，以2.5、10或20mg/kg的量对动物静脉内注射载体(对照)或GM602。图39A：其为前肢放置情况。图39B：其为后肢放置情况。图39C：其为平衡木情况。图39D：其为在所述研究结束时，测定的神经缺损情况(自发运动活动性)。在图39D中，第一根条柱是在施用测试制品之前的评分，而第二根条柱是在给要测试制品之后的第28天时的评分。
[0063] 图40。其为在经历缺血损伤的大鼠中的生物标志物测定值。所有的大鼠都经历了持续的脑缺血，及其后28天的恢复。在缺血发作后的3小时，以2.5、10或20mg/kg的量对动物静脉内注射载体(对照)或GM602。在第28天处死动物，并对脑切片进行处理以用于TNF免疫组织化学分析。
[0064] 图41。其为在经历缺血损伤的大鼠中的生物标志物测定值。所有的大鼠都经历了持续的脑缺血，及其后28天的恢复。在缺血发作后的3小时，以2.5、10或20mg/kg的量对动物静脉内注射载体(对照)或GM602。在第28天处死动物，并对脑部分进行处理以用于Fluoro-jade免疫组织化学分析。
[0065] 发明详述
[0066] 已经发现，胚胎运动神经元的存活取决于由相关的、发育中的骨骼肌衍生而来的特定的营养物质。已经报道，骨骼肌产生能够通过抑制胚胎神经元发生退化以及随后的自然细胞死亡来增强运动神经元的存活和发育的物质(O′Brian，R.J.and Fischbach，G.D.，6 J.Neurosci.3265(1986)；Hollyday，M.and Hamburger，V.，170 J.Comp.Neurol.311(1976).McManaman，J.L.，et al.，263 J.Biol.Chem.5890(1988)；Oppenheim，R.W.，et al.，240 Science，919(1988)； 和 Smith，R.G.，et al.，6 J.Neurosci.439(1986))。
[0067] 人运动神经元营养因子(MNTF)是一种得自骨骼肌组织的特殊的NTF，已经显示其能够减少运动神经损伤位置处的炎症，增强神经再生，以及促进运动神经元的存活。已经在大鼠的多种神经系统中对MNTF进行了测试，其中所述的神经系统包括：外周坐骨神经(控制下肢肌肉)，外周肌皮神经(控制上肢肌肉)，头部和面部神经(控制面部和头部肌肉)，头部舌下神经(控制舌头)，以及控制颈部、胸腔和上肢中的肌肉的部分脊髓。在脊髓模型中，将MNTF施加在大鼠的半横切脊髓中的神经移植物上；MNTF减少了炎症、限制了恶化并增强了嫁接神经的再生。许多研究已经证实了当将MNTF或其肽类似物直接施加到所述的神经上时，这些合成的MNTF或其肽类似物在大鼠外周神经模型中在营养和热效应方面的效力。此外，MNTF已经显示出能够促进运动神经元的再生和存活。
[0068] 在生长和形成的某些时期，在脊椎动物的神经系统中发生神经元细胞死亡。因此，加入得自相关目标组织的可溶性神经元营养因子可以起到减轻神经元死亡的这种现象。
[0069] 因此，本发明公开的多个方面和实施方案提供了用于治疗神经元紊乱的、包含MNTF肽类似物及其衍生物的方法和组合物。
[0070] 本发明公开的多个方面和实施方案涉及与运动神经元营养因子的作用有关的功能蛋白质结构域，该结构域已经被识别并且在MNTF1分子中被绘制成短的重叠序列。这些这些蛋白质结构域(包括″WMLSAFSRYAR″，″WMLSAFS″，″FSRYAR″以及得自SEQ ID NO：1-142的其他结构域)足以调节神经元细胞的生存能力和增殖。此外，包含这些结构域的多种截短的MNTF1种类或类似物(序列片段类似物或其功能类似物)他们本身足以证明运动神经元/成神经细胞瘤细胞杂交体的刺激生物活性。
[0071] 定义
[0072] 以下列出在描述本发明公开所属技术的内容中使用的某些术语。除非另作说明，否则以下术语当在本文中以及在所附的权利要求书中使用时具有以下含义。在以下说明书或者在本说明书中的其他处没有定义的那些术语具有他们本领域所公认的含义。
[0073] 如本文所使用的，“运动神经元营养因子”包括涉及运动神经元的营养或维持的那些因子。术语“运动神经元营养因子”、“MNTF”、“MNTF肽”、“运动神经元营养因子类似物”和“MNTF类似物”可以互换使用，只要它们具有本文限定的功能特性。他们可以包括参照NMTF序列的序列以及功能同源物。运动神经元营养因子可以促进定型的神经祖细胞的发育和分化，或者它们可以诱导或增强分化的神经细胞的生长(例如神经突长出)和存活。本发明的运动神经元营养因子一般以有效产生CNS或PNS的完全分化的神经细胞(例如，运动神经元)的量提供。关于量的指导在本文中提供，并且可以由技术人员基于已知操作和本文公开的方法容易地确定。
[0074] 示例性的MNTF肽及其肽类似物可以包括在Chau，R.M.W.，et al.，Muscle Neuronotrophic Factors Specific for Anterior HornMotoneurons of Rat Spinal Cord.In：Recent Advances in Cellularand Molecular Biology，Vol.5，Peeters Press，Leuven，Belgium，pp.89-94(1992)中所报道的那些，以及在(例如)US6309877、US7183373、US6841531、US6759389和US20060052299中发现的那些。这些文献的内容全文并入本文。在某些实施方案中，实例可以包括可用于诱导或调节神经元细胞的生存能力和生长的、经合成和/或纯化的、包含有部分WMLSAFSRYAR结构域(包括WMLSAFS、FSRYAR以及得自SEQ ID NO：1-142的其他结构域)的MNTF肽类似物，以及模拟了其类似物的结构和/或功能的分子(包括截短的序列同源物和类似物)。
[0075] 此外，示例性的MNTF肽及其肽类似物还可以包括在Chau，R.M.W.，et al.，The Effect of a 30 kD Protein from Tectal Extractof Rat on Cultured Retinal Neurons，34 Science in China，SeriesB，908(1991)；Chau，R.M.W.，et al.，Muscle NeuronotrophicFactors Specific for Anterior Horn Motoneurons of Rat SpinalCord.In：Recent Advances in Cellular and Molecular Biology，Vol.5，Peeters Press，Leuven，Belgium，pp.89-94(1992)；Chau，R.M.W.，et al.，The Effect of a 30 kD Protein from Tectal Extractof Rat on Cultured Retinal Neurons，34 Science in China，SeriesB，908(1991)；Chau，R.M.W.，et al.，Cloning of Genes forMuscle-Derived Motoneuronotrophic Factor 1(MNTF1)and ItsReceptor by Monoclonal Antibody Probes，(abstract)19 Soc.forNeurosci.part 1，252(1993)，Chau，R.M.W.，et al.，Cloningof Genes for Muscle-Derived Motoneuronotrophic Factor 1(MNTF1)and Its Receptor by Monoclonal Antibody Probes，(abstract)19Soc.for Neurosci.part 1，252(1993)中所描述的那些，这些文献的全部内容均以参考方式并入本文。在某些实施方案中，所述的MNTF或其类似物是合成的或纯化的。
[0076] 在某些实施方案中，MNTF肽类似物可以包括得自MNTF结构域的活性位点之一的序列(例如6个氨基酸的MNTF类似物，例如SEQ ID NO：2)。
[0077] 在某些实施方案中，MNTF肽类似物可以包括含有SEQ ID NO：1-142的序列类似物。
[0078] 在某些实施方案中，MNTF肽类似物可以包括如在SEQ ID NO：1-142中所述的肽类似物的功能衍生物。
[0079] 在某些实施方案中，所述的MNTF肽类似物及其衍生物可以由在SEQ ID NO：1-142中所述的序列构成。
[0080] 如本申请所用，“类似物”是指这样的肽，其中在参照序列中的一个或多个氨基酸被改变，而基本上没有影响MNTF的活性。在某些实施方案中，根据本发明公开的类似物包括“保守性”的取代。保守性的氨基酸取代包括使用具有相同基团的同义氨基酸进行的氨基酸替代，其中所述的同义氨基酸具有足够相同相似的物理化学性质，从而使得同类成员之间的取代将保留所述分子的生物学功能，Grantham，Science，Vol.185，pp.862-864(1974)。
[0081] 同义氨基酸基团包括在表I、II和III中定义的那些。
[0082] 表I
[0083] 宽泛种类的同义氨基酸
[0084] 氨基酸-同义种类
[0085] Ser-Ser，Thr，Gly，Asn
[0086] Arg-Arg，Gln，Lys，Glu，His
[0087] Leu-Ile，Phe，Tyr，Met，Val，Leu
[0088] Pro-Gly，Ala，Thr，Pro
[0089] Thr-Pro，Ser，Ala，Gly，His，Gln，Thr
[0090] Ala-Gly，Thr，Pro，Ala
[0091] Val-Met，Tyr，Phe，Ile，Leu，Val
[0092] Gly-Ala，Thr，Pro，Ser，Gly
[0093] Ile-Met，Tyr，Phe，Val，Leu，Ile
[0094] Phe-Trp，Met，Tyr，Ile，Val，Leu，Phe
[0095] Tyr-Trp，Met，Phe，Ile，Val，Leu，Tyr
[0096] Cys-Ser，Thr，Cys
[0097] His-Glu，Lys，Gln，Thr，Arg，His
[0098] Gln-Glu，Lys，Asn，His，Thr，Arg，Gln
[0099] Asn-Gln，Asp，Ser，Asn
[0100] Lys-Glu，Gln，His，Arg，Lys
[0101] Asp-Glu，Asn，Asp
[0102] Glu-Asp，Lys，Asn，Gln，His，Arg，Glu
[0103] Met-Phe，Ile，Val，Leu，Met
[0104] Trp-Trp
[0105] 表II
[0106] 中等程度种类的同意氨基酸
[0107] 氨基酸-同义种类
[0108] Ser-Ser
[0109] Arg-His，Lys，Arg
[0110] Leu-Ile，Phe，Met，Leu
[0111] Pro-Ala，Pro
[0112] Thr-Thr
[0113] Ala-Pro，Ala
[0114] Val-Met，Ile，Val
[0115] Gly-Gly**
[0116] Ile-Ile，Met，Phe，Val，Leu
[0117] Phe-Met，Tyr，Ile，Leu，Phe
[0118] Tyr-Phe，Tyr
[0119] Cys-Ser，Cys
[0120] His-Arg，Gln，His
[0121] Gln-Glu，His，Gln
[0122] Asn-Asp，Asn
[0123] Lys-Arg，Lys
[0124] Asp-Asn，Asp
[0125] Glu-Gln，Glu
[0126] Met-Phe，Ile，Val，Leu，Met
[0127] Trp-Trp
[0128] 表III
[0129] 狭窄范围种类的同义氨基酸
[0130] 氨基酸-同义种类
[0131] Ser-Ser
[0132] Arg-Arg
[0133] Leu-Ile，Met，Leu
[0134] Pro-Pro
[0135] Thr-Thr
[0136] Ala-Ala
[0137] Val-Val
[0138] Gly-Gly
[0139] Ile-Ile，Met，Leu
[0140] Phe-Phe
[0141] Tyr-Tyr
[0142] Cys-Ser，Cys
[0143] His-His
[0144] Gln-Gln
[0145] Asn-Asn
[0146] Lys-Lys
[0147] Asp-Asp
[0148] Glu-Glu
[0149] Met-Ile，Leu，Met
[0150] Trp-Trp
[0151] 在本文所提供的化合物(例如肽和蛋白质)中所使用的氨基酸可以是遗传编码的氨基酸，天然形成的非遗传编码的氨基酸，或者合成的氨基酸。上述任何氨基酸的L-和D-对映体都可以用于所述的化合物中。本文中，以下缩写可以用于以下遗传编码的氨基酸(及其残基)中：丙氨酸(Ala，A)；精氨酸(Arg，R)；天冬酰胺(Asn，N)；天冬氨酸(Asp，D)；半胱氨酸(Cys，C)；甘氨酸(Gly，G)；谷氨酸(Glu，E)；谷氨酰胺(Gln，Q)；组氨酸(His，H)；
异亮氨酸(Ile，I)；亮氨酸(Leu，L)；赖氨酸(Lys，K)；甲硫氨酸(Met，M)；苯丙氨酸(Phe，F)；脯氨酸(Pro，P)；丝氨酸(Ser，S)；苏氨酸(Thr，T)；色氨酸(Trp，W)；酪氨酸(Tyr，Y)；
以及缬氨酸(Val，V)。
异亮氨酸(Ile，I)；亮氨酸(Leu，L)；赖氨酸(Lys，K)；甲硫氨酸(Met，M)；苯丙氨酸(Phe，F)；脯氨酸(Pro，P)；丝氨酸(Ser，S)；苏氨酸(Thr，T)；色氨酸(Trp，W)；酪氨酸(Tyr，Y)；
以及缬氨酸(Val，V)。
[0152] 某些并非遗传编码的并且可以在本文所述的化合物中存在的常见的氨基酸包括(但不限于)：β-丙氨酸(b-Ala)以及其他ω-氨基酸，例如3-氨基丙酸(Dap)，2，3-二氨基丙酸(Dpr，Z)，4-氨基丁酸等；α-氨基异丁酸(Aib)；ε-氨基己酸(Aha)；δ-氨基戊酸(Ava)；甲基甘氨酸(MeGly)；鸟氨酸(Orn)；瓜氨酸(Cit)；叔丁基丙氨酸(t-BuA)；叔丁基甘氨酸(t-BuG)；N-甲基异亮氨酸(MeIle)；苯基甘氨酸(Phg)；环己基丙氨酸(Cha)；正亮氨酸(Nle，J)；2-萘基丙氨酸(2-Nal)；4-氯苯基丙氨酸(Phe(4-Cl))；2-氟苯基丙氨酸(Phe(2-F))；3-氟苯基丙氨酸(Phe(3-F))；4-氟苯基丙氨酸(Phe(4-F))；青霉胺(Pen)；
1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸(Tic)；β-2-噻吩丙氨酸(Thi)；甲硫氨酸亚砜(MSO)；高精氨酸(hArg)；N-乙酰基赖氨酸(AcLys)；2，3-二氨基丁酸(Dab)；2，3-二氨基丁酸(Dbu)；
对氨基苯基丙氨酸(Phe(pNH2))；N-甲基缬氨酸(MeVal)；高半胱氨酸(hCys)；3-苯并噻唑-2-基-丙氨酸(BztAla，B)；以及高丝氨酸(hSer)。所考虑的其他氨基酸类似物包括：磷酸丝氨酸、磷酸苏氨酸、磷酸酪氨酸、羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸酯、马尿酸、八氢吲哚-2-羧酸、施德丁(Statine)、α-甲基-丙氨酸、对苯酰-苯基丙氨酸、炔丙基甘氨酸以及肌氨酸。
无论是目前或是在将来，本文所述的肽在L-或D-构型中可以具有任何之前所述的氨基酸，或者可以具有本文所述的或本领域已知的任何其他氨基酸。
1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸(Tic)；β-2-噻吩丙氨酸(Thi)；甲硫氨酸亚砜(MSO)；高精氨酸(hArg)；N-乙酰基赖氨酸(AcLys)；2，3-二氨基丁酸(Dab)；2，3-二氨基丁酸(Dbu)；
对氨基苯基丙氨酸(Phe(pNH2))；N-甲基缬氨酸(MeVal)；高半胱氨酸(hCys)；3-苯并噻唑-2-基-丙氨酸(BztAla，B)；以及高丝氨酸(hSer)。所考虑的其他氨基酸类似物包括：磷酸丝氨酸、磷酸苏氨酸、磷酸酪氨酸、羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸酯、马尿酸、八氢吲哚-2-羧酸、施德丁(Statine)、α-甲基-丙氨酸、对苯酰-苯基丙氨酸、炔丙基甘氨酸以及肌氨酸。
无论是目前或是在将来，本文所述的肽在L-或D-构型中可以具有任何之前所述的氨基酸，或者可以具有本文所述的或本领域已知的任何其他氨基酸。
[0153] 可以彼此取代其他的氨基酸通常在相似的类别或亚类中。如本领域的技术人员所知道的那样，主要根据氨基酸侧链的化学和物理性质，许多氨基酸可以被放置到不同的类别中。例如，一些氨基酸通常被认为是亲水性的或者是极性的氨基酸，而其他的氨基酸被认为是疏水性的或者是非极性的氨基酸。极性氨基酸包括具有酸性、碱性或亲水性侧链的氨基酸，而非极性氨基酸包括具有芳香或疏水性侧链的氨基酸。非极性氨基酸可以被进一步再细分，其中包括脂肪族氨基酸等。本文所用的氨基酸类别的定义如下所示：
[0154] “非极性氨基酸”指具有在生理pH下不带电，非极性和一般被水溶液排斥的侧链的氨基酸。遗传编码的疏水性氨基酸的例子包括Ala、Ile、Leu、Met、Trp、Tyr和Val。非遗传编码的非极性氨基酸的例子包括t-BuA、Cha和Nle。
[0155] “芳香族氨基酸”指具有这样的侧链的非极性氨基酸，所述侧链包含至少一个具有缀合的π-电子系统(芳香族基团)的环。芳香族基团可以进一步替换为取代基例如烷基、烯基、炔基、羟基、磺酰基、硝基和氨基以及其他。遗传编码的芳香族氨基酸的例子包括苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。常见的非遗传编码的芳香族氨基酸包括苯基甘氨酸、2-萘基丙氨酸、β-2-噻吩丙氨酸、3-苯并噻唑-2-基-丙氨酸、1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸、4-氯苯丙氨酸、2-氟苯丙氨酸、3-氟苯丙氨酸和4-氟苯丙氨酸。
[0156] “脂肪族氨基酸”指具有饱和或未饱和的直链、分支或环状烃侧链的非极性氨基酸。遗传编码的芳香族氨基酸的例子包括Ala、Leu、Val和Ile。非编码的芳香族氨基酸的例子包括Nle。
[0157] “极性氨基酸”指具有这样的侧链的亲水性氨基酸，所述侧链在生理pH下是带电的或不带电的，并且具有其中由2个原子共同分享的电子对通过原子之一保持更紧密的键。极性氨基酸一般是亲水性的，意指它们具有由水溶液吸引的侧链的氨基酸。遗传编码的极性氨基酸的例子包括天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸和丝氨酸。非遗传编码的极性氨基酸的例子包括瓜氨酸、高半胱氨酸、N-乙酰赖氨酸和甲硫氨酸亚砜。
[0158] “酸性氨基酸”指具有小于7的侧链pK值的亲水性氨基酸。由于氢离子的丧失，酸性氨基酸在生理pH下一般具有带负电的侧链。遗传编码的酸性氨基酸的例子包括天冬氨酸(天冬氨酸盐)和谷氨酸(谷氨酸盐)。
[0159] “碱性氨基酸”指具有大于7的侧链pK值的亲水性氨基酸。由于水合氢离子的丧失，碱性氨基酸在生理pH下一般具有带正电的侧链。遗传编码的碱性氨基酸的例子包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。非遗传编码的碱性氨基酸的例子包括鸟氨酸、2，3-二氨基丙酸、2，4-二氨基丁酸和高精氨酸。
[0160] “可电离的氨基酸”指在生理pH下可以带电的氨基酸。此类可电离的氨基酸包括酸性和碱性氨基酸，例如D-天冬氨酸、D-谷氨酸、D-组氨酸、D-精氨酸、D-赖氨酸、D-羟赖氨酸、D-鸟氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-组氨酸、L-精氨酸、L-赖氨酸、L-羟赖氨酸或L-鸟氨酸。
[0161] 如本领域技术人员应当理解的，上文分类法不是绝对的。几种氨基酸显示出超过一种的特征性质，并且因此可以包括在超过一种的类别中。例如，酪氨酸具有非极性芳香族环和极性羟基。因此，酪氨酸具有可以被描述为非极性、芳香族和极性的几个特征。然而，非极性环是占优势的并且因此酪氨酸一般被视为非极性的。类似地，除了能够形成二硫键外，半胱氨酸也具有非极性特性。因此，尽管没有严格分类为疏水性或非极性氨基酸，但在许多情况下半胱氨酸可以用于给肽赋予疏水性或非极性。
[0162] 在某些实施方案中，由本发明考虑的极性氨基酸包括，例如，精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、高半胱氨酸、赖氨酸、羟赖氨酸、鸟氨酸、丝氨酸、苏氨酸和结构上相关的氨基酸。在一个实施方案中，极性氨基酸是可电离的氨基酸，例如精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、羟赖氨酸、赖氨酸或鸟氨酸。
[0163] 可以利用的极性或非极性氨基酸残基的例子包括例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸等。
[0164] 本文中的术语“盐”是指羧基盐以及本文所述的的肽或其类似物的氨基形成的酸加成盐。羧基盐可以通过本领域中已知的方法来形成，并且包括无机盐(例如钠盐、钙盐、铵盐、铁盐、锌盐等)以及与有机碱(如与胺(例如三乙醇胺、精氨酸、赖氨酸、哌啶、鲁普卡因等)形成的那些碱)形成的盐。酸性盐包括例如：与矿物酸(例如盐酸或硫酸)形成的盐，以及与有机酸(例如乙酸或草酸)形成的盐。当然，任何所述的盐都必需与本发明所公开的肽具有基本相似的活性。
[0165] 如本文所使用的，定义“功能衍生物”是指这样的衍生物，该衍生物可以根据已知的方法由存在于所述氨基酸部分的侧链上或者存在于N-基团或C-基团上的官能团来制备得到，并且当该衍生物是药学上可接受的时，即，当他们不会破坏所述蛋白质的活性或者不会使包含他们的药物组合物具有毒性时，这些衍生物将被包含在本发明公开的范围内。这些衍生物可以包括例如：游离氨基的羧基和N-酰基衍生物的酯或脂肪族酰胺或者游离羟基的O-酰基，并且这些衍生物可以是与酰基(例如alcanoyl或者芳酰基)形成的。
[0166] “前体”是在人或动物体内可以转化为本文所公开的肽的化合物。
[0167] 本发明公开的肽可以通过任何已知的方法来制备，例如固相合成或者液相合成方法。例如，就固相合成而言，将待合成的肽的C末端相应的氨基酸与载体结合，该载体不溶于有机溶剂，并通过交替反复的反应，其中所述的反应为：使其中其α-氨基和侧链官能团是由合适的保护基团所保护的氨基酸以由C末端至N末端的顺序依次浓缩的反应；以及使与树脂或者所述肽的α-氨基的保护基团结合的氨基酸被释放出来的反应，由此，按照这种方式所述的肽链被延长。根据所用的包含基团的种类，固相合成方法在很大程度上被分为tBoc方法和Fmoc方法。
[0168] 常用的保护基团包括：用于氨基的tBoc(叔丁氧基羰基)，Cl-Z(2-氯苄氧基羰基)，Br-Z(2-溴苄氧基羰基)，Bzl(苄基)，Fmoc(9-芴甲氧基羰基)，Mbh(4，4′-dimethoxydibenzhydryl)，Mtr(4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯磺酰基)，Trt(三苯甲基)，Tos(甲苯磺酰基)，Z(苄氧羰基)以及Cl2-Bzl(2，6-二氯苄基)，用于胍基的NO2(硝基)和Pmc(2，2，5，7，8-五甲基色原烷-6-磺酰基)；以及用于羟基的tBu(叔丁基)。
[0169] 在合成所需的肽之后，应该对该肽进行脱保护反应，并从固相载体上切下来。对于Boc方法而言，这种肽的切除反应可以使用氟化氢或者三氟甲磺酸来进行，而对于Fmoc方法而言，上述肽的切除反应可以使用TFA来进行。
[0170] 然后，对如此得到的肽粗品进行纯化。通过可以达到上述目的的任何一种方法来进行纯化，即，涉及提取、沉淀、色谱、电泳等的任何传统方法。例如，可以使用HPLC(高效液相色谱)。可以使用蛋白质纯化常用的水-乙腈基的溶剂来进行洗脱。
[0171] 本文所述的肽可以以基本纯化的形式来提供，由此使其在需要MNTF活性和/或调节的病理学中作为活性组分而适用于药物组合物中。
[0172] 如本文所使用的，术语“生物活性肽”和“生物活性片段”指依照上文描述的运动神经元分化因子(MNDF)或运动神经元营养因子(MNTF)的肽或多肽，其中MNDF使干细胞分化成运动神经元，和MNTF显示出神经保护、修复和治疗功能。
[0173] 术语“互补的”一般指例如在允许的盐和温度条件下，经由碱基配对的多核苷酸的天然结合。例如，序列“A-G-T”与互补序列“T-C-A”结合。2个单链分子之间的互补性可以是“部分的”，从而使得只有某些核酸结合，或其可以是“完全的”，从而使得总体互补性存在于单链分子之间。核酸分子之间的互补性程度对它们之间的杂交效率和强度具有显著影响。“可杂交的”和“互补的”是这样的术语，其用于指出互补性的足够程度，从而使得足以执行预期作用的结合优选地稳定的结合例如在核酸之间发生。应当理解寡核苷酸无需与其可杂交的靶核酸序列100％互补。
[0174] 术语“组合物”旨在包括含有一种或多种成分的产物。
[0175] 术语“分化的”是相对术语，其中“分化细胞”是比待比较的细胞已沿着发育途径进一步进展的细胞。如本文进一步所使用的，“分化的神经细胞”一般指中枢神经系统(CNS)或外周神经系统(PNS)的部分分化或完全分化的细胞。祖细胞是在发育和分化期间通过一系列细胞分裂产生不同的细胞谱系的母细胞。例如，神经祖细胞被定型为最终将发育成CNS或PNS的完全分化的神经细胞的细胞谱系；然而，此类神经祖细胞可能尚未献身于特定类型，或亚类的神经细胞。神经祖细胞可能变得定型为这样的细胞系，其将分化成特定类型的神经细胞，并且其后产生完全分化的神经细胞。因此，本发明的部分分化的神经细胞可以是具有神经标识的细胞，其已获得定向或定位特性，或已定型为发育成特定种类的神经细胞，但并非完全分化的神经细胞。例如，依照本发明用单独或与成形素(例如RA)组合的MNTF肽处理ES细胞可以产生部分分化的神经细胞或神经祖细胞。
[0177] “饲养细胞”或“饲养物”包括一种类型的细胞，其与另一种类型的细胞共培养，一般用于提供其中第二种类型的细胞可以生长的环境。例如，某些类型的pPS细胞可以由原代小鼠胚胎成纤维细胞、永生化小鼠胚胎成纤维细胞、或由hES细胞分化的人成纤维细胞样细胞得到支持。
[0178] “功能等价物”意指具有基本上类似于例如MLSAFSRYAR结构域的生物活性的肽，及其保守的、同源6-聚体(例如SEQ ID NO：2)、7-聚体、8-聚体、9-聚体或10-聚体衍生物。其包括具有此活性或特征的“片段”、“变体”、“类似物”、“同系物”或“化学衍生物”。MLSAFSRYAR结构域的功能等价物和上述其他随后可以共享或不共享相同的氨基酸序列，并且常规或非常规氨基酸的保守或非保守的氨基酸置换是可能的。
[0179] 如本文所使用的，术语“MLSAFSRYAR，WMLSAFS和FSRYAR结构域”是指本发明所证明的足以使干细胞分化形成运动神经元的多肽结构域，以及能够模仿所述结构域的结构和/或功能的肽和/或分子。其他的结构域示于SEQ ID NO：1-142中。
[0180] 在某些方面中，提供了包含任何序列ID NO：1-142中的氨基酸的肽，及其功能等价物。
[0181] 术语“基因产物”是指由基因转录的RNA分子，或者由基因编码或由所述RNA翻译的多肽。
[0182] “生长环境”是其中目的细胞在合适的条件下可以在体外增殖、分化或成熟的环境。此类条件可以包括例如，其中细胞进行培养的培养基，可以存在的任何生长因子或分化诱导因子，和固体表面或支持结构。
[0183] 如本文所使用的，各种形式的术语“调节剂”和“调节”预期包含特定靶的表达或作用或活性的全部或部分抑制。
[0184] 为了本公开内容的目的，术语“神经祖细胞”或“神经前体细胞”包括可以产生这样的后代的细胞，所述后代是神经元细胞(例如，神经元前体或成熟神经元)或胶质细胞(例如神经胶质前体、成熟星形胶质细胞或成熟少突神经胶质细胞)。细胞一般表达具有神经谱系特征的某些表型标记，并且当在体外单独进行培养时，它们一般不产生其他胚胎胚层的后代。
[0185] “神经元祖细胞”或“神经元前体细胞”包括可以产生这样的后代的细胞，所述后代是成熟神经元并且有时还具有产生胶质细胞的能力。
[0186] “多潜能神经祖细胞群”包括具有产生这样的后代的能力的细胞群，所述后代是神经元细胞，是胶质细胞，并且有时是其他类型的细胞。这个术语不要求群体内的个别细胞具有形成2种类型的后代的能力，尽管可以存在是多潜能神经前体的个别细胞。
[0187] 术语“拟肽”和“模拟物”包括可以基本上具有它们模拟的蛋白质区域相同的结构和功能特征的天然的和合成的化学化合物。
[0188] 具有类似于模板肽的那些的性质的肽类似物可以是非肽药物。“肽模拟物”或“拟肽”包括基于肽的化合物，还包括此类基于非肽的化合物(Fauchere，J. Adv.Drug Res.15：29(1986)；Veber和Freidinger；TINS；392(1985)；和Evans等人，J.Med.Chem.30：1229(1987)；Beeley N.，Trends Biotechnol.Jun；12(6)：213-6(1994)；Kieber-Emmons T，等人；Curr Opin Biotechnol.Aug；8(4)：435-41(1997)。在结构上类似于治疗上有用的肽的肽模拟物可以用于产生等价的或增强的治疗或预后效果。一般而言，拟肽在结构上等同或类似于示例多肽(即，具有生物或药理学功能或活性的多肽)，但还可以具有任选地被选自下述的键替换的一个或多个肽键：例如，-CH2NH-、-CH2S-、-CH2-CH2-、-CH＝CH-(顺式和反式)、-COCH2-、-CH(OH)CH2-和-CH2SO-。模拟物可以完全由天然氨基酸或氨基酸的非天然类似物组成，或者是部分天然的肽氨基酸和部分氨基酸的非天然类似物的嵌合分子。模拟物还可以包含任何量的天然氨基酸的保守置换，只要此类置换同样基本上不改变模拟物活性。
[0189] 如本文所使用的，“预防”是指完全或部分预防，或者改善或控制。
[0190] 如本文所使用的，术语“治疗”是指治疗性处理以及预防的或预防性措施。需要治疗的那些对象包括已经患有所述的紊乱的那些，以及倾向于患有所述的紊乱或者被诊断出所述的紊乱的那些，或者所述的紊乱有待预防的那些。
[0191] 如本文所使用的，关于本文中所述的化合物或组合物的“有效量”是指足以诱导出所需的生物学结果、药物学结果或治疗结果的量。所述的结果可以为疾病、紊乱或病况的迹象、症状或原因的减轻，或者生物系统的任何其他所需的改变。
[0192] 如本文所使用的，“同时地”用于指将MNTF组合物与一种或多种其他治疗剂同时施用，而术语“组合”用于指如果所述的MNTF组合物与一种或多种其他治疗剂如果不同时施用或者以物理组合的方式施用，则为在一定的时间框(他们均可利用，从而起治疗作用)内，“依次”施用。因此，“依次”施用可以允许一种试剂在其他试剂之后的若干分钟(例如1、2、3、4、5、10、15、20、25、30)、大约若干小时、天、星期、月的时间范围内进行施用，前体条件是MNTF与一种或多种其他治疗剂同时以有效量存在。在多种成分施用之间的时间延迟期间会发生变化，这取决于所述成分的精确的性质，成分之间的相互作用，以及这些成分的各自的半衰期。
[0193] 如本文所使用的，术语“肽类似物”是指具有与模板肽相类似的性质的化合物，并且可以为非肽类药物。“肽的模拟物”或者“肽模拟物”包括肽基化合物，还包括所述的非肽基化合物，例如肽类似物。与具有治疗用途的肽结构类似的肽模拟物可用于产生等效的或增强的治疗或预后效果。通常，肽类似物与示范多肽(即，具有生物学或药理学功能或活性的多肽)为结构或功能的模拟物(即，同一性或相似性)，而且还可以具有一个或多个可任选地被其他键替代的肽键，其中所述的其他键选自(例如)：-CH2NH-，-CH2S-，-CH2-CH2-，-CH＝CH-(顺式和反式)，-COCH2-，-CH(OH)CH2-，以及-CH2SO-。所述的模拟物可以完全由天然氨基酸、合成的化学化合物或氨基酸的非天然类似物组成，或者是由部分天然肽氨基酸与部分非天然氨基酸的类似物构成的嵌合分子。所述的模拟物还可以包含任意量的天然氨基酸的保守性置换，只要这种置换同样基本上不改变模拟物活性。
[0194] 如本文所使用的，术语“蛋白质”指经由肽键连接的2个或更多单个氨基酸(无论是不是天然存在的)的任何聚合物，如在下述情况下发生的一样，当与1个氨基酸(或氨基酸残基)的α-碳键合的羧酸基团的羧基碳原子变得和与邻近氨基酸的α-碳键合的氨基的氨基氮原子共价结合时。这些肽键连接，和包含其的原子(即，α-碳原子、羧基碳原子(及其取代氧原子)，和氨基氮原子(及其取代氢原子)形成蛋白质的“多肽主链”。此外，如本文所使用的，术语“蛋白质”应当理解为包括术语“多肽”和“肽”(它们有时可以在本文中互换使用)。类似地，蛋白质片段、类似物、衍生物和变体在本文中可以被称为“蛋白质”，并且除非另有说明应被视为“蛋白质”。术语蛋白质的“片段”指包含少于蛋白质的所有氨基酸残基的多肽。蛋白质的“结构域”也是片段，并且包含通常是赋予活性或功能所需的蛋白质的氨基酸残基。
[0195] 短语“百分比(％)同一性”是指在对比两条或多条序列中所发现的序列相似性的百分比。例如，可以采用任何合适的软件来以电子方式测定百分比同一性。同样地，两条序列(或者任一条序列或者这两条序列的一个或多个部分)之间的“相似性”可以通过将一条序列与第二条序列进行序列比对来测定。
[0196] 组合物或制剂的“药学上可接受的”化合物和其他成分，例如载体、稀释剂或赋形剂是适合于给其受体施用的那些。
[0197] 术语“严格条件”指允许编码目的MNTF肽的多核苷酸之间杂交的条件。严格条件可以由盐浓度、有机溶剂(例如，甲酰胺)的浓度、温度和本领域众所周知的其他条件进行限定。通过减少盐的浓度、增加有机溶剂(例如，甲酰胺)的浓度、或提高杂交温度可以增加严格性。例如，严格盐浓度通常将小于约750mM NaCl和75mM柠檬酸三钠，例如小于约500mM NaCl和50mM柠檬酸三钠，和小于约250mMNaCl和25mM柠檬酸三钠。低严格性杂交可以在不存在有机溶剂例如甲酰胺的情况下获得，而高严格性杂交可以在有机溶剂(例如，至少约35％甲酰胺，最优选地至少约50％甲酰胺)的存在下获得。严格温度条件通常将包括至少约30℃，至少约37℃，和至少约42℃的温度。各种附加参数，例如，杂交时间，去污剂例如十二烷基硫酸钠(SDS)的浓度，以及载体DNA的包括或排除，是本领域技术人员众所周知的。各种水平的严格性通过使这些各种条件根据需要进行组合来完成，并且在本领域的技术内。严格杂交条件还可以由低于靶序列的解链温度(Tm)约5℃-约20℃或25℃中的条件，以及与靶具有精确或接近精确的互补性的探针来限定。如本文所使用的，解链温度是在其下双链核酸分子群体变得半解离成单链的温度。用于计算核酸的Tm的方法是本领域众所周知的(参见，例如，Berger和Kimmel，Methods InEnzymology，第152卷：
Guide To Molecular Cloning Techniques，San Diego(1987)：Academic Press，Inc.和Sambrook等人，MolecularCloning(1989)：A Laboratory Manual，第2版，第1-3卷，Cold SpringHarbor Laboratory)。如由标准参考文献指出的，Tm值的简单估计可以通过下式进行计算：Tm＝81.5+0.41(％G+C)，当核酸在1M NaCl的水溶液中时(参见例如，Anderson和Young，“QuantitativeFilter Hybridization”in Nucleic Acid Hybridization(1985))。
杂合体的解离温度(和因此关于严格杂交的条件)受到各种因素的影响，例如探针的长度和性质(DNA、RNA、碱基组成)和靶的性质(DNA、RNA、碱基组成、存在于溶液中或固定的等)，以及盐和其他组分(例如，甲酰胺、硫酸葡聚糖、聚乙二醇的存在或不存在)的浓度。这些因素的效应是众所周知的并且在本领域的标准参考文献中得到讨论，参见，例如，Sambrook，同上，和Ausubel，同上。一般地，严格杂交条件是在pH 7.0-8.3下小于约1.0M钠离子、一般约0.01-1.0M钠离子的盐浓度，和对于短探针(例如，10-50个核苷酸)至少约30℃和对于长探针(例如，大于50个核苷酸)至少约60℃的温度。如指出的，严格条件还可以通过添加去稳定剂例如甲酰胺来达到，在这种情况下可以使用较低的温度。在本文所述，多核苷酸可以是在中至高严格性的条件下与靶mRNA杂交的多核苷酸，所述条件例如0.03M氯化钠和0.03M柠檬酸钠在约50-约60摄氏度下。
Guide To Molecular Cloning Techniques，San Diego(1987)：Academic Press，Inc.和Sambrook等人，MolecularCloning(1989)：A Laboratory Manual，第2版，第1-3卷，Cold SpringHarbor Laboratory)。如由标准参考文献指出的，Tm值的简单估计可以通过下式进行计算：Tm＝81.5+0.41(％G+C)，当核酸在1M NaCl的水溶液中时(参见例如，Anderson和Young，“QuantitativeFilter Hybridization”in Nucleic Acid Hybridization(1985))。
杂合体的解离温度(和因此关于严格杂交的条件)受到各种因素的影响，例如探针的长度和性质(DNA、RNA、碱基组成)和靶的性质(DNA、RNA、碱基组成、存在于溶液中或固定的等)，以及盐和其他组分(例如，甲酰胺、硫酸葡聚糖、聚乙二醇的存在或不存在)的浓度。这些因素的效应是众所周知的并且在本领域的标准参考文献中得到讨论，参见，例如，Sambrook，同上，和Ausubel，同上。一般地，严格杂交条件是在pH 7.0-8.3下小于约1.0M钠离子、一般约0.01-1.0M钠离子的盐浓度，和对于短探针(例如，10-50个核苷酸)至少约30℃和对于长探针(例如，大于50个核苷酸)至少约60℃的温度。如指出的，严格条件还可以通过添加去稳定剂例如甲酰胺来达到，在这种情况下可以使用较低的温度。在本文所述，多核苷酸可以是在中至高严格性的条件下与靶mRNA杂交的多核苷酸，所述条件例如0.03M氯化钠和0.03M柠檬酸钠在约50-约60摄氏度下。
[0199] 术语“治疗有效量”意指将引发所需应答的受试化合物的量，所述所需应答例如由例如研究者、兽医、医师或其他临床医生寻求的组织、系统、动物或人的生物学或医学应答。
[0200] “治疗”指治疗性处理和预防性或预防措施。需要治疗的那些包括已具有病症的那些以及其中待预防病症的那些。
[0201] 术语“载体”指用于将核酸递送给细胞的质粒、噬菌体、病毒或其他系统(它是天然的或合成的)形式的核酸分子扩增、复制和/或表达媒介物，其中质粒、噬菌体或病毒可以与细菌、酵母、无脊椎动物和/或哺乳动物宿主细胞一起发挥作用。载体可以保持独立于宿主细胞基因组DNA或可以与基因组DNA全部或部分整合。载体一般将包含但不必包含所有必需元件，以便在它与之相容的任何宿主细胞中起作用。“表达载体”是在合适的条件下能够指导外源多核苷酸，例如编码结合结构域融合蛋白的多核苷酸表达的载体。
[0202] 如本文所描述的，术语“同源性和同系物”包括可以是含有与目的蛋白质序列序列同源的氨基酸序列的肽。此类肽一般与相关序列具有至少约70％的同源性，优选地至少约80％、90％、95％、97％或99％的同源性，例如在至少约15、20、30、40、50、100或更多邻接核苷酸(同源序列的)的区域上。
[0203] 同源性可以基于本领域的任何方法进行计算。例如UWGCG Package提供了BESTFIT程序，其可以用于计算同源性(例如以其缺省设置使用)(Devereux等人，Nucleic Acids Research 12，第387-395页(1984))。PILEUP和BLAST算法可以用于计算同源性或排列序列(一般以其缺省设置)，例如，如Altschul S.F.；J Mol Evol 36：290-300(1993)；Altschul，S.F.等人；J Mol Biol 215：403-10(1990)中所述。用于执行BLAST分析的软件是可通过美国国立生物信息中心(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/L)公开获得的。这种算法包括首先通过鉴定查询序列中长度W的短字来鉴定高得分序列对，当与数据库序列中相同长度的字比对时，所述短字匹配或满足某些正值阈值得分T。T被称为邻近字得分阈值(Altschul等人，同上)。这些起始邻近字命中充当种子用于起始搜索以找到包含其的HSPs。字命中沿着每个序列在2个方向上进行延伸直至累积比对得分可以得到增加。关于字命中在每个方向上的延伸在下述情况下停止：累积比对得分与其达到的最大值减少量X；由于一个或多个负得分残基比对的积累，累积得分变成零或以下；或达到任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X决定比对的敏感性和速度。BLAST程序使用字长(W)11、BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff和Henikoff Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：
10915-10919(1992))比对(B)50、期望值(E)10、M＝5、N＝4和2条链的比较作为缺省值。
10915-10919(1992))比对(B)50、期望值(E)10、M＝5、N＝4和2条链的比较作为缺省值。
[0204] BLAST算法执行2个序列之间的相似性的统计分析；参见，例如，Karlin和Altschul Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5787(1993)。由BLAST算法提供的一种相似性测量是最小总和概率(P(N))，其提供了2个核苷酸或氨基酸序列之间的匹配将偶然发生的概率指示。例如，如果在第一个序列的比较中最小总和概率小于约1、以及小于约0.1、0.01或0.001，那么序列被视为与另一个序列类似。
[0205] 同源序列一般通过至少(或通过不超过)约1个、2个、5个、10个、15个或20个或更多突变(它可以是置换、删除或插入)不同于相关序列。这些突变可以在上文提及的任何区域上相对于计算的同源性进行测量。同源序列一般在显著超过背景的水平上与原始序列选择性杂交。选择性杂交一般使用中至高严格性(例如0.03M氯化钠和0.03M柠檬酸钠在约50℃-约60℃下)的条件达到。然而，此类杂交可以在本领域已知的任何合适的条件下进行(参见Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(1989))。例如，如果需要高严格性，那么合适的条件包括0.2xSSC在60℃下。如果需要低严格性，那么合适的条件包括2xSSC在60℃下。
[0206] 术语“重组”指在体外合成或以其他方式处理的多核苷酸(例如，“重组多核苷酸”)，指使用重组多核苷酸在细胞或其他生物系统中生产基因产物的方法，或指由重组多核苷酸编码的多肽(“重组蛋白质”)。因此，“重组”多核苷酸由其生产方法或其结构来限定。关于其生产方法，该过程指重组核酸技术的使用，例如，涉及核苷酸序列中的人为干预，一般为选择或生产。备选地，它可以是通过产生包含2个或更多片段的融合物的序列制备的多核苷酸，所述片段并非天然地彼此邻接。因此，包含了例如通过用任何非天然存在的载体转化细胞制备的产物，如包含使用任何合成寡核苷酸方法衍生的序列的多核苷酸。类似地，“重组”多肽是由重组多核苷酸表达的多肽。
[0207] “重组宿主细胞”是包含载体例如克隆载体或表达载体的细胞，或已通过重组技术在其他方面进行处理以表达目的蛋白质的细胞。
[0208] 治疗的普通方面
[0209] 提供了治疗患有神经元紊乱的受试者的方法，该方法包括向所述的受试者施用运动神经元营养因子(MNTF)肽类似物。
[0210] 如本文所使用的，神经元紊乱可以包括完全地或部分地与功能神经组织的急性、进行性或逐渐性丧失有关的，或者特征在于完全地或部分地功能神经组织的急性、进行性或逐渐丧失的疾病、紊乱或病况。示例性的神经元紊乱可以包括脊髓损伤、神经退行性疾病、中风或者短暂或延长的缺血状况(例如脑缺血)、亨廷顿氏疾病(HD)、帕金森氏疾病(PD)、多发性硬化(MS)、ALS、阿兹海默氏疾病和糖尿病神经病变、脊髓性肌萎缩(SMA)、以及横贯性脊髓炎。
[0211] 此外，示例性的神经退行性疾病还可以包括：亚历山大疾病、阿耳珀疾病、毛细管扩张性共济失调、Batten疾病(也称为Spielmeyer-Vogt-Sjogren-Batten疾病)、牛海绵状脑病(BSE)、卡纳万疾病、科可因氏综合征、皮质基底退化症
(Corticobasaldegeneration)、克-雅二氏疾病(Creutzfeldt-Jakob disease)、HIV相关性痴呆、Kennedy疾病、克拉伯疾病、Lewy小体痴呆、Machado-Joseph疾病(3型脊髓小脑性共济失调(Spinocerebellarataxia))、多系统萎缩、发作性嗜睡病、神经疏螺旋体病、Pelizaeus-Merzbacher疾病、皮克疾病、原发性侧索硬化、朊病毒疾病、Refsum疾病、Sandhoff疾病以及Schilder疾病。
(Corticobasaldegeneration)、克-雅二氏疾病(Creutzfeldt-Jakob disease)、HIV相关性痴呆、Kennedy疾病、克拉伯疾病、Lewy小体痴呆、Machado-Joseph疾病(3型脊髓小脑性共济失调(Spinocerebellarataxia))、多系统萎缩、发作性嗜睡病、神经疏螺旋体病、Pelizaeus-Merzbacher疾病、皮克疾病、原发性侧索硬化、朊病毒疾病、Refsum疾病、Sandhoff疾病以及Schilder疾病。
[0212] “神经退行性疾病”是指与中枢或外周神经系统有关的病况，其中所述的中枢或外周神经系统的特征在于功能神经组织的进行性、渐进性丧失。
[0213] “肌萎缩性侧索硬化”或“ALS”为本领域所理解的术语，并且如本文所使用的，其是指可以影响上运动神经元(脑中的运动神经元)和/或下运动神经元(脊髓中的运动神经元)、并且可以导致运动神经元死亡的进行性神经退化疾病。如本文所使用的，术语“ALS”包括本领域已知的ALS的所有类别，包括，但不限于：典型ALS(通常影响上和下运动神经元)、原发性侧索硬化(PLS，通常只影响上运动神经元)、进行性延髓麻痹(PBP或延髓发作(Bulbar Onset)，一种通常以吞咽、咀嚼和说话困难开始的ALS)、进行性肌萎缩(PMA，通常仅影响下运动神经元)和家族性ALS(遗传型ALS)。
[0214] ALS的示例性临床症状包括：肌无力、肌萎缩(muscle wasting)、肌肉痉挛(muscle cramping)、肌颤搐、模糊或缓慢的口齿、吞咽苦难、吞咽缓慢、运动不协调。ALS的其他示例性临床症状包括可在生物样品中检测的那些，其中所述的生物样品得自患有或疑似患有ALS(例如与正常相比，CD4∶CD8细胞的比例增大；与正常相比，CD14+细胞的数量减少；与正常CD14+细胞相比，CD14+细胞上的HLA-DR的表达增多；与正常细胞相比，活化的单核细胞或巨噬细胞的水平增多；发生巨噬细胞增殖；以及与正常相比，血清IgG和/或IgM减少，其中本文中所用的“正常”是指未受ALS影响的受试者或来自这种未受影响的受试者的细胞)的受试者。因此，“处理”涵盖了取得一种或多种临床症状的减少，这种减少可能具有理想的伴随效果，例如减轻、改善、稳定、逆转、减慢或延迟疾病的进程，延迟和/或甚至预防疾病的发作。
[0215] “多发性硬化”或“MS”是本领域所理解的术语，并且如本文所使用的，其是指导致覆盖神经细胞，特别是脑和脊髓的神经细胞的髓磷脂(myelin)被破坏的进行性神经退化疾病。如本文所使用的，“MS”包括本领域已知的所有类别的MS，包括但不限于：复发缓解型MS(RRMS)(通常表征为在疾病侵袭(也称为恶化、复发或骤发)后的部分或完全恢复)；继发性进行性MS(SPMS)(通常表征为较少复发，并伴有残疾情况增加以及多个症状)，以及原发性进行性MS(PPMS)(通常表征为症状以及残疾的发展，而没有减轻)。
[0216] MS的示例性临床症状包括：疲劳(也称为MS疲乏)、肌肉疲劳、感觉异常、行走和/或平衡问题产生困难、感觉异常(例如麻木、刺痛或“发麻”、疼痛、膀胱功能障碍、肠功能障碍、认知功能改变(包括记忆、注意力、集中、判断和解决问题方面都发生问题)、头晕和眩晕、情绪问题(例如抑郁)、性功能障碍、以及视觉问题)。严重的情况可能涉及部分或完全瘫痪(例如视觉模糊或复视觉、红-绿色盲、单眼失明)。其他症状包括：头疼、听觉损失、瘙痒、癫痫、痉挛、语言和吞咽紊乱、以及颤抖。MS的其他示例性临床症状包括可在生物样品中检测的那些，其中所述的生物样品得自患有或疑似患有MS(例如与正常相比，CD4∶CD8细胞的比例增大；与正常相比，CD14+细胞的数量减少；与正常CD14+细胞相比，CD14+细胞上的HLA-DR的表达增多；与正常细胞相比，活化的单核细胞或巨噬细胞的水平增多；发生巨噬细胞增殖；以及与正常相比，血清IgG和/或IgM减少，其中本文中所用的“正常”是指未受MS影响的受试者或来自这种未受影响的受试者的细胞。因此“处理”包括实现一种或多种临床症状的减少，所述减少可以具有希望的伴随作用，例如减轻、改善、稳定、逆转、减慢或延迟疾病的发展，延迟和/或甚至阻止疾病的发作。
[0217] “阿兹海默氏疾病”或“AD”是本领域所理解的术语，并且如本文所使用的，其是指进行性神经退化疾病，其特征在于痴呆，并且由美国精神病学会(American Psychiatric Association)(在DSM IV中)根据多发性认知缺陷(其包括记忆受损)的发展情况来定义。
[0218] AD的示例性临床症状包括轻度的健忘，包括：对近期事件、活动或熟悉的人的名字或事情发生记忆障碍；难以解答简单的数学问题；难以记忆怎样做简单的工作(例如刷牙或梳理头发)；不能清楚地思考；说、理解、阅读或写都发生困难；以及焦虑或攻击行为，或者趋向于离家出走。
[0219] 如本文所使用的，术语“受试者”可以为脊椎动物，例如哺乳动物，例如人。哺乳动物包括但不限于：家畜、运动动物、啮齿动物、灵长动物和宠物。
[0220] 如本文所使用的，帕金森氏疾病(也称为帕金森病或PD)的特征在于全或部分的中枢神经系统的退行性病况，这种病况通常会削弱患者的运动技巧和语言。帕金森氏疾病属于一种被称为运动紊乱的病况。其特征部分在于肌肉僵直、颤抖、物理运动缓慢(运动徐缓)，极端情况下为物理运动丧失(运动不能)。原发症状是基底核对运动皮质的刺激发生减少的结果，这通常是由于多巴胺的形成和作用不足所导致，其中所述的多巴胺由脑中的多巴胺能神经元所产生。继发症状可以包括高水平的认知功能障碍和细微语言问题。PD为慢性的，且为进行性的。PD为帕金森综合征(一系列相似的症状)的最常见的原因。PD还称为“原发帕金森综合征”或“先天PD”(原因未知)。虽然多数形式的帕金森综合征是先天性的，但是存在这样一些情况，其中一些症状可以由毒性、药品、基因突变、头部损伤或其他医学紊乱所导致。
[0221] 亨廷顿氏疾病(HD)的特征在于常染色体显性神经退化紊乱，其是由于在Huntington(Htt)基因的外显子1中发生CAGE三核苷酸延伸所导致的(E.g.Perutz et al.，Trends Biochem.Sci.1999；24：58-63；and Rubinsztein et al.，J.Med.Genet.1999；
36：265-270)。HD患者可以表征为存在异常的肌体运动、痴呆和精神问题。
36：265-270)。HD患者可以表征为存在异常的肌体运动、痴呆和精神问题。
[0222] 综述
[0223] 来自大鼠肌肉组织的2种运动神经元营养因子(MNTF1和MNTF2)的分离和表征以及衍生自人视网膜母细胞瘤cDNA文库的重组MNTF1-F6基因的随后克隆在美国专利号6,309,877、6,759,389和6,841,531(以及共同未决的美国专利申请序列号10/858,144、
10/858,286、10/858,543和10/858,545)中得到描述；所述所有专利在此整体引入作为参考。MNTF1-F6基因序列编码在本文中如SEQ IDNO：4所示的33个氨基酸的序列。如国际申请号PCT/US2004/038651中所述，发现编码MNTF1多肽的核苷酸序列位于人染色体16q22内，所述专利在此整体引入作为参考。
10/858,286、10/858,543和10/858,545)中得到描述；所述所有专利在此整体引入作为参考。MNTF1-F6基因序列编码在本文中如SEQ IDNO：4所示的33个氨基酸的序列。如国际申请号PCT/US2004/038651中所述，发现编码MNTF1多肽的核苷酸序列位于人染色体16q22内，所述专利在此整体引入作为参考。
[0224] 看起来对于MNTF1的已知生物活性足够的MNTF1-F6分子内的2个重叠结构域得到鉴定。参见，国际申请号PCT/US04/01468或美国专利申请序列号10/541,343，所述专利在此整体引入作为参考。在本文中命名为“WMLSAFS”和“FSRYAR”结构域的这些结构域中的每一个足以刺激运动神经元衍生的细胞系增殖，其方式类似于MNTF1-F6 33-聚体。类似地，“FSRYAR”结构域足以在体内指导经由运动神经元的肌肉靶的选择性神经再支配，其方式类似于MNTF1-F6 33-聚体。此外，“FSRYAR”结构域提供了足以产生抗体的抗原表位，所述抗体识别包含“FSRYAR”序列的任何MNTF肽，包括MNTF1-F6 33-聚体。
[0225] 运动神经元营养因子(MNTF)在人胎儿妊娠期中第9周时在表达中达到峰值(Di，X.等人，Acta Anatomica Sinica 29：86-89，1998)。基于MNTF在发育中的人中的表达，我们推断MNTF可能促进运动神经元的分化和/或存活。为了检查这点，我们确定MNTF是否调节多能胚胎干细胞分化成运动神经元并且是否增强ES细胞衍生的运动神经元的存活。
[0226] 如本文公开的，本发明人已确定ES细胞暴露于RA和MNTF类似物指导这些细胞产生运动神经元。
[0227] 使用方法
[0228] 包括但不限于包含MLSAFSRYAR结构域的那些的MNTF和截短的MNTF分子，所述MLSAFSRYAR结构域在本文中被称为运动神经元分化因子(MDNF)，在本文中被证实诱导干细胞或部分分化的神经元细胞分化成运动神经元。此类试剂提供了用于从干细胞培养物产生和/或分离运动神经元群体的新方法。
[0229] 本发明的方法包括使胚胎干细胞与视黄酸(RA)和运动神经元分化因子(MNDF)接触。在本发明的一个实施方案中，使胚胎干细胞与RA连同运动神经元分化因子接触。备选地，该方法包括使部分分化的神经元细胞与运动神经元分化因子接触。因子以有效产生分化的神经细胞的量提供。这些量可以由技术人员基于已知操作和本文公开的方法容易地确定。
[0230] MNTF1和/或其肽类似物还在体外促进哺乳动物运动神经元的存活。因此，本文所述的技术提供了MNTF肽类似物作为关于神经元细胞培养物的生长因子/补充物的用途，包括通过在体外用有效量的MNTF肽类似物培养干细胞衍生的神经元细胞，用于促进干细胞衍生的神经元细胞系的存活的方法。
[0231] 本发明人也已发现在神经营养因子的存在下培养的神经元存活并产生突起。因此，在另一个实施方案中，本发明的方法包括使干细胞衍生的运动神经元与至少一种MNTF肽类似物接触，例如，在与RA和运动神经元分化因子例如如本文所描述的MNTF肽类似物或备选地音猬(Sonic Hedgehog，Shh)接触后，所述音猬包括Shh激动剂。
[0232] 分化的运动神经元可以例如通过FACS分选进行分离或富集。例如基于GFP的运动神经元标记方法的使用允许表征ES细胞衍生的运动神经元的纯群体。我们已使用这种方案用于从来自胚状体的细胞混合群体中分离细胞的纯运动神经元群体。使用胶原酶和分散酶使胚状体分解成单细胞。这些单细胞随后对于GFP进行FACS分选，因为由HB9启动子控制表达GFP的细胞是群体中真正的运动神经元。
[0233] 因此，本文所述技术的另一个方面涉及通过下述用于分离和/或纯化分化的神经细胞群的方法：(a)获得或产生在运动神经元特异性启动子的控制下表达G增强型绿色荧光蛋白(eGFP)的胚胎干细胞培养物；(b)使胚胎干细胞的培养物与有效产生表达eGFP的分化的神经细胞的量的RA和MNTF接触；(d)检测分化的神经细胞中的eGFP表达；和(f)分离表达eGFP的分化的神经细胞。
[0234] 本发明人已发现由于其促进哺乳动物神经元的存活、生长、增殖和/或维持的能力，MNTF和某些MNTF类似物对于治疗神经元紊乱是有用的。本发明人已进一步发现根据某些实施方案，MNTF肽或MNTF类似物调节不依赖于音猬通路(例如取决于实施方案，部分或完全不依赖)的信号转导通路。同样地，本发明人已发现MNTF肽和MNTF类似物调节某些蛋白激酶通路，包括某些酪氨酸激酶和生长因子受体的表达或活性。得到调节的信号转导或蛋白激酶通路包括例如，音猬非依赖性通路。
[0235] 音猬(Shh)是负责尾部化的(caudalized)神经元腹部化(ventralization)的关键组分，经由其跨膜受体组分patched-smoothened发挥作用。本文呈现的数据显示，在视黄酸的存在下鼠类ES细胞在体外分化成运动神经元方面，MNTF肽有效代替音猬(实施例5)。给这些ES培养物添加MNTF导致成熟运动神经元转录因子(HB9和Islet 1/2)的表达、成熟运动神经元标记胆碱乙酰转移酶(ChAT)的表达、和能够传导动作电位的神经元的产生。数据还显示在smoothened受体信号的特异性抑制剂(环杷明-KAAD)的存在下，MNTF肽能够产生有丝分裂后的成熟运动神经元。尽管不希望被束缚于任何具体理论或机制，但本发明人认为数据显示MNTF通过与Shh或smoothened的下游不同的途径发信号。基于本文呈现的数据，本发明人已进一步确定MNTF肽通过本文描述的信号转导途径发挥作用，以促进哺乳动物神经元的存活、生长、增殖和/或维持。因此，在本发明的另一个方面，施用MNTF因子或MNTF类似物以调节某些信号转导组分的表达或活性。我们的数据进一步证实ES细胞的MNTF处理导致胰岛素受体(IR)的Tyr972和Tyr1162/1163的自磷酸化(实施例5)。这些残基是IR活化的标记。此外，免疫共沉淀研究显示由于对于ES细胞的MNTF处理，特异性SH2结构域与IR(关于PI3激酶的p85亚单位)的结合。实施例5还显示阻断IGF-1R对MNTF产生运动神经元的能力没有影响，但阻断IR消除了这种能力。
[0236] 在某些实施方案中，响应给患者或给靶器官、组织或细胞施用的运动神经元营养因子(MNTF)类似物，胰岛素受体底物蛋白质的表达或活性得到调节。胰岛素受体底物蛋白质(IRS-蛋白质)是胰岛素和IGF起始信号的效应子。它们共享在其N末端附近的PH和PTB结构域，和在其C末端区域中的多个Tyr磷酸化基序。与酪氨酸-磷酸化的IRS-蛋白质结合的蛋白质包括PI3激酶p85、GRB2、SHP2、Nck、Crk和Fyn。IRS-1看起来主要涉及IGF信号和细胞骨架生长。IRS-2看起来是胰岛素信号的重要介质，因为遗传去除导致II型糖尿病。IRS-3主要在脂细胞中表达，并且是PI3激酶的罕有地有效活化剂。IRS-4缺乏在其他IRS-蛋白质中与SHP2结合的酪氨酸残基。
[0237] 在某些实施方案中，响应给患者或给靶器官、组织或细胞施用的运动神经元营养因子(MNTF)类似物，IGF-I、IGF-II或任一的受体的蛋白质表达或活性得到调节。IGF-I和-II通过与胰岛素受体同源的IGF-I受体发信号。IGF-II受体的高亲和力在信号传导中不发挥直接的作用，但调控游离IGF-II的浓度。IGFs涉及骨骼生长，并且对于预防凋亡是必需的。游离IGFs的血清水平通过隔离IGF的IGF结合蛋白质(IGFBPs)的作用保持很低。IGFBPs的过量表达可以诱导凋亡，推测是通过游离IGF的减少；IGFBP水平在某些癌症中也是被改变的。IGF-I受体不象某些其他生长因子受体一样是促有丝分裂的，但其通过胰岛素受体底物(IRS)蛋白质激活PI3激酶途径的能力对于调节细胞存活是非常重要的。
[0238] 在某些实施方案中，响应给患者或给靶器官、组织或细胞施用的运动神经元营养因子(MNTF)类似物，磷脂酰肌醇3-激酶蛋白质的表达或活性得到调节。PI3激酶(磷脂酰肌醇3-激酶)负责PI(4，5)P2的肌醇环的3位的磷酸化，以产生存活信号所需的有效第二信使PI(3，4，5)P3，和胰岛素作用。PI3激酶是由85kDa调节亚单位和110kDa催化亚单位组成的异二聚复合物。生长因子受体的酪氨酸磷酸化产生停泊位点用于结合受体上的p85(通过其SH2结构域)；p85给其带来p110，所述p110随后接近于其在膜上的磷脂底物。PI3激酶还通过Ras，和异三聚的G蛋白质的β：γ亚单位得到激活。PI3激酶可被渥曼青霉素抑制，所述渥曼青霉素是用于研究PI3激酶信号途径的有用工具。
[0239] 在某些实施方案中，响应给患者或给靶器官、组织或细胞施用的运动神经元营养因子(MNTF)类似物，Akt激酶蛋白质的表达或活性得到调节。Akt是PI3激酶通路的主要已知效应子。PIP3的产生导致使Akt上的Thr308磷酸化的PDK1，和使Akt上的Ser473磷酸化的另一种激酶(预期为PDK2)的活化。这些磷酸化另外激活Akt Ser/Thr激酶活性，和针对这些位点中任一的磷酸化状态特异性抗体的使用能意味着Akt活化。Akt的活化可以通过免疫沉淀随后为用放射性标记的ATP使已知底物磷酸化进行直接测量。Akt使Bad上的Ser136磷酸化，导致保护不受凋亡。Akt的其他底物包括GLUT4、心脏PFK2和GSK3，其通过这种磷酸化被灭活。
[0240] 在某些实施方案中，响应给患者或给靶器官、组织或细胞施用的运动神经元营养因子(MNTF)类似物，Bad激酶蛋白质的表达或活性得到调节。Bad或“细胞死亡的Bcl-2拮抗剂”是Bcl-2家族的成员以及生存对死亡的重要调节物。非磷酸化的Bad与Bcl-2和Bcl-XL成为二聚物，中和其抗凋亡活性。PI3激酶途径的活化导致Akt的活化，这使Bad上的ser-136磷酸化。MAP激酶途径使BAD上的ser-112磷酸化，并且近来，已显示PKA使BAD上的Ser-155磷酸化。磷酸化的Bad结合14-3-3蛋白质和可能的其他因子，所述14-3-3蛋白质和因子使Bad与其促凋亡作用隔离。使用对这些位点特异的磷酸化状态特异性抗体的测定法充当细胞存活通路活化的记录。
[0241] 在某些实施方案中，响应给患者或给靶器官、组织或细胞施用的运动神经元营养因子(MNTF)类似物，PI(3，4，5)P3依赖性激酶蛋白质的表达或活性得到调节。PI(3，4，5)P3依赖性激酶1(PDK1)是具有PH结构域并且受PIP3强烈刺激的Ser/Thr激酶。PDK1的最佳表征的底物是Akt，所述Akt通过PDK1上的Thr308进行磷酸化，促成Akt活化。PDK1的2种同种型已得到鉴定。PDK1也被认为在p70 S6激酶的活化中起作用，并且在T细胞活化期间对于从T细胞受体到NFκB信号传导是重要的。
[0242] 在某些实施方案中，响应给患者或给靶器官、组织或细胞施用的运动神经元营养因子(MNTF)类似物，Bax蛋白质的表达或活性得到调节。与Bcl-2共享高度保守的结构域的Bax蛋白质，可以在线粒体的脂双层中形成离子传导通道，这通过将凋亡基因蛋白质释放到细胞溶质内在许多细胞的凋亡通路中起必要作用。Bax为许多涉及凋亡的疾病提供了有趣的治疗靶，所述疾病例如癌症或神经变性病症。
[0243] 在某些实施方案中，响应给患者或给靶器官、组织或细胞施用的运动神经元营养因子(MNTF)类似物，p53基因产物的表达或活性得到调节。p53在所有人癌症的大约一半中是突变的。它的基因产物涉及针对细胞毒性应激的细胞应答，并且连同p19ARF一起诱导p21Cip1的表达，以引起细胞周期停滞。此外，p53能够通过转录和非转录机制诱导凋亡。p53的氨基末端的83个氨基酸包含反式激活结构域，以及涉及转录非依赖性生长抑制的区域。羧基末端区域包含DNA结合结构域，其通过3种磷酸化事件，以及潜在地通过乙酰化得到调节。
[0244] 在某些实施方案中，响应给患者或给靶器官、组织或细胞施用的运动神经元营养因子(MNTF)类似物，一氧化氮合酶蛋白质的表达或活性得到调节。一氧化氮合酶(NOS)是二聚的，含亚铁血红素的酶，其产生一氧化氮，并且包含C末端还原酶和N末端氧合酶结构域。NOS的3个类别包括主要在神经元组织中表达的nNOS/NOS I/NOS1，通过炎症刺激在巨噬细胞和某些其他细胞中可诱导的iNOS/NOS II/NOS2，和组成性表达的NOS的上皮形式的eNOS/NOS III/NOS3。组成性表达的nNOS和eNOS需要Ca2+用于活性，并且通过Ca2+内流进行调节。iNOS不依赖于Ca2+。不同同种型在许多位点上的磷酸化对蛋白质活性具有不同的影响；某些是抑制的和某些是活化的。
[0245] 在某些实施方案中，响应给患者或给靶器官、组织或细胞施用的运动神经元营养因子(MNTF)类似物，糖原合酶激酶3蛋白质的表达或活性得到调节。糖原合酶激酶3(GSK)不同于大多数丝氨酸/苏氨酸激酶的地方在于它在不存在信号传导途径作用的情况下是活性的。存在2种同种型，GSK3α和GSK3β。GSK3的功能是使糖原合酶磷酸化并且从而使其灭活。胰岛素作用刺激PI3激酶通路，导致Akt活化，这使GSK3磷酸化并且使其灭活。糖原合酶随后迅速地去磷酸化并且被活化。其他GSK3底物包括Jun(在抑制位点上)和eIF2B。通过GSK3使Tau磷酸化可能涉及阿尔茨海默氏疾病的发展。针对GSK3上的Akt位点(Ser21)的磷酸化状态特异性抗体适合于代替测定途径的活化状态。
[0246] 在某些实施方案中，响应给患者或给靶器官、组织或细胞施用的运动神经元营养因子(MNTF)类似物，半胱天冬酶蛋白质的表达或活性得到调节。涉及线虫(C.elegans)CED-3死亡蛋白质的半胱氨酸天冬氨酰蛋白酶包含半胱天冬酶家族。所有作为通过蛋白质水解活化的酶原被表达。就其在凋亡中的作用而言，取决于它们是通过受体群集(起始)还是通过线粒体通透性转变(效应)得到活化，可以将半胱天冬酶再分成起始(半胱天冬酶8、9、10)和效应(半胱天冬酶3、6、7)半胱天冬酶。效应半胱天冬酶，最显著地是半胱天冬酶3，切割众多底物以实现与凋亡相关的形态学变化。在半胱天冬酶3的底物中有DFF45/ICAD，其释放DFF的DNA酶亚单位以引起染色质降解，以及凝溶胶蛋白、PAK2、D4GDI(所有这些都涉及细胞骨架组织)、核层纤蛋白和PARP。PARP切割的意义仍不明了，但它是关于半胱天冬酶活化的极佳标记和正在进行的凋亡的推测。
[0247] 在某些实施方案中，响应给患者或给靶器官、组织或细胞施用的运动神经元营养因子(MNTF)类似物，RAS基因产物的表达或活性得到调节。Ras蛋白质是小GTP结合蛋白，其与异三聚的G蛋白质不同，在单个多肽内包含所有GTPase和效应子作用。存在Ras的至少3种同种型，Ki-Ras、Ha-Ras和N-Ras，具有不同的表达模式但相似的信号活性。Ras在羧基末端处进行棕榈酰化和法尼基化，使其锚定在膜上。在静止细胞中，Ras装载GDP，并且在受体的生长受体刺激之后被活化，这将Ras鸟嘌呤核苷酸交换因子召募至膜的平面。交换因子与Ras蛋白质的接近引起GDP的释放，以及其被GTP替换。在其GTP结合形式中，Ras结合几种蛋白质，包括Raf、RalGDS和PI3激酶。Ras的灭活通过GTP水解发生，这极大地受到RasGAP或NF-1这2种已知的Ras GTP酶活化蛋白的促进。通过使裂解物与Raf-1的Ras结合结构域一起温育可以测定Ras活化，所述Raf-1与Ras:GTP选择性结合。
[0248] 干细胞培养
[0249] 胚胎干(ES)细胞是培养的细胞，衍生自能够无限复制的胚泡期胚胎的多能内细胞群。一般而言，ES细胞具有分化成其他细胞的潜能(即，它们是多能的)；因此，它们可以充当新细胞的持续来源。用于在本发明中使用的胚胎干细胞可以得自任何动物，但优选得自哺乳动物(例如，人、驯养动物或商业动物)。在本发明的一个实施方案中，胚胎干细胞是鼠类胚胎干细胞。在另一个实施方案中，胚胎干细胞得自人。
[0250] 用于培养哺乳动物干细胞的合适方法是本领域已知的，例如，如美国专利申请号10/362,437、10/789,266、10/789,308、10/928,805和美国专利号6,833,269中所述，所述专利全部整体引入本文。除非另有明确说明，本文所述的技术可以使用任何脊椎动物物种的干细胞(例如，来自人；以及非人灵长类动物、驯养动物、家畜和其他非人哺乳动物的干细胞)进行实践。在适合于在本发明中使用的干细胞中包括了衍生自在妊娠后形成的组织例如胚泡，或在妊娠期间的任何时候获取的胎儿或胚胎组织的灵长类多能干(pPS)细胞。
非限制性例子是胚胎干细胞或胚胎生殖细胞的原代培养物或建立的系。
非限制性例子是胚胎干细胞或胚胎生殖细胞的原代培养物或建立的系。
[0251] 在某些实施方案中，使用原型“灵长类多能干细胞(pPS细胞)。pPS细胞包括衍生自在受精后任何时候的胚胎前、胚胎或胎儿组织的多能细胞。在合适的条件下，它们能够产生三个胚层(内胚层、中胚层和外胚层)衍生物的几种不同细胞类型的后代。pPS细胞包含各种类型的胚胎细胞，包括如由Thomson等人，Science 282：1145(1998)描述的人胚胎干(hES)细胞；来自其他灵长类动物的胚胎干细胞，例如恒河猴干细胞(Thomson等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA92：7844，(1995))、绒猴干细胞(Thomson等人，Biol.Reprod.55：254(1996)和人胚胎生殖(hEG)细胞(Shamblott等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：
13726(1998)，以及本领域已知的其他类型的多能细胞。包括能够产生所有三个胚层衍生物的后代的灵长类动物起源的任何细胞，不管它们是衍生自胚胎组织、胎儿组织还是其他来源。pPS细胞一般不衍生自恶性来源，并且优选细胞是核型正常的。
13726(1998)，以及本领域已知的其他类型的多能细胞。包括能够产生所有三个胚层衍生物的后代的灵长类动物起源的任何细胞，不管它们是衍生自胚胎组织、胎儿组织还是其他来源。pPS细胞一般不衍生自恶性来源，并且优选细胞是核型正常的。
[0252] 当群体中大比例的干细胞及其衍生物显示未分化细胞的形态特征时，pPS细胞培养物被描述为“未分化的”，当与胚胎或成人起源的分化细胞比较时，所述未分化细胞是显而易见的。未分化的pPS细胞由本领域技术人员容易地识别，并且一般在具有高核/质比和明显核仁的细胞集落的显微镜视野的2个平面中出现。群体内未分化细胞的集落通常由分化的邻近细胞围绕这是常见的。
[0253] 分化的神经细胞
[0254] 用于培养前体、部分分化和完全分化的神经细胞的合适方法是本领域已知的，例如，如美国专利申请号10/362,437、10/789,266、10/789,308、10/928,805和美国专利号6,833,269中所述的，所述专利全部整体引入本文。
[0255] 此外，如本文所使用的，“神经元细胞”或“神经元”是神经系统的传导或神经细胞，其一般由下述组成：包含核和周围细胞质的细胞体(核周体)；几个短的、照射状突起(树突)；以及于终止细枝样分支(终树突)，和可以具有沿着其路线伸出的分支(侧突)的一个长突起(轴突)。神经元的例子包括运动神经元。
[0256] 分化的神经细胞的表征
[0257] 通过已知的细胞和分子操作以及本文公开的测定法和方法可以检测分化成部分或完全分化的神经细胞的ES细胞。例如，可以就神经元标记例如NeuN(神经元标记)和/或特异性运动神经元标记如HB9或ChAT探测细胞培养物。
[0258] 在本发明的另一个实施方案中，如本文所描述的，分化的神经细胞是遗传标记的，因为它表达增强型绿色荧光蛋白(eGFP)。eGFP遗传标记在用于分离和/或纯化分化的神经细胞群的方法中，或在用于监控脊髓再驻的方法中可以是特别有用的。
[0259] 视黄酸
[0260] 视黄酸(RA)或维生素A是被认为是成形素的醛分子。RA是容易获得的；它可以例如得自Sigma Chemical Co.(St.Louis，Mo.)。用终浓度约0.0.001-1μM的RA处理导致干细胞有效分化成神经前体。
[0261] MNTF肽
[0262] 如本领域和本发明的技术人员应当理解的，包含MNTF活性结构域及其肽类似物的序列在体外和体内赋予运动神经元以神经保护、修复和治疗性作用。本文所述的MNTF因子可以合成或重组生产，或从天然细胞中分离。
[0263] 包含本发明的MNTF肽类似物的蛋白质或肽中的氨基酸残基序列在本文中通过使用其常用的三字母命名法或通过其单字母命名法进行命名。这些三字母和单字母命名法的列表可以在教科书例如Biochemistry，第2版，Lehninger，A.，Worth Publishers，New York，N.Y.(1975)中找到。当氨基酸序列横向列出时，氨基末端旨在位于左端，而羧基末端旨在位于右端。
[0264] 技术人员应当理解包含各种MNTF肽类似物的肽的精确化学结构将依许多因素而变。例如，给定多肽可以作为酸性或碱性盐或以中性形式获得，因为在分子中发现可电离的羧基和氨基。因此，为了本发明的目的，保留MNTF1 33聚体肽的生物活性，包含WMLSAFS、FSRYAR或MLSAFSRYAR结构域的任何形式的肽，意欲在本发明的范围内。
[0265] 图25举例说明了依照本发明的MNTF肽的某些优选实施方案。
[0266] MNTF1-F6 33-聚体
[0267] 在美国专利No.6,309,877中，提供了具有以下氨基酸序列的多肽，所述的序列为：LGTFWGDTLN CWMLSAFSRY ARCLAEGHDG PTQ(SEQ IDNO：1)。具有该序列的多肽在本文中被称为MNTF1 33-聚体。
[0268] 包含该序列的重组蛋白质与针对MNTF-1的单克隆抗体反应，维持运动神经元的生存力，增加神经突的长出，减少运动神经元细胞死亡/凋亡，并且支持运动神经元生长和“扩展”到具有延伸的含生长锥轴突的巨大的、活性神经元内。
[0269] MNTF1 33聚体通过用于在下文实施例中使用的固相合成进行合成。这种MNTF-1分子在下文中将被称为“33聚体”。当与低浓度的RA结合使用时，线性33-聚体诱导ES细胞分化成运动神经元。此外，MNTF1诱导的ES细胞分化不受音猬信号转导通路抑制剂的阻断。用MNTF1 33-聚体处理胚状体与胰岛素受体(IR)和/或胰岛素样生长因子受体(IGF-R)的自磷酸化相关，这意味着MNTF通过IR/IGF-R介导的信号转导通路起作用。
[0270] 本发明公开包括MNTF1的肽类似物的用途，其中所述的MNTF1的肽类似物保持了MNTF1的能力，所述的能力为发挥神经保护作用；促进运动神经元的存活、保持和/或修复；或者在某些情况下，使干细胞分化形成运动神经元。通常，用于本文所述用途的MNTF肽类似物的长度为6至33个氨基酸，并且包含与SEQ ID NO：1的氨基酸残基12至18相应的WMLSAFS结构域(SEQ ID NO：3)；或者与SEQ ID NO：1的氨基酸残基17至22相应的FSRYAR结构域(SEQ ID NO：2)。此外，某些实施方案的MNTF肽类似物包括含有所述活性结构域的、SEQ ID NO：1的6至33个连续氨基酸残基片段(SEQ ID NO：2或3)。
[0271] 在备选实施方案中，通过BLAST分析测定，运动神经元营养因子肽类似物的氨基酸序列与SEQ ID NO：4所示的10个连续氨基酸残基的同一性为至少60％，与SEQ ID NO：4所示的10个连续氨基酸残基的同一性为至少70％，与SEQ ID NO：4所示的10个连续氨基酸残基的同一性为至少80％，以及与SEQ ID NO：4所示的10个连续氨基酸残基的同一性为至少90％。
[0272] 为了比较多肽序列与相应的SEQ ID NO：1片段，可以使用可通过美国国立生物信息中心(在万维网上ncbi.nlm.nih.gov处)公开获得的BLAST程序进行序列的总体比对。在进行总体比对前，可以将SEQ IDNO：1提交给GenBank。对于总体比对可以使用由美国国立生物信息中心提供的缺省参数。
[0273] 10-聚体
[0274] 在一个实施方案中，提供了一种具有以下氨基酸序列的肽：MLSAFSRYAR(SEQ ID NO：4)，其与SEQ ID NO：1所示的氨基酸残基13-22相对应。示例性的MNTF片段可以包含WMLSAFS结构域的大部分以及完整的FSRYAR结构域。该片段及其变体保留了MNTF1的能力，所述的能力为发挥神经保护作用；促进运动神经元的存活、保持和/或修复；或者在某些情况下，使干细胞分化形成运动神经元。
[0275] MNTF 10聚体在低至0.01g/ml的浓度时在体外刺激胚胎干细胞分化成运动神经元方面至少与全长MNTF 33聚体一样有效(参见图2)。此外，MNTF 10聚体在增强干细胞衍生的运动神经元的存活方面几乎与MNTF 33聚体一样有效。MNTF-1分子的这个部分在下文中将被称为“10聚体”。
[0276] 6-聚体及类似物
[0277] 在另一实施方案中，提供了具有以下氨基酸序列的肽：FSRYAR(SEQ ID NO：2)，其与SEQ ID NO：1所示的氨基酸残基17-22相对应。该片段及其变体保留了MNTF1的能力，所述的能力为发挥神经保护作用；促进运动神经元(包括干细胞衍生的运动神经元)的存活、保持和/或修复。这一部分MNTF-1分子在下文中被称为“6聚体”。
[0278] 在某些实施方案中，MNTF肽类似物可以包含6-聚体肽的功能类似物的序列。
[0279] 7-聚体
[0280] 在另一实施方案中，提供了具有以下氨基酸序列的肽：WMLSAFS(SEQ ID NO：3)，其与SEQ ID NO：1所示的氨基酸残基12-18相对应。MNTF1的这种7个氨基酸片段与FSRYAR结构域的FS残基交叠。该片段及其变体保留了MNTF1的能力，所述的能力为发挥神经保护作用；促进运动神经元(包括干细胞衍生的运动神经元)的存活、保持和/或修复。这一部分MNTF-1分子在下文中被称为“7聚体”。
[0281] 11-聚体
[0282] 在另一实施方案中，提供了具有以下氨基酸序列的肽：FSRYARCLAE G(SEQ ID NO：5)，其与SEQ ID NO：1所示的氨基酸残基17-27相对应。MNTF1 11-聚体包含FSRYAR结构域。该片段及其变体保留了MNTF1的能力，所述的能力为发挥神经保护作用；促进运动神经元(包括干细胞衍生的运动神经元)的存活、保持和/或修复。这一部分MNTF-1分子在下文中被称为“11聚体”。
[0283] 21-聚体
[0284] 在另一实施方案中，提供了具有以下氨基酸序列的肽：MLSAFSRYARCLAEGHDGPT Q(SEQ ID NO：6)，其与SEQ ID NO：1所示的氨基酸残基13至33相对应。MNTF1 21-聚体包含″WMLSAFS″结构域的大部分以及完整的FSRYAR结构域。该片段及其变体保留了MNTF1的能力，所述的能力为发挥神经保护作用；促进运动神经元(包括干细胞衍生的运动神经元)的存活、保持和/或修复。这一部分MNTF-1分子在下文中被称为“21聚体”。
[0285] MNTF肽类似物
[0286] 应当理解本文所述的技术包括其中一个或多个氨基酸替换为其他氨基酸的肽类似物的使用。在一个优选的备选方案中，运动神经元营养因子肽类似物包含针对SEQ ID NO：1的6-32个连续氨基酸残基的片段的一个或多个保守氨基酸置换。
[0287] MNTF肽类似物可以是MNTF1肽的改变形式，条件当然一般是该肽的必需活性基本上保持不变。如本文所使用的，术语“改变的形式”指已进行处理以改变其天然存在的结构的肽。改变的形式可以通过下述进行制备，例如通过MNTF1肽片段的共价修饰，通过使MNTF1肽片段与不溶性支持基质交联，或通过使MNTF1肽片段与载体蛋白交联。
[0288] MNTF1肽类似物可以是在抗原上与MNTF1肽片段相关的肽片段。在抗原上相关的2种肽显示免疫交叉反应性。例如，针对第一种肽的抗体同样识别第二种肽。
[0289] MNTF1肽类似物可以是包含与异源蛋白附着的MNTF1肽片段的融合蛋白。异源蛋白具有与MNTF1肽片段基本上不相似的氨基酸序列。异源蛋白可以与MNTF1肽片段的N末端或C末端融合。融合蛋白可以包括但不限于，聚-His融合物、MYC-标记的融合物、Ig融合物和酶促融合蛋白例如β-半乳糖苷酶融合物。此类融合蛋白，特别是聚-His融合物可以促进重组MNTF1肽片段的纯化。
[0290] MNTF肽的拟肽也包括在本文所述技术的范围内，并且可以充当药物用于调节神经元细胞的生存力和生长，通过例如阻断包含WMLSAFS、FSRYAR或者SEQ ID NO：1-142中所述的任何其他序列或功能结构域的蛋白质的功能。拟肽在制药工业中通常理解为包括具有与模拟的肽的那些类似性质的非肽药物。拟肽设计的原则和实践是本领域已知的，并且在例如Fauchere J.，Adv.Drug Res.15：29(1986)；和Evans等人，J.Med.Chem.30：1229(1987)中得到描述。
[0291] 具有对于治疗上有用的肽的结构相似性的拟肽可以用于产生等价的治疗或预防效果。一般地，此类拟肽具有任选地被键替换的一个或多个肽键，这可以改变所需性质例如对体内化学破坏的抵抗力。此类键可以包括-CH2NH--、--CH2S--、--CH2--CH2--、--CH＝CH--、--COCH2--、--CH(OH)CH2--和--CH2SO--。拟肽可以显示出增强的药理性质(生物半衰期、吸收率等)，不同的特异性，增加的稳定性，生产经济，减少抗原性等，这使得它们能够作为特别需要的治疗剂使用。
[0292] 基于建模(例如在实验上测定的)肽结构，使用推理性药物设计的已知方法，可以由技术人员进行WMLSAFS、FSRYAR或其他类似结构域模拟物或结合分子的推理性设计。推理性药物设计的目的是生产生物活性多肽或靶化合物的结构类似物。通过制备此类类似物，可以形成药物，所述药物比天然分子更有活性或稳定，具有针对改变的不同敏感性，或可以影响各种其他分子的功能。在一种方法中，将产生关于靶分子或其片段的三维结构。这可以通过x射线晶体学，计算机建模或通过2种方法的组合来完成。
[0293] 制备方法
[0294] 应当理解本发明的MNTF肽组合物可以通过本领域众所周知的方法来制备，包括但不限于，通过固相合成的化学合成和通过HPLC纯化使其不含化学反应的其他产物，或通过在体外翻译系统或在活细胞中表达编码包含本发明的MNTF肽的肽或多肽的核酸序列(例如，DNA序列)生产。优选地组合物的MNTF肽得到分离并进行广泛透析，以去除一种或多种不希望有的小分子量分子，和/或进行冻干以更容易配制到所需媒介物内。应进一步理解在MNTF肽组分中制备的存在的任何另外的氨基酸、突变、化学修饰等，将优选地基本上不干扰MNTF停泊序列的受体识别。
[0295] 对应MNTF1的一种或多种片段的肽或多肽长度一般应为至少6个氨基酸残基，并且可以包含多至约7个、约8个、约9个、约10个、约11个、约12个、约13个、约15个、约20个或约30个残基左右。肽序列可以通过本领域普通技术人员已知的方法进行合成，例如，使用自动化肽合成机器的肽合成，例如可从Applied Biosystems(FosterCity，CA)获得的那些。本文所述技术包括衍生自(SEQ ID NO：1)和(SEQ ID NO：6)的环状肽的合成和使用。
[0296] 通过使靶向氨基酸残基与有机衍生剂反应可以将共价修饰引入肽内，所述有机衍生剂能够与选择的侧链或末端残基反应。使用有机衍生剂的多肽共价修饰是本领域技术人员众所周知的。例如，可以使半胱氨酰残基与α-卤乙酸盐(haloacetates)(和相应的胺)，例如氯乙酸或氯乙酰胺反应，以产生羧甲基或羧氨基甲基(carboxyamidomethyl)衍生物。组氨酰残基可以通过在pH 5.5-7.0下与焦碳酸二乙酯反应，或在pH6下在1M二甲基胂酸钠中与对溴苯酰甲基溴反应进行衍生。赖氨酰和氨基末端残基可以与琥珀酸或其他羧酸酐进行反应。精氨酰残基可以通过与一种或几种常规试剂反应进行修饰，在所述常规试剂中有苯甲酰甲醛、2，3-丁二酮、1，2-环己胺二酮和茚三酮。通过与芳香族重氮化合物或四硝基甲烷反应可以将光谱标记引入酪氨酰残基内；最常见地，使用N-乙酰咪唑(acetylimidizol)和四硝基甲烷以分别形成0-乙酰酪氨酰种类和3-硝基衍生物。羧基侧基(天冬氨酰或谷氨酰)可以通过与碳化二亚胺(R’-N-C-N-R’)反应进行选择性修饰，例如1-环己基-3-(2-吗啉基-(4-乙基)碳化二亚胺或1-乙基-3(4氮鎓4，4-二甲基戊基)碳化二亚胺。此外，通过与铵离子反应将天冬氨酰和谷氨酰残基转变成天冬酰胺酰和谷氨酰胺酰残基。谷氨酰胺酰和天冬酰胺酰残基可以脱去酰胺基为相应的谷氨酰和天冬氨酰残基。其他修饰包括脯氨酸和赖氨酸的羟基化，丝氨酰或苏氨酰残基的羟基的磷酸化，赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的α-氨基的甲基化(T.E.Creighton，1983，Proteins：Structure和Molecule Properties，W.H.Freeman & Co.，San Francisco，第79-86页)，N末端胺的乙酰化，和在某些情况下C末端羧基的酰胺化。
[0297] 本文所述的MNTF肽类似物可以以游离形式或与载体分子(例如蛋白质或固体颗粒，以及与标记物或示踪物(例如生物素或异硫氰酸荧光素)连接的经修饰的肽)连接的形式而用于检测及检测试剂盒中。
[0298] 使MNTF1肽片段与水不溶性支持基质交联可以用本领域众所周知的双功能剂来进行，包括1，1二(重氮乙酰基)2苯乙烷，戊二醛，N-羟基琥珀酰亚胺酯，例如，与4-叠氮水杨酸的酯，同双功能酰亚胺酯，包括二琥珀酰亚胺酯例如3，3’-二巯基二(琥珀酰亚胺基丙酸酯)，和双功能马来酰亚胺例如二-N-马来酰亚胺-1，8-辛烷。双功能剂例如甲基-3-[(对叠氮苯基)二硫代]亚胺丙酯产生在光的存在下能够形成交联的光可激活的中间产物。备选地，可以使用反应性水不溶性基质例如溴化氰活化的碳水化合物用于蛋白质固定化。
[0299] 可以使用本文所述的双功能试剂来进行MNTF1肽片段与第二种蛋白质(包括第二种MNTF1肽片段)的交联。在另一种备选的情况中，存在有插入的间隔物，例如二巯基或二氨基，或者多个氨基酸残基(例如甘氨酸)。所述的间隔物还可以为同源的或异源的双功能交联剂，例如异源双功能交联剂N-(4-羧基-环己基-甲基)-马来酰亚胺。
[0300] 可以通过标准的重组DNA技术制备较长的肽或多肽，例如融合蛋白。例如，编码MNTF1肽片段的DNA片段可以克隆在已包含异源蛋白的商购可得的表达载体中，而结果是在框内与异源蛋白融合的MNTF1肽片段。
[0301] 在某些实施方案中，编码MNTF1肽的核酸和/或本文所述的成分可以用于用于在体外或体内生产肽用于本发明的各种组合物和方法。例如，在某些实施方案中，编码MNTF1肽的核酸是例如重组细胞中的载体的组分。可以表达核酸以生产包含MNTF1肽序列的肽或多肽。肽或多肽可以从细胞中分泌出来，或作为细胞的部分，或在细胞内。
[0302] 化合物的筛选
[0303] 在另一个实施方案中，鉴定了改变MNTF肽或涉及MNTF肽细胞内信号转导途径的蛋白质的表达水平的化合物。在某些实施方案中，这些化合物被靶向用于治疗本文描述的各种神经病症。
[0304] 通过本文描述和本领域已知的使用神经元细胞的后续测试，可以区别神经保护的激动剂和拮抗剂，并且可以评估化合物的功效。
[0305] 基于其在领域公认的动物细胞培养疾病和紊乱模型系统中治疗神经元紊乱的能力，可以进一步区别通过本文描述的筛选操作鉴定的化合物，并且可以评估化合物的功效。
[0306] 在测试化合物和天然提取物文库的许多药物筛选测定法中，需要高通量测定法以便使给定时间段内检查的化合物数目最大。在无细胞系统中进行，例如可以用纯化或部分纯化的蛋白质获得的测定法，作为“初步”筛选通常是优选的，因为它们可以被产生以允许快速发展和相对容易的检测由测试化合物介导的分子靶中的改变。此外，测试化合物的细胞毒性和/或生物利用度的效应在体外系统中一般是可以被忽略的，相反该测定法主要集中于药物对分子靶的影响，如可以在与受体蛋白质的结合亲和力的改变中表现的。
[0307] 因此在另一个方面，提供了鉴定用于促进运动神经元的生长或存活的化合物的方法。在一个实施方案中，该方法包括下述步骤：i)制备包含候选化合物的样品，ii)使细胞与所述样品接触，iii)测定涉及信号转导通路的化合物的表达或活性是否得到调节，和iv)测定样品是否能够促进运动神经元的生长或存活。在某些实施方案中，该方法进一步包括测定包含候选化合物的样品是否在体外或体内刺激胰岛素受体的Tyr972和Tyr1162/1163的自磷酸化。在其他实施方案中，该方法进一步包括测定包含候选化合物的样品是否调控MNTF信号转导途径。在其他实施方案中，该方法进一步包括测定包含候选化合物的样品是否调节选自下述的一种或多种蛋白质的表达或活性：胰岛素受体、IGF-1受体、IGF-2受体、Shh、Akt、Bad(bcl-2的细胞死亡拮抗剂)、PI(3，4，5)P3依赖性激酶1(PDK1)、Bax、p53基因产物、pp60-Src、JAK2、一氧化氮合酶(NOS)、糖原合酶激酶3(GSK)、半胱天冬酶、PI3激酶(磷脂酰肌醇3-激酶)和Ras。在其他实施方案中，该方法进一步包括测定包含候选化合物的样品是否受MNTF类似物的调控，或备选地调控MNTF类似物(例如活性、表达等)。在另一个方面，本发明提供了通过施用由本文描述的筛选操作鉴定的化合物促进运动神经元生长或存活或用于治疗神经元病症的方法。
[0308] 在示例性筛选测定法中，目的化合物在其中一般能够结合MNTF肽的条件下与包括MNTF结合蛋白质(例如，表达MNTF肽受体的细胞)和MNTF肽的混合物接触。随后向混合物中加入包含测试化合物的组合物。受体/MNTF肽复合物的检测和量化提供了用于测定测试化合物在抑制(或加强)受体蛋白质和MNTF肽之间的复合物形成方面的功效的方法。还可以执行对照测定法以提供用于比较的基线，其中向受体蛋白质中添加分离的和纯化的MNTF肽，并且在不存在测试化合物的情况下定量受体/MNTF肽复合物的形成。
[0309] MNTF肽和MNTF肽之间的复合物形成可以通过各种技术进行检测。例如，复合物形成的调节可以使用例如可检测标记的蛋白质例如放射性标记、荧光标记或酶促标记的MNTF肽，通过免疫测定法或通过色谱检测进行定量。对于无细胞测定法，一般将希望使MNTF肽或MNTF肽结合蛋白固定，以促进受体/MNTF肽复合物与未复合形式的蛋白质之一的分离，以及调节测定法的自动化。例如可以提供添加允许蛋白质与基质结合的结构域的融合蛋白。例如，谷胱甘肽-S-转移酶/受体(GST/受体)融合蛋白可以吸附在谷胱甘肽琼脂糖珠(SigmaChemical，St.Louis，Mo.)或谷胱甘肽衍生的微量滴定板上，其随后与MNTF肽例如35
S标记的MNTF肽和测试化合物组合，并且在有助于复合物形成的条件下进行温育，例如在对于盐和pH的生理条件下，尽管略微更严格的条件可以是希望的。温育后，洗涤珠以去除任何未结合的MNTF肽，并且直接地或在受体/猬复合物解离后的上清液中测定基质珠结合的放射性标记(例如，置于闪烁体中的珠)。备选地，复合物可以与珠解离，通过SDS-PAGE凝胶分开，并且使用标准电泳技术定量来自凝胶的在珠中发现的MNTF肽水平。
S标记的MNTF肽和测试化合物组合，并且在有助于复合物形成的条件下进行温育，例如在对于盐和pH的生理条件下，尽管略微更严格的条件可以是希望的。温育后，洗涤珠以去除任何未结合的MNTF肽，并且直接地或在受体/猬复合物解离后的上清液中测定基质珠结合的放射性标记(例如，置于闪烁体中的珠)。备选地，复合物可以与珠解离，通过SDS-PAGE凝胶分开，并且使用标准电泳技术定量来自凝胶的在珠中发现的MNTF肽水平。
[0310] 用于使蛋白质固定在基质上的其他技术也可用于在受试测定法中使用。例如，MNTF肽的可溶性部分可以使用生物素和链霉亲和素的缀合进行固定。例如，使用本领域众所周知的技术(例如，生物素化试剂盒，Pierce Chemicals，Rockford，I11.)生物素化的受体可以从生物素-NHS(N-羟基-琥珀酰亚胺)进行制备，并且固定在链霉亲和素包被的96孔板(Pierce Chemical)的孔中。备选地，与MNTF肽反应但不干扰猬结合的抗体可以衍生至平板的孔，并且受体通过抗体缀合捕获在孔中。如上所述，MNTF肽和测试化合物的制剂在平板的受体呈递孔中进行温育，并且可以定量孔中捕获的受体/猬复合物的量。用于检测此类复合物的示例性方法，除了上文描述的关于GST-固定复合物的那些外，包括使用与MNTF肽反应，或与受体蛋白质反应并且竞争结合MNTF肽的抗体的复合物的免疫检测；以及依赖于与MNTF肽相关的酶促活性检测的酶联测定法。在后者的情况下，酶可以与MNTF肽进行化学缀合或作为含MNTF肽的融合蛋白提供。为了举例说明，MNTF肽可以与碱性磷酸酶进行化学交联或遗传融合，并且复合物中捕获的MNTF肽的量可以使用酶的生色底物例如对硝基磷酸苯酯进行评估。同样地，可以提供包含MNTF肽和谷胱甘肽-S-转移酶的融合蛋白，并且通过使用1-氯-2，4二硝基苯检测GST活性定量复合物形成(Habig等人，J Biol Chem，249：7130(1974))。对于用于定量复合物中捕获的抗体之一的免疫检测，可以使用针对蛋白质的抗体，例如抗MNTF肽抗体。备选地，复合物中待检测的蛋白质可以以融合蛋白的形式“附加表位”，除了MNTF肽或MNTF肽序列外，所述融合蛋白还包括对于其可容易获得抗体的第二种多肽(例如，来自商业来源)。例如，使用针对GST部分的抗体，上文描述的GST融合蛋白也可以用于结合的定量。其他有用的附加表位包括myc-表位(例如，参见Ellison等人，J Biol Chem 266：21150-21157(1991))，其包括来自c-myc的10残基序列，以及pFLAG系统(International Biotechnologies，Inc.)或pEZZ-蛋白A系统(Pharamacia，N.J.)。
[0311] 组合物
[0312] 药物组合物可以包含本发明公开的一种或多种MNTF肽类似物以及药学上可接受的稀释剂和/或载体。合适的载体/稀释剂是本领域公知的，其包括盐水或其他无菌水性介质，任选地包含其他成分，例如缓冲盐和防腐剂，或者糖、淀粉、盐或它们的混合物。
[0313] 包含MNTF肽的组合物可以以适于施用方案和/或患者需要的任何合适的形式提供于应用中。
[0314] 本文所述的技术包括培养基，其可用于建立和繁殖干细胞、神经祖细胞、分化的神经细胞以及干细胞衍生的运动神经元。所述的培养基特别适用于干细胞的分化以及干细胞衍生的运动神经元的长期培养。
[0315] 本发明的细胞培养基理想地补充有成形素和/或生长因子，并且根据需要培养的个别细胞类型进行优化。此类补充和优化在本领域的普通技术内。在某些优选实施方案中，细胞培养基可以补充下述近似水平(或在1个有效数字内)的任何或所有下述成形素和/或生长因子的：0.001-1μM RA，0.001-1μM Shh或Shh激动剂，和/或0.01-250μg/ml的一种或多种MNTF肽类似物。
[0316] 作为任选成分，本发明的药物制剂可以包括药学上可接受的载体、稀释剂、稳定或乳化剂、和本领域可获得的类型的盐。此类物质的例子包括标准盐水溶液例如生理学缓冲盐水溶液和水。在本发明的药物制剂中有用的载体和/或稀释剂的具体非限制性例子包括水和生理学可接受的缓冲盐水溶液，例如磷酸盐缓冲盐水溶液pH 7.0-8.0。合适的药学载体包括但不限于，无菌水，盐溶液(例如林格氏溶液)，醇，聚乙烯二醇，明胶，碳水化合物例如乳糖、直链淀粉或淀粉，硬脂酸镁，滑石，硅酸，粘性石蜡，脂肪酸酯，羟甲基纤维素，聚乙烯吡咯烷酮等。药物制剂可以进行灭菌并且需要时和不与活性化合物有害地反应的助剂混合，所述助剂例如润滑剂、防腐剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂、用于影响渗透压的盐、缓冲剂、着色剂和/或芳香族物质等。需要时它们还可以与其他活性物质例如酶抑制剂组合，以减少代谢性降解。
[0317] 本文提供的化合物可以在药物组合物中进行配制，除了肽外所述药物组合物还可以包括药学上可接受的载体、增稠剂、缓冲剂、防腐剂、表面活性剂、中性或阳离子脂质、脂质复合物、脂质体、渗透增强剂、载体化合物和其他药学上可接受的载体或赋形剂等。
[0318] 药物组合物一般配制用于治疗用途施用。药物组合物还可以包括一种或多种活性成分例如干扰素、抗微生物剂、抗炎剂、麻醉剂等。用于肠胃外施用的制剂可以包括无菌水溶液，所述无菌水溶液还可以包含缓冲剂、脂质体、稀释剂和其他合适的添加剂。包含本文提供的肽的药物组合物可以包括渗透增强剂，以便增强肽的消化递送。穿透增强剂可以分类为属于5个广泛类别之一，即，脂肪酸、胆汁盐、螯合剂、表面活性剂和非表面活性剂(Lee等人，Critical Reviews inTherapeutic Drug Carrier Systems 8，91-192(1991)；Muranishi，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 7，1-33(1990))。
可以包括来自这些广泛类别中的一个或多个的一种或多种渗透增强剂。
可以包括来自这些广泛类别中的一个或多个的一种或多种渗透增强剂。
[0319] 充当渗透增强剂的各种脂肪酸及其衍生物包括例如，油酸、月桂酸、癸酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、二癸酸酯、三癸酸酯、蓖麻油酸酯(recinleate)、甘油单油酸酯(a k.a.1-单油酰基-rac-甘油)、甘油二月桂酸酯、辛酸、花生四烯酸、甘油基1-单癸酸酯、1-十二烷基环庚烷-2-酮、酰基肉毒碱、酰基胆碱、单和双甘油酯及其生理学可接受的盐(即油酸盐、月桂酸盐、癸酸盐、肉豆蔻酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、亚油酸盐等)。Lee等人，CriticalReviews in Therapeutic Drug Carrier Systems第92页(1991)；
Muranishi，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems7，1(1990)；
E1-Hariri等人，J.Pharm.Pharmacol.44，651-654(1992))。
Muranishi，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems7，1(1990)；
E1-Hariri等人，J.Pharm.Pharmacol.44，651-654(1992))。
[0320] 胆汁的生理学作用包括促进脂质和脂溶性维生素的分散和吸收(Brunton，Chapter 38 In：Goodman & Gilman’s The PharmacologicalBasis of Therapeutics，第9版，Hardman等人McGraw-Hill，NewYork，N.Y.，第934-935页(1996))。各种天然胆汁盐及其合成衍生物充当渗透增强剂。因此，术语“胆汁盐”包括胆汁的任何天然组分及其任何合成衍生物。
[0321] 可以使用包含一种或多种渗透增强剂的复合制剂。例如，胆汁盐可以与脂肪酸组合使用以制备复合制剂。螯合剂包括但不限于，乙二胺四乙酸(EDTA)、柠檬酸、水杨酸盐(例如，水杨酸钠、5-甲氧基水杨酸盐和同香兰草盐)、胶原的N-酰基衍生物、月桂醇聚醚和β-二酮的N氨基酰基衍生物(烯胺)[Lee等人，Critical Reviews inTherapeutic Drug Carrier Systems第92页(1991)；Muranishi，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 7，1-33(1990)；Buur等人，J.Control Rel.14，43-51(1990))。螯合剂还具有充当DNA酶抑制剂的另外优点。
[0322] 表面活性剂包括例如月桂硫酸钠、聚氧乙烯-9-月桂醚和聚氧乙烯-20-鲸蜡醚(Lee等人，Critical Reviews in Therapeutic DrugCarrier Systems第92页(1991))；和全氟化合物乳状液，例如FC-43(Takahashi等人，J.Pharm.Phamacol.40，252-257(1988))。非表面活性剂包括例如，未饱和的环状脲、1-烷基-和1-烯基氮杂环-烷酮衍生物(Lee等人，Critical Reviews in Therapeutic DrugCarrier Systems第92页(1991))；和非甾体抗炎剂例如双氯芬酸钠、吲哚美辛和保泰松(Yamashita等人，J.Pharm.Pharmacol.39，
621-626(1987))。
621-626(1987))。
[0323] 一般的药学上可接受的载体包括但不限于，结合剂(例如，预胶化的玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素等)；填充剂(例如，乳糖和其他糖、微晶纤维素、胶质、明胶、硫酸钙、乙基纤维素、聚丙烯酸酯或磷酸氢钙等)；润滑剂(例如，硬脂酸镁、滑石、硅石、二氧化硅胶体、硬脂酸、硬脂酸金属盐、氢化植物油、玉米淀粉、聚乙烯二醇、苯甲酸钠、乙酸钠等)；崩解剂(例如，淀粉、淀粉羟乙酸拿等)；或湿润剂(例如，月桂磷酸钠等)。
[0324] 本文提供的组合物可以另外包含以其领域确定的使用水平的，在药物组合物中通常发现的其他附属组分。因此，例如，组合物可以包含另外的相容性药学活性材料，例如止痒剂、收敛剂、局部麻醉剂或抗炎剂，或可以包含在本发明的组合物的各种剂型物理学配制中有用的另外材料，例如染料、调味剂、防腐剂、抗氧化剂、遮光剂、增稠剂和稳定剂。然而，当添加时此类材料不应不适当地干扰本文提供的组合物组分的生物活性。
[0325] 不管化合物通过其引入患者内的方法，胶态分散系统可以用作递送媒介物，以增强肽的体内稳定性和/或使肽靶向特定器官、组织或细胞类型。胶态分散系统包括但不限于，大分子复合物、纳米胶囊、微球体、珠和基于脂质的系统包括水包油乳状液、微胶粒、混合微胶粒、脂质体和未表征结构的脂质：肽复合物。优选的胶态分散系统是多个脂质体。脂质体是由脂质构成以双层构型排列的，具有由一个或多个外层围绕的水核心的微观球体(一般参见，Chonn等人，Current Op.Biotech.6，698-708(1995))。
[0326] 在某些实施方案中，MNTF肽和MNTF类似物可以掺入生物分布导向部分内，或与生物分布导向部分结合使用，所述生物分布导向部分包括一种或多种聚合物，以指导MNTF肽或MNTF类似物或本文提供的其他化合物的生物分布至所需靶的附近，或允许其持续释放。活性剂包括例如，用于增加治疗功效、用于优化生物分布和生物利用度、用于减少组织损伤、用于促进愈合、或用于增加患者舒适的化合物；示例性活性剂包括血管活性剂、麻醉剂、用于缺血的治疗剂、生长因子和细胞因子。备选地，微颗粒或纳米颗粒聚合珠剂型可以在本文提供的组合物中使用。本文提供的化合物可以与活性剂组合使用，或连同与其附着的许多配体或抗配体分子一起包裹在颗粒剂型中。
[0327] 以这种方式，单独地或与其他活性剂组合的MNTF肽和MNTF类似物以及本文提供的其他化合物随着时间在那个位点处释放，以提供持续的治疗益处。相对于本发明实践中有用的其他活性剂，例如生长因子、细胞因子等，持续释放剂型也是有用的。活性剂从本发明的颗粒剂型中的释放可以由于扩散和颗粒基质腐蚀而发生。生物降解率直接影响活性剂释放动力学。
[0328] 在某些实施方案中，本发明的MNTF肽、MNTF类似物和化合物的控制释放肠胃外制剂可以制备为植入剂、油性注射剂或作为颗粒系统。颗粒系统包括微球体、微粒、微胶囊、纳米胶囊、纳米球和纳米微粒。微胶囊包含治疗蛋白质作为中央核心。在微球体中，治疗剂分散在整个颗粒中。脂质体可以用于控制释放以及诱陷药物的药物靶向。
[0329] 在某些实施方案中，本发明的药物组合物，包括MNTF肽和MNTF类似物可以地方性地、局部地、经鼻、经口、胃肠道、支气管内、膀胱内、阴道内施用到子宫内，皮下、肌内、关节周、关节内施用到脑脊髓液(ICSF)内、脑组织内(例如颅内施用)、脊髓内、创伤内、腹膜内或胸膜内，或全身地，例如静脉内、动脉内、肝门内或直接施用到器官内。
[0330] 如本领域已知的，各种导管和递送途径可以用于达到冠状动脉内递送。例如，适合于在本发明中使用的各种通用导管以及改良导管可从商业供应商例如Advanced Cardiovascular Systems(ACS)、TargetTherapeutics和Cordis获得。同样地，当通过直接注射到冠状动脉内(这是目前最优选的)来完成给心肌的递送时，如本领域已知的，许多方法可用于将导管引入冠状动脉内。作为举例说明，导管可以方便地引入股动脉内并且向后穿过髂动脉和腹主动脉并且进入冠状动脉内。备选地，导管可以首先引入臂或颈动脉内并且向后穿过至冠状动脉。这些和其他技术的详细描述可以在本领域中找到(参见，例如，Topol，E J(编辑)，The Textbook of Interventional Cardiology，第2版(W.B.Saunders Co.1994)；Rutherford，R B，Vascular Surgery， 第 3 版 (W.B.Saunders Co.1989)；Wyngaarden J B等人(编辑)，The Cecil Textbook of Medicine，第19版(W.B.Saunders，
1992)；和Sabiston，D，The Textbook of Surgery，第14版(W.B.SaundersCo.1991))。
1992)；和Sabiston，D，The Textbook of Surgery，第14版(W.B.SaundersCo.1991))。
[0331] 本文提供的化合物可以肠胃外(parentally)施用。有时优选某些化合物与药学上可接受的载体或赋形剂组合，以产生药物组合物。合适的载体和稀释剂包括等渗盐水溶液，例如磷酸盐缓冲盐水。组合物可以配制用于肠胃外、肌内、大脑内、静脉内、皮下或经皮施用。施用的制剂可以包含此类试剂。这些试剂的例子包括阳离子试剂(例如磷酸钙和DEAE-葡聚糖)和lipofectants(例如lipofectamTM和transfectam TM)。
[0332] 用于局部施用的制剂可以包括经皮贴剂、软膏、洗剂、乳膏、凝胶、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体和粉剂。常规药学载体，水、粉末或油基，增稠剂等可能是必需或希望的。包被手套、避孕套等也可能是有用的。用于口部施用的组合物包括粉剂或颗粒剂、在水或非水介质中的悬浮液或溶液、胶囊、囊剂或片剂。增稠剂、调味剂、稀释剂、乳化剂、分散助剂或粘合剂可能是希望的。用于肠胃外施用的组合物可以包括无菌水溶液，其还可以包含缓冲剂、稀释剂和其他合适的添加剂。在某些情况下，用肽与其他常规治疗形式结合治疗患者可能是更有效的，以便增加治疗方案的功效。如本文所使用的，术语“治疗方案”意欲包含治疗、姑息和预防形式。
[0333] 给药剂量可以取决于许多因素，包括待治疗疾病状态的严重度和应答性，并且疗程从数天持续至数月，或直至实现治愈或达到疾病状态减少。本文提供的化合物的毒性和治疗功效可以通过标准药学操作在细胞培养或实验动物中进行确定。例如，为了确定LD50(对50％群体致死的剂量)和ED50(在50％群体中治疗上有效的剂量)。毒性和疗效之间的剂量比是治疗指数，并且它可以表示为比LD50/ED50。显示出大治疗指数的化合物是优选的。尽管可以使用显示出有毒副作用的化合物，但应慎重设计使此类化合物靶向受累组织位点的递送系统，以便使对未感染细胞的潜在损害降到最低，并且从而减少副作用。
[0334] 得自细胞培养测定法和动物研究的数据可以在用于在人中使用的剂量范围配制中使用。此类化合物的剂量优选地位于循环浓度范围内，所述循环浓度范围包括具有很少毒性或没有毒性的ED50。取决于使用的剂型和利用的施用途径，剂量可以在这个范围内变化。对于在本发明的方法中使用的任何化合物，治疗有效剂量可以最初由细胞培养测定法进行评估。剂量可以在动物模型中进行配制，以达到包括如在细胞培养中确定的IC50(即，达到症状的半最大抑制的测试化合物的浓度)的循环血浆浓度范围。此类信息可以用于更精确地确定在人中的有用剂量。在血浆中的水平可以例如通过高效液相层析进行测量。给药方案可以由患者体内的药物蓄积测量进行计算。剂量可以依单个化合物包括MNTF肽和MNTF类似物的相对功效而变，并且一般可以基于发现在体外和体内动物模型中有效的EC50进行评估。本领域技术人员将认识到，优选剂量将以MNTF肽如何和何处施用(例如体外、体内、局部地、全身地等)而变。
[0335] 例如，在一个方面，可以施用MNTF肽和MNTF类似物，以在靶位点处(例如在ES干细胞的细胞培养中)达到终浓度约0.01微克/毫升(μg/ml)-约1mg/ml、约0.1μg/mL-约50μg/mL、约0.1μg/mL-约150μg/mL、约1μg/mL-约200μg/mL、和约0.1μg/mL-约
500μg/mL，包括在这些范围内的任何范围。
500μg/mL，包括在这些范围内的任何范围。
[0336] 取决于施用途径，备选的合适剂量可以例如从约0.1ug到多至约1克的总剂量不同。关于具体剂量和递送方法的指导在文献中提供并且对于本领域从业者一般是可得到的。本领域技术人员将利用对于核苷酸与对于蛋白质或其抑制剂不同的制剂。类似地，本文提供的多核苷酸、多肽和化合物的递送将对具体细胞、条件和位置特异。一般而言，剂量一般为0.01mg/kg-1000mg/kg体重，和更一般地，例如，约0.1mg/kg-300mg/kg体重，并且可以每天、每周、每月或每年给予一次或多次，或甚至在2-20年的时间间隔期间给予一次或多次。在某些实施方案中，剂量可以从手术后紧接着到24小时给予，在另一个实施方案中；剂量从2小时到高达24小时给予。取决于具体制剂的半衰期和清除率，长效组合物可以每
3-4天、每周或每2周进行施用。基于在体液或组织中测量的药物停留时间和浓度，本领域普通技术人员可以容易地估计用于给药的重复率。成功治疗后，可能希望使患者经历维持疗法以预防疾病状态的复发，其中所选化合物以0.01mg/kg-100mg/kg体重的维持剂量施用，每天一次或多次至每20年一次。在某些病状的治疗或预防中，合适的剂量水平一般为约0.001-100mg/kg患者体重/天，其可以以单次或多次剂量施用。合适的剂量水平可以为约1-约40mg/kg/天。在某些实施方案中，本文提供的化合物，包括MNTF肽和MNTF肽类似物以这样的量施用以达到下述体内浓度：在损害位点上约1微摩尔-约1毫摩尔、约10微摩尔-约500微摩尔、或约30微摩尔-约300微摩尔、和约25微摩尔-约300微摩尔终浓度，并且包括在损害位点上约25微摩尔、或约160微摩尔、或约300微摩尔终浓度，并且更一般地约1微摩尔-约100微摩尔。
3-4天、每周或每2周进行施用。基于在体液或组织中测量的药物停留时间和浓度，本领域普通技术人员可以容易地估计用于给药的重复率。成功治疗后，可能希望使患者经历维持疗法以预防疾病状态的复发，其中所选化合物以0.01mg/kg-100mg/kg体重的维持剂量施用，每天一次或多次至每20年一次。在某些病状的治疗或预防中，合适的剂量水平一般为约0.001-100mg/kg患者体重/天，其可以以单次或多次剂量施用。合适的剂量水平可以为约1-约40mg/kg/天。在某些实施方案中，本文提供的化合物，包括MNTF肽和MNTF肽类似物以这样的量施用以达到下述体内浓度：在损害位点上约1微摩尔-约1毫摩尔、约10微摩尔-约500微摩尔、或约30微摩尔-约300微摩尔、和约25微摩尔-约300微摩尔终浓度，并且包括在损害位点上约25微摩尔、或约160微摩尔、或约300微摩尔终浓度，并且更一般地约1微摩尔-约100微摩尔。
[0337] 在某些实施方案中，可以施用1、5、10、20、50、100、150或者200mg/kg的剂量。
[0338] 本文描述的化合物可以在诊断、治疗、预防中、以及作为研究试剂和在试剂盒中使用。用于检测目的化合物(例如MNTF肽和MNTF类似物)的方法供应可以常规地完成。此类供应可以包括酶缀合物、放射性标记或任何其他合适的检测系统。还可以制备用于检测目的化合物存在或不存在的试剂盒。
[0339] 如本文所使用的，脊髓损伤可以包括由肿瘤、机械外伤和化学外伤所导致的损伤。相同或相似的方法被考虑用于恢复患有肌萎缩性侧索硬化、多发性硬化或脊髓损伤的受试者的运动功能。
[0340] 在某些实施方案中，施用一种MNTF类似物还提供了预防功能。这种施用情况具有保护受试者或者处于患有肌萎缩性侧索硬化、多发性硬化或脊髓损伤风险的受试者的运动功能的作用。
[0341] 在某些实施方案中，施用MNTF类似物保护了MNTF通路的完整性。
[0342] 具体而言，用于治疗(在发现症状前或发现症状后)脊髓损伤、神经退行性疾病、中风或脑缺血、亨延顿氏疾病、帕金森氏疾病、多发性硬化、ALS、阿兹海默氏疾病和糖尿病神经病变的方法包括施用选自SEQ ID NO：1-142中的MNTF肽类似物。
[0343] 在某些方面中，提供了多种组合物以及治疗性处理方法，该方法包括在神经通路受到损伤或者是在预计到发生这种损伤时，以足以维持神经通路(包括修复损害的通路或抑制神经通路发生额外的损伤)的浓度向受试者施用治疗有效量的本文所述的MNTF类似物蛋白质，并持续一段时间。
[0344] 在另一方面中，本文所述的技术包括用于保持神经通路的组合物和治疗性处理方法。这种处理方法包括在神经通路受到损伤或者是在预计到发生这种损伤时，向所述的受试者施用刺激治疗有效浓度的内源MNTF的化合物。
[0345] 本文所述的多个方面和多种实施方案提供了用于保护神经元免于受到对神经损伤的肌体免疫和炎性应答有关的组织破坏性作用的方法。
[0346] 在某些实施方案中，提供了用于刺激对损害的神经元和神经通路进行细胞修复(包括损害的树突或轴突的再生)的方法、组合物和装置。
[0347] 在一个方面中，本文所述的MNTF类似物可用于修复外周神经系统中损害的神经通路。特别是，MNTF可用于修复损伤的神经通路，包括横切的神经纤维或者是损伤的神经纤维。具体而言，本文所述的MNTF能够刺激完全轴突神经的再生，包括髓鞘的血管化和再形成。MNTF可以在处于具有生物相容性和生物吸收性的载体(其能够保持MNTF处于损伤位点处)中的情况下而被提供于所述的位点处，并且在必要的情况下，MNTF提供了用于指导轴突由邻近的位点处生长至严重神经元的远端的手段。例如，在神经再生有待于被诱导越过延长的距离(例如大于10mm)的情况下，可能需要用于指导轴突生长的手段。能够提供上述功能的许多载体是可预见的。例如，有用的载体包括基本上不溶的材料，或者按照本文所公开的方法制备的粘性溶液，包括：层粘蛋白，透明质酸或胶原，或者其他合适的、合成的、具有生物相容性的聚合物材料(例如聚乳酸、聚羟基乙酸、聚丁酸和/或它们的共聚物)。
[0348] 在某些实施方案中，将MNTF类似物置于其距离跨越了损害通路的神经导管中。所述的导管起到了保护性覆盖物和用于定向神经突生长的物理手段的作用。可用的导管包括结构可以为管状生物相容性膜，该膜具有足以跨越有待修复的神经间隙的维度，并且具有适于容纳严重神经末梢的开口。所述的膜可以由任何具有生物相容性的无刺激性材料(例如有机硅或生物相容性聚合物，如聚乙烯或聚乙烯-醋酸乙烯)制成。所述的包装物还可以由具有生物相容性和生物吸收性的聚合物构成，其中所述的聚合物包括例如胶原、透明质酸、聚乳酸、聚丁酸和聚羟基乙酸。在一个实施方案中，所述导管的外表面基本上是不可渗透的。
[0349] 在另一方面中，本文所述的MNTF可用于保护对抗损害，该损害与针对神经组织最初的损伤而产生的肌体免疫和炎性应答有关。所述的应答可以发生在神经组织发生外伤(例如通过自体免疫功能紊乱、肿瘤病变、感染、化学或机械外伤、疾病、通过中断血液流入到神经元或神经胶质细胞中，或者通过对神经或周围物质造成的其他外伤所引起)之后。例如，认为在神经血液供应被闭塞之后，由组织缺氧或缺血-再灌注导致的原发性损害(如同在栓塞性中风中)具有免疫相关性。此外，与大量原发性脑肿瘤有关的至少部分损伤还表现出具有免疫相关性。MNTF类似物的应用直接或系统性的减轻和/或抑制了针对神经损伤所产生的免疫相关性应答。
[0350] 在另一实施方案中，本文所述的技术涵盖了本文所述的任何MNTF蛋白质的生物活性种类(系统发生的)变体的用途，其中所述的变体包括但不限于：保守的氨基酸序列变体，由兼并核苷酸序列变体编码的蛋白质，以及共享保守的MNTF结构域的、并且由在标准的严格条件下能够与编码本文所述的MNTF蛋白质的DNA发生杂交的DNA所编码的MNTF蛋白质。
[0351] 本发明的化合物还可以用于研究目的。因此，由肽显示出的特异性杂交可以用于测定法、纯化、细胞产物制备和通过本领域普通技术人员可以理解的其他方法中。
[0352] 除非另有说明，本文使用的技术和科学术语具有本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义。本文参考本领域技术人员已知的各种方法。可以参考的阐述此类已知方法的出版物和其他材料整体引入本文作为参考，如详细阐述一样。阐述重组DNA技术的一般原理的标准参考著作包括Sambrook，J.，等人，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Planview，N.Y.(1989)和Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第3版(Sambrook和Russel，2001)，在本文中共同和单独地称为“Sambrook”；McPherson，M.J.，Ed.，Directed Mutagenesis：APractical Approach，IRL Press，Oxford(1991)；Jones，J.，AminoAcid and Peptide Synthesis，Oxford Science Publications，Oxford(1992)；Austen，B.M.和Westwood，O.M.R.，Protein Targetingand Secretion，IRL Press，Oxford(1991)；OligonucleotideSynthesis(M.J.Gait， 编 辑，1984)；Animal Cell Culture(R.I.Freshney，编 辑，1987)；Handbook of Experimental Immunology(D.M.Weir & C.C.Blackwell，编辑)；Gene Transfer Vectorsfor Mammalian Cells(J.M.Miller & M.P.Calos， 编 辑，1987)；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等人，编辑，1987包括直到2001年的补充)；PCR：The Polymerase ChainReaction，(Mullis 等 人，编 辑，1994)；Current Protocols inImmunology(J.E.Coligan等人，编辑，1991)；The ImmunoassayHandbook(D.Wild，编辑，Stockton Press NY，1994)；BioconjugateTechniques(Greg T.Hermanson，编辑，Academic Press，1996)；
Methods of Immunological Analysis(R.Masseyeff，W.H.Albert和N.A.Staines，编辑，Weinheim：VCH Verlags gesellschaft mbH，1993)，Harlow 和 Lane(1988)Antibodies，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Publications，New York 和 Harlow 和Lane(1999)Using Antibodies：A Laboratory Manual Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(在本文中共同和单独地称为Harlow和Lane)，Beaucage等人编辑，Current Protocols inNucleic Acid Chemistry John Wiley & Sons，Inc.，New York，2000)；和Agrawal，编辑，Protocols for Oligonucleotides and Analogs，Synthesis and Properties Humana Press Inc.，New Jersey，1993)；Teratocarcinomas and embryonic stem cells：A practical approach(E.J.Robertson，编辑，IRL Press Ltd.(1987)；Guide toTechniques in Mouse Development(P.M.Wasserman等人 编辑，Academic Press(1993)；Embryonic Stem Cell Differentiation invitro(M.V.Wiles，Meth.Enzymol.225：900(1993)；Propertiesand uses of Embryonic Stem Cells：
Prospects for Application toHuman Biology and Gene Therapy(P.D.Rathjen等人，Reprod.Fertil.Dev.，10：31(1998))；CNS Regeneration：Basic Scienceand Clinical Advances，M.H.Tuszynski & J.H.Kordower，编辑，Academic Press，(1999)。
Methods of Immunological Analysis(R.Masseyeff，W.H.Albert和N.A.Staines，编辑，Weinheim：VCH Verlags gesellschaft mbH，1993)，Harlow 和 Lane(1988)Antibodies，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Publications，New York 和 Harlow 和Lane(1999)Using Antibodies：A Laboratory Manual Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(在本文中共同和单独地称为Harlow和Lane)，Beaucage等人编辑，Current Protocols inNucleic Acid Chemistry John Wiley & Sons，Inc.，New York，2000)；和Agrawal，编辑，Protocols for Oligonucleotides and Analogs，Synthesis and Properties Humana Press Inc.，New Jersey，1993)；Teratocarcinomas and embryonic stem cells：A practical approach(E.J.Robertson，编辑，IRL Press Ltd.(1987)；Guide toTechniques in Mouse Development(P.M.Wasserman等人 编辑，Academic Press(1993)；Embryonic Stem Cell Differentiation invitro(M.V.Wiles，Meth.Enzymol.225：900(1993)；Propertiesand uses of Embryonic Stem Cells：
Prospects for Application toHuman Biology and Gene Therapy(P.D.Rathjen等人，Reprod.Fertil.Dev.，10：31(1998))；CNS Regeneration：Basic Scienceand Clinical Advances，M.H.Tuszynski & J.H.Kordower，编辑，Academic Press，(1999)。
[0353] 在本发明实践中可能有用的某些技术在各种专利和专利申请中得到描述，包括报道了从脑组织获得多潜能神经干细胞的美国专利号5,851,832，报道了由新生大脑半球生产成神经细胞的美国专利号5,766,948，报道了哺乳动物神经嵴干细胞的使用的美国专利号5,654,183和5,849,553，报道了从哺乳动物多潜能CNS干细胞在体外产生分化的神经元的美国专利号6,040,180，报道了神经上皮干细胞、少突胶质细胞-星形胶质细胞前体、和谱系受限的神经元前体的产生和分离的WO 98/50526和WO 99/01159，和报道了从胚胎前脑获得并用培养基进行培养的神经干细胞的美国专利号5,968,829，所述培养基包含葡萄糖、转铁蛋白、胰岛素、硒、孕酮和几种其他的生长因子。
[0354] 尽管在本发明的执行中可以利用技术人员已知的任何合适的材料和/或方法；然而，本文还是描述了非限制性优选的材料和/或方法。
[0355] 本发明在某些方面可以参考下述实施例进行理解，所述实施例为了举例说明而不是为了限制而提供。除非另有说明，下述实施例中参考的材料、试剂等可从商业来源获得。
[0356] 以下描述的某些实施例包含了下文提供的引用文献：
[0357] Chau RMW，Ren F，Huang W，Jen LS.Muscle neurotrophic factorsspecific for anterior horn motoneurons of rat spinal cord.Recent Advances in Cell.And Mol.Biol.1992，5：89-94.
[0358] Copeland RL Jr，Leggett YA，Kanaan YM，Taylor RE，Tizabi Y.Neuroprotective effects of nicotine against salsolinol-inducedcytotoxicity：implications for Parkinson′s disease.NeurotoxRes.2005 Nov；8(3-4)：289-93.
[0359] KM Biotech.Published PCT Patent Application：WO 98/13492，1998.[0360] Maruyama W，Yi H，Takahashi T，Shimazu S，Ohde H，Yoneda F，Iwasa K，Naoi M.Neuroprotective function ofR-(-)-l-(benzofuran-2-yl)-2-propylaminopentane，[R-(-)-BPAP]，against apoptosis induced by N-methyl(R)salsolinol，anendogenous dopaminergic neurotoxin，in human dopaminergicneuroblastoma SH-SY5Y cells.Life Sci.2004 May21；75(1)：107-17.
[0361] Nussbaum D，Ash D，Jabs E，Brushart T.Mononeuron trophicfactor(MNTF)From Gene to Function.Soc.For Neuroscience，NewOrleans，LA，2003.
[0362] Shavali S，Ren J，Ebadi M.Insulin-like growth factor-1protects human dopaminergic SH-SY5Y cells fromsalsolinol-induced toxicity.Neurosci Lett.2003 Apr10；340(2)：79-82.
[0363] Wang AM，Chau RMW，Chow SP，Zhang ZY，Li ZM.Effects ofmyogenic 22 and 35kD neurotrophic factors on axonal regenerationin free peripheral autografts into rat spinal cord.1995，5(6)：248-252.
[0364] Dubai DB，Zhu H，Yu J，Rau SW，Shughrue PJ，MerchenthalerI，Kindy MS，Wise PM.Estrogen receptor alpha，not beta，is acritical link in estradiol-mediated protection against braininjury.Proc Natl Acad Sci USA.2001，98：1952-1957.[0365] Ellsworth JL，Garcia R，Yu J，Kindy MS.Time window offibroblast growth factor-18-mediated neuroprotection afterocclusion of the middle cerebral artery in rats.J Cereb BloodFlow Metab.2004，24：114-123.
[0366] Ellsworth JL，Garcia R，Yu J，Kindy MS.Fibroblast growthfactor-18 reduced infarct volumes and behavioral deficits aftertransient occlusion of the middle cerebral artery in rats.Stroke.2003，34：1507-1512.
[0367] Gary DS，Bruce-Keller AJ，Kindy MS，Mattson MP.Ischemic andexcitotoxic brain injury is enhanced in mice lacking the p55tumor necrosis factor receptor.J Cereb Blood Flow Metab.1998，18：1283-1287.
[0368] KM Biotech.International Patent WO 98/13492，1998.
[0369] Mattson MP，Zhu H，Yu J，Kindy MS.Presenilin-1 mutationincreases neuronal vulnerability to focal ischemia in vivo andto hypoxia and glucose deprivation in cell culture：involvementof perturbed calcium homeostasis.J Neurosci.2000，20：1358-1364.
[0370] Di X，Huang W.Localization and morphometric study onmotoneuronotrophic factor 1 and its receptor in developingchorionic villi of human placenta.Acta Anatomica Sinica，1998，29：86-89.
[0371] Xinyu D，Weiquan H.Localization and morphometric studyonmotoneuronotrophic factor 1 and its recep tor in developingchorionic villi of human placenta.Acta Anatomica Sinica，1998，29：86-89.
[0372] 如本文所使用的，应该预计到MNTF肽、及其序列和/或功能类似物的效力可以通过与以下实施例中所述的基本相似和/或一致的方案来测定。此外，应该预计到SEQ ID NO：1-142中列出的任何MNTF肽类似物、及其变体的效力可以根据本文所述的实验条件来测定。
[0373] 如本文所使用的，示例性的MNTF肽类似物GM6、GM602、GM603、GM604、MNTF 6聚体都称为含有序列FSRYAR(SEQ ID NO：2)的MNTF 6-聚体。
[0374] 实施例1
[0375] MNTF血脑屏障渗透的测试
[0376] 用于本实施例的缩写/术语。
[0377] “MNTF”是指运动神经元营养因子；或其肽类似物。
[0378] “GM6”和“6聚体”是指MNTF的示例性6个氨基酸的肽类似物，即，FSRYAR(SEQ ID NO：2)。
[0379] “BBB”是指血脑屏障。
[0380] “Genervon”和“GB”是指Genervon Biopharmaceuticals，LLC。
[0381] “I.V.”是指静脉内。
[0382] “抗-6聚体的抗体”是指抗-GM6的抗体。
[0383] “NTS”是指Neurological Testing Service，其为合同研究组织。
[0384] 对运动神经元营养因子(MNTF)的合成的6氨基酸类似物(GM6；FSRYAR)穿过血脑屏障并进入脑的能力进行测试。
[0385] GM6为合成的6个氨基酸肽MNTF的类似物。GM6以固体的形式提供，并且制剂(储存在4℃下的溶液)由NTS来制备。
[0386] 已经在大鼠的多种神经系统中对MNTF进行了测试，其中所述的神经系统包括：外周坐骨神经、外周肌皮神经，头部和面部神经、头部舌下神经以及控制颈部、胸腔和上肢中的肌肉的部分脊髓。在所述的脊髓模型中，将MNTF应用在大鼠的半横切脊髓中的神经移植物上。MNTF减少了炎症、限制了恶化并增强了嫁接神经的再生。许多研究已经证实了当将MNTF或GM6直接应用到神经上时，合成的MNTF或GM6在良好建立的大鼠外周神经模型中对营养和热作用的效力。此外，MNTF已经显示出能够促进运动神经元的再生和存活。
[0387] 此外，选择具有双隐性基因的Wobbler小鼠模型(运动神经元病小鼠模型)作为代用品，来在上述小鼠品系中研究MNTF挽救运动神经元免于发生基因缺陷(该缺陷会导致运动神经元退行性疾病)的能力。在预备实验中，在六周龄时肌肉内给予一剂量的MNTF减缓了运动神经元疾病的发展。在经处理的运动神经元病小鼠中，未经治疗的运动神经元病小鼠的存活由9至12周明显增加至28至63周。
[0388] 对MNTF和GM6在多种动物系统中的作用进行评估。在对超过1000只Sprague Dawley大鼠和15组运动神经元病小鼠及其正常的同窝出生的幼鼠进行的实验中，未鉴定出安全问题。由于具有潜在作用的MNTF起到了神经保护、发炎和神经元再生的作用，所以包含MNTF及其肽类似物的药物组合物被评价为用于治疗神经疾病。治疗中枢神经系统疾病和紊乱的一个主要障碍是难以将药物传递至中枢神经系统中。测定药物的生物利用度和对多种神经紊乱的作用，从而评估药物的治疗潜力。
[0389] 评估通过静脉内注射的gm6对脑的有效性。
[0390] 方法和材料
[0391] 研究设计
[0392] 对C57BL6小鼠注射所示剂量的GM6，并对脑中的GM6进行检测。取出一半脑用于针对GM6的免疫细胞化学分析，并将另一半(脑)冷冻用于ELISA分析。
[0393] 体内方法
[0394] 在实验前和实验过程中，使重量大约为25克的雄性C57BL/6小鼠(Jackson Laboratory)自由进食和进水。在实验前，使动物适应环境，为期1周。将载体或GM6以0.2或2mg/kg的浓度经尾静脉对动物给予静脉内推注给药。通过使用储存在4℃下的100％的盐水溶液重构GM6来配制GM6作为原液。载体对照也包含盐水溶液。
[0395] 免疫组织化学分析
[0396] 将组织切片脱蜡，并在pH 7.4的Tris缓冲盐水(TBS)中洗涤，再在合适的血清(山羊)中封闭。将切片在4℃下封闭过夜，然后在4℃下经历一级抗体(抗6-聚体的抗体)过夜。将切片在TBS中洗涤，然后加入二级抗体，再在室温下温育1小时。在洗涤后，将切片根据VectorABC Elite试剂盒的指导进行温育，并用二氨基联苯胺(DAB)染色。在水中终止反应，并在用二甲苯处理后盖上盖玻片。使用计算机辅助的图像分析系统测定各切片中的免疫细胞化学染色面积，其中所述的计算机辅助图像分析系统由装配有Quick Capture图像采集卡的PowerMacintosh计算机、安装在Olympus显微镜上的Hitachi CCD照相机、以及照相机支架构成。使用NIH Image Analysis Software，v.1.55。获取图像，并在10个切片上测定GM6肽的总面积。由对治疗状态为盲的单个操作者进行所有的测量。
[0397] ELISA分析
[0398] 使用竞争性ELISA试剂盒测定样品中GM6的水平。将处于涂敷缓冲剂中的浓度为10ug/ml的亲和力纯化兔抗-6聚体涂敷在ELISA板上。在所述的检测中，使用1uM(最终稀释度)的6聚体-生物素。将浓度已知的GM6(竞争试剂)用作参照标准品，在所述的测试中，所述标准品的起始浓度为80uM，并对采用2倍稀释法稀释至0.625uM的该标准品进行滴定，以建立标准曲线。根据标准曲线，由OD450的观察结果估测测试样品的浓度。
[0399] 在包含100mM Tris HCl，pH 7.0，包含2％BSA，1M NaCl，4mMEDTA，2％Triton X-100，0.1％叠氮化钠、以及蛋白酶抑制剂(CompleteTM，Mini，Boehringer Mannheim)的细胞裂解缓冲剂中制备脑组织。在相对组织湿重10个体积的缓冲剂中制备匀浆。将所述的匀浆在14,000xg下离心30分钟。将调整的合适体积的所得上清液用于ELISA。
[0400] 对于所述的检测，将抗6聚体pAb在ELISA涂敷缓冲剂中稀释至10ug/ml。使用经稀释的pAb以100ul/孔的量涂敷96孔微孔板。盖上所述的微孔板，并保持冷冻过夜。第二天，用3％的BSA以200ul/孔TBS封闭所述的板，然后在RT下保持60分钟。将板用TBST(TBS+0.05％Tween 20)洗涤3X。对各板，制备10ml 1uM 6聚体-生物素和1ml的标准混合物：1uM 6聚体-生物素与80uM的6聚体。对于各板，通道1和2用于标准曲线。除了A1和A2以外，将1uM 6聚体-生物素(100μl)加入到所有的孔中，而将标准混合物以
200ul/孔的量加入到A1和A2中。通过由各孔中取出100ul的样品、并将其与下一个孔混合-吸管上下抽吸至少8次，从而由孔A1和A2直至孔H1和H2进行2倍系列稀释。将最后孔(H1和H2)中的额外的100ul丢弃。将测试样品(脑匀浆)在Ab稀释缓冲剂中稀释，并以1∶50与1uM的6聚体-生物素混合。在RT下，将所得的板在混合器上以400rpm混合2小时。将得到的样品用TBST洗涤6X。通过在Ab稀释缓冲剂中将链霉亲和素-HRP稀释至1∶2000来制备链霉亲和素-HRP溶液(每板10ml)。在RT下，将板在混合器上再混合1小时。将样品用TBST洗涤8X。以50ul/孔的量加入底物(TMBS，Genetel)，并显色5分钟。使用50ul 1M的HCl终止反应，并立刻读取OD450。
200ul/孔的量加入到A1和A2中。通过由各孔中取出100ul的样品、并将其与下一个孔混合-吸管上下抽吸至少8次，从而由孔A1和A2直至孔H1和H2进行2倍系列稀释。将最后孔(H1和H2)中的额外的100ul丢弃。将测试样品(脑匀浆)在Ab稀释缓冲剂中稀释，并以1∶50与1uM的6聚体-生物素混合。在RT下，将所得的板在混合器上以400rpm混合2小时。将得到的样品用TBST洗涤6X。通过在Ab稀释缓冲剂中将链霉亲和素-HRP稀释至1∶2000来制备链霉亲和素-HRP溶液(每板10ml)。在RT下，将板在混合器上再混合1小时。将样品用TBST洗涤8X。以50ul/孔的量加入底物(TMBS，Genetel)，并显色5分钟。使用50ul 1M的HCl终止反应，并立刻读取OD450。
[0401] 统计分析
[0402] 将结果表示成平均值±标准偏差(SD)。采用t检验分析ELISA和免疫组织数据的差异显著性。
[0403] 所述研究中动物的排除
[0404] 基于以下若干标准从研究中排除动物：
[0405] 在研究结束前(在任何时间点上)死亡的动物；
[0406] 在施用测试制品后形成严重并发症的动物。
[0407] 处理组
[0408] 所有的组都经历GM6或者作为对照。将载体或MNTF以指示的剂量经尾静脉对动物(30只动物)给予静脉内推注给药。
[0409] 表-小鼠BBB模型
[0410]组别 化合物 剂量(mg/kg) 途径
C57BL/6小鼠
1(n＝10只小鼠) 载体 0 IV
2(n＝10只小鼠) GM6 0.2mg/kg IV
3(n＝10只小鼠) GM6 2mg/kg IV
C57BL/6小鼠
1(n＝10只小鼠) 载体 0 IV
2(n＝10只小鼠) GM6 0.2mg/kg IV
3(n＝10只小鼠) GM6 2mg/kg IV
[0411] 结束
[0412] 脑中的GM6
[0413] 将所有的测试组都提供给NTS；将GM6以固体材料的形式提供给NTS。测试组中所有的动物都给予上文指示的剂量。
[0414] 在所述研究结束时，取出1/2的脑以用于针对GM6的免疫细胞化学分析。取出另1/2脑以用于针对GM6的ELISA分析。
[0415] 结果
[0416] 小鼠中的MNTF。血脑屏障研究
[0417] 对GM6在脑中的相对有效性进行评估。数据得自静脉内施用载体或GM6的小鼠(野生型)。
[0418] 免疫细胞化学分析：
[0419] GM6：在施用MNTF后，取出脑，并使用抗-6聚体的抗体对取出的脑进行针对GM6的免疫细胞化学分析。与对照动物相比，在任何动物的组织中都没有检测到免疫反应性。
[0420] ELISA分析：
[0421] 为了使用竞争性ELISA试剂盒测定脑样品中GM6的水平，按照上文所述制备样品，并对其进行ELISA。如图1和表4所示，采用ELISA测试，检测脑中的MNTF GM6。ELISA检测到了脑中内源GM6的基础水平(0.4μM)。在注射有0.2mg/kg GM6的动物中，检测到GM6增长至400％(1.760μM)，而在注射2mg/kg GM6的4小时之后，脑中的GM6增长至3000％(12.92μM)。这些数据表明静脉内注射GM6可以使所述的肽在脑中进行分布。
[0422] 表4.脑中的MNTF(I.V注射)。(示于图1中)
[0423]化合物 小鼠品系 ELISA MNTF(μM) P值(增大)
载体 WT 0.4050±0.3027 0
MNTF 0.2mg/kg WT 1.760±0.9834 0.0001(434％)
MNTF 2mg/kg WT 12.92±4.635 0.0001(3190％)
载体 WT 0.4050±0.3027 0
MNTF 0.2mg/kg WT 1.760±0.9834 0.0001(434％)
MNTF 2mg/kg WT 12.92±4.635 0.0001(3190％)
[0424] 死亡率：在该研究中没发生死亡。
[0425] 根据这些数据，MNTF为这样的营养因子，其能够提供保护从而免于神经疾病，并且可以使神经元组织在受损或移植后再生。在此所进行的研究证明了MNTF(GM6)的6氨基酸类似物以有效且高效的方式穿过血脑屏障的能力。静脉内施用0.2和2mg/kg的单推注剂量的GM6证明脑中的GM6的水平呈剂量依赖方式的增加。这表明，GM6通过静脉内施用能够进入脑，并且可以用于各种疾病模型中，从而确定了其有益效果。
[0426] 当通过静脉内进行施用时，发现GM6在4小时之后存在于脑中。GM6在脑中的水平是剂量依赖方式的，并且表明GM6能够通过静脉内施用的方式进入脑中。
[0427] 实施例2
[0428] 中风：在MCAO模型中用MNTF治疗中风
[0429] 在中脑动脉阻塞(MCAO)的小鼠模型中测试MNTF肽类似物GM602(SEQ ID NO：2，FSRYAR)的效力。为了测定GM602在MCAO小鼠模型中的效力，使小鼠经历1小时的缺血和24小时的再灌注。在开始再灌注之后即刻通过尾静脉以静脉内推注方式对小鼠注射几种剂量的GM602，并检测在脑血流量(CBF)、心率(HR)、血压(BP)、pO2、pCO2、pH、神经缺损(ND)和梗塞体积(IFV)方面的变化。对静脉(IV)内施用的单剂量(1或5mg/kg)GM602检测。施用GM602证明在HR、BP、pO2、pCO2或pH方面无变化。观察到，在再灌注后，施用GM602会使CBF明显高于对照组，表明GM602会帮助减轻由血流阻断所导致的缺血作用。在注射GM602之后，检测在ND和IFV中发生的剂量依赖方式的变化。1mg/kg和5mg/kg的GM602都表现出了明显的免于受到梗塞损伤的保护，这解释了对神经缺损的保护作用。所得的这些数据表明，在MCAO小鼠模型中，GM602在经历IV注射之后对脑具有神经保护作用。
[0430] 用于本实施例的缩写/术语。
[0431] “MNTF”是指运动神经元营养因子。
[0432] “MNTF6聚体”是指MNTF的6个氨基酸的肽类似物，例如FSRYAR。
[0433] “GM602”是指用于中风的MNTF的6个氨基酸的肽类似物。
[0434] “GM602(1)”是指剂量为1mg/kg的GM602。
[0435] “GM602(5)”是指剂量为5mg/kg的GM602。
[0436] “MCAO”是指中脑动脉阻塞。
[0437] “GB”是指Genervon Biopharmaceuticals LLC。
[0438] “IV”是指静脉内。
[0439] “CBF”是指脑血流量。
[0440] “HR”是指心率。
[0441] “BP”是指血压。
[0442] “ND”是指神经缺损。
[0443] “IFV”是指梗塞体积。
[0444] MNTF为通过其功能而发现的、在人染色体上具有特定位置的内源神经营养因子。MNTF对人的神经系统具有高度的特异性，并且在人类胎儿的完整神经系统的形成过程中的妊娠期的三个月中被快速表达，并在第九周时达到峰值(Di and Huang，1998)。MNTF为完全结合非常特异性的受体的神经信号传导分子。如在动物和体外研究中所证明的那样，MNTF的特异性功能为：使胚胎干细胞分化形成运动神经元；使运动神经元得以维持和存活；在其指导下运动轴突的再生；以及目标肌肉和器官的再神经无力(re-enervation)(Chau et al.，1992；Nussbaum et al.，2003)。当中枢神经系统(CNS)和外周神经系统(PNS)处于由疾病、紊乱或损伤所导致的攻击之下时，MNTF针对神经再生和修复形成了保护性和许可的环境，该环境为神经保护性的、抗细胞凋亡的、抗氧化的、抗炎的以及抗创伤的。
[0445] 大量的研究已经证明了MNTF在大鼠的各种神经系统中的效力，其中所述的神经系统包括：外周坐骨神经、外周肌皮神经、头部和面部神经、头部舌下神经以及控制颈部、胸腔和上肢中的肌肉的部分脊髓(Wang et al.，1995)。在半横切的大鼠脊髓模型中，MNTF减少了炎症、限制了恶化并增强了嫁接神经的再生(KM Biotech PCT，1998)。许多研究已经证实了合成的MNTF或MNTF 6聚体(FSRYAR；SEQ ID NO：2)在良好建立的大鼠外周神经模型中在营养和热作用的效力(Nussbaum et al，2003)。此外，MNTF已经显示出促进运动神经元的再生和存活(KM Biotech PCT，1998)。此外，在具有双隐性基因的运动神经元病小鼠(NIH)达到6周龄时给予其一剂量的35ng的MNTF，减慢上述品系小鼠的神经退行性基因疾病(KM Biotech PCT，1998)。
[0446] 将MNTF的一个活性位点的6个氨基酸(FSRYAR)的类似序列作为具有MNTF活性的药物候选物进行研究。由使用了自己建立的检测方法和方案的独立的研究组进行以下的CNS和PNS实验：1.已经显示出MNTF6聚体类似物能够通过IV注射而渗透过血脑屏障并进入到脑中。2.L-2-羟基戊二酸(LGA)诱导了神经系统的氧化应激和细胞凋亡。在斑马鱼生物分析中，MNTF6聚体保护了CNS中的由LGA诱导的细胞凋亡，并将中脑中的细胞凋亡减少了85％。3.在大鼠的坐骨神经断层(具有8mm间隙)的研究中，经MNTF处理的动物中具有呈剂量应答方式的运动神经元再生明显的改善(在最佳剂量下，p＜0.0002)，并促进了DRG神经元的再生。4.在横切的股神经大鼠模型中，在经MNTF6聚体处理的动物中，大量的运动神经元以剂量应答的方式正确投射到肌肉中。在最佳剂量下，正确投射到肌肉中的运动神经元的数量为不正确地投射到皮肤中的运动神经元的数量的3倍(p＜0.0001)。5.在斑马鱼生物分析中，MNTF6聚体保护了PNS中由LGA诱导的细胞凋亡，并将外周肌神经接合点的细胞凋亡减小49％。
[0447] 评估示例性的MNTF肽GM602(FSRYAR；SEQ ID NO：2)，其为运动神经元营养因子的6个氨基酸肽类似物(MNTF6聚体)在保护脑免受急性缺血和再灌注损伤的能力。GM602是在GMP认证下化学合成的(CS BioCo.，Menlo Park，CA，GMP013，lot C811)。在Neurological TestingService，Inc(NTS，Charleston，SC)的合同下进行上述研究。将GM602以固体形式提供给NTS，并且制剂(储存在4℃下的溶液)由NTS来制备。
[0448] 方法和材料
[0449] 在实验前，重量大约为22-25克的动物C57BL/6小鼠(JacksonLaboratory，Bar Harbor，ME)均给予自由进食和进水。使用氟烷来麻醉动物(70％/30％NO2/O2中1％的氟烷，通过面罩麻醉)。通过尾筒装置(tail cuff apparatus)监测平均动脉血压(MABP)，并收集血液样品，从而测定动脉pH水平、以及PaCO2和PaO2。使用Visitech System血压监测仪记录MABP和心率。
[0450] 使用插入到颞肌肌肉中的直肠温度计和热敏探针来监测脑的温度。通过使用带有水套的加热垫，将动物的体温保持在37℃。在缺血前的1小时至缺血后的6小时监测脑的温度，并每隔30分钟记录一次。
[0451] 实验组
[0452] 所有的动物都经历了1.0h的缺血、及其后的24h的再灌注。将动物随机分成载体组(n＝10)，或静脉内注射剂量为1或5mg/kg的GM602的处理组(n＝10)。NTS通过使用储存在4℃下的标准盐水溶液重构GM602来配制GM6(CS Bio Co.，Menlo Park，CA，GMP013，lot C811)作为原液。载体对照接受盐水溶液。在再灌注发生后即刻通过尾静脉进行IV推注。研究人员对于处理组是盲的。
[0453] 缺血的诱导
[0454] 本研究涉及缺血的瞬时模型。对每只小鼠都进行麻醉，并分离出颈外动脉(ECA)和颈总动脉(CCA)。将热敏探针插入到直肠和颞肌肌肉中，从而监测肌体和脑的温度，其中通过外部加热，将所述的温度保持在36-37℃。通过颈部正中切口使左侧颈总动脉(CCA)暴露出来。对甲状腺上动脉和枕动脉进行电凝集并分开。将显微手术夹放置在颈外动脉(ECA)源头的周围。将ECA的远端用6-0丝绑结，并横切。将6-0丝松散地系在ECA残端的周围。移开所述的手术夹，并将5-0尼龙缝合线(涂有有机硅)的经烧边的尖端温和地插入到ECA残端中。将环状的6-0丝系紧在所述残端的周围，并且使尼龙缝合线进入并通过颈外动脉(ICA)中大约13mm(根据体重进行调节)，直至所述的缝合线停留在前大脑动脉(ACA)中，由此阻塞了前交通动脉和中脑动脉。在将尼龙缝合线放置1小时后，其被拉回到ECA中，并封闭切口。
[0455] 组织学检测
[0456] 关于组织学检测，在诱导缺血之后的24小时，采用腹膜内注射戊巴比妥钠(50mg/kg)来麻醉动物。采用穿心灌注(transcardially)的方式，使用4℃的10％的磷酸盐缓冲盐水(PBS)对脑进行灌注。取出所述的脑，并将其在-20℃下冷冻15分钟，然后再放置到啮齿动物脑矩阵中。制备冠状切片(1mm厚)，并将其在37℃下用2％的氯化三苯基四氮唑(TTC)染色。由各脑获得由梗塞的前缘直至尾部范围的7个连续的1mm厚冠状切片，其中所述的梗塞距额极2mm开始。将经TTC染色的切片放置在10％中性的缓冲福尔马林中，并在黑暗状态下，在4℃下保持至少24小时。使用计算机辅助的图像分析系统测定各切片中的梗塞的面积，其中所述的计算机辅助图像分析系统由装配有QuickCapture图像采集卡的Power Macintosh计算机、安装在Olympus显微镜上的Hitachi CCD照相机、以及照相机支架构成。使用NIH ImageAnalysis Software，v.1.55。获取图像，并在7个切片上测定损害的总面积。由对治疗状态为盲的单个操作者进行所有的测量。通过对切片中梗塞体积求和来计算梗塞体积。通过采用以下公式来计算梗塞的尺寸(％)以消除水肿影响：(对侧体积-同侧未损伤的体积)×100/对侧体积。
[0457] 脑血流量的测量
[0458] 通过使用激光多普勒血流仪监测脑血流量(CBF)。CBF值以百分比的形式测定，这是因为由激光多普勒血流仪显示的值并非为绝对值。如上文所述，使用氟烷来麻醉动物(70％/30％NO2/O2中1％的氟烷，通过面罩麻醉)。在与MCA阻塞同侧的脑半球中，坐标如下：点A，前囱点后0.5mm、中线侧部2mm；点B，前囱点后1mm、中线侧部1.2mm；点D，前囱点后1mm、中线侧部1.7mm；点C，在对侧半球中，前囱点后1mm、距中线2mm。在缺血发作前15分钟，在注射测试制品前的缺血过程中(缺血开始之后的15分钟)，以及在注射制品之后的30分钟时(在缺血之前的15分钟至注射所述的化合物结束之后的30分钟进行连续地测定，并且每30分钟记录一次)，对比CBF。将MCA阻塞前的平均值作为基线，此后的数据以基线值的百分比表示。
[0459] 行为评估
[0460] 在缺血损伤之前和之后的小鼠中测定行为分析(神经缺损)。神经学评分如下：0，正常的运动功能；1，当通过尾巴将动物提起来时，躯干和对侧前肢弯曲；2，当通过尾巴将动物按在平面上时，会发生对侧偏转，但在休息时保持正常的姿态；3，在休息时发生对侧倾斜；4，没有自发运动活性。
[0461] 所述研究中动物的排除
[0462] 基于以下若干标准从研究中排除动物：
[0463] 在研究结束前(在任何时间点上)死亡的动物。将至死亡时收集的数据提供给GB；
[0464] 在阻塞后脑血流量没有降低至基线值的20±5％(即，被认为为非缺血情况)，或者在再灌注时血流量没有恢复至基线值的90±15％；
[0465] 在缺血损伤后产生癫痫状行为的动物；
[0466] 在缺血过程中或缺血后片刻，检测到过量出血的动物。
[0467] 统计分析
[0468] 将结果表示成平均值±标准偏差(SD)。采用单因素协方差分析(ANOVA)、再通过Fisher精确检验(Fisher′s post hoc test)来分析生理学和组织学数据中的差异显著性。在监测数据基础上计算重复测量的ANOVA，再通过Fisher精确检验评价多组中的差异显著性。
[0469] 处理组。
[0470] 所有的组都经历GM602或者作为对照。以IV剂量方式给予动物(30只动物)以指示剂量的载体或GM602。
[0471] 小鼠中风模型
[0472]组别 化合物 剂量(mg/kg) 途径
C57BL/6小鼠
1(n＝10只小鼠) 载体 0 IV
2(n＝10只小鼠) GM602 1mg/kg IV
3(n＝10只小鼠) GM602 5mg/kg IV
C57BL/6小鼠
1(n＝10只小鼠) 载体 0 IV
2(n＝10只小鼠) GM602 1mg/kg IV
3(n＝10只小鼠) GM602 5mg/kg IV
[0473] 结束
[0474] GM602在由缺血和再灌注损伤所导致的神经保护方面的作用。
[0475] 针对脑血流量(CBF)、心率(HR)、血压(BP)、pO2、pCO2、pH、神经缺损(ND)和梗塞体积(IFV)来评价动物。
[0476] 将所有的测试组都提供给NTS；将GM602以固体材料的形式提供给NTS。测试组中所有的动物都以上文指示给药。
[0477] 结果
[0478] 小鼠中的缺血(缺血研究)。对上述研究中的缺血的相对严重性进行评估。数据得自患有缺血损伤的小鼠，其中所述的小鼠静脉内注射有载体或GM602。
[0479] 梗塞体积：与载体注射组相比，在GM602处理组(在1mg/kg和5mg/kg下)中，脑中梗塞体积明显减小。GM602显示出使梗塞体积呈剂量依赖性地减小(参见表5)。梗塞体积对GM6的剂量绘制于图2A中。在脑中梗塞体积减小的百分比示于表5中。如表5所示，缺血后，IV施用0、1或5mg/kg的GM602分别显示出57％、39％和12％的梗塞尺寸。对于载体组而言，梗塞体积为73.37mm 3；对于1或5mg/kg的GM602处理组而言，梗塞体积分别为45.93mm 3和20.29mm3。由此，与载体相比，缺血后IV施用1或5mg/kg的GM602使得梗塞体积分别减小38％和73％。
[0480] 表5.脑中梗塞减小的百分比
[0481]组别 剂量 GBID 梗塞的 梗塞尺寸 化合物梗 梗塞体积 P值
化合 尺寸(％) 减小的百 塞体积 减小的百
物 分比 (mm3) 分比
1 0 载体 57％ 0 73.37+4. 0
43
2 1mg GM602 39％ 31.6％ 45.93+3. 38％ 0.0004*
99
3 5mg GM602 12％ 79％ 20.29+2. 73％ 0.0001*
87
化合 尺寸(％) 减小的百 塞体积 减小的百
物 分比 (mm3) 分比
1 0 载体 57％ 0 73.37+4. 0
43
2 1mg GM602 39％ 31.6％ 45.93+3. 38％ 0.0004*
99
3 5mg GM602 12％ 79％ 20.29+2. 73％ 0.0001*
87
[0482] 减小的百分比与各种载体对照动物相比。
[0483] 所有组与对照组相比，p值均＜0.0001。
[0484] 死亡率：在本研究中未发生死亡。
[0485] 生理学参数
[0486] 在使用5mg/kg的GM602(其有助于减轻由阻断血流量所导致的缺血效果)治疗的组中，观察到在再灌注之后脑血流量明显高于载体组，除此以外，在缺血过程中或者是在再灌注之后，在载体小鼠和治疗小鼠之间，生理学参数(平均动脉血压、血液pO2、pCO2和pH)不具有显著性差异，均为基线水平(参见图3-7)。
[0487]化合物 在再灌注之后的CBF 与载体相比的p值
载体 84.9
GM602(1) 89.6 P＜0.07
GM602(5) 91.2 P＜0.003
载体 84.9
GM602(1) 89.6 P＜0.07
GM602(5) 91.2 P＜0.003
[0488] 行为测定
[0489] 基于0至4的分值，针对神经缺损对动物进行评估。使用GM602治疗的动物显示出神经缺损呈剂量依赖方式的减小(数据同样示于图8)。
[0490]化合物 神经缺损 与载体相比的p值
载体 2.7±0.30
GM602(1) 1.8±0.249 P＜0.04
GM602(5) 1.3±0.153 P＜0.0006
载体 2.7±0.30
GM602(1) 1.8±0.249 P＜0.04
GM602(5) 1.3±0.153 P＜0.0006
[0491] 在美国，中风是死亡的第三大原因，并且是造成残疾的主要原因。局灶性脑缺血造成的结果和所形成的梗塞的尺寸可以通过“坏死性”(细胞凋亡)细胞死亡情况以及通过在缺血边缘带中延迟的神经元细胞损失(程序性细胞死亡或细胞凋亡)情况来测定。近期出现的疗法用于治疗缺血性中风。但是，这些治疗方法通常涉及溶解血液凝块，但一旦神经元细胞死亡循环被引发不会发挥神经保护、或者减小行为缺陷或脑梗塞体积的作用。理解影响细胞损伤的基础机理将有助于能够减小与缺血性损伤有关的细胞死亡的药物的设计和应用。
[0492] MNTF为这样的营养因子，其能够提供保护从而免于神经疾病，并可以在发生损伤或缺血性中风后使神经元组织再生。本发明所进行的研究证明了GM602(MNTF的6个氨基酸(FSRYAR)的类似物)以有效且高效的方式保护脑免于受到由脑缺血和再灌注损伤而造成的有害作用的能力。静脉内施用1和5mg/kg单次推注剂量的GM602证明了通过减小梗塞体积、改善行为性质以及增大脑血流量而在脑中产生对抗缺血/再灌注损伤的、呈剂量依赖方式的保护作用。这些研究表明，GM602在中风中具有有利的作用。
[0493] 当将GM602进行静脉内施用时，发现其在小鼠中具有对抗缺血/再灌注损伤的神经保护作用。这些研究奠定了进一步研究的基础，以测定GM602在中风和其他神经退行性紊乱中的有利作用。
[0494] 实施例3
[0495] 脊髓损伤：GM603(示例性MNTF6聚体FSRYAR)在脊髓损伤的小鼠模型中的测试。
[0496] 针对在脊髓损伤(SCI)小鼠模型中的效力对MNTF类似物GM603(SEQ ID NO：2；FSRYAR)进行测试。为了测定GM603在SCI小鼠模型中的效力，使小鼠经历脊髓受损，和14天的恢复。在损伤后即刻向小鼠静脉内注射若干剂量的GM603，并且在14天中的每一天均如此。针对病变体积(LV)和行为恢复(BR)情况来对动物进行测试。对静脉内(i.v.)施用多剂量的GM603(1或5mg/kg)的情况进行测试。施用GM603证实了LV和BR方面的变化，其显示出剂量依赖方式的效果。1和5mg/kg的GM603显示出病变体积明显减小，这解释了对神经缺损的保护作用。这些数据证明，在对SCI小鼠模型i.v.注射GM603之后，其在脊髓中具有神经保护作用。
[0497] 用于本实施例的缩写/术语。
[0498] “MNTF”是指运动神经元营养因子。
[0499] “MNTF6聚体”是指MNTF的6个氨基酸的肽类似物。
[0500] “GM603”是指用于SCI的MNTF的6个氨基酸的肽类似物(FSRYAR)。
[0501] “GM603-1”是指剂量为1mg/kg的GM603；SEQ ID NO：2，FSRYAR。
[0502] “GM603-5”是指剂量为5mg/kg的GM603。
[0503] “SCI”是指脊髓损伤。
[0504] “GB”是指Genervon Biopharmaceuticals，LLC。
[0505] “I.V.”是指静脉内。
[0506] “BR”是指行为恢复。
[0507] MNTF6聚体是相对小型的，其不具有大型肽在稳定性、溶解性、诱变性、免疫原性、或者转基因或重组方法的高制造成本方面的缺点。固相合成6aa的成本是相对低的。
[0508] 在中脑动脉阻塞(MOAC)的小鼠中风模型中，通过IV注射MNTF6聚体的后期治疗减小了脑中梗塞体积并以剂量应答的方式减轻了神经缺损。与载体相比，高剂量的MNTF6聚体将脑中梗塞体积减小了74％，并且显著地减轻了神经缺损(p＜0.0001)，表明MNTF6聚体在中风方面具有有利的作用。
[0509] L-2-羟基戊二酸(LGA)诱导了神经系统中的氧化应激和细胞凋亡。在斑马鱼生物分析中，MNTF6聚体保护了CNS中由LGA诱导的细胞凋亡，并将中脑中的细胞凋亡减少85％(Parng et al，2004)。
[0510] 在具有8mm间隙的大鼠坐骨神经横切研究中，经MNTF6聚体治疗的动物以剂量应答的方式明显地改善了运动神经元的再生(p＜0.0002，在最佳剂量下)，并促进了DRG神经元的再生(Nussbaum et al，2003)。
[0511] 在经横切的股神经大鼠模型中，在经MNTF 6聚体治疗的动物中，正确透射到肌肉中的运动神经元的数量呈现剂量应答的方式。在最佳剂量下，正确透射到肌肉中的运动神经元的数量是非正确地透射到皮肤中的运动神经元的数量的3倍(p＜0.0001)(Nussbaum et al，2003)。
[0512] 在斑马鱼生物分析中，MNTF 6聚体保护了PNS中由LGA诱导的细胞凋亡，并使外周肌神经接合点的细胞凋亡减少49％(Parng et al，2004)。
[0513] 测定了GB GM603(其为运动神经元营养因子(MNTF 6聚体)的6个氨基酸的肽类似物(FSRYAR；SEQ ID NO：2))通过静脉内推注来保护脊髓免于受到损害或损伤的能力(Tyor et al.，2002；Engesser-Cesaret al.，2005)。GM603是在GMP认证下化学合成的(CS Bio Co.，MenloPark，CA，GMP013，lot C811)。在Neurological Testing Service，Inc(NTS，Charleston，SC)的合同下进行上述研究。将GM603以固体形式提供给NTS，并且制剂(储存在4℃下的溶液)由NTS来制备。
[0514] 方法和材料
[0515] 动物
[0516] 在实验前，每只重量大约为22-25克的C57BL/6小鼠(JacksonLaboratory，Bar Harbor，ME)均自由进食和进水。使用良好表征的气动冲击装置，使刚成熟的雌性小鼠(25gm)接受脊髓挫伤。
[0517] 实验组
[0518] 在实施外科手术前，根据随机分组设计方案，将小鼠分配到不同的处理组中，使得在任何给定的手术当天，所有的治疗都被包括在内。研究者对于处理组是盲的。NTS通过使用储存在4℃下的％盐水溶液重构GM603来配制GM603(CS Bio Co.，Menlo Park，CA，GMP013，lotC811)作为原液。载体对照含有盐水溶液。在再灌注发生后即刻通过尾静脉进行IV推注。
[0519] 脊髓损伤的诱导
[0520] 在对第10个胸椎关节(T10)进行椎板切除术之前，使用克他命(80mg/kg)和甲苯噻嗪(10mg/kg)来麻醉小鼠。使用直角夹具在上胸椎(T8和腰胸椎(T11)处将脊柱夹稳，并将直径为2mm的铜针通过空气作用推进到叠置在背部脊髓上方的、暴露且完整的硬脑脊膜上。立刻除去气动冲击装置，并用盐水冲洗伤口，再将肌肉和皮肤开口缝合在一起。
[0521] 处理
[0522] 就化合物的应用而言，每天i.v.注射GM603，并持续2周。在损伤后即刻施用2种不同剂量(1mg/kg和5mg/kg)的GM603。由于雌性动物发生了与损伤有关的瘫痪并且易于排空膀胱，所以使用这种动物。
[0523] 行为分析：旋转棒测试和旷场测试
[0524] 就行为分析而言，在实施手术前，以及在手术后的第1、3、5、7和14天对动物进行测试。将动物在旷场室(直径为120cm，壁高为25cm)中放置4分钟，以确保所有的受试者都获得了Basso，Beattie和Bresnahan(BBB)运动评分表中的最大分值21。将小鼠在旷场中放置4分钟，并录像以用于评分。此外，测试小鼠保持在旋转棒上的能力。就旋转棒测试而言，使小鼠经历1周的学习时间，其后，它们能够在加速的旋转棒上表演。在第1、3、5、7和14天进行测试，测试小鼠，直到它们在三次连续的尝试中不能在旋转棒上保持10秒钟以上为止，将这种情况确定为旋转棒失败。将最长的时间设定为90秒。记录处理组的分值，并将平均分绘制为损伤后时间的函数。
[0525] 组织学
[0526] 在上述研究结束时，处死动物，并将脊髓固定于4％的多聚甲醛中。就分析而言，将20μm的冷冻切片用铬花青(EC)染色，以区分白质和细胞体，从而计算出穿过病变位点处的剩余组织的量。对所述的组织进行免疫细胞化学分析。由穿过损伤T10节段的10个均匀间隔的部分，通过计算图像分析来测定组织受量(tissue sparing)。坏死组织的体积除以横穿部分的总体积，由此被转换为百分比，然后再从100％中减去该百分比。
[0527] 所述研究中动物的排除
[0528] 基于以下若干标准从研究中排除动物：
[0529] 在研究结束前(在任何时间点上)死亡的动物。将至死亡时收集的数据提供给GB；
[0530] 在缺血损伤后发生癫痫状行为的动物；
[0531] 在损伤过程中或损伤后片刻，检测到过量出血的动物。
[0532] 统计分析
[0533] 将所得的结果表示为平均值±该平均值的标准误差(SEM)。采用t检验来分析病变体积和行为恢复中的差异显著性。
[0534] 脊髓损伤的小鼠模型
[0535]组别 小鼠数量 化合物 剂量 应用 剂量/体积
1 10 载体 0 IV 0
2 10 GM603 1mg/kg IV 0.100ml
3 10 GM603 5mg/kg IV 0.100ml
1 10 载体 0 IV 0
2 10 GM603 1mg/kg IV 0.100ml
3 10 GM603 5mg/kg IV 0.100ml
[0536] 结束
[0537] 行为缺陷
[0538] 组织学分析
[0539] GM603保护免于受到脊髓损伤的作用。针对脊髓损伤来评价动物。
[0540] 已经将所有的测试组都提供给NTS；将GM603以固体材料的形式提供给NTS。测试组中所有的动物都如上文指示给药。
[0541] 结果
[0542] 小鼠中的脊髓损伤。SCI研究。对上述研究中SCI的相对严重程度进行评估。数据得自静脉内注射载体或GM603的SCI小鼠。
[0543] 病变体积：与载体注射组相比，在GM603组(1和5mg/kg)中，脊髓中的病变体积明显减小。1至5mg/kg的GM603显示出剂量依赖性地减小病变体积(参见表6)。病变体积绘制于图9中。脊髓中所存在的病变体积的减小百分比列于表6中。如表6所示，与载体相比，1或5mg/kg的GM603使病变体积分别减小28％或53％。图10示出了得自损伤动物的脊髓的代表性照片。图10显示，在载体处理的动物中，病变体积(染成红色)非常大，而在GM603(5mg/kg)处理的动物中，损伤体积(染成红色)相对较小。
[0544] 表6
[0545]组别 剂量 化合物 损伤体积(mm3) 损伤体积减小 P值
的百分比
1 0 载体 2.696±0.2902 0
2 1mg GM603 1.912±0.3139 28％ 0.05*
3 5mg GM603 1.274±0.2680 53％ 0.002*
的百分比
1 0 载体 2.696±0.2902 0
2 1mg GM603 1.912±0.3139 28％ 0.05*
3 5mg GM603 1.274±0.2680 53％ 0.002*
[0546] 减小的百分比与各载体对照动物相比
[0547] *与组1(载体)相比
[0548] 死亡率：在本研究中未发生死亡。
[0549] 行为测定
[0550] 使小鼠经历旋转棒测试。对动物保持在旋转棒上的能力进行测试，最长时间为90秒。在旋转棒测试中对动物进行测试，这可以用于测定运动功能。装置(DS 37型)由直径为2.5cm的棒构成，该棒被直径为25cm的圆盘分成6个分隔间。使棒以22rpm的恒定速度旋转。在第1、3、5、7和14天对动物进行测试。记录它们在旋转棒上保持的时间(最长为90秒)。如图11所示，所有的动物证实，开始时都不能保持在旋转棒上。但是，3天后，各组间形成了清楚的描绘。在第3天和第5天，差异是显著的(P＜0.05)，到第7天显著性甚至更大(P＜0.01)。
[0551] 将动物在旷场室(直径为120cm，壁高为25cm)中放置4分钟，以确保所有的受试者都获得了Basso，Beattie和Bresnahan(BBB)运动评分表中的最大分值21，从而对动物进行评估。将小鼠在旷场中放置4分钟，并录像以用于评分。如图12所示，在第1天，由于损伤，所有的动物在运动中都显示出相同的缺陷。但是，到第3天，与载体处理的动物相比，GM603处理的动物都显示出明显的改善。到第5天，显著性P＜0.01。
[0552] 讨论
[0553] MNTF为这样的营养因子，其能够提供保护从而免于神经疾病，并且可以使神经元组织在损伤或移植后再生。在此所进行的研究证明了MNTF6聚体类似物GM603以有效且高效的方式保护了得自经历SCI有害作用的脊髓的能力。每日静脉内注射施用1和5mg/kg的GM603持续14天证明通过减小病变体积和行为性质而在脊髓中对抗SCI的剂量依赖性保护作用。这些研究表明，GM603在SCI中具有有利的作用。
[0554] 当通过静脉内进行施用时，发现GM603在小鼠中对抗脊髓损伤的保护作用。
[0555] 实施例4
[0556] ALS：测试Gm604在肌萎缩性侧索硬化中如何
[0557] 对MNTF肽类似物GM604(FSRYAR；SEQ ID NO：2)在肌萎缩性侧索硬化(ALS)小鼠模型中的效力进行测试。为了测定GM604在ALS小鼠模型中的效力，向80天的小鼠静脉内注射两种剂量的GM604，并持续直到小鼠死亡。针对在疾病发作的年龄、死亡年龄、以及疾病的行为表现方面的变化，对动物进行测试。测试多剂量静脉内(i.v.)施用的GM604(1或5mg/kg)。施用GM604证明，在疾病发作的年龄、死亡年龄和疾病的行为表现方面发生了变化，这些变化显示为剂量依赖方式的作用。1和5mg/kg的GM604都显示出，动物的寿命预期的明显延长，这解释了对神经缺损的保护作用。这些数据表明，在ALS小鼠模型中GM604可以具有神经保护性作用。
[0558] 用于本实施例的缩写/术语。
[0559] “MNTF”是指运动神经元营养因子。
[0560] “MNTF6聚体”是指MNTF的6个氨基酸的肽类似物。
[0561] “GM604”是指用于ALS的MNTF的6个氨基酸的肽类似物(FSRYAR)。
[0562] “GM604-1”是指剂量为1mg/kg的GM604。
[0563] “GM604-5”是指剂量为5mg/kg的GM604。
[0564] “ALS”是指肌萎缩性侧索硬化。
[0565] “GB”是指Genervon Biopharmaceuticals，LLC。
[0566] “I.V.”是指静脉内。
[0567] 评估运动神经元营养因子(MNTF6聚体)的GB测试制品GM604(6个氨基酸的肽类似物(FSRYAR；SEQ ID NO：2))在延迟或调节ALS小鼠模型中ALS疾病的临床迹象的发作、临床迹象的改善以及疾病末期方面的能力。使动物经历静脉内注射GM604，其为在GMP认证下化学合成的(CS Bio Co.，Menlo Park，CA，GMP013，lot C811)。GM604以固体配制物(储存在4℃下的溶液)的形式提供。
[0568] 方法和材料
[0569] 动物
[0570] 将ALS小鼠(Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME)在无特定病原体(SPF)的条件下喂养和维持。在实验前，使重量为22-25克的动物均自由进食和进水。使年轻的成熟小鼠(25gm)经历静脉内注射GM604。
[0571] 实验组
[0572] 在实施外科手术前，根据随机分组设计方案，将小鼠分配到不同的处理组中，使得在任何给定的手术当天，所有的处理都被包括在内。通过使用储存在4℃下的盐水溶液重构GM604来配制GM604作为原液。载体对照含有盐水溶液。通过尾静脉进行IV推注。
[0573] 处理
[0574] 就化合物的应用而言，每天i.v.注射GM604，直到动物死亡。应用2种不同剂量的GM604(1mg/kg和5mg/kg)。由于需要大量的动物进行研究，所以使用了雄性和雌性小鼠。
[0575] 行为分析：
[0576] 旋转棒
[0577] 就行为分析而言，在疾病发作前(80天)并且每隔三天对动物进行一次测试，直到动物死亡。针对小鼠保持在旋转棒上的能力对其进行测试。就旋转棒测试而言，使小鼠经历1周的学习时间，其后，它们能够在加速的旋转棒上表演。每隔三天进行一次测试，测试小鼠，直到它们在三次连续的尝试中不能在旋转棒上保持10秒钟以上为止，将这种情况确定为旋转棒失败。将最长的时间设定为180秒。记录处理组的分值，并将中值绘制为年龄的函数。
[0578] 抓力检验
[0579] 使用抓力计(San Diego Instruments)，一周两次测定小鼠前肢的力量(单位为牛顿)。上述测定测出了当拉住小鼠的尾巴将其直线拉离传感器时，小鼠前肢施加到杆上的力量峰值。在经历4次尝试后，采用最高的结果来进行分析。
[0580] 鼠尾测试
[0581] 拉住鼠尾将小鼠提至空中，并检测后肢的伸展情况。将后肢缺少伸展确定为鼠尾检验失败。
[0582] 临床评价
[0583] 基于以下标准，对小鼠进行分值为0至4的临床评分。
[0584] 未见虚弱迹象(0)；颤抖和丧失张开反射(1)；一只后肢轻瘫(2)；两只后肢轻瘫(3)；一只或两只后肢瘫痪(4)。在水平4的情况下处死小鼠，以用于人为目的。
[0585] 组织学
[0586] 在上述研究结束时，处死动物，并将脊髓固定于4％的多聚甲醛中，以用于分析。
[0587] 所述研究中动物的排除
[0588] 基于若干标准从研究中排除动物：
[0589] 在本研究中没有动物被排除
[0590] 统计分析
[0591] 将所得的结果表示为平均值±该平均值的标准误差(SEM)。采用t检验来分析在发作年龄、死亡年龄和行为表现方面的差异显著性。
[0592] ALS小鼠模型
[0593]组别 小鼠数量 化合物 剂量 应用 剂量/体积
1 10 载体 0 IV 0
2 10 GM604 1mg/kg IV 0.100ml
3 10 GM604 5mg/kg IV 0.100ml
1 10 载体 0 IV 0
2 10 GM604 1mg/kg IV 0.100ml
3 10 GM604 5mg/kg IV 0.100ml
[0594] 结束
[0595] 疾病发作的年龄
[0596] 死亡的年龄
[0597] 行为缺陷
[0598] 组织学分析
[0599] 已经将所有的测试组都提供给NTS；将GM604以固体材料的形式提供给NTS。测试组中所有的动物均以上文指示给药。
[0600] 结果
[0601] ALS研究。对上述研究中ALS的相对严重程度进行评估。数据得自静脉内注射载体或GM604的ALS小鼠。
[0602] 疾病发作的年龄：与载体注射组相比，在使用GM604(1和5mg/kg)治疗的ALS小鼠中，疾病发作的年龄明显延长。1至5mg/kg的GM604显示出疾病发作年龄的剂量依赖式延迟(参见表7)。疾病发作的概况示于表13中。疾病发作年龄增大的百分比列于表7中。如表7所示，与载体相比，1或5mg/kg的GM604使疾病发作的年龄分别增大12％或27％。
[0603] 表7.ALS小鼠中疾病发作的年龄
[0604]组别 剂量 化合物 疾病发作的年龄 发作年龄增大 P值
(中值) 的百分比
1 0 载体 114.5 0
2 1mg GM604 128 12％ 0.001*
3 5mg GM604 145.5 27％ 0.001*
(中值) 的百分比
1 0 载体 114.5 0
2 1mg GM604 128 12％ 0.001*
3 5mg GM604 145.5 27％ 0.001*
[0605] 增大的百分比与各载体对照动物相比
[0606] *与组1(载体)相比
[0607] 死亡的年龄
[0608] 与载体注射组相比，在使用GM604(1和5mg/kg)治疗的ALS小鼠中，死亡的年龄明显延长。1至5mg/kg的GM604显示出死亡年龄的剂量依赖式延迟(参见表8)。死亡的年龄绘制于图14中。死亡年龄延长的百分比列于表8中。如表8所示，与载体相比，1或5mg/kg的GM604使死亡的年龄分别增大16％或30％。
[0609] 表8ALS小鼠中死亡时的年龄
[0610]组别 剂量 化合物 死亡的年龄(中 死亡年龄增大 P值
值) 的百分比
1 0 载体 126 0
2 1mg GM604 146.5 16％ 0.001*
3 5mg GM604 163.5 30％ 0.001*
值) 的百分比
1 0 载体 126 0
2 1mg GM604 146.5 16％ 0.001*
3 5mg GM604 163.5 30％ 0.001*
[0611] 增大的百分比与各载体对照动物相比
[0612] *与组1(载体)相比
[0613] 死亡率
[0614] 在本研究中未发生涉及疾病的死亡。
[0615] 行为测试
[0616] 旋转棒
[0617] 使小鼠经历旋转棒测试。对动物保持在旋转棒上的能力进行测试，最长时间为180秒。在旋转棒测试中对动物进行测试，这可以用于测定运动功能。装置(DS 37型)由直径为2.5cm的棒构成，该棒被直径为25cm的圆盘分成6个分隔间。使所述的棒以22rpm的恒定速度旋转。在第80天开始对动物每周进行2次测试。记录它们在旋转棒上保持的时间(最长为180秒)。如图15所示，所有的动物都能高效地通过旋转棒测试，直到疾病发作为止(参见图15)。
[0618] 表9.在ALS小鼠中的旋转棒分析
[0619]组别 剂量 化合物 年龄(中值) 旋转棒功能增大 P值
的百分比
1 0 载体 124 0
2 1mg GM604 141 14％ 0.001*
3 5mg GM604 174.5 41％ 0.001*
的百分比
1 0 载体 124 0
2 1mg GM604 141 14％ 0.001*
3 5mg GM604 174.5 41％ 0.001*
[0620] 增大的百分比与各载体对照动物相比
[0621] *与组1(载体)相比
[0622] 抓力
[0623] 在疾病进行过程中并在GM604存在下，检查小鼠的抓力。与对照小鼠相比，使用GM604处理的ALS小鼠显示出在抓力减小方面明显延迟(参见图16A和表10)。总之，与对照动物相比，使用1或5mg/kg的GM604处理的小鼠表现更好。
[0624] 表10.ALS小鼠的抓力
[0625]组别 剂量 化合物 年龄(中值) 旋转棒功能增大的 P值
百分比
1 0 载体 120 0
2 1mg GM604 137 14％ 0.001*
3 5mg GM604 169 41％ 0.001*
百分比
1 0 载体 120 0
2 1mg GM604 137 14％ 0.001*
3 5mg GM604 169 41％ 0.001*
[0626] 增大的百分比与各载体对照动物相比
[0627] *与组1(载体)相比
[0628] 临床评价
[0629] 在疾病进行过程中并在GM604存在下，检查小鼠的临床评分。与对照动物相比，使用GM604处理的ALS小鼠显示出在临床评分减小方面明显延迟(参见图16B和表11)。总之，与对照动物相比，使用1或5mg/kg的GM604治疗的小鼠表现更好。
[0630] 表11.ALS小鼠的临床评分
[0631]组别 剂量 化合物 年龄(中值) 临床评分增大的百 P值
分比
1 0 载体 113 0
2 1mg GM604 139 23％ 0.001*
3 5mg GM604 173 53％ 0.001*
分比
1 0 载体 113 0
2 1mg GM604 139 23％ 0.001*
3 5mg GM604 173 53％ 0.001*
[0632] 增大的百分比与各载体对照动物相比
[0633] *与组1(载体)相比
[0634] MNTF为这样的营养因子，其能够提供保护从而免于神经疾病，并且可以使神经元组织在损伤或移植后能够再生。在此所进行的研究证明了MNTF 6聚体类似物GM604以有效且高效的方式保护脊髓免于受到ALS的有害作用和的能力。每天静脉内注射施用1和5mg/kg的GM604证明了通过增大疾病发作的年龄、死亡年龄和行为参数而在ALS小鼠模型中产生呈剂量依赖方式的保护作用。这些研究证明，GM604在ALS方面具有有利的作用。
[0635] 当通过静脉内进行施用时，发现GM604在小鼠中具有对抗ALS的保护作用。
[0636] 实施例5A
[0637] 小鼠帕金森氏疾病模型
[0638] 在帕金森氏疾病(PD)模型中测试GM6(FSRYAR，SEQ ID NO：2)(CSBio Co.，Menlo Park，CA)的效力。
[0639] 为了测定GM6在PD中的效力，向小鼠注射1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(MPTP)以诱导PD，然后静脉内注射几种不同剂量的GM6，从而测定其在减轻PD方面的作用。对5天(每天2次)进行静脉内(i.v.)施用GM6(1，5，10或20mg/kg)的情况进行测试。施用GM6证明了其以剂量依赖方式减轻小鼠的PD，其中20mg/kg显示出最大的效力。行为、生物化学和组织学分析证明了减轻作用，说明了GM6在PD中的独特作用。这些数据表明，在i.v.注射之后GM6在PD小鼠模型中的有效性，并且可以成为用于PD患者的有效治疗。
[0640] 用于本实施例的缩写/术语。
[0641] “MNTF”是指运动神经元营养因子。
[0642] “GM6”和“6聚体”分别是指MNTF的6个氨基酸的肽类似物。
[0643] “PD”是帕金森氏疾病。
[0644] “MPTP”是指1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶。
[0645] “DOPAC”是指二氢基苯乙酸。
[0646] “HVA”是指多巴胺。
[0647] “DA”是指高香草酸。
[0648] “Genervon”和“GB”分别是指Genervon Biopharmaceuticals，LLC。
[0649] “I.V.”是指静脉内。
[0650] 测定运动神经元营养因子(MNTF)的6氨基酸类似物(GM6)的能力，从而测定GM6在帕金森氏疾病(PD)的小鼠模型中的效力。
[0651] 帕金森氏疾病(PD)
[0652] GM6为合成的6个氨基酸的肽(MNTF)。将GM6以固体形式提供给NTS，并且制剂(储存在4℃下的溶液)由NTS制备。
[0653] 治疗中枢神经系统疾病和紊乱的主要障碍是难以将药物传递至中枢神经系统中。测定药物的生物利用度和其对各种神经紊乱的作用对于潜在的治疗发明而言是重要的。
[0654] 对通过静脉内注射的GM6在PD小鼠模型中的效力进行评估。
[0655] 方法和材料
[0656] 研究设计。按照下文所述向雄性C57BL/6小鼠注射MPTP，并检测指示剂量的GM6对PD的保护作用。针对行为表现、生物化学和组织学方面的变化来检测这些动物。
[0657] MPTP治疗。对C57BL/6小鼠进行注射(i.p.，以20mg/kg的量溶于0.1ml的水中，以2小时的时间间隔注射4剂量的1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶，MPTP，Sigma M-0896)，并在注射后对这些小鼠进行每周一次的检测。各组中的对照小鼠接受4次i.p.注射盐水。在注射后，将小鼠置于加热毯上24小时。
[0658] 施用MNTF。对于MNTF(GM6)处理，使小鼠每天接受两次(12hr间隔)静脉内注射溶于盐水中的各种剂量(1、5、10或20mg/kg)的MNTF，这种注射是在第一次MPTP注射后的30分钟开始，并在最后一次注射MPTP后再持续额外的4天；对照小鼠仅接受盐水。N＝10/组。
[0659] 行为测试。将雄性小鼠用于行为测试中。将所有的动物都保持在12小时的光-暗循环(在7点至19点为光照)中，并允许它们自由进食和进水。为了评价自发的运动活性，我们使用了由4个Plexiglas气缸(23cm×30cm，直径×高)构成的活性监测器，其中每个气缸都装配有三个红外线光束和自动计数系统。通过将小鼠放置到气缸中来开始自发活性测试。在3min的环境适应之后，通过计数在每5min内穿过光电池装置中的红外线光束的次数来对活性进行评估。为了评估感觉运动协调性，在旋转棒任务中评价小鼠。使用由旋转轴(直径为7.3cm)和5个单独的分隔间构成的旋转棒单元，一次对5只小鼠进行测试。在每天训练两次，并持续两天(第一天速度为12rpm，第二天速度为18rpm)之后，在第三天测试期间，将测试的旋转速度增大至25rpm。对每只小鼠都进行3次实验，每次间隔5分钟，每次最长的实验时间长度为60秒，并记录每只小鼠在旋转棒上保持的时间。数据以三次测试实验后在旋转棒上的平均时间示出。
[0660] 脑一元胺的定量
[0661] 将切开的脑区域在0.1M的高氯酸和0.1mM的EDTA中(10mg/100μl)超声。然后将提取物离心15分钟，并收集上清液，然后将其储存在-20℃下。采用电化学检测方法，使用高压液相色谱(HPLC)测定一元胺(多巴胺，[DA])和代谢物(二氢苯乙酸[DOPAC]，高香草酸[HVA])。
[0662] 免疫组织化学法。将所有小鼠(1/2脑)滴落固定于4％的PFA中。将所述的脑在4℃的4％的PFA中固定12h，然后储存在溶解于PBS中的30％的蔗糖中。切下50微米切片，并使用1∶1000稀释的TH抗体(Sigma T-1299)进行处理用于免疫组织化学。使用单克隆抗TH的抗体来显现酪氨酸氢化酶(TH)的免疫反应性。采用图像分析，对黑质和腹侧被盖区中的TH免疫阳性细胞进行初步定量。将切片干燥，并固定于Depex中。使用计算机辅助的立体工具盒来进行细胞计数。所有细胞的计数都是在对药物处理为盲的条件下进行的，并且是在100倍放大下进行的。
[0663] 统计分析。将所得的结果以平均值±标准偏差(SD)的形式表示。采用t检验来分析数据中的差异显著性。
[0664] 所述研究中动物的排除
[0665] 基于以下若干标准从研究中排除动物：
[0666] 在研究结束前(在任何时间点上)死亡的动物；
[0667] 在施用测试制品后产生严重并发症的动物。
[0668] 处理组。所有的组都经历GM6或者作为对照。将载体或MNTF以所述的剂量经尾静脉对动物(60只动物)给予静脉内推注给药。对动物每天注射2次，并持续5天。
[0669] 使用GM6(其为示例性的MNTF 6-聚体FSRYAR SEQ ID NO：2)的小鼠PD模型：
[0670]组别 化合物 剂量(mg/kg) 途径
C57BL/6小鼠
1(n＝10只小鼠) 载体 0 IV
2(n＝10只小鼠) 示例性MNTF GM6：FSRYAR 1mg/kg/天 IV
3(n＝10只小鼠) 示例性MNTF GM6：FSRYAR 5mg/kg/天 IV
4(n＝10只小鼠) 示例性MNTF GM6：FSRYAR 10mg/kg/天 IV
5(n＝10只小鼠) 示例性MNTF GM6：FSRYAR 20mg/kg/天 IV
6(n＝10只小鼠) 对照 对照 NA
C57BL/6小鼠
1(n＝10只小鼠) 载体 0 IV
2(n＝10只小鼠) 示例性MNTF GM6：FSRYAR 1mg/kg/天 IV
3(n＝10只小鼠) 示例性MNTF GM6：FSRYAR 5mg/kg/天 IV
4(n＝10只小鼠) 示例性MNTF GM6：FSRYAR 10mg/kg/天 IV
5(n＝10只小鼠) 示例性MNTF GM6：FSRYAR 20mg/kg/天 IV
6(n＝10只小鼠) 对照 对照 NA
[0671] 结束
[0672] 小鼠中PD的调节
[0673] 将所有的测试组都提供给NTS；将GM6以固体材料的形式提供给NTS。测试组中所有的动物都如上文指示给药。
[0674] 行为测试。对GM6在MS小鼠模型中的效力进行评估。数据得自i.v.施用载体或GM6(以指示的剂量)的小鼠。
[0675] 行为分析：在使用MPTP诱导PD之后，向小鼠施用上文指示剂量的GM6。从第2天开始并且每天都对动物进行检测，以测定在给予MPTP和GM6之后动物的行为。在MPTP施用的当天开始，向小鼠注射GM6，并持续5天。在最后一次MPTP注射后的30min开始施用GM6，并再持续另外的4天。如表12和13所示，与对照动物或经处理的动物相比，使用载体治疗的小鼠在行为评分(参见自发活性和旋转棒测试图)方面显示出明显的增加。使用GM6的处理显示出在行为方面明显的改善(减轻)。5、10和20mg/kg的GM6显示出是明显有利的，而1mg/kg则没有显示出任何改善。
[0676] 自发运动活性
[0677] 表12.自发活性
[0678]处理 运动的次数/5min
载体 67.60±13.28(NA)
GM6(1mg/kg) 74.50±19.12(0.3610)
GM6(5mg/kg) 121.6±21.69(＜0.0001)
GM6(10mg/kg) 161.5±24.95(＜0.0001)
GM6(20mg/kg) 254.9±26.69(＜0.0001)
对照 292.0±33.75(＜0.0001)
载体 67.60±13.28(NA)
GM6(1mg/kg) 74.50±19.12(0.3610)
GM6(5mg/kg) 121.6±21.69(＜0.0001)
GM6(10mg/kg) 161.5±24.95(＜0.0001)
GM6(20mg/kg) 254.9±26.69(＜0.0001)
对照 292.0±33.75(＜0.0001)
[0679] 旋转棒测试
[0680] 表13.旋转棒测试
[0681]处理 潜伏期
载体 41.40±3.645(NA)
GM6(1mg/kg) 42.70±4.237(0.4741)
GM6(5mg/kg) 38.00±2.331(＜0.0947)
GM6(10mg/kg) 33.90±3.091(＜0.0006)
GM6(20mg/kg) 23.80±1.003(＜0.0001)
对照 20.29±5.254(＜0.0001)
载体 41.40±3.645(NA)
GM6(1mg/kg) 42.70±4.237(0.4741)
GM6(5mg/kg) 38.00±2.331(＜0.0947)
GM6(10mg/kg) 33.90±3.091(＜0.0006)
GM6(20mg/kg) 23.80±1.003(＜0.0001)
对照 20.29±5.254(＜0.0001)
[0682] 死亡率：本研究中没有发生死亡。
[0683] 经MPTP处理的动物脑中一元胺和代谢物的水平。测定GM6对脑一元胺和代谢物水平的效力，其中所述的一元胺和代谢物的水平在用MPTP处理的过程中是变化的，并且是PD的标志物。如表14以及图21A-21C所示，与载体处理的动物相比，在GM6处理的动物中的多巴胺、DOPAC和HVA水平都是较高的。20mg/kg/天显示出在MPTP处理后的最大的保护作用。
[0684] 表14.一元胺和代谢物的水平
[0685]
[0686]
[0687] 细胞计数。在行为研究之后，在第7天将动物处死，取出1/2的脑，并在黑质致密部(SNpc)对酪氨酸氢化酶(TH)阳性神经元进行染色。MPTP选择性地杀死了这些神经元，并且这些神经元是测定GM6在减轻疾病方面作用的极好的标志物。通过计数TH阳性神经元来测定SNpc中细胞的数量，并示于表15和图22中。如所述的表和图所示，随着GM6剂量的增加，脑中细胞的数量也增加(防止细胞损失)。这表明GM6保护脑免于受到PD诱导的有害作用。
[0688] 表15.细胞计数
[0689] 区域 剂量 细胞计数 P值 差异％
[0690] (mg/kg) 平均值±SD
[0691] SNpc 0 2698±510.6 NA NA
[0692] 1 2988±763.3 0.3314 +111
[0693] 5 4820±823.2 ＜0.0001 +179
[0694] 10 6494±944.1 ＜0.0001 +241
[0695] 20 9993±1025 ＜0.0001 +370
[0696] 对照 11797±1339 ＜0.0001 +437
[0697] MNTF为这样的营养因子，其能够提供保护从而免于神经疾病，并且可以使神经元组织在损伤或移植后再生。在此所进行的研究证明了MNTF(GM6)的6氨基酸类似物减轻小鼠模型中PD的能力。经历5天静脉内施用推注剂量为1、5、10和20mg/kg的GM6证明PD行为、生物化学和组织学以剂量依赖方式降低。这表明，GM6通过静脉内施用能够有效地限定PD在小鼠中的程度，并且有利于治疗这些疾病。
[0698] 当通过静脉内进行施用时，发现GM6在PD小鼠模型中是有效的。GM6的效力是剂量依赖方式的，并且表明GM6有利于PD。
[0699] 实施例5B
[0700] 在帕金森氏疾病的细胞培养物模型中测试MNTF行
[0701] 对MNTF在帕金森氏疾病(PD)的细胞培养物模型中的效力进行测试。为了测定MNTF在PD细胞培养物模型中的效力，使SH-SY5Y细胞在猪毛菜酚(100μM)中暴露24小时。将细胞用不同浓度的MNTF处理，以及未经MNTF处理，然后针对细胞的生存能力进行测试。在暴露24小时之后，猪毛菜酚诱导了SH-SY5Y细胞的细胞死亡。将MNTF加入到所述的培养物中显示了以剂量依赖方式保护对猪毛菜酚的暴露。此外，使用渥曼青霉素(PI3K)进行处理破坏了MNTF的作用。这些数据表明，MNTF在施用猪毛菜酚之后的PD细胞培养物模型中具有神经保护作用，并且可以通过PI3K途径起作用。
[0702] 用于本实施例的缩写/术语。
[0703] “MNTF”是指运动神经元营养因子。
[0704] “PD”是帕金森氏疾病。
[0705] “GB”分别是指Genervon Biopharmaceuticals，LLC。
[0706] “CV”是指细胞生存能力。
[0707] “GM”是指MNTF。
[0708] “WRT”是指渥曼青霉素。
[0709] “Sal”是指猪毛菜酚。
[0710] 大量的研究证明了MNTF在大鼠的各种神经系统中的效力，其中所述的神经系统包括：外周坐骨神经、外周肌皮神经、头部和面部神经、头部舌下神经以及控制颈部、胸腔和上肢中的肌肉的部分脊髓(Wanget al.，1995)。此外，在具有双隐性基因的wobbler小鼠(NIH)达到6周龄时给予其一剂量的35ng的MNTF，会终止上述品系小鼠的神经退行性遗传疾病。
[0711] 独立研究组使用其自己建立的检测和方案来实施以下CNS和PNS实验：1.在GM6血脑屏障渗透的研究中，静脉内施用单次推注剂量为0.2和2mg/kg的GM6证明了在4小时后，脑中GM6的水平以剂量依赖方式增大。2.在中脑动脉阻塞(MOAC)小鼠中风模型中，在IV注射GM6处理后，会减小脑中梗塞体积，并以剂量依赖方式减少神经缺损。与载体相比，高剂量的GM6会将脑中梗塞体积减小74％，并显著减小神经缺损(p＜0.0001)。3.L-2-羟基戊二酸(LGA)诱导神经系统的氧化应激和细胞凋亡。在斑马鱼生物分析中，GM6保护了CNS中由LGA诱导的细胞凋亡，并将中脑中的细胞凋亡减少85％。4.在具有8mm间隙的大鼠坐骨神经横切研究中，GM6处理的动物会以剂量依赖方式显著地改善运动神经元的再生(在最佳剂量下p＜0.0002)，并促进DRG神经元的再生。5.在横切的股神经大鼠模型中，在GM6处理的动物中，正确投射到肌肉中的运动神经元的数量呈现剂量应答的方式。在最佳剂量下，正确投射到肌肉中的运动神经元的数量是不正确地投射到皮肤中的运动神经元数量的3倍(p＜0.0001)。6.在斑马鱼生物分析中，GM6保护了PNS中由LGA诱导的细胞凋亡，并将外周肌神经接合点的细胞凋亡减少49％。7.得自患有CNS紊乱的患者的脑脊液(CSF)含有可溶性因子，这些因子诱导了神经突损坏和神经元死亡。GM6显著地增强了患者CSF中细胞的存活：亨廷顿氏疾病(271％)、MS(246％)、中风(205％)、帕金森氏疾病(198％)、阿兹海默氏疾病(191％)和ALS(175％)。这些数据表明，MNTF能够保护神经元细胞对抗由神经紊乱患者的CSF所刺激的细胞死亡，我们在动物实验中的发现强烈地证实了这一点。
[0712] GMP级别的GM6(在本报道中也称为MNTF)在帕金森氏疾病的细胞培养物模型中的效力(Shavali et al.，2003)。进行所述的研究以测试MNTF保护SH-SY5Y细胞免受损害的能力。MNTF以固体的形式提供，并制备制剂(储存在4℃下的溶液)。
[0713] 方法和材料
[0714] 细胞
[0715] SH-SY5Y细胞购自美国典型培养物保藏中心(Manassas，VA)，并在包含最小必需培养基、Hams F-12培养基和Hanks平衡盐溶液(Gibco-BRL)(比例为2∶1∶1)的完全培养基中培养。所述的培养基还包含10％的胎牛血清、以及青霉素(50U/ml)和链霉素(50mg/ml)。将所得的细胞在烧瓶中培养，并保持在37℃的、包含5％CO2(空气中)的潮湿培养箱中。所述的培养基每2-3天更换一次。
[0716] 实验组
[0717] 在进行操作之前，根据随机分组设计方案，将培养物分配到不同的处理组中。研究者对于处理组而言是盲的。
[0718] 帕金森氏疾病的细胞模型的诱导
[0719] 就细胞生存能力实验而言，将SH-SY5Y细胞(0.5×105/孔)在96孔细胞培养板中培养，并使用单独的(±)SAL(Sigma，St.Louis，MO)、或者与不同浓度的GM6(Genervon)一起使用的(±)SAL(含有或不含有渥曼青霉素(WRT)(Sigma，St.Louis，MO)，其为磷脂酰肌醇-3-激酶(PI-3激酶)的抑制剂)来将上述细胞处理24h。通过噻唑兰(MTT)检测来测定细胞的生存能力。
[0720] 统计分析
[0721] 将这些结果以平均值±SD表示，并使用Sigma-stat软件，通过t检验来计算统计学显著性，其中认为P＜0.05为有效值。
[0722] PD细胞的培养物模型：
[0723]组别 培养物数量 化合物 剂量
1 10 载体 0
2 10 GM6 0.1mg/ml
3 10 GM6 1mg/ml
4 10 GM6 10mg/ml
5 10 GM6/WRT 10mg/ml+WRT(10μM)
6 10 Sal 100μM
7 10 Sal/GM6 100μM/0.1mg/ml
8 10 Sal/GM6 100μM/1mg/ml
9 10 Sal/GM6 100μM/10mg/ml
10 10 Sal/GM6/WRT 100μM/10mg/ml+WRT(10μM)
1 10 载体 0
2 10 GM6 0.1mg/ml
3 10 GM6 1mg/ml
4 10 GM6 10mg/ml
5 10 GM6/WRT 10mg/ml+WRT(10μM)
6 10 Sal 100μM
7 10 Sal/GM6 100μM/0.1mg/ml
8 10 Sal/GM6 100μM/1mg/ml
9 10 Sal/GM6 100μM/10mg/ml
10 10 Sal/GM6/WRT 100μM/10mg/ml+WRT(10μM)
[0724] 结束
[0725] 细胞数量
[0726] 将所有的测试组都提供给NTS；将MNTF以固体形式提供给NTS。测试组中所有的培养物都如上文指示给药。猪毛菜酚和渥曼青霉素得自Sigma。GM6＝示例性MNTF(FSRYAR，SEQ ID NO：2)。
[0727] 结果
[0728] PD的细胞培养物模型。PD研究。当将SH-SY5Y细胞与GM6±猪毛菜酚(Sal)一起培养时，对该细胞生存能力的相对变化进行评估。数据得自使用载体或MNTF(GM6)处理的细胞培养物。
[0729] 细胞的生存能力。将细胞培养物在各种浓度的GM6(0.1至10mg/ml)±猪毛菜酚(100μM)、以及渥曼青霉素(WRT，10μM)中温育，并测定细胞数量。根据所得的数据，与对照处理细胞相比，GM6显示出使细胞数量以剂量依赖方式增多。与对照处理细胞相比，10mg/ml使细胞数量增多19.2％。使用10mM的渥曼青霉素处理细胞抑制细胞数量的增多，表明GM6针对PI3K的作用。
[0730] 使用100μM的猪毛菜酚处理所述的细胞，证明多巴胺能SH-SY5Y细胞的细胞生存能力降低。在使用猪毛菜酚处理24小时后，细胞的数量减少63.7％。向所述的细胞中加入GM6抑制由Sal诱导的细胞死亡，并显著地增加细胞的存活，这可由MTT分析来评估。浓度为100μM的SAL将细胞的生存能力降至36.5％，并且将浓度为100μM的SAL与浓度为0.1，1.0和10.0mg/ml的GM6进行共同处理，分别使细胞的生存能力增大至66％、85％和
95％(参见图17)。WRT(10μM)阻断了GM6的神经保护作用(参见图17)。
95％(参见图17)。WRT(10μM)阻断了GM6的神经保护作用(参见图17)。
[0731] 表16.GM6和猪毛菜酚处理后细胞生存能力变化的百分比
[0732]组别 剂量 处理 化合物 生存能力(细胞％) 细胞数量 P值
平均值±SD 变化的百
分比
1 0mg/ml 载体 载体 100.6±5.187 NA NA
2 0.1mg/ml GM6 载体 101.2±7.260 +0.6％** 0.8394**
3 1mg/ml GM6 载体 108.0±8.249 +7.4％** 0.0283**
4 10mg/ml GM6 载体 119.9±14.01 +19.2％** 0.0007**
5 10mg/ml GM6 WRT 93.81±9.246 -6.7％** 0.0576**
6 0mg/ml 猪毛菜酚 载体 36.48±12.78 NA NA
7 0.1mg/ml GM6/Sal 载体 65.85±10.80 +80.5％* ＜0.0001*
8 1mg/ml GM6/Sal 载体 85.19±10.18 +133.5％* ＜0.0001*
9 10mg/ml GM6/Sal 载体 95.57±8.328 +162％* ＜0.0001*
10 10mg/ml GM6/Sal WRT 41.35±10.79 +13.4％* 0.3689*
平均值±SD 变化的百
分比
1 0mg/ml 载体 载体 100.6±5.187 NA NA
2 0.1mg/ml GM6 载体 101.2±7.260 +0.6％** 0.8394**
3 1mg/ml GM6 载体 108.0±8.249 +7.4％** 0.0283**
4 10mg/ml GM6 载体 119.9±14.01 +19.2％** 0.0007**
5 10mg/ml GM6 WRT 93.81±9.246 -6.7％** 0.0576**
6 0mg/ml 猪毛菜酚 载体 36.48±12.78 NA NA
7 0.1mg/ml GM6/Sal 载体 65.85±10.80 +80.5％* ＜0.0001*
8 1mg/ml GM6/Sal 载体 85.19±10.18 +133.5％* ＜0.0001*
9 10mg/ml GM6/Sal 载体 95.57±8.328 +162％* ＜0.0001*
10 10mg/ml GM6/Sal WRT 41.35±10.79 +13.4％* 0.3689*
[0733] *组7-10中细胞数量变化的百分比与猪毛菜酚处理的细胞(组6)相比较。
[0734] **组2-5中细胞数量变化的百分比与载体处理的细胞(组1)相比较。
[0735] 加入100μM的猪毛菜酚(Sal)，加入10μM的渥曼青霉素(WRT)。
[0736] MNTF(GM)为这样的营养因子，其能够提供保护从而免于神经疾病，并且使神经元组织在损伤或移植后再生。在此所进行的研究证明了MNTF以有效且高效的方式保护多巴胺能神经元(SH-SY5Y细胞)免于受到PD(猪毛菜酚)有害作用的能力。24小时施用剂量为0.1、1和10mg/ml的MNTF证明了通过增加细胞数量而在SH-SY5Y细胞中以剂量依赖方式对由猪毛菜酚所导致的细胞死亡的保护作用。这些研究表明，MNTF在PD中具有有利的作用。
[0737] 当进行施用时，发现MNTF(GM6)具有对抗细胞死亡(猪毛菜酚诱导的细胞凋亡)的PD细胞培养物模型的保护作用。
[0738] 实施例6
[0739] 测试MNTF对抗CSF损伤的保护作用
[0740] 针对GM6在神经元损伤模型中的效力进行测试。在原代神经元细胞中，对得自对照组以及8个神经紊乱组的每一个组中的5个疾病特异性人患者脑脊液(CSF)样品进行测试，从而测定对神经元细胞死亡的作用。此外，针对对抗由CSF诱导的损伤的保护作用，对GM6的作用进行检测。当将CSF以10％溶液的形式应用时，得自8个不同神经疾病的疾病特异性人的CSF诱导了神经元细胞的死亡。GM6提供了保护从而免于受到该损伤。这些研究表明得自患有神经紊乱的人的CSF包含诱导细胞死亡的某些因子，并且GM6能够保护对抗这些作用。这些研究进一步表明GM6在神经疾病模型中的效力。
[0741] 用于本实施例的缩写/术语。
[0742] “MNTF”是指运动神经元营养因子。
[0743] “GM6”和“6聚体”均是指MNTF的示例性6个氨基酸的肽类似物：FSRYAR(SEQ ID NO：2)。
[0744] “CSF”是指脑脊液。
[0745] “Genervon”和“GB”分别是指Genervon Biopharmaceuticals，LLC。
[0746] “NCC”是指神经细胞培养物。
[0747] 测试MNTF在对抗CSF损伤中的保护作用
[0748] 使用死后CSF样品(得自9个研究组的每一个组中的5个疾病特异性患者/供体)以及由UCLA Human Brain and Spinal Fluid ResourceCenter(Los Angeles，CA)提供的鉴定、临床诊断和神经病理学诊断文件，进行研究以评估MNTF肽在CSF损伤的保护中的能力。在原代神经元细胞中测试CSF样品，从而测定对神经元细胞死亡的作用。此外，针对对抗由CSF诱导的损伤的保护作用来检测MNTF6聚体/GM6的作用。GM6在GMP认证下化学合成(CS Bio Co.，Menlo Park，CA，GMP013，lot C811)。在Neurological Testing Service，Inc(NTS，Charleston，SC)的合同下进行上述研究。将GM6以固体形式提供给NTS，并且制剂(储存在4℃下的溶液)由NTS来制备。
[0749] 方法和材料
[0750] 研究的设计
[0751] Sprague Dawley大鼠脑皮层神经元细胞由18天大的胚胎胎儿(embryonic fetuses)中分离得到，并在培养物中生长12天。将得自对照和各种神经紊乱供体的死后CSF应用到培养物中，并检测神经元生存能力。此外，将MNTF加入到所述的培养物中，以保护所述的细胞免于受到损伤。
[0752] 体外方法
[0753] 由18天大的Sprague-Dawley大鼠胎儿制备神经元培养物。将大鼠胎儿中脑切开，并在由2mg/ml胰岛素溶于不含Ca2+-和Mg2+-的Hank平衡盐溶液(HBSS)中形成的溶液中温育15分钟，其中所述的Hank平衡盐溶液(HBSS)使用了10mM的HEPES(GIBCO Life Technologies，Paisley，Scotland)进行缓冲。然后，将所述的组织在大豆胰岛素抑制剂(1mg/mL，溶于HBSS)中暴露2分钟，并在HBSS中漂洗3次。通过研碎使细胞分离，然后将这些细胞分配到96孔或24孔聚-L-赖氨酸涂敷的塑料培养板(Costar，Cambridge，MA)中。最初的涂布密度为大约160-180个细胞/mm2。在涂布时，每个孔中都包含0.2ml的DMEM/F12培养基(GIBCO Life Technologies，NY)，其中所述的培养基补充有100ml/L的胎牛血清(Sigma Chemicals，St.Louis，MO)。在24小时之后，用0.15ml的2％v/v B-27神经基础培养基替代DMEM/F12培养基，其中所述的神经基础培养基补充有2mM的GlutaMAX和0.5％w/vD-(+)葡萄糖(GIBCO Life Technologies)。每周2次，使用相同组成的新配制培养基取代其中2/3的神经基础培养基。在培养12天之后，将培养物用于神经毒性实验。在研究之前、在研究过程中以及当将原始数据提供给赞助人时，NTS的研究人员并不清楚所述的材料。
[0754] UCLA Human Brain and Spinal Fluid Resource Center(LosAngeles，CA)提供了死后CSF样品(其得自9个研究组的每一个研究组中5个供体)，以及鉴定、临床诊断和神经病理学诊断文件。在运输之前，将样品储存在-170℃，并使用干冰来运送。所述的研究组为对照(无神经紊乱)、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、神经病(NP)、多发性硬化(MS)、阿兹海默氏疾病(AD)、Batten疾病(BD)、亨廷顿氏疾病(HD)、帕金森氏疾病(PD)以及脑缺血(中风)。
[0755] 为了测试CSF对神经元细胞存活的作用，将CSF加入到处于含有10％CSF的神经基础培养基中的培养物中。将CSF加入到所述的培养物中，并在48小时后进行检测。取得培养物的图像，然后使该培养物经历MTT分析(参见下文)，从而测定细胞死亡％。将额外的培养物与MNTF(100nM)温育，其中所述的MNTF是在加入CSF之前2小时加入到培养物中的。
[0756] MTT分析。按照上文所述测定原代神经元的生存能力。用使用载体刺激的细胞所得到的值作为100％，以一式三份测定存活细胞的相对数量。通过MTT分析，在处理的第2天对细胞的存活进行估测。将MTT(溴化3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-2，5-二苯基四唑)在Hank平衡盐溶液(Biochrom)中稀释至200mM，并在3 7℃下将其在2个小时内加入到培养物中。通过加入二甲亚砜由所述的细胞中释放出MTT甲 产物，并在570nm处在Ultrospect III分光光度计(Pharmacia)中测定上述产物。然后测定与未经处理的对照相对比的相对存活情况。
[0757] 统计分析。所得的结果以平均值±标准偏差(SD)来表示。使用t检验来分析数据的差异显著性。
[0758] 处理组。
[0759] 神经元损伤模型
[0760]组别 化合物 剂量 途径
1对照 CSF 10％ 体外
2ALS CSF 10％ 体外
3NP CSF 10％ 体外
4MS CSF 10％ 体外
5AD CSF 10％ 体外
6BD CSF 10％ 体外
7HD CSF 10％ 体外
8PD CSF 10％ 体外
9中风 CSF 10％ 体外
1对照 CSF 10％ 体外
2ALS CSF 10％ 体外
3NP CSF 10％ 体外
4MS CSF 10％ 体外
5AD CSF 10％ 体外
6BD CSF 10％ 体外
7HD CSF 10％ 体外
8PD CSF 10％ 体外
9中风 CSF 10％ 体外
[0761] MNTF的作用
[0762]组别 化合物 剂量 途径
1对照+MNTF CSF 10％(100nM) 体外
2ALS+MNTF CSF 10％(100nM) 体外
3NP+MNTF CSF 10％(100nM) 体外
4MS+MNTF CSF 10％(100nM) 体外
5AD+MNTF CSF 10％(100nM) 体外
6BD+MNTF CSF 10％(100nM) 体外
7HD+MNTF CSF 10％(100nM) 体外
8PD+MNTF CSF 10％(100nM) 体外
9中风+MNTF CSF 10％(100nM) 体外
1对照+MNTF CSF 10％(100nM) 体外
2ALS+MNTF CSF 10％(100nM) 体外
3NP+MNTF CSF 10％(100nM) 体外
4MS+MNTF CSF 10％(100nM) 体外
5AD+MNTF CSF 10％(100nM) 体外
6BD+MNTF CSF 10％(100nM) 体外
7HD+MNTF CSF 10％(100nM) 体外
8PD+MNTF CSF 10％(100nM) 体外
9中风+MNTF CSF 10％(100nM) 体外
[0763] *括号指示MNTF的剂量。
[0764] 代码
[0765] “ALS”是指肌萎缩性侧索硬化。
[0766] “NP”是指神经性疼痛。
[0767] “MS”是指多发性硬化。
[0768] “AD”是指阿兹海默氏疾病。
[0769] “BD”是指Batten疾病。
[0770] “HD”是指亨廷顿氏疾病。
[0771] “PD”是指帕金森氏疾病。
[0772] “中风”是指脑缺血。
[0773] 结果
[0774] CSF在神经元细胞培养物中的研究。在神经元细胞损伤的体外模型中，评估CSF对神经元细胞死亡的作用。将CSF以占总体积10％加入到原代大鼠神经元细胞培养物中。通过显微镜分析和针对细胞死亡的MTT分析来测试细胞。
[0775] 显微镜分析
[0776] 用得自对照或多种神经紊乱供体的10％CSF处理神经元细胞培养物48小时，然后评估细胞损失。对照CSF对细胞存活不具有明显的作用，而使用得自神经紊乱的CSF来处理细胞则诱导了细胞死亡。
[0777] MTT分析
[0778] 为了测定在大鼠原代神经元细胞培养物中由CSF诱导的细胞损伤的百分比，采用MTT分析来分析培养物。如图18所示，与对照样品相比，得自对照患者的CSF没有诱导出任何合适的细胞死亡。但是，得自各种神经紊乱的CSF则诱导了细胞死亡，从而导致不同程度的细胞损伤(参见表17和图18)。如所述的图和表所示，MS诱导了最多的细胞损失(70％)，而NP则诱导了最少量的细胞死亡(32％)。这些数据表明，神经紊乱刺激或导致了能够诱导或加剧神经元细胞损失的化合物的释放。
[0779] 表17.由CSF诱导的神经元细胞损失
[0780]CSF 剂量 细胞存活的％(平均值±SD) P值(降低的％)
对照 10％ 92.00±9.181 0(0)
ALS 10％ 41.33±13.76 ＜0.0001(55)
NP 10％ 62.73±13.42 ＜0.0001(32)
MS 10％ 27.40±7.149 ＜0.0001(70)
AD 10％ 37.53±12.45 ＜0.0001(59)
BD 10％ 57.00±8.443 ＜0.0001(38)
HD 10％ 29.40±10.35 ＜0.0001(68)
PD 10％ 39.67±11.45 ＜0.0001(57)
中风 10％ 39.07±11.13 ＜0.0001(57.5)
对照 10％ 92.00±9.181 0(0)
ALS 10％ 41.33±13.76 ＜0.0001(55)
NP 10％ 62.73±13.42 ＜0.0001(32)
MS 10％ 27.40±7.149 ＜0.0001(70)
AD 10％ 37.53±12.45 ＜0.0001(59)
BD 10％ 57.00±8.443 ＜0.0001(38)
HD 10％ 29.40±10.35 ＜0.0001(68)
PD 10％ 39.67±11.45 ＜0.0001(57)
中风 10％ 39.07±11.13 ＜0.0001(57.5)
[0781] MNTF对神经元细胞培养物中的CSF的作用。在神经元细胞损伤的体外模型中，评估MNTF对神经元细胞死亡中的CSF的作用。在加入CSF之前2小时，将MNTF以100nM的量加入到细胞培养物中。将CSF以占总体积10％加入到原代大鼠神经元细胞培养物中。针对细胞死亡，通过显微镜分析和MTT分析对细胞进行检测。
[0782] 显微镜分析
[0783] 将神经元细胞培养物用100nM的MNTF处理2小时，然后加入得自对照或各种神经紊乱的10％的CSF，持续48小时，再对细胞损失进行评估。在细胞经历CSF前处理的条件下，MNTF对细胞存活具有明显的作用。
[0784] MTT分析
[0785] 为了测定在经CSF处理的大鼠原代神经元细胞培养物中由MNTF诱导的细胞保护的百分比，采用MTT分析来分析培养物。如图2所示，在由得自对照神经紊乱患者的CSF所诱导的细胞死亡中，MNTF对神经元细胞培养物提供了一定水平的保护作用(参见表18和图19)。如图19和表18所示，MNTF增强细胞存活，在HD的CSF中最多(271％)，在MS(246％)、Stroke(205％)、Parkinson(198％)、Alzheimer(191％)和ALS(175％)的CSF中显著，而MNTF在BD的CSF中增强细胞存活最少(114％)。这些数据表明，MNTF能够保护神经元细胞对抗由神经紊乱患者的CSF所刺激的细胞死亡。
[0786] 表18.由MNTF引起的神经元细胞保护作用
[0787]CSF 剂量 细胞存活％ P值
(平均值±SD) (减小％(↓)或者增加％(↑))
对照 10％ 92.00±9.181 0(0)
ALS 10％ 41.33±13.76 ＜0.0001(55↓)
ALS+MNTF 10％+100nM 72.33±10.83 ＜0.0001(175↑)
NP 10％ 62.73±13.42 ＜0.0001(32↓)
NP+MNTF 10％+100nM 75.47±13.22 ＜0.014(120↑)
MS 10％ 27.40±7.149 ＜0.0001(70↓)
MS+MNTF 10％+100nM 67.33±11.65 ＜0.0001(246↑)
AD 10％ 37.53±12.45 ＜0.0001(59↓)
AD+MNTF 10％+100nM 71.53±10.81 ＜0.0001(191↑)
BD 10％ 57.00±8.443 ＜0.0001(38↓)
BD+MNTF 10％+100nM 65.20±11.04 ＜0.03(114↑)
HD 10％ 29.40±10.35 ＜0.0001(68↓)
HD+MNTF 10％+100nM 79.80±8.768 ＜0.0001(271↑)
PD 10％ 39.67±11.45 ＜0.0001(57↓)
PD+MNTF 10％+100nM 78.53±8.806 ＜0.0001(198↑)
中风 10％ 39.07±11.13 ＜0.0001(57.5↓)
中风+MNTF 10％+100nM 80.07±8.548 ＜0.0001(205↑)
(平均值±SD) (减小％(↓)或者增加％(↑))
对照 10％ 92.00±9.181 0(0)
ALS 10％ 41.33±13.76 ＜0.0001(55↓)
ALS+MNTF 10％+100nM 72.33±10.83 ＜0.0001(175↑)
NP 10％ 62.73±13.42 ＜0.0001(32↓)
NP+MNTF 10％+100nM 75.47±13.22 ＜0.014(120↑)
MS 10％ 27.40±7.149 ＜0.0001(70↓)
MS+MNTF 10％+100nM 67.33±11.65 ＜0.0001(246↑)
AD 10％ 37.53±12.45 ＜0.0001(59↓)
AD+MNTF 10％+100nM 71.53±10.81 ＜0.0001(191↑)
BD 10％ 57.00±8.443 ＜0.0001(38↓)
BD+MNTF 10％+100nM 65.20±11.04 ＜0.03(114↑)
HD 10％ 29.40±10.35 ＜0.0001(68↓)
HD+MNTF 10％+100nM 79.80±8.768 ＜0.0001(271↑)
PD 10％ 39.67±11.45 ＜0.0001(57↓)
PD+MNTF 10％+100nM 78.53±8.806 ＜0.0001(198↑)
中风 10％ 39.07±11.13 ＜0.0001(57.5↓)
中风+MNTF 10％+100nM 80.07±8.548 ＜0.0001(205↑)
[0788] MNTF为这样的营养因子，其能够提供保护从而免于神经疾病，并且可以使神经元组织在损伤或移植后再生。在此所进行的研究证明了MNTF(GM6)的6氨基酸类似物保护对抗神经紊乱CSF对神经元损伤的有害作用的能力。在多数情况下，体外应用100nM的GM6证明了对神经元细胞的保护作用。这表明，GM6具有对抗多种神经紊乱的保护作用。
[0789] 当在体外施用至神经元细胞时，发现GM6具有对抗得自神经疾病的CSF的保护作用。
[0790] 实施例7
[0791] MS模型
[0792] 在小鼠多发性硬化(MS)模型中测试GM6(CS Bio Co.，Menlo Park，CA)的效力。为了测定GM6在MS中的效力，向小鼠注射髓鞘蛋白脂蛋白(PLP)以诱导MS，然后静脉内注射若干剂量的GM6以测定对减轻MS的影响。对静脉内(i.v.)施用的7个剂量(每天一次)的GM6(1，5，10或20mg/kg)进行测试。在这些小鼠中，施用GM6证明了呈剂量依赖方式的减轻MS，并且其中20mg/kg的剂量显示出最大的效力。临床和组织学分析都证明了减轻，表明了GM6在MS中的独特作用。这些数据表明，在i.v.注射后的MS小鼠模型中，GM6是有效的，并且可以是MS患者的有效治疗方法。
[0793] 用于本实施例的缩写/术语。
[0794] “MNTF”是指运动神经元营养因子。
[0795] “GM6”和“6聚体”均是指MNTF的示例性6个氨基酸的肽类似物。
[0796] “MS”是指多发性硬化。
[0797] “EAE”是指实验性自体免疫脑脊髓炎。
[0798] “PLP”是指髓鞘蛋白脂蛋白。
[0799] “Genervon”和“GB”分别是指Genervon Biopharmaceuticals，LLC。
[0800] “I.V.”是指静脉内。
[0801] 本实验的设计将对运动神经元营养因子(MNTF)的6氨基酸类似物(GM6)的能力进行评估，以测定GM6在多发性硬化的小鼠模型中的效力。GB测试制品为合成的6个氨基酸肽(MNTF)(CS Bio Co.，MenloPark，CA)。
[0802] 评估通过静脉内注射的GM6在MS小鼠模型中的效力
[0803] 方法和材料
[0804] 研究设计。按照上文所述向雌性SJL/J小鼠注射PLP，并检测指示剂量的GM6对由EAE诱导的MS所产生的保护作用。针对临床表现和组织学变化对动物进行检测。
[0805] 实验性自体免疫脑脊髓炎(EAE)的诱导。在本实验中，使用雌性SJL/J小鼠(8-10周龄，the Jackson Laboratory)。使用EAE诱导和处理髓鞘蛋白脂蛋白(PLP)(p139-151，HSLGKWLGHPDKF，SynPepCorporation)用于免疫。在雌性SJL/J小鼠中，通过皮下注射溶解于弗氏完全佐剂中的25μg的PLP来诱导EAE(CFA，DifcoLaboratories)。在免疫的当天和48h之后，将溶于磷酸缓冲盐水(PBS)中的200ng的百日咳毒素(PT，List Biological laboratories，Inc)注射到小鼠的尾静脉中。
[0806] MNTF的施用。将小鼠随机分成以下几组：MNTF处理组(n＝10/组)：在临床症状发作(评分≥1)的当天开始，在连续7天内静脉内施用MNTF，这使得该处理方案具有临床相关性。根据初步研究，MNTF的剂量为1、5、10或20mg/kg。EAE对照组(n＝10)：使用与实验组相同体积的盐水来对EAE小鼠进行处理。
[0807] 临床观察。针对EAE的临床迹象每天观察小鼠，并且每2天对小鼠称重。如下确定临床评分：0，未发现EAE迹象；1，受到影响的尾强直；2，尾瘫痪；3，后肢中度瘫痪；4，后肢重度瘫痪；5，一支后肢瘫痪；6，后肢完全瘫痪；7，后肢完全瘫痪和前肢轻瘫；以及8，死亡。
[0808] 就临床EAE评价而言，使用以下参数：对每只动物而言，发作当天被定义为首次表现出EAE症状的那一天。按照以下方法计算EAE持续时间：每只动物被评分为疾病的天数除以评分的总天数，并以百分比的形式表示。累积发病率定义为在实验期间产生EAE的动物的百分比。就每只动物而言，在实验期间的平局评分计算为所有单次评分的总和除以测量的次数。就每只动物而言，在实验期间，最大评分被定义为最高的临床评分。如果在实验的整个过程中，小鼠死于EAE，则在所有以后的时间点都将这些小鼠指定为8分。如果小鼠在清楚地发作EAE症状之前死亡，则将这些小鼠从实验中排除。在整个实验过程中，所有的动物(包括严重EAE影响的动物)都自由进食和进水。
[0809] 组织学。20天后取出脑和脊髓，并在10％的缓冲的福尔马林(Sigma)中固定。将石蜡包埋切片(6μm厚)用H&E染色，从而评估脑和脊髓中的病变数量。对这些进行评分和记录。
[0810] 统计分析。将结果以平均值±标准偏差(SD)来表示。采用t检验来分析数据的差异显著性。
[0811] 所述研究中动物的排除。基于以下若干标准从研究中排除动物：
[0812] 在研究结束前(在任何时间点上)死亡的动物；
[0813] 在施用测试制品后产生严重并发症的动物。
[0814] 处理组。所有的组都经历GM6或者作为对照。将载体或MNTF以指示的剂量经尾静脉对动物(50只动物)静脉内推注给药。
[0815] 小鼠MS模型。
[0816]组别 化合物 剂量(mg/kg) 途径
SJL雌性小鼠
1(n＝10只小鼠) 载体 0 IV
2(n＝10只小鼠) MNTF 1mg/kg/天 IV
3(n＝10只小鼠) MNTF 5mg/kg/天 IV
4(n＝10只小鼠) MNTF 10mg/kg/天 IV
5(n＝10只小鼠) MNTF 20mg/kg/天 IV
SJL雌性小鼠
1(n＝10只小鼠) 载体 0 IV
2(n＝10只小鼠) MNTF 1mg/kg/天 IV
3(n＝10只小鼠) MNTF 5mg/kg/天 IV
4(n＝10只小鼠) MNTF 10mg/kg/天 IV
5(n＝10只小鼠) MNTF 20mg/kg/天 IV
[0817] 结束
[0818] 对小鼠中MS的调节
[0819] 将所有的测试组都提供给NTS；将GM6以固体材料的形式提供给NTS。测试组中所有的动物都如上指示给药。
[0820] 结果
[0821] 临床评分。对GM6在MS小鼠模型中的效力进行评估。数据得自i.v.施用载体或GM6(以所述的剂量)的小鼠。
[0822] 临床分析
[0823] GM6：在PLP诱导MS后，对小鼠施用指示剂量的GM6(参见图23)。从第0天开始每隔一天对动物进行一次检测，以测定动物的临床评分。在注射PLP的当天开始，在7天中，每天都向小鼠注射GM6。如图23所示，使用载体处理的小鼠显示临床评分明显增大。使用GM6进行治疗显示所述疾病明显改善(减轻)(参见图23)。5、10和20mg/kg的GM6显示是明显有利的，而1mg/kg的GM6却没有显示出任何复原。表20示出了在使用GM6处理后产生急性疾病的小鼠的数量。如表20所示，10和20mg/kg显示急性疾病小鼠的总数减少，但是慢性疾病小鼠的总数则没有减少。
[0824] 表19.与载体处理动物相比，GM6施用的显著性
[0825]处理 P值
载体 NA
GM6(1mg/kg) NA
GM6(5mg/kg) ＜0.01
GM6(10mg/kg) ＜0.001
GM6(20mg/kg) ＜0.001
载体 NA
GM6(1mg/kg) NA
GM6(5mg/kg) ＜0.01
GM6(10mg/kg) ＜0.001
GM6(20mg/kg) ＜0.001
[0826] 表20.具有临床迹象的小鼠/小鼠的总数(％)-急性疾病
[0827]处理 P值
载体 10/10(100％)
GM6(1mg/kg) 10/10(100％)
GM6(5mg/kg) 10/10(100％)
GM6(10mg/kg) 7/10(70％)
GM6(20mg/kg) 0/10(0％)
载体 10/10(100％)
GM6(1mg/kg) 10/10(100％)
GM6(5mg/kg) 10/10(100％)
GM6(10mg/kg) 7/10(70％)
GM6(20mg/kg) 0/10(0％)
[0828] 表21.具有临床迹象的小鼠/小鼠的总数(％)-慢性疾病
[0829]处理 P值
载体 10/10(100％)
GM6(1mg/kg) 10/10(100％)
GM6(5mg/kg) 10/10(100％)
GM6(10mg/kg) 10/10(100％)
GM6(20mg/kg) 10/10(100％)
载体 10/10(100％)
GM6(1mg/kg) 10/10(100％)
GM6(5mg/kg) 10/10(100％)
GM6(10mg/kg) 10/10(100％)
GM6(20mg/kg) 10/10(100％)
[0830] 死亡率：本研究中没有发生死亡。
[0831] 病变数量：脑和脊髓中的病变数量通过计数来测定，并示于图24A和24B中。随着GM6剂量的增加，脑和脊髓中的病变数量减少。这表明，GM6保护脑和脊髓免于受到MS诱导的有害作用。
[0832] 表22.
[0833] 区域 剂量 病变# P值 差异％
[0834] (mg/kg) 平均值±SD
[0835] 脑 0 69.20±10.99 NA NA
[0836] 1 62.30±9.202 0.1454 -10
[0837] 5 45.00±8.367 ＜0.0001 -35
[0838] 10 24.90±6.871 ＜0.0001 -64
[0839] 20 22.40±6.687 ＜0.0001 -68
[0840] 脊髓 0 59.90±9.098 NA NA
[0841] 1 55.20±8.817 0.2560 -8
[0842] 5 36.90±7.385 ＜0.0001 -38
[0843] 10 24.50±6.671 ＜0.0001 -59
[0844] 20 19.90±8.517 ＜0.0001 -67
[0845] MNTF为这样的营养因子，其能够提供保护从而免于神经疾病，并且可以使神经元组织在损伤或移植后再生。在此所进行的研究证明了MNTF(GM6)的6氨基酸类似物减轻小鼠模型中MS的效力。经7天静脉内施用推注剂量为1、5、10或20mg/kg的GM6证明了在MS临床评分和组织学中呈剂量依赖方式的减小。这表明，通过静脉内施用，GM6在限定小鼠MS程度方面的有效性，并且可以有利于治疗该疾病。
[0846] 当进行静脉内施用时，发现GM6在MS小鼠模型中是有效的。GM6的效力是剂量依赖方式的，这表明GM6有利于治疗MS。
[0847] 实施例8
[0848] 在中脑动脉阻塞的小鼠模型中测试GM602(MNTF6聚体)。
[0849] 在中脑动脉阻塞(MCAO)的小鼠模型中测试GenervonBiopharmaceuticals，LLC测试制品GM602的效力。为了测定GM602在MCAO小鼠模型中的效力，使小鼠经历1小时的缺血和14天的再灌注。在再灌注开始后的0、3、6、12和24小时，经尾静脉推注向小鼠静脉内注射GM602，并检测在脑血流量(CBF)、心率(HR)、血压(BP)、pO2、pCO2，pH、神经缺损(ND)和梗塞体积(IFV)方面的变化。检测在缺血后的指定时间以及在3天中的每一天都静脉内(i.v.)施用GM602(5mg/kg)的神经保护作用。施用GM602证明在CBF、HR、BP、pO2、pCO2、或pH方面没有发生变化。在ND和IFV中检测变化，其是时间依赖性的。在0、3、6和12小时，5mg/kg的GM602显示出显著保护作用免于梗塞损害，这解释了对神经缺损的保护作用。这些数据表明，在MCAO小鼠模型中，在i.v.注射后GM602对脑具有神经保护作用。
[0850] 缩写/术语
[0851]缩写/术语 定义
MNTF 运动神经元营养因子
MNTF6聚体 MNTF的6氨基酸肽类似物
GM602 用于中风的MNTF的6氨基酸肽类似物
MCAO 中脑动脉阻塞
GB Genervon Biopharmaceuticals LLC
I.V. 静脉内
CBF 脑血流量
HR 心率
BP 血压
ND 神经缺损
IFV 梗塞体积
MNTF 运动神经元营养因子
MNTF6聚体 MNTF的6氨基酸肽类似物
GM602 用于中风的MNTF的6氨基酸肽类似物
MCAO 中脑动脉阻塞
GB Genervon Biopharmaceuticals LLC
I.V. 静脉内
CBF 脑血流量
HR 心率
BP 血压
ND 神经缺损
IFV 梗塞体积
[0852] 对GB测试制品GM602(其为运动神经元营养因子的6氨基酸肽类似物(MNTF6聚体；FSRYAR))保护脑免于受到急性缺血和再灌注损伤的能力进行测试。GM602在P认证下化学合成(CS Bio Co.，Menlo Park，CA，GMP013，lot C811)。将GM602以固体的形式提供，并由此制备制剂(其为储存在4℃下的溶液)。
[0853] 方法和材料
[0854] 动物
[0855] 在实验前，使重量为22-25克的C57BL/6小鼠(JacksonLaboratory，Bar Harbor，ME)均自由进食和进水。使用氟烷来麻醉动物(70％/30％NO2/O2中1％的氟烷，通过面罩麻醉)。通过尾套装置监测平均动脉血压(MABP)，并收集血液样品，从而测定动脉pH水平、以及PaCO2和PaO2。使用Visitech System血压监测仪记录MABP和心率。
[0856] 使用插入到颞肌肌肉中的直肠温度计和热敏探针来监测脑的温度。通过使用带有水套的加热垫，将动物的体温保持在37℃。在缺血前的1小时至缺血后的6小时监测脑的温度，并每隔30分钟记录一次。
[0857] 实验组
[0858] 所有的动物都经历了1.0h的缺血及24h的再灌注，并将动物随机分成载体组(n＝10)，或静脉内注射了剂量为5mg/kg的GM602的处理组(n＝10)。NTS通过使用储存在4℃下的(100％)盐水溶液重构GM602来配制GM6(CS Bio Co.，Menlo Park，CA，CS1507，GMP013，lot C811)作为原液。载体对照接受盐水溶液。在再灌注开始后的0、3、6、12和24小时、以及损失后的三天中的每一天(损伤后)都通过尾进行IV推注GM602。研究者对处理组是盲的。
[0859] 缺血的诱导
[0860] 本研究涉及缺血的瞬时模型。对每只小鼠都进行麻醉，并分离出颈外动脉(ECA)和颈总动脉(CCA)。将热敏探针插入到直肠和颞肌肌肉中，从而监测肌体和脑的温度，其中通过外部加热，将所述的温度保持在36-37℃。通过颈部正中切口使左侧颈总动脉(CCA)暴露出来。对甲状腺上动脉和枕动脉进行电凝集并分开。将显微手术夹放置在颈外动脉(ECA)起源的周围。将ECA的远端用6-0丝绑结，并横切。将6-0丝松散地系在ECA残端的周围。移开所述的手术夹，并将5-0尼龙缝合线(涂有有机硅)的经烧边的尖端温和地插入到ECA残端中。将环状的6-0丝系紧在所述残端的周围，并且使尼龙缝合线进入并通过颈外动脉(ICA)中大约13mm(根据体重进行调节)，直至所述的缝合线停留在前大脑动脉(ACA)中，由此阻塞了前交通动脉和中脑动脉。在将尼龙缝合线放置1小时后，其被拉回到ECA中，并封闭切口。
[0861] 组织学检测
[0862] 关于组织学检测，在诱导缺血之后的14天，采用腹膜内注射戊巴比妥钠(50mg/kg)来麻醉动物。采用穿心灌注的方式，使用4℃的10％的磷酸盐缓冲盐水(PBS)对脑进行灌注。取出所述的脑，并将其在-20℃下冷冻15分钟，然后再放置到啮齿动物脑矩阵中。制备冠状切片(1mm厚)，并将其在37℃下用2％的氯化三苯基四氮唑(TTC)染色。由各脑获得由梗塞的前缘直至尾部范围的7个连续的1mm厚冠状切片，其中所述的梗塞距额极2mm开始。将经TTC染色的切片放置在10％中性的缓冲福尔马林中，并在黑暗状态下，在4℃下保持至少24小时。使用计算机辅助的图像分析系统测定各切片中的梗塞的面积，其中所述的计算机辅助图像分析系统由装配有Quick Capture图像采集卡的Power Macintosh计算机、安装在Olympus显微镜上的Hitachi CCD照相机、以及照相机支架构成。使用NIH Image Analysis Software，v.1.55。获取图像，并在7个切片上测定损害的总面积。由对治疗状态为盲的单个操作者进行所有的测量。通过对切片的梗塞体积求和来计算梗塞体积。通过采用以下能够消除水肿影响的公式来计算梗塞的尺寸(％)：(对侧体积-同侧未损伤的体积)×100/对侧体积。
[0863] 脑血流量的测量
[0864] 通过使用激光多普勒血流仪监测脑血流量(CBF)。CBF值以百分比的形式测定，这是因为由激光多普勒血流仪显示的值并非为绝对值。如上文所述，使用氟烷来麻醉动物(70％/30％NO2/O2中的1％氟烷，通过面罩麻醉)。在与MCA阻塞同侧的脑半球中，坐标如下：点A，前囱点后0.5mm、中线侧部2mm；点B，前囱点后1mm、中线侧部1.2mm；点D，前囱点后1mm、中线侧部1.7mm；点C，在对侧半球中，前囱点后1mm、距中线2mm。在缺血发作前测定CBF，并在灌注结束后的2小时持续测量。在注射化合物之前和注射之后进行测定(在缺血前15分钟、至注射结束后30分钟内进行连续的测量，并且每30分钟记录一次)。将MCA阻塞后且在施用前的平均值作为基线值，此后的数据以基线值的百分比表示。
[0865] 行为评估
[0866] 在缺血损伤之前和之后的小鼠中测定行为分析(神经缺损)情况。神经学评分如下：0，正常的运动功能；1，当通过尾巴将动物提起来时，躯干和对侧前肢弯曲；2，当通过尾巴将动物按在平面上时，会发生对侧偏转，但在休息时保持正常的姿态；3，在休息时发生对侧倾斜；4，没有自发运动活性。
[0867] 所述研究中动物的排除
[0868] 基于以下若干标准从研究中排除动物：
[0869] 在研究结束前(在任何时间点上)死亡的动物。将至死亡时收集的数据提供给GB；
[0870] 在阻塞后脑血流量没有降低至基线值的20±5％(即，被认为为非缺血)，或者是血流量没有恢复至基线值的90±10％的动物；
[0871] 在缺血损伤后发展出癫痫状行为的动物；
[0872] 在缺血过程中或缺血后片刻，检测到过量出血的动物。
[0873] 统计分析
[0874] 将结果表示成平均值±标准偏差(SD)。采用单因素协方差分析(ANOVA)、再通过Fisher精确检验(Fisher′s post hoc test)来分析生理学和组织学数据中的差异显著性。在监测数据基础上计算重复测量的ANOVA，再通过Fisher精确检验评价多组中的差异显著性。
[0875] 处理组。
[0876] 所有的组都经历GM602或者作为对照。以IV给药方式给予动物(30只动物)以指示剂量的载体或GM602。
[0877] 小鼠中风模型
[0878]组别 化合物 剂量(mg/kg) 途径
1(n＝10只小鼠) 载体 0 IV
2(n＝10只小鼠) MNTF 在缺血后0分钟，5mg/kg IV
3(n＝10只小鼠) MNTF 在缺血后3小时，5mg/kg IV
4(n＝10只小鼠) MNTF 在缺血后6小时，5mg/kg IV
5(n＝10只小鼠) MNTF 在缺血后12小时，5mg/kg IV
6(n＝10只小鼠) MNTF 在缺血后24小时，5mg/kg IV
1(n＝10只小鼠) 载体 0 IV
2(n＝10只小鼠) MNTF 在缺血后0分钟，5mg/kg IV
3(n＝10只小鼠) MNTF 在缺血后3小时，5mg/kg IV
4(n＝10只小鼠) MNTF 在缺血后6小时，5mg/kg IV
5(n＝10只小鼠) MNTF 在缺血后12小时，5mg/kg IV
6(n＝10只小鼠) MNTF 在缺血后24小时，5mg/kg IV
[0879] 结束
[0880] MNTF对缺血和再灌注损伤的神经保护作用。针对脑血流量(CBF)、心率(HR)、血压(BP)、pO2、pCO2、pH、神经缺损(ND)和梗塞体积(IFV)来评价动物。
[0881] 将所有的测试组都提供给NTS；将GM602以固体材料的形式提供给NTS。测试组中所有的动物都如上文指示给药。
[0882] 结果
[0883] 小鼠中缺血的研究。对这些研究中的缺血的相对严重性进行评估。数据得自患有缺血损伤的小鼠，其中所述的小鼠静脉内注射载体或GM602。
[0884] 梗塞体积：与载体注射组相比，在GM602组(0、3、6和12小时)中，脑中梗塞体积明显减小。GM602显示出在缺血后的0至12小时使梗塞体积呈剂量依赖性地减小(参见表1)。梗塞体积示于图26中。在脑中梗塞体积减小的百分比示于表23中。如表所示，在0、
3、6和12小时的GM602显示出使梗塞尺寸减小70％、68％、58％和36％。24小时梗塞体积虽然减小，但是与载体处理动物相比没有显示出显著性差异。
3、6和12小时的GM602显示出使梗塞尺寸减小70％、68％、58％和36％。24小时梗塞体积虽然减小，但是与载体处理动物相比没有显示出显著性差异。
[0885] 表23.脑中梗塞减小的百分比
[0886]组别 剂量(mg/kg) 梗塞体积(mm3) 梗塞体积减小的百分比* P值*
1 0 74.26±12.09 0 NA
2 5 22.05±7.292 70.3％ 0.001
3 5 24.15±8.110 67.5％ 0.001
4 5 31.03±9.255 58.2％ 0.001
5 5 47.72±9.118 35.7％ 0.001
6 5 64.13±12.51 13.4％ 0.0821
1 0 74.26±12.09 0 NA
2 5 22.05±7.292 70.3％ 0.001
3 5 24.15±8.110 67.5％ 0.001
4 5 31.03±9.255 58.2％ 0.001
5 5 47.72±9.118 35.7％ 0.001
6 5 64.13±12.51 13.4％ 0.0821
[0887] 减小的百分比与各自载体对照动物相比。
[0888] *与组1(载体)相比。
[0889] 死亡率：在本研究中未发生死亡。
[0890] 生理学参数。在缺血期间或者再灌注之后，载体小鼠和经治疗的小鼠之间，生理学参数(脑血流量、平均动脉血压、血液pO2、pCO2和pH)不具有显著性差异，均为基线值(参见图27-31)。
[0891] 行为测定。基于0至4的分值，针对神经缺损对动物进行评估。使用GM602处理的动物显示出神经缺损呈剂量依赖方式的减小(数据同样示于图32中)。
[0892] 表24
[0893]化合物(组) 神经缺陷 与载体相比的p值
1-载体 3.600±0.163 NA
2-GM602 1.200±0.200 P＝0.001
3-GM602 1.667±0.167 P＝0.001
4-GM602 1.800±0.133 P＝0.001
5-GM602 2.500±0.167 P＝0.002
6-GM602 3.200±0.200 P＝0.1387
1-载体 3.600±0.163 NA
2-GM602 1.200±0.200 P＝0.001
3-GM602 1.667±0.167 P＝0.001
4-GM602 1.800±0.133 P＝0.001
5-GM602 2.500±0.167 P＝0.002
6-GM602 3.200±0.200 P＝0.1387
[0894] 在美国，中风是死亡的第三大常见原因，并且是造成残疾的主要原因。局灶性脑缺血造成的结果和所形成的梗塞的尺寸可以通过“坏死性”(细胞凋亡)细胞死亡情况以及通过在缺血边缘带中延迟的神经元细胞损失(程序性细胞死亡或细胞凋亡)情况来测定。近期出现的疗法用于治疗缺血性中风，但是，一旦神经元细胞死亡循环被引发，这些治疗方法通常涉及溶解血液凝块，但不会发挥神经保护、或者减小行为缺损或脑梗塞体积的作用。理解影响细胞损失的基础机制将有助于减小与缺血性损伤有关的细胞死亡的药物的设计和应用。
[0895] MNTF为这样的营养因子，其能够提供保护从而免于神经疾病，并可以在发生损伤或缺血性中风后使神经元组织再生。本发明所进行的研究在此证明了GM602(MNTF的6氨基酸类似物)能够以有效且高效的方式保护脑免于受到由脑缺血和再灌注损伤而造成的有害作用的能力。在缺血损伤后在各时间静脉内施用5mg/kg的GM602证明了通过减小梗塞体积和行为性质而在脑中产生对抗缺血/再灌注损伤的、呈时间依赖性的保护作用。这些研究表明，GM602在中风中具有有利的作用。
[0896] 当静脉内施用时，发现GM602在小鼠中具有对抗缺血/再灌注损伤的神经保护作用。
[0897] 实施例9
[0898] 在永久性中脑动脉阻塞的大鼠模型中测试GM602(MNTF6聚体)。
[0899] 在永久性中脑动脉阻塞(MCAO)的大鼠模型(Kindy，Study#2CStroke)中测定Genervon Biopharmaceuticals，LLC测试制品GM602的效力。为了测定GM602在MCAO大鼠模型中的效力，使大鼠经历28天的永久性缺血。在缺血开始后的3小时，经尾静脉向大鼠静脉内推注GM602。针对在脑血流量(CBF)、心率(HR)、血压(BP)、pO2、pCO2、pH、神经缺损(ND)和梗塞体积(IFV)方面的变化对大鼠进行检测。虽然施用GM602证明在HR、BP、pO2、pCO2或pH方面没有发生变化，但是在缺血后3小时施用GM602证明CBF增大。更重要的是，在施用GM602之后，观察到ND、IFV、TNF(发炎的生物标志物)和Fluoro-Jade(神经元退行性病变的生物标志物)以剂量依赖方式显著降低。当进行施用时，IV注射2.5、10或20mg/kg的GM602会显示出明显的保护作用从而免于受到梗塞损害，这解释了对神经缺损的保护作用。这些数据表明，在MCAO的永久性大鼠模型中，在缺血过程中IV注射GM602对脑具有神经保护作用。在缺血发作后的3小时用GM602进行处理证明了保护作用，并且有利于临床试验。
[0900] 缩写/术语
[0901]缩写/术语 定义
MNTF 运动神经元营养因子
MNTF6聚体 MNTF的6个氨基酸的肽类似物
GM602 用于中风的MNTF的6个氨基酸肽类似物FSRYAR
MCAO 中脑动脉阻塞
GB Genervon Biopharmaceuticals LLC
I.V. 静脉内
CBF 脑血流量
HR 心率
BP 血压
ND 神经缺陷
IFV 梗塞体积
NS 不具有统计学显著性
MNTF 运动神经元营养因子
MNTF6聚体 MNTF的6个氨基酸的肽类似物
GM602 用于中风的MNTF的6个氨基酸肽类似物FSRYAR
MCAO 中脑动脉阻塞
GB Genervon Biopharmaceuticals LLC
I.V. 静脉内
CBF 脑血流量
HR 心率
BP 血压
ND 神经缺陷
IFV 梗塞体积
NS 不具有统计学显著性
[0902] 利用现有的数据，决定在永久性中脑动脉阻塞(MCAO)大鼠模型中，对GB测试制品GM602(其为运动神经元营养因子的6氨基酸肽类似物(MNTF6聚体))保护脑免于受到慢性缺血损伤的能力进行测试。GM602在GMP认证下化学合成(CS Bio Co.，Menlo Park，CA，lot D294)。
[0903] 方法和材料
[0904] 动物
[0905] 在试验前，使重量为225-250克的Sprague-Dawley大鼠(Harlan)均自由进食和进水。使用氟烷来麻醉动物(70％/30％NO2/O2中的1％氟烷，通过面罩麻醉)。收集血液样品，从而测定动脉pH水平以及PaCO2和PaO2。使用Visitech System血压监测仪记录MABP和心率。
[0906] 使用插入到颞肌肌肉中的直肠温度计和热敏探针来监测脑的温度。通过使用带有水套的加热垫，将动物的体温保持在37℃。在缺血前的1小时至缺血后的6小时监测脑的温度，并每隔30分钟记录一次。
[0907] 实验组
[0908] 所有的大鼠都经历了永久性缺血。将动物随机分成载体组(n＝10)，或静脉内注射了剂量为2.5、10或20mg/kg的GM602的三个处理组(n＝10)中的任一组中。在缺血发作后的3小时经尾静脉给予IV推注。研究者对处理组是盲的。由NTS配制GM6，其使用储存在4℃下的标准盐水溶液重构GM6来作为原液。载体对照接受盐水溶液。
[0909] 缺血的诱导
[0910] 本研究涉及缺血的永久性模型。对每只大鼠都进行麻醉，并分离出颈外动脉(ECA)和颈总动脉(CCA)。将热敏探针插入到直肠和颞肌肌肉中，从而监测肌体和脑的温度，其中通过外部加热，使大鼠保持在36-37℃。通过颈部正中切口使左侧颈总动脉(CCA)暴露出来。对甲状腺上动脉和枕动脉进行电凝集并分开。将显微手术夹放置在颈外动脉源(ECA)的周围。将ECA的远端用6-0丝绑结，并横切。将6-0丝松散地系在ECA残端的周围。移开所述的手术夹，并将5-0尼龙缝合线(涂有有机硅)的经烧边的尖端温和地插入到ECA残端中。将环状的6-0丝系紧在所述残端的周围，并且使尼龙缝合线进入并通过颈外动脉(ICA)中大约17mm(根据体重进行调节)，直至所述的缝合线停留在前大脑动脉(ACA)中，由此阻塞了前交通动脉和中脑动脉。在使用手术吻合器插入尼龙缝合线后即刻封闭伤口。使所述的缝合线保持放置28天。
[0911] 组织学检测
[0912] 关于组织学检测，在诱导缺血之后的28天，采用腹膜内注射戊巴比妥钠(50mg/kg)来麻醉动物。采用穿心灌注的方式，使用4℃的10％的磷酸盐缓冲盐水(PBS)、然后4％的多聚甲醛(4℃)对脑进行灌注。取出脑，将其在4％的多聚甲醛中过夜固定，然后再在4℃下30％的蔗糖中固定24小时。将所述的组织包埋到OCT培养基中，并在干冰上冷冻(储存在-80℃)。这些组织用于组织和免疫细胞化学分析。在缺血发作后28天收集脑，将其冷冻，然后切成16μm的切片。使用苏木精和曙红对冠状切片进行染色，从而清晰地描绘出缺血损伤的程度。通过对在16-μm染色的冠状切片(由各脑的前囱点点+2.46、+1.66、+0.86、+0.06、0.74、1.54、2.34和3.14mm收集得到)上的损伤面积进行积分，来计算梗塞体积。使用计算机辅助的图像分析系统(NIH IMAGE，Version 1.6)，对脑皮层、纹状体(striatal)和海马趾梗塞总体积进行定量。由对治疗状态为盲的单个操作者进行所有的测量。通过对切片中梗塞体积求和来计算梗塞体积。通过采用以下能够消除水肿影响的公式来计算梗塞的尺寸(％)：(对侧体积-同侧未损伤的体积)×100/对侧体积。
[0913] 脑血流量的测量
[0914] 通过使用激光多普勒血流仪监测脑血流量(CBF)。CBF值以百分比的形式测定，这是因为由激光多普勒血流仪显示的值并非为绝对值。如上文所述，使用氟烷来麻醉动物(70％/30％NO2/O2中的1％氟烷，通过面罩麻醉)。在与MCA阻塞同侧的脑半球中，坐标如下：点A，前囱点后0.5mm、中线侧部2mm；点B，前囱点后1mm、中线侧部1.2mm；点D，前囱点后1mm、中线侧部1.7mm；点C，在对侧半球中，前囱点后1mm、距中线2mm。在缺血发作前、在诱导缺血后3小时但在施用测试制品之前、以及在施用测试制品之后1小时，测定CBF。将MCA阻塞前的平均值作为基线值，此后的数据以基线值的百分比表示。
[0915] 行为评估
[0916] 在缺血损伤之前，每天都对动物处理10min，持续3天。在损伤之前的当天，针对行为变化对动物进行检测。
[0917] 所有的行为测试都是在中风手术片刻之前、以及在施用测试制品之后的28天进行。在测试开始之前，在各阶段都使动物在测试房间里适应30min。
[0918] 前肢放置测试——针对各个前肢得到单独的评分。就视觉放置的子测试而言，测试者将动物垂直把握，并使其接近桌面。正常放置在桌子上的一肢得0分；延迟放置(＜2s)的得1分；而没有放置或非常延迟放置(＞2s)的得2分。首先，当将所述的动物向桌子的前方拉拽、接着将所述的动物向桌子的一侧拉拽时，从而得到单独的评分(每一肢的最大评分，4；分数越高表示缺陷越重)。就触觉放置的子测试而言，把握住动物，使其不能看见或者用其胡须接触到桌面上。当将所述的动物向桌子的前方拉拽、接着向桌子的一侧拉拽时，都使前爪轻轻地接触桌面。按照上文的标准(每一肢的最大评分，4)，对每一次放置评分。就本体放置的子测试而言，仅将动物向前方拉拽，并向前爪施加更大的压力；按照上文对放置评分(每一肢的最大评分，2)。将这些子评分加起来，从而得到每一肢前肢放置的总评分(范围为0-10)。
[0919] 后肢放置测试——按照与上述前肢相同的方式实施后肢放置测试，但是仅包括触觉和本体的子测试(最大评分分别为4和2；总分范围为0-6)。
[0920] 改进的平衡木测试——改进的平衡木测试检测了前庭运动反射(vestibulomoter reflex)活性，其为使动物在狭窄的平衡木(30×1.3cm)上保持60秒钟。在平衡木上的平衡能力按照如下标准评分：动物以所有四只爪子都保持在平衡木的顶部的方式达到平衡，1；动物将爪子放置在平衡木的一侧或者在平衡木上晃动，2；有一肢或两肢从平衡木上滑落，3；有三肢从平衡木上滑落，4；动物试图用爪子在平衡木上保持平衡，但是跌落，5；动物伸出了平衡木，然后跌落，6；动物未尝试平衡而由平衡木上跌落，7。在手术前，动物接受了三个训练试验；将这些分值中最后的评分作为基线评分。
[0921] 自发运动活性——在手术前的当天、以及手术后的一周时，将动物放置在狭窄的玻璃筒(16.5×25cm)中，并录像10min。对动物的自发运动评分。如下评分：0，没有运动；1，几乎没有或者没有进行探测(有限的运动)；2，一定程度的探测(有限程度的运动)；3，自由运动(对照，进行正常的探测)。
[0922] 生物标志物分析
[0923] 将16μm厚的冠状切片固定在显微载玻片上，并干燥。将所述的载玻片在包含溶于80％乙醇的1％氢氧化钠(将20mL 5％的NaOH加入到80mL的无水乙醇中)的溶液中浸渍5分钟。然后，在70％的乙醇中浸渍2分钟，再在蒸馏水中浸渍2分钟。将所述的载玻片转移到0.06％的高锰酸钾溶液中，持续10分钟。然后，将所述的载玻片在蒸馏水中冲洗2分钟。由0.01％的原液制备成染色液，以用于Fluoro- B。在所述的载玻片于染色液中保持20分钟之后，将其在3次蒸馏水洗涤，每次冲洗1分钟。通过简单地将载玻片垂直在纸巾上(15秒)排水来除去过量的水。然后将所述的载玻片放置在被设定在大约50℃的切片加热器上，直到完全干燥(例如5-10分钟)。通过在二甲苯中浸渍至少1分钟来清洁干燥的载玻片，然后用DPX(Fluka，Milwaukee WI，orSigma Chem.Co.，St.Louis，MO)(其为非水性非荧光的塑料固定介质)盖片。就细胞因子(TNF)分析而言，将组织切片在pH7.4的Tris缓冲盐水(TBS)中洗涤，并在合适的血清(山羊)中封闭。将切片在4℃下封闭过夜，然后在4℃下经历第一抗体过夜。将切片在TBS中洗涤，然后加入第二抗体，并在室温下温育1小时。在洗涤后，将切片按照说明书在Vector ABC Elite试剂盒中温育，然后用二氨基联苯胺(DAB)染色。在水中终止反应，并在经历二甲苯处理后盖片。
[0924] 所述研究中动物的排除
[0925] 基于以下若干标准从研究中排除动物：
[0926] 在研究结束前(在任何时间点上)死亡的动物。将至死亡时收集的数据提供给GB；
[0927] 在阻塞后脑血流量没有降低至基线值的20±5％(即，被认为为非缺血情况)的动物；
[0928] 在缺血损伤后产生癫痫状行为的动物；
[0929] 在缺血过程中或缺血后片刻，检测到过量出血的动物。
[0930] 处理组。所有的组都经历GM602或者作为对照。在诱导缺血后的3小时，动物接受IV给药的载体或GM602。
[0931] 大鼠中风模型
[0932]组别 化合物 剂量(mg/kg) 途径
1(n＝10只大鼠) 载体 0 IV
2(n＝10只大鼠) GM602 2.5mg/kg IV
3(n＝10只大鼠) GM602 10mg/kg IV
4(n＝10只大鼠) GM602 20mg/kg IV
1(n＝10只大鼠) 载体 0 IV
2(n＝10只大鼠) GM602 2.5mg/kg IV
3(n＝10只大鼠) GM602 10mg/kg IV
4(n＝10只大鼠) GM602 20mg/kg IV
[0933] 结束
[0934] GM602对缺血和再灌注损伤中的神经保护作用。针对脑血流量(CBF)、心率(HR)、血压(BP)、pO2、pCO2、pH、神经缺损(ND)、梗塞体积(IFV)、发炎生物标志物和神经元退行性生物标志物来评价动物。
[0935] 将所有的测试组都提供给NTS；将GM602以固体材料的形式提供给NTS。测试组中所有的动物都如上文指示给药。
[0936] 统计分析
[0937] 将结果表示成平均值±标准偏差(SD)。采用单因素协方差分析(ANOVA)、再通过Fisher精确检验来分析生理学和组织学数据中的差异显著性。在监测数据基础上计算重复测量的ANOVA，再通过Fisher精确检验评价多组中的差异显著性。
[0938] 结果
[0939] 大鼠中缺血的研究。对这些研究中缺血的相对严重性进行评估。数据得自患有缺血损伤的大鼠，其中所述的大鼠静脉内注射载体或GM602。
[0940] 梗塞体积：所有研究组中梗塞体积绘制于图33中。在永久性缺血后3小时，IV施用GM602减小动物脑中的梗塞体积。梗塞体积减小的百分比示于表25中。
[0941] 表25.脑中梗塞减小的百分比
[0942]组别 剂量(mg/kg) 梗塞体积(mm3) 梗塞体积减小的百分比* P值*
1 0 283.7±42.66 0 NA
2 2.5 217.5±48.44 23.3％ P＜0.0045
3 10 159.6±44.84 43.6％ P＜0.0001
4 20 124.3±33.82 56.2％ P＜0.0001
1 0 283.7±42.66 0 NA
2 2.5 217.5±48.44 23.3％ P＜0.0045
3 10 159.6±44.84 43.6％ P＜0.0001
4 20 124.3±33.82 56.2％ P＜0.0001
[0943] 减小的百分比与各种载体对照动物相比。
[0944] *与组1相比(载体)。
[0945] 死亡率：在本研究中未发生死亡。
[0946] 生理学参数。在缺血期间或者在施用测试药物之后，载体小鼠和治疗的小鼠之间，生理学参数(平均动脉血压、血液pO2、pCO2和pH)不具有显著性差异(参见图35-38)，均为基线值。但是，在使用GM602处理的组中，观察到由GM602介导的脑血流量显著增大(参见图34)。
[0947] 表26-施用GM602之后CBF增加
[0948]化合物(组) 缺血过程中 药物施用之后 缺血后施用 GM602gp与
的CBF 的CBF 前与施用后 载体
1-载体(施用盐水) 16.80±2.53 17.90±2.767 P＝0.37 NA
2-GM602(2.5mg/kg) 16.50±2.99 24.10±2.424 P＜0.0001 P＜0.0001
3-GM602(10mg/kg) 14.40±3.20 25.40±2.459 P＜0.0001 P＜0.0001
4-GM602(20mg/kg) 16.20±2.49 29.50±3.923 P＜0.0001 P＜0.0001
的CBF 的CBF 前与施用后 载体
1-载体(施用盐水) 16.80±2.53 17.90±2.767 P＝0.37 NA
2-GM602(2.5mg/kg) 16.50±2.99 24.10±2.424 P＜0.0001 P＜0.0001
3-GM602(10mg/kg) 14.40±3.20 25.40±2.459 P＜0.0001 P＜0.0001
4-GM602(20mg/kg) 16.20±2.49 29.50±3.923 P＜0.0001 P＜0.0001
[0949] 行为测试。基于多个不同的参数(如下文所指示)，针对神经缺损对动物进行评估。使用GM602治疗的动物显示出神经缺陷呈剂量依赖方式的减小(数据同样示于图39中)。
[0950] 表27-施用GM602后的前肢放置测定
[0951]化合物(组) 测试评分 与载体相比的p值
1-载体 14.40±2.119 NA
2-GM602(2.5mg/kg) 11.10±2.514 P＜0
3-GM602(10mg/kg) 7.800±2.466 P＜0.0001
4-GM602(20mg/kg) 6.300±2.003 P＜0.0001
1-载体 14.40±2.119 NA
2-GM602(2.5mg/kg) 11.10±2.514 P＜0
3-GM602(10mg/kg) 7.800±2.466 P＜0.0001
4-GM602(20mg/kg) 6.300±2.003 P＜0.0001
[0952] 表28-施用GM602后的后肢放置测定
[0953]化合物(组) 测试评分 与载体相比的p值
1-载体 5.1±0.74 NA
2-GM602(2.5mg/kg) 3.9±1.20 P＜0.02
3-GM602(10mg/kg) 2.7±0.95 P＜0.0001
4-GM602(20mg/kg) 2.0±0.82 P＜0.0001
1-载体 5.1±0.74 NA
2-GM602(2.5mg/kg) 3.9±1.20 P＜0.02
3-GM602(10mg/kg) 2.7±0.95 P＜0.0001
4-GM602(20mg/kg) 2.0±0.82 P＜0.0001
[0954] 表29-施用GM602后的平衡木测定
[0955]化合物(组) 测试评分 与载体相比的p值
1-载体 5.300±1.059 NA
2-GM602(2.5mg/kg) 4.100±0.9944 P＜0.0177
3-GM602(10mg/kg) 3.200±0.7888 P＜0.0001
4-GM602(20mg/kg) 2.700±0.4930 P＜0.0001
1-载体 5.300±1.059 NA
2-GM602(2.5mg/kg) 4.100±0.9944 P＜0.0177
3-GM602(10mg/kg) 3.200±0.7888 P＜0.0001
4-GM602(20mg/kg) 2.700±0.4930 P＜0.0001
[0956] 表30-施用GM602后的自发活性
[0957]化合物(组) 测试评分 与载体相比的p值
1-载体 0.2±0.42 NA
2-GM602(2.5mg/kg) 0.9±0.74 P＜0.02
3-GM602(10mg/kg) 1.6±0.52 P＜0.0001
4-GM602(20mg/kg) 1.9±0.74 P＜0.0001
1-载体 0.2±0.42 NA
2-GM602(2.5mg/kg) 0.9±0.74 P＜0.02
3-GM602(10mg/kg) 1.6±0.52 P＜0.0001
4-GM602(20mg/kg) 1.9±0.74 P＜0.0001
[0958] 生物标志物分析。收集组织切片以用于生物标志物分析(Fluoro-Jade和TNF)。
[0959] 在GM602施用组中，在第28天，在所述组织部分中所见的TNF染色明显减少，并且这种减少呈现出剂量依赖性(参见表31和图8)。在永久性缺血损伤后，在施用GM602之后的第28天所见的针对Fluoro-Jade的染色明显减少(参见表32和图41)。
[0960] 表31-施用GM602后TNF水平的减少情况
[0961]化合物(组) TNF水平(对照的％) 与载体相比的p值
1-载体 89.07±17.96 NA
2-GM602(2.5mg/kg) 64.24±16.18 P＜0.005
3-GM602(10mg/kg) 49.03±12.60 P＜0.0001
4-GM602(20mg/kg) 32.72±11.15 P＜0.0001
1-载体 89.07±17.96 NA
2-GM602(2.5mg/kg) 64.24±16.18 P＜0.005
3-GM602(10mg/kg) 49.03±12.60 P＜0.0001
4-GM602(20mg/kg) 32.72±11.15 P＜0.0001
[0962] 表32-在施用GM602后Fluoro-jade水平的减少情况
[0963]化合物(组) Fluoro-jade(细胞的#) 与载体相比的p值
1-载体 7007±1054 NA
2-GM602(2.5mg/kg) 4899±1248 P＝0.0007
3-GM602(10mg/kg) 3504±959.4 P＜0.0001
4-GM602(20mg/kg) 2889±719.6 P＜0.0001
1-载体 7007±1054 NA
2-GM602(2.5mg/kg) 4899±1248 P＝0.0007
3-GM602(10mg/kg) 3504±959.4 P＜0.0001
4-GM602(20mg/kg) 2889±719.6 P＜0.0001
[0964] 在美国，中风是死亡的第三大常见原因，并且是造成残疾的主要原因。局灶性脑缺血造成的结果和所形成的梗塞的尺寸可以通过“坏死性”(细胞凋亡)细胞死亡情况以及通过在缺血边缘带中延迟的神经元细胞损失(程序性细胞死亡或细胞凋亡)情况来测定。近期出现的疗法用于治疗缺血性中风。但是，一旦神经元细胞死亡循环被引发，这些治疗方法通常涉及溶解血液凝块，但不会发挥神经保护、或者减小行为缺损或脑梗塞体积的作用。理解影响细胞损失的基础机制将有助于减小缺血性损伤有关的细胞死亡的药物的设计和应用。
[0965] MNTF为这样的营养因子，其能够提供保护从而免于神经疾病，并可以在发生损伤或缺血性中风后使神经元组织再生。本发明所进行的研究在此证明了GM602(MNTF的6氨基酸类似物)能够以有效且高效的方式保护大鼠的脑免于受到由永久性脑缺血损伤而造成的有害作用的能力。在缺血损伤后3小时静脉内施用2.5、10或20mg/kg的GM602证明了通过减小梗塞体积、改善行为性质、增加脑血流量、降低炎症和神经元退化而在脑中产生对抗缺血损伤的、呈剂量依赖方式的保护作用。这些研究表明，GM602在永久性中风中具有有利的作用。
[0966] 当将GM602进行静脉内施用时，发现其在大鼠中具有对抗缺血损伤的神经保护作用。
[0967] 本文参考或提及的所有专利、出版物、科学论文、网站以及其他文件和材料指示本发明所属领域技术人员的技术水平，并且每个此类参考的文件和材料在此引入作为参考，其程度与其已单独地整体引入作为参考或整体在本文中阐述相同。申请人保留将来自任何此类专利、出版物、科学论文、网站、可电子获得的信息、以及其他参考的材料或文件在形体上引入本说明书内的权利。
[0968] 本文描述的具体方法和组合物是优选实施方案的代表，并且是示例性的而不意欲作为对本发明范围的限制。考虑本说明书后，其他目的、方面和实施方案将被本领域技术人员想到，并且包含在如由权利要求范围限定的本发明的精神内。对于本领域技术人员显而易见的是，无需背离本发明的范围和精神，可以进行本文公开的本发明的各种替代和修改。本文举例说明性描述的本发明适当地可以在不存在本文未具体公开为必需的任何一种或多种元件，或一种或多种限制的情况下进行实践。因此，例如，在本文的每种情况下，在本发明的实施方案或实施例中，术语“包含”、“基本上由......组成”和“由......组成”中的任何一个在说明书中都可以替换为其他2个术语中的任一。同样地，术语“包含”、“包括”、“含有”等应被广泛而且没有限制地理解。本文举例说明性描述的方法和过程可以适当地以不同的步骤顺序进行实践，并且它们不必限制于本文或权利要求中指出的步骤顺序。同样如本文和附加权利要求中所使用的，除非上下文另有明确说明，单数形式“一种”、“一个”和“所述”等包括复数参考。该专利决不能被解释为限制于本文具体公开的具体实施例或实施方案或方法。该专利决不能被解释为受由专利商标局的任何审查者或任何其他官员或雇员进行的任何陈述限制，除非此类陈述由申请人以回答的书面形式特别地而没有限定或保留明确地采用。
[0969] 已使用的术语和表达作为描述性而非选择性的术语使用，并且在此类术语和表达的使用中不预期排除所示和所述特征的任何等价物或其部分，但应认识到在如要求保护的本发明范围内的各种修改是可能的。因此，应当理解尽管本发明已通过优选实施方案和任选特征具体公开，但本领域技术人员可以采用公开的本文概念的修改和变化，并且此类修改和变化被视为在如由附加权利要求限定的本发明的范围内。
[0970] 本发明已在本文中得到广泛和一般地描述。属于一般公开内容的更窄的种类和亚一般分类中的每一种也可形成本发明的部分。这包括本发明的一般描述，条件或负面限制是从种类中去除任何主题，不管删除的材料是否在本文中具体引用。
[0971] 其他实施方案在下述权利要求内。此外，当本发明的特征或方面按照Markush组进行描述时，本领域技术人员将认识到本发明因此也按照Markush组的任何个别成员或成员亚组进行描述。
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