技术领域  本发明涉及一种绿色添加剂生物反应器及其构建方 法和应用，更具体地说，涉及一种利用小球藻生产抗畜禽病毒蛋白、 促生长因子的方法及其应用。

背景技术  众所周知，小球藻繁殖迅速，每20小时增长4倍。 小球藻含有丰富的营养物质：包括氨基酸(有19种游离氨基酸，其 中8种为人体必需氨基酸)、核酸、多肽、蛋白质、维生素、矿物质、 多糖、植物激素和神秘成分等生物活性物质。另含特有的细胞活性物 质----小球藻生长因子(Chlorella Growth Factor，简称CGF，以 下同)，其生理功能被称之为“类荷尔蒙”，具有活化人体细胞功能， 能使儿童生长发育加快，且具有激活淋巴细胞，增强机体免疫能力， 抵抗外来疾病的入侵，促进人体受伤组织修复，减少或减轻因有机物、 重金属等的中毒反应，还能防治胃溃疡、高血压和心血管等疾病。实 验证明，小球藻喂养被注射癌细胞的老鼠，显示出很强的抗癌能力。

在现有技术中，用细菌、哺乳动物细胞作表达载体来表达外源蛋 白已有不少报道，但将促进动物生长的PGH基因、PEGF基因、口蹄 疫VP1抗原基因、猪传染性胃肠炎病毒抗原人工修饰基因、猪呼吸与 生殖综合症病毒抗原基因、禽流感病毒的主要免疫原性蛋白HA基因、 鸡新城疫病毒的主要免疫原性蛋白F基因、鸡传染性法氏囊病毒的主 要免疫原性蛋白VP2基因置于小球藻上表达尚未见报道。

现有的动物促生长添加剂中，有化学合成的促生长添加剂，如β- 激动剂(俗称“瘦肉精”)和生长激素，但因其是人工合成，具有顽 固的热稳定性，使用后会在动物组织中形成累积性残留。由于这类化 合物具有口服活性，违法使用会给消费者带来一些不良影响(如头晕 眼花，呕吐等症状)，正受到国家的“封杀”。此外，市场上还有一 些抗生素型促生长素，它们通过抑制肠道内的有害细菌而达到促生长 的目的，由于它们属于抗生素，因此，必然面临耐药性和药物残留的 问题。用促进动物生长的PGH基因、PEGF基因修饰小球藻后，其表 达产物具有增强对营养物质的吸收，如糖、氨基酸和电解质，改善肠 道消化功能，从而促进动物的生长，减少胰岛素的分泌、促进蛋白和 糖的生成，减少脂肪沉积、促进脂肪溶解，从而提高畜禽的瘦肉比例， 提高饲料的转化率，无毒、无副作用，在动物组织无残留，是一种典 型的绿色环保型促生长添加剂。

现有技术用植物作表达载体来表达外源蛋白抗原并激发特异性 的免疫应答，已有不少报道。但用基因修饰的小球藻开发抗病毒蛋白 未见成功报道。

口蹄疫、猪传染性胃肠炎、猪呼吸与生殖综合症、禽流感、鸡新 城疫、鸡传染性法氏囊炎是影响畜禽生产工业的主要疾病。现有的预 防技术中，上述疾病的预防免疫有用死苗的，也有用弱毒苗的。但现 有的免疫技术有诸多不完善因素：一是生产疫苗的厂家具有散毒的危 险，二是弱毒苗具有“返祖”现象，更重要的是人为的传播了其他疾病， 给病毒病的根除带来极大的困难。三是灭活苗和弱毒苗免疫的程序复 杂，成本较高，免疫不确实。因此，要彻底地控制和消灭上述疾病病， 必须开发一种安全、高效、低廉的替代品。研究表明：AIV的结构蛋 白HA、NDV的结构蛋白F、IBDV的结构蛋白VP2携有各自病毒典 型的抗原决定簇，可诱发IgA/IgG的产生，两者均可保护试验或本体 动物抵抗强毒攻击。FMDV的结构蛋白VP1携有典型的抗原决定簇， 可诱发中和抗体的产生。用VPI蛋白或其部分氨基酸合成肽免疫动 物，均可保护试验或本体动物抵抗强毒攻击。

发明内容  本发明的目的在于提供一种能够生产促进动物生长 因子、抗动物疾病病毒蛋白的绿色添加剂生物反应器及其构建方法和 应用。

为了达到上述目的，本发明提供了如下的技术方案：构建一种绿 色添加剂生物反应器，该反应器由小球藻、信号肽基因和免疫原性基 因、目标基因及基因修饰后的小球藻表达的具有生物活性的产物组 成，其中的信号肽基因和免疫原性基因为： GGATCCATGGGGAAGMCGGCAGCCTGTGCTGCTTCTCTCTGCTGCTGCTGCTGCTTCT CGCCGGGTTGGCGTCCATGAATAAAGTAAAATTTTATGTTTTATTTACGGCGTTACTATCCT CTCTATGTGCACACGGAGCTCCCGGGTATGCACATGGAACACCTCAAAATATTACTGATTT GTGTGCAGAATACCACMCACACAAATACATACGCTAAATGATAAGATATTTTCGTATACAG AATCTCTAGCTGGAAAAAGAGAGATGGCTATCATTACTTTTAAGAATGGTGCAACTTTTCAA GTAGAAGTACCAGGTAGTCAACATATAGATTCACAAAAAAAAGCGATTGAAAGGATGAAGG ATACCCTGAGGATTGCATATCTTACTGAAGCTAAAGTCGAAAAGTTATGTGTATGGAATAAT AAAACGCCTCATGCGATTGCCGCAATTAGTATGGCAAATTCTAGA

其目标基因包括下列基因之一种：

(1)促进动物生长基因PGH基因： ATCTAGAATGGCCTTCCCGGCCATGCCCCTGTCGAGCCTGTTCGCCAACGCCGTGCTGC GCGCCCAGCACCTGCACCAGCTGGCCGCCGACACGTACAAGGAGTTCGAGCGCGCCTA CATCCCGGAGGGTCAGCGCTACTCGATCCAGAACGCCCAGGCCGCCTTCTGCTTCTCG GAGACGATCCCGGCGCCGACGGGTAAGGACGAGGCCCAGCAGAGGTCGGACGTGGAG CTGCTGCGCTTCTCGCTGCTGCTGATTCAGTCGTGGCTGGGGCCCTTCATCCGCTGAGT CGACA

(2)促进动物生长的PEGF基因： TGGGGAAGAACGGCAGCCTGTGCTGCTTCTCTCTGCTGCTGCTGCTGCTTCTCGCCGG GTTGGCGTCCAACTCTTACTCTGAGTGCCCGCCGAGTCATGACGGGTACTGCCTTCACG GTGGTGTTTGTATGTACATTGAAGCTGTTGATTCTTACGCTTGCAACTGCGTTTTCGGTTA CGTTGGTGAAAGATGCCAACATAGAGACCTTAAGTGGTGGGAACTTAGACATCATCATCAT CATCAT

(3)口蹄疫VP1抗原基因： ACCACCTCCACAGGTGAGTCGGCTGACCCTGTGACTGCCACT GTTGAGAACTACGGTGGTGAGACACAGGTCCAGAGACGCCAA CACACGGATGTCTCGTTCATATTAGACAGATTTGTGAAAGTAAC ACCAAAAGACCAAATTAATGTGTTGGACCTGATGCAAACCCCT GCACACACTTTGGTAGGCGCGCTCCTCCGTACTGCCACCTAC TACTTCGCAGACCTAGAAGTGGCAGTGAAACACGAGGGGAAC CTTACCTGGGTCCCGAATGGGGCGCCCGAGACAGCGTTGGA CAACACCACCAATCCAACGGCTTACCACAAGGCACCGCTCAC CCGGCTTGCACTGCCTTACACGGCACCACACCGTGTCTTGGC TACTGTTTACAACGGGAACTGCAAGTATGGCGAGAGCCCCGT GACCAATGTGAGAGGTGACCTGCAAGTATTGGCTCAGAAGGC GGCAAGAACGCTGCCTACCTCCTTCAATTACGGCGCCATCAAA GCCACTCGGGTGACTGAACTGCTTTACCGCATGAAGAGGGCC GAAACATACTGCCCCCGGCCTCTTTTGGCTATTCACCCAAGCG AAGCTAGACACAAACAAAAGATTGTGGCGCCTGTGAAACAGC TTTTG

(4)口蹄疫病毒抗原多肽链： TCTAGAACCAACAACGTCCGCGGTGACCTTCAGGTCCTCGCT CAGAAGGCCGAGCGCACCCTCCCACATCATAAGCAGCGGATC GTTGCCCCCGCAAAACAGCTCCTCACCAACAACGTCCGCGGT GACCTTCAGGTCCTCGCTCAGAAGGCCGAGCGCACCCTCCC ATGAGTCGAC

(5)猪传染性胃肠炎病毒人工修饰抗原基因：

   1 tctagaacca tggctttctt gaagagtttc ccattctacg ctttcttgtg cttcggacaa

   61 tacttcgtgg ctgtgactca cgcagacaac ttcccatgct ctaagttgac caacaggacc

   121 atcggtaatc aatggaactt gatcgagacc ttcttgttga actactcatc taggttgcca

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   541 gcaaactgcg gaaacatgct gtacggcttg caatggttcg cagacgaggt ggtggcttac

   601 ttgcatggag ctagttaccg gattagtttc gagaaccaat ggtctggcac tgtgacattc

   661 ggtgacatgc gggccacaac attggaggtg gctggcacgt tggtggactt gtggtggttc

   721 aacccagtgt acgatgtcag ttactacagg gtgaacaaca agaacgggac taccgtggtg

   781 agcaactgca ctgaccaatg cgctagttac gtggctaacg tgttcactac acagccagga

   841 ggattcatcc catcagactt tagtttcaac aactggttcc tcttgactaa cagcagcact

   901 ttggtgagtg gtaagttggt gaccaagcag ccgttgctcg ttaactgctt gtggccagtc

   961 ccaagcttcg aggaggcagc ttctacattc tgcttcgagg gagctggctt cgaccaatgc

   1021 aatggagctg tgctcaacaa tactgtggac gtgattaggt tcaacctcaa cttcactaca

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   1321 tacattaacg gttacaactt cttcagcaca ttcccaattg actgcatctc attcaacttg

   1381 accactggtg acagtgacgt gttctggaca atcgcttaca caagctacac tgaggcactc

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   1561 gaggttggac tcgtgaacaa gagtgttgtg ctcctcccaa gcttctacac acacaccatt

   1621 gtgaacatca ctattgggct cggaatgaag cgtagtgggt acgggcaacc aatcgcctca

   1681 acattgagta acatcacatt gccaatgcag gaccacaaca ccgatgtgta ctgcattcgg

   1741 tctgaccaat tctcagttta cgtgcattct acttgcaaga gtgctttgtg ggacaatatt

   1801 ttcaagcgaa actgcacgga ccaccaccat caccatcact aaccgcggtg gagctc

(6)猪呼吸与生殖综合症病毒抗原基因： Atgttggggaaatgcttgaccacgggctgttgctcgcgattgctttctttgtggtgtatcgtgcc gttctgttttgctgtgctcgtcaacgccaacagcaacagcagctctcattttcagttgatttataa cttgacgctatgtgagctgaatggcacagattggctggctaacaaatttgactgggcagtgg agacttttgtcatctttcccgtgttgactcacattgtttcctatggggcactcaccaccagccattt ccttgacacagttggtctggtcactgtgtccaccgccgggttttatcacgggcggtatgtcttga gtagcatctacgcggtctgtgctctggctgcgttgattttgcttcgtcattaggcttgcgaagaac tgcatgtcctggcgctactcttgtaccagatataccaacttccttctggacactaagggcaga ctctatcgttggcggtcgcccgttattgtagagaaagggggtaaggttgaggtcgagggtca cctgatcgacctcaaaagagttgtgcttgatggttccgtggcaacccctttaaccagagtttca gcggaacaatggggtcgtctctag

(7)禽流感病毒的主要免疫原性蛋白基因即HA基因： ttgaattcttgaattcatggaaagaacagtgcttcttcttgcaacagtcagtcttgttaaaagtg atcagatttgcattggttaccatgcaaacaactcgacagagcaggttgacacaataatgga aaagaatgttactgttacacatgcccaagacatactggaaaggacacacaacgggaagc tctgcgatctaaatggagtgaagcctctcattttgagggattgtagtgtagctggatggctcctc ggaaaccctatgtgtgacgaattcatcaatgtgccggaatggtcttacatagtggagaagg ccagtccagccaatgacctctgttatccagggaatttcaacgactatgaagaactgaaaca cctattgagcagaataaaccattttgagaaaattcagatcatccccaaaagttcttggtccaa tcatgatgcctcatcaggggtgagctcagcatgtccataccttgggaggtcctcctttttcaga aatgtggtatggcttatcaaaaagaacagtgcatacccaacaataaagaggagctacaat aataccaaccaagaagatcttttggtactgtggggggttcaccatcctaatgatgcggcaga gcagacaaagctctatcaaaatccaaccacctacatttccgttggaacatcaacactgaac cagagattggttccagaaatagctactagacccaaagtaaacgggcaaagtggaagaat ggagttcttctggacaattttaaagccgaatgatgccatcaatttcgagagtaatggaaatttc attgctccagaatatgcatacaaaattgtcaagaaaggggactcaacaattatgaaaagtg aattggaatatggtaactgcaacaccaagtgtcaaactccaatgggggcgataaactctag tatgccattccacaacatacaccccctcaccatcggggaatgccccaaatatgtgaaatca aacagattagtccttgcgactggactcagaaatacccctcaaagagagagaagaagaaa aaagagaggactatttggagctatagcaggttttatagagggaggatggcagggaatggt agatggttggtatgggtaccaccatagcaatgagcaggggagttgctactctgcagacaa agaatccactcaaaaggcaatagatggagtcaccaataaggtcaactcgatcattaacaa aatgaacactcagtttgaggccgttggaagggaatttaataacttggaaaggaggataga gaatttaaacaagaagatggaagacggattcctagatgtctggacttacaatgctgaacttc tggttctcatggaaaatgagagaactctcgactttcatgactcaaatgtcaagaacctttacg acaaggtccgactacagcttagggataatgcaaaggagctgggtaatggttgtttcgaattc tatcacaaatgtgataatgaatgtatggaaagtgtaaaaaacggaacgtatgactacccgc agtattcagaagaagcaagactaaacagagaggaaataagtggagtaaaattggaatc aatgggaacttaccaaatactgtcaatttattcaacagtggcgagttccctagcactggcaat catggtagctggtctatctttatggatgtgctccaatggatcgttacaatgcagaatttgcattta aatttgtgagttcagattgtagttaaaaacaccctgacgtcgagacgtacc

(8)新城疫病毒的主要免疫原性蛋白基因即F基因： ttgaattcatgggccccaaatcttctaccaatgtcccagcacctctgatgctgaccgtcagga ttgcgctggcactgagctgtgtccgtctgacaaattctctcgatggaaggcctcttgcagctgc agggattgtagtaacgggagacaaagcagtcaacatatacacctcatctcagacagggtc aataatagtcaagttactcccaaatatgcctaaggataaagaggcgtgtgcaaaagcccc gttggaggcatacaacaggacactgactgctttgctcaccccccttggtgattctatccgcag gatacaagagtctgcgactacgtccggaggaaggaggcagagacgctttataggtgccat tatcggcagtgtagctcttggggttgccacagctgcccagataacagcagcctcagctctga tacaagccaaccagaatgctgccaacatcctccggcttaaagagagcattgctgcaacta atgaagctgtacatgaagtcactgacggattatcgcaactagcagtggcagttgggaagat gcagcagtttgttaatgaccagtttaataacacagctcaggaattggactgtataaaaattac acagcaggttggtgtagaactcaacctgtacctaactgaattgactacagtattcgggccac aaatcacttcccctgccttaactcagctgactatccaggcgctttacaatctagctggtggtaa gatggattatttgttgactaagttaggtgttgggaacaaccaactcagctcattaatcggtagc ggcttgatcaccggtaaccctattctgtacgattcacagactcaactcttaggtatacaggta actttaccctcagtcggtaacctaaataatatgcgtgctacctacttggagaccttgtctgtaa gcacaaccaagggatttgcctcagcacttgtcccaaaagtggtgacacaggtcgggtctgt gatagaggaacttgacacctcatactgtgtagagaccgatttggatttatattgtacaagaat agtgacattccctatgtctcctggtatttattcctgtctgagcggtaatacatcagcttgcatgtat tcaaagactgaaggtgcacttactacgccatatatgactatcaagggctcagttattgccaat tgcaagataacaacatgcagatgtgcagaccctccgggtatcatatcgcaaaattatggag aagctgtgtctctaatagataggcactcatgcaatgtcttatccttagacgggataactttgag gctcagtggagaatttgacgtaacttatcaaaagaatatctcaatattagattctcaggtaata gtgacaggcaatctcaatatctcaactgaacttgggaatgtcaacaactcgataagtaatgc tttggataagttagaggaaagcaatagcaaacttgacaaagtcaatgtcaagctgaccgg cacgtctgctctcattacctatatagttttaactatcatatctcttgtttgtggtatacttagcctggtt ctagcatgctatctgatgtataagcaaaaggcgcaacaaaagaccttattatggcttggga ataataccctaaatcagatgagggccactacaagaatctgaacacagagacgtccc

(9)法氏囊病毒的主要免疫原性蛋白基因即VP2基因： ttgaattcatgacaaacctgcaagatcaaacccaacagattgttccgttcatacggagccttc tgatgccaacaaccggaccggcgtccattccggacgacaccctggagaagcacactctc aggtcagagacctcgacctacaatttgactgtgggggacacagggtcagggctaattgcct ttttccctggattccctggctcaattgtgggtgctcactacacactgcagagcaatgggaacta caagttcgatcagatgctcctgactgcccagaacctaccggccagctacaactactgcag gctagtgagccggagtctcacagtaaggtcaagcacactccctggtggcgtttatgcacta aacggcaccataaacgccgtgaccttccaaggaagcctgagtgaactgacagatgttag ctacaatggattgatgtctgcaacagccaacatcaacgacaaaattgggaacgtcctagta ggggaaggggtcaccgtcctcagcttacccacatcatatgatcttgggtatgtgagacttggt gaccccatacccgctatagggcttgacccaaaaatggtagcaacatgtgacagcagtgac aggcccagagtctacactataactgcagccgatgattaccaattctcatcacaataccaac aaggtggggtaacgatcacactgttctcagccaacattgatgccatcacaagcctcagcgtt gggggagagcttgtgtttaaaacaagcgtccacagccttgtactgggcgccaccatctacct tataggctttgatgggactgcggtaatcactagagctgtagccgcaaacaatgggctgacg accggcatcgacaatcttatgccattcaatcttgtgattccaaccaacgagataacccagcc gatcacatccatcaaactggagatagtgacctccaggagtggtggtcaggcaggggatca gatgtcatggtcggcaagtgggagcctagcagtgacgatccatggtggcaactatccagg ggccctccgtcccgtcacactagtagcctacgaaagagtggcaacaggatctgtcgttacg ctcgccggggtgagcaacttcgagctgatcccaaatcctgaactagcaaagaacctggtta cggaatacggccgatttgacccaggggccatgaactacacaaaattgatactgagtgatg gggaccgtcttggcatcaagaccgtctggccaacaagggagtacacagactttcgtgagt acttcatggaggtggccgacctcaactctcccctgaagattgcaggagcatttggcttcaaa gacataatccgggccataagggacgtccc

本发明构建所述的绿色添加剂生物反应器的方法，包括基因重 组、质粒构建、小球藻转化和重组蛋白的制备，其具体过程为：(1) 插入质粒载体：采用分子生物学的方法人工合成目标基因，使目标基 因含有启动子(Ubiquitin)和终止子，基因经过修饰成为小球藻所偏 嗜的密码子，前端加信号肽基因(TMVΩ)，片段两端为内切酶位点(Xba I和sal I)，用相应的内切酶切表达载体和目的片段，T4连接酶连 接重组，构建重组表达载体，然后(2)将上述重组质粒转入小球藻 中进行表达，获得基因修饰小球藻：将重组质粒转化大肠杆菌 (Escherichia coli Top10)进行大量繁殖，抽提重组质粒后，对生 长至第4天的小球藻进行渗透处理，用6.0～9.0Kb的高脉冲电压， 0.05～0.2s的短脉冲时间和多次脉冲(2n)的条件进行电击转化，或抽 提重组质粒后包裹金弹，用6～9cm的子弹与靶细胞距离进行基因枪 轰击渗透处理的小球藻，通过G418筛选基因修饰小球藻。

本发明的过程包括：目的基因的同源性分析、目的基因的人工修 饰、目的基因的人工合成、基因重组、重组质粒转化小球藻。

本发明的绿色添加剂生物反应器的应用，是将基因修饰后的小球 藻进行大量繁殖，成熟后干燥、碾碎并混入支撑粉制作成添加剂饲喂 动物。

与现有技术相比，本发明具有以下明显的优点：一是生产技术简 单，基因修饰后的小球藻生长迅速，成熟快，干燥方便；二是小球藻 中的重组蛋白具有生物活性，可明显地促进动物的生长及抵抗病毒的 攻击。

具体实施方式  以下通过具体的实施例对本发明进行更加详细 的描述：

实施例1

首先通过对猪、牛、羊(绵羊和山羊)、人的GH基因进行大量的 分析和重组，选取具有相同保守区的功能片段进行分析。同时参照由 于缺失了几个氨基酸而更能抵抗酶的消化的变异株来确定目的基因。 为了提高在植物中的表达量，我们把目的片段与植物本身的一段信号 肽基因相融合，来防止mRNA的降解。采用分子生物学的方法人工合 成GH基因，该基因含有启动子(Ubiquitin)和终止子，基因经过修饰 成为小球藻所偏嗜的密码子，前端为信号肽基因，片段两端为内切酶 位点(Xba I和sal I)。用相应的内切酶切表达载体和目的片段， T4连接酶连接重组，构建相应的重组质粒。将重组质粒采用电击法 转化大肠杆菌(Escherichia coli Top10)进行大量培养繁殖，抽提 重组质粒。将在固体培养基上生长的直径约为1mm左右的单藻落接种 于20ml液体培养基中，转速80～100rpm，温度20～25℃，光照培养 16h，光照条件3000～4000lux，黑暗培养8h。后将，处于旺盛分裂 期的小球藻用含有0.2mo1/L甘露醇和0.2mol/L山梨醇进行渗透处理 1～2h，用6.0～9.0Kb的高脉冲电压，0.05～0.2s的短脉冲时间和 多次脉冲(2n)，脉冲距离为2mm，进行100个循环周期的条件进行电 击转化；或抽提重组质粒后包裹金弹，对培养至第4天，进行渗透处 理过的小球藻，吸取0.4ml培养物铺于含固体培养基中央直径3cm的 圆形有效轰击范围内，用6～9cm的子弹与靶细胞距离进行基因枪轰 击转化。转化完毕后用培养液清冼两次，然后将0.4ml混合小球藻均 匀涂于含含30μg/mlG418的固体培养基上，筛选出基因修饰小球藻。 3周左右可见到藻落的长出，长出的藻落通过固体培养保存藻系，在 含有G418 15μg/ml的液体培养中扩大繁殖。

基因修饰后的小球藻中所含外源基因GH，可经PCR、Southern 检测存在：收集对数生长期(约1×108个/ml)的小球藻细胞，采用改 良的CTAB法抽提小球藻总DNA。基因修饰后的小球藻中所含外源基 因GH所转录出的RNA，可经Northern检测存在。 基因修饰后的小球藻中所含的外源蛋白，经ELISA和Western blot 检测其存在，阳性对照为空质粒转化的小球藻抽提物中混有人工合成 的多肽GH(10ug/ml)，阴性对照为空质粒转化的小球藻抽提物。结 果显示基因修饰后的小球藻中含有外源蛋白GH，能够与蛋白中相应 的多肽血清发生明显的反应。在Western blot检测中，用抗GH的血 清可检测到特异性的条带，分子量为1-10KDa，得出与ELISA相同的检 测结果。

家畜进食含上述添加剂的饲料两周后，与空白对照组相比较，增 重率明显提高，超过了市场上销售的促生长型添加剂的水平。

实施例2

采用分子生物学的方法人工合成PEGF基因，该基因含有启动子 (Ubiquitin)和终止子，基因经过修饰成为小球藻所偏嗜的密码子， 前端为信号肽基因，片段两端为内切酶位点(Xba I和sal I)。用 相应的内切酶切表达载体和目的片段，T4连接酶连接重组，构建相 应的重组质粒。将重组质粒采用电击法转化大肠杆菌(Escherichia coli Top10)进行大量培养繁殖，抽提重组质粒。将在固体培养基上 生长的直径约为1mm左右的单藻落接种于20ml液体培养基中，转速 80～100rpm，温度20～25℃，光照培养16h，光照条件3000～4000lux， 黑暗培养8h。后将，处于旺盛分裂期的小球藻用含有0.2mol/L甘露 醇和0.2mol/L山梨醇进行渗透处理1～2h，用6.0～9.0Kb的高脉冲 电压，0.05～0.2s的短脉冲时间和多次脉冲(2n)，脉冲距离为2mm， 进行100个循环周期的条件进行电击转化；或抽提重组质粒后包裹金 弹，对培养至第4天，进行渗透处理过的小球藻，吸取0.4ml培养物 铺于含固体培养基中央直径3cm的圆形有效轰击范围内，用6～9cm 的子弹与靶细胞距离进行基因枪轰击转化。转化完毕后用培养液清冼 两次，然后将0.4ml混合小球藻均匀涂于含含30μg/mlG418的固体 培养基上，筛选出基因修饰小球藻。3周左右可见到藻落的长出，长 出的藻落通过固体培养保存藻系，在含有G418 15μg/ml的液体培养 中扩大繁殖。其它操作同实施例1。

实施例3

采用分子生物学的方法人工合成口蹄疫VP1抗原基因基因，该基 因含有启动子(Ubiquitin)和终止子，基因经过修饰成为小球藻所偏 嗜的密码子，前端为信号肽基因，片段两端为内切酶位点(Xba I和 sal I)。用相应的内切酶切表达载体和目的片段，T4连接酶连接重 组，构建相应的重组质粒。将重组质粒采用电击法转化大肠杆菌 (Escherichia coli Top10)进行大量培养繁殖，抽提重组质粒。将 在固体培养基上生长的直径约为1mm左右的单藻落接种于20ml液体 培养基中，转速80～100rpm，温度20～25℃，光照培养16h，光照 条件3000～4000lux，黑暗培养8h。后将，处于旺盛分裂期的小球藻 用含有0.2mol/L甘露醇和0.2mol/L山梨醇进行渗透处理1～2h，用 6.0～9.0Kb的高脉冲电压，0.05～0.2s的短脉冲时间和多次脉冲 (2n)，脉冲距离为2mm，进行100个循环周期的条件进行电击转化； 或抽提重组质粒后包裹金弹，对培养至第4天，进行渗透处理过的小 球藻，吸取0.4ml培养物铺于含固体培养基中央直径3cm的圆形有效 轰击范围内，用6～9cm的子弹与靶细胞距离进行基因枪轰击转化。 转化完毕后用培养液清冼两次，然后将0.4ml混合小球藻均匀涂于含 含30μg/mlG418的固体培养基上，筛选出基因修饰小球藻。3周左 右可见到藻落的长出，长出的藻落通过固体培养保存藻系，在含有 G418 15μg/ml的液体培养中扩大繁殖。其它操作同实施例1。

实施例4

采用分子生物学的方法人工合成口蹄疫病毒抗原多肽链基因，该 基因含有启动子(Ubiquitin)和终止子，基因经过修饰成为小球藻所 偏嗜的密码子，前端为信号肽基因，片段两端为内切酶位点(Xba I 和sal I)。用相应的内切酶切表达载体和目的片段，T4连接酶连接 重组，构建相应的重组质粒。将重组质粒采用电击法转化大肠杆菌 (Escherichia coli Top10)进行大量培养繁殖，抽提重组质粒。将 在固体培养基上生长的直径约为1mm左右的单藻落接种于20ml液体 培养基中，转速80～100rpm，温度20～25℃，光照培养16h，光照 条件3000～4000lux，黑暗培养8h。后将，处于旺盛分裂期的小球藻 用含有0.2mol/L甘露醇和0.2mol/L山梨醇进行渗透处理1～2h，用 6.0～9.0Kb的高脉冲电压，0.05～0.2s的短脉冲时间和多次脉冲 (2n)，脉冲距离为2mm，进行100个循环周期的条件进行电击转化； 或抽提重组质粒后包裹金弹，对培养至第4天，进行渗透处理过的小 球藻，吸取0.4ml培养物铺于含固体培养基中央直径3cm的圆形有效 轰击范围内，用6～9cm的子弹与靶细胞距离进行基因枪轰击转化。 转化完毕后用培养液清冼两次，然后将0.4ml混合小球藻均匀涂于含 含30μg/mlG418的固体培养基上，筛选出基因修饰小球藻。3周左 右可见到藻落的长出，长出的藻落通过固体培养保存藻系，在含有 G418 15μg/ml的液体培养中扩大繁殖。其它操作同实施例1。

实施例5

采用分子生物学的方法人工合成猪传染性胃肠炎病毒人工修饰 抗原基因，该基因含有启动子(Ubiquitin)和终止子，基因经过修饰 成为小球藻所偏嗜的密码子，前端为信号肽基因，片段两端为内切酶 位点(Xba I和sal I)。用相应的内切酶切表达载体和目的片段， T4连接酶连接重组，构建相应的重组质粒。将重组质粒采用电击法 转化大肠杆菌(Escherichia coli Top10)进行大量培养繁殖，抽提 重组质粒。将在固体培养基上生长的直径约为1mm左右的单藻落接种 于20ml液体培养基中，转速80～100rpm，温度20～25℃，光照培养 16h，光照条件3000～4000lux，黑暗培养8h。后将，处于旺盛分裂 期的小球藻用含有0.2mol/L甘露醇和0.2mol/L山梨醇进行渗透处理 1～2h，用6.0～9.0Kb的高脉冲电压，0.05～0.2s的短脉冲时间和 多次脉冲(2n)，脉冲距离为2mm，进行100个循环周期的条件进行电 击转化；或抽提重组质粒后包裹金弹，对培养至第4天，进行渗透处 理过的小球藻，吸取0.4ml培养物铺于含固体培养基中央直径3cm的 圆形有效轰击范围内，用6～9cm的子弹与靶细胞距离进行基因枪轰 击转化。转化完毕后用培养液清冼两次，然后将0.4ml混合小球藻均 匀涂于含含30μg/mlG418的固体培养基上，筛选出基因修饰小球藻。 3周左右可见到藻落的长出，长出的藻落通过固体培养保存藻系，在 含有G418 15μg/ml的液体培养中扩大繁殖。其它操作同实施例1。

实施例6

采用分子生物学的方法人工合成猪呼吸与生殖综合症病毒抗原 基因，该基因含有启动子(Ubiquitin)和终止子，基因经过修饰成为 小球藻所偏嗜的密码子，前端为信号肽基因，片段两端为内切酶位点 (Xba I和sal I)。用相应的内切酶切表达载体和目的片段，T4连 接酶连接重组，构建相应的重组质粒。将重组质粒采用电击法转化大 肠杆菌(Escherichia coli Top10)进行大量培养繁殖，抽提重组质 粒。将在固体培养基上生长的直径约为1mm左右的单藻落接种于20ml 液体培养基中，转速80～100rpm，温度20～25℃，光照培养16h， 光照条件3000～4000lux，黑暗培养8h。后将，处于旺盛分裂期的小 球藻用含有0.2mol/L甘露醇和0.2mol/L山梨醇进行渗透处理1～2h， 用6.0～9.0Kb的高脉冲电压，0.05～0.2s的短脉冲时间和多次脉冲 (2n)，脉冲距离为2mm，进行100个循环周期的条件进行电击转化； 或抽提重组质粒后包裹金弹，对培养至第4天，进行渗透处理过的小 球藻，吸取0.4ml培养物铺于含固体培养基中央直径3cm的圆形有效 轰击范围内，用6～9cm的子弹与靶细胞距离进行基因枪轰击转化。 转化完毕后用培养液清冼两次，然后将0.4ml混合小球藻均匀涂于含 含30μg/mlG418的固体培养基上，筛选出基因修饰小球藻。3周左 右可见到藻落的长出，长出的藻落通过固体培养保存藻系，在含有 G418 15μg/ml的液体培养中扩大繁殖。其它操作同实施例1。

实施例7

采用分子生物学的方法人工合成禽流感病毒的主要免疫原性蛋 白基因即HA基因，该基因含有启动子(Ubiquitin)和终止子，基因经 过修饰成为小球藻所偏嗜的密码子，前端为信号肽基因，片段两端为 内切酶位点(Xba I和sal I)。用相应的内切酶切表达载体和目的 片段，T4连接酶连接重组，构建相应的重组质粒。将重组质粒采用 电击法转化大肠杆菌(Escherichia coli Top10)进行大量培养繁殖， 抽提重组质粒。将在固体培养基上生长的直径约为1mm左右的单藻落 接种于20ml液体培养基中，转速80～100rpm，温度20～25℃，光照 培养16h，光照条件3000～4000lux，黑暗培养8h。后将，处于旺盛 分裂期的小球藻用含有0.2mol/L甘露醇和0.2mol/L山梨醇进行渗透 处理1～2h，用6.0～9.0Kb的高脉冲电压，0.05～0.2s的短脉冲时 间和多次脉冲(2n)，脉冲距离为2mm，进行100个循环周期的条件进 行电击转化；或抽提重组质粒后包裹金弹，对培养至第4天，进行渗 透处理过的小球藻，吸取0.4ml培养物铺于含固体培养基中央直径 3cm的圆形有效轰击范围内，用6～9cm的子弹与靶细胞距离进行基 因枪轰击转化。转化完毕后用培养液清冼两次，然后将0.4ml混合小 球藻均匀涂于含含30μg/mlG418的固体培养基上，筛选出基因修饰 小球藻。3周左右可见到藻落的长出，长出的藻落通过固体培养保存 藻系，在含有G418 15μg/ml的液体培养中扩大繁殖。其它操作同实 施例1。

实施例8

采用分子生物学的方法人工合成新城疫病毒的主要免疫原性蛋 白基因即F基因，该基因含有启动子(Ubiquitin)和终止子，基因经 过修饰成为小球藻所偏嗜的密码子，前端为信号肽基因，片段两端为 内切酶位点(Xba I和sal I)。用相应的内切酶切表达载体和目的 片段，T4连接酶连接重组，构建相应的重组质粒。将重组质粒采用 电击法转化大肠杆菌(Escherichia coli Top10)进行大量培养繁殖， 抽提重组质粒。将在固体培养基上生长的直径约为1mm左右的单藻落 接种于20ml液体培养基中，转速80～100rpm，温度20～25℃，光照 培养16h，光照条件3000～4000lux，黑暗培养8h。后将，处于旺盛 分裂期的小球藻用含有0.2mol/L甘露醇和0.2mol/L山梨醇进行渗透 处理1～2h，用6.0～9.0Kb的高脉冲电压，0.05～0.2s的短脉冲时 间和多次脉冲(2n)，脉冲距离为2mm，进行100个循环周期的条件进 行电击转化；或抽提重组质粒后包裹金弹，对培养至第4天，进行渗 透处理过的小球藻，吸取0.4ml培养物铺于含固体培养基中央直径 3cm的圆形有效轰击范围内，用6～9cm的子弹与靶细胞距离进行基 因枪轰击转化。转化完毕后用培养液清冼两次，然后将0.4ml混合小 球藻均匀涂于含含30μg/mlG418的固体培养基上，筛选出基因修饰 小球藻。3周左右可见到藻落的长出，长出的藻落通过固体培养保存 藻系，在含有G418 15μg/ml的液体培养中扩大繁殖。其它操作同实 施例1。

实施例9

采用分子生物学的方法人工合成法氏囊病毒的主要免疫原性蛋 白基因即VP2基因，该基因含有启动子(Ubiquitin)和终止子，基因 经过修饰成为小球藻所偏嗜的密码子，前端为信号肽基因，片段两端 为内切酶位点(Xba I和sal I)。用相应的内切酶切表达载体和目 的片段，T4连接酶连接重组，构建相应的重组质粒。将重组质粒采 用电击法转化大肠杆菌(Escherichia coli Top10)进行大量培养繁 殖，抽提重组质粒。将在固体培养基上生长的直径约为1mm左右的单 藻落接种于20ml液体培养基中，转速80～100rpm，温度20～25℃， 光照培养16h，光照条件3000～4000lux，黑暗培养8h。后将，处于 旺盛分裂期的小球藻用含有0.2mol/L甘露醇和0.2mol/L山梨醇进行 渗透处理1～2h，用6.0～9.0Kb的高脉冲电压，0.05～0.2s的短脉 冲时间和多次脉冲(2n)，脉冲距离为2mm，进行100个循环周期的条 件进行电击转化；或抽提重组质粒后包裹金弹，对培养至第4天，进 行渗透处理过的小球藻，吸取0.4ml培养物铺于含固体培养基中央直 径3cm的圆形有效轰击范围内，用6～9cm的子弹与靶细胞距离进行 基因枪轰击转化。转化完毕后用培养液清冼两次，然后将0.4ml混合 小球藻均匀涂于含含30μg/mlG418的固体培养基上，筛选出基因修 饰小球藻。3周左右可见到藻落的长出，长出的藻落通过固体培养保 存藻系，在含有G418 15μg/ml的液体培养中扩大繁殖。其它操作同

实施例1。