技术领域
[0001] 本
发明主要涉及兽用诊断试剂盒及诊断方法。具体而言，本发明涉及用 于检测对象
生物来源的生物样本中是否存在抗小反刍兽疫病毒的
抗体(IgG) 的试剂盒。
背景技术
[0002] 小反刍兽疫(Peste des petits ruminants,PPR)是由小反刍兽疫病毒 (Pestedes petits ruminants virus,PPRV)引起的ー种急性、烈性、
接触性传染病， 因其较高的发病率和死亡率，对山羊、
绵羊、白尾鹿、野生的瞪羚羊和藏羚 羊等动物具有极大的威胁，是世界范围内公认的烈性传染病，我国也将该病 列为ー类动物传染病。因此，灵敏度高、特异性强的小反刍兽疫诊断方法的 建立就显得尤为迫切。小反刍兽疫病毒(PPRV)属于副粘病毒科 (Paramyxoviriade)麻疫病毒属(Morbollivirus)，同属的其他成员有
牛瘟病毒 (RPV)、犬瘟热病毒(CDV)、海豹瘟病毒(PDV)、海豚瘟病毒(DDV)、牛麻疹 病毒(MVKI)和人麻疹病毒(MV)等。PPRV的基因组结构为单股负链、无节段 RNA。目前，小反刍兽疫的诊断方法主要有病毒分离鉴定、抗体血清学检测、
抗原检测等。抗原检测方法有琼脂凝胶免疫扩散(AGID)、
对流免疫
电泳 (CIEP)、间接
荧光抗体试验(IFAT)等方法。抗体血清学诊断常采用OIE推荐 的病毒中和试验(VNT)和竞争ELISA(c-ELISA)。随着分子生物学技术的迅猛 发展，PCR技术得到了快速发展。
[0003] 世界动物卫生组织推荐采用的小反刍兽疫病毒抗体检测方法主要有病 毒中和试验(VNT)和酶联
免疫测定(ELISA)。其中，病毒中和试验方法的检测 结果准确，是检测小反刍兽疫病毒的金标准，但该方法检测时间长且不适于 检测大量样本。与此相对，酶联免疫测定的特异性和敏感性较高、检测时间 比病毒中和试验短且适合检测大量样品，因此，被广泛应用于小反刍兽疫病 毒抗体的检测。
[0004] 用于小反刍兽疫病毒抗体检测的酶联免疫测定方法主要包括竞争酶联 免疫测定(c-ELISA)、阻断酶联免疫测定(b-ELISA)和间接酶联免疫测定(间接 ELISA)。c-ELISA和b-ELISA的特异性和敏感性都比较高，是被临床普遍 接受的小反刍兽疫病毒抗体检测方法，例如国际上通用的法国BIRAD实验 室的小反刍兽疫诊断试剂盒就采用了c-ELISA方法。但是，c-ELISA和 b-ELISA均需使用单克隆抗体，这造成检测成本大幅提高；而且，c-ELISA 和b-ELISA的操作繁琐、检测时间长(虽然相对于VNT已经有所缩短)、判 据复杂。另一方面，传统的间接ELISA使用源自小反刍兽疫病毒的完整蛋 白(例如H蛋白、N蛋白、F蛋白等)或重组蛋白作为包被抗原来检测血清中 的抗体，其成本低于c-ELISA和b-ELISA；但是，由于该方法使用完整蛋白 作为抗原，容易发生抗体的错误识别和非特异性识别，因此，其特异性和敏 感性都不及c-ELISA和b-ELISA。
[0005] 因此，需要开发出检测成本低、检测时间短、操作简便、特异性和敏感 性高的小反刍兽疫诊断试剂盒。
发明内容
[0006] 鉴于上述
现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种检测成本 低、检测时间短、操作简便、特异性和敏感性高的小反刍兽疫诊断试剂盒， 以及能够用于制备该试剂盒的多肽或多肽组合。
[0007] 基于抗原表位多肽的间接ELISA方法使用抗原表位多肽(20个
氨基酸左 右的单条多肽通常只包含一个抗原表位)作为包被抗原。
发明人发现：该方 法的敏感性往往偏低，单条多肽的敏感性一般不会超过50％；而灵敏性高的 多肽，
假阳性率也高，即特异性低。如果能够通过某种方式同时提高检测的 特异性和敏感性，就可以克服传统的间接ELISA的缺点，开发出特异性和 敏感性均可媲美c-ELISA和b-ELISA、甚至更高的小反刍兽疫诊断试剂盒。
[0008] 发明人为解决上述技术问题进行了深入研究，结果发现了下述多肽组合 1。当以该下述多肽组合1中的至少任意两条对对象生物来源的生物样本有 响应作为指标时，可以以94.2％的敏感性和92.1％的特异性诊断小反刍兽疫， 完全可以与c-ELISA方法和b-ELISA方法媲美。
[0009] 因此，本发明包括：
[0010] 1.一种小反刍兽疫诊断试剂盒，其包括基底，以及独立地固定于所述基 底上的下述多肽组合1；
[0011] 多肽组合1由SEQ ID NO：1～11所示的多肽组成，
[0012] SEQ ID NO：1所示的序列为N50：SAEALFRLQAMAKILEDQEE的多 肽，[0013] SEQ ID NO：2所示的序列为N46：TKRTRSGKPRGETPGPLLPE的多 肽，[0014] SEQ ID NO：3所示的序列为N47：GETPGPLLPEIMQEDELSRE的多 肽，[0015] SEQ ID NO：4所示的序列为N48：IMQEDELSRESSQNPREAQR的多 肽，[0016] SEQ ID NO：5所示的序列为H1：MSAQRERINAFYKDNLHNKT的多 肽，[0017] SEQ ID NO：6所示的序列为N40：AKLVSEIASQTGDERTVRGT的多 肽，[0018] SEQ ID NO：7所示的序列为H9：TESIDHQTKDVLTPLFKIIG的多肽，[0019] SEQ ID NO：8所示的序列为H36：LSSHRGIIKDNEANWVVPST的多 肽，[0020] SEQ ID NO：9所示的序列为F54：LKPDLTGTSKSYVRSL的多肽，
[0021] SEQ ID NO：10所示的序列为F52：CCCKGRCRNKEIPASKINPG的多 肽，以及[0022] SEQ ID NO：11所示的序列为F45：EIDLGPAISLEKLDVGTNLG的多 肽。
[0023] 2.根据项1所述的小反刍兽疫诊断试剂盒，其用于通过检测对象生物来 源的生物样本中是否存在抗小反刍兽疫病毒的抗体(IgG)，诊断对象生物是否 被小反刍兽疫
病毒感染或小反刍兽疫
疫苗免疫。
[0024] 3.根据项2所述的小反刍兽疫诊断试剂盒，其中，所述对象生物小反刍 动物。
[0025] 4.根据项2或3所述的小反刍兽疫诊断试剂盒，其中，所述对象生物是 山羊或绵羊。
[0026] 5.根据项2～4中任一项所述的小反刍兽疫诊断试剂盒，其中，所述生物 样本是
全血、
血浆或血清。
[0027] 6.下述多肽组合1在制备小反刍兽疫诊断试剂盒中的用途；
[0028] 多肽组合1由SEQ ID NO：1～11所示的多肽组成，
[0029] SEQ ID NO：1所示的序列为N50：SAEALFRLQAMAKILEDQEE的多 肽，[0030] SEQ ID NO：2所示的序列为N46：TKRTRSGKPRGETPGPLLPE的多 肽，[0031] SEQ ID NO：3所示的序列为N47：GETPGPLLPEIMQEDELSRE的多 肽，[0032] SEQ ID NO：4所示的序列为N48：IMQEDELSRESSQNPREAQR的多 肽，[0033] SEQ ID NO：5所示的序列为H1：MSAQRERINAFYKDNLHNKT的多 肽，[0034] SEQ ID NO：6所示的序列为N40：AKLVSEIASQTGDERTVRGT的多 肽，[0035] SEQ ID NO：7所示的序列为H9：TESIDHQTKDVLTPLFKIIG的多肽，[0036] SEQ ID NO：8所示的序列为H36：LSSHRGIIKDNEANWVVPST的多 肽，[0037] SEQ ID NO：9所示的序列为F54：LKPDLTGTSKSYVRSL的多肽，
[0038] SEQ ID NO：10所示的序列为F52：CCCKGRCRNKEIPASKINPG的多 肽，以及[0039] SEQ ID NO：11所示的序列为F45：EIDLGPAISLEKLDVGTNLG的多 肽。
[0040] 7.根据项6所述的用途，其中，所述小反刍兽疫诊断试剂盒用于通过检 测对象生物来源的生物样本中是否存在抗小反刍兽疫病毒的抗体(IgG)，诊断 对象生物是否被小反刍兽疫病毒感染或小反刍兽疫疫苗免疫。
[0041] 8.根据项7所述的用途，其中，所述对象生物小
反刍动物。
[0042] 9.根据项7或8所述的用途，其中，所述对象生物是山羊或绵羊。
[0043] 10.根据项7～9中任一项所述的用途，其中，所述生物样本是全血、血 浆或血清。
[0044] 上述多肽及试剂盒可以用于检测对象生物来源的生物样本中是否存在 抗小反刍兽疫病毒的抗体(IgG)。通常，生物样本中的小反刍兽疫病毒抗体 (IgG)是由于对象生物被小反刍兽疫病毒感染或被小反刍兽疫疫苗免疫而产 生的，因此，上述多肽及试剂盒可以用于诊断对象生物是否被小反刍兽疫病 毒感染或小反刍兽疫疫苗免疫。
[0045] 发明的具体实施方式
[0046] 首先，本发明提供下述多肽组合1：
[0047] 多肽组合1由SEQ ID NO：1～11所示的多肽组成，
[0048] SEQ ID NO：1所示的序列为N50：SAEALFRLQAMAKILEDQEE的多 肽，[0049] SEQ ID NO：2所示的序列为N46：TKRTRSGKPRGETPGPLLPE的多 肽，[0050] SEQ ID NO：3所示的序列为N47：GETPGPLLPEIMQEDELSRE的多 肽，[0051] SEQ ID NO：4所示的序列为N48：IMQEDELSRESSQNPREAQR的多 肽，[0052] SEQ ID NO：5所示的序列为H1：MSAQRERINAFYKDNLHNKT的多 肽，[0053] SEQ ID NO：6所示的序列为N40：AKLVSEIASQTGDERTVRGT的多 肽，[0054] SEQ ID NO：7所示的序列为H9：TESIDHQTKDVLTPLFKIIG的多肽，[0055] SEQ ID NO：8所示的序列为H36：LSSHRGIIKDNEANWVVPST的多 肽，[0056] SEQ ID NO：9所示的序列为F54：LKPDLTGTSKSYVRSL的多肽，
[0057] SEQ ID NO：10所示的序列为F52：CCCKGRCRNKEIPASKINPG的多 肽，以及[0058] SEQ ID NO：11所示的序列为F45：EIDLGPAISLEKLDVGTNLG的多 肽。
[0059] 与基于抗原表位多肽的间接ELISA方法中，单条多肽的一般不超过50％ 的敏感性相比，在以该多肽组合1中的至少任意两条对对象生物来源的生物 样本有响应作为指标的情况下，可以以94.2％的敏感性和92.1％的特异性诊 断小反刍兽疫。
[0060] 本
说明书中，敏感性是指：用“金标准”方法确认的阳性样本中，被其他 方法测定为阳性样本的比例。特异性是指：用“金标准”方法确认的阴性样本 中，被其他方法测定为阴性样本的比例。对于小反刍兽疫病毒抗体的检测而 言，本技术领域的“金标准”是病毒中和试验(VNT)。
[0061] 上述多肽组合可以作为检测探针用于制备检测对象生物来源的生物样 本中是否存在抗小反刍兽疫病毒的抗体(IgG)的试剂盒。通常，生物样本中的 小反刍兽疫病毒抗体(IgG)是由于对象生物被小反刍兽疫病毒感染或被小反 刍兽疫疫苗免疫而产生的，因此，上述多肽组合及试剂盒可以用于诊断对象 生物是否被小反刍兽疫病毒感染或小反刍兽疫疫苗免疫。
[0062] 因此，本发明还提供一种小反刍兽疫诊断试剂盒，其包括基底，以及独 立地连接于所述基底上的上述多肽组合1。
[0063] 在本说明书中，基底通常为固体，可以是一个，也可以是多个，但优选 为一个，即全部多肽独立地连接于同一基底上。在本发明中，对基底没有特 殊限制，只要是固体或不溶性材料载体即可。多肽与基底的连接可以采用本 领域技术人员公知的多肽与固体材料的连接方法来进行。
[0064] 在本说明书中，所述对象生物优选为小反刍动物，更优选为山羊或绵羊。
[0065] 在本说明书中，所述生物样本可以是全血、血浆或血清。
[0066] 在使用上述试剂盒诊断小反刍兽疫的情况下，当所述多肽组合1中的任 意两条或两条以上多肽对对象生物来源的生物样本有响应时，判定该对象生 物已被小反刍兽疫病毒感染或小反刍兽疫疫苗免疫(即阳性)；反之，判定该 对象生物未被小反刍兽疫病毒感染或小反刍兽疫疫苗免疫(即阴性)。
[0067] 在本说明书中，“响应”是指：
信噪比(SNR)大于或等于2，其中，信 噪比＝(多肽点
信号值-阴性对照点信号值)/阴性对照点信号值。
实施例[0068] 1.多肽的制备与确认
[0069] SEQ ID NO：1～11的多肽由吉尔生化(上海)有限公司合成，并通过质 谱对其进行了确认。其中，
[0070] SEQ ID NO：1所示的多肽的序列为N50：SAEALFRLQAMAKILEDQEE，[0071] SEQ ID NO：2所示的多肽的序列为N46：TKRTRSGKPRGETPGPLLPE，[0072] SEQ ID NO：3所示的多肽的序列为N47：GETPGPLLPEIMQEDELSRE，[0073] SEQ ID NO：4所示的多肽的序列为N48：IMQEDELSRESSQNPREAQR，[0074] SEQ ID NO：5所示的多肽的序列为H1：MSAQRERINAFYKDNLHNKT，[0075] SEQ ID NO：6所示的多肽的序列为N40：AKLVSEIASQTGDERTVRGT，[0076] SEQ ID NO：7所示的多肽的序列为H9：TESIDHQTKDVLTPLFKIIG，[0077] SEQ ID NO：8所示的多肽的序列为H36：LSSHRGIIKDNEANWVVPST，[0078] SEQ ID NO：9所示的多肽的序列为F54：LKPDLTGTSKSYVRSL，
[0079] SEQ ID NO：10所示的多肽的序列为F52：CCCKGRCRNKEIPASKINPG，[0080] SEQ ID NO：11所示的多肽的序列为F45：EIDLGPAISLEKLDVGTNLG。
[0081] 2.试剂盒(多肽芯片)1的制备
[0082] 试剂盒1
[0083] 多肽芯片是将SEQ ID NO：1～11的多肽的溶液分别点样在固体
支撑材 料——“0+X”膜(iPDMS膜)上制备而成的(同时点样一个山羊IgG作为阳 性质控点以及一个PB点作为阴性质控点)。“0+X”膜是将带烯
烃末端的、表 面引发聚合反应的引发剂加入到聚二甲基
硅氧烷材料中，随后以热交联(硅 氢键键合)的方式固定到聚二甲基硅氧烷的三维结构中，得到的一种材料。 其制作过程可参见国际公开
专利WO2014/044184。
[0084] 3.用试剂盒进行检测
[0085] 将多肽芯片置于室温20min，肉眼观察芯片表面，将有缺损的多肽芯片 淘汰，同时确定多肽芯片的正确方向，夹于凸槽，按照血清的数量进行芯片 的编号，然后在合格的多肽芯片内注满TBST(0.4M Tris-HCl，2.74M NaCl， 2％Tween20，pH7.2±0.2)，室温放置2-4min，检查有无漏夜，将漏液的多肽 芯片弃去。填补空缺的多肽芯片，操作同上。将检验合格的多肽芯片夹于凸 槽上，每8个芯片为一组，用TBST润洗2次，喷壶淋洗，一孔进一孔出， 形成流动，最后在纱布上轻轻拍打，再一个一个取盖甩干，但要注意保持多 肽芯片表面湿润，备用。
[0086] 在超净台内将血清稀释50倍(5μl血清样本+245μl血清稀释液)分别做 编号，震荡混匀，使芯片编号与血清编号互相一致，在已经润洗的芯片上上 样，200μl/孔，避免产生气泡，加入经稀释后的血清200μl，室温，摇床150rpm， 孵育30min。
[0087] 弃液，淋洗4次(方法同上)，甩干，加入二抗(兔抗山羊IgG)，室 温，摇床150rpm，孵育30min。
[0088] 弃液，弃盖，淋洗4次，甩干，每8个芯片为一组，加20μl/孔的发光 液(Thermo，Prod#37074)，曝光2min。使用GenePix Pro6.0采集数据。
[0089] 对于每一份血清，分别统计该试剂盒中的每一条多肽是否有响应(即， 信噪比(SNR)大于等于2)，并进行判定。
[0090] 对于上述试剂盒1，当检测到SEQ ID NO：1～11所示的多肽中的任意两 条或两条以上有响应时，判定为小反刍兽疫阳性；反之，判定为阴性。
[0091] 其中，信噪比＝(多肽点信号值-阴性对照点信号值)/阴性对照点信号值。 多肽点信号值是指
软件读取的多肽点的
化学发光强度值，阴性对照点信号值 是指软件读取的阴性对照点的化学发光强度值。
[0092] 对于755份来自中国各地区的山羊和绵羊血清样本，分别采用上述步骤 2中制备的试剂盒(按上述3的步骤)以及病毒中和试验(VNT，按OIE(2010) 《小反刍兽疫病毒中和试验》所述方法)进行检测，检测结果如下所示。
[0093] 表1
[0094]
[0095]
[0096] 敏感性＝376/399*100％＝94.2％
[0097] 特异性＝328/356＝92.1％
[0098] 由以上可知，试剂盒1的敏感性和特异性均在90％以上(且是采用VNT 方法验证，不是采用对照试剂盒方法验证)，足以媲美采用c-ELISA方法或 b-ELISA方法的试剂盒。
