小反刍兽疫病毒抗体检测试剂盒
阅读：232发布：2020-05-15
专利汇可以提供小反刍兽疫病毒抗体检测试剂盒专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及小反刍兽疫病毒 抗体 检测 试剂 盒 。本发明的检测试剂盒包括一个或多个固体载体，以及独立地连接于所述一个或多个固体载体上的特定多肽或特定多肽组合。，下面是小反刍兽疫病毒抗体检测试剂盒专利的具体信息内容。
1.一种小反刍兽疫病毒抗体(IgG)检测试剂盒，其包括一个或多个固体载体，以及独立地连接于所述一个或多个固体载体上的下述多肽组合3或多肽组合4；
多肽组合3
SEQ ID NO：1所示的多肽，以及SEQ ID NO：4所示的多肽；
多肽组合4
SEQ ID NO：1所示的多肽，以及SEQ ID NO：5所示的多肽。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其用于通过检测对象生物来源的生物样本中是否存在抗小反刍兽疫病毒的抗体(IgG)，诊断对象生物是否被小反刍兽疫病毒感染或小反刍兽疫疫苗免疫。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其中，所述对象生物小反刍动物。
4.根据权利要求2所述的试剂盒，其中，所述对象生物是山羊或绵羊。
5.根据权利要求2所述的试剂盒，其中，所述生物样本是全血、血浆或血清。
6.下述多肽组合3或多肽组合4在制备用于检测对象生物来源的生物样本中是否存在抗小反刍兽疫病毒的抗体(IgG)的试剂盒中的用途；
多肽组合3
SEQ ID NO：1所示的多肽，以及SEQ ID NO：4所示的多肽；
多肽组合4
SEQ ID NO：1所示的多肽，以及SEQ ID NO：5所示的多肽。
7.根据权利要求6所述的用途，其中，所述对象生物小反刍动物。
8.根据权利要求6所述的用途，其中，所述对象生物是山羊或绵羊。
9.根据权利要求6所述的用途，其中，所述生物样本是全血、血浆或血清。
小反刍兽疫病毒抗体检测试剂盒
技术领域
背景技术
[0003] 小反刍兽疫(peste des petits ruminants，PPR)俗称羊瘟，又名小反刍兽假性牛瘟(pseudorinderpest)、肺肠炎(pneumoenteritis)、口炎肺肠炎复合症(stomatitis-pneumoenteritis complex)，是由小反刍兽疫病毒引起的一种急性病毒性传染病，主要感染小反刍动物，以发热、口炎、腹泻、肺炎为特征。
[0004] 1942年本病首次在象牙海岸发生，其后，非洲的塞内加尔、加纳、多哥、贝宁等有本病报道，尼日利亚的绵羊和山羊中也发生了本病，并造成了重大损失。亚洲的一些国家也报道了本病，根据世界动物卫生组织(OIE)1993年《世界动物卫生》报道，孟加拉国的山羊有本病发生，印度德拉邦和马哈拉施特拉邦的部分地区绵羊中发生了类似牛瘟的疾病，最后确诊为小反刍兽疫，此后，泰米尔拉德邦也有受到感染报道。1993年，以色列第一次报道有小反刍兽疫发生，传染来源不明，为防止本病传播，以色列对其北部地区的绵羊和山羊接种了牛瘟疫苗。1992年，约旦的绵羊和山羊中发现了本病特异性抗体，1993年，有11个农场出现临诊病例，100多只绵羊和山羊死亡。1993年，沙特阿拉伯首次发现133个病例。2007年7月，该疫病首次传入我国西藏地区。
[0005] 小反刍兽疫病毒属副黏病毒科麻疹病毒属。与牛瘟病毒有相似的物理化学及免疫学特性。病毒呈多形性，通常为粗糙的球形。病毒颗粒较牛瘟病毒大，核衣壳为螺旋中空杆状并有特征性的亚单位，有囊膜。病毒可在胎绵羊肾、胎羊及新生羊的睾丸细胞、Vero细胞上增殖，并产生细胞病变(CPE)，形成合胞体。
[0006] 本病主要感染山羊、绵羊、美国白尾鹿等小反刍动物，流行于非洲西部、中部和亚洲的部分地区。在疫区，本病为零星发生，当易感动物增加时，即可发生流行。本病主要通过直接接触传染，病畜的分泌物和排泄物是传染源，处于亚临诊型的病羊尤为危险。小反刍兽疫潜伏期为4-5天，最长21天。自然发病仅见于山羊和绵羊。山羊发病严重，绵羊也偶有严重病例发生。一些康复山羊的唇部形成口疮样病变。感染动物临诊症状与牛瘟病牛相似。急性型体温可上升至41℃，并持续3～5天。感染动物烦躁不安，背毛无光，口鼻干燥，食欲减退。流黏液脓性鼻漏，呼出恶臭气体。在发热的前4天，口腔黏膜充血，颊黏膜进行性广泛性损害、导致多涎，随后出现坏死性病灶，开始口腔黏膜出现小的粗糙的红色浅表坏死病灶，以后变成粉红色，感染部位包括下唇、下齿龈等处。严重病例可见坏死病灶波及齿垫、腭、颊部及其乳头、舌头等处。后期出现带血水样腹泻，严重脱水，消瘦，随之体温下降。出现咳嗽、呼吸异常。发病率高达100％，在严重暴发时，死亡率为100％，在轻度发生时，死亡率不超过
50％。幼年动物发病严重发病率和死亡都很高，为我国划定的一类疾病。
50％。幼年动物发病严重发病率和死亡都很高，为我国划定的一类疾病。
[0007] 因本病毒对胃肠道淋巴细胞及上皮细胞具有特殊的亲和力，故能引起特征性病变。一般在感染细胞中出现嗜酸性胞浆包涵体及多核巨细胞。在淋巴组织中，小反刍兽疫病毒可引起淋巴细胞坏死。脾脏、扁桃体、淋巴结细胞被破坏。含嗜酸性胞浆包涵体的多核巨细胞出现，极少有核内包涵体。在消化系统，病毒引起马尔基氏层深部的上皮细胞发生坏死，感染细胞产生核固缩和核破裂，在表皮生发层形成含有嗜酸性胞浆包涵体的多核巨细胞。
[0008] 目前，尚无有效方法治疗小反刍兽疫，只能采取疫苗接种、疫情发生后扑杀及定期血清监测的方法来进行控制。因此，该病的血清学诊断及疫苗免疫效果的评估与监测显得尤为重要。
[0009] 世界动物卫生组织推荐采用的小反刍兽疫病毒抗体检测方法主要有病毒中和试验(VNT)和酶联免疫测定(ELISA)。其中，病毒中和试验方法的检测结果准确，是检测小反刍兽疫病毒的金标准，但该方法检测时间长且不适于检测大量样本。与此相对，酶联免疫测定的特异性和敏感性较高、检测时间比病毒中和试验短且适合检测大量样品，因此，被广泛应用于小反刍兽疫病毒抗体的检测。
[0010] 用于小反刍兽疫病毒抗体检测的酶联免疫测定方法主要包括竞争酶联免疫测定(c-ELISA)、阻断酶联免疫测定(b-ELISA)和间接酶联免疫测定(间接ELISA)。c-ELISA和b-ELISA的特异性和敏感性都比较高，是被临床普遍接受的小反刍兽疫病毒抗体检测方法，例如国际上通用的法国BIRAD实验室的小反刍兽疫诊断试剂盒就采用了c-ELISA方法。但是，c-ELISA和b-ELISA均需使用单克隆抗体，这造成检测成本大幅提高；而且，c-ELISA和b-ELISA的操作繁琐、检测时间长(虽然相对于VNT已经有所缩短)、判据复杂。另一方面，传统的间接ELISA使用源自小反刍兽疫病毒的完整蛋白(例如H蛋白、N蛋白、F蛋白等)或重组蛋白作为包被抗原来检测血清中的抗体，其成本低于c-ELISA和b-ELISA；但是，由于该方法使用完整蛋白作为抗原，容易发生抗体的错误识别和非特异性识别，因此，其特异性和敏感性都不及c-ELISA和b-ELISA。
[0011] 因此，需要开发出检测成本低、检测时间短、操作简便、特异性和敏感性高的小反刍兽疫病毒抗体检测试剂盒。
发明内容
[0012] 鉴于上述现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种检测成本低、检测时间短、操作简便、特异性和敏感性高的小反刍兽疫病毒抗体检测试剂盒，以及能够用于制备该试剂盒的多肽或多肽组合。
[0013] 基于抗原表位多肽的间接ELISA方法由于使用抗原表位多肽(20个氨基酸左右的单条多肽通常只包含一个抗原表位)作为包被抗原。发明人发现：该方法的敏感性往往偏低，单条多肽的敏感性一般不会超过50％；而灵敏性高的多肽，假阳性率也高，即特异性低。如果能够找到敏感性和特异性都高的抗原表位多肽，就可以克服传统的间接ELISA的缺点，开发出特异性和敏感性均可媲美c-ELISA和b-ELISA、甚至更高的小反刍兽疫病毒抗体检测试剂盒。
[0014] 发明人为解决上述技术问题进行了深入研究，结果发现了SEQ ID NO：1所示的多肽，用该多肽单独检测小反刍兽疫病毒抗体的敏感性为70.2％、特异性为99.4％。特别是，当用SEQ ID NO：1所示的多肽与SEQ ID NO：2所示的多肽组合检测小反刍兽疫病毒抗体时，敏感性为88.7％、特异性为94.9％；而当用SEQ ID NO：1所示的多肽与SEQ ID NO：3所示的多肽组合检测小反刍兽疫病毒抗体时，敏感性为87.2％、特异性为91.3％；完全可以与c-ELISA方法和b-ELISA方法媲美。
[0015] 发明人还发现，当用SEQ ID NO：1所示的多肽与SEQ ID NO：4所示的多肽组合检测小反刍兽疫病毒抗体时，敏感性为86.5％、特异性为95.2％；而当用SEQ ID NO：1所示的多肽与SEQ ID NO：5所示的多肽组合检测小反刍兽疫病毒抗体时，敏感性为85.7％、特异性为94.4％；完全可以与c-ELISA方法和b-ELISA方法媲美。
[0016] 发明人还发现，当用SEQ ID NO：1所示的多肽与SEQ ID NO：6所示的多肽组合检测小反刍兽疫病毒抗体时，敏感性为85％、特异性为92.7％。更好的效果是，当用SEQ ID NO：1所示的多肽、SEQ ID NO：6所示的多肽和SEQ ID NO：7所示的多肽组合检测小反刍兽疫病毒抗体时，敏感性为89％、特异性为89.9％；完全可以与c-ELISA方法和b-ELISA方法媲美。
[0017] 因此，本发明包括：
[0018] 1.SEQ ID NO：1所示的多肽。
[0019] 2.SEQ ID NO：2所示的多肽。
[0020] 3.SEQ ID NO：3所示的多肽。
[0021] 4.SEQ ID NO：1所示的多肽与SEQ ID NO：2所示的多肽的组合。
[0022] 5.SEQ ID NO：1所示的多肽与SEQ ID NO：3所示的多肽的组合
[0023] 6.上述多肽或多肽组合在制备用于检测对象生物来源的生物样本中是否存在抗小反刍兽疫病毒的抗体(IgG)的试剂盒中的用途。
[0024] 7.一种小反刍兽疫病毒抗体(IgG)检测试剂盒，其包括一个或多个固体载体，以及独立地连接于所述一个或多个固体载体上的下述多肽组合1；
[0025] 多肽组合1
[0026] SEQ ID NO：1所示的多肽，以及
[0027] SEQ ID NO：2所示的多肽。
[0028] 8.一种小反刍兽疫病毒抗体(IgG)检测试剂盒，其包括一个或多个固体载体，以及独立地连接于所述一个或多个固体载体上的下述多肽组合2；
[0029] 多肽组合2
[0030] SEQ ID NO：1所示的多肽，以及
[0031] SEQ ID NO：3所示的多肽。
[0033] 10.下述多肽组合1在制备用于检测对象生物来源的生物样本中是否存在抗小反刍兽疫病毒的抗体(IgG)的试剂盒中的用途；
[0034] 多肽组合1
[0035] SEQ ID NO：1所示的多肽，以及
[0036] SEQ ID NO：2所示的多肽。
[0037] 11.下述多肽组合2在制备用于检测对象生物来源的生物样本中是否存在抗小反刍兽疫病毒的抗体(IgG)的试剂盒中的用途；
[0038] 多肽组合2
[0039] SEQ ID NO：1所示的多肽，以及
[0040] SEQ ID NO：3所示的多肽。
[0041] 本发明还包括：
[0042] 12.SEQ ID NO：4所示的多肽。
[0043] 13.SEQ ID NO：5所示的多肽。
[0044] 14.SEQ ID NO：1所示的多肽与SEQ ID NO：4所示的多肽的组合。
[0045] 15.SEQ ID NO：1所示的多肽与SEQ ID NO：5所示的多肽的组合。
[0046] 16.上述多肽或多肽组合在制备用于检测对象生物来源的生物样本中是否存在抗小反刍兽疫病毒的抗体(IgG)的试剂盒中的用途。
[0047] 17.一种小反刍兽疫病毒抗体(IgG)检测试剂盒，其包括一个或多个固体载体，以及独立地连接于所述一个或多个固体载体上的下述多肽组合1；
[0048] 多肽组合3
[0049] SEQ ID NO：1所示的多肽，以及
[0050] SEQ ID NO：4所示的多肽。
[0051] 18.一种小反刍兽疫病毒抗体(IgG)检测试剂盒，其包括一个或多个固体载体，以及独立地连接于所述一个或多个固体载体上的下述多肽组合2；
[0052] 多肽组合4
[0053] SEQ ID NO：1所示的多肽，以及
[0054] SEQ ID NO：5所示的多肽。
[0055] 19.根据权利要求17或18所述的小反刍兽疫病毒抗体(IgG)检测试剂盒，其不包含其它探针分子(例如多肽、蛋白或核酸)。
[0056] 20.下述多肽组合3在制备用于检测对象生物来源的生物样本中是否存在抗小反刍兽疫病毒的抗体(IgG)的试剂盒中的用途；
[0057] 多肽组合3
[0058] SEQ ID NO：1所示的多肽，以及
[0059] SEQ ID NO：4所示的多肽。
[0060] 21.下述多肽组合4在制备用于检测对象生物来源的生物样本中是否存在抗小反刍兽疫病毒的抗体(IgG)的试剂盒中的用途；
[0061] 多肽组合4
[0062] SEQ ID NO：1所示的多肽，以及
[0063] SEQ ID NO：5所示的多肽。
[0064] 此外，本发明还包括：
[0065] 22.SEQ ID NO：6所示的多肽。
[0066] 23.SEQ ID NO：7所示的多肽。
[0067] 24.SEQ ID NO：1所示的多肽与SEQ ID NO：6所示的多肽的组合。
[0068] 25.SEQ ID NO：1所示的多肽、SEQ ID NO：6所示的多肽与SEQ ID NO：7所示的多肽的组合。
[0069] 26.上述多肽或多肽组合在制备用于检测对象生物来源的生物样本中是否存在抗小反刍兽疫病毒的抗体(IgG)的试剂盒中的用途。
[0070] 27.一种小反刍兽疫病毒抗体(IgG)检测试剂盒，其包括一个或多个固体载体，以及独立地连接于所述一个或多个固体载体上的下述多肽组合1；
[0071] 多肽组合5
[0072] SEQ ID NO：1所示的多肽，以及
[0073] SEQ ID NO：6所示的多肽。
[0074] 28.一种小反刍兽疫病毒抗体(IgG)检测试剂盒，其包括一个或多个固体载体，以及独立地连接于所述一个或多个固体载体上的下述多肽组合6；
[0075] 多肽组合6
[0076] SEQ ID NO：1所示的多肽，
[0077] SEQ ID NO：6所示的多肽，以及
[0078] SEQ ID NO：7所示的多肽。
[0079] 29.根据权利要求27或28所述的小反刍兽疫病毒抗体(IgG)检测试剂盒，其不包含其它探针分子(例如多肽、蛋白或核酸)。
[0080] 30.下述多肽组合5在制备用于检测对象生物来源的生物样本中是否存在抗小反刍兽疫病毒的抗体(IgG)的试剂盒中的用途；
[0081] 多肽组合5
[0082] SEQ ID NO：1所示的多肽，以及
[0083] SEQ ID NO：6所示的多肽。
[0084] 31.下述多肽组合6在制备用于检测对象生物来源的生物样本中是否存在抗小反刍兽疫病毒的抗体(IgG)的试剂盒中的用途；
[0085] 多肽组合6
[0086] SEQ ID NO：1所示的多肽，
[0087] SEQ ID NO：6所示的多肽，以及
[0088] SEQ ID NO：7所示的多肽。
[0091] 上述多肽及试剂盒可以用于检测对象生物来源的生物样本中是否存在抗小反刍兽疫病毒的抗体(IgG)。通常，生物样本中的小反刍兽疫病毒抗体是由于对象生物被小反刍兽疫病毒感染或被小反刍兽疫疫苗免疫而产生的，因此，上述多肽及试剂盒可以用于诊断对象生物是否被小反刍兽疫病毒感染或小反刍兽疫疫苗免疫。
[0092] 发明的具体实施方式
[0093] 首先，本发明提供SEQ ID NO：1～7所示的多肽，这些多肽作为检测对象生物来源的生物样本中是否存在抗小反刍兽疫病毒的抗体(IgG)的检测工具是有用的。而且，发明人发现，SEQ ID NO：1所示的多肽单独检测小反刍兽疫病毒抗体的敏感性为70.2％、特异性为99.4％。与基于抗原表位多肽的间接ELISA方法中，单条多肽的一般不超过50％的敏感性相比，SEQ ID NO：1所示的多肽的敏感性是惊人的，因此，其取得了预料不到的技术效果。
[0094] 本说明书中，敏感性是指：用“金标准”方法确认的阳性样本中，被其他方法测定为阳性样本的比例。特异性是指：用“金标准”方法确认的阴性样本中，被其他方法测定为阴性样本的比例。对于小反刍兽疫病毒抗体的检测而言，本技术领域的“金标准”是病毒中和试验(VNT)。
[0095] 所述SEQ ID NO：1所示的多肽可以作为检测探针用于制备检测对象生物来源的生物样本中是否存在抗小反刍兽疫病毒的抗体的试剂盒。
[0096] 此外，本发明还提供SEQ ID NO：2～7所示的多肽。
[0097] 此外，本发明还提供下述多肽组合1～6。
[0098] 多肽组合1
[0099] SEQ ID NO：1所示的多肽，以及
[0100] SEQ ID NO：2所示的多肽。
[0101] 多肽组合2
[0102] SEQ ID NO：1所示的多肽，以及
[0103] SEQ ID NO：3所示的多肽。
[0104] 多肽组合2-1
[0105] SEQ ID NO：1所示的多肽，
[0106] SEQ ID NO：2所示的多肽，以及
[0107] SEQ ID NO：3所示的多肽。
[0108] 多肽组合3
[0109] SEQ ID NO：1所示的多肽，以及
[0110] SEQ ID NO：4所示的多肽。
[0111] 多肽组合4
[0112] SEQ ID NO：1所示的多肽，以及
[0113] SEQ ID NO：5所示的多肽。
[0114] 多肽组合4-1
[0115] SEQ ID NO：1所示的多肽，
[0116] SEQ ID NO：4所示的多肽，以及
[0117] SEQ ID NO：5所示的多肽。
[0118] 多肽组合5
[0119] SEQ ID NO：1所示的多肽，以及
[0120] SEQ ID NO：6所示的多肽。
[0121] 多肽组合6
[0122] SEQ ID NO：1所示的多肽，
[0123] SEQ ID NO：6所示的多肽，以及
[0124] SEQ ID NO：7所示的多肽。
[0125] 多肽组合6-1
[0126] SEQ ID NO：1所示的多肽，以及
[0127] SEQ ID NO：7所示的多肽。
[0128] 将上述多肽用于检测对象生物来源的生物样本中是否存在抗小反刍兽疫病毒的抗体，敏感性和特异性均在85％以上(且是采用VNT方法验证，不是采用对照试剂盒方法验证)，足以媲美采用c-ELISA方法或b-ELISA方法。
[0129] 因此，上述多肽组合可以作为检测探针用于制备检测对象生物来源的生物样本中是否存在抗小反刍兽疫病毒的抗体的试剂盒。
[0130] 因此，本发明还提供一种小反刍兽疫病毒抗体检测试剂盒，其包括一个或多个固体载体，以及独立地连接于所述一个或多个固体载体上的上述多肽组合中的一个或多个。
[0131] 在本说明书中，固体载体可以是一个，也可以是多个，但优选为一个，即全部多肽独立地连接于同一固体载体上。在本发明中，对固体载体没有特殊限制，只要是作为固体或不溶性材料的载体即可。多肽与固体载体的连接可以采用本领域技术人员公知的多肽与固体载体的连接方法来进行。
[0132] 在本说明书中，所述对象生物优选为小反刍动物，更优选为山羊或绵羊。
[0133] 在本说明书中，所述生物样本可以是全血、血浆或血清。
[0134] 在使用上述试剂盒检测对象生物来源的生物样本中是否存在抗小反刍兽疫病毒的抗体的情况下，当所述多肽组合中的任意一条或多条多肽对对象生物来源的生物样本有响应时，判定为该对象生物来源的生物样本中存在抗小反刍兽疫病毒的抗体(即阳性)；反之，当所述多肽组合中没有任何一条多肽对对象生物来源的生物样本有响应时，判定为该对象生物来源的生物样本中不存在抗小反刍兽疫病毒的抗体(即阴性)。
[0136] 1.多肽的制备与确认
[0137] SEQ ID NO：1～7的多肽由吉尔生化(上海)有限公司合成，并通过质谱对其进行了确认。其中，
[0138] SEQ ID NO：1：SAEALFRLQAMAKILEDQEE。
[0139] SEQ ID NO：2：TKRTRSGKPRGETPGPLLPE。
[0140] SEQ ID NO：3：GETPGPLLPEIMQEDELSRE。
[0141] SEQ ID NO：4：TKNVRPIQTLTPGRRTRRFV。
[0142] SEQ ID NO：5：SSQNPREAQRSAEALFRLQA。
[0143] SEQ ID NO：6：NQDPDKLLTVIASDKCPVVE。
[0144] SEQ ID NO：7：TPGRRTRRFVGAVLAGVALG。
[0145] 2.试剂盒(检测芯片)1～3的制备
[0146] 试剂盒1
[0147] 采用常规方法在常规的ELISA用固相载体上点样上述SEQ ID NO：1所示的多肽的溶液，另外点样一个山羊IgG作为阳性质控点以及一个PB点作为阴性质控点，制备了检测芯片。
[0148] 试剂盒2
[0149] 除了在固相载体上分别点样上述SEQ ID NO：1和2所示的多肽的溶液外，按照与上述试剂盒1相同的制备方法制备了检测芯片，即为试剂盒2。试剂盒3
[0150] 除了在固相载体上分别点样上述SEQ ID NO：1和3所示的多肽的溶液外，按照与上述试剂盒1相同的制备方法制备了检测芯片，即为试剂盒3。试剂盒4
[0151] 除了在固相载体上分别点样上述SEQ ID NO：1和4所示的多肽的溶液外，按照与上述试剂盒1相同的制备方法制备了检测芯片，即为试剂盒4。试剂盒5
[0152] 除了在固相载体上分别点样上述SEQ ID NO：1和5所示的多肽的溶液外，按照与上述试剂盒1相同的制备方法制备了检测芯片，即为试剂盒5。试剂盒6
[0153] 除了在固相载体上分别点样上述SEQ ID NO：1和6所示的多肽的溶液外，按照与上述试剂盒1相同的制备方法制备了检测芯片，即为试剂盒6。试剂盒7
[0154] 除了在固相载体上分别点样上述SEQ ID NO：1、6和7所示的多肽的溶液外，按照与上述试剂盒1相同的制备方法制备了检测芯片，即为试剂盒7。
[0155] 3.用试剂盒进行检测
[0156] 检验步骤
[0157] (1)、用纯化水将20×浓缩清洗液(TBST：0.4M Tris-HCl，2.74M NaCl，2％Tween20，pH7.2±0.2)按1:20进行稀释，得到清洗液。为使检测芯片表面完全浸润，用移液枪将约200μL清洗液加到检测芯片表面，并浸泡检测芯片一定时间。
[0158] (2)、用样本稀释液(0.05MPBS，1％BSA，0.2％PVP，0.5％Tween20，pH7.2±0.2)将待测血清样本按照1:50稀释。
[0159] (3)、对于弃去了清洗液的检测芯片，在表面完全湿润的状态下，吸取200μL稀释后的血清样本加入到检测芯片上。
[0160] (4)、在恒温摇床中以150转/分钟将检测芯片孵育30分钟，温度为室温。
[0161] (5)、弃去血清样本，用清洗液清洗检测芯片的表面。
[0162] (6)、清洗后，在检测芯片上加入200μL的酶标抗体溶液(兔抗山羊IgG-HRP，Sigma，A5420)，在恒温摇床中以150转/分钟将检测芯片孵育30分钟，温度为室温。
[0163] (7)、弃去酶标抗体溶液，用清洗液将检测芯片表面清洗干净。
[0164] (8)、清洗完成后，在检测芯片表面上均匀铺展20μL的发光底物液(Thermo，Prod#37074)。
[0165] (9)、将用凝胶成像仪对检测芯片进行化学发光成像，并判定结果。
[0166] (10)、结果判定：对于每一份血清，分别统计该试剂盒中的每一条多肽是否有响应(即，信噪比(SNR)大于等于2)，并进行判定。即，
[0167] 对于上述试剂盒1，当检测到SEQ ID NO：1所示的多肽有响应时，判定为小反刍兽疫病毒抗体阳性；反之，判定为阴性。
[0168] 对于上述试剂盒2，当检测到SEQ ID NO：1和/或2所示的多肽有响应时，判定为小反刍兽疫病毒抗体阳性；反之，判定为阴性。
[0169] 对于上述试剂盒3，当检测到SEQ ID NO：1和/或3所示的多肽有响应时，判定为小反刍兽疫病毒抗体阳性；反之，判定为阴性。
[0170] 对于上述试剂盒4，当检测到SEQ ID NO：1和/或4所示的多肽有响应时，判定为小反刍兽疫病毒抗体阳性；反之，判定为阴性。
[0171] 对于上述试剂盒5，当检测到SEQ ID NO：1和/或5所示的多肽有响应时，判定为小反刍兽疫病毒抗体阳性；反之，判定为阴性。
[0172] 对于上述试剂盒6，当检测到SEQ ID NO：1和/或6所示的多肽有响应时，判定为小反刍兽疫病毒抗体阳性；反之，判定为阴性。
[0173] 对于上述试剂盒7，当检测到SEQ ID NO：1和/或6和/或7所示的多肽有响应时，判定为小反刍兽疫病毒抗体阳性；反之，判定为阴性。
[0175] 对于755份来自中国各地区的山羊和绵羊血清样本，分别采用上述步骤2中制备的试剂盒(按上述3的步骤)以及病毒中和试验(VNT，按OIE(2010)《小反刍兽疫病毒中和试验》所述方法)进行检测，检测结果如下所示。
[0176] 表1
[0177]
[0178]
[0179] 敏感性＝280/399*100％＝70.2％
[0180] 特异性＝354/356＝99.4％
[0181] 表2
[0182]
[0183] 敏感性＝354/399*100％＝88.7％
[0184] 特异性＝338/356＝94.9％
[0185] 表3
[0186]
[0187] 敏感性＝348/399*100％＝87.2％
[0188] 特异性＝325/356＝91.3％
[0189] 表4
[0190]
[0191] 敏感性＝345/399*100％＝86.5％
[0192] 特异性＝339/356＝95.2％
[0193] 表5
[0194]
[0195] 敏感性＝342/399*100％＝85.7％
[0196] 特异性＝336/356＝94.4％
[0197] 表6
[0198]
[0199] 敏感性＝339/399*100％＝85.0％
[0200] 特异性＝330/356＝92.7％
[0201] 表7
[0202]
[0203] 敏感性＝35539/399*100％＝89.0％
[0204] 特异性＝320/356＝89.9％
[0205] 由以上可知，试剂盒2～7的敏感性和特异性均在85％以上(且是采用VNT方法验证，不是采用对照试剂盒方法验证)，足以媲美采用c-ELISA方法或b-ELISA方法的试剂盒。
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