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重组猪FSH-CTP融合蛋白及其制备方法与应用

阅读：127发布：2020-07-17

专利汇可以提供重组猪FSH-CTP融合蛋白及其制备方法与应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明提供一种重组猪FSH‑CTP融合蛋白，所述融合蛋白是指猪FSH的β亚基直接或间接与人、灵长类或马属哺乳动物绒毛膜促性腺激素的β亚基羧端肽CTP相连，猪FSH的α亚基通过范德华力与猪FSH的β亚基结合。所述融合蛋白可基于基因工程技术，利用真核表达系统制备得到。本发明提供的猪FSH‑CTP融合蛋白与猪垂体FSH相比，半衰期更长，药效更好，可代替目前市场上的猪垂体FSH和孕马血清促性腺激素在动物繁殖领域使用。，下面是重组猪FSH-CTP融合蛋白及其制备方法与应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.重组猪FSH-CTP融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白是指猪FSH的β亚基直接或间接与绒毛膜促性腺激素的β亚基羧端肽CTP相连，猪FSH的α亚基通过范德华力与猪FSH的β亚基结合；
其中，所述绒毛膜促性腺激素来自于人、灵长类或马属哺乳动物。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白为pFSH-hCTP或pFSH-eCTP；
pFSH-hCTP：含有两条肽链，符合以下方程：(pFSHα:pFSHβ-hCTP)2，其中pFSHα是指猪FSH的α亚基；冒号代表猪FSHα亚基和β亚基以范德华力连接；pFSHβ是指猪FSH的β亚基；hCTP是指人绒毛膜促性腺激素β亚基羧端肽；括号外下标2代表所述猪FSH融合蛋白为二价同二聚体；
pFSH-eCTP：含有两条肽链，符合以下方程：(pFSHα:pFSHβ-eCTP)2，其中pFSHα是指猪FSH的α亚基；冒号代表猪FSHα亚基和β亚基以范德华力连接；pFSHβ是指猪FSH的β亚基；eCTP是指马绒毛膜促性腺激素β亚基羧端肽；括号外下标2代表所述猪FSH融合蛋白为二价同二聚体。
3.根据权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白pFSH-hCTP中的pFSHβ-hCTP为：
i)由SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列构成的蛋白；或
ii)SEQ ID NO:3所示氨基酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸且同等功能的由i)衍生的蛋白；或
iii)与SEQ ID NO:3所示氨基酸序列同源性在90％以上的，且具有同等功能的氨基酸序列构成的蛋白。
4.根据权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白pFSH-eCTP中的pFSHβ-eCTP为：
iv)由SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列构成的蛋白；或
v)SEQ ID NO:5所示氨基酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸且同等功能的由iv)衍生的蛋白；或
vi)与SEQ ID NO:5所示氨基酸序列同源性在90％以上的，且具有同等功能的氨基酸序列构成的蛋白。
5.表达盒、表达载体、克隆载体、工程菌或转基因细胞系，其特征在于，其包含编码如权利要求1-4任一项所述融合蛋白的核酸。
6.权利要求3或4所述融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述融合蛋白pFSH-hCTP的制备如下：优化并人工合成pFSHα和pFSHβ-hCTP的编码基因，优化后的pFSHα和pFSHβ-hCTP基因序列分别构建于不同的表达盒，然后连接到同一表达载体上，转化宿主细胞，并在宿主细胞中表达，分离纯化目标蛋白；或者，
将优化后的pFSHα和pFSHβ-hCTP基因序列分别构建到表达载体上，所得重组载体共同转化宿主细胞，并在宿主细胞中表达，分离纯化目标蛋白；
所述融合蛋白pFSH-eCTP的制备如下：优化并人工合成pFSHα和pFSHβ-eCTP的编码基因，优化后的pFSHα和pFSHβ-eCTP基因序列分别构建于不同的表达盒，然后连接到同一表达载体上，转化宿主细胞，并在宿主细胞中表达，分离纯化目标蛋白；或者，将优化后的pFSHα和pFSHβ-eCTP基因序列分别构建到表达载体上，所得重组载体共同转化宿主细胞，并在宿主细胞中表达，分离纯化目标蛋白；
其中，优化后的pFSHα、pFSHβ-hCTP和pFSHβ-eCTP的基因序列分别如SEQ ID NO:2、4和6所示。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述表达载体为pcDNA3.1；所述宿主细胞为CHO或293细胞。
8.一种促排卵药物或组合物，其特征在于，其活性成分为权利要求1-4任一项所述的融合蛋白。
9.权利要求1-4任一项融合蛋白的以下任一种应用：
1)促进动物繁殖中的应用，包括同期发情、超数排卵；
2)治疗动物生殖相关疾病的药物制备中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述动物为哺乳动物，包括猪、牛、羊、马或狗；优选猪。

说明书全文

重组猪FSH-CTP融合蛋白及其制备方法与应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物医药和动物繁殖技术领域，具体地说，涉及重组猪FSH-CTP融合蛋白及其制备方法与应用。

背景技术

[0002] 猪促卵泡素(Porcine Follicle-stimulating hormone，简称pFSH)是猪垂体前叶分泌的一种糖蛋白类促性腺激素，pFSH可以促进母猪子宫内膜、卵巢和卵泡的生长；促进雌激素的合成与分泌；诱导公猪曲细精管的发育和维持精子生成。pFSH在动物繁殖领域中常用于同期发情、超数排卵、胚胎移植、母畜卵巢疾病的治疗。

[0003] pFSH含有α和β两个亚基，α亚基负责信号转录，β亚基参与受体结合发挥生物功能。pFSH的α亚基与垂体的其他糖蛋白激素，如猪促黄体素(pLH)、猪促甲状腺素(pTSH)的α亚基完全相同，由96个氨基酸残基组成，含有2个N-连接糖基化位点，位于N56和N82。而pFSH、pLH和pTSH的β亚基不同，pFSH β亚基含有109个氨基酸残基，亦含有2个N-连接糖基化位点，位于N5和N22。

[0004] 目前动物繁殖领域常见的促性腺类激素主要包括猪垂体FSH(pFSH)和孕马血清促性腺激素(PMSG)。pFSH主要从猪脑垂体中提取纯化，如Folltropin-V(加拿大贝尔尼奇公司)，纯度不高，含量少，价格昂贵，且因LH的存在，副作用大。此外半衰期短(大鼠体内半衰期约为5h)，用于家畜同期发情和超数排卵，需要连续注射3-5天，增加了用户的药物投入成本和劳动力，所以在实际应用中受到限制。PMSG是一种马属动物胎盘尿囊绒毛膜细胞分泌的糖蛋白激素，兼具FSH(高)和LH(低)活性，半衰期长(在牛中可达120h以上)，药效持久，仅需注射一次即可获得理想效果。但是PMSG主要是从怀孕母马血清中提取的，来源有限、产品批次差异大，采血过多会导致母马流产、胎马死亡。

[0005] 基于猪垂体FSH和PMSG在实际应用中的不便和限制，须开发长效FSH制剂，以延长pFSH半衰期，增加pFSH在动物体内的残留时间。

发明内容

[0006] 本发明的目的是提供重组猪FSH-CTP融合蛋白及其制备方法与应用。

[0007] 本发明的构思如下：通过增加FSH的糖基化程度使其分子质量和体积增加，肾小球的肾清除率降低，FSH在体内的作用时间延长。CTP包含了数个O-连接糖基化位点，能增加唾液酸糖基化侧链，提高糖蛋白的分子质量。使用哺乳动物表达体系，尤其是中国仓鼠卵巢细胞(CHO)表达重组蛋白，能获得在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近天然的蛋白分子。

[0008] 为了实现本发明目的，本发明提供的重组猪FSH-CTP融合蛋白，所述融合蛋白是指猪FSH的β亚基直接或间接与绒毛膜促性腺激素的β亚基羧端肽CTP相连，猪FSH的α亚基通过范德华力与猪FSH的β亚基结合。

[0009] 其中，所述绒毛膜促性腺激素来自于人、灵长类或马属哺乳动物。优选来自人和马。

[0010] 人CTP由28个氨基酸残基组成，含有4个O-连接糖基化位点；马CTP由35个氨基酸残基组成，含有12个O-连接糖基化位点。

[0011] 所述融合蛋白为pFSH-hCTP或pFSH-eCTP。

[0012] pFSH-hCTP：含有两条肽链，符合以下方程：(pFSHα:pFSHβ-hCTP)2，其中pFSHα是指猪FSH的α亚基；冒号代表猪FSH α亚基和β亚基以范德华力连接；pFSHβ是指猪FSH的β亚基；hCTP是指人绒毛膜促性腺激素β亚基羧端肽；括号外下标2代表所述猪FSH融合蛋白为二价同二聚体。

[0013] 优选地，所述融合蛋白pFSH-hCTP中的pFSHβ-hCTP为：

[0014] i)由SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列构成的蛋白；或

[0015] ii)SEQ ID NO:3所示氨基酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸且同等功能的由i)衍生的蛋白；或

[0016] iii)与SEQ ID NO:3所示氨基酸序列同源性在90％以上的，且具有同等功能的氨基酸序列构成的蛋白。

[0017] pFSH-eCTP：含有两条肽链，符合以下方程：(pFSHα:pFSHβ-eCTP)2，其中pFSHα是指猪FSH的α亚基；冒号代表猪FSHα亚基和β亚基以范德华力连接；pFSHβ是指猪FSH的β亚基；eCTP是指马绒毛膜促性腺激素β亚基羧端肽；括号外下标2代表所述猪FSH融合蛋白为二价同二聚体。

[0018] 优选地，所述融合蛋白pFSH-eCTP中的pFSHβ-eCTP为：

[0019] iv)由SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列构成的蛋白；或

[0020] v)SEQ ID NO:5所示氨基酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸且同等功能的由iv)衍生的蛋白；或

[0021] vi)与SEQ ID NO:5所示氨基酸序列同源性在90％以上的，且具有同等功能的氨基酸序列构成的蛋白。

[0022] 所述pFSHα的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，或者与SEQ ID NO:1同源性在90％以上的，且具有同等功能的氨基酸序列构成的蛋白。

[0023] 经过修饰的蛋白，包括两种融合蛋白pFSH-hCTP、pFSH-eCTP或猪FSH经过糖基化、聚乙二醇化、乙酰化或与BSA结合等，均属于本发明的保护范围。

[0024] 经过改造的蛋白，包括两种融合蛋白pFSH-hCTP、pFSH-eCTP或猪FSH蛋白与CTP或与其他蛋白融合构成的不改变猪FSH蛋白活性的融合蛋白，均属于本发明的保护范围。

[0025] 本发明还提供表达盒、表达载体、克隆载体、工程菌或转基因细胞系，其包含编码上述猪FSH-CTP融合蛋白的核酸。

[0026] 本发明的长效重组猪FSH-CTP融合蛋白可按如下方法制备得到：

[0027] 所述融合蛋白pFSH-hCTP的制备如下：优化并人工合成pFSHα和pFSHβ-hCTP的编码基因，优化后的pFSHα和pFSHβ-hCTP基因序列分别构建于不同的表达盒，然后连接到同一表达载体上，转化宿主细胞，并在宿主细胞中表达，分离纯化目标蛋白；或者，

[0028] 将优化后的pFSHα和pFSHβ-hCTP基因序列分别构建到表达载体上，所得重组载体共同转化宿主细胞，并在宿主细胞中表达，分离纯化目标蛋白。

[0029] 所述融合蛋白pFSH-eCTP的制备如下：优化并人工合成pFSHα和pFSHβ-eCTP的编码基因，优化后的pFSHα和pFSHβ-eCTP基因序列分别构建于不同的表达盒，然后连接到同一表达载体上，转化宿主细胞，并在宿主细胞中表达，分离纯化目标蛋白；或者，

[0030] 将优化后的pFSHα和pFSHβ-eCTP基因序列分别构建到表达载体上，所得重组载体共同转化宿主细胞，并在宿主细胞中表达，分离纯化目标蛋白。

[0031] 其中，优化后的pFSHα、pFSHβ-hCTP和pFSHβ-eCTP的基因序列分别如SEQ ID NO:2、4和6所示。

[0032] 本发明所述表达载体为真核表达载体，包括但不限于pcDNA3.1，所述宿主细胞为真核细胞，包括但不限于293、CHO细胞。

[0033] 本发明还提供一种促排卵药物或组合物，其活性成分为所述重组猪FSH-CTP融合蛋白pFSH-hCTP和/或pFSH-eCTP。

[0034] 本发明还提供所述重组猪FSH-CTP融合蛋白的以下任一种应用：

[0035] 1)促进动物繁殖中的应用，包括同期发情、超数排卵；

[0036] 2)治疗动物生殖相关疾病的药物制备中的应用。

[0037] 其中，所述动物为哺乳动物，包括猪、牛、羊、马或狗；优选猪。

[0038] 本发明还提供上述长效重组猪FSH-CTP融合蛋白在动物繁殖领域中的应用。

[0039] 借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

[0040] (一)本发明提供的重组猪FSH-CTP融合蛋白，以及它们的衍生蛋白或经过修饰的蛋白，纯化后的蛋白纯度高，约95％，质量均一，安全系数高，便于大规模生产。

[0041] (二)本发明提供的重组猪FSH-CTP融合蛋白，以及它们的衍生蛋白或经过修饰的蛋白，pFSH-hCTP在大鼠中的半衰期约为25.7h，pFSH-eCTP约为36.4h，半衰期大于猪垂体FSH(5h)，一个发情周期只需注射一针，无需连续注射，降低了投药成本和劳动力。

[0042] (三)本发明提供的重组猪FSH-CTP融合蛋白，以及它们的衍生蛋白或经过修饰的蛋白，促进母猪同期发情和超数排卵，进而提高母猪的产仔性，其中同期发情有效性在80％以上，头均排卵数约为21-24枚，头产仔数约为11-13头，优于PMSG和pFSH。

[0043] (四)本发明提供的重组猪FSH-CTP融合蛋白，以及它们的衍生蛋白或经过修饰的蛋白，也能提高牛、羊的同期发情和超数排卵，其中荷斯坦母牛的头均胚胎为5.6-6.9枚，pFSH-hCTP和pFSH-eCTP对母山羊的同期发情率达93％和80％，优于PMSG和pFSH。

[0044] (五)本发明提供的重组猪FSH-CTP融合蛋白，以及它们的衍生蛋白或经过修饰的蛋白，蛋白纯度高、质量均一，安全性高，可有效延长猪FSH的半衰期，减少给药次数；提高猪、牛、羊等的发情率和排卵数，可替代pFSH和PMSG在动物繁殖领域中的应用。附图说明

[0045] 图1为本发明实施例1中pFSH-hCTP的SDS-PAGE非还原电泳图。其中，MK：蛋白Marker；1：澄清发酵液；2：Capto MMC收集液；3：Butyl收集液；4：Capto Q收集液。

[0046] 图2为本发明实施例1中pFSH-eCTP的SDS-PAGE非还原电泳图。其中，MK：蛋白Marker；1：澄清发酵液；2：Capto MMC收集液；3：Butyl收集液；4：Capto Q收集液。

具体实施方式

[0047] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

[0048] 以下实施例中所用pFSH为市售猪垂体促卵泡素产品。

[0049] 实施例1 pFSH-hCTP和pFSH-eCTP蛋白的制备

[0050] 在基因库中搜索猪FSHα(GenBank NM-214446.1)、猪FSHβ(GenBank NM-213875.1)、人CGβ(GenBank NM-000737.3)、马CGβ(GenBank NM-001197093.1)的基因序列。
进行密码子优化：pFSHα核苷酸序列，如SEQ ID NO:2所示；pFSHβ-hCTP序列，如SEQ ID NO:4所示；pFSHβ-eCTP序列，如SEQ ID NO:6所示。

[0051] 将人工合成的pFSHα、pFSHβ-hCTP和pFSHβ-eCTP基因，分别克隆到载体pcDNA3.1中。分别将pFSHα和pFSHβ-hCTP、pFSHα和pFSHβ-eCTP的重组载体电转转入293细胞中表达pFSH-hCTP和pFSH-eCTP，对瞬转表达的蛋白进行纯化验证活性。存在活性后分别将pFSHα和pFSHβ-hCTP、pFSHα和pFSHβ-eCTP的重组载体线性化后电转转入CHO细胞中获得pFSH-hCTP和pFSH-eCTP的稳转细胞系。

[0052] 将稳转细胞接入发酵罐内进行发酵培养，发酵液通过两级深层过滤膜包去除细胞和细胞碎片，然后用0.22μm滤膜过滤，获得澄清的发酵液。澄清的发酵液首先用弱阳离子交换层析(如Capto MMC,GE Healthcare)纯化：用平衡液(20mM乙酸铵，pH5.0)平衡上样，之后用洗脱液(50mM甘氨酸，1M氯化钾，pH8.0)洗脱、收集洗脱液。其次将弱阳离子交换层析收集液用疏水层析(如Butyl,GE Healthcare)纯化：用平衡液(50mM甘氨酸，1M氯化钾，pH8.0)平衡上样，之后用洗脱液(10mM PB，pH8.0)洗脱、收集洗脱液。最后将疏水层析收集液用强阴离子交换(如Capto Q，GE Healthcare)层析进一步纯化：用平衡液(50mM甘氨酸，pH8.0)平衡上样，之后用洗脱液(50mM甘氨酸，1M KCl，pH8.0)洗脱，收集得到纯化的目的蛋白。对目的蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳(图1和图2)。

[0053] 实施例2 pFSH-hCTP和pFSH-eCTP蛋白的活性检测

[0054] 采用大鼠卵巢增重法(Steelman-Pohley法)测定pFSH-hCTP和pFSH-eCTP的活性。本发明产品可代替PMSG在动物繁殖领域使用，因此参照“血促性素生物检定法”检定药品活性，以PMSG作为标准品。具体实施如下：将pFSH-hCTP(预估比活10000U/mg)、pFSH-eCTP(预估比活10000U/mg)和PMSG均配制成40IU、20IU和10IU高、中、低三个剂量。选取日龄21-23天、体重40-55g雌性SD(Sprague Dawley)大鼠随机分成9组，每组6只。每只大鼠皮下注射
0.5ml相应药品，6日后，将大鼠处死，称体重，解剖，摘出卵巢，称重，换算成每100g体重的卵巢重。使用中检所《药典生物检定统计BS2000》软件计算pFSH-hCTP的比活约为7900U/mg，pFSH-eCTP的比活约为8700U/mg。

[0055] 实施例3 pFSH-hCTP和pFSH-eCTP蛋白的药代动力学研究

[0056] 选取10只40g左右的雌性SD大鼠，随机分为两组：pFSH-hCTP组和pFSH-eCTP组。皮下注射20IU/kg体重的相应药品，分别在给药0、1、2、4、8、12、24、48、72、96、120、144h后取血100μl，3000rpm离心取血清-80℃冻存。使用FSH ELISA 试剂盒检测血清中pFSH-hCTP和pFSH-eCTP的含量，每个血样重复分析三次。使用Pksolver软件计算pFSH-hCTP半衰期为
25.7h，pFSH-eCTP半衰期为36.4h，高于猪垂体FSH(pFSH在大鼠体内的半衰期约为5h)。

[0057] 实施例4 pFSH-hCTP和pFSH-eCTP蛋白在促进初产和经产母猪同期发情和超数排卵中的应用

[0058] 分别选取80头初产大白母猪、断奶2周后没有发情的经产大白母猪，体重85-100kg，品种相同，体征接近。随机分为4组：pFSH-hCTP、pFSH-eCTP、PMSG和pFSH组；各组组内再分为初产母猪组和经产母猪组。分别在pFSH-hCTP、pFSH-eCTP和PMSG组供体猪耳后颈部肌肉注射1000IU相应药品，间隔72h后注射500IU HCG。pFSH组供体猪每日早晚两次肌肉注射400IU pFSH，注射4天，每天100IU，最后一次72h后注射500IU HCG。注射pFSH-hCTP、pFSH-eCTP、PMSG或首次注射pFSH 5天后观察记录各组母猪的发情情况。将发情母猪与同系公猪配种3次，每次间隔12h。在第一次配种36h后，对供体猪手术采卵，计算排卵数。

[0059] 结果如表1所示，各组供体母猪发情良好，pFSH-hCTP组初产和经产母猪发情率分别为80％和85％，pFSH-eCTP组初产和经产母猪发情率分别为65％和60％，均高于PMSG组(50％和55％)和pFSH组(60％和55％)，且pFSH-hCTP组与PMSG组和pFSH组比差异显著(P<0.05)。

[0060] 各组母猪的排卵数均高于正常自然发情母猪的排卵数(8-14枚/头)，pFSH-hCTP组初产和经产母猪的头均排卵数分别为23.7枚和22.9枚，pFSH-eCTP组初产和经产母猪的头均排卵数分别为21.3枚和21.5枚，两组母猪的头均排卵数均高于PMSG组(19.1枚和19.4枚)和pFSH组(20.6枚和20.3枚)，且pFSH-hCTP组初产母猪和经产母猪与PMSG组和pFSH组比差异显著(P<0.05)，pFSH-eCTP组初产母猪和经产母猪与PMSG组比差异显著(P<0.05)。

[0061] 实施例5 pFSH-hCTP和pFSH-eCTP蛋白在提高母猪产仔数的应用

[0062] 选择40头初产大白母猪，体重85-100kg，品种相同，体征接近。分4组：pFSH-hCTP、pFSH-eCTP、PMSG和pFSH组，依实施例4中方法对各组母猪注射相应药品。母猪发情后，选择发情的母猪与同系公猪配种3次，每次间隔12h。详细记录各组母猪的发情率和产仔数。

[0063] 结果如表2所示pFSH-hCTP组和pFSH-eCTP组母猪总产仔数分别为100头和64头，均高于PMSG组(49头)和pFSH组(53头)，且pFSH-hCTP组与PMSG组比差异显著(P<0.05)。pFSH-hCTP组和pFSH-eCTP组的胎均产仔数分别为12.5头和10.7头，亦高于PMSG组(9.8头)和pFSH组(8.8头)。

[0064] 表2 pFSH-hCTP、pFSH-eCTP、PMSG和pFSH对初产母猪产仔数的比较

[0065]

[0066]

[0067] 注：同列系列肩标不同大小写字母表示差异显著(P<0.05)，相同字母表示差异不显著(P>0.05)。

[0068] 实施例6 pFSH-hCTP和pFSH-eCTP蛋白在治疗乏情母猪中的应用

[0069] 选择60头断奶后21天以上仍未发情的乏情大白母猪，随机分成4组pFSH-hCTP、pFSH-eCTP、PMSG和pFSH组，依实施例4的方法对供体猪注射相应药品。观察母猪的发情特征：如阴户红肿、有粘液；压背时出现静立反应。将发情后的母猪与公猪进行配种，记录受胎情况。

[0070] 结果如表3所示，乏情母猪对药品反应敏感，pFSH-hCTP和pFSH-eCTP组母猪的发情率分别为87％和67％，均高于PMSG组(53％)和pFSH组(53％)，且pFSH-hCTP组与PMSG组和pFSH组比差异显著(P<0.05)。pFSH-hCTP和pFSH-eCTP组母猪的受孕率分别为85％和80％，亦均高于PMSG组(75％)和pFSH组(63％)。

[0071] 表3 pFSH-hCTP、pFSH-eCTP、PMSG和pFSH对诱导乏情母猪的发情比较

[0072]

[0073] 注：同列系列肩标不同大小写字母表示差异显著(P<0.05)，相同字母表示差异不显著(P>0.05)。

[0074] 实施例7 pFSH-hCTP和pFSH-eCTP蛋白在促进母牛超数排卵中的应用

[0075] 选择40头3-6岁龄体质健康、无疾病的荷斯坦母牛，随机分为pFSH-hCTP、pFSH-eCTP、PMSG和pFSH组。各组母牛在原有饲喂基础上加喂1kg精料，同时肌肉注射VA、VD和VE。每头供体牛埋植孕酮阴道栓CIDR(含黄体酮1.56g/支)。放栓当天记为0天，pFSH-hCTP、pFSH-eCTP和PMSG组供体牛分别肌肉注射1000IU相应药品(Day5)，同时再注射0.5mg氯前列烯醇(PG)，撤栓(Day10)。pFSH组供体牛于Day6至Day9天开始依每日两次递减肌肉注射
370IU pFSH，注射剂量分别为Day6 80/80IU、Day7 50/50IU、Day8 35/35IU、Day9 20/20IU，Day9注射pFSH的同时注射0.4mg PG，Day10撤栓。观察各组供体牛的发情情况，以供体牛接受公牛爬跨为准。站立发情12h后第一次输精，24h后第二次输精。16天非手术冲洗采集胚胎，统计胚胎数。

[0076] 结果如表4所示，各给药组供体牛超排效果显著(自然情况下，一头母牛一次只产生一枚胚胎)，pFSH-hCTP组和pFSH-eCTP组母牛头均胚胎数分别为6.9枚和5.6枚，高于pFSH组(4.4枚)，且pFSH-hCTP组与PMSG组(5.6枚)和pFSH组比差异显著(P<0.05)，pFSH-eCTP组与pFSH组比差异显著(P<0.05)。pFSH-hCTP组和pFSH-eCTP组母牛头均可用胚胎数分别为5.4枚和4.1枚，均高于PMSG组(3.9枚)和pFSH组(3.1枚)，且pFSH-hCTP组与PMSG组和pFSH组比差异显著(P<0.05)，pFSH-eCTP组与pFSH组比差异显著(P<0.05)。pFSH-hCTP组和pFSH-eCTP组母牛头均不可用胚胎数均为1.5枚，均低于PMSG组(1.7枚)但高于pFSH组(1.3枚)。

[0077] 表4 pFSH-hCTP、pFSH-eCTP、PMSG和pFSH对荷斯坦母牛超数排卵的比较

[0078]

[0079] 注：同列系列肩标不同大小写字母表示差异显著(P<0.05)，相同字母表示差异不显著(P>0.05)。

[0080] 实施例8 pFSH-hCTP和pFSH-eCTP蛋白在促进母山羊同期发情中的应用

[0081] 选择60只1.5-3岁，体重30-45kg、体质健康、无疾病的母山羊，随机分为pFSH-hCTP、pFSH-eCTP、PMSG和pFSH组。于发情周期任一天给供体羊放置孕酮阴道栓并记为0天，pFSH-hCTP、pFSH-eCTP和PMSG组供体羊分别肌肉注射300IU相应药品(Day10)，撤栓(Day12)。pFSH组于Day10和Day11分别注射25IU pFSH。观察母山羊的发情表现，并用试情公羊进行试情。以母羊外阴发红、流黏液并接受爬跨视为发情，计算发情率。

[0082] 结果如表5所示，各组母羊发情明显，pFSH-hCTP组和pFSH-eCTP组母羊发情率分别为均93％和80％，均高于PMSG组(67％)和pFSH组(67％)。

[0083] 表5 pFSH-hCTP、pFSH-eCTP、PMSG和pFSH对母山羊的发情比较

[0084]

[0085] 注：同列系列肩标不同大小写字母表示差异显著(P<0.05)，相同字母表示差异不显著(P>0.05)。

[0086] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

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