治疗1型糖尿病的组合物和方法
阅读：631发布：2021-08-25
专利汇可以提供治疗1型糖尿病的组合物和方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本文提供了用于 治疗 哺乳动物 对象中的1型糖尿病(T1D)的组合物和方法。该组合物包括表达IL‑2基因和T1D特异性自身 抗原 (例如胰岛素原(PINS))基因的乳酸 发酵 细菌(LAB)。示例性方法包括：口服给予哺乳动物对象 治疗有效量 的组合物。可以将组合物粘膜给予对象，导致LAB递送到胃肠道中，在这里释放LAB。因此，由LAB表达的 生物 活性多肽通过粘膜递送给予。可以选择LAB以向对象递送低剂量的IL‑2。该方法可能不需要伴随的全身性的抗CD3 抗体 治疗。该方法可适用于具有残留β细胞功能的对象，例如具有最近发病的T1D的对象。，下面是治疗1型糖尿病的组合物和方法专利的具体信息内容。
1.一种组合物，其包含：
(a)LAB，所述LAB包含编码白细胞介素-2(IL-2)多肽的外源核酸和编码1型糖尿病(T1D)特异性抗原多肽的外源核酸，或
(b)第一LAB和第二LAB，所述第一LAB包含编码白细胞介素-2(IL-2)多肽的外源核酸，所述第二LAB包含编码1型糖尿病(T1D)特异性抗原多肽的外源核酸。
2.如权利要求1所述的组合物，其中，所述LAB选自下组：乳球菌种(Lactococcus species)，乳杆菌种(Lactobacillus species)，双歧杆菌种(Bifidobacterium species)，链球菌种(Streptococcus species)和肠球菌种(Enterococcus species)。
3.如权利要求2所述的组合物，其中，所述LAB选自下组：格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、乳酸乳球菌乳脂亚种(Lactococcus lactis subsp.cremoris)、乳酸乳球菌叶蝉亚种(Lactococcus lactis subsp.hordniae)、乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp.Lactis)、鱼类乳球菌(Lactococcus piscium)、植物乳球菌(Lactococcus plantarum)、棉籽糖乳球菌(Lactococcus raffinolactis)、耐酸乳杆菌(Lactobacillus acetotolerans)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、活泼乳杆菌(Lactobacillus agilis)、双叉乳杆菌(Lactobacillus algidus)、食品乳杆菌(Lactobacillus alimentarius)、解淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylolyticus)、嗜淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylophilus)、食淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylovorus)、动物乳杆菌(Lactobacillus animalis)、鸟乳杆菌(Lactobacillus aviaries)、鸟乳杆菌不解棉子糖亚种(Lactobacillus aviarius subsp.araffinosus)、鸟乳杆菌鸟亚种(Lactobacillus aviarius subsp.aviaries)、白鲑乳杆菌(Lactobacillus bavaricus)、倍发酵乳杆菌(Lactobacillus bifermentans)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、布赫内氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、卡尼乳杆菌(Lactobacillus carnis)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、干酪乳杆菌不发酵乳糖亚种(Lactobacillus casei subsp.alactosus)、干酪乳杆菌干酪亚种(Lactobacillus casei subsp.casei)、干酪乳杆菌假植物亚种(Lactobacillus casei subsp.pseudoplantarum)、干酪乳杆菌鼠李糖亚种(Lactobacillus casei subsp.rhamnosus)、干酪乳杆菌坚韧亚种(Lactobacillus casei subsp.tolerans)、乳酪乳杆菌(Lactobacillus catenaformis)、纤维二糖乳杆菌(Lactobacillus cellobiosus)、丘状乳杆菌(Lactobacillus collinoides)、融合魏斯乳杆菌(Lactobacillus confuses)、棒状乳杆菌(Lactobacillus coryniformis)、棒状乳杆菌棒状亚种(Lactobacillus coryniformis subsp.coryniformis)、棒状乳杆菌扭曲亚种(Lactobacillus coryniformis subsp.torquens)、卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)、弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)、弯曲乳杆菌弯曲亚种(Lactobacillus curvatus subsp.curvatus)、弯曲乳杆菌蜜二糖亚种(Lactobacillus curvatus subsp.melibiosus)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.Bulgaricus)、德氏乳杆菌德氏亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.delbrueckii)、德氏乳杆菌乳酸亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.lactis)、:广布乳杆菌(Lactobacillus divergens)、香肠乳杆菌(Lactobacillus farciminis)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、穹隆乳杆菌(Lactobacillus fornicalis)、食果糖乳杆菌(Lactobacillus fructivorans)、果糖乳杆菌(Lactobacillus fructosus)、鹑鸡乳杆菌(Lactobacillus gallinarum)、加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、禾谷乳杆菌(Lactobacillus graminis)、耐盐乳杆菌(Lactobacillus halotolerans)、哈氏乳杆菌(Lactobacillus hamster)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、异型腐酒乳杆菌(Lactobacillus heterohiochii)、希氏乳杆菌(Lactobacillus hilgardii)、麦芽香乳杆菌(Lactobacillus homohiochii)、惰性乳杆菌(Lactobacillus iners)、肠乳杆菌(Lactobacillus intestinalis)、詹氏乳杆菌(Lactobacillus jensenii)、约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)、坎氏乳杆菌(Lactobacillus kandleri)、开菲尔乳杆菌(Lactobacillus kefiri)、马乳酒样乳杆菌(Lactobacillus kefiranofaciens)、偏性异发酵乳杆菌(Lactobacillus kefirgranum)、昆氏乳杆菌(Lactobacillus kunkeei)、乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis)、莱士曼氏乳酸杆菌(Lactobacillus leichmannii)、林氏乳杆菌(Lactobacillus lindneri)、坏发酵乳杆菌(Lactobacillus malefermentans)、马里乳杆菌(Lactobacillus mali)、马耳他乳杆菌Lactobacillus maltaromicus)、马尼厚乳杆菌(Lactobacillus manihotivorans)、稍小乳杆菌(Lactobacillus minor)、小小乳杆菌(Lactobacillus minutes)、粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)、鼠乳杆菌(Lactobacillus murinus)、纳氏乳杆菌(Lactobacillus nagelii)、口乳杆菌(Lactobacillus oris)、面包乳杆菌(Lactobacillus panis)、类布氏乳杆菌(Lactobacillus parabuchneri)、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、副干酪乳杆菌副干酪亚种(Lactobacillus paracasei subsp.paracasei)、副干酪乳杆菌坚韧亚种(Lactobacillus paracasei subsp.tolerans)、类高加索乳杆菌(Lactobacillus parakefiri)、类消化乳杆菌(Lactobacillus paralimentarius)、类植物乳杆菌(Lactobacillus paraplantarum)、戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)、类食品乳杆菌(Lactobacillus perolens)、栖鱼乳杆菌(Lactobacillus piscicola)、胚牙乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、脑桥乳杆菌(Lactobacillus pontis)、罗伊乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、龈沟乳杆菌(Lactobacillus rimae)、罗氏乳杆菌(Lactobacillus rogosae)、瘤胃乳杆菌(Lactobacillus ruminis)、米酒乳杆菌(Lactobacillus sakei)、米酒乳杆菌肉花亚种(Lactobacillus sakei subsp.camosus)、米酒乳杆菌米酒亚种(Lactobacillus sakei subsp.sakei)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、唾液乳杆菌水杨素亚种(Lactobacillus salivarius subsp.salicinius)、唾液乳杆菌唾液亚种(Lactobacillus salivarius subsp.salivarius)、旧金山乳杆菌(Lactobacillus sanfranciscensis)、沙氏乳杆菌(Lactobacillus sharpeae)、苏氏乳杆菌(Lactobacillus suebicus)、发状乳杆菌(Lactobacillus trichodes)、龈乳杆菌(Lactobacillus uli)、牛痘乳杆菌(Lactobacillus vaccinostercus)、阴道乳杆菌(Lactobacillus vaginalis)、绿色乳杆菌(Lactobacillus viridescens)、小牛乳杆菌(Lactobacillus vitulinus)、木糖乳杆菌(Lactobacillus xylosus)、山梨氏乳杆菌(Lactobacillus yamanashiensis)、山梨氏乳杆菌马里亚种(Lactobacillus yamanashiensis subsp.mali)、山梨氏乳杆菌山梨亚种(Lactobacillus yamanashiensis subsp.Yamanashiensis)、玉米乳杆菌(Lactobacillus zeae)、青春双岐杆菌(Bifidobacterium adolescentis)、角双歧杆菌(Bifidobacterium angulatum)、两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、链状双歧杆菌(Bifidobacterium catenulatum)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、婴儿双岐杆菌(Bifidobacterium infantis)、阿尔氏肠球菌(Enterococcus alcedinis)、阿桂氏肠球菌(Enterococcus aquimarinus)、亚洲肠球菌(Enterococcus asini)、鸟肠球菌(Enterococcus avium)、卡氏肠球菌(Enterococcus caccae)、山茶肠球菌(Enterococcus camelliae)、坎氏肠球菌(Enterococcus canintestini)、犬肠球菌(Enterococcus canis)、酪黄肠球菌(Enterococcus casseliflavus)、盲肠肠球菌(Enterococcus cecorum)、鸽肠球菌(Enterococcus columbae)、多样肠球菌(Enterococcus devriesei)、迪埃丝肠球菌(Enterococcus diestrammenae)、殊异肠球菌(Enterococcus dispar)、坚韧肠球菌(Enterococcus durans)、埃肯肠球菌(Enterococcus eurekensis)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、鹑鸡肠球菌(Enterococcus gallinarum)、浅黄肠球菌(Enterococcus gilvus)、溶过氧化肠球菌(Enterococcus haemoperoxidus)、荷曼氏肠球菌(Enterococcus hermanniensis)、海氏肠球菌(Enterococcus hirae)、意大利肠球菌(Enterococcus italicus)、乳酸肠球菌(Enterococcus lactis)、乐玛尼肠球菌(Enterococcus lemanii)、病臭肠球菌(Enterococcus malodoratus)、莫拉氏肠球菌(Enterococcus moraviensis)、蒙氏肠球菌(Enterococcus mundtii)、Enterococcus olivae、苍白肠球菌(Enterococcus pallens)、铅黄肠球菌(Enterococcus phoeniculicola)、植物肠球菌(Enterococcus plantarum)、假鸟肠球菌(Enterococcus pseudoavium)、魁北克肠球菌(Enterococcus quebecensis)、棉子糖肠球菌(Enterococcus raffinosus)、鼠肠球菌(Enterococcus ratti)、瑞氏肠球菌(Enterococcus rivorum)、罗泰肠球菌(Enterococcus rotai)、解糖肠球菌(Enterococcus saccharolyticus)、西里西亚肠球菌(Enterococcus silesiacus)、孤立肠球菌(Enterococcus solitaries)、硫磺肠球菌(Enterococcus sulfurous)、特氏肠球菌(Enterococcus termitis)、泰氏肠球菌(Enterococcus thailandicus)、尿肠球菌(Enterococcus ureasiticus)、解尿肠球菌(Enterococcus ureilyticus)、维克肠球菌(Enterococcus viikkiensis)、维洛肠球菌(Enterococcus villorum)、香坊肠球菌(Enterococcus xiangfangensis)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、咽峡炎(Streptococcus anginosus)、牛链球菌(Streptococcus bovis)、犬链球菌(Streptococcus canis)、星座链球菌(Streptococcus constellatus)、停乳链球菌(Streptococcus dysgalactiae)、马蹄足链球菌(Streptococcus equines)、海豚链球菌(Streptococcus iniae)、中间链球菌(Streptococcus intermedius)、米勒链球菌(Streptococcus milleri)、缓症链球菌(Streptococcus mitis)、变异链球菌(Streptococcus mutans)、口腔链球菌(Streptococcus oralis)、副溶血链球菌(Streptococcus parasanguinis)、拟链球菌(Streptococcus peroris)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia)、假肺链球菌(Streptococcus pseudopneumoniae)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、鼠伤寒链球菌(Streptococcus ratti)、唾液链球菌(Streptococcus salivarius)、牙龈链球菌(Streptococcus tigurinus)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、血链球菌(Streptococcus sanguinis)、表兄链球菌(Streptococcus sobrinus)、猪链球菌(Streptococcus suis)、乳房链球菌(Streptococcus uberis)、前庭链球菌(Streptococcus vestibularis)、绿色链球菌(Streptococcus viridians)和兽疫链球菌(Streptococcus zooepidemicus)。
4.如权利要求2所述的组合物，其中，所述LAB是乳球菌种。
5.如权利要求4所述的组合物，其中，所述LAB是乳酸乳球菌。
6.如权利要求1-5中任一项所述的组合物，其中，所述组合物还包含药学上可接受的载体。
7.如权利要求1-6中任一项所述的组合物，其中，所述T1D-特异性抗原选自下组：胰岛素原(PINS)，谷氨酸脱羧酶(GAD65)，胰岛素瘤相关蛋白2(IA-2)，胰岛特异性葡萄糖-6-磷酸酶催化亚基相关蛋白(IGRP)，锌转运蛋白8(ZnT8)，嗜铬粒蛋白A，(前原)胰岛淀粉样多肽(ppIAPP)，外周蛋白和瓜氨酸化葡萄糖调节蛋白(GRP)。
8.如权利要求7所述的组合物，其中，所述T1D-特异性抗原是PINS。
9.如权利要求1-8中任一项所述的组合物，其中，LAB包含所述编码IL-2多肽的外源核酸和所述编码T1D-特异性抗原多肽的外源核酸。
10.如权利要求1-8中任一项所述的组合物，其中，第一LAB包含所述编码IL-2多肽的外源核酸，所述第二LAB包含所述编码T1D-特异性抗原多肽的外源核酸。
11.如权利要求1-10中任一项所述的组合物，其中，所述编码IL-2多肽的外源核酸整合到所述LAB的染色体中。
12.如权利要求1-11中任一项所述的组合物，其中，所述编码T1D-特异性抗原多肽的外源核酸整合到所述LAB的染色体中，或者存在于所述LAB中包含的质粒上。
13.如权利要求1-11中任一项所述的组合物，其中，所述编码IL-2多肽的外源核酸和所述编码T1D-特异性抗原多肽的外源核酸均整合到所述LAB的染色体中。
14.如权利要求9或13所述的组合物，其中，所述编码IL-2多肽的外源核酸和所述编码T1D特异性抗原多肽的外源核酸是由相同启动子驱动的多顺反子表达单元的一部分。
15.如权利要求1-14中任一项所述的组合物，其中，所述IL-2是膜结合形式的IL-2或可溶形式的IL-2。
16.如权利要求1-15中任一项所述的组合物，其中，所述编码IL-2多肽的外源核酸编码IL-2变体多肽。
17.如权利要求16所述的组合物，其中，与相应的野生型IL-2多肽相比，所述IL-2变体多肽具有降低的IL-2活性或增强的IL-2活性。
18.权利要求16的组合物，其中，所述IL-2变体多肽选自：阿地白介素，替西白介素和生物白细胞介素。
19.如权利要求16所述的组合物，其中，所述IL-2变体多肽包含：
(a)相对于成熟的野生型IL-2的第一氨基酸取代，选自：L72G,L72A,L72S,L72T,L72Q,L72E,L72N,L72D,L72R和L72K；或
(b)相对于成熟的野生型IL-2的第二氨基酸取代，选自：F42A,F42G,F42S,F42T,F42Q,F42E,F42N,F42D,F42R和F42K；或
(c)相对于成熟的野生型IL-2的第三氨基酸取代，选自：Y45A,Y45G,Y45S,Y45T,Y45Q,Y45E,Y45N,Y45D,Y45R和Y45K；或
(d)它们的组合。
20.如权利要求1-19中任一项所述的组合物，其中，所述LAB适于在给予哺乳动物对象时粘膜递送低剂量IL-2。
21.一种包含乳酸乳球菌的组合物，其中，所述乳酸乳球菌包含编码IL-2多肽的外源核酸和编码PINS的外源核酸，并且所述乳酸乳球菌适于在给予哺乳动物对象时粘膜递送低剂量的IL-2。
22.如权利要求1-21中任一项所述的组合物在需要的哺乳动物对象中治疗T1D的应用。
23.一种治疗1型糖尿病(T1D)的方法，包括：
给予需要的哺乳动物对象治疗有效量的如权利要求1-21中任一项所述的组合物。
24.如权利要求23所述的方法，其中，不向所述对象给予抗CD3抗体。
25.如权利要求23所述的方法，还包括向所述对象给予抗-CD3抗体。
26.如权利要求25所述的方法，其中，所述抗CD3抗体与所述组合物以低剂量同时给予所述对象。
27.如权利要求25或26所述的方法，其中，静脉内给予所述对象所述抗CD3抗体。
28.如权利要求23到27任一项所述的方法，其中，所述低剂量IL-2递送为约0.01M IU/天/对象至约5.4M IU/天/对象；约0.02M IU/天/对象到约3.0M IU/天/对象；约0.1M IU/天/对象到约3.0M IU/天/对象；或约0.2M IU/天/对象到2.0M IU/天/对象。
29.如权利要求23-28中任一项所述的方法，其中，所述对象具有残留的β细胞功能。
30.如权利要求23-29中任一项所述的方法，其中，所述对象具有最近发病的T1D。
31.如权利要求23-30中任一项所述的方法，其中，所述对象具有指示残留β细胞功能的血液或尿液C-肽浓度。
32.如权利要求23-31中任一项所述的组合物，其中，所述对象是空腹血C肽浓度小于约
1nmol/L但至少约0.2nmol/L；或者受刺激的血液C肽浓度小于约4nmol/L但至少约0.5nmol/L的人类患者。
33.如权利要求23-32中任一项所述的方法，其中，所述对象在给予所述组合物之前的前12个月内已被诊断为患有T1D。
34.如权利要求23至33中任一项所述的方法，其中，所述组合物经粘膜给予所述对象。
35.如权利要求23至34中任一项所述的方法，其中，所述组合物以液体形式给予所述对象。
36.如权利要求23-34中任一项所述的方法，其中，所述组合物以食品、膳食补充剂或栓剂产品的形式给予所述对象。
37.如权利要求23-36中任一项所述的方法，其中，所述组合物以包含约1×104至约1×
12 6 12 9 12
10 ；约1×10至约1×10 ；或约1×10至约1×10 个菌落形成单位(cfu)的单位剂型给予。
38.如权利要求37所述的方法，其中，所述单位剂型可选自：胶囊，片剂，颗粒剂，栓剂和计量气雾剂。
39.如权利要求23-34和36中任一项所述的方法，其中，所述组合物是干粉形式或其压缩形式。
40.一种遗传修饰的微生物，其包含编码IL-2多肽的外源核酸和编码T1D特异性抗原多肽的外源核酸。
41.如权利要求40所述的遗传修饰的微生物，其中，所述微生物是LAB。
42.如权利要求40或41所述的遗传修饰的微生物，其中，所述编码白细胞介素-2和/或T1D特异性抗原多肽的外源核酸稳定整合到所述微生物的染色体中。
治疗1型糖尿病的组合物和方法
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2016年1月14日提交的美国临时申请号62/278,493和2016年6月15日提交的美国临时申请号62/350,472的权益，上述各申请通过引用全文纳入本文。
[0004] 本申请包含序列表，该序列表已经以ASCII格式电子提交，并且其全部内容通过引用并入本文。在2017年1月10日创建的所述ASCII拷贝命名为205350-0030-00-WO-549987_SL.txt，大小为189,854字节。
[0005] 背景
[0006] 大约有1千万到1千5百万人患有1型糖尿病(T1D)，这是婴儿期和青春期最常见的代谢紊乱，仅在欧洲就有112,000名16岁以下的儿童受到影响。T1D由遗传易感个体中胰岛素产生胰岛β细胞(“β细胞”)的进行性免疫介导的破坏引起，导致慢性高血糖症，其引发微血管和大血管并发症。参见，例如，van Belle，T.L.等人，Physiol.Rev.2011,91(1)：79-118。虽然某些自身免疫性疾病有治疗选择，但目前尚未批准用于T1D的治疗方法。T1D患者需要终身用胰岛素治疗。此外，长期管理需要多学科的方法，包括医生，护士，营养师和其他专家。
[0007] 在短期治疗或慢性方案的背景下，使用广义免疫抑制阻断自身反应性效应T细胞是自身免疫疾病的唯一治疗策略。据信，激活或扩增调节性T(Treg)细胞可以恢复效应T细胞和Treg细胞之间的平衡，并且可以实现相同的目的而没有与免疫抑制相关的毒性。
[0008] 白细胞介素-2(“IL-2”)具有免疫系统的关键功能，主要通过其对T细胞的直接作用。在T细胞成熟的胸腺中，它通过促进某些未成熟T细胞分化为调节性T细胞来预防自身免疫疾病，所述调节性T细胞抑制其他T细胞，否则引发攻击体内健康细胞。在较高浓度下，当初始T细胞也被抗原刺激时，IL-2还促进T细胞分化为效应T细胞和记忆T细胞，从而帮助身体抵抗感染。
[0009] 天然IL-2最初被鉴定为淋巴细胞生长因子，并且被认为主要在体内促进效应T细胞应答，并且重组IL-2被开发用于治疗需要增强效应T细胞的状况，即癌症和感染疾病。然而，显示IL-2对于效应T细胞的分化、存活和功能是不必要的，因为IL-2敲除小鼠发展T细胞介导的自身免疫疾病。现在已知IL-2是对Treg细胞发育，扩增，存活和外周活性至关重要的细胞因子。IL-2产生缺乏或缺乏IL-2反应性导致Treg细胞功能丧失和自身免疫增加。Treg细胞组成型表达IL-2的三聚体高亲和力受体(IL-2Rαβγ)，其水平高于CD4+和CD8+效应T细胞，NK细胞和嗜酸性粒细胞。与效应T细胞中相比，Treg细胞中较低剂量的IL-2TAT5a诱导信号传导。因此，低剂量IL-2似乎刺激优先激活并促进体内Treg细胞的存活。参见例如，Yu,A.等，Diabetes 2015,64:2172-2183。
[0010] 在临床研究中，给予IL-2诱导免疫学变化，但不会改变葡萄糖代谢的变量。参见例如Hartemann A.等人，Lancet Diabetes Endocrinol.2013；1:295-305；和Rosenzwajg M.等人，J Autoimmun.2015；58:48-58。
[0011] 药物IL-2制剂通过注射给药。尽管口服递送是有吸引力的(例如，由于易于给药)，但是胃肠道降解和低水平的吸收通常使得该途径对多肽的递送无效。正在研究替代途径，例如鼻，直肠，肺和眼部途径，用于基于多肽的治疗。
[0012] 已经使用遗传修饰的细菌将治疗分子递送至粘膜组织。参见例如Steidler,L.,等人，Nat.Biotechnol.2003,21(7):785-789；和Robert S.和Steidler L.，Microb.Cell Fact.2014,13增补1:S11。
[0013] 通过遗传改变的乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)肠道引入涉及β细胞自身免疫的抗原，已经显示通过诱导Foxp3+Treg细胞阻止NOD小鼠中的T1D。口服给予遗传改变的乳酸乳球菌将人胰岛素原(PINS)与人IL-10一起靶向胃肠道(GI)粘膜，并与全身性低剂量抗CD3抗体联合使用，在近60％的新发作糖尿病NOD小鼠中将免疫系统朝着长期耐受性重置。参见例如Robert,S.等人，Diabetes 2014,63:2876-2887；和Takiishi,T.等人,
J.Clin.Inv.2012,122(5):1717-1725。然而，涉及额外的免疫调节剂(例如抗CD3抗体)的这种抗原特异性组合疗法的临床翻译受到阻碍，例如，因为Fc修饰的抗人CD3抗体尚未被管理机构批准用于治疗T1D。
J.Clin.Inv.2012,122(5):1717-1725。然而，涉及额外的免疫调节剂(例如抗CD3抗体)的这种抗原特异性组合疗法的临床翻译受到阻碍，例如，因为Fc修饰的抗人CD3抗体尚未被管理机构批准用于治疗T1D。
[0014] 本领域需要用于治疗T1D的有效，靶向和受控的方法，而没有脱靶活性和全身毒性。此类策略应促进给药，增加安全性，并且理想地，改善功效并降低治疗有效剂量。本发明解决了这些需要。
[0015] 通过引用纳入
[0016] 所有发表物、专利或专利申请通过引用纳入本文，就好像将各篇单独的发表物或专利申请具体和单独地通过引用纳入本文那样。如果本文的术语与并入的参考文献中的术语之间存在冲突，则以本文中的术语为准。
发明内容
[0017] 因此，提供了涉及活乳酸发酵细菌(LAB)的组合物和方法，例如，遗传修饰的乳酸乳球菌(LL)菌株，作为用于粘膜递送低剂量IL-2的递送载体，例如与T1D-特异性自身抗原，如胰岛素原(PINS)一起。对LAB进行遗传修饰以表达生物活性多肽，其诱导生物应答，进而阻止胰腺β细胞的进一步自身免疫破坏。这种策略可以逆转已建立的T1D，例如，在具有足够残留β细胞功能的对象中，因此代表自身免疫性糖尿病的“真实”治疗。组合物可以口服给药，例如以肠溶包衣的药物制剂的形式，其将细菌运输到胃肠道，例如运输到胃肠道的下部(例如，结肠的远端部分)，在那里它们将分泌合适的低剂量IL-2，任选地与T1D特异性抗原(例如PINS)组合。
[0018] 所提供的组合物包含乳酸发酵细菌(LAB)，其包含编码白细胞介素-2(IL-2)多肽的外源核酸和编码1型糖尿病(T1D)特异性抗原多肽的外源核酸。或者，所提供的组合物包含第一LAB和第二LAB，第一LAB包含编码白细胞介素-2(IL-2)多肽的外源核酸，第二LAB包含编码1型糖尿病(T1D)特异性抗原多肽的外源核酸。该组合物可进一步包含药学上可接受的载体。当施用于哺乳动物对象时，所述LAB可适于粘膜递送低剂量IL-2。
[0019] 在一个方面，所述LAB可以选自下组：乳球菌种(Lactococcus species)，乳杆菌种(Lactobacillus species)，双歧杆菌种(Bifidobacterium species)，链球菌种(Streptococcus species)和肠球菌种(Enterococcus species)。所述LAB可以是乳球菌种。例如，所述LAB可以是乳酸乳球菌。或者，所述LAB可以选自下组：格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、乳酸乳球菌乳脂亚种(Lactococcus lactis subsp.cremoris)、乳酸乳球菌叶蝉亚种(Lactococcus lactis subsp.hordniae)、乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp.Lactis)、鱼类乳球菌(Lactococcus piscium)、植物乳球菌(Lactococcus plantarum)、棉籽糖乳球菌(Lactococcus raffinolactis)、耐酸乳杆菌(Lactobacillus acetotolerans)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、活泼乳杆菌(Lactobacillus agilis)、双叉乳杆菌(Lactobacillus algidus)、食品乳杆菌(Lactobacillus alimentarius)、解淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylolyticus)、嗜淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylophilus)、食淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylovorus)、动物乳杆菌(Lactobacillus animalis)、鸟乳杆菌(Lactobacillus aviaries)、鸟乳杆菌不解棉子糖亚种(Lactobacillus aviarius subsp.araffinosus)、鸟乳杆菌鸟亚种(Lactobacillus aviarius subsp.aviaries)、白鲑乳杆菌(Lactobacillus bavaricus)、倍发酵乳杆菌(Lactobacillus bifermentans)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、布赫内氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、卡尼乳杆菌(Lactobacillus carnis)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、干酪乳杆菌不发酵乳糖亚种(Lactobacillus casei
subsp.alactosus)、干酪乳杆菌干酪亚种(Lactobacillus casei subsp.casei)、干酪乳杆菌假植物亚种(Lactobacillus casei subsp.pseudoplantarum)、干酪乳杆菌鼠李糖亚种(Lactobacillus casei subsp.rhamnosus)、干酪乳杆菌坚韧亚种(Lactobacillus casei subsp.tolerans)、乳酪乳杆菌(Lactobacillus catenaformis)、纤维二糖乳杆菌(Lactobacillus cellobiosus)、丘状乳杆菌(Lactobacillus collinoides)、融合魏斯乳杆菌(Lactobacillus confuses)、棒状乳杆菌(Lactobacillus coryniformis)、棒状乳杆菌棒状亚种(Lactobacillus coryniformis subsp.coryniformis)、棒状乳杆菌扭曲亚种(Lactobacillus coryniformis subsp.torquens)、卷曲乳杆菌(Lactobacillus
crispatus)、弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)、弯曲乳杆菌弯曲亚种
(Lactobacillus curvatus subsp.curvatus)、弯曲乳杆菌蜜二糖亚种(Lactobacillus curvatus subsp.melibiosus)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.Bulgaricus)、德氏乳杆菌德氏亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.Delbrueckii)、德氏乳杆菌乳酸亚种
(Lactobacillus delbrueckii subsp.lactis)、:广布乳杆菌(Lactobacillus
divergens)、香肠乳杆菌(Lactobacillus farciminis)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、穹隆乳杆菌(Lactobacillus fornicalis)、食果糖乳杆菌(Lactobacillus fructivorans)、果糖乳杆菌(Lactobacillus fructosus)、鹑鸡乳杆菌(Lactobacillus gallinarum)、加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、禾谷乳杆菌(Lactobacillus graminis)、耐盐乳杆菌(Lactobacillus halotolerans)、哈氏乳杆菌(Lactobacillus hamster)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、异型腐酒乳杆菌(Lactobacillus heterohiochii)、希氏乳杆菌(Lactobacillus hilgardii)、麦芽香乳杆菌(Lactobacillus homohiochii)、惰性乳杆菌(Lactobacillus iners)、肠乳杆菌(Lactobacillus
intestinalis)、詹氏乳杆菌(Lactobacillus jensenii)、约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)、坎氏乳杆菌(Lactobacillus kandleri)、开菲尔乳杆菌(Lactobacillus kefiri)、马乳酒样乳杆菌(Lactobacillus kefiranofaciens)、偏性异发酵乳杆菌(Lactobacillus kefirgranum)、昆氏乳杆菌(Lactobacillus kunkeei)、乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis)、莱士曼氏乳酸杆菌(Lactobacillus leichmannii)、林氏乳杆菌(Lactobacillus lindneri)、坏发酵乳杆菌(Lactobacillus malefermentans)、马里乳杆菌(Lactobacillus mali)、马耳他乳杆菌Lactobacillus maltaromicus)、马尼厚乳杆菌(Lactobacillus manihotivorans)、稍小乳杆菌(Lactobacillus minor)、小小乳杆菌(Lactobacillus minutes)、粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)、鼠乳杆菌
(Lactobacillus murinus)、纳氏乳杆菌(Lactobacillus nagelii)、口乳杆菌
(Lactobacillus oris)、面包乳杆菌(Lactobacillus panis)、类布氏乳杆菌
(Lactobacillus parabuchneri)、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、副干酪乳杆菌副干酪亚种(Lactobacillus paracasei subsp.paracasei)、副干酪乳杆菌坚韧亚种(Lactobacillus paracasei subsp.tolerans)、类高加索乳杆菌(Lactobacillus parakefiri)、类消化乳杆菌(Lactobacillus paralimentarius)、类植物乳杆菌
(Lactobacillus paraplantarum)、戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)、类食品乳杆菌(Lactobacillus perolens)、栖鱼乳杆菌(Lactobacillus piscicola)、胚牙乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、脑桥乳杆菌(Lactobacillus pontis)、罗伊乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、龈沟乳杆菌(Lactobacillus rimae)、罗氏乳杆菌(Lactobacillus rogosae)、瘤胃乳杆菌
(Lactobacillus ruminis)、米酒乳杆菌(Lactobacillus sakei)、米酒乳杆菌肉花亚种(Lactobacillus sakei subsp.camosus)、米酒乳杆菌米酒亚种(Lactobacillus sakei subsp.sakei)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、唾液乳杆菌水杨素亚种(Lactobacillus salivarius subsp.salicinius)、唾液乳杆菌唾液亚种(Lactobacillus salivarius subsp.salivarius)、旧金山乳杆菌(Lactobacillus sanfranciscensis)、沙氏乳杆菌(Lactobacillus sharpeae)、苏氏乳杆菌(Lactobacillus suebicus)、发状乳杆菌(Lactobacillus trichodes)、龈乳杆菌(Lactobacillus uli)、牛痘乳杆菌
(Lactobacillus vaccinostercus)、阴道乳杆菌(Lactobacillus vaginalis)、绿色乳杆菌(Lactobacillus viridescens)、小牛乳杆菌(Lactobacillus vitulinus)、木糖乳杆菌(Lactobacillus xylosus)、山梨氏乳杆菌(Lactobacillus yamanashiensis)、山梨氏乳杆菌马里亚种(Lactobacillus yamanashiensis subsp.mali)、山梨氏乳杆菌山梨亚种(Lactobacillus yamanashiensis subsp.Yamanashiensis)、玉米乳杆菌(Lactobacillus zeae)、青春双岐杆菌(Bifidobacterium adolescentis)、角双歧杆菌(Bifidobacterium angulatum)、两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、链状双歧杆菌(Bifidobacterium catenulatum)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、婴儿双岐杆菌(Bifidobacterium infantis)、阿尔氏肠球菌(Enterococcus alcedinis)、阿桂氏肠球菌(Enterococcus aquimarinus)、亚洲肠球菌(Enterococcus asini)、鸟肠球菌(Enterococcus avium)、卡氏肠球菌(Enterococcus caccae)、山茶肠球菌(Enterococcus camelliae)、坎氏肠球菌(Enterococcus canintestini)、犬肠球菌(Enterococcus canis)、酪黄肠球菌(Enterococcus casseliflavus)、盲肠肠球菌(Enterococcus cecorum)、鸽肠球菌(Enterococcus columbae)、多样肠球菌
(Enterococcus devriesei)、迪埃丝肠球菌(Enterococcus diestrammenae)、殊异肠球菌(Enterococcus dispar)、坚韧肠球菌(Enterococcus durans)、埃肯肠球菌(Enterococcus eurekensis)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、鹑鸡肠球菌(Enterococcus gallinarum)、浅黄肠球菌(Enterococcus gilvus)、溶过氧化肠球菌(Enterococcus haemoperoxidus)、荷曼氏肠球菌(Enterococcus hermanniensis)、海氏肠球菌(Enterococcus hirae)、意大利肠球菌(Enterococcus italicus)、乳酸肠球菌(Enterococcus lactis)、乐玛尼肠球菌(Enterococcus lemanii)、病臭肠球菌
(Enterococcus malodoratus)、莫拉氏肠球菌(Enterococcus moraviensis)、蒙氏肠球菌(Enterococcus mundtii)、Enterococcus olivae、苍白肠球菌(Enterococcus pallens)、铅黄肠球菌(Enterococcus phoeniculicola)、植物肠球菌(Enterococcus plantarum)、假鸟肠球菌(Enterococcus pseudoavium)、魁北克肠球菌(Enterococcus quebecensis)、棉子糖肠球菌(Enterococcus raffinosus)、鼠肠球菌(Enterococcus ratti)、瑞氏肠球菌(Enterococcus rivorum)、罗泰肠球菌(Enterococcus rotai)、解糖肠球菌(Enterococcus saccharolyticus)、西里西亚肠球菌(Enterococcus silesiacus)、孤立肠球菌
(Enterococcus solitaries)、硫磺肠球菌(Enterococcus sulfurous)、特氏肠球菌(Enterococcus termitis)、泰氏肠球菌(Enterococcus thailandicus)、尿肠球菌(Enterococcus ureasiticus)、解尿肠球菌(Enterococcus ureilyticus)、维克肠球菌(Enterococcus viikkiensis)、维洛肠球菌(Enterococcus villorum)、香坊肠球菌(Enterococcus xiangfangensis)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、咽峡炎(Streptococcus anginosus)、牛链球菌(Streptococcus bovis)、犬链球菌
(Streptococcus canis)、星座链球菌(Streptococcus constellatus)、停乳链球菌(Streptococcus dysgalactiae)、马蹄足链球菌(Streptococcus equines)、海豚链球菌(Streptococcus iniae)、中间链球菌(Streptococcus intermedius)、米勒链球菌(Streptococcus milleri)、缓症链球菌(Streptococcus mitis)、变异链球菌
(Streptococcus mutans)、口腔链球菌(Streptococcus oralis)、副溶血链球菌
(Streptococcus parasanguinis)、拟链球菌(Streptococcus peroris)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia)、假肺链球菌(Streptococcus pseudopneumoniae)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、鼠伤寒链球菌(Streptococcus ratti)、唾液链球菌(Streptococcus salivarius)、牙龈链球菌(Streptococcus tigurinus)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、血链球菌(Streptococcus sanguinis)、表兄链球菌(Streptococcus sobrinus)、猪链球菌(Streptococcus suis)、乳房链球菌
(Streptococcus uberis)、前庭链球菌(Streptococcus vestibularis)、绿色链球菌(Streptococcus viridians)和兽疫链球菌(Streptococcus zooepidemicus)。
subsp.alactosus)、干酪乳杆菌干酪亚种(Lactobacillus casei subsp.casei)、干酪乳杆菌假植物亚种(Lactobacillus casei subsp.pseudoplantarum)、干酪乳杆菌鼠李糖亚种(Lactobacillus casei subsp.rhamnosus)、干酪乳杆菌坚韧亚种(Lactobacillus casei subsp.tolerans)、乳酪乳杆菌(Lactobacillus catenaformis)、纤维二糖乳杆菌(Lactobacillus cellobiosus)、丘状乳杆菌(Lactobacillus collinoides)、融合魏斯乳杆菌(Lactobacillus confuses)、棒状乳杆菌(Lactobacillus coryniformis)、棒状乳杆菌棒状亚种(Lactobacillus coryniformis subsp.coryniformis)、棒状乳杆菌扭曲亚种(Lactobacillus coryniformis subsp.torquens)、卷曲乳杆菌(Lactobacillus
crispatus)、弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)、弯曲乳杆菌弯曲亚种
(Lactobacillus curvatus subsp.curvatus)、弯曲乳杆菌蜜二糖亚种(Lactobacillus curvatus subsp.melibiosus)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.Bulgaricus)、德氏乳杆菌德氏亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.Delbrueckii)、德氏乳杆菌乳酸亚种
(Lactobacillus delbrueckii subsp.lactis)、:广布乳杆菌(Lactobacillus
divergens)、香肠乳杆菌(Lactobacillus farciminis)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、穹隆乳杆菌(Lactobacillus fornicalis)、食果糖乳杆菌(Lactobacillus fructivorans)、果糖乳杆菌(Lactobacillus fructosus)、鹑鸡乳杆菌(Lactobacillus gallinarum)、加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、禾谷乳杆菌(Lactobacillus graminis)、耐盐乳杆菌(Lactobacillus halotolerans)、哈氏乳杆菌(Lactobacillus hamster)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、异型腐酒乳杆菌(Lactobacillus heterohiochii)、希氏乳杆菌(Lactobacillus hilgardii)、麦芽香乳杆菌(Lactobacillus homohiochii)、惰性乳杆菌(Lactobacillus iners)、肠乳杆菌(Lactobacillus
intestinalis)、詹氏乳杆菌(Lactobacillus jensenii)、约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)、坎氏乳杆菌(Lactobacillus kandleri)、开菲尔乳杆菌(Lactobacillus kefiri)、马乳酒样乳杆菌(Lactobacillus kefiranofaciens)、偏性异发酵乳杆菌(Lactobacillus kefirgranum)、昆氏乳杆菌(Lactobacillus kunkeei)、乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis)、莱士曼氏乳酸杆菌(Lactobacillus leichmannii)、林氏乳杆菌(Lactobacillus lindneri)、坏发酵乳杆菌(Lactobacillus malefermentans)、马里乳杆菌(Lactobacillus mali)、马耳他乳杆菌Lactobacillus maltaromicus)、马尼厚乳杆菌(Lactobacillus manihotivorans)、稍小乳杆菌(Lactobacillus minor)、小小乳杆菌(Lactobacillus minutes)、粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)、鼠乳杆菌
(Lactobacillus murinus)、纳氏乳杆菌(Lactobacillus nagelii)、口乳杆菌
(Lactobacillus oris)、面包乳杆菌(Lactobacillus panis)、类布氏乳杆菌
(Lactobacillus parabuchneri)、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、副干酪乳杆菌副干酪亚种(Lactobacillus paracasei subsp.paracasei)、副干酪乳杆菌坚韧亚种(Lactobacillus paracasei subsp.tolerans)、类高加索乳杆菌(Lactobacillus parakefiri)、类消化乳杆菌(Lactobacillus paralimentarius)、类植物乳杆菌
(Lactobacillus paraplantarum)、戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)、类食品乳杆菌(Lactobacillus perolens)、栖鱼乳杆菌(Lactobacillus piscicola)、胚牙乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、脑桥乳杆菌(Lactobacillus pontis)、罗伊乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、龈沟乳杆菌(Lactobacillus rimae)、罗氏乳杆菌(Lactobacillus rogosae)、瘤胃乳杆菌
(Lactobacillus ruminis)、米酒乳杆菌(Lactobacillus sakei)、米酒乳杆菌肉花亚种(Lactobacillus sakei subsp.camosus)、米酒乳杆菌米酒亚种(Lactobacillus sakei subsp.sakei)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、唾液乳杆菌水杨素亚种(Lactobacillus salivarius subsp.salicinius)、唾液乳杆菌唾液亚种(Lactobacillus salivarius subsp.salivarius)、旧金山乳杆菌(Lactobacillus sanfranciscensis)、沙氏乳杆菌(Lactobacillus sharpeae)、苏氏乳杆菌(Lactobacillus suebicus)、发状乳杆菌(Lactobacillus trichodes)、龈乳杆菌(Lactobacillus uli)、牛痘乳杆菌
(Lactobacillus vaccinostercus)、阴道乳杆菌(Lactobacillus vaginalis)、绿色乳杆菌(Lactobacillus viridescens)、小牛乳杆菌(Lactobacillus vitulinus)、木糖乳杆菌(Lactobacillus xylosus)、山梨氏乳杆菌(Lactobacillus yamanashiensis)、山梨氏乳杆菌马里亚种(Lactobacillus yamanashiensis subsp.mali)、山梨氏乳杆菌山梨亚种(Lactobacillus yamanashiensis subsp.Yamanashiensis)、玉米乳杆菌(Lactobacillus zeae)、青春双岐杆菌(Bifidobacterium adolescentis)、角双歧杆菌(Bifidobacterium angulatum)、两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、链状双歧杆菌(Bifidobacterium catenulatum)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、婴儿双岐杆菌(Bifidobacterium infantis)、阿尔氏肠球菌(Enterococcus alcedinis)、阿桂氏肠球菌(Enterococcus aquimarinus)、亚洲肠球菌(Enterococcus asini)、鸟肠球菌(Enterococcus avium)、卡氏肠球菌(Enterococcus caccae)、山茶肠球菌(Enterococcus camelliae)、坎氏肠球菌(Enterococcus canintestini)、犬肠球菌(Enterococcus canis)、酪黄肠球菌(Enterococcus casseliflavus)、盲肠肠球菌(Enterococcus cecorum)、鸽肠球菌(Enterococcus columbae)、多样肠球菌
(Enterococcus devriesei)、迪埃丝肠球菌(Enterococcus diestrammenae)、殊异肠球菌(Enterococcus dispar)、坚韧肠球菌(Enterococcus durans)、埃肯肠球菌(Enterococcus eurekensis)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、鹑鸡肠球菌(Enterococcus gallinarum)、浅黄肠球菌(Enterococcus gilvus)、溶过氧化肠球菌(Enterococcus haemoperoxidus)、荷曼氏肠球菌(Enterococcus hermanniensis)、海氏肠球菌(Enterococcus hirae)、意大利肠球菌(Enterococcus italicus)、乳酸肠球菌(Enterococcus lactis)、乐玛尼肠球菌(Enterococcus lemanii)、病臭肠球菌
(Enterococcus malodoratus)、莫拉氏肠球菌(Enterococcus moraviensis)、蒙氏肠球菌(Enterococcus mundtii)、Enterococcus olivae、苍白肠球菌(Enterococcus pallens)、铅黄肠球菌(Enterococcus phoeniculicola)、植物肠球菌(Enterococcus plantarum)、假鸟肠球菌(Enterococcus pseudoavium)、魁北克肠球菌(Enterococcus quebecensis)、棉子糖肠球菌(Enterococcus raffinosus)、鼠肠球菌(Enterococcus ratti)、瑞氏肠球菌(Enterococcus rivorum)、罗泰肠球菌(Enterococcus rotai)、解糖肠球菌(Enterococcus saccharolyticus)、西里西亚肠球菌(Enterococcus silesiacus)、孤立肠球菌
(Enterococcus solitaries)、硫磺肠球菌(Enterococcus sulfurous)、特氏肠球菌(Enterococcus termitis)、泰氏肠球菌(Enterococcus thailandicus)、尿肠球菌(Enterococcus ureasiticus)、解尿肠球菌(Enterococcus ureilyticus)、维克肠球菌(Enterococcus viikkiensis)、维洛肠球菌(Enterococcus villorum)、香坊肠球菌(Enterococcus xiangfangensis)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、咽峡炎(Streptococcus anginosus)、牛链球菌(Streptococcus bovis)、犬链球菌
(Streptococcus canis)、星座链球菌(Streptococcus constellatus)、停乳链球菌(Streptococcus dysgalactiae)、马蹄足链球菌(Streptococcus equines)、海豚链球菌(Streptococcus iniae)、中间链球菌(Streptococcus intermedius)、米勒链球菌(Streptococcus milleri)、缓症链球菌(Streptococcus mitis)、变异链球菌
(Streptococcus mutans)、口腔链球菌(Streptococcus oralis)、副溶血链球菌
(Streptococcus parasanguinis)、拟链球菌(Streptococcus peroris)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia)、假肺链球菌(Streptococcus pseudopneumoniae)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、鼠伤寒链球菌(Streptococcus ratti)、唾液链球菌(Streptococcus salivarius)、牙龈链球菌(Streptococcus tigurinus)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、血链球菌(Streptococcus sanguinis)、表兄链球菌(Streptococcus sobrinus)、猪链球菌(Streptococcus suis)、乳房链球菌
(Streptococcus uberis)、前庭链球菌(Streptococcus vestibularis)、绿色链球菌(Streptococcus viridians)和兽疫链球菌(Streptococcus zooepidemicus)。
[0020] 在另一方面，所述T1D特异性抗原可以选自下组：胰岛素原(PINS)，谷氨酸脱羧酶(GAD65)，胰岛素瘤相关蛋白2(IA-2)，胰岛特异性葡萄糖-6-磷酸酶催化亚基相关蛋白(IGRP)，锌转运蛋白8(ZnT8)，嗜铬粒蛋白A，(前原)胰岛淀粉样多肽(ppIAPP)，外周蛋白和瓜氨酸化葡萄糖调节蛋白(GRP)。例如，所述T1D特异性抗原可以是PINS。
[0021] 在另一方面，LAB可包含所述编码IL-2多肽的外源核酸和所述编码T1D特异性抗原多肽的外源核酸。或者，第一LAB可包含所述编码IL-2多肽的外源核酸，第二LAB可包含所述编码T1D特异性抗原多肽的外源核酸。所述编码IL-2多肽的外源核酸可以整合到所述LAB的染色体中。编码T1D特异性抗原多肽的所述外源核酸可以整合到所述LAB的染色体中，或者可以存在于所述LAB中包含的质粒上。所述编码IL-2多肽的外源核酸和所述编码T1D特异性抗原多肽的外源核酸可以整合到所述LAB的染色体中。所述编码IL-2多肽的外源核酸和所述编码T1D特异性抗原多肽的外源核酸可以是由相同启动子驱动的多顺反子表达单元的一部分。
[0022] 在另一个方面，所述IL-2可以是膜结合形式的IL-2或可溶形式的IL-2。所述编码IL-2多肽的外源核酸可编码IL-2变体多肽。当与相应的野生型IL-2多肽相比时，所述IL-2变体多肽可具有降低的IL-2活性或增强的IL-2活性。所述IL-2变体多肽可选自下组：阿地白介素，替西白介素(teceleukin)和生物白细胞介素。例如，所述IL-2变体多肽包括：
[0023] (a)相对于成熟的野生型IL-2的第一氨基酸取代，选自：L72G,L72A,L72S,L72T,L72Q,L72E,L72N,L72D,L72R和L72K；或
[0024] (b)相对于成熟的野生型IL-2的第二氨基酸取代，选自：F42A,F42G,F42S,F42T,F42Q,F42E,F42N,F42D,F42R和F42K；或
[0025] (c)相对于成熟的野生型IL-2的第三氨基酸取代，选自：Y45A,Y45G,Y45S,Y45T,Y45Q,Y45E,Y45N,Y45D,Y45R和Y45K；或
[0026] (d)它们的组合。
[0027] 所提供的组合物可包含乳酸乳球菌，其中所述乳酸乳球菌包含编码IL-2多肽的外源核酸和编码PINS的外源核酸，并且所述乳酸乳球菌适于在给予哺乳动物对象时粘膜递送低剂量IL-2。所述低剂量IL-2递送可以是约0.01M IU/天/对象至约5.4M IU/天/对象；约0.02M IU/天/约3.0M IU/天/对象；约0.1M IU/天/约3.0M IU/天/对象；或约0.2M IU/天/受制于2.0M IU/天/对象。
[0028] 还提供了该组合物在有此需要的哺乳动物对象中用于治疗T1D的用途。提供的治疗1型糖尿病(T1D)的方法包括给予有此需要的哺乳动物对象治疗有效量的组合物。
[0029] 在一个方面，在治疗T1D的方法中没有向所述对象施用抗CD3抗体。或者，治疗T1D的方法还包括向所述对象施用抗CD3抗体。所述抗CD3抗体可以与所述组合物同时以低剂量施用于所述对象。所述抗CD3抗体可以静脉内施用于所述对象。
[0030] 在另一方面，所述对象可具有残留的β细胞功能。所述对象可具有最近发作的T1D。所述对象可具有指示残留β细胞功能的血液或尿液C-肽浓度。所述对象可以是空腹血C肽浓度小于约1nmol/L但至少约0.2nmol/L；或者受刺激的血液C肽浓度小于约4nmol/L但至少约
0.5nmol/L的人类患者。在施用所述组合物之前的前12个月内，所述对象可能已被诊断为患有T1D。
0.5nmol/L的人类患者。在施用所述组合物之前的前12个月内，所述对象可能已被诊断为患有T1D。
[0031] 在另一方面，所述组合物可以粘膜给予所述对象。所述组合物可以液体形式给予所述对象。所述组合物可以以食品，膳食补充剂或栓剂产品的形式给予所述对象。所述组合物可以以包含约1×104至约1×1012；约1×106至约1×1012；或约1×109至约1×1012个菌落形成单位(cfu)的单位剂型给药。所述单位剂型可选自：胶囊，片剂，颗粒剂，栓剂和计量气雾剂。所述组合物可以是干粉形式或其压缩形式。
[0032] 还提供了遗传修饰的微生物，其包含编码IL-2多肽的外源核酸；和编码T1D特异性抗原多肽的外源核酸。例如，所述微生物可以是LAB。所述编码白细胞介素-2和/或T1D特异性抗原多肽的外源核酸可以稳定整合到微生物的染色体中。附图说明
[0033] 图1描绘了编码usp45分泌前导序列(SSusp45)和hIL-2基因的融合体的核苷酸序列(SEQ ID NO:46)，编码人白细胞介素-2(hIL-2；UniProt:P60568,aa 21-153)，在高表达的磷酸丙酮酸水合酶基因(eno；基因ID:4797432；位置:NC_009004.1(606184..607485))的下游，包含在eno和SSusp45之间的高表达的乳酸乳球菌MG1363 50S核糖体蛋白L30基因之前的基因间区域(rpmD；基因ID:4797873；位置:NC_009004.1(2316732..2316911,互补))。
[0034] 图2描绘了具有基因间区域的LL-IL-2的遗传基因座(ΔthyA,trePTS(ΔtrePP),otsB,ΔptcC和eno>>hIL-2)的示意图以及PCR扩增产物大小(bp)。
[0035] 图3描绘了具有骨架的示例性载体质粒，所述骨架存在pORI19片段，其中增加了PhllA>>β-葡糖醛酸酶(uidA；基因ID:946149)表达模块；被载物区域包含rpmD基因间区域偶联的gapB下游的pins，侧接交叉(XO)区域，位于eno>>hil-2的5’和3’；以及红霉素选择标志物：红霉素抗性23S RNA甲基化酶基因(ermC)。
[0036] 图4描绘了由LL-IL-2产生的PCR片段的1.2％琼脂糖凝胶分析。
[0037] 图5描绘了Western印记，显示LL-IL-2培养物上清液中存在hIL-2。
[0038] 图6描绘了编码具有pins基因的usp45分泌前导序列(SSusp45)的融合体的核苷酸序列(SEQ ID NO:57)，编码人胰岛素原(PINS；UniProt:P01308,aa 25-110)，在高表达的甘油醛3-磷酸脱氢酶基因(gapB；基因ID:4797877；位置:NC_009004.1(2492509..2493519,互补))下游，包含在gapB和pins之间的高表达乳酸乳球菌MG1363 50S核糖体蛋白L30基因之前的基因间区域(rpmD；基因ID:4797873；位置:NC_009004.1(2316732..2316911,互补)，参见例如Steidler等人,Nat.Biotechnol.2003；21(7):785-789)。
[0039] 图7描绘了LL-PINS/IL-2相关遗传基因座:ΔthyA,trePTS(ΔtrePP),otsB,ptcC-,gapB>>pins和eno>>hil-2的示意图，指示相关寡核苷酸结合位点，EcoRI限制位点，(/截短的/)遗传特征，基因间区域(IR)，PCR扩增产物大小(bp)。
[0040] 图8描绘了具有骨架的示例性载体质粒，所述骨架存在pORI19片段，其中增加了PhllA>>β-葡糖醛酸酶(uidA；基因ID:946149)表达模块；被载物区域包含基因间区域rpmD偶联的gapB下游的pins，侧接交叉(XO)区域，位于gapB>>pins的5’和3’；以及红霉素选择标志物：红霉素抗性23S RNA甲基化酶基因(ermC)。
[0041] 图9描绘了由LL-PINS/IL-2产生的PCR片段的1.2％琼脂糖凝胶分析。
[0042] 图10A和10B描绘了Western印迹，显示(1)LL-PINS/IL-2培养物上清液中存在PINS(黑色箭头)(图10A)，和(2)LL-PINS/IL-2培养物上清液中存在hIL-2(空心箭头)(图10B)。
[0043] 图11描绘了根据本发明的示例性抗原特异性疗法中新发作糖尿病NOD小鼠中高血糖的稳定逆转。如本文所述，例如在实施例3中治疗新发作的糖尿病NOD小鼠，并在治疗开始后跟踪血糖浓度14周。显示了用粘膜递送的LL-PINS或粘膜递送的LL-PINS+LL-IL-2治疗后仍然患有糖尿病的小鼠的百分比。
[0044] 图12描绘了根据本发明的示例性抗原特异性疗法在初始血糖浓度大于或小于350mg/dL的近期发作的糖尿病小鼠中的有效性。显示了用如本文所述的粘膜递送的LL-PINS+LL-IL-2治疗时仍然患有糖尿病的小鼠的百分比，例如，在实施例3中。
[0045] 图13描绘了LL-IL-2和重组人IL-2(rhIL-2)之间的生物学活性的比较。
[0046] 图14A和14B描绘了非肥胖糖尿病小鼠给予单剂量(1010CFU)LL-IL-2后不同时间点胃肠道的不同组织中活细菌的浓度(分别是图14A：CFU/组织；图14B：CFU/g))。所有条形代表平均3只小鼠(n＝3)。SIP＝近端小肠；SID＝远端小肠；CAE＝盲肠；COP＝近端结肠；COD＝远端结肠。
[0047] 图15描绘了质粒pAGX0053的结构。质粒骨架存在pT1NX片段，其中加入了PthyA>>SSusp45::hpins表达模块。PthyA，胸苷酸合成酶基因的启动子。EmR：红霉素选择标志物；repD,repE：复制基因。
[0048] 图16描绘了蛋白质印迹，显示在LL-PINS培养物上清液中存在全长质粒衍生的PINS。
[0049] 图17描绘了用各种重组细菌治疗的新发作糖尿病NOD小鼠的糖尿病缓解率。结果表明，在新发作糖尿病NOD小鼠中，粘膜递送的LL-IL-2(例如，提供低剂量IL-2)，任选地与根据本公开的示例性T1D特异性抗原(即PINS)组合诱导糖尿病缓解，并稳定地逆转高血糖症。如本文所述将小鼠治疗6周，并测量血糖浓度，包括治疗开始后14周。显示了治疗后仍为糖尿病的小鼠的百分比(Mantel-Cox对数秩检验；**p<0.01)。
[0050] 图18描绘了根据起始血糖浓度的糖尿病缓解率。结果表明，起始血糖浓度可以预测小鼠的治疗成功率。基于初始(治疗前)血糖水平小于或大于350mg/dL，对最近发作的糖尿病小鼠进行分类。结果表明，粘膜递送的LL-IL-2，任选地与根据本公开的示例性抗原特异性疗法(例如，PINS)组合在初始血糖浓度小于350mg/dL的最近发作的糖尿病小鼠中特别有效。显示了如本文所述用LL-IL-2或LL-PINS+LL-IL-2治疗后保持糖尿病的小鼠的百分比。值得注意的是，治疗6周后6只用LL-IL-2单独治疗并具有低于350mg/dL葡萄糖的小鼠处死，表示为“LL-IL2<350(n＝9)”，3只小鼠观察整整14周的时间。LL-IL-2>350(n＝6)(实心三角形)的数据时间点隐藏在未治疗>350(n＝16)(实心方块)的数据点后面。具有>350mg/dL葡萄糖的所有LL-IL-2治疗的小鼠在治疗6周后和14周随访期后仍然患有糖尿病(Mantel-Cox对数秩检验；****p<0.0001)。
[0051] 图19描绘了糖尿病NOD小鼠中胰岛β细胞的胰岛炎评分。结果显示，粘膜递送的LL-IL-2(例如，提供低剂量IL-2)，任选地与根据本公开的示例性抗原特异性疗法组合(例如，LL-PINS+LL-IL-2)不仅可以防止胰岛炎的恶化(通常在未经治疗的情况下进展为长期糖尿病时出现)，而且与最近发作且未治疗的长期糖尿病小鼠相比，可以减少胰岛β细胞的胰岛炎(例如，将胰岛炎减少到与在长期“正常血糖”NOD小鼠中发现的胰岛炎相当的程度)。与未治疗的长期糖尿病小鼠相比，治疗后重度胰岛炎的程度得到改善。与最近发作且未治疗的长期小鼠相比，无胰岛炎的胰岛β细胞的百分比显著增加。显著百分比的轻度胰岛炎胰岛炎改善为“旁胰岛炎”(peri-insulitis)或“无胰岛炎”。出乎意料的是，在所有治疗的近期发作的小鼠中观察到胰岛炎的显著减少(有和没有缓解-被归类为“治愈”和“未治愈”)。
[0052] 图20描绘了糖尿病NOD小鼠血浆中的随机C肽浓度。结果表明，含有或不含胰岛素原的低剂量IL-2在糖尿病NOD小鼠中保留了β细胞功能。与最近发作且未治疗的长期糖尿病小鼠相比，在LL-IL-2治疗6周后，任选地与根据本公开的示例性抗原特异性疗法(例如，LL-PINS+LL-IL-2)组合，在最近发作的糖尿病小鼠中血浆C-肽浓度显示缓解(归类为“治愈”)增加(Mann-Whitney T-检验；*p<0.05)。未检测到(ND)治疗但未“未治愈”小鼠的血浆中的C肽浓度，表明这些小鼠可能具有很少或没有剩余的活性β细胞。4个分析的未治疗的长期糖尿病小鼠中的3个的C肽水平也未检测到。
[0053] 图21描绘了治疗6周后流式细胞术检测的糖尿病NOD小鼠的局部(即肠系膜引流淋巴结；MLN)，全身(即脾和血)和靶器官(即胰腺LN)的不同免疫细胞亚群中foxp3+CTLA4+调节性T细胞的扩增。结果表明，与最近发作的小鼠相比，粘膜递送的LL-IL-2，任选地与根据本公开的示例性抗原特异性疗法组合(例如，LL-PINS+LL-IL-2)，增加了胰腺LN中foxp3+CTLA4+调节性T细胞的数量。出乎意料的是，在表现出缓解(“治愈”)和未表现出缓解(“未治愈”)小鼠的小鼠中观察到胰腺LN的增加(Mann-Whitney T-检验；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)。
[0054] 图22A和22B描绘了仅用LL-IL-2治疗的(图22A)和用LL-IL-2+LL-PINS治疗的近期发病-糖尿病小鼠的血糖浓度(mg/dL)(图22B)。
[0055] 图23描绘了在起始血糖浓度350mg/dl下进入研究的糖尿病缓解率。将小鼠分配至5个实验治疗组：未治疗的对照，LL-PINS，LL-IL2，LL-PINS+LL-IL2的混合物和LL-PINS+LL-IL2的混合物与全身免疫调节抗CD3的组合，如实施例9中所述。显示了在治疗后不同时间点保持糖尿病的小鼠的百分比。
具体实施方式
[0056] 此处使用的缩写词和缩略语可能包括：
[0057] BD 美国BD公司(Becton Dickinson)
[0058] BSA 牛血清白蛋白
[0059] CAE 盲肠
[0060] CDS 编码序列
[0061] CFU 菌落形成单位
[0062] COD或DCO 远端结肠
[0063] COP或PCO 近端结肠
[0064] DCO 远端结肠
[0065] EDTA 乙二胺四乙酸
[0067] FACS 荧光激活细胞分选
[0068] FCS 胎牛血清
[0069] FOS 低聚果糖
[0070] GAD65 谷氨酸脱羧酶
[0071] GRP 瓜氨酸化葡萄糖调节蛋白
[0072] GUS 葡萄糖醛酸酶
[0073] HRP 辣根过氧化物酶
[0074] IA-2 胰岛素瘤相关蛋白2
[0075] IAA 胰岛素自身抗体
[0076] IC 胰岛素含量测定
[0077] IGRP 胰岛特异性葡萄糖-6-磷酸酶催化亚基相关蛋白
[0078] IL-2 白细胞介素-2
[0079] INS 胰岛素
[0080] IU 国际单位
[0081] LAB 乳酸发酵菌/细菌
[0082] LL 乳酸乳球菌
[0083] LLOQ 定量限
[0084] MCT油 中链甘油三酯
[0085] MLN 肠系膜淋巴结
[0086] MMTT 混合膳食耐受性试验
[0087] MTT 3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑盐溴化物
[0088] MWM 分子量标志物
[0089] NCBI 国家生物技术信息中心
[0090] NIBSC 国家生物标准与控制研究所
[0091] NK细胞 自然杀伤细胞
[0092] NOD小鼠 非肥胖糖尿病小鼠
[0093] PBS 磷酸盐缓冲盐水
[0094] PCR 聚合酶链反应
[0095] PFA 多聚甲醛
[0096] PINS 胰岛素原(proinsulin)
[0097] PLN 胰腺引流淋巴结
[0098] ppIAPP (前原)胰岛淀粉样蛋白多肽
[0099] PTPRN 蛋白酪氨酸磷酸酶，受体N型
[0100] PTS 磷酸转移酶系统
[0101] RIA 放射免疫分析(RIA)
[0102] SID/DSI 远端小肠
[0103] SIP/PSI 近端小肠
[0104] SPL 脾
[0105] T1D 1型糖尿病
[0106] TSLP 胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)
[0107] WHO 世界卫生组织
[0108] XO 交叉(cross over)
[0109] ZnT8 锌转运蛋白8
[0110] 目前提供了用于在对象中治疗T1D，诱导Treg和/或恢复对T1D特异性抗原(即自身抗原)的耐受性的组合物和方法。
[0111] 本文提供的组合物包含(1)包含白细胞介素-2(IL-2)基因和T1D特异性抗原基因的LAB，或(2)包含白细胞介素-2(IL-2)基因的第一LAB，和包含T1D特异性抗原的第二LAB。在一些实例中，LAB表达IL-2基因和/或T1D特异性抗原基因以产生IL-2和T1D特异性抗原(例如，PINS)。在一些实施方式中，组合物是包含LAB和药学上可接受的载体的药物组合物。
本文描述了示例性载体。在一些实例中，药物组合物适于将组合物粘膜递送至对象。
本文描述了示例性载体。在一些实例中，药物组合物适于将组合物粘膜递送至对象。
[0112] 提供了在有此需要的哺乳动物对象中治疗T1D的方法。该方法包括向对象施用(例如，通过粘膜途径)根据本发明的组合物。示例性方法包括：向对象施用治疗有效量的能够表达IL-2和T1D特异性抗原(例如，PINS)的LAB。
[0113] 出乎意料的是，发现具有显著残留β细胞功能的对象对本文所述的治疗方法反应特别好。因此，在一些实施方式中，本文描述的方法中的哺乳动物对象最近已被诊断患有T1D和/或患有最近发作的T1D。在一些实例中，对象可能在施用包含本文所述的LAB的组合物之前的前12个月，前24个月或之前的36个月内被诊断为患有T1D。
[0114] 在本文所述方法的一些实例中，将IL-2和抗原多肽递送至粘膜。这种方法可能导致低剂量IL-2浓度甚至低于低剂量全身给药所需的浓度。因此可以避免与全身递送IL-2相关的脱靶毒性。
[0115] 定义
[0116] 如本文所用，单数形式的“一个”、“一种”和“该”包括复数指代物，除非内容中另有明确规定。例如，术语“一个细胞”可以包括多个细胞，并包括其混合物。类似地，除非上下文另有明确规定，否则使用“一种化合物”来治疗或制备如本文所述的药物包括使用一种或多种化合物进行这种治疗或制备。
[0117] 如本文所用，术语“包括”或“包含”意在表示所述组合物和方法包括所提及的要素，但并不排除其它要素。当用以定义组合物和方法时，“基本由……组成”应表示排除对于该组合物具有任何基本意义的其它要素。因此，基本上由本文定义的元素组成的组合物不排除来自分离和纯化方法的痕量污染物和药学上可接受的载体，例如磷酸盐缓冲盐水，防腐剂等。“由......组成”意指排除除了其他成分的痕量元素以外的任何其他组分和用于施用本文所述组合物的实质方法步骤。通过各个这些转换术语定义的实施方式在本发明范围内。
[0118] 如本文所用，术语“表达”基因或多肽或“产生”多肽(例如，IL-2多肽或T1D特异性抗原多肽)意在分别包括“能够表达”和“能够产生”。例如，含有外源核酸的微生物可以在充分条件下(例如，充分水合和/或在营养物存在下)产生由外源核酸编码的多肽。然而，微生物可能不总是主动产生编码的多肽。可以将LAB(例如，乳酸乳球菌)干燥(例如，冷冻干燥)，并且在该状态下可以认为是休眠的(即，不是主动产生多肽)。然而，一旦LAB经受足够的条件，例如，给予对象并释放(例如，进入对象的胃肠道)，它可以开始产生多肽。因此，“表达”基因或多肽或“产生”本公开的多肽的LAB包括处于其“休眠”状态的LAB。
[0119] 与参考数值相关的术语“约”及其在此使用的语法等同物可以包括参考数值本身和从该参考数值加上或减去10％的值的范围。例如，术语“约10”包括10和从9到11的任何量。在一些情况下，与参考数值相关的术语“约”还可以包括值的范围加或减该参考数值的10％，9％，8％，7％，6％，5％，4％，3％，2％或1％。
[0120] “IL-2基因”是指编码“IL-2多肽”的白细胞介素2基因。术语“IL-2基因”包括编码“IL-2变体多肽”的“IL-2变体基因”。
[0121] 术语“IL-2”或“IL-2多肽”是指功能性的，例如全长的白细胞介素2多肽(例如，人IL-2多肽)，包括膜结合形式和可溶形式，以及“IL-2变体多肽”。
[0122] “IL-2变体”或“IL-2变体多肽”是指修饰的(例如，截短的或突变的)但功能性IL-2多肽，例如人IL-2的截短或突变形式。术语“IL-2变体多肽”包括与相应的野生型IL-2多肽相比具有增强的活性或活性降低的IL-2多肽。“IL-2变体多肽”保留至少一些IL-2活性。
[0123] T1D特异性抗原
[0124] 术语“T1D特异性自身抗原”，“T1D特异性抗原”，“疾病特异性抗原”，“自身抗原”，“自抗原”或“抗原”在本文中可互换使用。这些术语在本文中根据本领域公认的自身抗原或自抗原的含义使用，并且通常是指源自对象自身体内(由对象自身体内产生)的多肽/蛋白质，其中所述抗原被对象自身的免疫系统识别，通常产生针对这种抗原的抗体。自身免疫疾病通常与某些疾病特异性自身抗原相关。在T1D中，对象的免疫系统可以产生针对与β细胞破坏过程相关的至少一种抗原的抗体。这种自身抗原包括胰岛素原(PINS)，谷氨酸脱羧酶(GAD65)，胰岛素瘤相关蛋白2(IA-2)，胰岛特异性葡萄糖-6-磷酸酶催化亚基相关蛋白(IGRP)和锌转运蛋白(ZnT)8。临床T1D还可以与由β细胞表达的其他候选靶分子相关，例如嗜铬粒蛋白A，(前原)胰岛淀粉样蛋白多肽(ppIAPP)，外周蛋白和瓜氨酸化葡萄糖调节蛋白(GRP)。
[0125] 术语“T1D特异性抗原基因”是指编码上述“T1D特异性抗原”的基因。术语“T1D特异性抗原基因”包括编码“T1D特异性抗原变体多肽”的“T1D特异性抗原变体基因”。
[0126] 术语“T1D特异性抗原多肽”是指功能性的，例如全长的多肽，以及“T1D特异性抗原变体多肽”，与相应的野生型多肽相比，其可具有增强的活性或降低的活性。
[0127] 术语“T1D特异性抗原变体”或“T1D特异性抗原变体多肽”是指修饰的(例如，截短的或突变的)但功能性的多肽，例如人PINS的截短或突变形式。术语“变体多肽”包括与相应的野生型多肽相比具有增强的活性或活性降低的多肽。“变体多肽”保留至少一些生物活性(功能性多肽)。GAD65和IA-2的示例性变体包括其修剪形式(例如，分别为GAD65370-575和IA-2635-979；相对于NCBI登录号NP_000809.1(SEQ ID NO：7)和NP_002837.1(SEQID NO：9)，保留抗原性质，因此可用于本公开的组合物和方法，例如，在刺激Tregs和诱导对象的耐受性中。
通常，T1D特异性抗原的修剪或截短形式由LAB(例如，乳酸乳球菌(Lactococcus lactis))有效表达和分泌。
通常，T1D特异性抗原的修剪或截短形式由LAB(例如，乳酸乳球菌(Lactococcus lactis))有效表达和分泌。
[0128] 术语“可操作地连接”表示并置位置，其中如此描述的组分的关系允许其以所需方式发挥功能。“可操作地连接”至编码序列的控制序列以在与控制序列相容的条件下完成编码序列表达的方式连接。
[0129] 对象
[0130] “对象”是生物体，其可以受益于例如根据本公开内容的方法施用本公开的组合物。对象可以是哺乳动物(“哺乳动物对象”)。示例性哺乳动物对象包括人，农场动物(例如牛，猪，马，绵羊，山羊)，宠物(例如狗，猫和兔)和其他动物，例如小鼠，大鼠和灵长类动物。在一些实例中，哺乳动物对象是人类患者。
[0131] 低剂量IL-2
[0132] 术语“低剂量IL-2”是指IL-2多肽的剂量或浓度，其可以在相应的对象中促进调节性T(Treg)细胞群的能力和稳定性和/或促进幼稚CD4+T细胞发育成Treg细胞，但是低于在对象中刺激幼稚T细胞分化为的效应T细胞和/或记忆T细胞的阈值剂量/浓度。已经显示，例如当测量STAT5(pSTAT5)时，Treg细胞对IL-2的激活阈值比效应T细胞低10-20倍。在pSTAT5的下游，对细胞功能重要的许多基因的激活需要的IL-2剂量对Treg细胞比对效应T细胞低100倍(参见，例如，Yu，A.等，Diabetes 2015，64：2172-2183)。然而，就人类已知的治疗方案而言，尚未建立刺激Treg细胞所需的最小剂量的IL-2。
[0133] 在一些实施方式中，例如，在人类治疗的背景下，低剂量IL-2通常是指IL-2多肽或IL-2变体多肽的剂量约为0.01M IU/天/对象至约5.4M IU/天/对象。低剂量可以约为0.01M IU/天/对象至约3.0M IU/天/对象。低剂量可以约为0.02M IU/天/对象至约3M IU/天/对象，约0.03M IU/天/对象至约3M IU/天/对象，约0.04M IU/天/对象至约3M IU/天/对象，约0.05M IU/天/对象至约3M IU/天/对象，约0.06M IU/天/对象至约3M IU/天/对象，约0.07M IU/天/对象至约3M IU/天/对象，约0.08M IU/天/对象至约3M IU/天/对象，约0.09M IU/天/对象至约3M IU/天/对象，约0.1M IU/天/对象至约3M IU/天/对象，约0.2M IU/天/对象至约3M IU/天/对象，约0.3M IU/天/对象至约3M IU/天/对象，约0.4M IU/天/对象至约3M IU/天/对象，约0.5M IU/天/对象至约3M IU/天/对象，约0.6M IU/天/对象至约3M IU/天/对象，约0.7M IU/天/对象至约3M IU/天/对象，约0.8M IU/天/对象至约3M IU/天/对象，约
0.9M IU/天/对象至约3M IU/天/对象或约1.0M IU/天/对象至约3M IU/天/对象。低剂量可以约为0.02M IU/天/对象至约2.5M IU/天/对象。低剂量也可以约为0.05M IU/天/对象至约2.0M IU/天/对象。低剂量可以约为0.1M IU/天/对象至约1.5M IU/天/对象。在甚至其它实施方式中，低剂量可以约为0.3M IU/天/对象至约1.0M IU/天/对象。低剂量可以约为
0.5M IU/天/对象至约1.0M IU/天/对象。
0.9M IU/天/对象至约3M IU/天/对象或约1.0M IU/天/对象至约3M IU/天/对象。低剂量可以约为0.02M IU/天/对象至约2.5M IU/天/对象。低剂量也可以约为0.05M IU/天/对象至约2.0M IU/天/对象。低剂量可以约为0.1M IU/天/对象至约1.5M IU/天/对象。在甚至其它实施方式中，低剂量可以约为0.3M IU/天/对象至约1.0M IU/天/对象。低剂量可以约为
0.5M IU/天/对象至约1.0M IU/天/对象。
[0134] 术语“国际单位”(IU)在本文中根据其本领域公认的含义使用，并且表示物质(例如多肽)的量。构成一个国际单位的质量或数量根据所测量的物质而变化。世界卫生组织(WHO)提供生物活性多肽的单位表征。例如，1IU的人IL-2相当于约73pg的生物活性多肽(WHO国际标准；NIBSC 86/500)。
[0135] 低剂量抗-CD3
[0136] 术语“低剂量抗CD3”是指抗CD3抗体的累积剂量或浓度低于抗CD3抗体的标准剂量，或者是人类中用于治疗疾病如T1D或癌症的抗CD3抗体的调节批准剂量。例如，在人类中，低剂量抗CD3治疗可包含人体中小于50mg(累积)抗CD3抗体的剂量。例如，低剂量抗CD3可包含约1毫克至约50毫克；约5毫克至约40毫克；约10毫克至约30毫克；约15毫克至约25毫克；约20毫克至约30毫克；约15毫克至约20毫克；或约30毫克至约35毫克的累积抗CD抗体治疗。失剂量抗CD3可包含少于约50毫克；约45毫克；约40毫克；约35毫克；约30毫克；约25毫克；约20毫克；约15毫克；约10毫克；或约5毫克的累积抗CD抗体治疗。
[0137] 例如，在一些情况下，在人中给予的抗CD3抗体的累积剂量可以是在特定时间段给予(例如在14天期间)约34毫克或约17毫克。这意味着在14天的过程中给予约2.43毫克或1.21毫克的抗CD3抗体。
[0138] 低剂量抗CD3治疗还可包含约80％的剂量；约70％；约60％；约50％；约40％；约30％；约20％；约10％；约5％；约2％；约1％；从约80％到约70％；约70％至60％；从约60％到
50％；从约50％到25％；从约40％到15％；或约30％至5％的抗CD3抗体治疗T1D或癌症的监管批准剂量。
50％；从约50％到25％；从约40％到15％；或约30％至5％的抗CD3抗体治疗T1D或癌症的监管批准剂量。
[0139] 在其他哺乳动物如小鼠中，低剂量抗CD3可以指小于约5微克的剂量；2.5微克；或1微克。例如，可采用约5微克用于小鼠治疗。例如，可采用约2.5微克用于小鼠治疗。在其它情况下，可采用约1微克用于小鼠治疗。小鼠的总剂量可以是12.5微克或6微克抗CD3。
[0140] 抗CD3可以每天至少给药一次，每天最多达5次。例如，每天一次，每天2次，或每天3次，只要满足累积剂量即可。例如，如果给予的剂量是2.43毫克/天，并且每天给药两次，则每剂量给予1.215毫克。
[0141] 为了实现低剂量抗CD3方案，可以每天至少一次给予制剂至少3天；4天；5天；6天；7天；8天；9天；10天；11天；12天；13天；14天；15天；16天；17天，18天；19天；20天；30天；或40天，只要达到累积剂量即可。例如，如果给予34毫克抗CD3剂量方案(低剂量抗CD3)14天，则可给予对象约2.43毫克/天。在某些情况下，低剂量抗CD可以连续每天至少给药一次，持续至少1个月，2个月，3个月，6个月，1年或更长时间。
[0142] 低剂量抗CD3可以与给予本文所述组合物同时静脉内给药。任选地，可以在第一次施用本文所述组合物后给予低剂量抗CD3 1天；2天；3天；4天；5天；6天；7天；2周；3周；或1个月。此外，在某些情况下，可以在第一次施用本文所述组合物之前低给予剂量抗CD3 1天；2天；3天；4天；5天；6天；7天；2周；3周；或1个月。
[0143] 在一些情况下，可以在施用本文所述组合物之前或之后给予患者标准剂量的抗CD3抗体或人类中的监管批准剂量的抗CD3抗体以治疗诸如T1D和癌症的疾病。
[0144] 在某些实施方式中，抗-CD3抗体可以是特普利组单抗(teplizumab)。
[0145] 患者亚群
[0146] 使用本文描述的方法治疗的对象可具有显著(例如，可测量的)残留β细胞功能。在这种情况下，即使在治疗中断或完全停止之后，对象也可以维持疾病缓解。新诊断的患者在诊断时通常具有一定数量的胰岛β细胞(β细胞)，因此这些患者能够产生一定量的内源性胰岛素。当用本公开的组合物和方法(例如，低剂量IL-2和PINS疗法)治疗时，这样的患者群体可特别好地受益。本文描述的治疗可以防止β细胞的进一步破坏，并因此可以诱导疾病缓解。发现初始β细胞量可能影响治疗效果。例如，在用本公开的组合物治疗并且在治疗开始时具有约350mg/dL或更低的血糖浓度的57％的近期发作的NOD小鼠中，可以逆转糖尿病。仅在22％的初始葡萄糖浓度超过350mg/dL的小鼠中完成疾病的逆转。此外，在最近发作的小鼠中，在停止治疗后疾病的逆转保持稳定，表明本公开的方法(涉及生物活性多肽的粘膜递送)可以有效地纠正高血糖症并恢复对β细胞的长期耐受性。然而，一旦对象的β细胞被破坏，这样的对象可能不再以相同的方式受益于所述治疗。
[0147] 治疗
[0148] 本文所用的术语“治疗”、“处理”等是指改善或缓解疾病或病症(例如T1D)的特征性症状或表现。例如，T1D的治疗可导致对象中抗原特异性免疫耐受的恢复或诱导。在其他实例中，治疗意指阻止自身免疫性糖尿病或逆转自身免疫性糖尿病。例如，治疗可能导致维持剩余的β细胞量。在其他实例中，T1D的治疗涉及增加Treg细胞的频率或活化。在其他实例中，治疗可以扩增抗原特异性Treg细胞(例如，在胸腺中)，和/或诱导Treg细胞迁移到外周血中。在其他实例中，治疗涉及改善对象(人类患者)临床标志物中的至少一种。例如，治疗可以提高血液和/或尿液C-肽水平。在其他实例中，治疗可降低对象(例如，人类患者)的血糖水平(例如，响应食物摄取或空腹血糖水平)；减少在对象中维持适当血糖水平所需的注射胰岛素量，降低对象中与糖尿病相关的自身抗体水平，和/或增加/保持C-肽水平(例如，在口服葡萄糖耐量试验后)。治疗可以意指连续/慢性治疗或处理，其中对象在治疗停止后在相当长的时间内(例如，至少6个月，至少1年，至少2年，至少3年，至少4年，或至少5年)没有疾病或病症的临床症状。
[0149] 如本文所用，这些术语还包括，预防或延迟疾病或病症或与疾病或病症相关的症状的发作，包括在患有所述疾病或病症之前降低疾病或病症或其相关症状的严重性。在痛苦之前的这种预防或减少是指将本文所述的化合物或组合物给予患者，该患者在患有疾病或病症的给药时不给药。“预防”还包括预防疾病或病症或与其相关的症状的复发或复发预防，例如在一段时间的改善之后。
[0150] 治疗有效量
[0151] 如本文所用，术语“治疗有效量”是指当根据期望的治疗方案施用时将引起期望的治疗效果或响应的非致病微生物或本公开的组合物的量。所述化合物或组合物通常以单位剂型提供，例如片剂或胶囊，当每天给药一次或多次时，其含有相当于治疗有效量的活性成分的量。
[0152] 本领域普通技术人员将理解，实现期望的治疗效果(例如，用于有效治疗T1D)所需的治疗有效量的重组微生物将变化，例如，取决于由微生物表达的IL-2多肽的性质，由LAB表达的抗原多肽的性质，给药途径，以及接受者的年龄、体重和其他特征。
[0153] 最近发作的T1D
[0154] 在一些实施方式中，对象具有最近发作的T1D。术语“最近发作的T1D”、“新发作的T1D”，或“最近发作的疾病”是指对象(例如，人类患者)的病症，其最近被诊断为患有T1D(例如，在约3个月内，约6个月内，约9个月内，约12个月内，约15个月内，约18个月内，约24个月内，约30个月内，约36个月内，约42个月内，约48个月内，约54个月内，或约60个月内)。
[0155] 在人类中，可以使用诊断标记化合物测量在T1D诊断之前和之后发生的β细胞功能的下降。例如，C-肽以与胰岛素相同的量产生(在促胰岛素的酶促裂解期间)，因此可以用作内源性胰岛素分泌的量度(包括在用胰岛素治疗的患者中)。C-肽已经用于糖尿病患者的临床管理，并且用于测量C-肽的测定系统是本领域技术人员已知的。参见，例如，Jones A.G.和Hattersley A.T.，Diabetic Medicine 2013,30：803-817；Little RR等，Clin.Chem.2008,54:1023-1026；Wiedmeyer等，Clin.Chem.2007,53：784-787。
[0156] C肽值可以测量为nmol/L(其中1nmol/L是1000pmol/L，并且相当于约3ng/mL)测量。可以在对象的血液或尿液中测量C肽。血液C肽水平可以在非禁食对象(随机C肽)，禁食对象(禁食C肽)或用饮食刺激物刺激(例如混合液体膳食或胰高血糖素)的对象中测定(刺激C-肽)。尿液中的C-肽可以测量为对象在24小时内分泌的C-肽的总量。通常，尿液中含有的C肽以C-肽和肌酸酐的比例来测量。
[0157] 在一些实施方式中，在施用本公开的组合物之前的对象(例如，人)(例如，具有最近发作的T1D的对象)的空腹血液C-肽浓度小于约1nmol/L，但是至少约为0.5nmol/L，至少约0.4nmol/L，至少约0.3nmol/L，或至少约0.2nmol/L。在其他实施方式中，对象(例如人)的受刺激的血液C肽浓度小于约4nmol/L，但是至少约为1nmol/L，至少约0.9nmol/L，至少约0.8nmol/L，至少约0.7nmol/L，至少约0.6nmol/L，或至少约0.5nmol/L。在其他实施方式中，具有近期发作的T1D的对象(例如，人)的餐后尿C-肽:肌酸酐比(nmol/mmol)小于约4，但是至少约为1，至少约0.9，至少约0.8，至少约0.7，至少约0.6，至少约0.5，至少约0.4，或至少约0.3。
[0158] 在其他实施方式中，可以通过测量对象的血清或血液中的胰岛素自身抗体(IAA)来鉴定最近发作的T1D对象(例如，人类患者)。在一些实例中，对象对IAA测试呈阳性。血清IAA浓度也可用于测量疾病进展或治疗进展。已经描述了测量胰岛素自身抗体的方法。参见，例如Demeester等，Diabetes Care 2015,38(4):644-651。
[0159] 粘膜
[0160] 术语“粘膜”在本文中根据其本领域公认的含义使用。“粘膜”可以是体内发现的任何粘膜，例如口腔粘膜，直肠粘膜，胃粘膜，肠粘膜，尿道粘膜，阴道粘膜，眼粘膜，颊粘膜，支气管或肺粘膜，以及鼻粘膜或嗅粘膜。
[0161] 如本文所用的术语“粘膜递送”根据其本领域公认的含义使用，即，例如通过使本公开的组合物与粘膜接触而递送至粘膜。口腔粘膜递送包括口腔，舌下和牙龈递送途径。因此，在一些实施方式中，“粘膜递送”包括胃递送，肠递送，直肠递送，口腔递送，肺部递送，眼部递送，鼻腔递送，阴道递送和口服递送。
[0162] 术语“粘膜耐受性”是指在对象通过粘膜途径暴露于抗原后，抑制哺乳动物对象(例如人类患者)中对抗原的特异性免疫应答。通常，所述粘膜耐受性是全身耐受性。低剂量口服耐受是由低剂量抗原诱导的口服耐受，其特征在于主动免疫抑制，由可以转移对幼稚宿主的耐受性的环磷酰胺敏感的调节性T细胞介导。高剂量口服耐受性是由高剂量抗原诱导的口服耐受性，对环磷酰胺治疗不敏感，并且通过抗原特异性T细胞的无反应性和/或缺失进行T细胞低反应性的诱导。对环磷酰胺的敏感性差异可用于区分低剂量和高剂量耐受性。Strobel等,Immunology 1983,49:451-456。示例性口服耐受性参见Mayer和Shao，Nature Rev.Immunol.2004,4:407-419。
[0163] 免疫调节化合物
[0164] 在一些实施方式中，本公开内容提供了治疗T1D的方法，其中所述对象不同时用另外的免疫调节化合物(即，除IL-2外)治疗。因此，对象仅用T1D特异性抗原和IL-2治疗。
[0165] 在一些实施方式中，本公开提供了治疗T1D的方法，其中所述对象同时用另外的免疫调节化合物治疗。因此，用T1D特异性抗原，IL-2和另外的免疫调节化合物治疗对象。
[0166] 术语“免疫调节化合物”或“免疫调节剂”在本文中根据其本领域公认的含义使用。免疫调节化合物可以是本领域技术人员已知的任何免疫调节化合物。本领域技术人员可以选择在本文所述的治疗中包括或不包括免疫调节化合物。在治疗方案中包括免疫调节化合物的决定可以通过本文所述治疗的表现，对象的遗传特征和/或生理条件以及其他因素来确定。
[0167] 在一些实施方式中，免疫调节化合物是诱导耐受的化合物。例如，通过诱导调节性T细胞，或以间接方式，例如通过激活未成熟树突细胞以产生耐受的树突细胞和/或抑制Th2免疫应答诱导在成熟的树突状细胞上“共刺激”因子的表达，可以获得耐受性诱导。免疫调节和免疫抑制化合物是本领域技术人员已知的，包括但不限于细菌代谢物如精胍菌素(spergualin)，真菌和链霉素代谢物如他克莫司或环孢菌素，免疫抑制细胞因子如IL-4，IL-10，IFNα，TGFβ(作为调节性T细胞的选择性佐剂)Flt3L，TSLP和Rank-L(作为选择性致耐受性DC诱导剂)，抗体和/或拮抗剂如抗CD40L，抗CD25，抗-CD20，抗IgE，抗CD3和蛋白质，肽或融合蛋白，例如CTL-41g或CTLA-4激动剂融合蛋白。在一些实施方式中，免疫调节化合物是免疫抑制化合物。免疫抑制化合物可以是免疫抑制细胞因子或抗体。在其他实施方式中，免疫抑制细胞因子是耐受性增强细胞因子或抗体。本领域技术人员将理解，术语“免疫调节化合物”还包括其功能同源物。功能同系物是具有与预期目的基本相同或相似的功能的分子，但可以在结构上不同。在一些实例中，免疫调节化合物是抗CD3或其功能同源物。
[0168] LAB
[0169] 本公开涉及遗传修饰的乳酸发酵细菌(LAB)的用途。LAB菌株可以是乳球菌种(Lactococcus species)，乳杆菌种(Lactobacillus species)，双歧杆菌种(Bifidobacterium species)，链球菌种(Streptococcus species)和肠球菌种
(Enterococcus species)。
(Enterococcus species)。
[0170] 如本文所用，乳球菌或乳杆菌不限于特定种或亚种，而是意指包括任何乳球菌或乳杆菌种或亚种。示例性的乳球菌种包括：格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、鱼类乳球菌(Lactococcus piscium)、植物乳球菌(Lactococcus plantarum)和棉籽糖乳球菌(Lactococcus raffinolactis)。在一些例子中，乳酸乳球菌是乳酸乳球菌乳脂亚种(Lactococcus lactis subsp.cremoris)、乳酸乳球菌叶蝉亚种(Lactococcus lactis subsp.hordniae)、乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp.Lactis)。
[0171] 示例性的乳杆菌种包括：耐酸乳杆菌(Lactobacillus acetotolerans)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、活泼乳杆菌(Lactobacillus agilis)、双叉乳杆菌(Lactobacillus algidus)、食品乳杆菌(Lactobacillus alimentarius)、解淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylolyticus)、嗜淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylophilus)、食淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylovorus)、动物乳杆菌(Lactobacillus animalis)、鸟乳杆菌(Lactobacillus aviaries)、鸟乳杆菌不解棉子糖亚种(Lactobacillus aviarius subsp.araffinosus)、鸟乳杆菌鸟亚种(Lactobacillus aviarius subsp.aviaries)、白鲑乳杆菌(Lactobacillus bavaricus)、倍发酵乳杆菌(Lactobacillus bifermentans)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、布赫内氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、卡尼乳杆菌(Lactobacillus carnis)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、干酪乳杆菌不发酵乳糖亚种(Lactobacillus casei subsp.alactosus)、干酪乳杆菌干酪亚种(Lactobacillus casei subsp.casei)、干酪乳杆菌假植物亚种(Lactobacillus casei subsp.pseudoplantarum)、干酪乳杆菌鼠李糖亚种(Lactobacillus casei subsp.rhamnosus)、干酪乳杆菌坚韧亚种(Lactobacillus casei subsp.tolerans)、乳酪乳杆菌(Lactobacillus catenaformis)、纤维二糖乳杆菌(Lactobacillus cellobiosus)、丘状乳杆菌(Lactobacillus collinoides)、融合魏斯乳杆菌(Lactobacillus confuses)、棒状乳杆菌(Lactobacillus coryniformis)、棒状乳杆菌棒状亚种(Lactobacillus coryniformis subsp.coryniformis)、棒状乳杆菌扭曲亚种(Lactobacillus coryniformis subsp.torquens)、卷曲乳杆菌(Lactobacillus
crispatus)、弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)、弯曲乳杆菌弯曲亚种
(Lactobacillus curvatus subsp.curvatus)、弯曲乳杆菌蜜二糖亚种(Lactobacillus curvatus subsp.melibiosus)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)、德氏乳杆菌德氏亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.delbrueckii)、德氏乳杆菌乳酸亚种
(Lactobacillus delbrueckii subsp.lactis)、:广布乳杆菌(Lactobacillus
divergens)、香肠乳杆菌(Lactobacillus farciminis)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、穹隆乳杆菌(Lactobacillus fornicalis)、食果糖乳杆菌(Lactobacillus fructivorans)、果糖乳杆菌(Lactobacillus fructosus)、鹑鸡乳杆菌(Lactobacillus gallinarum)、加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、禾谷乳杆菌(Lactobacillus graminis)、耐盐乳杆菌(Lactobacillus halotolerans)、哈氏乳杆菌(Lactobacillus hamster)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、异型腐酒乳杆菌(Lactobacillus heterohiochii)、希氏乳杆菌(Lactobacillus hilgardii)、麦芽香乳杆菌(Lactobacillus homohiochii)、惰性乳杆菌(Lactobacillus iners)、肠乳杆菌(Lactobacillus
intestinalis)、詹氏乳杆菌(Lactobacillus jensenii)、约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)、坎氏乳杆菌(Lactobacillus kandleri)、开菲尔乳杆菌(Lactobacillus kefiri)、马乳酒样乳杆菌(Lactobacillus kefiranofaciens)、偏性异发酵乳杆菌(Lactobacillus kefirgranum)、昆氏乳杆菌(Lactobacillus kunkeei)、乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis)、莱士曼氏乳酸杆菌(Lactobacillus leichmannii)、林氏乳杆菌(Lactobacillus lindneri)、坏发酵乳杆菌(Lactobacillus malefermentans)、马里乳杆菌(Lactobacillus mali)、马耳他乳杆菌Lactobacillus maltaromicus)、马尼厚乳杆菌(Lactobacillus manihotivorans)、稍小乳杆菌(Lactobacillus minor)、小小乳杆菌(Lactobacillus minutes)、粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)、鼠乳杆菌
(Lactobacillus murinus)、纳氏乳杆菌(Lactobacillus nagelii)、口乳杆菌
(Lactobacillus oris)、面包乳杆菌(Lactobacillus panis)、类布氏乳杆菌
(Lactobacillus parabuchneri)、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、副干酪乳杆菌副干酪亚种(Lactobacillus paracasei subsp.paracasei)、副干酪乳杆菌坚韧亚种(Lactobacillus paracasei subsp.tolerans)、类高加索乳杆菌(Lactobacillus parakefiri)、类消化乳杆菌(Lactobacillus paralimentarius)、类植物乳杆菌
(Lactobacillus paraplantarum)、戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)、类食品乳杆菌(Lactobacillus perolens)、栖鱼乳杆菌(Lactobacillus piscicola)、胚牙乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、脑桥乳杆菌(Lactobacillus pontis)、罗伊乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、龈沟乳杆菌(Lactobacillus rimae)、罗氏乳杆菌(Lactobacillus rogosae)、瘤胃乳杆菌
(Lactobacillus ruminis)、米酒乳杆菌(Lactobacillus sakei)、米酒乳杆菌肉花亚种(Lactobacillus sakei subsp.camosus)、米酒乳杆菌米酒亚种(Lactobacillus sakei subsp.sakei)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、唾液乳杆菌水杨素亚种(Lactobacillus salivarius subsp.salicinius)、唾液乳杆菌唾液亚种(Lactobacillus salivarius subsp.salivarius)、旧金山乳杆菌(Lactobacillus sanfranciscensis)、沙氏乳杆菌(Lactobacillus sharpeae)、苏氏乳杆菌(Lactobacillus suebicus)、发状乳杆菌(Lactobacillus trichodes)、龈乳杆菌(Lactobacillus uli)、牛痘乳杆菌
(Lactobacillus vaccinostercus)、阴道乳杆菌(Lactobacillus vaginalis)、绿色乳杆菌(Lactobacillus viridescens)、小牛乳杆菌(Lactobacillus vitulinus)、木糖乳杆菌(Lactobacillus xylosus)、山梨氏乳杆菌(Lactobacillus yamanashiensis)、山梨氏乳杆菌马里亚种(Lactobacillus yamanashiensis subsp.Mali)、山梨氏乳杆菌山梨亚种(Lactobacillus yamanashiensis subsp.Yamanashiensis)、玉米乳杆菌(Lactobacillus zeae)、青春双岐杆菌(Bifidobacterium adolescentis)、角双歧杆菌(Bifidobacterium angulatum)、两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、链状双歧杆菌(Bifidobacterium catenulatum)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)和婴儿双岐杆菌(Bifidobacterium infantis)。在一些例子中，LAB是乳酸乳球菌(LL)。
crispatus)、弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)、弯曲乳杆菌弯曲亚种
(Lactobacillus curvatus subsp.curvatus)、弯曲乳杆菌蜜二糖亚种(Lactobacillus curvatus subsp.melibiosus)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)、德氏乳杆菌德氏亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.delbrueckii)、德氏乳杆菌乳酸亚种
(Lactobacillus delbrueckii subsp.lactis)、:广布乳杆菌(Lactobacillus
divergens)、香肠乳杆菌(Lactobacillus farciminis)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、穹隆乳杆菌(Lactobacillus fornicalis)、食果糖乳杆菌(Lactobacillus fructivorans)、果糖乳杆菌(Lactobacillus fructosus)、鹑鸡乳杆菌(Lactobacillus gallinarum)、加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、禾谷乳杆菌(Lactobacillus graminis)、耐盐乳杆菌(Lactobacillus halotolerans)、哈氏乳杆菌(Lactobacillus hamster)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、异型腐酒乳杆菌(Lactobacillus heterohiochii)、希氏乳杆菌(Lactobacillus hilgardii)、麦芽香乳杆菌(Lactobacillus homohiochii)、惰性乳杆菌(Lactobacillus iners)、肠乳杆菌(Lactobacillus
intestinalis)、詹氏乳杆菌(Lactobacillus jensenii)、约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)、坎氏乳杆菌(Lactobacillus kandleri)、开菲尔乳杆菌(Lactobacillus kefiri)、马乳酒样乳杆菌(Lactobacillus kefiranofaciens)、偏性异发酵乳杆菌(Lactobacillus kefirgranum)、昆氏乳杆菌(Lactobacillus kunkeei)、乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis)、莱士曼氏乳酸杆菌(Lactobacillus leichmannii)、林氏乳杆菌(Lactobacillus lindneri)、坏发酵乳杆菌(Lactobacillus malefermentans)、马里乳杆菌(Lactobacillus mali)、马耳他乳杆菌Lactobacillus maltaromicus)、马尼厚乳杆菌(Lactobacillus manihotivorans)、稍小乳杆菌(Lactobacillus minor)、小小乳杆菌(Lactobacillus minutes)、粘膜乳杆菌(Lactobacillus mucosae)、鼠乳杆菌
(Lactobacillus murinus)、纳氏乳杆菌(Lactobacillus nagelii)、口乳杆菌
(Lactobacillus oris)、面包乳杆菌(Lactobacillus panis)、类布氏乳杆菌
(Lactobacillus parabuchneri)、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、副干酪乳杆菌副干酪亚种(Lactobacillus paracasei subsp.paracasei)、副干酪乳杆菌坚韧亚种(Lactobacillus paracasei subsp.tolerans)、类高加索乳杆菌(Lactobacillus parakefiri)、类消化乳杆菌(Lactobacillus paralimentarius)、类植物乳杆菌
(Lactobacillus paraplantarum)、戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)、类食品乳杆菌(Lactobacillus perolens)、栖鱼乳杆菌(Lactobacillus piscicola)、胚牙乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、脑桥乳杆菌(Lactobacillus pontis)、罗伊乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、龈沟乳杆菌(Lactobacillus rimae)、罗氏乳杆菌(Lactobacillus rogosae)、瘤胃乳杆菌
(Lactobacillus ruminis)、米酒乳杆菌(Lactobacillus sakei)、米酒乳杆菌肉花亚种(Lactobacillus sakei subsp.camosus)、米酒乳杆菌米酒亚种(Lactobacillus sakei subsp.sakei)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、唾液乳杆菌水杨素亚种(Lactobacillus salivarius subsp.salicinius)、唾液乳杆菌唾液亚种(Lactobacillus salivarius subsp.salivarius)、旧金山乳杆菌(Lactobacillus sanfranciscensis)、沙氏乳杆菌(Lactobacillus sharpeae)、苏氏乳杆菌(Lactobacillus suebicus)、发状乳杆菌(Lactobacillus trichodes)、龈乳杆菌(Lactobacillus uli)、牛痘乳杆菌
(Lactobacillus vaccinostercus)、阴道乳杆菌(Lactobacillus vaginalis)、绿色乳杆菌(Lactobacillus viridescens)、小牛乳杆菌(Lactobacillus vitulinus)、木糖乳杆菌(Lactobacillus xylosus)、山梨氏乳杆菌(Lactobacillus yamanashiensis)、山梨氏乳杆菌马里亚种(Lactobacillus yamanashiensis subsp.Mali)、山梨氏乳杆菌山梨亚种(Lactobacillus yamanashiensis subsp.Yamanashiensis)、玉米乳杆菌(Lactobacillus zeae)、青春双岐杆菌(Bifidobacterium adolescentis)、角双歧杆菌(Bifidobacterium angulatum)、两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、链状双歧杆菌(Bifidobacterium catenulatum)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)和婴儿双岐杆菌(Bifidobacterium infantis)。在一些例子中，LAB是乳酸乳球菌(LL)。
[0172] 在其它例子中，细菌选自下组：阿尔氏肠球菌(Enterococcus alcedinis)、阿桂氏肠球菌(Enterococcus aquimarinus)、亚洲肠球菌(Enterococcus asini)、鸟肠球菌(Enterococcus avium)、卡氏肠球菌(Enterococcus caccae)、山茶肠球菌(Enterococcus camelliae)、坎氏肠球菌(Enterococcus canintestini)、犬肠球菌(Enterococcus canis)、酪黄肠球菌(Enterococcus casseliflavus)、盲肠肠球菌(Enterococcus cecorum)、鸽肠球菌(Enterococcus columbae)、多样肠球菌(Enterococcus devriesei)、迪埃丝肠球菌(Enterococcus diestrammenae)、殊异肠球菌(Enterococcus dispar)、坚韧肠球菌(Enterococcus durans)、埃肯肠球菌(Enterococcus eurekensis)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、鹑鸡肠球菌(Enterococcus gallinarum)、浅黄肠球菌(Enterococcus gilvus)、溶过氧化肠球菌(Enterococcus haemoperoxidus)、荷曼氏肠球菌(Enterococcus hermanniensis)、海氏肠球菌(Enterococcus hirae)、意大利肠球菌(Enterococcus italicus)、乳酸肠球菌(Enterococcus lactis)、乐玛尼肠球菌(Enterococcus lemanii)、病臭肠球菌
(Enterococcus malodoratus)、莫拉氏肠球菌(Enterococcus moraviensis)、蒙氏肠球菌(Enterococcus mundtii)、Enterococcus olivae、苍白肠球菌(Enterococcus pallens)、铅黄肠球菌(Enterococcus phoeniculicola)、植物肠球菌(Enterococcus plantarum)、假鸟肠球菌(Enterococcus pseudoavium)、魁北克肠球菌(Enterococcus quebecensis)、棉子糖肠球菌(Enterococcus raffinosus)、鼠肠球菌(Enterococcus ratti)、瑞氏肠球菌(Enterococcus rivorum)、罗泰肠球菌(Enterococcus rotai)、解糖肠球菌(Enterococcus saccharolyticus)、西里西亚肠球菌(Enterococcus silesiacus)、孤立肠球菌
(Enterococcus solitaries)、硫磺肠球菌(Enterococcus sulfurous)、特氏肠球菌(Enterococcus termitis)、泰氏肠球菌(Enterococcus thailandicus)、尿肠球菌(Enterococcus ureasiticus)、解尿肠球菌(Enterococcus ureilyticus)、维克肠球菌(Enterococcus viikkiensis)、维洛肠球菌(Enterococcus villorum)、香坊肠球菌(Enterococcus xiangfangensis)。
(Enterococcus malodoratus)、莫拉氏肠球菌(Enterococcus moraviensis)、蒙氏肠球菌(Enterococcus mundtii)、Enterococcus olivae、苍白肠球菌(Enterococcus pallens)、铅黄肠球菌(Enterococcus phoeniculicola)、植物肠球菌(Enterococcus plantarum)、假鸟肠球菌(Enterococcus pseudoavium)、魁北克肠球菌(Enterococcus quebecensis)、棉子糖肠球菌(Enterococcus raffinosus)、鼠肠球菌(Enterococcus ratti)、瑞氏肠球菌(Enterococcus rivorum)、罗泰肠球菌(Enterococcus rotai)、解糖肠球菌(Enterococcus saccharolyticus)、西里西亚肠球菌(Enterococcus silesiacus)、孤立肠球菌
(Enterococcus solitaries)、硫磺肠球菌(Enterococcus sulfurous)、特氏肠球菌(Enterococcus termitis)、泰氏肠球菌(Enterococcus thailandicus)、尿肠球菌(Enterococcus ureasiticus)、解尿肠球菌(Enterococcus ureilyticus)、维克肠球菌(Enterococcus viikkiensis)、维洛肠球菌(Enterococcus villorum)、香坊肠球菌(Enterococcus xiangfangensis)。
[0173] 在其它例子中，细菌选自下组：无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、咽峡炎(Streptococcus anginosus)、牛链球菌(Streptococcus bovis)、犬链球菌(Streptococcus canis)、星座链球菌(Streptococcus constellatus)、停乳链球菌(Streptococcus dysgalactiae)、马蹄足链球菌(Streptococcus equines)、海豚链球菌(Streptococcus iniae)、中间链球菌(Streptococcus intermedius)、米勒链球菌(Streptococcus milleri)、缓症链球菌(Streptococcus mitis)、变异链球菌
(Streptococcus mutans)、口腔链球菌(Streptococcus oralis)、副溶血链球菌
(Streptococcus parasanguinis)、拟链球菌(Streptococcus peroris)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia)、假肺链球菌(Streptococcus pseudopneumoniae)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、鼠伤寒链球菌(Streptococcus ratti)、唾液链球菌(Streptococcus salivarius)、牙龈链球菌(Streptococcus tigurinus)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、血链球菌(Streptococcus sanguinis)、表兄链球菌(Streptococcus sobrinus)、猪链球菌(Streptococcus suis)、乳房链球菌
(Streptococcus uberis)、前庭链球菌(Streptococcus vestibularis)、绿色链球菌(Streptococcus viridians)和兽疫链球菌(Streptococcus zooepidemicus)。
(Streptococcus mutans)、口腔链球菌(Streptococcus oralis)、副溶血链球菌
(Streptococcus parasanguinis)、拟链球菌(Streptococcus peroris)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia)、假肺链球菌(Streptococcus pseudopneumoniae)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、鼠伤寒链球菌(Streptococcus ratti)、唾液链球菌(Streptococcus salivarius)、牙龈链球菌(Streptococcus tigurinus)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、血链球菌(Streptococcus sanguinis)、表兄链球菌(Streptococcus sobrinus)、猪链球菌(Streptococcus suis)、乳房链球菌
(Streptococcus uberis)、前庭链球菌(Streptococcus vestibularis)、绿色链球菌(Streptococcus viridians)和兽疫链球菌(Streptococcus zooepidemicus)。
[0174] 示例性LAB菌株可以是乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)或其任何亚种，包括乳酸乳球菌乳脂亚种(Lactococcus lactis subsp.cremoris)、乳酸乳球菌叶蝉亚种(Lactococcus lactis subsp.hordniae)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)和乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp.lactis)。在另一个方面，LAB菌株可以是生物学上包含的系统，例如无质粒乳酸乳球菌菌株MG1363，其丧失了正常生长和在乳中产酸的能力，参见Gasson,M.J.(1983)J.Bacterid.154:1-9；或苏氨酸-和嘧啶-营养缺陷型衍生物乳酸乳球菌菌株，参见Sorensen等，(2000)Appl.Environ.Microbiol.66:1253-1258；和Glenting等(2002)68:5051-5056。
[0175] 重组细菌宿主-载体系统可以是生物学上包含的系统。生物容纳是本领域技术人员已知的，并且可以通过引入营养缺陷型突变来实现，例如，自杀营养缺陷型突变，例如ThyA突变，或其等同物。或者，生物容纳可以在携带编码IL-2多肽或IL-2变体的基因的质粒水平上实现，例如，通过使用不稳定的附加体构建体，其在几代后丢失。如果需要，几种水平的容纳可以组合，例如质粒不稳定性和营养缺陷型，以确保高水平的容纳。
[0176] 构件体
[0177] 如本文所述，LAB在预期位点即粘膜递送IL-2多肽和T1D特异性抗原。例如，LAB表达IL-2多肽，之后IL-2多肽暴露于细胞表面(如果使用膜结合形式的IL-2)或分泌(如果实验分泌形式的IL-2)。因此，在一个具体实施方式中，LAB(例如乳酸乳球菌)包含能够在细胞内表达IL-2多肽和T1D特异性抗原的表达载体。例如，多肽在指定粘膜(例如在胃肠道中)存在的条件下暴露于细胞表面。LAB可以包含能够在细胞内表达IL-2多肽的表达载体，使得IL-2多肽在细胞表面上暴露到足以在接受者中提供有效治疗T1D的低剂量IL-2的程度。当使用表达更高量的IL-2多肽和T1D特异性抗原的LAB菌株时，可能需要较低频率和较低的LAB剂量来治疗T1D。因此，本领域技术人员可以调节提供的LAB菌株的量以递送所需量的IL-2多肽和T1D特异性抗原。
[0178] 通常，表达系统包括遗传构建体，其包含至少一种编码IL-2多肽和/或TD1特异性抗原多肽的核苷酸序列，通常可操作地连接至能够介导宿主微生物中的序列表达的启动子。适当地，待表达的IL-2多肽和T1D特异性抗原可以由适合宿主的优选密码子使用的核酸序列编码。构建体可以进一步包含(所有)其他合适的元件，包括增强子，转录起始序列，信号序列，报道基因，转录终止序列等，在所选宿主中可操作，如本领域技术人员已知的那样。
[0179] 构建体通常是适于宿主转化的形式和/或可以稳定保持在宿主中的形式，例如载体，质粒或微型染色体。可以选择或构建包含用于引入LAB菌株(例如乳酸乳球菌)的核酸的合适载体，其含有合适的调节序列，包括启动子序列，终止子片段，增强子序列，标记基因和适当的其他序列。载体可以是质粒，病毒，例如噬菌体或噬菌粒，视情况而定。进一步的细节参见例如分子克隆：实验室指南，第二版，Sambrook等，1989，冷泉港实验室出版社。
[0180] 分子生物的简要方案(Short Protocols in Molecular Biology),第二版，Ausubel等编,John Wiley&Sons,1992中详细描述了操作核酸的许多已知技术和方法，例如制备核酸构建物、诱变、测序、将DNA引入细胞和基因表达以及分析蛋白质。在一个实施方式中，IL-2多肽的编码序列可以包含在操纵子中，即用于多顺反子表达的核酸构建体。在操纵子中，来自启动子的转录产生包含一个以上编码序列的mRNA，每个编码序列在其上游具有其自身适当定位的核糖体结合位点。因此，可以从单个mRNA翻译一种以上的多肽。使用操纵子能够协调IL-2多肽和T1D特异性抗原多肽的表达。细菌宿主细胞中的多顺反子表达系统描述于例如美国专利申请号2014/0105863中。
[0181] 为了获得稳定转染的LAB菌株，即编码IL-2多肽和/或T1D特异性抗原基因的基因可以整合到宿主LAB的基因组中。用于建立稳定转染的LAB菌株的技术是本领域已知的。例如，可以通过同源重组将IL-2多肽和/或T1D特异性抗原基因克隆到宿主的基因组中。通常，宿主的必需基因被同源重组事件破坏，例如基因的缺失、导致由必需基因编码的蛋白质的无活性形式的一个或多个氨基酸取代、或导致由必需基因编码的蛋白质的截短形式的移码突变。在一个实施方式中，必需基因是thyA基因。示例性技术描述于WO 02/090551中。转化质粒没有特别限制，只要它不能补充破坏的必需基因，例如thyA基因。质粒可以是自我复制的，通常携带一种或多种感兴趣基团和一种或多种抗性标志物，或质粒是整合质粒。在后一种情况下，整合质粒本身可用于通过在必需基因(例如thyA位点)的基因座处整合来破坏必需基因，因为必需基因(例如thyA位点)的功能被打乱了。通常，必需基因(例如thyA基因)被包含一种或多种感兴趣基因的盒的双重同源重组所取代，侧接靶向必需基因插入的靶序列，例如thyA靶位点。应理解，这些靶序列足够长并且足够同源，使得能够将感兴趣基因整合到靶位点中。
[0182] 因此，编码IL-2多肽和/或T1D特异性抗原的遗传构建体可以在染色体外染色体中存在于宿主细胞中，通常使用自身的复制起点自主复制，或者可以整合到LAB基因组DNA(例如乳球菌染色体)中。在后一种情况下，可以整合核酸的单个或多个拷贝；整合可以发生在染色体的随机位点，或如上所述，在其预定位点，例如乳球菌(例如乳酸乳球菌)的thyA基因座。
[0183] 因此，编码IL-2多肽和/或T1D特异性抗原的遗传构建体可以进一步包含配置成实现将遗传构建体插入宿主LAB细胞的基因组(例如染色体)中的序列。
[0184] 在一个实例中，可以通过同源重组促进遗传构建体插入宿主LAB细胞的基因组(例如染色体)内的特定位点。例如，本文所述的遗传构建体可包含与宿主LAB细胞的基因组(例如染色体)内的所述整合位点同源的一个或多个区域。所述基因组(例如染色体)位点处的序列可以是天然的，即天然存在的序列，或者可以是先前遗传工程引入的外源序列。
[0185] 例如，同源区域可以是至少50bp，100bp，200bp，300bp，400bp，500bp，600bp，700bp，800bp，900bp，1000bp或更多。
[0186] 在一个实例中，可以包括两个同源区域，各自侧接本文所述遗传构建体中存在的相关表达单元。这样的构型可以有利地在宿主细胞中插入相关序列，即至少编码和影响感兴趣抗原表达的序列。进行同源重组(特别是在细菌宿主中)以及选择重组体的方法是本领域公知的。
[0187] LAB菌株的转化方法是本领域技术人员已知的，例如原生质体转化和电穿孔。
[0188] 通过对LAB中存在的表达载体(例如乳酸乳球菌)使用同源表达和/或分泌信号，可以实现高度表达。表达信号对于本领域技术人员而言是显而易见的。可以根据掺入的LAB(例如乳酸乳球菌)优化用于表达的表达载体。例如，已知在乳球菌，乳酸乳杆菌，干酪乳杆菌和植物乳杆菌中提供足够水平表达的特异性表达载体。此外，已知开发用于在非致病性、非定植、非侵入性食品级细菌乳酸乳球菌中表达异源抗原的系统(例如，英国专利GB2278358B)。示例性构建体包含PCT/NL95/00135(WO 96/32487)中描述的多拷贝表达载体，其中已经描述了编码IL-2多肽T1D特异性抗原的核苷酸序列。这种构建体可以适合于以高表达水平在乳酸菌中，特别是在乳杆菌中表达所需抗原，并且还可以有利地用于将表达的产物导向细菌细胞的表面。构建体(例如，PCT/NL95/00135)的特征在于编码IL-2多肽和/或T1D特异性抗原的核酸序列之前是5'非翻译核酸序列，其至少包含核糖体识别和RNA稳定化所需的最小序列。其后可以是翻译起始密码子，其可以接着(紧接)乳酸细菌基因的翻译核酸序列的5'末端部分的至少5个密码子的片段或片段的结构或功能等同物。片段也可以由启动子控制。本公开内容的一个方面提供了一种方法，其允许宿主中异源基因的高水平调节表达和表达与分泌的偶联。在另一个实施方式中，根据WO 93/17117，采用T7噬菌体RNA聚合酶及其同源启动子开发强大的表达系统。在一个实施方式中，表达质粒可以衍生自pT1NX。
[0189] 本文使用的启动子通常在细菌中组成型表达。组成型启动子的使用避免了提供诱导物或其他调节信号以进行表达的需要。通常，启动子将表达介导在细菌宿主细胞保持存活的水平，即保留一些代谢活性，即使不维持生长。然后有利地，这种表达可以处于低水平。例如，当表达产物在细胞内积累时，表达水平可导致表达产物在小于约10％的细胞蛋白质中累积，任选地约或小于约5％，例如约1-3％。启动子可以与所用的细菌同源，即在自然界中在该细菌中发现的细菌。例如，乳球菌启动子可用于乳球菌。用于乳酸乳球菌(或其他乳球菌)的示例性启动子是衍生自乳酸乳球菌的染色体的“P1”(Waterfield NR等，Gene
1995,165(1)：9-15)。启动子的另一个例子是usp45启动子。其他有用的启动子描述于美国专利8,759,088和美国专利申请2014/0105863中。
1995,165(1)：9-15)。启动子的另一个例子是usp45启动子。其他有用的启动子描述于美国专利8,759,088和美国专利申请2014/0105863中。
[0190] 一种或多种核酸构建体可包含分泌信号序列。因此，在一些实施方式中，编码IL-2和/或T1D特异性抗原的核酸可以提供多肽的分泌，例如通过将编码信号序列的核酸序列与编码多肽的核酸序列适当地偶联。携带该核酸的细菌分泌抗原的能力可以在维持生物体活力的培养条件下体外测试。示例性分泌信号序列包括在LAB菌株中具有活性的那些。这些序列可包括芽孢杆菌(Bacillus amyloliquetaciens)的α-淀粉酶分泌前导序列或由一些葡萄球菌菌株分泌的葡萄球菌激酶的分泌前导序列，已知其在革兰氏阳性和革兰氏阴性宿主中起作用(Rapoport,Current Opinion in Biotechnology 1990,1:21-27)，或来自许多其他芽孢杆菌酶或S-层蛋白的前导序列(参见Harwood和Cutting的第341-344页，杆菌的分子生物学方法(Molecular Biological Methods for Bacillus)，John Wiley&Co.1990)。在一个实施方式中，所述分泌信号源自usp45(Van Asseldonk等人(1993)Mol.Gen.Genet.240：428-434)。在一些实施方式中，IL-2多肽或IL-2变体可以组成型分泌。
[0191] IL-2多肽
[0192] IL-2多肽的实例包括膜结合或分泌形式的野生型人IL-2和任何IL-2变体多肽，例如与野生型IL-2或相应的成熟IL-2多肽具有至少约60％，至少约70％，至少约80％，至少约90％，至少约95％或至少约98％的序列相同性的多肽。野生型人IL-2的示例性氨基酸序列由SEQ ID NO：1表示，而示例性IL-2编码核酸序列由SEQ ID NO：2表示。成熟的野生型人IL-
2是由SEQ ID NO：3表示。
2是由SEQ ID NO：3表示。
[0193] IL-2的信号肽(SEQ ID NO：4)标有下划线并代表SEQ ID NO：1的氨基酸1-20。IL-2的信号肽可以被本文所述的细菌分泌信号序列取代(例如，SSusp45)。根据该实施方式的示例性核苷酸序列由SEQ ID NO：5表示。
[0194] 术语“IL-2变体”包括IL-2多肽，其特征在于在天然IL-2多肽链的一个或多个位点处的氨基酸插入，缺失，取代和/或修饰。根据本公开内容，任何此类插入，缺失，取代和修饰都产生IL-2变体多肽，其保留至少一些IL-2RP结合活性。示例性变体包括具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个氨基酸取代的多肽。IL-2变体可以在IL-2的其他位置具有保守修饰和取代(即对变体多肽的二级或三级结构具有最小影响的那些)。这种保守取代包括Dayhoff在《蛋白质序列和结构图册5》(“The Atlas of Protein Sequence and Structure 5)(1978)中描述的那些，以及Argos在EMBO J.，8：779-785(1989)中描述的那些。例如，属于下组之一的氨基酸代表保守变化：组I：ala，pro，gly，gln，asn，ser，thr；组II：cys，ser，tyr，thr；组III：val，ile，leu，met，ala，phe；组IV：lys，arg，his；组V：phe，tyr，trp，his；和组VI：asp，glu。
[0195] 在一些实例中，IL-2是如美国专利号4,518,584中所述的变体，其中通常出现在野生型或天然分子的125位的半胱氨酸已经被中性氨基酸如丝氨酸或丙氨酸取代。或者或结合地，IL-2变体可以是1985年12月17日提交的美国申请06/810,656中描述的变体，其中通常出现在野生型或天然分子的104位的甲硫氨酸已经被替换为中性氨基酸如丙氨酸。在一些实例中，IL-2变体可以在天然IL 2的前五个N-末端氨基酸中的一个或多个具有缺失。还产生IL-2突变蛋白，其对CD122的结合亲和力降低(以实现较低的IL-2毒性)，例如BAY 50-4798(含有IL 2的N88R突变)。
[0196] 可以使用的其他形式的IL-2包括IL-2变体序列，例如在阿地白介素(aldesleukin or proleukin)(普罗米修斯实验室(Prometheus Laboratories))，替西白介素(teceleukin)(罗氏公司(Roche))，生物白细胞介素(bioleukin)(葛兰素公司(Glaxo))中发现的那些，以及Taniguchi等，Nature 1983,302(5906):305-10和Devos等,Nucleic Acids Res.1983,11(13):4307-23；欧洲专利申请91,539和88,195；美国专利4,518,584，美国专利公开2012/0244112；美国专利7,569,215；美国专利5,229,109；美国专利公开2006/
0269515；欧洲专利公开EP 1730184A2；以及PCT公开WO 2005/086751中描述的那些变体。
0269515；欧洲专利公开EP 1730184A2；以及PCT公开WO 2005/086751中描述的那些变体。
[0197] 在一些实施方式中，与野生型IL-2多肽相比，IL-2变体具有降低的与高亲和力IL-2受体结合的能力，但保留变体IL-2对结合中间体亲和力IL-2受体的亲和力。在一些实施方式中，成熟IL-2多肽的特征在于一个、两个或三个氨基酸取代，例如，其中取代的氨基酸残基选自L72，F42和Y45。在一些实施方式中，IL-2变体的特征在于L72的取代，例如，包含选自L72G,L72A,L72S,L72T,L72Q,L72E,L72N,L72D,L72R和L72K的第一氨基酸取代。IL-2变体的特征可在于F42的取代，例如，包含选自F42A,F42G,F42S,F42T,F42Q,F42E,F42N,F42D,F42R和F42K的第二氨基酸取代。在进一步的实施方式中，IL-2变体的特征在于Y45的取代，例如，包含选自Y45A,Y45G,Y45S,Y45T,Y45Q,Y45E,Y45N,Y45D,Y45R和Y45K的第三氨基酸取代。本公开的IL-2变体可以包含上述第一，第二和第三氨基酸取代的任何组合。
[0198] 如本文所述的IL-2变体可以与相应的野生型IL-2具有约75％，约80％，约85％，约90％，约95％，约96％，约97％，约98％或约99％相同，只要IL-2变体多肽保留一些IL-2活性(功能性多肽)。
[0200] 本领域普通技术人员将理解，使用本公开的方法递送至对象的IL-2的最佳量因例如表达IL-2多肽的LAB和遗传构建体而变化，例如，遗传构建体中使用的启动子的强度。通常，LAB的施用量可以等于表达IL-2多肽的特定量，或以产生相应对象中相应IL-2多肽的所需PK概况的量。示例性的每日IL-2多肽剂量为每天约10fg至约100μg活性多肽。其他示例性剂量范围为每天约1pg至约100μg；或每天约1ng至约100μg。
[0201] 上述剂量可以通过每天给对象施用有效量的微生物来实现，其中微生物适于表达4
足够量的IL-2以实现所需的剂量，例如上述那些。分泌IL-2多肽的LAB可以以约10菌落形成单位(cfu)至约1012cfu/天，特别是约106cfu至约1012cfu/天，更特别是约109cfu至约
1012cfu/天的剂量递送。分泌的IL-2多肽的量可以基于cfu确定，例如根据Steidler等，Science 2000；289(5483):1352-1355中描述的方法，或通过使用ELISA。例如，LAB可以每
9
10cfu分泌至少约1ng至约1μg的活性多肽。基于此，技术人员可以计算在其他cfu剂量下分泌的IL-2多肽的范围。
足够量的IL-2以实现所需的剂量，例如上述那些。分泌IL-2多肽的LAB可以以约10菌落形成单位(cfu)至约1012cfu/天，特别是约106cfu至约1012cfu/天，更特别是约109cfu至约
1012cfu/天的剂量递送。分泌的IL-2多肽的量可以基于cfu确定，例如根据Steidler等，Science 2000；289(5483):1352-1355中描述的方法，或通过使用ELISA。例如，LAB可以每
9
10cfu分泌至少约1ng至约1μg的活性多肽。基于此，技术人员可以计算在其他cfu剂量下分泌的IL-2多肽的范围。
[0202] 上述剂量/剂量范围中的每一个可以与本文所述的任何给药方案一起施用。日剂量可以全天以1,2,3,4,5或6份给药。此外，每日剂量可以施用任何天数，在施用期之间具有任意数量的休息期。例如，对象可以以相当于约0.1至约3MIU/天或每隔一天的剂量施用微生物，持续至少约1周，至少约2周，至少约3周，至少约4周，至少约5周，或至少约6周的时间。在一些实例中，对象以相当于约0.1至约5MIU/天，或约0.3至约3MIU，例如持续约5天，约7天或约14天的剂量施用LAB。示例性剂量描述于例如Hartemann等，Lancet Diabetes Endocrinol.2013,1(4):295-305。
[0203] T1D特异性抗原多肽
[0204] 本公开的LAB含有至少一种疾病特异性(即T1D特异性)自身抗原基因，并且可以在足以表达的条件下表达这种基因。示例性T1D特异性自身抗原包括与β细胞破坏过程相关的胰岛抗原。实例包括但不限于：胰岛素原(PINS)，谷氨酸脱羧酶(GAD65)，胰岛素瘤相关蛋白2(IA-2)，胰岛特异性葡萄糖-6-磷酸酶催化亚基相关蛋白(IGRP)和锌转运蛋白(ZnT)8。其他实例包括由β细胞表达的分子，例如嗜铬粒蛋白A，(前原)胰岛淀粉样蛋白多肽(ppIAPP)，外周蛋白和瓜氨酸化葡萄糖调节蛋白(GRP)。
[0205] PINS多肽的实例包括野生型人PINS和与这种野生型人PINS具有至少约60％，至少约70％，至少约80％，至少约90％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，或至少约99％的序列相同性的多肽。野生型人PINS的示例性氨基酸序列由SEQ ID NO：6表示，而示例性PINS编码核酸序列由SEQ ID NO：7表示(参见登录号NM_000207.2中包含的CDS)。
[0206] 另外的示例性PINS核苷酸序列由NCBI登录号AY899304(完整CDS，可选剪接；SEQ ID NO：8)；NM_000207(转录物变体1；SEQ ID NO：9)；NM_001185097(转录物变体2；SEQ ID NO：10)；NM_001185098(转录物变体3；SEQ ID NO：11)；NM_001291897(转录物变体4；SEQ ID NO：12)的编码序列及其部分功能序列表示。示例性PINS氨基酸序列包括由任何一种上述PINS核酸序列编码的那些。
[0207] 可以使用编码SEQ ID NO：6的氨基酸序列的任何核苷酸序列，或编码其至少约20，至少约30，至少约40，至少约50，至少约60，至少约70，至少约80，至少约90，或至少约100个连续氨基酸的任何核苷酸序列，或编码与SEQ ID NO：6具有至少约60％，至少约70％，至少约80％，至少约90％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，或至少约99％的序列相同性的多肽的任何核苷酸序列。
[0208] 另外的PINS多肽描述于例如UniProtKB-P01308和其中的链接中。在一些实例中，PINS多肽由氨基酸残基25-110表示(根据SEQ ID NO：6编号)。
[0209] 示例性GAD(例如，GAD65)多肽包括野生型人GAD65，和与这种野生型GAD65具有至少约60％，至少约70％，至少约80％，至少约90％，至少约95％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，或至少约99％的序列相同性的多肽。野生型人GAD65的示例性氨基酸序列由SEQ ID NO：13表示，而示例性GAD65编码核酸序列由SEQ ID NO：14表示(参见例如登录号M81882.1中包含的CDS)。
[0210] 可以使用编码上述SEQ ID NO：13代表的氨基酸序列的任何核苷酸序列，或编码其至少约100，至少约200，至少约300，至少约400，至少约500个连续氨基酸的任何核苷酸序列，或编码与SEQ ID NO：13具有至少约60％，至少约70％，至少约80％，至少约90％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，或至少约99％的序列相同性的多肽的任何核苷酸序列。
[0211] 其他示例性谷氨酸脱羧酶(例如，GAD65)序列描述于例如UniProtKB-Q05329及其中的链接中。在一些实例中，GAD多肽是修饰的变体，其含有少于约500，少于约400，或少于约300的野生型氨基酸。示例性多肽片段(修剪的GAD65变体)描述于例如Robert等，Benef。Benef.Microbes 2015,6(4):591-601。在一些实例中，修剪的GAD变体由LAB(即乳酸乳球菌)有效表达和分泌。示例性修剪的GAD变体是GAD65370-575(相对于NCBI登录号NP_000809.1的氨基酸编号，即SEQ ID NO：13)。
[0212] 其他示例性GAD核苷酸序列由NCBI登录号M81882(GAD65；SEQ ID NO：15)；M81883(GAD67；SEQ ID NO：16)；NM_000818(GAD2变体1；SEQ ID NO：17)；和NM_001134366(GAD2变体2；SEQ ID NO：18)；和其中包含的开放阅读框(CDS)表示。示例性氨基酸序列包括由登录号M81882，M81883，NM_001134366和NM_000818的上述核苷酸序列编码的序列。
[0213] IA-2多肽的实例包括野生型人IA-2和与这种野生型人IA-2具有至少约60％，至少约70％，至少约80％，至少约90％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，或至少约99％的序列相同性的多肽。野生型人IA-2的示例性氨基酸序列由SEQ ID NO：19表示，而示例性IA-2编码核酸序列由SEQ ID NO：20表示(参见例如登录号NM_002846.3中包含的开放阅读框)。
[0214] 可以使用编码上述SEQ ID NO：19代表的氨基酸序列的任何核苷酸序列，或编码其至少约100，至少约200，至少约300，至少约400，至少约500，至少约600，或至少约800个连续氨基酸的任何核苷酸序列，或编码与SEQ ID NO：19具有至少约60％，至少约70％，至少约80％，至少约90％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，或至少约99％的序列相同性的多肽的任何核苷酸序列。
[0215] 示例性IA-2核苷酸序列由NCBI登录号NM_002846(人IA-2或蛋白酪氨酸磷酸酶，受体N型(PTPRN)，转录变体1；SEQ ID NO：21)；NM_001199763(人IA-2或蛋白酪氨酸磷酸酶，受体型，N(PTPRN)，转录变体2；SEQ ID NO：22)；NM_001199764(人IA-2或蛋白酪氨酸磷酸酶，受体型，N(PTPRN)，转录变体3；SEQ ID NO：23)表示。示例性IA-2氨基酸序列包括由上述核苷酸序列编码的氨基酸序列。
[0216] 其他示例性IA-2序列描述于例如UniProtKB-Q16849和其中的链接中。在一些实例中，IA-2多肽可以是修剪的变体，其含有少于约700，少于约600，少于约500，或少于约400的野生型氨基酸。示例性多肽片段(修剪的GAD65变体)描述于例如Robert等，Benef.Microbes 2015,6(4):591-601。在一些实例中，修剪的IA-2变体可以由LAB(即乳酸乳球菌)有效表达和分泌。在一个实例中，修剪的IA-2变体是IA-2635-979(相对于NCBI登录号NP_002837.1的氨基酸编号；即，SEQ ID NO：19)。
[0217] IGRP多肽的实例包括野生型人IGRP和与这种野生型人IGRP具有至少约60％，至少约70％，至少约80％，至少约90％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，或至少约99％的序列相同性的多肽。野生型人IGRP的示例性氨基酸序列由SEQ ID NO：24表示，而示例性IGRP编码核酸序列由SEQ ID NO：25表示(参见NCBI登录号BC113376.1中包含的开放阅读框)。
[0218] 可以使用编码上述SEQ ID NO：24代表的氨基酸序列的任何核苷酸序列，或编码其至少50，至少100，至少200或至少300个连续氨基酸的任何核苷酸序列，或编码与SEQ ID NO：24具有至少约60％，至少约70％，至少约80％，至少约90％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，或至少约99％的序列相同性的多肽的任何核苷酸序列。
[0219] 其他示例性核苷酸序列由NCBI登录号NM_021176(G6PC2转录物变体1；SEQ ID NO：26)表示；NM_001081686(人葡萄糖-6-磷酸酶，催化，2(G6PC2)转录物变体2；SEQ ID NO：
27)；和NM_001270397(G6PC，转录物变体2；SEQ ID NO：28)表示。示例性IGRP-2氨基酸序列包括由上述核苷酸序列编码的氨基酸序列。
27)；和NM_001270397(G6PC，转录物变体2；SEQ ID NO：28)表示。示例性IGRP-2氨基酸序列包括由上述核苷酸序列编码的氨基酸序列。
[0220] 其他示例性序列描述于例如UniProtKB-Q9NQR9及其中的链接，以及Arden等，Diabetes 1999；48(3):531-542；Martin等,J.Biol.Chem.2001；276(27):25197-207；和Dogra等,Diabetologia 2006；49(5):953-7。在一些实例中，IGRP多肽是修饰的变体，其含有少于约300，少于约200，少于约100，或少于约50的野生型氨基酸。在一些实例中，选择修剪的IGRP变体以由LAB(即乳酸乳球菌)有效表达和分泌。
[0221] ZnT8多肽的实例包括野生型人ZnT8和与这种野生型人ZnT8具有至少约60％，至少约70％，至少约80％，至少约90％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，或至少约99％的序列相同性的多肽。野生型人ZnT8的示例性氨基酸序列由SEQ ID NO：29表示，而示例性ZnT8编码核酸序列由SEQ ID NO：30表示(参见NCBI登录号NM_173851.2中包含的开放阅读框)。
[0222] 可以使用编码上述SEQ ID NO：29代表的氨基酸序列的任何核苷酸序列，或编码其至少50，至少100，至少200，至少300，至少250，至少300个氨基酸的任何核苷酸序列，或编码与SEQ ID NO：29具有至少约60％，至少约70％，至少约80％，至少约90％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，或至少约99％的序列相同性的多肽的任何核苷酸序列。
[0223] 其他示例性ZnT8核苷酸序列由NCBI登录号AY212919.1(人锌转运蛋白8，完整cds；SEQ ID NO：31)；NM_173851.2(人锌转运蛋白8，转录变体1；SEQ ID NO：32)；NM_
001172814.1(人锌转运蛋白8，转录物变体2；SEQ ID NO：33)；NM_001172811.1(人锌转运蛋白8，转录变体3；SEQ ID NO：34)；NM_001172813.1(人锌转运蛋白8，转录变体4；SEQ ID NO：
35)；NM_001172815.2(人锌转运蛋白8，转录变体5；SEQ ID NO：36)及其部分序列表示。示例性ZnT8氨基酸序列包括由上述核苷酸序列编码的氨基酸序列。
001172814.1(人锌转运蛋白8，转录物变体2；SEQ ID NO：33)；NM_001172811.1(人锌转运蛋白8，转录变体3；SEQ ID NO：34)；NM_001172813.1(人锌转运蛋白8，转录变体4；SEQ ID NO：
35)；NM_001172815.2(人锌转运蛋白8，转录变体5；SEQ ID NO：36)及其部分序列表示。示例性ZnT8氨基酸序列包括由上述核苷酸序列编码的氨基酸序列。
[0224] 其他示例性序列描述于例如UniProtKB-Q8IWU4和其中的链接中。在一些实例中，ZnT8多肽是修剪的变体，其含有少于约300，少于约200，或少于约100的野生型氨基酸。在一些实例中，选择修剪的ZnT8变体以由LAB(即乳酸乳球菌)有效表达和分泌。
[0225] ppIAPP多肽的实例包括野生型人ppIAPP和与这种野生型人ppIAPP具有至少约60％，至少约70％，至少约80％，至少约90％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约
98％，或至少约99％的序列相同性的多肽。野生型人ppIAPP的示例性氨基酸序列由SEQ ID NO：37表示，而示例性ppIAPP编码核酸序列由SEQ ID NO：38表示(参见例如NCBI登录号NM_
000415.2中包含的开放阅读框)。
98％，或至少约99％的序列相同性的多肽。野生型人ppIAPP的示例性氨基酸序列由SEQ ID NO：37表示，而示例性ppIAPP编码核酸序列由SEQ ID NO：38表示(参见例如NCBI登录号NM_
000415.2中包含的开放阅读框)。
[0226] 可以使用编码上述SEQ ID NO：37代表的氨基酸序列的任何核苷酸序列，或编码其至少50，至少100，至少200，至少300，至少250，至少300个氨基酸的任何核苷酸序列，或编码与SEQ ID NO：37具有至少约60％，至少约70％，至少约80％，至少约90％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，或至少约99％的序列相同性的多肽的任何核苷酸序列。
[0227] 其他示例性ppIAPP序列描述于例如UniProtKB-P10997和其中的链接中。在一些实例中，ppIAPP多肽可以是修剪的变体，其含有少于约80，少于约60，少于约40，或少于约20的野生型氨基酸。在一些实例中，选择修剪的ppIAPP变体以由LAB菌株(即乳酸乳球菌)有效表达和分泌。
[0228] 外周蛋白多肽的实例包括野生型人外周蛋白和与这种野生型具有至少约60％，至少约70％，至少约80％，至少约90％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，或至少约99％的序列相同性的多肽。野生型人外周蛋白的示例性氨基酸序列由SEQ ID NO：39表示，而示例性外周蛋白编码核酸序列由SEQ ID NO：40表示(参见例如NCBI登录号NM_006262.3中包含的开放阅读框)。
[0229] 可以使用编码上述SEQ ID NO：39代表的氨基酸序列的任何核苷酸序列，或编码其至少约100，至少约200，至少约300或至少约400个连续氨基酸的任何核苷酸序列，或编码与SEQ ID NO：39具有至少约60％，至少约70％，至少约80％，至少约90％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，或至少约99％的序列相同性的多肽的任何核苷酸序列。
[0230] 其他示例性外周蛋白序列描述于例如UniProtKB-P41219和其中的链接中。在一些实例中，外周蛋白多肽是修剪的变体，其含有少于约400，少于约300，少于约200或少于约100的野生型氨基酸。在一些实例中，选择修剪的外周蛋白变体以由LAB(即乳酸乳球菌)有效表达和分泌。
[0231] 其他示例性核苷酸序列由NCBI登录号NM_006262.3(人外周蛋白；PRPH；SEQ ID NO：41)；XM_005269025.1(预测的人外周蛋白，转录物变体X1；SEQ ID NO：42)；XR_944623.1(预测的人外周蛋白，转录物变体X2；SEQ ID NO：43)及其部分序列表示。示例性外周蛋白氨基酸序列包括由上述核苷酸序列编码的氨基酸序列。
[0232] GRP多肽的实例包括野生型人GRP和与这种野生型人GRP具有至少约60％，至少约70％，至少约80％，至少约90％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，或至少约99％的序列相同性的多肽。野生型人GRP的示例性氨基酸序列由SEQ ID NO：44表示，而示例性GRP编码核酸序列由SEQ ID NO：45表示(参见例如NCBI登录号X87949.1中包含的开放阅读框)。
[0233] 可以使用编码上述SEQ ID NO：44代表的氨基酸序列的任何核苷酸序列，或编码其至少约100，至少约200，至少约300，至少约400，至少约500个连续氨基酸的任何核苷酸序列，或编码与SEQ ID NO：44具有至少约60％，至少约70％，至少约80％，至少约90％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，或至少约99％的序列相同性的多肽的任何核苷酸序列。
[0234] 其他示例性GRP序列描述于例如UniProtKB-P11021和其中的链接中。在一些实例中，GRP多肽是修剪的变体，其含有少于约500，少于约400，少于约300，或少于约200的野生型氨基酸。在一些实例中，选择修剪的GRP变体以由LAB菌株(即乳酸乳球菌)有效表达和分泌。
[0235] 本领域普通技术人员将理解，使用本公开内容的方法递送至对象的最佳自身抗原量例如随抗原类型，表达抗原的微生物和遗传构建体而变化，例如，遗传构建体中使用的启动子的强度。通常，微生物的施用量等于表达抗原的特定量，或产生相应对象中各抗原多肽的所需PK概况的量。示例性的每日抗原剂量为每天约10fg至约100μg活性多肽。其他示例性剂量范围可以是每天约1pg至约100μg；或每天约1ng至约100μg。
[0236] 上述抗原剂量可以通过每天给对象施用有效量的LAB来实现，其中LAB适于表达足够量的活性多肽以实现所需的剂量，例如上述那些。分泌抗原多肽的LAB可以以约104菌落形成单位(cfu)至约1012cfu/天，例如约106cfu至约1012cfu/天，或者约109cfu至约1012cfu/天的剂量递送。
[0237] 分泌抗原多肽的量可以基于cfu确定，例如根据Steidler等，Science 2000；289(5483):1352-1355中描述的方法，或通过使用ELISA。例如，LAB可以每109cfu分泌至少约1ng至约1μg的活性多肽。基于此，技术人员可以计算在其他cfu剂量下分泌的抗原多肽的范围。
[0238] 上述剂量/剂量范围中的每一个可以与本文所述的任何给药方案一起施用。活性多肽的日剂量可以全天以1、2、3、4、5或6份给药。此外，每日剂量可以施用任何天数，在施用期之间具有任意数量的休息期。例如，可以每隔一天施用约0.1至约3.0M IU/天/对象的剂量，总共6周。
[0239] 制剂和方案
[0240] 在本文所述方法中，IL-2和T1D可以由相同或不同的LAB表达。当两种多肽由不同的微生物表达时，它们可以以相同(例如，组合)的制剂施用于对象，或者可以以分开的(例如，不同的)制剂施用。可以在相同时间或在不同时间点施用单独的制剂。例如，在它们各自的制剂中产生IL-2和T1D特异性抗原的微生物可以同时给予对象，或者可以顺序给予，例如在给药之间休息一段时间。
[0241] 产生IL-2和T1D特异性抗原的LAB菌株可以同时给予。在一些实例中，产生IL-2的微生物和产生T1D特异性抗原的微生物可以包含在相同的药物制剂中，或者包含在同时服用的一种以上的药物制剂中。在示例性实施方式中，使用产生IL-2和T1D特异性抗原的单一LAB菌株将两种生物活性多肽递送至对象。
[0242] 在一些实施方式中，本文所述的组合物将每天施用一次，两次，三次，四次，五次或六次，例如使用口服制剂。在一些实施方式中，LAB菌株每天，每隔一天，每周一次，每周两次，每周三次或每周四次施用。在其他实施方式中，治疗每两周进行一次。在其他实施方式中，治疗每三周进行一次。在其他实施方式中，治疗每月发生一次。
[0243] 该方法的治疗周期的持续时间可以是例如7天至对象的一生，如治疗或逆转T1D，或防止复发所需。治疗周期可持续约30天至约2年。在其他实施方式中，对象可具有持续30天至1.5年的治疗周期。在其他实施方式中，对象可具有持续30天至1年的治疗周期。在其他实施方式中，对象可具有持续30天至11个月的治疗周期。在其他实施方式中，对象可具有持续30天至10个月的治疗周期。在其他实施方式中，对象可具有持续30天至9个月的治疗周期。对象可具有持续30天至8个月的治疗周期。对象可具有持续30天至7个月的治疗周期。对象可具有持续30天至6个月的治疗周期。对象可具有持续30天至5个月的治疗周期。对象可具有持续30天至4个月的治疗周期。对象可具有持续30天至3个月的治疗周期。对象可具有持续30天至2个月的治疗周期。
[0244] 可以在对象中临床需要的时间内给予每日维持剂量，例如从1天到几年(例如持续对象的整个剩余寿命)；例如从大约(2,3或5天，1或2周，或1个月)向上和/或例如最长达大约(5年，1年，6个月，1个月，1周，或3或5天)。通常给予每日维持剂量持续约3至约5天或持续约1周至约1年。然而，任选地每天两次至每两周一次施用单位剂量，直至观察到治疗效果。
[0245] 产生IL-2多肽和抗原多肽的LAB菌株可以单一或组合疗法递送以治疗T1D。在一些实施方式中，本公开的组合物包含另外的治疗活性剂。在一些实施方式中，对象的治疗不涉及其他活性成分，例如，不涉及额外的免疫调节物质，例如抗体(例如抗CD3)。因此，在一些实例中，本公开的药物组合物基本上由如本文所述的LAB(表达治疗性IL-2和抗原多肽)和药学上可接受的载体组成。
[0246] 药物组合物和载体
[0247] 本文所述的LAB菌株(例如乳酸乳球菌)可以以纯的形式，与其他活性成分组合，和/或与药学上可接受的(即，无毒的)赋形剂或载体组合施用。术语“药学上可接受的”在本文中根据其本领域公认的含义使用，并且是指与药物组合物的其他成分相容并且对其接受者无害的载体。
[0248] 本文所述的组合物可以任何已知的或有效的剂量或产品形式制备，适用于提供LAB菌株(例如乳酸乳球菌)向粘膜的全身递送，其包括药物组合物和剂型以及营养产品形式。
[0249] 在一些实施方式中，制剂是口服制剂或药物组合物。在根据该实施方式的一些实例中，制剂或药物组合物包含干粉形式(例如，冷冻干燥形式)的LAB菌株或其压实形式，任选地与其他干燥载体组合。口服制剂通常包括惰性稀释剂载体或可食用载体。
[0250] 在一些实例中，口服制剂包含包衣或利用包封策略，其促进制剂递送到肠道中，和/或允许微生物在肠道(例如，回肠，小肠，或结肠)中释放和水合。一旦LAB从制剂中释放并充分水合，它就开始表达生物活性多肽，其随后释放到周围环境中，或在微生物表面上表达。这种包衣和包封策略(即延迟释放策略)是本领域技术人员已知的。参见例如U.S.5,972,685；WO 2000/18377；和WO 2000/22909。
[0251] 提供了一种药物组合物，其可包含冻干或冷冻干燥形式的LAB菌株，任选地结合其他组分如葡聚糖，谷氨酸钠和多元醇。示例性的冷冻干燥的组合物描述于例如美国专利公开2012/0039853。示例性制剂包含冷冻干燥的细菌(例如，治疗有效量的细菌)和药学上可接受的载体。冷冻干燥的细菌可以以胶囊，片剂，颗粒和粉末的形式制备，每种细菌可以口服给药。或者，可以在合适的培养基中将冷冻干燥的细菌制备成含水悬浮液，或者可以在使用前将冻干的细菌悬浮在合适的培养基例如饮品中。
[0252] 对于口服给药，制剂可以是胃耐受的口服剂型。例如，口服剂型(例如，胶囊，片剂，丸剂，微丸，颗粒等)用抵抗在胃中溶解或破坏但不抵抗在肠中溶解或破坏的赋形剂薄层(通常是聚合物，纤维素衍生物和/或亲脂性物质)包衣，从而允许转移通过胃，有利于在肠(例如，小肠或结肠)中崩解、溶解和吸收。
[0253] 在一些实例中，口服制剂可包括提供微生物的受控释放，持续释放或延长释放的化合物，从而提供其中编码的所需蛋白质的受控释放。这些剂型(例如片剂或胶囊剂)通常含有常规和众所周知的赋形剂，例如亲脂性、聚合性、纤维素、不溶性和可溶胀的赋形剂。控释制剂也可用于任何其他递送部位，包括肠，结肠，生物粘附或舌下递送(即牙粘膜递送)和支气管递送。当本文所述的组合物直肠或阴道给药时，药物制剂可包括栓剂和乳膏。在这种情况下，宿主细胞悬浮在也包括脂质的常见赋形剂的混合物中。上述制剂中的每一种都是本领域熟知的，并且例如在以下参考文献中描述：Hansel等，(1990,药物剂型和药物递送系统(PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS),第5版，William和Wilkins)；Chien 1992,新型药物递送系统(NOVEL DRUG DELIVERY SYSTEM),第2版,M.Dekker)；Prescott等，(1989,新型药物递送(NOVEL DRUG DELIVERY),J.Wiley&Sons)；Cazzaniga等,(1994,Int.J.Pharm.108(1):77-83)。
[0254] 本文所述的口服制剂和组合物可进一步包括可增强LAB表达的生物活性多肽的粘膜递送和/或粘膜摄取的化合物。本文所述的制剂/组合物还可包括增强制剂内和/或释放后的微生物活力的化合物。
[0255] 如本文所述的LAB可以悬浮在药物制剂中，用于给予患有待治疗疾病的人或动物。此类药物制剂包括但不限于活的LAB和适于给药的培养基。LAB可以在常见的赋形剂存在下冻干，所述赋形剂例如乳糖，其他糖，碱和/或碱土金属硬脂酸盐，碳酸盐和/或硫酸盐(例如硬脂酸镁，碳酸钠和硫酸钠)，高岭土，二氧化硅，芳香剂和香料。如此冻干的细菌可以以胶囊，片剂，颗粒和粉末(例如漱口水粉末)的形式制备，每种形式可以通过口服途径给药。或者，可以在合适的培养基中将LAB菌株制备为水性悬浮液，或者可以在使用前将冻干的细菌悬浮在合适的培养基中，这种培养基包括本文提及的赋形剂和其他赋形剂，例如葡萄糖、甘氨酸和糖精钠。
[0256] 在一些实例中，使用任何合适的方法将LAB局部递送至对象的胃肠道。例如，可以使用微球递送系统来增强向肠道的递送。微球递送系统包括具有包衣的微粒，所述包衣提供局部释放到对象的胃肠道中(例如，控释制剂，例如肠溶包衣制剂和结肠制剂)。
[0257] 对于口服给药，可以配制胃肠道口服剂型，该剂型还可以包括提供LAB菌株控制释放的化合物，从而在消化的不同点提供其中编码的所需蛋白质(例如IL-2)的控制释放。例如，口服剂型(包括胶囊，片剂，丸剂，颗粒，粉末)可以用抵抗在胃中溶解或破坏但不抵抗在肠中溶解或破坏的赋形剂薄层(例如，聚合物，纤维素衍生物和/或亲脂性物质)包衣，因而允许转移通过胃，有利于在肠中崩解、溶解和吸收。
[0258] 口服剂型可以设计成允许LAB菌株和产生的外源蛋白质的缓慢释放，例如受控释放，持续释放，延长释放，持续作用片剂或胶囊。这些剂型通常含有常规和众所周知的赋形剂，例如亲脂性、聚合性、纤维素、不溶性和可溶胀的赋形剂。此类制剂例如在下列参考文献中描述：Hansel等，药物剂型和药物递送系统(PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS),第5版,William和Wilkins,1990；Chien 1992,新型药物递送系统(NOVEL DRUG DELIVERY SYSTEM),第2版,M.Dekker；Prescott等，新型药物递送(NOVEL DRUG DELIVERY),J.Wiley&Sons,1989；和Cazzaniga等，Int.J.Pharm.108(1):77-83(1994)。
[0259] 药物剂型(例如胶囊)通常用pH依赖性Eudragit聚合物包衣以获得胃液抗性和在回肠末端和结肠处的预期递送，其中聚合物在pH6.5溶解。通过使用其他 聚合物或聚合物之间的不同比例，可以调节延迟释放曲线，以释放细菌，例如在十二指肠或空肠中。
[0260] 药物组合物通常含有至少一种药学上可接受的载体。合适的赋形剂、稀释剂和载体的非限制性实例包括：防腐剂，无机盐，酸，碱，缓冲剂，营养素，维生素，填充剂和增量剂，例如淀粉，糖，甘露糖醇和硅酸衍生物；粘合剂如羧甲基纤维素和其它纤维素衍生物，藻酸盐，明胶和聚乙烯吡咯烷酮；保湿剂如甘油/崩解剂如碳酸钙和碳酸氢钠；用于延缓溶解的试剂，如石蜡；再吸收促进剂，如季铵化合物；表面活性剂如乙酰醇，甘油单硬脂酸酯；吸附载体如高岭土和膨润土；载体如丙二醇和乙醇，和润滑剂如滑石，硬脂酸钙和硬脂酸镁，以及固体聚乙二醇。
[0261] 药学上可相容的结合剂和/或佐剂物质可作为组合物的一部分包含在内。片剂、丸剂、胶囊、含片等可含有任何以下成分或具有相似特性的化合物：粘合剂例如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂例如淀粉或乳糖，分散剂例如海藻酸、羧甲基淀粉(Primogel)或玉米淀粉；润滑剂例如硬脂酸镁；助流剂例如二氧化硅胶体；甜味剂例如蔗糖或糖精；或调味剂例如薄荷、水杨酸甲酯、橙调味剂。当剂量单位形式是胶囊时，除了上述类型的材料以外，它可以包含液体运载体(如脂肪油)。此外，剂量单位形式可含有多种其他材料，其修饰剂量单位的物理形式，例如糖、虫胶和其他肠溶试剂的包衣。此外，除活性化合物之外，糖浆剂还可含有作为调味剂的蔗糖和其他防腐剂、染料和着色剂和调味剂。应理解，药学上可接受的载体的形式和特征取决于与其组合的活性成分的量、给药途径和其它众所周知的变量。所述载体必须是“可接受的”，这意味着它与该制剂的其它成分相容，并且对接受者无害。
[0262] 用于给药的替代制剂包括无菌水溶液或非水溶液，悬浮液和乳液。非水性溶剂的示例是二甲基亚砜、醇、丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油，和可注射有机酯如油酸乙酯。含水载体包括醇和水的混合物，缓冲介质和盐水。静脉内载剂包括液体和营养补充剂、电解质补充剂，例如基于林格右旋糖的那些物质等。也可存在防腐剂和其它添加剂，例如，抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。这些递送方法可以有各种液体制剂，包括盐水，醇，DMSO和水基溶液。
[0263] 口服含水制剂包括赋形剂，例如药物级甘露醇，乳糖，淀粉，硬脂酸镁，糖精钠，纤维素，碳酸镁和/或类似物。这些组合物采取溶液形式，例如漱口水，还包含含水载体，例如水，醇/水溶液，盐水溶液，肠胃外载剂如氯化钠，林氏葡萄糖等。
[0264] 水性漱口水制剂是本领域技术人员熟知的。关于漱口水和口腔冲洗剂的制剂详见以下文献，例如美国专利6,387,352,美国专利6,348,187,美国专利6,171,611,美国专利6,165,494,美国专利6,117,417,美国专利5,993,785,美国专利5,695,746,美国专利5,470,
561,美国专利4,919,918,美国专利申请2004/0076590,美国专利申请2003/0152530和美国专利申请2002/0044910。
561,美国专利4,919,918,美国专利申请2004/0076590,美国专利申请2003/0152530和美国专利申请2002/0044910。
[0265] 其他添加剂可以存在于本公开的制剂中，例如调味剂，甜味剂或着色剂，或防腐剂。薄荷，例如来自薄荷或留兰香，肉桂，桉树，柑橘，决明子，茴香和薄荷醇，是合适的调味剂的实例。调味剂任选地以0至3％的量存在于口腔组合物中；在液体组合物的情况下，任选地至多2％，例如至多0.5％，任选地约0.2％。
[0266] 甜味剂包括人造或天然甜味剂，例如糖精钠，蔗糖，葡萄糖，糖精，右旋糖，左旋糖，乳糖，甘露醇，山梨糖醇，果糖，麦芽糖，木糖醇，奇异果甜蛋白，阿斯巴甜，D-色氨酸，二氢查尔酮，乙酰磺胺酸及其任意组合，可以以口腔组合物的0至2％，任选至多1％w/w，例如0.05至0.3％w/w的量存在。
[0267] 着色剂是合适的天然或合成颜色，例如二氧化钛或CI 42090，或其混合物。着色剂在组合物中的含量可以为0-3％；在液体组合物的情况下，任选地至多0.1％，例如至多0.05％，任选地约0.005-0.0005％。在常用的防腐剂中，苯甲酸钠通常以基本上不足以改变组合物pH的浓度使用，否则可能需要调节缓冲剂的量以达到所需的pH。
[0268] 其他任选成分包括保湿剂，表面活性剂(非离子，阳离子或两性)，增稠剂，树胶和粘合剂。保湿剂增加制剂体积并在洁齿剂组合物中保留水分。此外，保湿剂有助于防止制剂储存期间的微生物变质。它还有助于保持相稳定性，并提供配制透明或半透明洁齿剂的方法。
[0269] 合适的保湿剂包括甘油，木糖醇，甘油和二醇如丙二醇，其各自可以以最高达50％w/w的量存在，但总的保湿剂不超过约60-80％w/w的组合物。例如，液体组合物可包含至多约30％的甘油加至多约5％，任选约2％w/w的木糖醇。表面活性剂可以不是阴离子的，并且可以包括聚山梨醇酯20或椰油酰胺基甜菜碱等，用量最高达组合物的约6％，任选约1.5-3％w/w。
[0270] 当如本文所述的口腔组合物为液体形式时，所述组合物通常可包含占口腔组合物至多约3％w/w的成膜剂，例如在0至0.1％的范围内，任选占口腔组合物约0.001-0.01％，例如约0.005％w/w。合适的成膜剂包括(除透明质酸钠外)以商品名GantrezTM销售的那些。
[0271] 用于口服或肠内给药的液体营养制剂可包含一种或多种营养素，例如脂肪，碳水化合物，蛋白质，维生素和矿物质。许多不同来源和类型的碳水化合物，脂质，蛋白质，矿物质和维生素是已知的并且可以用于本文所述的营养液实施方式中，只要这些营养素与所选制剂中的添加成分相容，对于它们的指定用途是安全有效的，不得以其他方式过度损害产品性能。
[0272] 这些营养液通常配制成具有足够的粘度，流动或其他物理或化学特性，以在饮用或施用营养液时提供更有效和舒缓的粘膜涂层。这些营养实施方式还可以代表适合于满足个体的唯一，主要或补充营养需求的平衡营养源。合适的营养液的非限制性实例描述于例如美国专利5,700,782；美国专利5,869,118；和美国专利5,223,285。
[0273] 适用于本文的营养蛋白质可以是水解的，部分水解的或非水解的，并且可以衍生自任何已知的或其他合适的来源，例如牛奶(例如酪蛋白，乳清)，动物(例如肉，鱼)，谷类(例如，大米，玉米)，蔬菜(例如大豆)或其组合。
[0274] 适用于营养液的脂肪或脂质包括但不限于椰子油，大豆油，玉米油，橄榄油，红花油，高油酸红花油，MCT油(中链甘油三酯)，葵花籽油，高油酸葵花籽油，结构化甘油三酯，棕榈和棕榈仁油，棕榈油精，菜籽油，海洋油，棉籽油及其组合。适用于营养液的碳水化合物可以是简单的或复合的，含乳糖的或不含乳糖的，或其组合。合适的碳水化合物的非限制性实例包括：水解玉米淀粉，麦芽糖糊精，葡萄糖聚合物，蔗糖，玉米糖浆，玉米糖浆固体，稻衍生的碳水化合物，葡萄糖，果糖，乳糖，高果糖玉米糖浆和难消化的低聚糖如低聚果糖(FOS)及其组合。
[0275] 如本文所述的营养液可进一步包含多种维生素中的任何一种，其非限制性实例包括：维生素A，维生素D，维生素E，维生素K，硫胺素，核黄素，吡哆醇，维生素B12，烟酸，叶酸，泛酸。酸，生物素，维生素C，胆碱，肌醇，其盐和衍生物，以及它们的组合。
[0277] 本文所述的LAB菌株还可以配制成酏剂或溶液以便于口服或直肠给药，或者配制成适合肠胃外给药的溶液，例如通过肌肉内，皮下或静脉内途径。另外，核苷衍生物也非常适合作为持续或延长释放剂型的制剂，包括在肠道的特定部分仅释放或任选地释放活性成分的剂型，任选地在延伸或延长的时间段内进一步提高效率。这种剂型中的包衣，包膜和保护基质可以由例如制药领域熟知的聚合物质或蜡制成。
[0278] 如本文所述的组合物可包括药物剂型，例如锭剂，药片(troches)或软锭剂。这些通常是盘状固体，在适当调味的基质中含有活性成分。基质可以是硬糖，甘油明胶，或具有足够粘液以使其形成的糖的组合。可将药片置于口腔中，它们缓慢溶解，释放活性成分用于与粘膜直接接触。
[0279] 例如，可以通过将水缓慢加入粉末状活性粉末，粉末状糖和树胶的混合物中直至形成柔韧物质来制备药片。7％的金合欢粉末可用于为物质提供足够的粘合性。将块状物展开并从扁平物料上切下锭块，或者将块体卷成圆筒并分开。将每个切割或分开的片成形并使其干燥，从而形成药片剂型。
[0280] 如果活性成分是热不稳定的，可以通过压缩将其制成锭剂。例如，制备中的造粒步骤以与用于任何压缩片剂的方式类似的方式进行。使用重压缩设备制备锭剂以得到比平时更硬的片剂，因为期望剂型在口中缓慢溶解或崩解。通常选择成分以促进缓慢溶解特性。
[0281] 在示例性制剂中，LAB菌株可以掺入含有预胶化淀粉和交联聚(丙烯酸)的生物粘附载体中以形成生物粘附片剂和适于口腔施用的生物粘附凝胶(即，具有延长的生物粘附和持续的药物递送)。
[0282] LAB菌株，生物粘附聚合物(预胶化淀粉和通过喷雾干燥共加工的交联聚(丙烯酸))，硬脂酰富马酸钠(润滑剂)和二氧化硅(助流剂)的粉末混合物可以加工成片剂(重量：100mg；直径：7毫米)。制备这些片剂的方法是本领域技术人员熟知的，并且之前已经描述了成功开发含有各种药物(咪康唑，睾酮，氟化物，环丙沙星)的生物粘附片剂(Bruschi M.L.和de Freitas O.,药物开发和工业药学(Drug Development and Industrial Pharmacy),
2005 31:293-310)。
2005 31:293-310)。
[0283] 为了优化配方，可以改变片剂中的药物负荷和淀粉与聚(丙烯酸)之间的比例。基于先前的研究，共处理的生物粘附载体中的最大药物载量为约60％(w/w)，淀粉/聚(丙烯酸)比率可在75/25和95/5之间变化(w/w))。在优化研究期间，片剂的生物粘附性质和片剂中的药物释放是主要评价参数，标准片剂性质(硬度，脆性)作为次要评价标准。
[0284] LAB菌株可以掺入预胶化淀粉和交联聚(丙烯酸)的水分散体中。使用高剪切混合器通过标准程序制备该聚合物分散体。
[0285] 与片剂类似，可能需要优化凝胶的药物负荷和淀粉/聚(丙烯酸)比例，以获得对食道粘膜具有最佳粘附性的凝胶。对于凝胶，分散体中聚合物的浓度是另外的变量，因为它决定了凝胶的粘度，因此它具有粘膜粘附性能。
[0286] Batchelor等已详细描述了筛选聚合物分散体对食道粘膜的生物粘附性质的模型(Int.J.Pharm.,238:123-32,2002)。
[0287] 其他途径和给药形式包括含有活LAB菌株的食品制剂。在一些实例中，表达生物活性多肽的LAB菌株可包含在乳制品中。
[0288] 本文所述的药物组合物可以通过任何已知的或有效的方法制备，以配制或制造所选择的剂型。例如，LAB菌株可以与常见的，例如药学上可接受的载体(例如赋形剂和稀释剂)一起配制，形成口服片剂，胶囊，喷雾剂，锭剂，处理过的基质(例如用本文所述组合物处理过的口服或局部拭子，垫，或一次性不可消化的基质)；口服液体(例如悬浮液，溶液，乳液)，粉末，栓剂或任何其它合适的剂型。在一些实施方式中，本公开提供了制备药物组合物的方法。示例性方法包括：使含有IL-2基因和T1D特异性抗原基因(或能够表达IL-2和T1D特异性抗原)的LAB菌株(例如，乳酸乳球菌)与药学上可接受的载体接触，从而形成药物组合物。在一些实例中，该方法可以进一步包括：在培养基中培养LAB菌株。该方法可以进一步包括冷冻干燥含有微生物的液体，其中液体任选地包括药学上可接受的载体。
[0289] 单位剂型
[0290] 本公开内容进一步提供包含一定量LAB菌株的单位剂型，其任选地与食品级或药学上可接受的载体组合，其中LAB菌株包含：白细胞介素-2(IL-2)基因；和1型糖尿病(T1D)特异性抗原基因。示例性的单位剂型包含约1×103至约1×1014菌落形成单位(cfu)的LAB(例如乳酸乳球菌)。其它示例性的单位剂型包含约1×104至约1×1013菌落形成单位(cfu)的LAB(例如乳酸乳球菌)，或约1×104至约1×1012菌落形成单位(cfu)的LAB(例如乳酸乳球菌)。在其它实施方式中，单位剂型包含约1×105至约1×1012菌落形成单位(cfu)，约1×106至约1×1012菌落形成单位(cfu)的LAB(例如乳酸乳球菌)。在其它实施方式中，单位剂型包含约1×108至约1×1012菌落形成单位(cfu)，约1×109至约1×1012菌落形成单位(cfu)的LAB(例如乳酸乳球菌)。在其它实施方式中，单位剂型包含约1×108至约1×1011菌落形成单9 10
位(cfu)，约1×10至约1×10 菌落形成单位(cfu)的LAB(例如乳酸乳球菌)。在其它实施方式中，单位剂型包含约1×107至约1×1011菌落形成单位(cfu)，约1×108至约1×1010菌落形成单位(cfu)的LAB(例如乳酸乳球菌)。
位(cfu)，约1×10至约1×10 菌落形成单位(cfu)的LAB(例如乳酸乳球菌)。在其它实施方式中，单位剂型包含约1×107至约1×1011菌落形成单位(cfu)，约1×108至约1×1010菌落形成单位(cfu)的LAB(例如乳酸乳球菌)。
[0291] 在其它实施方式中，单位剂型包含约1×109至约1×1010菌落形成单位(cfu)，约19 9
×10至约100×10菌落形成单位(cfu)的LAB(例如乳酸乳球菌)。
×10至约100×10菌落形成单位(cfu)的LAB(例如乳酸乳球菌)。
[0292] 单位剂型可具有任何物理形式或形状。在一些实施方式中，单位剂型可适于口服给药。在根据这些实施方式的一些实例中，单位剂型可以是胶囊，片剂或颗粒的形式。示例性胶囊包括填充有微粒的胶囊。在一些实施方式中，剂型中含有的LAB(例如乳酸乳球菌)是干粉形式。例如，LAB是冷冻干燥的粉末形式，其任选地被压实和涂覆。
[0293] 实施例
[0295] 实施例1.构建乳酸乳球菌分泌hIL-2(LL-IL-2)
[0296] 相对于乳酸乳球菌MG1363(亲本菌株)构建能够分泌IL-2(LL-IL-2)的乳酸乳球菌菌株。参见，例如Gasson MJ,J.Bacteriol.1983,154(1):1-9。在LL-IL-2中，将以下修饰引入细菌基因组中：
[0297] (a)除去胸苷酸合成酶基因(thyA；基因ID：4798358；位置：NC_009004.1(930251..931090))以确定环境容纳。
[0298] (b)除去海藻糖-6-磷酸磷酸化酶基因(trePP；基因ID：4797140；位置：NC_009004.1(449195..451504))以允许外源海藻糖的积累。
[0299] (c)海藻糖-6-磷酸磷酸酶(otsB；基因ID：1036914；基因座标签c2311)位于未鉴定的分泌的45-kDa蛋白基因(usp45；基因ID：4797218；位置：NC_009004.1(2462440..2463825)，互补))的下游以促进海藻糖-6-磷酸转化为海藻糖。
[0300] (d)加入HU样DNA结合蛋白基因(PhllA；基因ID：4797353；位置：NC_009004.1(490275..490550))的组成型启动子，先于海藻糖操纵子中推定的磷酸转移酶基因(trePTS；ptsI和ptsII；LLMG_RS02300和LLMG_RS02305；基因ID：4797778；位置：NC_009004.1(446937..447422)和基因ID：4797093；位置：NC_009004.1(447563..449128)，分别)以增强海藻糖摄取。
[0301] (e)删除编码纤维二糖特异性PTS系统IIC组分的基因(基因ID：4796893；位置：NC_009004.1(430271..431608))，ptcC，以增加海藻糖保留。
[0302] (f)编码usp45分泌前导序列(Ssusp45)与hIL-2基因的融合，编码人白细胞介素-2(hIL-2；UniProt：P60568，aa 21-153)的基因，位于磷酸丙酮酸水合酶基因(eno；基因ID：4797432；位置：NC_009004.1(606184..607485))的下游，以允许hIL-2的表达和分泌。通过使用高表达的乳酸乳球菌MG136350S核糖体蛋白L30基因之前的基因间区域(rpmD；基因ID：
4797873；位置：NC_009004.1(2316732..2316911)，互补))，hIl-2表达单元转录和翻译偶联于eno。编码通过rpmD连接的enoA下游的Ssusp45和hIL-2的上述融合的示例性核苷酸序列描绘于图1中(SEQ ID NO：46)。
4797873；位置：NC_009004.1(2316732..2316911)，互补))，hIl-2表达单元转录和翻译偶联于eno。编码通过rpmD连接的enoA下游的Ssusp45和hIL-2的上述融合的示例性核苷酸序列描绘于图1中(SEQ ID NO：46)。
[0303] 图2提供了上述遗传基因座的示意图。
[0304] 该实验还涉及具有与LL-IL-2相当的遗传性状的对照菌株(LL-对照)，不同之处在于对照菌株不含有用于表达IL-2的构建体。LL-IL-2和LL-对照菌株的遗传性状总结于下表1中。
[0305] 表1.各种LL菌株的遗传特征的概述
[0306]
[0307] 参见表1，trePTS表达(在海藻糖操纵子处)可以与野生型(wt)一样或由hllA启动子(PhllA>>PTS)驱动；trePP可以是wt或删除(Δ)；ptcC可以是wt或Δ；otsB可以不存在(-)或位于usp45(usp45>>otsB)的下游并由其表达；thyA可以是wt或Δ；eno基因座可以是wt(-)或含有hIL-2。与LL-PINS/IL-2相比，所有gapB基因座都是wt，其携带如下文所述的gapB>>pins。
[0308] 使用这些遗传性状的5'和3'末端的双同源重组进行遗传修饰。已经描述了用于构建乳酸乳球菌Thy12的类似方法(参见例如Steidler L.等,Nat.Biotechnol.2003,21(7):785-789)，不同之处在于不施用辅助质粒pVE6007。该方法涉及红霉素选择作为中间步骤，随后除去红霉素选择标志物。结果，LL-IL-2基本上没有残留的红霉素抗性。
[0309] 载体质粒
[0310] 该修饰方法利用源自条件性非复制型pORI19的载体质粒。参见例如Law J.等,J.Bacteriol.1995；177(24):7011-7018。这种复制蛋白A基因缺陷(repA)-质粒，作为其所有repA-衍生物，不能在repA-乳酸乳球菌中复制。使用repA+乳酸乳球菌菌株LL108(参见Sanders等，J.Bacteriol.1995,177(18)：5254-5260)作为构建宿主。设计载体质粒，使得与细菌染色体上野生型序列侧接区域相同的最高达1kb交叉(XO)区域位于质粒携带修饰的5'和3'。使用示例性质粒以这样的方式在eno下游插入hIL-2，使得两者通过rpmD基因间区域偶联。通过使用标准分子生物学方法进行所有质粒构建。
[0311] 染色体修饰
[0312] 质粒pORI19的衍生物携带红霉素选择标志物(ermC，23S RNA甲基化酶基因；基因ID：1263245)，并且不能在MG1363或其任何衍生物中复制。在将这种质粒导入MG1363后，对培养物进行红霉素选择。在含有红霉素的固体琼脂平板上选择抗性菌落。由于载体质粒的复制不能，红霉素抗性细菌只能在5'或3'靶位点的第一次同源重组后出现。可以通过PCR进一步验证同源重组。
[0313] 红霉素选择的释放使得能够通过第二次同源重组在5'或3'靶位点从细菌染色体上切除载体质粒。对于一些红霉素敏感后代，第二次同源重组可以发生在替代第一次同源重组之一的靶位点。该事件用细菌染色体上的突变体取代野生型，并可通过PCR鉴定。适当的传代培养将迅速稀释载体质粒的所有残余物。
[0314] β-载体葡萄糖醛酸酶基因(uidA，基因ID：946149)在载体质粒中的存在，其中它与ermC一起繁殖，使得能够鉴定红霉素敏感性和红霉素抗性菌落。例如，将细菌悬液涂布在含有5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖醛酸(X-Gluc)的固体琼脂平板上。表达葡萄糖醛酸酶(GUS)(因此红霉素抗性)集落通过将X-gluc转化为其不溶的蓝色反应产物二氯二溴靛蓝而呈现蓝色，而红霉素敏感性集落也丧失了uidA基因并因此保持白色。在上述过程的相关阶段鉴定蓝色和白色集落极大地促进了这种方法。
[0315] PCR分析
[0316] 通过PCR分析在3'或5'靶位点显示适当同源重组的集落。使用Qiagen MinElute PCR纯化试剂盒纯化DNA片段。产生的DNA序列与预测的相同。图4显示使用表2中列出的寡核苷酸，Herculase II融合DNA聚合酶(安捷伦科技有限公司(Agilent Technologies)；#600677)和适当的温度循环50/120/30产生的1.2％琼脂糖凝胶。结果证明在LL-IL-2中存在所需的遗传性状。
[0317] 表2.用于构建LL-IL-2的寡核苷酸
[0318] 序列 检测/PCR
SEQ ID NO:47 AATCCAATGACGGCACTTCTTC thyA基因座
SEQ ID NO:48 CTTGTCGTTAAAGCCTATTC thyA基因座
SEQ ID NO:49 CGTAACCATGTAAAAGCACTTCTG otsB
SEQ ID NO:50 GTAATTCTAATGCTGGTGGG otsB
SEQ ID NO:51 ATTACGCCATCTAAATCAAAC trePTS
SEQ ID NO:52 CATCGCTGAAGCTATCATCG eno hil-2基因座
SEQ ID NO:53 GATGGCTGAAGCTCCAACTC trePTS
SEQ ID NO:54 GCATGGAAGAGGACAAAGAG eno hil-2基因座
SEQ ID NO:55 AACCTGTGGGAGGGCGAAAG ptcC基因座
SEQ ID NO:56 TGGGTCGTGAATACTTCC ptcC基因座
SEQ ID NO:47 AATCCAATGACGGCACTTCTTC thyA基因座
SEQ ID NO:48 CTTGTCGTTAAAGCCTATTC thyA基因座
SEQ ID NO:49 CGTAACCATGTAAAAGCACTTCTG otsB
SEQ ID NO:50 GTAATTCTAATGCTGGTGGG otsB
SEQ ID NO:51 ATTACGCCATCTAAATCAAAC trePTS
SEQ ID NO:52 CATCGCTGAAGCTATCATCG eno hil-2基因座
SEQ ID NO:53 GATGGCTGAAGCTCCAACTC trePTS
SEQ ID NO:54 GCATGGAAGAGGACAAAGAG eno hil-2基因座
SEQ ID NO:55 AACCTGTGGGAGGGCGAAAG ptcC基因座
SEQ ID NO:56 TGGGTCGTGAATACTTCC ptcC基因座
[0319] 在图4中，分子量标志物(MWM；英杰公司(Invitrogen)10488-85Trackit 1kb plus DNA梯度)表示碱基对：100,200,300,400,500,650,850,1000,1650,2000,3000,4000,5000和更高。DNA片段的预期大小也以碱基对表示。
[0320] 进一步测序LL-IL-2的细菌基因组。发现LL-IL-2中与亲本菌株MG1363不同的所有遗传性状的实验测定的DNA序列与预期的相同。
[0321] hIL-2的表达
[0322] 使用ELISA和蛋白质印迹测量LL-IL-2对hIL-2的表达。在ELISA实验中(利用R&D系统huIL-2#DY202)，在培养上清液中测量了47.1ng/mL的hIL-2，而对照菌株不产生hIL-2。
[0323] 图5蛋白质印迹，显示在LL-IL-2的培养上清液中存在hIL-2。使用山羊抗人IL-2(1/1000R&D系统AF-202-NA)作为第一抗体，与兔抗山羊-AP(1/1000南方生物技术公司(Southern Biotech)#6160-04)作为检测抗体一起孵育，随后NBT/BCIP染色(Roche NBT/BCIP片剂，#11 697 471 001)，产生Western印迹。将1ml LL-IL-2细菌培养物和对照菌株的等同物上样到蛋白质凝胶上。Invitrogen Plus2预染色标准品用作分子量标志物(MWM)。数据表明LL-IL-2分泌全长hIL-2(即，如SEQ ID NO：46所编码)。
[0324] 细菌在GM17培养基中培养，GM17培养基是补充有0.5％葡萄糖的M17肉汤(Oxoid；#CM0817)或GM17T培养基(补充有200μM胸苷的GM17)。
[0325] 实施例2.乳酸乳球菌分泌PINS和hIL-2(LL-PINS/IL-2)
[0326] 描述了菌株LL-PINS/IL-2(乳酸乳球菌(L.lactis))MG1363的衍生物的构建和选择。LL-PINS/IL-2包括以下遗传性状：(a)除去胸苷酸合成酶基因(thyA；基因ID：4798358；位置：NC_009004.1(930251..931090))以确定环境容纳；(b)除去海藻糖-6-磷酸磷酸化酶基因(trePP；基因ID：4797140；位置：NC_009004.1(449195..451504))以允许外源添加的海藻糖的积累；(c)海藻糖-6-磷酸磷酸酶(otsB；基因ID：1036914；基因座标签c2311)位于未鉴定的分泌的45-kDa蛋白基因(usp45；基因ID：4797218；位置：NC_009004.1
(2462440..2463825)，互补))的下游以促进海藻糖-6-磷酸转化为海藻糖；(d)使用高表达的乳酸乳球菌MG1363 50S核糖体蛋白L30基因之前的基因间区域(rpmD；基因ID：4797873；
位置：NC_009004.1(2316732..2316911)，互补))，otsB表达单元转录和翻译偶联于gapB；
(d)HU样DNA结合蛋白基因(PhllA；基因ID：4797353；位置：NC_009004.1(490275..490550))的组成型启动子先于海藻糖操纵子中推定的磷酸转移酶基因(trePTS；ptsI和ptsII；LLMG_RS02300和LLMG_RS02305；基因ID：4797778；位置：NC_009004.1(446937..447422)和基因ID：4797093；位置：NC_009004.1(447563..449128)，分别)以增强海藻糖摄取；(f)编码纤维二糖特异性PTS系统IIC组分的基因(基因ID：4796893；位置：NC_009004.1
(430271..431608))，ptcC，被破坏(tg在446的密码子位置30；tga30)以确定海藻糖积累后保留；(f)编码usp45分泌前导序列(SSusp45)与编码人胰岛素原的PIN基因(PINS；UniProt：
P01308，aa 25-110)融合的基因位于甘油醛3-磷酸脱氢酶基因(gapB；Gene ID：4797877；位置：NC_009004.1(2492509..2493519，补体))的下游，以允许胰岛素原的表达和分泌；(h)通过使用高表达的乳酸乳球菌MG1363 50S核糖体蛋白L30基因之前的基因间区域(rpmD；基因ID：4797873；位置：NC_009004.1(2316732..2316911)，互补))，pins表达单元转录和翻译偶联于gapB；和(i)编码usp45分泌前导序列(Ssusp45)与hIL-2基因的融合，编码人白细胞介素-2(hIL-2；UniProt：P60568，aa 21-153)的基因，位于磷酸丙酮酸水合酶基因(eno；基因ID：4797432；位置：NC_009004.1(606184..607485))的下游，以允许hIL-2的表达和分泌。通过使用高表达的乳酸乳球菌MG1363 50S核糖体蛋白L30基因之前的基因间区域(rpmD；基因ID：4797873；位置：NC_009004.1(2316732..2316911)，互补))，hIl-2表达单元转录和翻译偶联于eno。
(2462440..2463825)，互补))的下游以促进海藻糖-6-磷酸转化为海藻糖；(d)使用高表达的乳酸乳球菌MG1363 50S核糖体蛋白L30基因之前的基因间区域(rpmD；基因ID：4797873；
位置：NC_009004.1(2316732..2316911)，互补))，otsB表达单元转录和翻译偶联于gapB；
(d)HU样DNA结合蛋白基因(PhllA；基因ID：4797353；位置：NC_009004.1(490275..490550))的组成型启动子先于海藻糖操纵子中推定的磷酸转移酶基因(trePTS；ptsI和ptsII；LLMG_RS02300和LLMG_RS02305；基因ID：4797778；位置：NC_009004.1(446937..447422)和基因ID：4797093；位置：NC_009004.1(447563..449128)，分别)以增强海藻糖摄取；(f)编码纤维二糖特异性PTS系统IIC组分的基因(基因ID：4796893；位置：NC_009004.1
(430271..431608))，ptcC，被破坏(tg在446的密码子位置30；tga30)以确定海藻糖积累后保留；(f)编码usp45分泌前导序列(SSusp45)与编码人胰岛素原的PIN基因(PINS；UniProt：
P01308，aa 25-110)融合的基因位于甘油醛3-磷酸脱氢酶基因(gapB；Gene ID：4797877；位置：NC_009004.1(2492509..2493519，补体))的下游，以允许胰岛素原的表达和分泌；(h)通过使用高表达的乳酸乳球菌MG1363 50S核糖体蛋白L30基因之前的基因间区域(rpmD；基因ID：4797873；位置：NC_009004.1(2316732..2316911)，互补))，pins表达单元转录和翻译偶联于gapB；和(i)编码usp45分泌前导序列(Ssusp45)与hIL-2基因的融合，编码人白细胞介素-2(hIL-2；UniProt：P60568，aa 21-153)的基因，位于磷酸丙酮酸水合酶基因(eno；基因ID：4797432；位置：NC_009004.1(606184..607485))的下游，以允许hIL-2的表达和分泌。通过使用高表达的乳酸乳球菌MG1363 50S核糖体蛋白L30基因之前的基因间区域(rpmD；基因ID：4797873；位置：NC_009004.1(2316732..2316911)，互补))，hIl-2表达单元转录和翻译偶联于eno。
[0327] LL-PINS/IL-2的所有遗传特征都位于细菌染色体上。该菌株的遗传背景保证：PINS和hIL-2的组成型分泌；严格依赖外源性添加胸苷进行生长和存活；以及积累和保留海藻糖以抵抗例如胆汁酸裂解的能力。
[0328] 编码通过基因间区域rpmD连接的gapB基因下游的SSusp45和PINS的上述融合的示例性核苷酸序列描绘于图6中(SEQ ID NO：57)。图7提供了上述遗传基因座的示意图。如实施例1中所述将遗传性状引入细菌基因组中。如上文实施例1中所述培养和分析细菌菌株。用于构建和分析LL-PINS/IL-2的寡核苷酸总结于下表3中。
[0329] 表3.用于构建LL-PINS/IL-2的寡核苷酸
[0330] 序列 检测/PCR
SEQ ID NO:47 AATCCAATGACGGCACTTCTTC thyA基因座
SEQ ID NO:48 CTTGTCGTTAAAGCCTATTC thyA基因座
SEQ ID NO:49 CGTAACCATGTAAAAGCACTTCTG otsB
SEQ ID NO:50 GTAATTCTAATGCTGGTGGG otsB
SEQ ID NO:51 ATTACGCCATCTAAATCAAAC trePTS
SEQ ID NO:52 CATCGCTGAAGCTATCATCG eno hil-2基因座
SEQ ID NO:58 AACCGCTTTCAGAAGAAGGG gapB pins基因座
SEQ ID NO:53 GATGGCTGAAGCTCCAACTC trePTS
SEQ ID NO:54 GCATGGAAGAGGACAAAGAG eno hil-2基因座
SEQ ID NO:59 CACCGAATTAACACGCATTATGACTT ptcC基因座
SEQ ID NO:60 TTTCGCTGGGAAAGCACAC gapB pins基因座
SEQ ID NO:61 GCGTGTCCAAGCAATAGATG ptcC基因座
SEQ ID NO:47 AATCCAATGACGGCACTTCTTC thyA基因座
SEQ ID NO:48 CTTGTCGTTAAAGCCTATTC thyA基因座
SEQ ID NO:49 CGTAACCATGTAAAAGCACTTCTG otsB
SEQ ID NO:50 GTAATTCTAATGCTGGTGGG otsB
SEQ ID NO:51 ATTACGCCATCTAAATCAAAC trePTS
SEQ ID NO:52 CATCGCTGAAGCTATCATCG eno hil-2基因座
SEQ ID NO:58 AACCGCTTTCAGAAGAAGGG gapB pins基因座
SEQ ID NO:53 GATGGCTGAAGCTCCAACTC trePTS
SEQ ID NO:54 GCATGGAAGAGGACAAAGAG eno hil-2基因座
SEQ ID NO:59 CACCGAATTAACACGCATTATGACTT ptcC基因座
SEQ ID NO:60 TTTCGCTGGGAAAGCACAC gapB pins基因座
SEQ ID NO:61 GCGTGTCCAAGCAATAGATG ptcC基因座
[0331] 图9描绘了来自LL-PINS/IL-2的PCR片段的1.2％琼脂糖凝胶分析，表明存在所需的遗传性状：trePTS，ptcC-，eno>>hil-2，otsB，gapB>>pin。在图9中，分子量标志物(MWM；英杰公司(Invitrogen)10488-85Trackit 1kb plus DNA梯度)表示碱基对：100,200,300,400,500,650,850,1000,1650,2000,3000,4000,5000和更高。DNA片段的预期大小也以碱基对表示。
[0332] 进一步测序LL-PINS/IL-2的细菌基因组。发现PINS/IL-2中与亲本菌株MG1363不同的所有遗传性状的实验测定的DNA序列与预期的相同。
[0333] 同源重组方法涉及衍生自上述条件性非复制型pORI19的载体质粒。设计载体质粒，使得与细菌染色体上野生型序列侧接区域相同的最高达1kb交叉(XO)区域位于质粒携带修饰的5'和3'。载体质粒的一个例子是pAGX1145，其图示于图8中。质粒用于插入gapB下游的pins，使得两者通过rpmD基因间区域偶联。使用类似的质粒pAGX1372(参见附录：pAGX1372.gbk)将en1下游的hil-2插入。通过使用标准分子生物学方法进行所有质粒构建。
[0334] PINS和hIL-2表达
[0335] 使用ELISA和蛋白质印迹测量LL-PINS/IL-2对PINS和hIL-2的表达。来自LL-PINS/IL-2的培养物上清液含有0.6ng/mL的PINS和28.2ng/mL的hIL-2，而对照菌株(LL-对照)不产生任一种多肽。将表达来自质粒载体(LL-PINS)的PINS的MG1363细菌菌株用作阳性对照。使用Mercodia目录号10-1118-01测定上清液中的PINS含量，使用R&D系统的huIL-2#DY202测定hIL-2含量。
[0336] 图10是蛋白质印迹，显示在LL-PINS/IL-2的培养上清液中存在PINS和hIL-2。将1ml细菌培养物的等同物加载到蛋白质凝胶上。使用山羊多克隆抗胰岛素B(Santa Cruz N-
20：sc-7838)和山羊抗人IL-2(1/1000R&D系统AF-202-NA)作为PINS和hIL-2的第一抗体，分别与兔抗山羊-AP(1/1000Southern Biotech#6160-04)检测抗体孵育，随后进行NBT/BCIP染色(RocheNBT/BCIP片，#11 697 471 001，产生蛋白质印迹。Invitrogen
Plus2预染色标准品用作分子量标志物(MWM)。数据表明LL-PINS/IL-2分泌全长PINS和hIL-
2。
20：sc-7838)和山羊抗人IL-2(1/1000R&D系统AF-202-NA)作为PINS和hIL-2的第一抗体，分别与兔抗山羊-AP(1/1000Southern Biotech#6160-04)检测抗体孵育，随后进行NBT/BCIP染色(RocheNBT/BCIP片，#11 697 471 001，产生蛋白质印迹。Invitrogen
Plus2预染色标准品用作分子量标志物(MWM)。数据表明LL-PINS/IL-2分泌全长PINS和hIL-
2。
[0337] 细菌在GM17培养基中培养，GM17培养基是补充有0.5％葡萄糖的M17肉汤(Oxoid；#CM0817)或GM17T培养基(补充有200μM胸苷的GM17)。
[0338] 实施例3.用于检查两种细菌菌株对糖尿病进展的影响的药效学研究，乳酸乳球菌(LL)分泌胰岛素原(LL-PINS)和hIL-2(LL-IL-2)
[0339] 如Takiishi,T.等,J.Clin.Inv.2012,122(5):1717-1725所述培养细菌。
[0340] 例如，将相应乳酸乳球菌的单菌落接种于GM17T(M17，Oxoid，Hampshire，UK，补充有0.5％葡萄糖，200μM胸苷)中并过夜生长至饱和。将1/25稀释的该培养物在GM17T中预生长3小时。通过离心收获细菌，并在缓冲培养基中孵育3小时(1x BM9盐，0.5％酪胨(casitone)(Difco，BD生物科学公司(BD Biosciences))，0.5％葡萄糖，25mM NaHCO3,25mM Na2CO3,2mM MgSO4,0.1μM CaCl2((BM9培养基)(Schotte等，(2000)Enzyme Microb.Technol.27(10):761-765)，补充有200μM胸苷)(BM9T)。通过离心除去细菌并取上清液样品用于分析蛋白质印迹和ELISA。对于蛋白质印迹，从粗制BM9T乳酸乳球菌上清液中通过脱氧胆酸盐/TCA/丙酮沉淀制备蛋白质，并溶解于SDS-PAGE样品缓冲液中。破碎细菌细胞团以得到细胞内部分。培养上清液(相当于1ml培养物)和细胞内(相当于50μl培养物)蛋白质部分通过SDS-12％PAGE分离，免疫印迹并通过山羊抗hIL-2显示和使用兔抗山羊抗体和NBT/BCIP检测。
[0341] 将所有菌株的储备溶液在-20℃下储存在GM17中的50％甘油中。细菌在GM17培养基中培养，即补充有0.5％葡萄糖的M17(Difco实验室(Difco Laboratories)，密歇根州底特律(Detroit，MI))。
[0342] 在实验装置中使用具有阳性糖尿和两次连续血糖测量超过200mg/dl的新发作糖尿病NOD小鼠。将小鼠分配至三个实验治疗组：(1)未治疗的对照，(2)LL-PINS治疗，和(3)用LL-PINS和LL-IL-2的组合治疗的小鼠，持续6周。
[0343] 该实验涉及两种不同的LL菌株。一种菌株组成型表达PINS，另一种菌株组成型表9
达IL-2。通过口服强饲法每周5次以2×10CFU的剂量治疗小鼠，持续六(6)周。
达IL-2。通过口服强饲法每周5次以2×10CFU的剂量治疗小鼠，持续六(6)周。
[0344] 跟踪小鼠42天(治疗停止)或100天(治疗停止后8周)。除了最初的疾病缓解随访至100天之外，在治疗开始后42天对另外的小鼠(未治疗和LL-PINS+LL-IL-2治疗)实施安乐死，并且使用外周血和不同器官进行进一步分析。在治疗前和停止治疗后(第42天)收集用于测量胰岛素自身抗体(IAA)，炎性细胞因子和葡萄糖刺激的C肽的血清样品。在所有实验组(疾病缓解者和非缓解者)中评估外周免疫系统(表型和功能)。在治疗停止(第42天)时采集胰腺样品用于组织学(胰岛炎)和胰岛素含量测定(IC)。
[0345] T1D和胰岛炎评估
[0346] 通过评估尿液(Clinistix；拜尔诊断公司(Bayer Diagnostics))和静脉血(Accu-Chek Aviva，罗氏诊断公司(Roche Diagnostics))中的葡萄糖浓度筛选糖尿病发作的NOD小鼠。在8和11am之间收集随机喂养的血糖测量值。当患有阳性糖尿和两次连续血糖测量超过200mg/dl时，将小鼠分类为糖尿病。糖尿病缓解定义为连续两天没有糖尿和血糖值<250mg/dl。
[0347] 将胰腺样品固定在甲醛溶液中并加工用于石蜡包埋。将7-μm厚的切片用苏木精/曙红染色，并用显微镜评估胰岛炎的程度。对胰岛的损害评级如下：0：没有渗透；1：旁胰岛炎(perin-insulitis)；2：淋巴细胞浸润小于50％的胰岛；3：淋巴细胞浸润超过50％的胰岛；4：胰岛完全被摧毁。
[0348] 自身抗体检测
[0349] 通过RIA测定在疾病发作和治疗终止(第42天)时测量血清IAA。测试了LL-PINS+LL-IL-2疫苗接种是否可以纠正新发作糖尿病NOD小鼠的高血糖症(疾病缓解)和维持正常血糖。在治疗开始后跟踪血糖浓度14周。
[0350] 结果-疾病缓解
[0351] 图11显示治疗后仍为糖尿病的小鼠的百分比。在NOD小鼠出现高血糖症(连续2天血糖浓度>200mg/dl)后，它们通常发展为严重的高血糖症，自发缓解最小，并且大多数在3-6周内死亡(n＝27)。
[0352] 使用LL-PINS接种的单一疗法(2×109CFU/天，每周5天，持续6周；n＝8)在15％的小鼠中校正高血糖症。值得注意的是，用LL-PINS和LL-IL-2联合治疗的43％的新糖尿病小鼠(n＝45)迅速重新建立了正常血糖。LL-PINS+LL-IL-2治疗诱导稳定和永久性糖尿病缓解，治愈小鼠在停止治疗后8周的额外随访期间维持血糖正常。
[0353] LL-PINS和LL-IL-2治疗的临床功效明显受到治疗开始时血糖浓度的影响。基于初始血糖浓度低于或高于350mg/dL，对最近发作的糖尿病NOD小鼠进行分类。LL-PINS加LL-IL-2疗法不仅治愈了57％具有低于350mg/dL的起始血糖的小鼠，而且还治愈了22％的具有高于350mg/dL的起始血糖的小鼠(图12)。这些数据首次证明了重组乳酸乳球菌细菌对IL-2的PINS粘膜递送有效地纠正了高血糖，并恢复了最近发病的T1D的NOD小鼠对β细胞的免疫耐受性。
[0354] 在所有Kaplan-Meier存活曲线中，组间的统计学显著性通过Mantel-Cox对数秩检验确定(*：p<0.05)。
[0355] 实施例4.乳酸乳球菌分泌的hIL-2(LL-IL-2)具有与重组hIL-2相当的生物学活性[0356] 该实验涉及如本文所述的表达人IL-2(LL-IL-2)的乳酸乳球菌菌株(参见例如实施例1)和对照菌株。
[0357] 基于小鼠T淋巴细胞系HT2克隆A5E的IL-2依赖性存活/增殖测量LL-IL-2的生物活性。用不含IL-2的培养基洗涤HT2细胞三次，并以4×103细胞/96孔的密度接种。将连续稀释的重组hIL-2系列(例如R&D系统#202-IL-010)或来自LL-IL-2的上清液和对照菌株加入到铺板的细胞中并在37℃、5％二氧化碳和高湿度下孵育24小时。使用AQueousOne溶液(Promega#G3582)测量细胞活力。每孔加入20μl MTT溶液，在37℃、5％CO2和高湿度下孵育4小时后，使用700nm作为参考波长在490nm处读板。来自LL-IL-2的重组hIL-2(R&D系统)和hIL-2显示出相当的剂量依赖性反应，而乳酸乳球菌对照菌株的上清液是无活性的。结果如图13所示。
[0358] 实施例5.LL-IL-2在口服给予后向非肥胖糖尿病小鼠的胃肠道递送低剂量的hIL-2
[0359] 该实验涉及如本文所述的表达人IL-2(LL-IL-2)的乳酸乳球菌菌株，例如
[0360] 实施例1。
[0361] 活细菌
[0362] 在通过口服强饲法单剂量施用1010CFU的LL-IL-2后，在不同时间点测量胃肠道的不同组织中的活细菌浓度(CFU/组织和CFU/g)。结果分别如图14A和14B所示，其中每个条代表3只小鼠的平均值(n＝3)。参考图14A(CFU/组织)，在2,4,6和8小时后在盲肠(CAE)，近端结肠(COP)和远端结肠(COD)中发现显著量的LL-IL-2细菌。发现小肠中的细菌浓度低于106CFU/组织。参考图14B(CFU/g)中，分别在2,4,6和8小时后在近端小肠(SIP)，远端小肠(SID)，盲肠(CAE)，近端结肠(COP)和远端结肠(COD)中发现LL-IL-2细菌的浓度。血液中未检测到细菌。
[0363] hIL-2蛋白
[0364] 在施用单剂量的LL-IL-2细菌(1010CFU)后测量胃肠道不同组织中hIL-2蛋白的浓度(pg/组织和pg/g)。在2小时和4小时后，在盲肠(CAE)，近端结肠(COP)和远端结肠(COD)中发现hIL-2蛋白浓度。发现小肠中的hIL-2蛋白质浓度低于定量限(LLOQ＝10pg/mL)。在测试小鼠的血流中未检测到hIL-2蛋白。测量的hIL-2蛋白浓度总结在下表4和表5中。
[0365] 在处死时，称重完整组织(SIP，SID，CAE，COP或COD)并匀浆化。将匀浆样品用于平板接种(以确定CFU)和用于ELISA(以确定hIL-2)。在该上下文中的总组织意味着在匀浆样品中测定的细菌或蛋白质的浓度被重新计算为总组织的重量。
[0366] 表4.单剂量施用1010CFU的LL-IL-2后胃肠道不同组织中hIL-2蛋白的浓度(pg/组织)
[0367]时间 CAE COP COD
2小时 32.6(n＝1) 91.5(n＝3) 36.1(n＝3)
4小时6小时 8小时
2小时 32.6(n＝1) 91.5(n＝3) 36.1(n＝3)
4小时
[0368] CAE＝盲肠；COP＝近端结肠；COD＝远端结肠；LLOQ＝10pg/mL
[0369] 表5单剂量施用1010CFU的LL-IL-2后胃肠道不同组织中hIL-2蛋白浓度(pg/组织)[0370]时间 CAE COP COD
2小时 69.4(n＝1) 319.8(n＝3) 178.5(n＝3)
4小时6小时 8小时
2小时 69.4(n＝1) 319.8(n＝3) 178.5(n＝3)
4小时
[0371] CAE＝盲肠；COP＝近端结肠；COD＝远端结肠；LLOQ＝10pg/mL
[0372] 在整个胃肠道中发现了活的乳酸乳球菌，大多数细菌位于大肠的近端和远端部分以及盲肠中。这里的细菌浓度比小肠的远端和近端部分高1000倍。这可以通过肠道的这些部分中的大量粘液和低运动性来解释。在给药后2小时，可以从结肠的远端部分回收约50％的施用的乳酸乳球菌。这一发现令人惊讶，因为先前已报道只有约10-30％的口服乳酸乳球菌在十二指肠递送中存活(Drouault S，等，Appl.Environ.Microbiol.1999；65(11):4881–6)。据推测，用BM9接种缓冲液接种细菌可以保护细菌(至少部分地)免受GI条件的影响。
[0373] 据估计，在给予约1010CFU LL-IL-2后，将约90pg IL-2递送至组织，其对应于约1.2IU的IL-2(基于1IU＝73pg)。
[0374] 实施例6.对药效学和机制进行研究以检查临床级乳酸乳球菌(LL)菌株分泌胰岛素原(PINS)和hIL-2的作用
[0375] 该实验涉及表达如本文所述的PINS和IL-2(LL-PINS/IL-2)的乳酸乳球菌菌株(参见例如实施例2)。可以如前所述培养细菌。参见Takiishi,T.等,J.Clin.Inv.2012,122(5):1717-1725。可以如上文实施例3中所述筛选、处理和分析NOD小鼠。可以通过口服强饲法用细菌处理小鼠，例如以2×109CFU的剂量每周5次，持续六(6)周。
[0376] 局部和外周免疫系统的表型分析
[0377] 可以在治疗终止时(例如，在第42天)分离外周器官(即，血液，肠系膜和胰腺淋巴结和胰腺)并且可以进行表型检查，例如，通过对经典和非经典Treg标志物(即，CD3，CD4，CD25，Foxp3，CD39，CD49b，LAG-3和CD73)的流式细胞术分析。例如，CD49b和LAG-3的共表达使得能够表征高度抑制性产生IL-10的Tr1细胞(参见，例如，Gagliani，N.等，Nat.Med.2013,19(6):739-746)，而表达胞外酶CD39和CD73的Tregs产生高浓度的腺苷，其被认为是Treg抑制机制之一。参见例如Antonioli,L.等,Trends Mol.Med.2013,19(6):
355-367。
355-367。
[0378] 对于细胞内细胞因子染色，可以在1μl/ml GolgiPlugTM(BD)存在下，例如用1μg/ml佛波醇肉豆蔻酸(PMA，西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich))和0.5μg/ml离子霉素(西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich))再刺激免疫细胞4小时。在细胞表面染色后，可以例如使用Cytofix/CytopermTM试剂盒(BD)进行细胞内染色(即CD3，CD4，CD8，IL-2，IL-4，IL-17和IFN-γ)。
[0379] 对于pSTAT-5检测，可以在处死后或体外培养后，例如在10体积的PBS 1.5％甲醛溶液中，在室温下快速固定细胞悬浮液10分钟。可以将细胞洗涤，例如在含有0.2％BSA的PBS溶液中，并在冰上透化，例如用100％甲醇透化10分钟。细胞可以进一步洗涤，例如用PBS 0.2％BSA洗涤，并且可以与磷酸特异性抗体一起与感兴趣的抗体(例如抗CD3，CD4，CD8，CD25，CD69，CD44，CD122)一起孵育，例如，在室温下在黑暗中保持30分钟。在一些情况下，可以将抗Ki67抗体与抗Foxp3抗体一起添加。pSTAT5阴性阈值可以在未刺激的细胞上或在用所有荧光抗体减去pSTAT5染色的细胞上定义。
[0380] 可以例如使用FACS Gallios(贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter))，FACS Canto II(BD公司(Becton Dickinson，BD))或FACS Fortessa(BD)进行多参数分析，并用FlowJo软件(Tree Star)进行分析。可以从所有分析中排除死细胞(活死黄405染色)和双峰。
[0381] 体外多克隆抑制试验和IFN-γ检测
[0382] 可以评估从脾和淋巴结(理想地从hCD2.Foxp3NOD小鼠中分离)分离的外周Tregs的抑制功能，例如，如所述进行体外多克隆抑制测定。参见例如Takiishi,T.等,J Clin.Invest.2012.122(5):1717-1725。在无细胞上清液中测量IFN-γ。
[0383] 结果
[0384] 预期LL-PINS/IL-2处理刺激和募集Tregs，并且具有与本文所述的LL-IL-2+LL-PINS处理相当的生物活性，例如，在实施例3和8中。
[0385] 实施例7.构建乳酸乳球菌分泌胰岛素原(LL-PINS)
[0386] 从GenBank(登录号NM_00207.2)检索编码人胰岛素原(hpins)的DNA序列。hpins DNA序列在3'末端延伸，具有TAA终止密码子和SpeI限制性位点。通过40聚体寡核苷酸(oAGX0362至oAGX0377)的PCR组装合成DNA片段，并使用Accu Prime DNA聚合酶进行扩增。将扩增的片段与thyA乳球菌启动子(PthyA)下游的usp45分泌信号(SSusp45)融合，其在5'末端用EcoRI限制性位点延伸。将具有5'EcoRI末端和3'SpeI末端的扩增产物插入质粒pT1NX(GenBank登录号HM585371.1)的EcoRI和SpeI限制性位点之间并连接。通过电穿孔将连接物引入乳酸乳球菌MG1363中，并通过PCR分析筛选菌落。得到的质粒命名为pAGX0053(图15)。
[0387] 从MG1363[pAGX0053]，使用oAGX0169和oAGX0170产生含有PthyA>>SSusp45::hpins表达模块的PCR片段。纯化该片段，证实MG1363[pAGX0053]的DNA序列与预测的序列相同。通过使用标准分子生物学方法进行质粒构建。
[0388] 通过ELISA和蛋白质印迹在来自[MG1363]pAGX0053的培养物上清液(SN)上测试PINS表达。MG1363[pAGX0053]分泌2.47ng/m的PINS，通过使用Pro-Insulin ELISA(Mercodia#10-1118-01)测定。制备用于蛋白质印迹的粗制SN样品。将[MG1363]pAGX0053和参比菌株MG1363[pT1NX]和sAGX0037的1ml细菌培养物的等同物上样到蛋白质凝胶上。将样品与山羊多克隆抗胰岛素B(Santa Cruz N-20：sc-7838,1/500)一起孵育。通过与兔抗山羊AP(Southern Biotech#6160-04,1/1000)孵育和随后的NBT/BCIP染色(Roche NBT/BCIP片#11 697 471 001；如制造商所示使用)进行检测。Invitrogen Plus2预染色标准品用作分子量标志物(MWM)。数据呈现在图16中，显示LL-PINS分泌全长PINS。
[0389] 含有编码除PINS以外的T1D特异性抗原(例如GAD65，IA-2，IGRP，ZnT8，ppIAPP，外周蛋白，嗜铬粒蛋白A和GRP)的外源核酸的乳酸乳球菌菌株可以使用适当的核酸而不是hpins按照上述方法制备。
[0390] 实施例8.与LL-PINS+LL-IL-2比较口服单独给予的LL-IL-2的药代动力学分析[0391] 细菌培养
[0392] 如Takiishi,T.等,J.Clin.Inv.2012,122(5):1717-1725所述培养细菌。例如，LL-pT1NX和LL-PINS在GM17TE培养基(补充有0.5％葡萄糖，200μM胸苷和5μg/mL红霉素的M17肉汤)中培养。在GM17T培养基(补充有0.5％葡萄糖和200μM胸苷的M17肉汤)中培养LL-IL-2。将LL菌株的原液悬浮液在-80℃下储存在甘油中。将储备悬浮液在生长培养基(分别为GM17TE或GM17T)中1/1000稀释，并在30℃孵育16小时，达到2×109CFU/mL的饱和密度。通过在4℃和2900rpm离心10分钟收集细菌，并在BM9T培养基中浓缩10倍(5×M9盐，10％酪胨，
10％葡萄糖，0.5M NaHCO3,0.5M Na2CO3,1M MgCl2,100M CaCl2和100mM胸苷)用于胃内接种。
治疗由100μL用于LL-pT1NX，LL-PINS和LL-IL-2的该悬浮液组成。通过混合等份的LL-PINS和LL-IL-2悬浮液制备LL-PINS+LL-IL-2。然后治疗由200μL该悬浮液组成。
10％葡萄糖，0.5M NaHCO3,0.5M Na2CO3,1M MgCl2,100M CaCl2和100mM胸苷)用于胃内接种。
治疗由100μL用于LL-pT1NX，LL-PINS和LL-IL-2的该悬浮液组成。通过混合等份的LL-PINS和LL-IL-2悬浮液制备LL-PINS+LL-IL-2。然后治疗由200μL该悬浮液组成。
[0393] 给药时间表和剂量
[0394] 新发作糖尿病NOD小鼠(连续2次血糖测量超过200mg/dL和阳性糖尿)每周5次(工作日)接受2×109菌落形成单位(CFU)的活转基因乳酸乳球菌，持续6周。用LL-PINS+LL-IL-2处理的小鼠接受2×109CFU的LL-PINS和2×109CFU的LL-IL-2。对照1小鼠未接受治疗，对照
2小鼠接受携带空载体(LL-pT1NX)的细菌。在6周的治疗期后，在治疗开始后14周后保留一些小鼠用于进一步分析。
2小鼠接受携带空载体(LL-pT1NX)的细菌。在6周的治疗期后，在治疗开始后14周后保留一些小鼠用于进一步分析。
[0395] 血糖正常的NOD小鼠(22周龄)接受一剂2×109CFU的LL-IL-2。给药后2,4,6或8小时，使小鼠安乐死并收集全血和血清。在匀浆缓冲液(10×M9盐，0.5M NaHCO3,0.5M Na2CO3,10％牛血清白蛋白，蒸馏水)中收集近端小肠(PSI)，远端小肠(DSI)，盲肠(CAE)，近端结肠(PCO)和远端结肠(DCO)，浓度为100mg/mL并机械解离。将肠组织和全血的匀浆物以连续稀释物铺板在GM17平板上以定量细菌回收。通过ELISA测量血清和匀浆中IL-2的浓度。
[0396] 器官收获
[0397] 处理开始后6周，用CO2对小鼠实施安乐死。用肝素化针头通过心脏穿刺收集血液。将血液等分(200μL)用于加工成单细胞用于流式细胞术和血浆分离(在室温下以2000g离心
10分钟)。收获胰腺用于组织学分析并储存在5％多聚甲醛(PFA)中。通过流式细胞术除去以下淋巴器官用于分析：脾(SPL)，肠系膜淋巴结(MLN)和胰腺引流淋巴结(PLN)。
10分钟)。收获胰腺用于组织学分析并储存在5％多聚甲醛(PFA)中。通过流式细胞术除去以下淋巴器官用于分析：脾(SPL)，肠系膜淋巴结(MLN)和胰腺引流淋巴结(PLN)。
[0398] 胰腺和胰岛炎分级的组织学
[0399] 将PFA固定的石蜡包埋的胰腺切成6μm的切片并收集100μm，然后用苏木精和曙红染色。使用二甲苯除去石蜡，然后用100％-90％-70％-50％乙醇溶液进行乙醇脱水。用自来水和蒸馏水将切片再水合。将切片在苏木精中染色3分钟并用自来水冲洗。将切片在酸性乙醇中短暂漂洗3次，然后用自来水充分洗涤。将样品置于饱和的Li2CO3水溶液中，并在自来水中漂洗。然后将样品置于曙红Y-溶液(0.5％水溶液)中并在自来水中漂洗。载玻片用50％乙醇，70％乙醇，90％乙醇脱水，用100％乙醇脱水两次，用二甲苯脱水两次，每个步骤持续10秒。安装盖玻片，在光学显微镜下以20×或40×观察胰岛，并客观地分级。胰岛浸润评分如下：0-无浸润；1-旁胰岛炎；2-渗透小于50％面积的胰岛；3–渗透超过50％面积的胰岛；4-完全破坏胰岛/重症胰岛炎。
[0400] C-肽ELISA
[0401] 用于大鼠/小鼠C肽(EZRMCP2-21K，EMD密理博公司(EMD Millipore)，密苏里州圣查尔斯(St.Charles，MO))的市售ELISA试剂盒用于测定血浆中的C肽水平。简言之，用1×HRP洗涤缓冲液(含有Tween-20的50mM Tris缓冲盐水，用蒸馏水1:10稀释)洗涤96孔板3次。将基质溶液(含有0.008％叠氮化钠的血清基质)加入空白，标准和质量控制孔中。然后向所有孔中加入测定缓冲液(0.05M磷酸盐，0.025M乙二胺四乙酸(EDTA)，0.08％叠氮化钠，1％牛血清白蛋白(BSA)，pH7.4)。将含有已知水平的大鼠C肽的标准品和质量对照加入各孔中，并加入未稀释的小鼠血浆。加入抗体溶液混合物(预滴定捕获和生物素化的C肽检测抗体的
1：1混合物)，将板在轨道微量滴定板振荡器上以中等速度在室温温育2小时。用1×HRP洗涤缓冲液洗涤孔3次，并向每个孔中加入酶溶液(预先滴定的链霉抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶)以将辣根过氧化物酶与固定的生物素化抗体偶联。将板在室温下在设定为中等速度的微量滴定板振荡器上孵育30分钟。用1×HRP洗涤缓冲液彻底洗涤孔。向每个孔中加入含有3,3'5,5'-四甲基联苯胺的底物溶液，振荡该板15分钟。用终止溶液(0.3M HCl)终止酶活性，并在Victor分光光度计(Perkin Elmer)上在5分钟内在450nm处测量吸光度。
1：1混合物)，将板在轨道微量滴定板振荡器上以中等速度在室温温育2小时。用1×HRP洗涤缓冲液洗涤孔3次，并向每个孔中加入酶溶液(预先滴定的链霉抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶)以将辣根过氧化物酶与固定的生物素化抗体偶联。将板在室温下在设定为中等速度的微量滴定板振荡器上孵育30分钟。用1×HRP洗涤缓冲液彻底洗涤孔。向每个孔中加入含有3,3'5,5'-四甲基联苯胺的底物溶液，振荡该板15分钟。用终止溶液(0.3M HCl)终止酶活性，并在Victor分光光度计(Perkin Elmer)上在5分钟内在450nm处测量吸光度。
[0402] 淋巴器官淋巴细胞的分离
[0403] 收获器官并置于补充4.5％抗生素(硫酸G418)和2％胎牛血清(FCS)的冰冷的洗涤培养基(RPMI 1640培养基(生命技术公司/英杰(LifeTechnologies/Invitrogen))中。通过70μm过滤器用洗涤培养基洗涤器官。通过离心沉淀细胞。对于脾脏，在37℃下加入NH4Cl 3分钟，然后用PBS洗涤。将细胞重悬于150μL FACS缓冲液(1×PBS，0.1％BSA，2mM EDTA)中。
使用以下荧光染料偶联的抗体进行染色：CD3-PerCP-Cy5.5(145-2C11),CD4-APC-H7(GK1.5,BD),CD8α-eFluor450(53-6.7),CD25-PE-Cy7(PC61.5),CTLA4-PE(UC10-489),Foxp3-APC(FJK-165)。除非另有说明，所有抗体均来自电子生物科学公司(eBioscience)。
抗小鼠CD16/CD32(93，电子生物科学公司)用于阻断Fc-γII和III受体以降低荧光染料偶联抗体的非特异性结合。根据制造商的说明书，使用Zombie黄色可固定活力染料(生物传奇公司(BioLegend))染色死细胞。
使用以下荧光染料偶联的抗体进行染色：CD3-PerCP-Cy5.5(145-2C11),CD4-APC-H7(GK1.5,BD),CD8α-eFluor450(53-6.7),CD25-PE-Cy7(PC61.5),CTLA4-PE(UC10-489),Foxp3-APC(FJK-165)。除非另有说明，所有抗体均来自电子生物科学公司(eBioscience)。
抗小鼠CD16/CD32(93，电子生物科学公司)用于阻断Fc-γII和III受体以降低荧光染料偶联抗体的非特异性结合。根据制造商的说明书，使用Zombie黄色可固定活力染料(生物传奇公司(BioLegend))染色死细胞。
[0404] Treg细胞染色
[0405] 在染色之前用1×PBS洗涤细胞。将大约1×109个细胞接种到96孔板中，并重悬于50μl在1×PBS中1/500稀释的Zombie黄色可固定活力染料中。将细胞在室温下在黑暗中孵育20分钟。随后用200μL FACS缓冲液洗涤细胞，并与在FACS缓冲液中稀释的抗细胞外表位的抗体在黑暗中于4℃下孵育30分钟。用200μL FACS缓冲液洗涤细胞。将细胞固定并在固定/渗透固定溶液(Foxp3/转录因子染色缓冲液组，电子生物公司(eBioscience))中在室温下透化30分钟。将抗细胞内表位的抗体在1×透化缓冲液中稀释，并在黑暗中于4℃下与细胞孵育30分钟。洗涤细胞并重悬于FACS缓冲液中并过滤收集。以下稀释液使用以下抗体：
CD3(PerCP-Cy5.5；1/100)；CD25(PE-Cy7；1/625)；CD4(APC-H7；1/160)；CD8a(eFluor450；1/
300)；CTLA4(PE；1/200)；Foxp3(APC 1/200)。
CD3(PerCP-Cy5.5；1/100)；CD25(PE-Cy7；1/625)；CD4(APC-H7；1/160)；CD8a(eFluor450；1/
300)；CTLA4(PE；1/200)；Foxp3(APC 1/200)。
[0406] 流式细胞术
[0407] 在具有FACSDiva的BD Canto II上获得流式细胞术数据，并用FlowJo软件(TreeStar)分析。UltraComp eBeadsTM(电子生物公司(eBioscience))用于补偿设置。
[0408] 统计学分析
[0409] 使用GraphPad Prism 6软件进行统计学分析。
[0410] 结果
[0411] 结果通常表明(a)有或没有胰岛素原作为自身抗原(例如，作为LL-PINS给药)的低剂量IL2(通过LL-IL-2粘膜给药)可以安全地恢复小鼠的新发作糖尿病，(b)诱导和激活Tregs(CD4+CD25+Foxp3+CTLA4+)可能是LL-IL-2和LL-IL-2+LL-PINS治疗的作用机制，(c)初始血糖浓度是小鼠中治疗成功的预测因素。
[0412] LL-IL-2的粘膜递送在NOD小鼠中诱导持久的糖尿病缓解。
[0413] 如果小鼠连续两天血糖测量值超过200mg/dL，结合阳性糖尿，则诊断为糖尿病发作。治疗成功(“缓解”)定义为具有低于200mg/dL的两次连续血糖测量和完全没有阳性葡萄糖尿。
[0414] 未治疗的糖尿病NOD小鼠保持高血糖，并且当它们失重超过其初始体重的20％时被安乐死。用LL-pT1NX治疗并未恢复糖尿病小鼠的血糖正常。LL-PINS的粘膜递送导致约12％的新发作糖尿病小鼠的糖尿病逆转。出乎意料的是，在治疗6周后，单独的LL-IL-2在约
27％的新发作糖尿病小鼠中引起糖尿病逆转(即，导致重新建立的血糖正常)。由粘膜递送LL-IL-2与LL-PINS(LL-IL-2+LL-PINS)组成的组合疗法在约30％的小鼠中恢复糖尿病后的血糖正常。LL-IL-2和LL-IL-2+LL-PINS在治疗终止后至少另外8周的随访中诱导长期的糖尿病缓解。与单独的LL-IL-2治疗相比，LL-IL-2+LL-PINS治疗可以更快地逆转糖尿病。结果如图17所示。
27％的新发作糖尿病小鼠中引起糖尿病逆转(即，导致重新建立的血糖正常)。由粘膜递送LL-IL-2与LL-PINS(LL-IL-2+LL-PINS)组成的组合疗法在约30％的小鼠中恢复糖尿病后的血糖正常。LL-IL-2和LL-IL-2+LL-PINS在治疗终止后至少另外8周的随访中诱导长期的糖尿病缓解。与单独的LL-IL-2治疗相比，LL-IL-2+LL-PINS治疗可以更快地逆转糖尿病。结果如图17所示。
[0415] 治疗开始时的血糖浓度影响治疗成功
[0416] LL-IL-2和LL-IL-2+LL-PINS治疗6周后，分别在约45％和约50％的350mg/dL以下初始血糖测量值的小鼠中恢复糖尿病。为了比较，仅有约8％的起始血糖测量值高于350mg/dL的小鼠处于缓解期。这些结果表明，治疗开始时残留的β细胞量可预测治疗成功率。结果如图18所示。图22A和22B描绘了在治疗期间和随访期间仅用LL-IL-2治疗(图22A)和用LL-IL-2+LL-PINS治疗(图22B)的近期发作的糖尿病小鼠的血糖浓度(mg/dL)。
[0417] LL-IL-2的粘膜递送保留了功能性β细胞群
[0418] 血浆C-肽可反映胰腺胰岛素含量(参见，例如，Suarez-Pinzon WL等，组合疗法与胰高血糖素样肽-1和胃泌素恢复糖尿病NOD小鼠中的正常血糖(Combination therapy with glucagon-like peptide-1 and gastrin restores normoglycemia in diabetic NOD mice)，Diabetes 2008；57:3281–8)。用LL-IL-2(113.23±28.16pM，n＝3)和LL-IL-2+LL-PINS(167.63±64.38pM，n＝9)治疗和治愈的小鼠的C肽水平分别是在长期正常血糖NOD小鼠(602.93±293.43pM，n＝6)中测量的C肽值的19％和28％，并且是未治疗的长期糖尿病NOD小鼠中的值的约两倍(n＝4；58.23±100.86pM)。C肽水平可以是剩余胰岛产生的内源胰岛素量的量度。当NOD小鼠使糖尿病C肽水平下降时，并且在未治疗的长期糖尿病小鼠中，预期C肽水平非常低或不可检测。实际上，这在4只分析的小鼠中有3只观察到。只有一只小鼠具有可检测水平的C肽。该观察结果表明功能性β细胞在糖尿病诊断时仍然存在并且通过治疗保留。与新发作糖尿病小鼠相比，用LL-IL-2+LL-PINS治疗并表现出糖尿病缓解的小鼠具有统计学上显著更高的C肽水平(p<0.05)。未治愈的小鼠具有不可检测的C肽值，类似于在大多数长期存在的糖尿病小鼠中发现的那样。结果表明，最近发病的动物具有一些β细胞功能。治愈小鼠的C肽水平与最近发病的糖尿病小鼠中发现的水平相当。未治愈的动物丧失了β细胞功能，如不可检测的C肽水平所示。结果如图19所示。
[0419] LL-IL-2的粘膜递送停止胰岛炎进展
[0420] 糖尿病发作后胰腺的组织学分析显示，胰岛被白细胞严重浸润，只有少数胰岛残留有β细胞。LL-IL-2和LL-IL-2+LL-PINS使胰岛炎停止(即防止恶化)。在从新发作糖尿病到长期糖尿病的进展期间通常观察到胰岛炎恶化。出乎意料的是，与长期正常血糖NOD小鼠中发现的胰岛炎相比，这两种疗法都改善了胰岛炎的程度。虽然重症胰岛炎胰岛的百分比没有受到显著影响，但这两种疗法都显著增加了无胰岛炎区域。更意外的是，在未达到血糖正常的动物(“未治愈的”动物)中也观察到了这种改善。结果如图20所示。
[0421] 苏木精和伊红染色不能确定哪种免疫细胞浸润胰腺，即对Treg细胞的效应T细胞(Teff)。
[0422] LL-IL-2的粘膜递送诱导CD4+Foxp3+CTLA4+Treg细胞的扩增
[0423] 使用流式细胞术分析测量LL-IL-2对局部(即MLN)，全身(即脾和血)和靶器官(即PLN)的不同免疫细胞亚群的影响。因为全身给予的低剂量IL-2可诱导Treg细胞相关蛋白(包括Foxp3，CD25和CTLA4)的表达，所以测定CD4+，CD8+和CD4+Foxp3+细胞或其活化状态(CD44，CD62L)的频率。
[0424] 评估活CD3+T细胞内的CD4+和CD8+T细胞群。与治愈的动物相比，在未治愈的小鼠中用LL-IL-2和LL-IL-2+LL-PINS治疗检测到MLN中CD4+T细胞的少量减少(分别为p＝0.044和p＝0.068)。在检查的外周器官(即血液和脾脏)和靶器官(即PLN)中，这些白细胞的数量没有统计学上的显著变化。CD4+T细胞频率的差异局限于局部暴露于LL-IL-2和LLIL-2+LL-PINS的位点。相反，与治愈的小鼠相比，未治愈小鼠中LL-IL-2+LL-PINS治疗的MLN中CD8+T细胞群增加(p＝0.012)。这种趋势也存在于LL-IL-2疗法中。此外，与新发作糖尿病NOD小鼠相比，LL-IL-2和LL-IL-2+LL-PINS治疗的未治愈小鼠具有显著更高的CD8+脾T细胞(分别为p＝0.025和p＝0.011)。这种系统性变化可能是疾病进展的结果，而不是基于乳酸乳球菌的疗法。
[0425] 还使用流式细胞术评估Treg细胞的存在。治疗开始后6周，与新发作糖尿病小鼠相比，LL-IL-2和LL-IL-2+LL-PINS治愈小鼠的PLN显示出更高频率的Foxp3+CTLA-4+Treg细胞的趋势(与最发足小鼠中的约10％相比，约为17％)。在LL-IL-2和LL-IL-2+LL-PINS处理的未治愈小鼠中也观察到这种趋势(分别为约14％和约17％)
[0426] 在脾脏中，与治愈的小鼠相比，并且与未治疗的新发作小鼠相比，未治愈的小鼠表现出该Treg细胞区室的减少。在血液中，与新发作糖尿病小鼠相比，两种疗法均诱导循环Foxp3+CTLA-4+Treg细胞增加的趋势。同样，这种增加与治疗结果无关，并且在未治愈的LL-IL-2+LL-PINS治疗的小鼠中，这种增加是显著的(p＝0.009)。在MLN中，与新发作糖尿病小鼠相比，LL-IL-2+LL-PINS未治愈小鼠的Foxp3+CTLA4+Treg细胞频率也显著更高(p＝0.002)。上述结果如图21所示。
[0427] 进一步定义Treg细胞区室，测量CD25表达。相当数量的Foxp3+CTLA4+Treg细胞不表达CD25(CD25-)，但用LL-IL-2和LL-IL-2+LL-PINS治疗仍然诱导该群体的变化。CD25-Foxp3+CTLA-4+Treg细胞在血液中相对丰富，并且在LL-IL-2+LL-PINS未治愈的小鼠(p＝0.004)和LL-IL-2治愈的小鼠中增加。在脾脏中，与治愈的小鼠相比，在LL-IL-2和LL-IL-2+LL-PINS治疗的未治愈的小鼠中观察到该亚群减少的趋势(分别为p＝0.06和p＝0.06)。在肠系膜淋巴结中，LL-IL-2或LL-IL-2+LL-PINS对CD25-Foxp3+CTLA-4+Tregs几乎没有影响。
在靶淋巴结(即PLN)中，与新发作糖尿病小鼠相比，LL-IL-2和LL-IL-2+LL-PINS治愈的小鼠中该Treg细胞亚群增加。
在靶淋巴结(即PLN)中，与新发作糖尿病小鼠相比，LL-IL-2和LL-IL-2+LL-PINS治愈的小鼠中该Treg细胞亚群增加。
[0428] 对于CD25+细胞观察到以下趋势：在MLN中，与新发作糖尿病小鼠相比，用LL-IL-2和LL-IL-2+LL-PINS治疗的未治愈小鼠中CD25+Foxp3+CTLA-4+Treg细胞增加(分别为12％和14％对比7％)。这在后一组中具有统计学意义(p＝0.001)。在PLN中，LL-IL-2和LL-IL-2+LL-PINS治疗组中该亚群增加的趋势明显。
[0429] 在基于CD25表达的进一步分类后，在血液和脾中观察到的Foxp3+CTLA-4+Treg细胞的分布模式是相似的。在局部和靶淋巴结(即MLN和PLN)中，在LL-IL-2和LL-PINS+IL-2治疗后均观察到Foxp3+CTLA-4+Treg细胞增加，这可能主要归因于CD25+Treg细胞室。
[0430] 评估用LL-PINS+IL-2治疗的新发作糖尿病NOD小鼠的脾脏大小，总周期为6周(n＝3)。没有观察到脾肿大。用LL-IL-2以及LL-IL-2+LL-PINS治疗是安全且耐受良好的。
[0431] 结论
[0432] LL-IL-2和LL-IL-2+LL-PINS疗法安全且耐受良好，并且在新发作糖尿病NOD小鼠中诱导糖尿病缓解。两种疗法都具有有益的代谢和免疫效果。出乎意料的是，未治愈的小鼠也会出现一些影响，这表明对象有潜在的益处，在实验过程中没有达到血糖正常，或治疗来得太晚，因为剩余的β细胞质量低于治疗开始时的某一阈值(在NOD小鼠中，与人体中观察到的损失相比，β细胞损失的过程更快)。因此，在所有治疗的动物中可能已经观察到免疫效应，但是这种效果可能仅在那些在治疗开始时具有足够β细胞量的动物中转化为确定的治疗效果。
[0433] LL-IL-2和LL-IL-2+LL-PINS疗法可能通过涉及Treg细胞扩增的机制阻止胰岛炎进展。在LL-IL-2和LL-IL-2+LL-PINS治疗后，在PLN中发现了治疗的和未治疗的新发作糖尿病小鼠之间Foxp3+CTLA4+Treg细胞百分比的差异。由治疗诱导的Treg细胞数量的增加可能是Treg细胞存活率提高的结果(参见，例如，Tang Q,Bluestone JA.Nat.Immunol.2008；9(3):239–244)。或者，Treg细胞增加数量可以是效应T细胞(Teff)转化为诱导的Treg细胞(Zheng Y,Rudensky AY.Nat.Immunol.2007；8(5):457–462)，或Treg细胞向PLN的募集增加(Grinberg-Bleyer Y.等,J.Exp.Med.2010；207(9):1871–1878)的结果。
[0434] 实施例9.抗CD3抗体给药对糖尿病缓解率的影响
[0435] 在小鼠中进行抗CD3抗体剂量发现研究。起始血糖水平大于200mg/dl的小鼠通过IV注射以2.5微克/天给药；5微克/天；10微克/天；25微克/天；或50微克/天给予抗CD3抗体(特普利组单抗(teplizumab))。25微克/天或50微克/天的剂量表现出一些毒性。在5天的时间内给予治疗，这意味着累积的抗CD3抗体剂量为12.5微克；25微克；50微克；125微克；或250微克。接受10微克/天的治疗组导致最大缓解诱导约50％。然而，为了在较长的治疗期间降低毒性，选择2.5微克/天(累积12.5微克)的剂量，其被认为是亚治疗剂量(低剂量)。用
2.5微克/天的抗CD3抗体治疗效果低于10微克/天，导致诱导缓解约20％。
2.5微克/天的抗CD3抗体治疗效果低于10微克/天，导致诱导缓解约20％。
[0436] 与实施例8类似，LL-PINS，LL-IL2，LL-PINS+LL-IL2通过胃内接种(2×109CFU/天)给予，每周5次给予新糖尿病小鼠6周。另外，对接受LL-PINS+LL-IL2接种的小鼠静脉内(2.5微克/天)施用仓鼠抗小鼠CD3单克隆抗体(mAb)(145-2C11，BioXCell，新罕布什尔(New Hampshire)，USA)连续5天。所有测试的新糖尿病小鼠的起始血糖浓度低于350mg/dl。每周测量3次体重和血糖。糖尿病缓解定义为连续两天没有糖尿和血糖值<200mg/dl。
[0437] 如图23所示，用LL-PINS(n＝5)，LL-IL2(n＝13)和LL-PINS+LL-IL2(n＝31)混合物接种的治疗方法分别校正20％，30.8％和45.2％的小鼠高血糖症。用LL-PINS+LL-IL2和抗CD3的组合治疗的新糖尿病小鼠(n＝3)有66.7％的小鼠重新建立了正常血糖。这些数据表明另外的免疫调节物质，例如抗CD3抗体，改善了具有较低起始血糖浓度的对象中LL-IL-2+LL-PINS治疗的结果。
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