骨关节炎和疼痛的治疗
阅读：227发布：2021-08-11
专利汇可以提供骨关节炎和疼痛的治疗专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及使用IL-1α和IL-1β结合蛋白 治疗 骨关节炎和 疼痛 ，所述IL-1α和IL-1β结合蛋白包括抗IL-1α和抗IL-1β 抗体 和工程改造的多价和多特异性IL-1α和IL-1β结合蛋白。，下面是骨关节炎和疼痛的治疗专利的具体信息内容。
1.用于治疗个体的骨关节炎的方法，其包括向所述个体施用以下的步骤：
结合IL-1α的结合蛋白和结合IL-1β的结合蛋白；
或
结合IL-1α和IL-1β两者的结合蛋白。
2.根据权利要求1的方法，其中所述结合IL-1α的结合蛋白是抗IL-1α抗体。
3.根据权利要求1的方法，其中所述结合IL-1β的结合蛋白是抗IL-1β抗体。
4.根据权利要求1的方法，其中所述结合IL-1α的结合蛋白是抗IL-1α抗体且所述结合IL-1β的结合蛋白是抗IL-1β抗体。
5.根据权利要求1的方法，其中所述结合IL-1α和IL-1β两者的结合蛋白是双重可变结构域免疫球蛋白(DVD-Ig)结合蛋白。
6.根据权利要求1的方法，其中所述结合IL-1α的结合蛋白和所述结合IL-1β的结合蛋白配制在包含药学可接受载体的药物组合物中。
7.根据权利要求1的方法，其中所述结合IL-1α和IL-1β两者的结合蛋白配制在包含药学可接受载体的药物组合物中。
8.根据权利要求1的方法，其中所述结合IL-1α的结合蛋白和所述结合IL-1β的结合蛋白是结晶的。
9.根据权利要求1的方法，其中所述结合IL-1α和IL-1β两者的结合蛋白是结晶的。
10.根据权利要求8的方法，其中所述结合IL-1α的结晶结合蛋白和所述结合IL-1β的结晶结合蛋白配制在包含成分和聚合载体的组合物中。
11.根据权利要求9的方法，其中所述结晶结合蛋白配制在包含成分和聚合载体的组合物中。
12.根据权利要求10或11的方法，其中所述聚合载体是选自以下中的一种或多种的聚合物：聚丙烯酸、聚氰基丙烯酸酯、聚氨基酸、聚酐、聚酯肽、聚酯、聚乳酸、乳酸-乙醇酸共聚物或PLGA、聚b-羟基丁酸酯、聚己内酯、聚二氧杂环己酮、聚乙二醇、聚(羟丙基)甲基丙烯酰胺、聚有机磷腈、聚原酸酯、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、马来酐-烷基乙烯基醚共聚物、pluronic多元醇、白蛋白、藻酸盐、纤维素和纤维素衍生物、胶原蛋白、血纤蛋白、明胶、透明质酸、寡糖、糖胺聚糖、硫酸化多糖、其掺合物及共聚物。
13.根据权利要求10或11的方法，其中所述成分选自白蛋白、蔗糖、海藻糖、乳糖醇、明胶、羟丙基-β-环糊精、甲氧基聚乙二醇和聚乙二醇。
14.根据权利要求1的方法，其进一步包括向所述个体施用提供所需性质的第二种药剂。
15.根据权利要求14的方法，其中所述第二种药剂是选自以下的一种或多种化合物：
布地萘德，表皮生长因子，皮质类固醇，环孢菌素，柳氮磺吡啶，氨基水杨酸盐，6-巯基嘌呤，硫唑嘌呤，甲硝唑，脂肪加氧酶抑制剂，美沙拉秦，奥沙拉嗪，巴柳氮，抗氧化剂，血栓烷抑制剂，IL-1受体拮抗剂，抗IL-1β单克隆抗体，抗IL-6单克隆抗体，生长因子，弹性蛋白酶抑制剂，吡啶基-咪唑化合物，TNF、LT、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-18、IL-23、EMAP-II、GM-CSF、FGF和PDGF的抗体，CD2、CD3、CD4、CD8、CD-19、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD90或其配体的抗体，氨甲蝶呤，环孢菌素，FK506，雷帕霉素，霉酚酸酯，来氟洛米，NSAIDs，布洛芬，皮质类固醇，强的松龙，磷酸二酯酶抑制剂，腺苷激动剂，抗凝剂，补体抑制剂，肾上腺素能药，IRAK，NIK，IKK，p38，MAP激酶抑制剂，IL-1β转换酶抑制剂，TNFα转换酶抑制剂，T细胞信号传递抑制剂，金属蛋白酶抑制剂，柳氮磺吡啶，硫唑嘌呤，6-巯基嘌呤，血管紧张素转换酶抑制剂，可溶性细胞因子受体，可溶性p55 TNF受体，可溶性p75 TNF受体，sIL-1RI，sIL-1RII，sIL-6R，抗炎细胞因子，IL-4，IL-10，IL-11，IL-13和TGFβ。
16.根据权利要求1-11、14和15中任一项的方法，其中所述给所述个体施用的步骤是通过至少一种选自以下的模式：肠胃外、皮下、肌内、静脉内、关节内、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、结肠内、颈内、胃内、肝内、心肌内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸内、子宫内、膀胱内、推注、阴道、直肠、口腔含化、舌下、鼻内、和经皮。
17.用于治疗个体的疼痛的方法，其包括向所述个体施用以下的步骤：
结合IL-1α的结合蛋白和结合IL-1β的结合蛋白，其中所述结合蛋白在混合物中、同时或相继施用于所述个体；
或
结合IL-1α和IL-1β两者的结合蛋白。
18.根据权利要求17的用于治疗疼痛的方法，其中所述个体患有选自异常疼痛、痛觉过敏、和异常疼痛与痛觉过敏的组合的疼痛状况。
19.根据权利要求17的方法，其中所述结合IL-1α的结合蛋白是抗IL-1α抗体。
20.根据权利要求17的方法，其中所述结合IL-1β的结合蛋白是抗IL-1β抗体。
21.根据权利要求17的方法，其中所述结合IL-1α的结合蛋白是抗IL-1α抗体且所述结合IL-1β的结合蛋白是抗IL-1β抗体。
22.根据权利要求17的方法，其中所述结合IL-1α和IL-1β两者的结合蛋白是双特异性抗体或双重可变结构域免疫球蛋白(DVD-Ig)结合蛋白。
23.根据权利要求17的方法，其中所述结合IL-1α的结合蛋白和所述结合IL-1β的结合蛋白配制在包含药学可接受的载体的药物组合物中。
24.根据权利要求17的方法，其中所述结合IL-1α和IL-1β两者的结合蛋白配制在包含药学可接受的载体的药物组合物中。
25.根据权利要求17的方法，其中所述结合IL-1α的结合蛋白和所述结合IL-1β的结合蛋白是结晶的。
26.根据权利要求17的方法，其中所述结合IL-1α和IL-1β两者的结合蛋白是结晶的。
27.根据权利要求25的方法，其中所述结合IL-1α的结晶结合蛋白和所述结合
IL-1β的结晶结合蛋白配制在组合物中，所述组合物包含：
任选地，成分；
和聚合载体。
28.根据权利要求26的方法，其中所述结合IL-1α和IL-1β两者的结晶结合蛋白配制在组合物中，所述组合物包含：
任选地，成分；和
聚合载体。
29.权利要求27或28的方法，其中所述聚合载体是选自以下中的一种或多种的聚合物：聚丙烯酸、聚氰基丙烯酸酯、聚氨基酸、聚酐、聚酯肽、聚酯、聚乳酸、乳酸-乙醇酸共聚物或PLGA、聚b-羟基丁酸酯、聚己内酯、聚二氧杂环己酮、聚乙二醇、聚(羟丙基)甲基丙烯酰胺、聚有机磷腈、聚原酸酯、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、马来酐-烷基乙烯基醚共聚物、pluronic多元醇、白蛋白、藻酸盐、纤维素和纤维素衍生物、胶原蛋白、血纤蛋白、明胶、透明质酸、寡糖、糖胺聚糖、硫酸化多糖、其掺合物及共聚物。
30.根据权利要求27或28的方法，其中所述成分，当存在时，选自白蛋白、蔗糖、海藻糖、乳糖醇、明胶、羟丙基-β-环糊精、甲氧基聚乙二醇和聚乙二醇。
31.根据权利要求17的方法，其进一步包括向所述个体施用提供所需性质的第二种药剂。
32.根据权利要求31的方法，其中所述第二种药剂是选自以下的一种或多种化合物：
布地萘德，表皮生长因子，皮质类固醇，环孢菌素，柳氮磺吡啶，氨基水杨酸盐，6-巯基嘌呤，硫唑嘌呤，甲硝唑，脂肪加氧酶抑制剂，美沙拉秦，奥沙拉嗪，巴柳氮，抗氧化剂，血栓烷抑制剂，IL-1受体拮抗剂，抗IL-1β单克隆抗体，抗IL-6单克隆抗体，生长因子，弹性蛋白酶抑制剂，吡啶基-咪唑化合物，TNF、LT、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-18、IL-23、EMAP-II、GM-CSF、FGF和PDGF的抗体，CD2、CD3、CD4、CD8、CD-19、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD90或其配体的抗体，氨甲蝶呤，环孢菌素，FK506，雷帕霉素，霉酚酸酯，来氟洛米，NSAIDs，布洛芬，皮质类固醇，强的松龙，磷酸二酯酶抑制剂，腺苷激动剂，抗凝剂，补体抑制剂，肾上腺素能药，IRAK，NIK，IKK，p38，MAP激酶抑制剂，IL-1β转换酶抑制剂，TNFα转换酶抑制剂，T细胞信号传递抑制剂，金属蛋白酶抑制剂，柳氮磺吡啶，硫唑嘌呤，6-巯基嘌呤，血管紧张素转换酶抑制剂，可溶性细胞因子受体，可溶性p55 TNF受体，可溶性p75 TNF受体，sIL-1RI，sIL-1RII，sIL-6R，抗炎细胞因子，IL-4，IL-10，IL-11，IL-13和TGFβ。
33.根据权利要求17的用于治疗个体疼痛的方法，其中所述个体患有选自以下的疾病或病症：骨关节炎、类风湿性关节炎、青少年慢性关节炎、脓毒性关节炎、莱姆关节炎、牛皮癣性关节炎、反应性关节炎、脊椎关节病、系统性红斑狼疮、克罗恩病、溃疡性结肠炎、炎性肠病、胰岛素依赖性糖尿病、甲状腺炎、哮喘、变应性疾病、牛皮癣、皮炎、硬皮病、移植物抗宿主病、器官移植排斥、与器官移植相关的急性或慢性免疫性疾病、肉状瘤病、动脉粥样硬化、弥散性血管内凝血、川崎氏病、Grave氏病、肾病综合症、慢性疲乏综合症、韦格纳氏肉芽肿病、Henoch-Schoenlein紫癜、肾显微血管炎、慢性活动性肝炎、葡萄膜炎、脓毒性休克、中毒性休克综合症、脓毒病综合症、恶病质、感染病、寄生虫病、急性横贯性脊髓炎、亨廷顿氏舞蹈病、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、中风、原发性胆汁性肝硬变、溶血性贫血、恶性肿瘤、心力衰竭、心肌梗塞、阿狄森氏病、散发性多腺性I型缺乏、多腺性II型缺乏 (Schmidt氏综合症)、成人(急性)呼吸窘迫综合症、秃头、斑秃、血清反应阴性关节病、关节病、Reiter氏病、牛皮癣性关节病、溃疡性结肠炎性关节病、肠病性滑膜炎、衣原体相关性关节病、耶尔森氏菌相关性关节病、沙门氏菌相关性关节病、脊椎关节病、动脉粥样化疾病/动脉硬化、特应性变态反应、自身免疫性大疱性疾病、寻常天疱疮、落叶状天疱疮、类天疱疮、线性IgA疾病、自身免疫性溶血性贫血、Coombs阳性溶血性贫血、获得性恶性贫血、青少年性恶性贫血、肌痛脑炎/Royal Free疾病、慢性粘膜皮肤念珠菌病、巨细胞性动脉炎、原发性硬化性肝炎、隐原性自身免疫性肝炎、获得性免疫缺陷综合症、获得性免疫缺陷相关病、乙型肝炎、丙型肝炎、常见的各种免疫缺陷(常见的可变低丙种球蛋白血症)、扩张型心肌病、女性不育、卵巢衰竭、过早卵巢衰竭、纤维化肺疾病、隐原性纤维化肺泡炎、炎症后间质性肺病、间质性肺炎、结缔组织病相关性间质性肺病、混合型结缔组织病相关性肺病、全身性硬皮病相关性间质性肺病、类风湿性关节炎相关性间质性肺病、系统性红斑狼疮相关性肺病、皮肌炎/多肌炎相关性肺病、斯耶格伦氏病相关性肺病、强直性脊柱炎相关性肺病、脉管炎性弥散性肺病、含铁血黄素沉着病相关性肺病、药物诱导的间质性肺病、纤维化、放射性纤维化、闭塞性细支气管炎、慢性嗜酸性肺炎、淋巴细胞性浸润性肺病、感染后间质性肺病、痛风性关节炎、自身免疫性肝炎、1型自身免疫性肝炎(传统自身免疫性或狼疮样肝炎)、2型自身免疫性肝炎(抗LKM抗体肝炎)、自身免疫介导的低血糖、具有黑棘皮症的B型胰岛素抵抗、甲状旁腺机能减退、与器官移植相关的急性免疫性疾病、与器官移植相关的慢性免疫性疾病、骨关节病、原发性硬化性胆管炎、1型牛皮癣、2型牛皮癣、特发性白细胞减少、自身免疫性嗜中性白细胞减少症、肾脏病NOS、肾小球肾炎、肾显微血管炎、莱姆病、盘状红斑狼疮、特发性男性不育症或NOS、精子自身免疫性、多发性硬化(所有亚型)、交感性眼炎、结缔组织病继发的肺动脉高压、Goodpasture氏综合症、结节性多动脉炎的肺表现、急性风湿热、类风湿性脊椎炎、Still氏病、全身性硬皮病、斯耶格伦氏综合症、高安氏病/动脉炎、自身免疫性血小板减少症、特发性血小板减少症、自身免疫性甲状腺病、甲状腺机能亢进、甲状腺肿性自身免疫性甲状腺功能减退(桥本氏病)、萎缩性自身免疫性甲状腺功能减退、原发性粘液性水肿、晶状体性葡萄膜炎、原发性血管炎、白癜风、急性肝病、慢性肝病、酒精性肝硬变、酒精诱导的肝损伤、胆汁郁积、特应性肝病、药物诱导的肝炎、非酒精性脂肪性肝炎、变态反应、B群链球菌(GBS)感染、精神障碍(例如，抑郁和精神分裂症)、Th2型和Th1型介导的疾病、急性和慢性痛(不同形式的疼痛)、癌症诸如肺、乳腺、胃、膀胱、结肠、胰、卵巢、前列腺和直肠癌以及造血恶性肿瘤(白血病和淋巴瘤)、无β脂蛋白血症、手足发绀、急性和慢性寄生或感染过程、急性白血病、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓细胞样白血病(AML)、急性或慢性细菌感染、急性胰腺炎、急性肾功能衰竭、腺癌、心房异位搏动、AIDS痴呆复征、酒精诱导的肝炎、变应性结膜炎、过敏性接触性皮炎、变应性鼻炎、同种异体移植物排斥、α-1-抗胰蛋白酶缺乏、肌萎缩性侧索硬化、贫血、心绞痛、前角细胞变性、抗-CD3治疗、抗磷脂综合症、抗受体超敏反应、主动脉和周围性动脉瘤、主动脉壁夹层形成、高动脉压、动脉硬化、动静脉瘘、共济失调、心房纤维颤动(持续性或阵发性)、心房扑动、房室传导阻滞、B细胞淋巴瘤、骨移植物排斥、骨髓移植(BMT)排斥、束支传导阻滞、Burkitt氏淋巴瘤、烧伤、心律失常、心脏震晕综合症、心脏肿瘤、心肌病、心肺分流术炎症应答、软骨移植排斥、小脑皮质变性、小脑病症、紊乱性或多源性房性心动过速、化学治疗相关病症、慢性髓细胞性白血病(CML)、慢性酒精中毒、慢性炎性病理学、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性阻塞性肺部疾病(COPD)、慢性水杨酸盐中毒、结肠直肠癌、充血性心力衰竭、结膜炎、接触性皮炎、肺源性心脏病、冠状动脉疾病、克雅氏病、培养物阴性脓毒病、囊性纤维化、细胞因子治疗相关病症、拳击员痴呆、脱髓鞘病、登革出血热、皮炎、皮肤病学状况、多尿症、糖尿病性动脉硬化性疾病、弥漫性Lewy小体病、扩张性充血性心肌病、基底神经节病症、中年唐氏综合症、由阻断CNS多巴胺受体的药物诱导的药物诱导的运动障碍、药物敏感性、湿疹、脑脊髓炎、心内膜炎、内分泌病、会厌炎、EB病毒感染、红斑性肢痛病、锥体外束和小脑病症、家族性噬血性淋巴组织细胞增多症、胎儿胸腺移植排斥、Friedreich氏共济失调、功能性外周性动脉病症、真菌性脓毒病、气性坏疽病、胃溃疡、肾小球肾炎、任何器官或组织的移植物排斥、革兰氏阴性脓毒病、革兰氏阳性脓毒病、由于细胞内生物的肉芽肿、毛细胞性白血病、Hallervorden-Spatz病、桥本氏甲状腺炎、枯草热、心脏移植排斥、血色素沉着症、血液透析、溶血性尿毒性综合症/血栓溶解性血小板减少性紫癜、出血、甲型肝炎、希氏束心律失常、HIV感染/HIV神经病、何杰金氏病、运动过度性运动障碍、超敏反应、超敏感性肺炎、高血压、运动机能减退性运动障碍、下丘脑-垂体-肾上腺轴评价、特发性阿狄森氏病、特发性肺纤维化、抗体介导的细胞毒性、虚弱、婴儿型脊髓性肌萎缩、主动脉炎症、甲型流行性感冒、电离辐射照射、虹膜睫状体炎/葡萄膜炎/视神经炎、缺血性再灌注损伤、缺血性中风、青少年类风湿性关节炎、青少年脊髓性肌萎缩、卡波西氏肉瘤、肾移植排斥、军团杆菌、利什曼病、麻风病、皮层脊髓系统损伤、脂肪水肿、肝移植排斥、淋巴水肿、疟疾、恶性淋巴瘤、恶性组织细胞增多症、恶性黑素瘤、脑膜炎、脑膜炎球菌血症、代谢性偏头痛、特发性偏头痛、线粒体多系统病症、混合型结缔组织病、单克隆丙种球蛋白病、多发性骨髓瘤、多系统变性(Menzel, Dejerine-Thomas, Shy-Drager, 和Machado-Joseph)、重症肌无力、鸟胞内分支杆菌、结核分支杆菌、骨髓异常增生综合症、心肌梗塞、心肌缺血性病症、鼻咽癌、新生儿慢性肺病、肾炎、肾变病、神经变性疾病、神经原性肌萎缩、嗜中性粒细胞减少性发热、非何杰金淋巴瘤、腹主动脉及其分支闭塞、闭塞性动脉病症、OKT3®治疗、睾丸炎/附睾炎、睾丸炎/输精管切除术逆转术、器官巨大症、骨质疏松症、胰移植排斥、胰癌、恶性肿瘤的肿瘤相关综合症/高钙血症、甲状旁腺移植排斥、盆腔炎症性疾病、常年性鼻炎、心包疾病、外周性动脉粥样硬化疾病、外周血管病症、腹膜炎、恶性贫血、卡氏肺囊虫性肺炎、肺炎、POEMS综合症(多发性神经病、器官巨大症、内分泌病、单克隆丙种球蛋白病和皮肤变化综合症)、灌注后综合症、泵后综合症、MI心切开术后综合症、先兆子痫、进行性核上麻痹、原发性肺动脉高压、放射治疗、Raynaud氏现象、Raynaud氏病、Refsum氏病、常规狭窄QRS心动过速、肾血管性高血压、再灌注损伤、限制性心肌病、肉瘤、老年性舞蹈病、Lewy小体型老年性痴呆、血清反应阴性关节病、中风、镰状细胞贫血、皮肤同种异体移植物排斥、皮肤变化综合症、小肠移植排斥、实体瘤、特殊心律失常、脊髓性共济失调、脊髓小脑变性、链球菌肌炎、小脑结构损伤、亚急性硬化性全脑炎、晕厥、心血管系统梅毒、全身性过敏反应、全身炎症反应综合症、全身发作性青少年类风湿性关节炎、T细胞或FAB ALL、毛细血管扩张、血栓闭塞性脉管炎、血小板减少症、毒性、移植物、创伤/出血、III型超敏反应、IV型超敏反应、不稳定心绞痛、尿毒症、尿脓毒病、荨麻疹、心脏瓣膜疾病、静脉曲张、血管炎、静脉疾病、静脉血栓形成、心室纤维性颤动、病毒和真菌感染、病毒性脑炎/无菌性脑膜炎、病毒相关性噬红细胞综合症、Wernicke-Korsakoff综合症、Wilson氏病、任何器官或组织的异种移植排斥、急性冠状动脉综合症、急性特发性多神经炎、急性炎性脱髓鞘性多发性神经根性神经病、急性缺血、成人Still氏病、斑秃、过敏反应、抗磷脂抗体综合症、再生障碍性贫血、动脉硬化、特应性湿疹、特应性皮炎、自身免疫性皮炎、与链球菌感染相关的自身免疫性病症、自身免疫性肠病、自身免疫性听力丧失、自身免疫性淋巴细胞增生综合症(ALPS)、自身免疫性心肌炎、自身免疫性过早卵巢衰竭、睑炎、支气管扩张、大疱性类天疱疮、心血管病、灾变性抗磷脂综合症、乳糜泻、颈椎关节强硬、慢性缺血、疤痕性类天疱疮、具有多发性硬化风险的临床孤立综合症(CIS)、儿童期发病性精神病、慢性阻塞性肺部疾病(COPD)、泪囊炎、皮肌炎、糖尿病性视网膜病、椎间盘突出、盘脱垂、药物诱导的免疫性溶血性贫血、心内膜炎、子宫内膜异位、眼内炎、巩膜外层炎、多形性红斑、重型多形性红斑、妊娠期类天疱疮、格林巴利综合症(GBS)、枯草热、Hughes综合症、特发性帕金森氏病、特发性间质性肺炎、IgE介导的变态反应、免疫性溶血性贫血、内含体肌炎、感染性眼炎性疾病、炎性脱髓鞘疾病、炎性心脏病、炎性肾病、IPF/UIP、虹膜炎、角膜炎、干燥性角膜结膜炎、Kussmaul病或Kussmaul-Meier病、Landry氏麻痹、朗格汉斯细胞组织细胞增多症、网状青斑、黄斑变性、显微镜下多脉管炎、白赫铁列夫症、运动神经元病症、粘膜类天疱疮、多器官衰竭、重症肌无力、脊髓异常增生综合症、心肌炎、神经根障碍、神经病、非甲非乙型肝炎、视神经炎、骨质溶解、卵巢癌、少关节的JRA、周围动脉闭塞性疾病(PAOD)、周围血管疾病(PVD)、外周动脉疾病(PAD)、静脉炎、结节性多动脉炎(或结节性动脉外膜炎)、多软骨炎、风湿性多肌痛、白发症、多关节的JRA、多发性内分泌缺陷综合症、多肌炎、风湿性多肌痛(PMR)、泵后综合症、原发性帕金森综合症、前列腺癌和直肠癌和造血性恶性病(白血病和淋巴瘤)、前列腺炎、单纯红细胞再生障碍、原发性肾上腺机能不足、复发型视神经脊髓炎、再狭窄、风湿性心脏病、SAPHO(滑膜炎、痤疮、脓疱病、骨肥厚和骨炎)、继发性淀粉样变性、休克肺、巩膜炎、坐骨神经痛、继发性肾上腺机能不足、聚硅氧烷相关的结缔组织病、Sneddon-Wilkinson皮肤病、关节强硬性脊椎炎、Stevens-Johnson综合症(SJS)、全身性炎症应答综合症、颞动脉炎、弓形体视网膜炎、中毒性表皮坏死松解、横贯性脊髓炎、TRAPS(肿瘤坏死因子受体1型(TNFR)相关周期性综合症)、I型变态反应、II型糖尿病、荨麻疹、普通型间质性肺炎(UIP)、脉管炎、春季结膜炎、病毒性视网膜炎、Vogt-Koyanagi-Harada综合症(VKH综合症)、湿黄斑变性和伤口愈合。
34.根据权利要求17的用于治疗个体病痛的方法，其中所述个体患有选自以下的疾病：原发性癌症、转移性癌症、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、肺癌、口咽癌、下咽癌、食道癌、胃癌、胰癌、肝癌、胆囊癌、胆管癌、小肠癌、结肠癌、尿道癌、肾癌、膀胱癌、尿道上皮癌、女性生殖道癌、子宫颈癌、子宫癌、卵巢癌、绒毛膜癌、妊娠性滋养层细胞病、男性生殖道癌、前列腺癌、精囊癌、睾丸癌、生殖细胞肿瘤、内分泌腺癌、甲状腺癌、肾上腺癌、脑下垂体癌、皮肤癌、血管瘤、黑素瘤、肉瘤、骨癌、软组织癌、卡波西氏肉瘤、脑瘤、神经癌、眼癌、脑膜癌、星形细胞瘤、神经胶质瘤、成胶质细胞瘤、视网膜母细胞瘤、神经瘤、成神经细胞瘤、神经鞘瘤、脑膜瘤、从造血恶性肿瘤产生的实体瘤、白血病、何杰金淋巴瘤、和非何杰金淋巴瘤。
35.根据权利要求17-28和31-34中任一项的方法，其中所述向所述个体施用的步骤是通过至少一种选自以下的模式：肠胃外、皮下、肌内、静脉内、关节内、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、结肠内、颈内、胃内、肝内、心肌内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸内、子宫内、膀胱内、推注、阴道、直肠、口腔含化、舌下、鼻内、和经皮。
骨关节炎和疼痛的治疗
[0002] 本发明涉及治疗骨关节炎和疼痛，且更具体而言涉及结合IL-1α 和/或 IL-1β的蛋白用于治疗骨关节炎和疼痛的用途。
[0003] 发明背景健康脊椎动物(包括人和其他哺乳动物)的关节软骨或“透明软骨”是半透明的乳白色结缔组织，其特征在于主要由蛋白聚糖、II型胶原蛋白和水构成的细胞外基质(ECM)中软骨细胞的柱状生长模式。关节软骨提供有效承重缓冲垫以防止关节中对接骨之间的接触，且因此对关节正常功能至关重要。关节软骨不仅易受关节外伤损伤，而且易受逐渐侵蚀过程损伤。最初，该侵蚀可以仅仅是无症状的“部分厚度缺损(partial thickness defect)”，其中透明软骨减少的区域没有完全穿透至软骨下骨(subchondral bone)。所述部分厚度缺损通常不疼且通常仅在关节镜检查期间检测出。然而，如果不治疗侵蚀过程，那么部分厚度缺损的基底可继续磨损且缺损直径可增加，使得该缺损最终发展为穿透下层骨的“完全厚度缺损(full thickness defect)”。该完全厚度缺损可变得足够大，使得关节对接骨表面变得接触且开始彼此侵蚀，导致炎症、疼痛和其他退行性病变，即骨关节炎(OA)的典型症状。骨关节炎因此是导致关节变形、不稳定、损伤和疼痛的退行性、进行性和致残疾病。最终，关节置换手术可以是至少部分恢复个体一定活动水平的唯一可行的求助手段。
[0004] IL-1超家族由具有广泛生物学和生理学效应的炎症过程的介质组成，所述生物学和生理学效应包括发热、前列腺素合成(在例如成纤维细胞、肌肉细胞和内皮细胞中)、T淋巴细胞活化和白介素-2产生。IL-1超家族的最初成员是IL-1α、IL-1β和IL-1受体拮抗剂(IL-1Ra、IL-1RA、IL-1ra、IL-1Rα)。IL-1α和IL-β是参与针对感染的免疫防御的促炎细胞因子。IL-1Rα与IL-1α和IL-1β竞争受体结合，从而阻断其在免疫活化中的作用。IL-1超家族的其他分子包括IL-18 (参见Dinarello (1994) FASEB J.8(15):1314–1325; Huising等人(2004) Dev. Comp. Immunol. 28(5):395–413)和另外六个与IL-1α、IL-1β或IL-1RA结构同源的基因，命名为IL1F5、IL1F6、IL1F7、IL1F8、IL1F9和IL1F10。相应地，将IL-1α、IL-1β和IL-1RA分别重新命名为IL-1F1、IL-1F2和IL-1F3(参见Sims等人 (2001) Trends Immunol. 22(10):536–537; Dunn等人(2001) Trends Immunol. 22(10):533–536)。被称为IL-33或IL-1F11的IL-1家族的另一个推定成员已得到描述，尽管该命名尚未得到HGNC基因家族命名法数据库的正式接受。
[0005] IL-1α和IL-1β都由巨噬细胞、单核细胞和树突细胞产生。它们形成身体对感染的炎症反应的重要部分。这些细胞因子增加粘附因子在内皮细胞上的表达，来使得白细胞能够向感染部位移行，并重置下丘脑体温调节中枢，从而导致其自身表现为发热的体温升高。因此将IL-1称为内源性致热原。升高的体温帮助身体免疫系统对抗感染。IL-1对于血细胞生成的调节也是重要的。IL-1β在外周组织的产生也和与发热相关的痛觉过敏(对疼痛的敏感性增高)有关(Morgan等人(2004)Brain Res. 1022(1-2):96–100)。IL-1上调与疼痛相关的环加氧酶-2(COX-2)的表达。在很大程度上，IL-1α 和 IL-1β结合相同的细胞受体。该受体由两个相关但不相同的亚基组成，所述亚基通过与某些其他受体大部分共享的通路传导细胞内信号。这些包括先天免疫受体的Toll家族和IL-18受体。IL-1α和IL-1β也具有相似的生物学性质，包括诱导发热、慢波睡眠和嗜中性白细胞增多、T和B淋巴细胞活化、成纤维细胞增生、对某些细胞的细胞毒性、诱导胶原酶、肝急性期蛋白的合成、以及集落刺激因子和胶原蛋白产生增加。
[0006] 编码IL-1α 和 IL-1β的cDNA已得到分离和表达；这些cDNA代表两个不同的基因产物，称为IL-1α (Lomedico 等人(1984) Nature 312:458) 和 IL-1β (Auron等人(1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:7909)。八个白介素1家族基因形成染色体2上的细胞因子基因簇。IL-1β是由人单核细胞产生的、在mRNA和蛋白水平的主要形式。人IL-1的两种形式仅共享26％的氨基酸同源性。尽管其多肽序列不同，但两种形式的IL-1具有结构相似性(Auron等人(1985)J. Mol. Cell Immunol. 2:169)，这是由于氨基酸同源性被限制于IL-1分子的不连续区。
[0007] IL-1α和IL-1β作为前体肽产生。换言之，它们作为长蛋白产生，然后进行加工以释放较短的活性分子，称为成熟蛋白。IL-1α作为蛋白原(proprotein)产生，由钙激活中性蛋白酶蛋白水解加工，并以尚未得到充分研究的机制释放。例如，成熟的IL-1β是由蛋白胱天蛋白酶家族的特定成员(称为胱天蛋白酶-1或白介素-1转变酶(ICE))切割后从IL-1β原释放的。人IL-1超家族各成员成熟形式的三维结构由产生桶状蛋白的12-14 β-链构成。
[0008] IL-1α最初由于其增加软骨再吸收的作用而被称为“分解代谢物”，但也由于其对滑膜细胞中胶原酶和前列腺素的刺激性作用而被称为“单核细胞因子”(MCF)，以及对急性期反应具有刺激性作用的“白细胞内源性因子”(LEM)。由于IL-1α由许多不同的细胞合成，例如单核细胞、巨噬细胞、成纤维细胞、内皮细胞和淋巴细胞，并且许多细胞具有IL-1α的特异性受体，所以IL-1α具有广谱生物学活性。IL-1α通过诱导IL-2释放、B细胞成熟和增殖以及成纤维细胞生长因子活性来刺激胸腺细胞增殖。IL-1α蛋白经鉴定为内源性致热原，并有报道其刺激前列腺素和胶原酶从滑膜细胞释放。因此，IL-1α作为各种病症和病症症状的触发物也占有重要位置。这些病症经常是对于其存在很少治疗或无治疗的显著严重的病症。已有建议说这些基因的多态性与类风湿性关节炎和阿尔茨海默氏病相关。一般而言，IL-1已牵涉于许多人类疾病，包括关节炎、肺纤维化、中枢神经系统疾病、糖尿病和某些心血管疾病。关于IL-1α的不需要的作用描述于，例如 Oppenheim 等人 (1986) Immunol. Today 7:45-56, Durum等人(1985) Ann. Rev. Immunol. 3:263-287 和 Symons 等人(1989) Lymphokine Res. 8:365-372。
[0009] OA的起始、维持和进展是由IL-1发挥关键作用的机械和生物化学途径的复杂级联所介导的。IL-1α和IL-1β不仅由单核细胞、巨噬细胞和嗜中性白细胞产生，而且由关节组织中的细胞产生，诸如软骨细胞、滑液成纤维细胞和破骨细胞(参见例如Dinarello等人, (2009) Ann. Rev. Immunol. 27: 519-550)。在体外，IL-1可刺激软骨细胞和滑膜细胞产生参与导致OA的软骨破坏的蛋白酶类(参见例如Dayer等人, (1977) Science 195:181-183；Dayer等人, (1984) Biochem. Pharmacol. 33: 2893-2899；McGuire-Goldring等人, (1984) Arthritis Rheum. 27: 654-662)，以及抑制蛋白聚糖和II型胶原蛋白(正常透明软骨细胞外基质(ECM)的主要组分)合成(参见例如Goldring等人, (1987) J. Biol. Chem. 262: 16724-16729；Goldring等人, (1988) J. Clin. Investig. 82:
2026-2037)。临床前研究和临床研究已提供IL-1在OA发病机制中的其他证据。例如，将IL-1关节内(ia)注射至动物膝盖中导致白细胞浸润和软骨损失(Pettiphar等人, (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 8749-8753)。相比之下，ia注射IL-1拮抗剂导致实验性OA的进展明显减慢(参见例如Pelletier等人, (1997) Arthritis Rheum. 40:
1012-1019；Caron等人, (1996) Arthritis Rheum. 39: 1535-1544)；Fernandes等人, (1999) Am. J. Pathol. 154: 11590-11690)；Zhang等人, (2006) Biochem. Biophys. Res. Commun. 341: 202-208)。另外，发现IL-1敲除(KO)小鼠当与其野生型对应物相比时对手术诱导的软骨损伤具有抗性(Glasson等人, (2009) Osteoarthritis Cartilage,
18: 572-580)。
2026-2037)。临床前研究和临床研究已提供IL-1在OA发病机制中的其他证据。例如，将IL-1关节内(ia)注射至动物膝盖中导致白细胞浸润和软骨损失(Pettiphar等人, (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 8749-8753)。相比之下，ia注射IL-1拮抗剂导致实验性OA的进展明显减慢(参见例如Pelletier等人, (1997) Arthritis Rheum. 40:
1012-1019；Caron等人, (1996) Arthritis Rheum. 39: 1535-1544)；Fernandes等人, (1999) Am. J. Pathol. 154: 11590-11690)；Zhang等人, (2006) Biochem. Biophys. Res. Commun. 341: 202-208)。另外，发现IL-1敲除(KO)小鼠当与其野生型对应物相比时对手术诱导的软骨损伤具有抗性(Glasson等人, (2009) Osteoarthritis Cartilage,
18: 572-580)。
[0010] IL-1α和IL-1β两者都在人OA患者的滑膜、软骨和滑液中表达(参见例如Farahat等人, (1993) Ann. Rheum. Dis. 52: 870-875)。已证明IL-1拮抗剂阿那白滞素(Anakinra)(其为IL-1受体拮抗剂)和AMG-108(其为IL-1受体单克隆抗体)在OA试验中关于症状和软骨保护的一些效力("Results from a Randomized Controlled Trial of AMG 108 (a fully human monoclonal antibody to IL-1R type I) in Patients With Osteoarthritis of the Knee" Cohen等人, ACR2007)。这些建议治疗都有待其他研究来证明清楚和稳固的临床效力。
[0011] 仍需要用于治疗受骨关节炎困扰的个体的新且有效的方法和组合物。
[0012] 发明概述本发明提供用于治疗骨关节炎(OA)和用于治疗疼痛的方法。所述方法包括向个体(人或其他哺乳动物)施用一种或多种结合IL-1α和IL-1β的结合蛋白。
[0013] 在本发明的一个方面，用于治疗在个体(人或其他哺乳动物)的骨关节炎的方法包括以下步骤：将结合IL-1α的结合蛋白与(例如在混合物中、通过连续施用或通过同时施用)结合IL-1β的结合蛋白组合施用于个体或将结合IL-1α和IL-1β两者的结合蛋白施用于个体。
[0014] 在一个实施方案中，用于治疗个体的骨关节炎的方法包括向该个体施用结合IL-1α的结合蛋白，其中该结合蛋白是IL-1α的抗体，例如IL-1α的单克隆抗体。在另一个实施方案中，用于治疗个体的骨关节炎的方法包括向该个体施用结合IL-1β的结合蛋白，其中该结合蛋白是结合IL-1β的抗体，例如结合IL-1β的单克隆抗体。
[0015] 在本发明的另一个方面，治疗个体(人或其他哺乳动物)的骨关节炎的方法包括以下步骤：向该个体施用结合IL-1α和IL-1β两者的结合蛋白。优选地，结合蛋白是双重可变结构域免疫球蛋白结合蛋白(在本文中也称为“DVD-Ig™”或“DVD-Ig”结合蛋白或分子)，其包含至少一个结合IL-1α的结合位点和至少一个结合IL-1β的结合位点。更优选地，DVD-Ig结合蛋白包含两个结合IL-1α的结合位点和两个结合IL-1β的结合位点。
[0016] 在另一个实施方案中，本发明的用于治疗个体的骨关节炎的方法包括向该个体施用药物组合物，该药物组合物包含结合IL-1α的结合蛋白、结合IL-1β的结合蛋白、结合IL-1α的结合蛋白与结合IL-1β的结合蛋白的组合、或结合IL-1α和IL-1β两者的结合蛋白；和药学可接受的载体。
[0017] 在本发明的一个实施方案中，用于治疗骨关节炎的方法包括向个体施用结合IL-1α的结晶结合蛋白和结合IL-1β的结晶结合蛋白，或结合IL-1α和IL-1β两者的结晶结合蛋白。可用于本发明的所述结晶结合蛋白包括但不限于IL-1α的结晶抗体、IL-1β的结晶抗体和结合IL-1α和IL-1β两者的结晶DVD-Ig结合蛋白。
[0018] 可用于本发明的治疗个体的骨关节炎的方法中的组合物包括用于释放结合IL-1α的结晶结合蛋白、结合IL-1β的结晶结合蛋白、结合IL-1α的结晶结合蛋白与结合IL-1β的结晶结合蛋白的组合、或结合IL-1α和IL-1β两者的结晶结合蛋白的组合物。
[0019] 在一个实施方案中，可用于本发明的治疗骨关节炎的方法中的组合物包含：(a) 制剂，其中所述制剂包含结合IL-1α的结晶结合蛋白、结合IL-1β的结晶结合蛋白、结合IL-1α的结晶结合蛋白与结合IL-1β的结晶结合蛋白两者的组合、或结合IL-1α和IL-1β两者的结晶结合蛋白；和任选地，成分；和
(b) 至少一种聚合载体。
(b) 至少一种聚合载体。
[0020] 在一个实施方案中，上述组合物包含结合IL-1α的结晶结合蛋白与结合IL-1β的结晶结合蛋白两者的组合。在另一个实施方案中，结合IL-1α的结晶结合蛋白是结合IL-1α的结晶抗体，例如结晶单克隆抗体，且结合IL-1β的结晶结合蛋白是结合IL-1β的结晶抗体，例如单克隆抗体。
[0021] 在一个实施方案中，上述组合物包含结合IL-1α和IL-1β两者的结晶结合蛋白。在另一个实施方案中，结晶结合蛋白是结合IL-1α和IL-1β-Ig两者的结晶双重可变结构域(DVD-Ig)结合蛋白。
[0022] 在另一个实施方案中，用于治疗个体的骨关节炎的方法包括向该个体施用组合物，该组合物包含结合IL-1α的结晶结合蛋白、结合IL-1β的结晶结合蛋白、结合IL-1α的结晶结合蛋白与结合IL-1β的结晶结合蛋白两者的组合、或结合IL-1α和IL-1β两者的结晶结合蛋白；其中所述至少一种聚合载体是选自一种或多种由以下组成的组的聚合物：聚丙烯酸、聚氰基丙烯酸酯、聚氨基酸、聚酐、聚酯肽、聚酯、聚乳酸、乳酸-乙醇酸共聚物或PLGA、聚b-羟基丁酸酯、聚己内酯、聚二氧杂环己酮(poly(dioxanone))、聚乙二醇、聚(羟丙基)甲基丙烯酰胺、聚有机磷腈、聚原酸酯、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、马来酐-烷基乙烯基醚共聚物、pluronic多元醇、白蛋白、藻酸盐、纤维素和纤维素衍生物、胶原蛋白、血纤蛋白、明胶、透明质酸、寡糖、糖胺聚糖(glycaminoglycans)、硫酸化多糖、其掺合物及共聚物。
[0023] 在一个实施方案中，当任选的成分存在于上述组合物中时，该成分选自白蛋白、蔗糖、海藻糖、乳糖醇(lactitol)、明胶、羟丙基-β-环糊精、甲氧基聚乙二醇和聚乙二醇。
[0024] 在一个实施方案中，上述治疗骨关节炎的方法进一步包括向该个体施用第二种药剂，其中该第二种药剂向该方法或该方法中使用的组合物提供其他所需性质。该第二种药剂可以是由以下组成的组中的一种或多种分子：布地萘德，表皮生长因子，皮质类固醇，环孢菌素，柳氮磺吡啶，氨基水杨酸盐，6-巯基嘌呤，硫唑嘌呤，甲硝唑，脂肪加氧酶抑制剂，美沙拉秦，奥沙拉嗪，巴柳氮，抗氧化剂，血栓烷抑制剂，IL-1受体拮抗剂，抗IL-1β单克隆抗体，抗IL-6单克隆抗体，生长因子，弹性蛋白酶抑制剂，吡啶基-咪唑化合物，TNF、LT、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-18、IL-23、EMAP-II、GM-CSF、FGF和PDGF的抗体，CD2、CD3、CD4、CD8、CD-19、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD90或其配体的抗体，氨甲蝶呤，环孢菌素，FK506，雷帕霉素，霉酚酸酯，来氟洛米，NSAID，布洛芬，皮质类固醇，强的松龙，磷酸二酯酶抑制剂，腺苷激动剂，抗凝剂，补体抑制剂，肾上腺素能药，IRAK，NIK，IKK，p38，MAP激酶抑制剂，IL-1β转换酶抑制剂，TNFα转换酶抑制剂，T细胞信号传递抑制剂，金属蛋白酶抑制剂，柳氮磺吡啶，硫唑嘌呤，6-巯基嘌呤，血管紧张素转换酶抑制剂，可溶性细胞因子受体，可溶性p55 TNF受体，可溶性p75 TNF受体，sIL-1RI，sIL-1RII，sIL-6R，抗炎细胞因子，IL-4，IL-10，IL-11，IL-13和TGFβ。
[0025] 在本发明的另一方面，本文所述的治疗骨关节炎的方法包括通过至少一种选自以下的模式向个体施用一种或多种本文所述的结合蛋白或本文所述的组合物：肠胃外、皮下、肌内、静脉内、关节内(intra-articular)、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、结肠内、颈内、胃内、肝内、心肌内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸内、子宫内、膀胱内、推注(bolus)、阴道、直肠、口腔含化、舌下、鼻内、和经皮。
[0026] 在本发明的一个方面，用于治疗个体(人或其他哺乳动物)的疼痛的方法包括以下步骤：将结合IL-1α的结合蛋白与(例如在混合物中、通过连续施用或通过同时施用)结合IL-1β的结合蛋白组合施用于个体或将结合IL-1α和IL-1β两者的结合蛋白施用于个体。
[0027] 本发明的方法和组合物可用于治疗具有任何疼痛形式的个体的疼痛，包括来自癌症的疼痛、神经性疼痛、肌肉疼痛、关节疼痛、骨折疼痛、创伤疼痛、来自手术的疼痛、头痛、偏头痛以及疼痛状况，诸如异常疼痛(异常疼痛)、痛觉过敏和异常疼痛与痛觉过敏的组合。
[0028] 在一个实施方案中，用于治疗个体的疼痛的方法包括向该个体施用结合IL-1α的结合蛋白，其中该结合蛋白是IL-1α的抗体，例如IL-1α的单克隆抗体。在另一个实施方案中，用于治疗个体的疼痛的方法包括向该个体施用结合IL-1β的结合蛋白，其中该结合蛋白是结合IL-1β的抗体，例如结合IL-1β的单克隆抗体。
[0029] 在本发明的另一个方面，治疗个体的疼痛的方法包括以下步骤：向该个体施用结合IL-1α和IL-1β两者的结合蛋白。优选地，结合蛋白是双重可变结构域免疫球蛋白结合蛋白(在本文中也称为“DVD-Ig™”或“DVD-Ig”结合蛋白或分子)，其包含至少一个结合IL-1α的结合位点和至少一个结合IL-1β的结合位点。优选地，DVD-Ig结合蛋白包含两个结合IL-1α的结合位点和两个结合IL-1β的结合位点。
[0030] 在另一个实施方案中，本发明的用于治疗个体的疼痛的方法包括向该个体施用药物组合物，该药物组合物包含结合IL-1α的结合蛋白、结合IL-1β的结合蛋白、结合IL-1α的结合蛋白与结合IL-1β的结合蛋白的组合、或结合IL-1α和IL-1β两者的结合蛋白；和药学可接受的载体。
[0031] 在本发明的一个实施方案中，用于治疗疼痛的方法包括向个体施用结合IL-1α的结晶结合蛋白和结合IL-1β的结晶结合蛋白，或结合IL-1α和IL-1β两者的结晶结合蛋白。可用于本发明的所述结晶结合蛋白包括但不限于IL-1α的结晶抗体、IL-1β的结晶抗体和结合IL-1α和IL-1β两者的结晶DVD-Ig结合蛋白。
[0032] 可用于本发明的治疗个体的疼痛的方法中的组合物包括用于释放结合IL-1α的结晶结合蛋白、结合IL-1β的结晶结合蛋白、结合IL-1α的结晶结合蛋白与结合IL-1β的结晶结合蛋白的组合、或结合IL-1α和IL-1β两者的结晶结合蛋白的组合物。
[0033] 在一个实施方案中，可用于本发明的治疗疼痛的方法中的组合物包含：(a) 制剂，其中所述制剂包含结合IL-1α的结晶结合蛋白、结合IL-1β的结晶结合蛋白、结合IL-1α的结晶结合蛋白与结合IL-1β的结晶结合蛋白两者的组合、或结合IL-1α和IL-1β两者的结晶结合蛋白；和任选地，成分；和
(b) 至少一种聚合载体。
(b) 至少一种聚合载体。
[0034] 在一个实施方案中，上述组合物包含结合IL-1α的结晶结合蛋白与结合IL-1β的结晶结合蛋白两者的组合。在另一个实施方案中，结合IL-1α的结晶结合蛋白是结合IL-1α的结晶抗体，例如结晶单克隆抗体，且结合IL-1β的结晶结合蛋白是结合IL-1β的结晶抗体，例如单克隆抗体。
[0035] 在一个实施方案中，上述组合物包含结合IL-1α和IL-1β两者的结晶结合蛋白。在另一个实施方案中，结晶结合蛋白是结合IL-1α和IL-1β-Ig两者的结晶双重可变结构域(DVD-Ig)结合蛋白。
[0036] 在另一个实施方案中，用于治疗个体的疼痛的方法包括向该个体施用组合物，该组合物包含结合IL-1α的结晶结合蛋白、结合IL-1β的结晶结合蛋白、结合IL-1α的结晶结合蛋白与结合IL-1β的结晶结合蛋白两者的组合、或结合IL-1α和IL-1β两者的结晶结合蛋白；其中所述至少一种聚合载体是选自一种或多种由以下组成的组的聚合物：聚丙烯酸、聚氰基丙烯酸酯、聚氨基酸、聚酐、聚酯肽、聚酯、聚乳酸、乳酸-乙醇酸共聚物或PLGA、聚b-羟基丁酸酯、聚己内酯、聚二氧杂环己酮(poly(dioxanone))、聚乙二醇、聚(羟丙基)甲基丙烯酰胺、聚有机磷腈、聚原酸酯、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、马来酐-烷基乙烯基醚共聚物、pluronic多元醇、白蛋白、藻酸盐、纤维素和纤维素衍生物、胶原蛋白、血纤蛋白、明胶、透明质酸、寡糖、糖胺聚糖(glycaminoglycans)、硫酸化多糖、其掺合物及共聚物。
[0037] 在一个实施方案中，当任选的成分存在于上述组合物中时，该成分选自白蛋白、蔗糖、海藻糖、乳糖醇(lactitol)、明胶、羟丙基-β-环糊精、甲氧基聚乙二醇和聚乙二醇。
[0038] 在一个实施方案中，上述治疗疼痛的方法进一步包括向该个体施用第二种药剂，其中该第二种药剂向该方法或该方法中使用的组合物提供其他所需性质。该第二种药剂可以是由以下组成的组中的一种或多种分子：布地萘德，表皮生长因子，皮质类固醇，环孢菌素，柳氮磺吡啶，氨基水杨酸盐，6-巯基嘌呤，硫唑嘌呤，甲硝唑，脂肪加氧酶抑制剂，美沙拉秦，奥沙拉嗪，巴柳氮，抗氧化剂，血栓烷抑制剂，IL-1受体拮抗剂，抗IL-1β单克隆抗体，抗IL-6单克隆抗体，生长因子，弹性蛋白酶抑制剂，吡啶基-咪唑化合物，TNF、LT、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-18、IL-23、EMAP-II、GM-CSF、FGF和PDGF的抗体，CD2、CD3、CD4、CD8、CD-19、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD90或其配体的抗体，氨甲蝶呤，环孢菌素，FK506，雷帕霉素，霉酚酸酯，来氟洛米，NSAID，布洛芬，皮质类固醇，强的松龙，磷酸二酯酶抑制剂，腺苷激动剂，抗凝剂，补体抑制剂，肾上腺素能药，IRAK，NIK，IKK，p38，MAP激酶抑制剂，IL-1β转换酶抑制剂，TNFα转换酶抑制剂，T细胞信号传递抑制剂，金属蛋白酶抑制剂，柳氮磺吡啶，硫唑嘌呤，6-巯基嘌呤，血管紧张素转换酶抑制剂，可溶性细胞因子受体，可溶性p55 TNF受体，可溶性p75 TNF受体，sIL-1RI，sIL-1RII，sIL-6R，抗炎细胞因子，IL-4，IL-10，IL-11，IL-13和TGFβ。
[0039] 在本发明的另一方面，本文所述的治疗疼痛的方法包括通过至少一种选自以下的模式向个体施用一种或多种本文所述的结合蛋白或本文所述的组合物：肠胃外、皮下、肌内、静脉内、关节内(intra-articular)、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、结肠内、颈内、胃内、肝内、心肌内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸内、子宫内、膀胱内、推注(bolus)、阴道、直肠、口腔含化、舌下、鼻内、和经皮。
[0040] 在另一个实施方案中，本发明提供治疗患有与IL-1表达相关的疾病或病症的个体的疼痛的方法。个体中的该IL-1表达可导致个体血浆和/或局部组织中IL-1水平升高。
[0041] 在一个实施方案中，本文所述的方法和组合物用来治疗患有疾病或病症的个体的疼痛，所述疾病或病症选自骨关节炎、类风湿性关节炎、青少年慢性关节炎、脓毒性关节炎、莱姆关节炎、牛皮癣性关节炎、反应性关节炎、脊椎关节病、系统性红斑狼疮、克罗恩病、溃疡性结肠炎、炎性肠病、胰岛素依赖性糖尿病、甲状腺炎、哮喘、变应性疾病、牛皮癣、皮炎、硬皮病、移植物抗宿主病、器官移植排斥、与器官移植相关的急性或慢性免疫性疾病、肉状瘤病、动脉粥样硬化、弥散性血管内凝血、川崎氏病、Grave氏病、肾病综合症、慢性疲乏综合症、韦格纳氏肉芽肿病、Henoch-Schoenlein紫癜(Henoch-Schoenlein purpurea)、肾显微血管炎、慢性活动性肝炎、葡萄膜炎、脓毒性休克、中毒性休克综合症、脓毒病综合症、恶病质、感染病、寄生虫病、急性横贯性脊髓炎、亨廷顿氏舞蹈病、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、中风、原发性胆汁性肝硬变、溶血性贫血、恶性肿瘤、心力衰竭、心肌梗塞、阿狄森氏病、散发性多腺性I型缺乏、多腺性II型缺乏 (Schmidt氏综合症)、成人(急性)呼吸窘迫综合症、秃头、斑秃(alopecia areata)、血清反应阴性关节病、关节病、Reiter氏病、牛皮癣性关节病、溃疡性结肠炎性关节病、肠病性滑膜炎、衣原体相关性关节病、耶尔森氏菌相关性关节病、沙门氏菌相关性关节病、脊椎关节病、动脉粥样化疾病/动脉硬化、特应性变态反应、自身免疫性大疱性疾病、寻常天疱疮、落叶状天疱疮、类天疱疮、线性IgA疾病、自身免疫性溶血性贫血、Coombs阳性溶血性贫血、获得性恶性贫血、青少年性恶性贫血、肌痛脑炎/Royal Free疾病、慢性粘膜皮肤念珠菌病、巨细胞性动脉炎、原发性硬化性肝炎、隐原性自身免疫性肝炎、获得性免疫缺陷综合症、获得性免疫缺陷相关病、乙型肝炎、丙型肝炎、常见的各种免疫缺陷(常见的可变低丙种球蛋白血症)、扩张型心肌病、女性不育、卵巢衰竭、过早卵巢衰竭、纤维化肺疾病、隐原性纤维化肺泡炎、炎症后间质性肺病、间质性肺炎、结缔组织病相关性间质性肺病、混合型结缔组织病相关性肺病、全身性硬皮病相关性间质性肺病、类风湿性关节炎相关性间质性肺病、系统性红斑狼疮相关性肺病、皮肌炎/多肌炎相关性肺病、斯耶格伦氏病相关性肺病、强直性脊柱炎相关性肺病、脉管炎性弥散性肺病、含铁血黄素沉着病相关性肺病、药物诱导的间质性肺病、纤维化、放射性纤维化、闭塞性细支气管炎、慢性嗜酸性肺炎、淋巴细胞性浸润性肺病、感染后间质性肺病、痛风性关节炎、自身免疫性肝炎、1型自身免疫性肝炎(传统自身免疫性或狼疮样肝炎)、2型自身免疫性肝炎(抗LKM抗体肝炎)、自身免疫介导的低血糖、具有黑棘皮症的B型胰岛素抵抗、甲状旁腺机能减退、与器官移植相关的急性免疫性疾病、与器官移植相关的慢性免疫性疾病、骨关节病、原发性硬化性胆管炎、1型牛皮癣、2型牛皮癣、特发性白细胞减少(leucopaenia)、自身免疫性嗜中性白细胞减少症、肾脏病NOS、肾小球肾炎(glomerulonephritides)、肾显微血管炎、莱姆病、盘状红斑狼疮、特发性男性不育症或NOS、精子自身免疫性、多发性硬化(所有亚型)、交感性眼炎、结缔组织病继发的肺动脉高压、Goodpasture氏综合症、结节性多动脉炎的肺表现、急性风湿热、类风湿性脊椎炎、Still氏病、全身性硬皮病、斯耶格伦氏综合症、高安氏病/动脉炎、自身免疫性血小板减少症、特发性血小板减少症、自身免疫性甲状腺病、甲状腺机能亢进、甲状腺肿性(goitrous)自身免疫性甲状腺功能减退(桥本氏病)、萎缩性自身免疫性甲状腺功能减退、原发性粘液性水肿、晶状体性(phacogenic)葡萄膜炎、原发性血管炎、白癜风、急性肝病、慢性肝病、酒精性肝硬变、酒精诱导的肝损伤、胆汁郁积(cholestasis)、特应性肝病、药物诱导的肝炎、非酒精性脂肪性肝炎、变态反应、B群链球菌(GBS)感染、精神障碍(例如，抑郁和精神分裂症)、Th2型和Th1型介导的疾病、急性和慢性痛(不同形式的疼痛)、癌症诸如肺、乳腺、胃、膀胱、结肠、胰、卵巢、前列腺和直肠癌以及造血恶性肿瘤(白血病和淋巴瘤)、无β脂蛋白血症、手足发绀、急性和慢性寄生或感染过程、急性白血病、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓细胞样白血病(AML)、急性或慢性细菌感染、急性胰腺炎、急性肾功能衰竭、腺癌、心房(atrial)异位搏动、AIDS痴呆复征、酒精诱导的肝炎、变应性结膜炎、过敏性接触性皮炎、变应性鼻炎、同种异体移植物排斥、α-1-抗胰蛋白酶缺乏、肌萎缩性侧索硬化、贫血、心绞痛、前角细胞(horn cell)变性、抗-CD3治疗、抗磷脂综合症、抗受体超敏反应、主动脉和周围性动脉瘤(aneuryisms)、主动脉壁夹层形成、高动脉压、动脉硬化、动静脉瘘、共济失调、心房纤维颤动(持续性或阵发性)、心房扑动、房室传导阻滞、B细胞淋巴瘤、骨移植物排斥、骨髓移植(BMT)排斥、束支传导阻滞、Burkitt氏淋巴瘤、烧伤、心律失常、心脏震晕综合症、心脏肿瘤、心肌病、心肺分流术炎症应答、软骨移植排斥、小脑皮质变性、小脑病症、紊乱性或多源性房性心动过速、化学治疗相关病症、慢性髓细胞性白血病(CML)、慢性酒精中毒、慢性炎性病理学、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性阻塞性肺部疾病(COPD)、慢性水杨酸盐中毒、结肠直肠癌、充血性心力衰竭、结膜炎、接触性皮炎、肺源性心脏病、冠状动脉疾病、克雅氏病、培养物阴性脓毒病、囊性纤维化、细胞因子治疗相关病症、拳击员痴呆、脱髓鞘病、登革出血热、皮炎、皮肤病学状况、多尿症(diabetes)、糖尿病性动脉硬化性疾病、弥漫性Lewy小体病、扩张性充血性心肌病、基底神经节病症、中年唐氏综合症、由阻断CNS多巴胺受体的药物诱导的药物诱导的运动障碍、药物敏感性、湿疹、脑脊髓炎、心内膜炎、内分泌病、会厌炎、EB病毒感染、红斑性肢痛病、锥体外束和小脑病症、家族性噬血性淋巴组织细胞增多症、胎儿胸腺移植排斥、Friedreich氏共济失调、功能性外周性动脉病症、真菌性脓毒病、气性坏疽病、胃溃疡、肾小球肾炎、任何器官或组织的移植物排斥、革兰氏阴性脓毒病、革兰氏阳性脓毒病、由于细胞内生物的肉芽肿、毛细胞性白血病、Hallervorden-Spatz病、桥本氏甲状腺炎、枯草热、心脏移植排斥、血色素沉着症、血液透析、溶血性尿毒性综合症/血栓溶解性血小板减少性紫癜、出血、甲型肝炎、希氏束心律失常、HIV感染/HIV神经病、何杰金氏病、运动过度性运动障碍、超敏反应、超敏感性肺炎、高血压、运动机能减退性运动障碍、下丘脑-垂体-肾上腺轴评价、特发性阿狄森氏病、特发性肺纤维化、抗体介导的细胞毒性、虚弱、婴儿型脊髓性肌萎缩、主动脉炎症、甲型流行性感冒、电离辐射照射、虹膜睫状体炎/葡萄膜炎/视神经炎、缺血性再灌注损伤、缺血性中风、青少年类风湿性关节炎、青少年脊髓性肌萎缩、卡波西氏肉瘤、肾移植排斥、军团杆菌、利什曼病、麻风病、皮层脊髓系统损伤、脂肪水肿、肝移植排斥、淋巴水肿、疟疾、恶性淋巴瘤、恶性组织细胞增多症、恶性黑素瘤、脑膜炎、脑膜炎球菌血症、代谢性偏头痛、特发性偏头痛、线粒体多系统病症、混合型结缔组织病、单克隆丙种球蛋白病、多发性骨髓瘤、多系统变性(Menzel, Dejerine-Thomas, Shy-Drager, 和Machado-Joseph)、重症肌无力、鸟胞内分支杆菌、结核分支杆菌、骨髓异常增生综合症、心肌梗塞、心肌缺血性病症、鼻咽癌、新生儿慢性肺病、肾炎、肾变病、神经变性疾病、神经原性肌萎缩、嗜中性粒细胞减少性发热、非何杰金淋巴瘤、腹主动脉及其分支闭塞、闭塞性动脉病症、OKT3®治疗、睾丸炎/附睾炎(epididymitis)、睾丸炎/输精管切除术逆转术、器官巨大症、骨质疏松症、胰移植排斥、胰癌、恶性肿瘤的肿瘤相关综合症/高钙血症、甲状旁腺移植排斥、盆腔炎症性疾病、常年性鼻炎、心包疾病、外周性动脉粥样硬化疾病、外周血管病症、腹膜炎、恶性贫血、卡氏肺囊虫性肺炎、肺炎、POEMS综合症(多发性神经病、器官巨大症、内分泌病、单克隆丙种球蛋白病和皮肤变化综合症)、灌注后综合症、泵后综合症、MI心切开术后综合症、先兆子痫、进行性核上(supranucleo)麻痹、原发性肺动脉高压、放射治疗、Raynaud氏现象、Raynaud氏病、Refsum氏病、常规狭窄QRS心动过速、肾血管性高血压、再灌注损伤、限制性心肌病、肉瘤、老年性舞蹈病、Lewy小体型老年性痴呆、血清反应阴性关节病、中风、镰状细胞贫血、皮肤同种异体移植物排斥、皮肤变化综合症、小肠移植排斥、实体瘤、特殊心律失常、脊髓性共济失调、脊髓小脑变性、链球菌肌炎、小脑结构损伤、亚急性硬化性全脑炎、晕厥、心血管系统梅毒、全身性过敏反应(anaphalaxis)、全身炎症反应综合症、全身发作性青少年类风湿性关节炎、T细胞或FAB ALL、毛细血管扩张、血栓闭塞性脉管炎、血小板减少症、毒性、移植物、创伤/出血、III型超敏反应、IV型超敏反应、不稳定心绞痛、尿毒症、尿脓毒病、荨麻疹、心脏瓣膜疾病、静脉曲张、血管炎、静脉疾病、静脉血栓形成、心室纤维性颤动、病毒和真菌感染、病毒性脑炎/无菌性脑膜炎、病毒相关性噬红细胞(hemophagocytic)综合症、Wernicke-Korsakoff综合症、Wilson氏病、任何器官或组织的异种移植排斥、急性冠状动脉综合症、急性特发性多神经炎、急性炎性脱髓鞘性多发性神经根性神经病、急性缺血、成人Still氏病、斑秃、过敏反应、抗磷脂抗体综合症、再生障碍性贫血、动脉硬化、特应性湿疹、特应性皮炎、自身免疫性皮炎、与链球菌感染相关的自身免疫性病症、自身免疫性肠病、自身免疫性听力丧失、自身免疫性淋巴细胞增生综合症(ALPS)、自身免疫性心肌炎、自身免疫性过早卵巢衰竭、睑炎、支气管扩张、大疱性类天疱疮、心血管病、灾变性抗磷脂综合症、乳糜泻、颈椎关节强硬、慢性缺血、疤痕性类天疱疮、具有多发性硬化风险的临床孤立综合症(CIS)、儿童期发病性精神病、慢性阻塞性肺部疾病(COPD)、泪囊炎、皮肌炎、糖尿病性视网膜病、椎间盘突出、盘脱垂、药物诱导的免疫性溶血性贫血、心内膜炎、子宫内膜异位、眼内炎、巩膜外层炎、多形性红斑、重型多形性红斑、妊娠期类天疱疮、格林巴利综合症(GBS)、枯草热、Hughes综合症、特发性帕金森氏病、特发性间质性肺炎、IgE介导的变态反应、免疫性溶血性贫血、内含体肌炎、感染性眼炎性疾病、炎性脱髓鞘疾病、炎性心脏病、炎性肾病、IPF/UIP、虹膜炎、角膜炎、干燥性角膜结膜炎、Kussmaul病或Kussmaul-Meier病、Landry氏麻痹、朗格汉斯细胞组织细胞增多症、网状青斑、黄斑变性、显微镜下多脉管炎、白赫铁列夫症(Morbus Bechterev)、运动神经元病症、粘膜类天疱疮、多器官衰竭、重症肌无力、脊髓异常增生综合症、心肌炎、神经根障碍、神经病、非甲非乙型肝炎、视神经炎、骨质溶解、卵巢癌、少关节的JRA、周围动脉闭塞性疾病(PAOD)、周围血管疾病(PVD)、外周动脉疾病(PAD)、静脉炎、结节性多动脉炎(或结节性动脉外膜炎)、多软骨炎、风湿性多肌痛、白发症、多关节的JRA、多发性内分泌缺陷综合症、多肌炎、风湿性多肌痛(PMR)、泵后综合症、原发性帕金森综合症、前列腺癌和直肠癌和造血性恶性病(白血病和淋巴瘤)、前列腺炎、单纯红细胞再生障碍、原发性肾上腺机能不足、复发型视神经脊髓炎、再狭窄、风湿性心脏病、SAPHO(滑膜炎、痤疮、脓疱病、骨肥厚和骨炎)、继发性淀粉样变性、休克肺、巩膜炎、坐骨神经痛、继发性肾上腺机能不足、聚硅氧烷相关的结缔组织病、Sneddon-Wilkinson皮肤病、关节强硬性脊椎炎、Stevens-Johnson综合症(SJS)、全身性炎症应答综合症、颞动脉炎、弓形体视网膜炎、中毒性表皮坏死松解、横贯性脊髓炎、TRAPS(肿瘤坏死因子受体1型(TNFR)相关周期性综合症)、I型变态反应、II型糖尿病、荨麻疹、普通型间质性肺炎(UIP)、脉管炎、春季结膜炎、病毒性视网膜炎、Vogt-Koyanagi-Harada综合症(VKH综合症)、湿黄斑变性和伤口愈合。
[0042] 在一个实施方案中，本文所述的方法和组合物用于治疗患病个体的疼痛。根据权利要求16的治疗个体疼痛的方法，其中该个体患有选自以下的疾病：原发性癌症、转移性癌症、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、肺癌、口咽癌、下咽癌、食道癌、胃癌、胰癌、肝癌、胆囊癌、胆管癌、小肠癌、结肠癌、尿道癌、肾癌、膀胱癌、尿道上皮癌、女性生殖道癌、子宫颈癌、子宫癌、卵巢癌、绒毛膜癌、妊娠性滋养层细胞病、男性生殖道癌、前列腺癌、精囊癌、睾丸癌、生殖细胞肿瘤、内分泌腺癌、甲状腺癌、肾上腺癌、脑下垂体癌、皮肤癌、血管瘤，黑素瘤，肉瘤、骨癌、软组织癌、卡波西氏肉瘤、脑瘤、神经癌、眼癌、脑膜癌、星形细胞瘤、神经胶质瘤、成胶质细胞瘤、视网膜母细胞瘤、神经瘤、成神经细胞瘤、神经鞘瘤(Schwannomas)、脑膜瘤、从造血恶性肿瘤产生的实体瘤、白血病、何杰金淋巴瘤、非何杰金淋巴瘤。
[0044] 图1B显示DVD1-Ig、DVD2-Ig和两个嵌合单特异性单克隆抗体2D13.E3(抗IL-1α)和13F5.G5(抗IL-1β)的基因构建体的示意图。“VHβ”和“VLβ”分别表示结合IL-β的13F5.G5抗体的抗原结合位点的重链可变结构域和轻链可变结构域。“VHα”和“VLα”分别表示结合IL-1α的3D12.E3抗体的重链可变结构域和轻链可变结构域。“L”表示前导序列。在DVD2-Ig的基因构建体图中，“VHβ”与“VHα”之间和“VLβ”与“VLα”之间的水平标记表示存在接头序列。
[0045] 图2显示小鼠骨关节炎的关节不稳定模型(JIM)中关节软骨的的组织学评分条形图。各组条形图提供四个处理组中小鼠膝中的关节软骨的评分：仅用磷酸盐缓冲盐水(PBS)媒介物处理("PBS”)、用抗IL-1α单克隆抗体处理(“抗IL-1α mAb”)、用抗IL-1β单克隆抗体处理(“抗IL-1β mAb”)和用抗IL-1α单克隆抗体与抗IL-1β单克隆抗体的组合处理(“抗IL-1α mAb +抗IL-1β mAb”)。各组内的个别条形图显示组织学总得分和三个独立区的得分，其中各区是胫骨内侧软骨区域的三分之一(区1：内部区，区2：中间区，和区3：外部区)。自左至右：胫骨内侧区1、2和3总得分的条形图；胫骨内侧区1得分的条形图；胫骨内侧区2得分的条形图；和胫骨内侧区3得分的条形图。参见实施例3.3.1。
[0046] 图3显示小鼠骨关节炎的关节不稳定模型(JIM)中关节软骨的的组织学评分条形图。各组条形图提供四个处理组中小鼠膝中的关节软骨的评分：仅用PBS媒介物处理(“媒介物”)、用抗IL-1α单克隆抗体与抗IL-1β单克隆抗体的组合处理(“抗IL-1α mAb(6 mg/kg)+抗IL-1β mAb(6 mg/kg)")、用mIL-1α/β DVD-Ig结合蛋白以6 mg/kg进行处理("IL-1α/β DVD-Ig(6 mg/kg)")和用mIL-1α/β DVD-Ig结合蛋白以12 mg/kg进行处理("IL-1α/β DVD-Ig(12 mg/kg)")。各组内的个别条形图显示组织学总得分和三个独立区的得分，其中各区是胫骨内侧软骨区域的三分之一(区1：内部区，区2：中间区，和区3：外部区)。自左至右：胫骨内侧区1、2和3总得分的条形图；胫骨内侧区1得分的条形图；胫骨内侧区2得分的条形图；和胫骨内侧区3得分的条形图。参见实施例3.3.2。
[0047] 图4显示小鼠骨关节炎的关节不稳定模型(JIM)中关节软骨的的组织学评分条形图。各组条形图提供四个处理组中小鼠膝中的关节软骨的评分：仅用PBS媒介物处理("媒介物")、用抗IL-1α单克隆抗体(6 mg/kg)与抗IL-1β单克隆抗体(6 mg/kg)的组合处理(“抗IL-1α mAb(6 mg/kg)+抗IL-1β mAb(6 mg/kg)")、用抗IL-1β单克隆抗体(12 mg/kg)处理(“抗IL-1β mAb(12 mg/kg)")、用抗IL-1β单克隆抗体(6 mg/kg)处理(“抗IL-1β mAb(6 mg/kg)")和用抗IL-1β单克隆抗体(3 mg/kg)处理(“抗IL-1β mAb(3 mg/kg)")。各组内的个别条形图显示组织学总得分和三个独立区的得分，其中各区是胫骨内侧软骨区域的三分之一(区1：内部区，区2：中间区，和区3：外部区)。自左至右：胫骨内侧区1、2和3总得分的条形图；胫骨内侧区1得分的条形图；胫骨内侧区2得分的条形图；和胫骨内侧区3得分的条形图。参见实施例3.3.3。
[0048] 图5显示在骨关节炎的关节不稳定模型中，当仅用PBS媒介物("媒介物")、用抗IL-1α单克隆抗体(6 mg/kg)与抗IL-1β单克隆抗体(6 mg/kg)的组合(“抗IL-1α mAb(6 mg/kg)+抗IL-1β mAb(6 mg/kg)")、用6 mg/kg的mIL-1α/β DVD-Ig结合蛋白("IL-1α/β DVD(6 mg/kg)")和12 mg/kg的mIL-1α/β DVD-Ig结合蛋白("IL-1α/β DVD(12 mg/kg)")处理时，动物中酵母聚糖诱导的IL-6产生的水平(pg/ml)。参见实施例3.3.4。
[0049] 图6显示在骨关节炎的内侧半月板去稳定(DMM)模型中，用PBS媒介物("媒介物")、抗IL-1α单克隆抗体(6 mg/kg)与抗IL-1β单克隆抗体(6 mg/kg)的组合(“抗IL-1α mAb(6 mg/kg)+抗IL-1β mAb(6 mg/kg)")和6 mg/kg的mIL-1α/β DVD-Ig结合蛋白("IL-1α/β DVD(6 mg/kg)")处理时，动物中软骨退化的总得分总和。参见实施例3.3.5。
[0050] 图7显示在骨关节炎的内侧半月板去稳定(DMM)模型中，各种处理对于动物软骨退化的8周研究结果。各条形图表明仅用PBS媒介物("媒介物")、用抗IL-1α单克隆抗体(6 mg/kg)(“抗IL-1α mAb 6 mg/kg")、用抗IL-1β单克隆抗体(6 mg/kg)(“抗IL-1β6 mg/kg")、用抗IL-1α单克隆抗体(6 mg/kg)与抗IL-1β单克隆抗体(6 mg/kg)的组合(“抗IL-1α mAb(6mg/kg)+抗IL-1β mAb(6 mg/kg)")、用1.5 mg/kg的mIL-1α/β DVD-Ig结合蛋白("IL-1α/β DVD 1.5 mg/kg")、用3 mg/kg的mIL-1α/β DVD-Ig结合蛋白("IL-1α/β DVD 3 mg/kg")或用6 mg/kg的mIL-1α/β DVD-Ig结合蛋白("IL-1α/β DVD 6 mg/kg")处理时，动物的软骨退化平均得分总和。参见实施例3.3.6。
[0051] 图8显示在骨关节炎的内侧半月板去稳定(DMM)模型中，仅用媒介物("媒介物")、用多西环素(30 mg/kg)("多西环素(30 mg/kg)")或用抗IL-1α单克隆抗体(6 mg/kg)与抗IL-1β单克隆抗体(6 mg/kg)的组合(“抗IL-1α mAb(6 mg/kg)+抗IL-1β mAb(6 mg/kg)")处理动物的4周研究结果。参见实施例3.3.7。
[0052] 图9显示经DMM手术的小鼠的爪在第7、14、21、28和35天的缩爪阈值(克，"g")条形图。DMM爪("DMM")的缩爪阈值与对侧(未手术)爪("对侧")和假手术("假")的爪相比显著减小。DMM爪早在第7天即出现异常疼痛且直至第35天展现该疼痛行为。参见实施例4。
[0053] 图10显示DMM小鼠在仅用媒介物("PBS对照")、用IgG同种型对照(确定疾病和疼痛的阳性对照，"IgG对照")、或用抗IL-1α单克隆抗体与抗IL-1β单克隆抗体的组合(“抗IL-1α mAb(6 mg/kg)+抗IL-1β mAb(6 mg/kg)")处理5周后(第35天)与对侧(未手术)爪("对侧")和假手术("假")爪相比的缩爪阈值(克，"g")条形图。数据表明中和IL-1α和IL-1β两者显著预防异常疼痛的发展。处理动物在一周后观察到类似效力(未显示)。参见实施例4。
[0054] 图11显示先前用IgG同种型对照(确定疾病和疼痛的阳性对照)处理35天且随后用抗IL-1α单克隆抗体或抗IL-1β单克隆抗体的组合给药并在第36天测试24小时后的缩爪阈值(“抗IL-1α mAb(6 mg/kg)+抗IL-1β(6 mg/kg)(给药后24小时)")的DMM小鼠的缩爪阈值(克，"g")条形图。为了对比，在5周后(第35天)提供对侧(未手术)爪("对侧")、假手术爪("假")、仅用媒介物处理("PBS对照")、用IgG同种型处理("IgG对照")和用抗IL-1α单克隆抗体与抗IL-1β单克隆抗体的组合处理的手术爪(“抗IL-1α mAb(6 mg/kg)+抗IL-1β mAb(6 mg/kg)")的第35天的缩爪阈值。数据表明中和IL-1α和IL-1β两者显著逆转具有确定疼痛的小鼠的异常疼痛。参见实施例4。
[0055] 图12显示每周两次腹膜内(ip)施用仅PBS媒介物("媒介物")、抗IL-1α单克隆抗体(6 mg/kg)(“抗IL-1α mAb(6 mg/kg)")、抗IL-1β单克隆抗体(6 mg/kg)(“抗IL-1β mAb(6 mg/kg)")、或抗IL-1α单克隆抗体(6 mg/kg)与抗IL-1β单克隆抗体(6 mg/kg)的组合(“抗IL-1α mAb(6 mg/kg)+抗IL-1β mAb(6 mg/kg)")处理持续4周的DMM小鼠的缩爪阈值(克，"g")条形图。在第28天测试动物的异常疼痛。"对侧"条形图提供代表性未手术(对侧)肢的缩爪阈值。用媒介物处理的组中动物的同侧(手术)肢与对侧(未手术)肢相比或与已进行假手术的动物("假")相比呈现异常疼痛(疼痛)。参见实施例5。
[0056] 图13显示仅用PBS媒介物("媒介物")处理或用抗IL-1α单克隆抗体与抗IL-1β单克隆抗体的组合处理时，两者都每4日以1 mg/kg(“抗IL-1α mAb(1 mg/kg)+抗IL-1β mAb(1 mg/kg)")、3 mg/kg(“抗IL-1α mAb(3 mg/kg)+抗IL-1β mAb(3 mg/kg)")或6 mg/kg(“抗IL-1α mAb(6 mg/kg)+抗IL-1β mAb(6 mg/kg)")腹膜内(ip)施用4周的DMM小鼠的缩爪阈值(克，"g")条形图。在第28天测试动物。仅用PBS媒介物处理的组中动物的同侧(手术)肢与对侧(未手术)肢相比或与已进行假手术的动物("假")相比呈现异常疼痛(疼痛)。结果显示用抗IL-1α单克隆抗体与抗IL-1β单克隆抗体的组合的处理以剂量相关方式预防DMM小鼠中的异常疼痛的发展。参见实施例6。
[0057] 图14显示当患有确定骨关节炎和机械性异常疼痛的DMM小鼠在第27天用抗IL-1α单克隆抗体与抗IL-1β单克隆抗体的组合处理时的缩爪阈值(克，"g")条形图，两者都在第28天测试异常疼痛之前24小时以1 mg/kg(“抗IL-1α mAb(1 mg/kg)+抗IL-1β mAb(1 mg/kg)")、3 mg/kg(“抗IL-1α mAb(3 mg/kg)+抗IL-1β mAb(3 mg/kg)")或6 mg/kg(“抗IL-1α mAb(6 mg/kg)+抗IL-1β mAb(6 mg/kg)")腹膜内(ip)施用。用媒介物处理的组("媒介物")中动物的同侧(手术)肢与对侧(未手术)肢相比或与已进行假手术的动物("假")相比呈现异常疼痛(疼痛)。结果显示用抗IL-1α单克隆抗体与抗IL-1β单克隆抗体的组合的处理以剂量相关方式逆转患有确定疾病的DMM小鼠的确定异常疼痛。参见实施例7。
[0058] 图15显示在小鼠角叉菜胶诱导的炎性疼痛(痛觉过敏)模型中，动物的缩爪潜伏期(秒，"s”)条形图。在角叉菜胶足底注射后30小时，仅用抗IL-1α单克隆抗体(900 μg)(“抗IL-1α mAb”)、仅用抗IL-1β单克隆抗体(900 μg)(“抗IL-1β mAb”)、用抗IL-1α单克隆抗体(900 μg)与抗IL-1β单克隆抗体(900 μg)的组合(“抗IL-1α mAb +抗IL-1β mAb”)、用PBS媒介物("PBS”)或用IgG同种型对照("IgG")处理小鼠。另一组在角叉菜胶足底施用后47和95小时施用一个剂量(30 mg/kg)双氯芬酸(非类固醇抗炎镇痛对照)。在足底施用角叉菜胶后48小时(图15A)和96小时(图15B)使用辐射热刺激进行热痛觉过敏测试。实心条形图显示对照爪(无角叉菜胶)的缩爪潜伏期。空心条形图显示施用角叉菜胶的爪的缩爪潜伏期。参见实施例8。
[0059] 图16显示在小鼠角叉菜胶诱导的小鼠炎性疼痛(痛觉过敏)模型中，动物的缩爪潜伏期(秒，"s”)条形图。在角叉菜胶足底注射后30小时，用媒介物("PBS”)、用IgG同种型对照("IgG")或用抗IL-1α单克隆抗体与抗IL-1β单克隆抗体的组合的三种剂量中的一种处理小鼠，其中各单克隆抗体以100 μg(“抗IL-1α mAb(100 μg)+抗IL-1β mAb(100 μg)")、300 μg(“抗IL-1α mAb(300 μg)+抗IL-1β mAb(300 μg)")或900 μg(“抗IL-1α mAb(900 μg)+抗IL-1β mAb(900 μg)")施用。另一组在角叉菜胶足底施用后47和95小时施用一个剂量(30 mg/kg)双氯芬酸(非类固醇抗炎镇痛阳性对照)。在足底施用角叉菜胶后在48小时(图16A)和96小时(图16B)使用辐射热刺激进行热痛觉过敏测试。实心条形图显示对照爪(无角叉菜胶)的缩爪潜伏期。空心条形图显示施用角叉菜胶的爪的缩爪潜伏期。参见实施例9。
[0060] 图17显示在小鼠CFA("完全弗氏佐剂")炎性疼痛模型中，抗IL-1α单克隆抗体与抗IL-1β单克隆抗体组合治疗的测试结果。在CFA足底注射后30小时，用抗IL-1α单克隆抗体(900 μg)与抗IL-1β单克隆抗体(900 μg)的组合、用PBS媒介物("PBS”)或用IgG同种型对照("IgG")处理小鼠。另一组在CFA足底施用后47小时施用一个剂量(30 mg/kg)双氯芬酸(非类固醇抗炎镇痛阳性对照)。在CFA施用后48小时使用von Frey单丝进行动物机械性异常疼痛测试。图17A显示缩爪阈值(克，"g")条形图。实心条形图显示对侧(无CFA)对照爪的缩爪阈值。空心条形图显示在处理组动物中施用CFA的爪的缩爪阈值。图17B显示处理组动物的效力量级(MPE%)条形图。参见实施例10。
[0061] 图18显示神经痛的L5/L6脊神经结扎(SNL)小鼠模型动物中的缩爪阈值(克，"g")条形图。在SNL手术后第6天，用抗IL-1α单克隆抗体(900 μg)与抗IL-1β单克隆抗体(900 μg)的组合(“抗IL-1α mAb+抗IL-1β mAb”)、用PBS媒介物("PBS”)或用IgG同种型对照("IgG")处理动物。在SNL手术后24小时(图18A)和72小时(图18B)使用von Frey单丝进行动物机械性异常疼痛测试。在测试之前1小时用加巴喷丁(100 mg/kg，"加巴喷丁")处理另一组作为阳性对照。参见实施例11。
[0062] 图19显示如图18所述的动物处理组在24和72小时的效力量级(MPE%)条形图。"媒介物"表示用PBS媒介物处理的SNL动物。"IgG"表示用IgG同种型对照处理的SNL动物。"IL-1αβ”表示用抗IL-1α单克隆抗体(900 μg)与抗IL-1β单克隆抗体的组合处理的动物。参见实施例11。
[0063] 发明详述本发明基于以下发现：阻断白介素-1(IL-1)的功能可以是治疗个体(人或其他哺乳动物)的骨关节炎(OA)的有效手段。根据本发明，为了治疗OA阻断IL-1功能可通过向个体施用一种或多种结合IL-1α和IL-1β的蛋白来实现。该“双重特异性”治疗可通过向OA患者施用结合IL-1α的结合蛋白(例如抗体)和结合IL-1β的结合蛋白(例如抗体)或通过施用结合IL-1α和IL-1β两者的多价和多特异性结合蛋白来实现。可用于本发明的该多价和多特异性结合蛋白包括双重可变结构域免疫球蛋白结合蛋白(在本文中也称为“DVD-Ig™”或“DVD-Ig”结合蛋白或分子)。参见例如PCT公开号WO 2007/024715和Wu等人, (2007) Nature Biotech. 25(11): 1290-1297。IL-1α结合蛋白与IL-1β结合蛋白的特定组合或结合IL-1α和IL-1β两者的特异性DVD-Ig分子是否可用于治疗OA可以使用OA动物模型来评估，诸如OA的关节不稳定模型(JIM)或OA的内侧半月板去稳定(DMM)模型(Glasson等人, (2007) Osteoarthrit. Cart. 15(9):1061-9)。
[0064] 除非本文另有定义，连同本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。术语的含义和范围应当清晰，然而，在任何潜在不明确性的情况下，本文提供的定义优先于任何字典或外来定义。此外，除非上下文另有要求，单数术语应包括复数，且复数术语应包括单数。在本申请中，除非另有说明，术语“或”的使用意味着“和/或”。此外，术语“包括”及其他形式，诸如“包括”和“包括”的使用是非限制性的。同样，除非另有具体说明，术语诸如“元件”或“组分”涵盖包含一个单位的元件和组分以及包含超过一个亚单位的元件和组分。
[0065] 一般地，连同本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学、蛋白和核酸化学以及核酸杂交使用的命名法和其技术是本领域众所周知和通常使用的那些。除非另有说明，本发明的方法和技术一般根据本领域众所周知，且如各种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法来进行，所述参考文献在本说明书自始至终引用和讨论。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书、如本领域通常实现的或如本文所述来进行。连同本文描述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学使用的命名法、以及其实验室程序和技术是本领域众所周知和通常使用的那些。使用标准技术用于化学合成、化学分析、药物制备、配制、和递送、以及患者治疗。
[0066] 为了本发明可以更容易地理解，选择的术语在下文定义。
[0067] 术语“多肽”意指氨基酸的任何聚合链。术语“肽”和“蛋白”可与术语多肽互换使用，且同样指氨基酸的聚合链。术语“多肽”包含天然或人工蛋白、蛋白片段和蛋白序列的多肽类似物。多肽可以是单体或聚合的。
[0068] 术语“分离的蛋白”或“分离的多肽”意指这样的蛋白或多肽，其由于其衍生起源或来源不与天然结合的组分结合，所述天然结合的组分在其天然状态下与其伴随；基本上不含来自相同物种的其他蛋白；由来自不同物种的细胞表达；或在自然界中不存在。因此，化学合成或在不同于其天然起源的细胞的细胞系统中合成的多肽将是与其天然结合的组分“分离的”。还可以通过分离，使用本领域众所周知的蛋白纯化技术，使得蛋白基本上不含天然结合的组分。
[0069] 术语“回收”意指通过分离，例如使用本领域众所周知的蛋白纯化技术，使得化学种类诸如多肽基本上不含天然结合的组分的过程。
[0070] 术语“人IL-1α”(本文也缩写为"hIL-1α" 或 "IL-1α")包括参与各种免疫应答、炎症过程和血细胞生成的多效细胞因子。例如，IL-1α包括由活化的巨噬细胞所产生的人细胞因子；其通过诱导IL-2释放、B细胞成熟和增殖以及成纤维细胞生长因子活性来刺激胸腺细胞增殖。术语"人IL-1α" 预期包括可以通过标准重组表达方法制备的重组人IL-1α("rh IL-1α")。
[0071] 术语“人IL-1β”(本文也缩写为"hIL-1β", 或"IL-1β")包括参与各种免疫应答、炎症过程和血细胞生成的多效细胞因子。术语人"IL-1β" 包括可以通过标准重组表达方法制备的重组人IL-1β ("rh IL-1β")。
[0072] 人IL-1α 和IL-1β的氨基酸序列显示在表1中。
[0073] 表1：人IL-1α和IL-1β的序列
[0074] 术语“生物学活性”指细胞因子的所有固有生物学性质。IL-1α和IL-1β的生物学性质包括但不限于结合IL-1受体。
[0075] 术语“生物学活性”指IL-1α的所有固有生物学性质。IL-1α的生物学性质包括但不限于结合IL-1α受体；通过诱导IL-2释放、B细胞成熟和增殖和成纤维细胞生长因子活性刺激胸腺细胞增殖。
[0076] 关于抗体、蛋白、或肽与第二种化学种类相互作用的术语“特异性结合”或“特异地结合”，意指相互作用取决于化学种类上特定结构(例如，抗原决定簇或表位)的存在；例如，抗体识别且与特定蛋白结构结合而不是一般地与蛋白结合。如果抗体对表位“A”特异，那么在包含标记的“A”和抗体的反应中，包含表位A的分子(或游离的，未标记的A)的存在将减少与抗体结合的标记的A的量。
[0077] 术语“抗体”广泛地指由4条多肽链－2条重(H)链和2条轻(L)链组成的任何免疫球蛋白(Ig)分子，或其保留Ig分子的基本表位结合特征的任何功能片段、突变体、变体或衍生物。此种突变体、变体或衍生抗体形式是本领域已知的，其非限制性实施方案在下文讨论。
[0078] 在全长抗体中，每条重链由重链可变区(本文缩写为HCVR或VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由3个结构域CH1、CH2和CH3组成。每条轻链由轻链可变区(本文缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由1个结构域CL组成。VH和VL区可以进一步细分成称为互补性决定区(CDR)的高变区，用称为构架区(FR)的较保守区域点缀。每个VH和VL由3个CDRs和4个FRs组成，以下列顺序从氨基末端到羧基末端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。免疫球蛋白分子可以是任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、种类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。
[0079] 术语抗体的“抗原结合部分”指保留与抗原(例如，hIL-1α)特异性结合的能力的一种或多种抗体片段。抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段来进行。此种抗体实施方案也可以具有双特异性、双重特异性、或多特异性形式，与2种或更多不同抗原特异性结合。包含在术语抗体的“抗原结合部分”内的结合片段的实例包括(i)Fab片段，其是由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii) F(ab')2片段，其是包含在铰链区由二硫键连接的2个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段，(v)dAb片段(Ward等人 (1989) Nature 341:544-546, PCT公开号WO 90/05144)，其包含单个可变结构域；和(vi)分离的互补性决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段的2个结构域VL和VH由分开的基因编码，但它们可以使用重组方法通过合成接头来连接，所述合成接头使得它们能够作为单条蛋白链制备，在所述单条蛋白链中VL和VH区配对以形成单价分子 (称为单链Fv (scFv)；参见例如Bird等人(1988) Science242:423-426；和Huston等人(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883)。此种单链抗体(scFvs)也预期包含在术语抗体的“抗原结合部分”内。也包含其他形式的单链抗体诸如双抗体。双抗体是二价、双特异性抗体，其中VH和VL结构域在单条多肽链上表达，但使用的接头太短而不允许相同链上的2个结构域之间的配对，从而促使结构域与另一条链的互补结构域配对且产生2个抗原结合位点(参见例如，Holliger等人(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448；Poljak等人(1994) Structure 2:1121-1123)。
此种抗体结合部分是本领域已知的(Kontermann和Dübel 编辑，Antibody Engineering (Springer-Verlag, New York, 2001) (ISBN 3-540-41354-5))。
此种抗体结合部分是本领域已知的(Kontermann和Dübel 编辑，Antibody Engineering (Springer-Verlag, New York, 2001) (ISBN 3-540-41354-5))。
[0080] 术语“抗体构建体”指包含与接头多肽或免疫球蛋白恒定结构域连接的一个或多个本发明的抗原结合部分的多肽。接头多肽包含通过肽键连接的2个或更多氨基酸残基，且用于连接一个或多个抗原结合部分。此种接头多肽是本领域众所周知的(参见例如，Holliger等人(1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448；Poljak等人(1994)Structure 2:1121-1123)。免疫球蛋白恒定结构域指重或轻链恒定结构域。人IgG重链(γ)和轻链(κ和λ)恒定结构域氨基酸序列是本领域已知的，并表示于表2中。
[0081] 表2: 人IgG重和轻链恒定结构域的序列
[0082] 另外，抗体或其抗原结合部分可以是较大的免疫粘附分子的一部分，所述免疫粘附分子通过抗体或其抗原结合部分与一个或多个其他蛋白或肽的共价或非共价结合形成。这种免疫粘附分子的实例包括使用链霉抗生物素蛋白核心区以制备四聚scFv分子(Kipriyanov, S.等人(1995) Human Antibod. Hybridomas 6:93-101)以及使用半胱氨酸残基、标记肽和C末端聚组氨酸标签以制备二价和生物素化scFv分子(Kipriyanov, S. 等人(1994) Mol. Immunol. 31:1047-1058)。可以使用常规技术例如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶分别消化整个抗体，从整个抗体制备抗体的抗原结合部分例如Fab和F(ab')2片段。此外，可以使用如本文所述的标准重组DNA技术获得抗体、其抗原结合部分和免疫粘附分子。
[0083] “分离的抗体”指基本不含其他具有不同抗原特异性的抗体的抗体(例如，特异性结合hIL-1α的分离的抗体基本不含与除hIL-1α外的抗原特异性结合的抗体)。然而，特异性结合hIL-1α的分离的抗体可以与其他抗原(诸如来自其他物种的hIL-1α分子)具有交叉反应性。另外，分离的抗体可基本不含其他细胞材料和/或化学试剂。
[0084] 术语“人抗体”包括具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区的抗体。本发明的人抗体可以包括例如在CDRs且特别是CDR3中，不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，在体外通过随机或位点特异性诱变或在体内通过体细胞突变引入的突变)。然而，术语“人抗体”不包括其中来源于另一种哺乳动物物种诸如小鼠种系的CDR序列已嫁接到人构架序列上的抗体。
[0085] 术语“重组人抗体”包括通过重组方法制备、表达、产生或分离的所有人抗体，诸如使用转染到宿主细胞内的重组表达载体表达的抗体(在下文部分II C中进一步描述)，从重组、组合人抗体文库中分离的抗体(Hoogenboom, H. (1997) Trends Biotechnol.15: 62-70; Azzazy和Highsmith (2002) Clin. Biochem. 35: 425-445; Gavilondo和Larrick (2000) BioTechniques 29:128-145; Hoogenboom和Chames (2000) Immunol. Today 21: 371-378 )，从对于人免疫球蛋白基因是转基因的动物(例如小鼠)中分离的抗体 (参见例如，Taylor等人(1992) Nucl. Acids Res. 20: 6287-6295; Kellermann和Green (2002) Curr. Opin. Biotechnol. 13: 593-597; Little等人(2000) Immunol. Today 21:364-370) 或通过包括使人免疫球蛋白基因序列与其他DNA序列剪接的任何其他方法制备、表达、产生或分离的抗体。此种重组人抗体具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区。然而，在某些实施方案中，对此种重组人抗体实施体外诱变(或，当使用对于人Ig序列转基因的动物时，体内体细胞诱变)，且因此重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是，尽管来源于人种系VH和VL序列且与人种系VH和VL序列相关，但可能在体内的人抗体种系所有组成成分内非天然存在的序列。
[0086] 术语“嵌合抗体”指包含来自一个物种的重和轻链可变区序列以及来自另一个物种的恒定区序列的抗体，诸如具有与人恒定区连接的鼠重和轻链可变区的抗体。
[0087] 术语“CDR嫁接的抗体”指包含来自一个物种的重和轻链可变区序列的抗体，但其中VH和/或VL区的一个或多个CDR区域的序列用另一个物种的CDR序列替换，诸如具有人重和轻链可变区的抗体，其中一个或多个人CDRs(例如，CDR3)已用鼠CDR序列替换，例如如得自针对人IL-1α的鼠单克隆抗体。
[0088] 如本文使用，术语“CDR”指在抗体可变序列内的互补性决定区。在重链和轻链的每个可变区中存在3个CDRs，所述CDRs对于每个可变区命名为CDR1、CDR2和CDR3。如本文使用，术语“CDR组”指在抗原结合位点的单个可变区(即，VH或VL)中出现的3个CDRs的组。这些CDRs的确切边界已根据不同系统不同地限定。由(Kabat等人(1987, 1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland) 描述的系统，不仅提供了可应用于抗体的任何可变区的明确残基编号系统，还提供了限定3个CDRs的精确残基边界。这些CDRs可以被称为Kabat CDRs。Chothia和同事(Chothia和Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917以及Chothia等人(1989) Nature 342: 877-883) 发现Kabat CDRs内的某些亚部分采取几乎相同的肽主链构象，尽管在氨基酸序列水平上具有大的多样性。这些亚部分命名为L1、L2和L3或H1、H2和H3，其中“L”和“H”分别指轻链和重链区域。这些区域可以被称为Chothia CDRs，所述Chothia CDRs具有与Kabat CDRs重叠的边界。与Kabat CDRs重叠的限定CDRs的其他边界已由Padlan等人(1995) FASEB J. 9: 133-139 和 MacCallum (1996) J. Mol. Biol.
262(5): 732-745)描述。再其他的CDR边界定义可能不严格地遵循上述系统之一，但仍将与Kabat CDRs重叠，尽管根据特定残基或残基组或甚至整个CDRs并不显著影响抗原结合的预测或实验发现，它们可以缩短或加长。本文使用的方法可以利用根据这些系统中的任何一种限定的CDRs，尽管某些实施方案使用Kabat或Chothia限定的CDRs。
262(5): 732-745)描述。再其他的CDR边界定义可能不严格地遵循上述系统之一，但仍将与Kabat CDRs重叠，尽管根据特定残基或残基组或甚至整个CDRs并不显著影响抗原结合的预测或实验发现，它们可以缩短或加长。本文使用的方法可以利用根据这些系统中的任何一种限定的CDRs，尽管某些实施方案使用Kabat或Chothia限定的CDRs。
[0089] 术语“Kabat编号”、“Kabat定义”和“Kabat标记”本文可互换使用。这些术语指氨基酸残基编号系统，所述氨基酸残基比抗体或其抗原结合部分的重和轻链可变区中的其他氨基酸残基更可变(即高变)(Kabat等人 (1971) (1971) Ann. NY Acad. Sci. 190:382-391和Kabat, E.等人(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242)。对于重链可变区，高变区对于CDR1为氨基酸位置31－35，对于CDR2为氨基酸位置50－65，且对于CDR3为氨基酸位置95－102。对于轻链可变区，高变区对于CDR1为氨基酸位置24－34，对于CDR2为氨基酸位置50－56，且对于CDR3为氨基酸位置89－
97。
97。
[0090] 经过过去20年可变重和轻区域的氨基酸序列的广泛公共数据库的增长和分析已导致在可变区序列内的构架区(FR)和CDR序列之间的一般边界的理解，并且使得本领域技术人员能够精确地确定根据Kabat编号、Chothia编号或其他系统的CDRs。参见例如，Martin, "Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains," Kontermann and Dübel，编 辑，Antibody Engineering (Springer-Verlag, Berlin,2001)，第31章，第432-433页。确定可变重(VH)和可变轻(VL)区域的氨基酸序列内Kabat CDRs的氨基酸序列的有用方法在下文提供：
为了鉴定CDR-L1氨基酸序列：
由VL区的氨基末端约24个氨基酸残基开始；
在CDR-L1序列前的残基总是半胱氨酸(C)；
在CDR-L1序列后的残基总是色氨酸(W)残基，一般是Trp-Tyr-Gln (W-Y-Q)，但也是Trp-Leu-Gln (W-L-Q)、Trp-Phe-Gln (W-F-Q)、和Trp-Tyr-Leu (W-Y-L)；
长度一般是10 – 17个氨基酸残基。
为了鉴定CDR-L1氨基酸序列：
由VL区的氨基末端约24个氨基酸残基开始；
在CDR-L1序列前的残基总是半胱氨酸(C)；
在CDR-L1序列后的残基总是色氨酸(W)残基，一般是Trp-Tyr-Gln (W-Y-Q)，但也是Trp-Leu-Gln (W-L-Q)、Trp-Phe-Gln (W-F-Q)、和Trp-Tyr-Leu (W-Y-L)；
长度一般是10 – 17个氨基酸残基。
[0091] 为了鉴定CDR-L2氨基酸序列：在CDR-L1结束后总是16个残基开始；
在CDR-L2序列前的残基一般是Ile-Tyr (I-Y)，但也是Val-Tyr (V-Y)、Ile-Lys
(I-K)、和Ile-Phe (I-F)；
长度总是7个氨基酸残基。
在CDR-L2序列前的残基一般是Ile-Tyr (I-Y)，但也是Val-Tyr (V-Y)、Ile-Lys
(I-K)、和Ile-Phe (I-F)；
长度总是7个氨基酸残基。
[0092] 为了鉴定CDR-L3氨基酸序列：在CDR-L2结束后总是33个氨基酸开始；
在CDR-L3氨基酸序列前的残基总是半胱氨酸(C)；
在CDR-L3序列后的残基总是Phe-Gly-X-Gly (F-G-X-G) (SEQ ID NO:7)，其中X是任何氨基酸；
长度一般是7 – 11个氨基酸残基。
在CDR-L3氨基酸序列前的残基总是半胱氨酸(C)；
在CDR-L3序列后的残基总是Phe-Gly-X-Gly (F-G-X-G) (SEQ ID NO:7)，其中X是任何氨基酸；
长度一般是7 – 11个氨基酸残基。
[0093] 为了鉴定CDR-H1氨基酸序列：由VH区的氨基末端约31个氨基酸残基并且总是在半胱氨酸(C)后9个残基开始；
在CDR-H1序列前的残基总是Cys-X-X-X-X-X-X-X-X (SEQ ID NO:151)，其中X是任何氨基酸；
在CDR-H1序列后的残基总是Trp(W)，一般是Trp-Val (W-V)，但也是Trp-Ile (W-I), 和Trp-Ala (W-A)；
长度一般是5 – 7个氨基酸残基。
在CDR-H1序列前的残基总是Cys-X-X-X-X-X-X-X-X (SEQ ID NO:151)，其中X是任何氨基酸；
在CDR-H1序列后的残基总是Trp(W)，一般是Trp-Val (W-V)，但也是Trp-Ile (W-I), 和Trp-Ala (W-A)；
长度一般是5 – 7个氨基酸残基。
[0094] 为了鉴定CDR-H2氨基酸序列：在CDR-H1结束后总是15个氨基酸开始；
在CDR-H2序列前的残基一般是Leu-Glu-Trp-Ile-Gly (L-E-W-I-G) (SEQ ID NO:8)，但也是其他变异；
在CDR-H2序列后的残基是Lys/Arg-Leu/Ile/Val/Phe/Thr/Ala-Thr/Ser/Ile/Ala
(K/R-L/I/V/F/T/A-T/S/I/A)；
长度一般是16 – 19个氨基酸残基。
在CDR-H2序列前的残基一般是Leu-Glu-Trp-Ile-Gly (L-E-W-I-G) (SEQ ID NO:8)，但也是其他变异；
在CDR-H2序列后的残基是Lys/Arg-Leu/Ile/Val/Phe/Thr/Ala-Thr/Ser/Ile/Ala
(K/R-L/I/V/F/T/A-T/S/I/A)；
长度一般是16 – 19个氨基酸残基。
[0095] 为了鉴定CDR-H3氨基酸序列：在CDR-H2结束后总是33个氨基酸残基并且总是在半胱氨酸(C)'后3个开始；
在CDR-H3序列前的残基总是Cys-X-X (C-X-X)，其中X是任何氨基酸，一般是
Cys-Ala-Arg (C-A-R)；
在CDR-H3序列后的残基总是Trp-Gly-X-Gly (W-G-X-G) (SEQ ID NO:9)，其中X是任何氨基酸；
长度一般是3 – 25个氨基酸残基。
在CDR-H3序列前的残基总是Cys-X-X (C-X-X)，其中X是任何氨基酸，一般是
Cys-Ala-Arg (C-A-R)；
在CDR-H3序列后的残基总是Trp-Gly-X-Gly (W-G-X-G) (SEQ ID NO:9)，其中X是任何氨基酸；
长度一般是3 – 25个氨基酸残基。
[0096] 如本文使用，术语“受体”和“受体抗体”指抗体或核酸序列，所述抗体或核酸序列提供或编码一个或多个构架区的至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或100％的氨基酸序列。在一些实施方案中，术语“受体”指提供或编码一个或多个恒定区的抗体氨基酸或核酸序列。在又另一个实施方案中，术语“受体”指提供或编码一个或多个构架区和一个或多个恒定区的抗体氨基酸或核酸序列。在特定实施方案中，术语“受体”指人抗体氨基酸或核酸序列，所述人抗体氨基酸或核酸序列提供或编码一个或多个构架区的至少
80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或100％的氨基酸序列。依照该实施方案，受体可含有至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或至少10个氨基酸残基，这些氨基酸残基不存在于人抗体的一个或多个特定位置。受体构架区和/或一个或多个受体恒定区可以是例如从种系抗体基因、成熟抗体基因、功能抗体(例如本领域众所周知的抗体、开发中的抗体或可通过商业途径获得的抗体)衍生或获得的。
80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或100％的氨基酸序列。依照该实施方案，受体可含有至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或至少10个氨基酸残基，这些氨基酸残基不存在于人抗体的一个或多个特定位置。受体构架区和/或一个或多个受体恒定区可以是例如从种系抗体基因、成熟抗体基因、功能抗体(例如本领域众所周知的抗体、开发中的抗体或可通过商业途径获得的抗体)衍生或获得的。
[0097] 如本文使用，术语“规范”残基指CDR或构架中定义具体规范CDR结构的残基，如由Chothia等人(1987) J. Mol. Biol. 196:901-917 和Chothia等人 (1992) J. Mol. Biol. 227:799-817定义的。根据Chothia等人，尽管在氨基酸序列水平的巨大多样性，但许多抗体的CDR的关键部分具有几乎相同的肽主链构象。各个规范结构主要为形成环的氨基酸残基的邻接区段限定了一套肽主链扭转角。
[0098] 如本文使用，术语“供体”和“供体抗体”指提供一个或多个CDRs的抗体。在一个实施方案中，供体抗体是来自与获得或衍生构架区的抗体不同的物种的抗体。在人源化抗体上下文中，术语“供体抗体”指提供一个或多个CDRs的非人抗体。
[0099] 如本文使用，术语“构架”或“构架序列”指减去CDRs的可变区的剩余序列。因为CDR序列的确切定义可以由不同系统来决定，所以对构架序列的含义进行相应不同的解释。6个CDRs(轻链的CDR-L1、-L2和-L3，以及重链的CDR-H1、-H2和-H3)也将轻链和重链上的构架区分成在每条链上的4个亚区(FR1、FR2、FR3和FR4)，其中CDR1位于FR1和FR2之间，CDR2位于FR2和FR3之间，且CDR3位于FR3和FR4之间。不将特定亚区指定为FR1、FR2、FR3或FR4，如其他人提及的，构架区代表单条天然存在的免疫球蛋白链可变区内的组合FR's。如本文使用，FR代表4个亚区之一，且FRs代表构成构架区的4个亚区中的2个或更多。
[0100] 人重链和轻链受体序列为本领域所已知。在本发明的一个实施方案中，人重链和轻链受体序列选自表3和表4中所述的序列。
[0101] 表3: 重链受体序列
[0102] 表4: 轻链受体序列
[0103] 如本文使用，术语“种系抗体基因”或“基因片段”指由非淋巴样细胞编码的免疫球蛋白序列，所述非淋巴样细胞尚未经历成熟过程，所述成熟过程导致用于表达特定免疫球蛋白的遗传重排和突变 (参见例如，Shapiro等人(2002) Crit. Rev. Immunol. 22(3):183-200；Marchalonis等人(2001) Adv. Exp. Med. Biol. 484:13-30)。由各种本发明的实施方案提供的优点之一源于下述认识：种系抗体基因比成熟抗体基因更可能保存物种中个体特有的基本氨基酸序列结构，因此当在那个物种中治疗上使用时，更不可能被识别为来自外来来源。
[0104] 如本文使用，术语“关键”残基指可变区中的某些残基，其对于抗体尤其是人源化抗体的结合特异性和/或亲和力具有更多影响。关键残基包括但不限于下列中一个或多个：接近CDR的残基、潜在的糖基化位点(可以是N-或O-糖基化位点)、稀有残基、能够与抗原相互作用的残基、能够与CDR相互作用的残基、规范残基、重链可变区和轻链可变区之间的接触残基、Vernier区内的残基、以及可变重链CDR1的Chothia定义和第一个重链构架的Kabat定义之间重叠的区域中的残基。
[0105] 术语“人源化抗体”指包含来自非人物种(例如，小鼠)的重和轻链可变区序列的抗体，但其中至少部分VH和/或VL序列已改变成更“人样”，即更类似于人种系可变序列。一种类型的人源化抗体是CDR嫁接的抗体，其中将非人CDR序列引入人VH和VL序列以替换相应的非人构架(FR)序列。例如，术语“人源化抗体”是抗体或其变体、衍生物、类似物或片段，其与目的抗原免疫特异性结合，且包含基本上具有人抗体的氨基酸序列的构架(FR)区、和基本上具有非人抗体的氨基酸序列的互补决定区(CDR)。如本文使用，在CDR背景中的术语“基本上”指具有的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少
98％或至少99％等同于非人抗体CDR的氨基酸序列的CDR。人源化抗体包含基本上所有至少一个、且一般为2个可变结构域(Fab、Fab'、F(ab')2、FabC、Fv)，其中所有或基本上所有CDR区对应非人免疫球蛋白(即，供体抗体)的那些，且所有或基本上所有构架区是人免疫球蛋白共有序列的那些。在一个实施方案中，人源化抗体也包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，一般为人免疫球蛋白的那种。在一些实施方案中，人源化抗体包含轻链以及至少重链的可变结构域。抗体还可以包括重链的CH1、铰链、CH2、CH3和CH4区。在一些实施方案中，人源化抗体只包含人源化轻链。在一些实施方案中，人源化抗体只包含人源化重链。在具体实施方案中，人源化抗体只包含轻链的人源化可变结构域和/或人源化重链。
98％或至少99％等同于非人抗体CDR的氨基酸序列的CDR。人源化抗体包含基本上所有至少一个、且一般为2个可变结构域(Fab、Fab'、F(ab')2、FabC、Fv)，其中所有或基本上所有CDR区对应非人免疫球蛋白(即，供体抗体)的那些，且所有或基本上所有构架区是人免疫球蛋白共有序列的那些。在一个实施方案中，人源化抗体也包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，一般为人免疫球蛋白的那种。在一些实施方案中，人源化抗体包含轻链以及至少重链的可变结构域。抗体还可以包括重链的CH1、铰链、CH2、CH3和CH4区。在一些实施方案中，人源化抗体只包含人源化轻链。在一些实施方案中，人源化抗体只包含人源化重链。在具体实施方案中，人源化抗体只包含轻链的人源化可变结构域和/或人源化重链。
[0106] 人源化抗体可以选自任何种类的免疫球蛋白，包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE，以及任何同种型，包括但不限于IgG 1、IgG2、IgG3和IgG4。人源化抗体可以包含来自超过一个种类或同种型的序列，且特定恒定结构域可以使用本领域众所周知的技术进行选择，以优化所需的效应子功能。
[0107] 人源化抗体的构架和CDR区不需要与亲本序列精确对应，例如，可以通过取代、插入和/或缺失至少一个氨基酸残基来诱变供体抗体CDR或共有构架，以便该位点的CDR或构架残基与供体抗体或共有构架均不对应。然而，在一个实施方案中，这种突变不会是广泛的。通常，至少80％、至少85％、至少90％和至少95％的人源化抗体残基将与亲本FR和CDR序列的残基对应。如本文使用，术语“共有构架”指共有免疫球蛋白序列中的构架区。如本文使用，术语“共有免疫球蛋白序列”指由相关免疫球蛋白序列家族中最频繁出现的氨基酸(或核苷酸)形成的序列(参见例如Winnaker (1987) From Genes to Clones (Verlagsgesellschaft, Weinheim, Germany))。“共有免疫球蛋白序列”因此可以包含“共有可变结构域”和/或“共有恒定结构域”。“共有可变结构域”又可以包含一个或多个“共有构架区”和/或一个或多个“共有CDRs”。在免疫球蛋白家族中，共有序列中各位置由家族中在该位置最频繁出现的氨基酸占据。如果两个氨基酸出现一样频繁，则任一个可以包括在共有序列中。
[0108] 如本文使用，术语“Vernier”区指可以调整CDR结构并精调与抗原的配合(fit)的构架残基的亚群，如由Foote和Winter(1992) J. Mol. Biol. 224:487-499所述的。Vernier区残基形成CDRs基础层，并且可以影响CDRs结构以及抗体亲和力。
[0109] 术语“多价结合蛋白”在本说明书用于指包含2个或更多抗原结合位点的结合蛋白。多价结合蛋白经工程改造为具有3个或更多抗原结合位点，且一般不是天然存在的抗体。术语“多特异性结合蛋白”指能够结合2种或更多相关或无关目标的结合蛋白。双重可变结构域(DVD)结合蛋白是包含2个或更多抗原结合位点的结合蛋白，并且是四价或多价结合蛋白。这种DVD结合蛋白可以是单特异性的，即能够结合一种抗原，或多特异性的，即能够结合2种或更多抗原。将包含两个重链DVD多肽和两个轻链DVD多肽的DVD结合蛋TM TM白称为DVD-Ig 分子。DVD-Ig 分子的每一半包含重链DVD多肽，和轻链DVD多肽，和2个抗原结合位点。每个结合位点包含重链可变结构域和轻链可变结构域，其中每个抗原结合位点总共6个参与抗原结合的CDRs。DVD结合蛋白以及制备DVD结合蛋白的方法公开在美国专利号7,612,181中。
[0110] 本发明的一个方面和DVD结合蛋白有关，其包含能够结合人IL-1α的结合蛋白。在另一个方面，DVD结合蛋白能够结合IL-1α和第二个目标。在一个实施方案中，DVD结合蛋白能够结合IL-1α和IL-1β。
[0111] 术语“中和”指当结合蛋白特异性结合细胞因子时，中和细胞因子的生物学活性。在一个实施方案中，中和结合蛋白是中和抗体，其与hIL-1α的结合导致hIL-1α生物学活性的抑制。在一个实施方案中，中和结合蛋白结合hIL-1α且使hIL-1α的生物学活性减少至少约20％、至少约40％、至少约60％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约
95％或至少约100％。可以通过测量本领域所众所周知的hIL-1α生物学活性的一个或多个指示物，来评估中和结合蛋白对hIL-1α生物学活性的抑制。
95％或至少约100％。可以通过测量本领域所众所周知的hIL-1α生物学活性的一个或多个指示物，来评估中和结合蛋白对hIL-1α生物学活性的抑制。
[0112] 术语“表位”包括能够与免疫球蛋白或T细胞受体特异性结合的任何多肽决定簇。在某些实施方案中，表位决定簇包括分子诸如氨基酸、糖侧链、磷酰基、或磺酰基的化学活性表面定组(grouping)，且在某些实施方案中，可以具有具体三维结构特征、和/或具体电荷特征。表位是由抗体结合的抗原区域。因此，表位由已知结合于特异性结合伴侣上的互补位点的抗原(或其片段)区域的氨基酸残基组成。抗原片段可以包含多于一个表位。在某些实施方案中，当抗体在蛋白和/或大分子复杂混合物中识别其靶抗原时，它被说成特异性结合抗原。如果抗体交叉竞争(一个阻止另一个的结合或调谐作用)，则将抗体称为“结合相同表位”。另外，表位的结构性定义(重叠、类似、同一)是提供信息的，但是功能性定义往往更加相关，因为它们包含了结构性(结合)和功能性(调谐、竞争)参数。
[0113] 术语“表面等离子共振”指通过检测生物传感器基质内的蛋白浓度改变，例如使TM用BIACORE 系统(Biacore International AB, a GE Healthcare company, Uppsala, Sweden and Piscataway, New Jersey)，允许分析实时生物特异性相互作用的光学现象。关于进一步的描述，参见Jönsson, U.等人(1993) Ann. Biol. Clin. 51:19-26；
Jönsson, U.等人(1991) Biotechniques 11:620-627；Johnsson, B.等人(1995) J. Mol. Recognit. 8: 125-131；和Johnsson, B.等人 (1991) Anal. Biochem. 198:268-277。
Jönsson, U.等人(1991) Biotechniques 11:620-627；Johnsson, B.等人(1995) J. Mol. Recognit. 8: 125-131；和Johnsson, B.等人 (1991) Anal. Biochem. 198:268-277。
[0114] 如本领域已知的，术语“Kon”指结合蛋白(例如抗体)与抗原结合以形成例如抗体/抗原复合物的结合速率常数。也将“Kon”称为术语“结合速率常数”或“ka”，如本文中可互换使用的。该值指示抗体与其靶抗原的结合速率、或抗体与抗原之间的复合物形成速率，其也由方程表示：。
[0115] 如本领域已知的，术语“Koff”指结合蛋白(例如抗体)从例如抗体/抗原复合物中解离的解离速率常数。也将“Koff”称为术语“解离速率常数”或“kd”，如本文中可互换使用的。该值指示抗体从其靶抗原的解离速率、或Ab-Ag复合物随时间过去分离为游离抗体和抗原的解离速率，其由下列方程表示：。
[0116] 术语“平衡解离常数”或“KD”，如本文中可互换使用的，指在滴定测量中在平衡时、或者通过将解离速率常数(koff)除以结合速率常数(kon)所获得的值。使用结合速率常数、解离速率常数和平衡解离常数表示抗体对抗原的结合亲和力。确定结合和解离速率常数的方法为本领域众所周知。使用基于荧光的技术提供了高灵敏度以及在生理缓冲液中在平衡TM时检查样品的能力。可以使用其他实验途径和仪器诸如BIACORE (生物分子相互作用分析)测定(例如，可以从Biacore International AB，a GE Healthcare company，Uppsala，瑞典获得的仪器)。另外，也可以使用可以从Sapidyne Instruments(Boise, Idaho)获得的KinExA®(动态排阻测定(Kinetic Exclusion Assay))测定。
[0117] 如本文使用，术语“标记的结合蛋白”指具有标记并入的蛋白，所述标记提供了结合蛋白的鉴定。在一个方面，标记是可检测标记，例如，并入放射性标记的氨基酸或使生物素化(biotinyl)部分与多肽结合，所述生物素化部分可以通过标记的抗生物素蛋白(例如包含可以通过光学或比色法检测的荧光标记或酶促活性的链霉抗生物素蛋白)进行检3 14
测。关于多肽的标记实例包括但不限于下述：放射性同位素或放射性核素(例如，H、C、
35 90 99 111 125 131 177 166 153
S、Y、Tc、In、 I、I、 Lu、Ho、或 Sm)；荧光标记(例如，FITC、罗丹明、和镧系磷光体)，酶促标记(例如，辣根过氧化物酶、萤光素酶、碱性磷酸酶)；化学发光标记；生物素化基团；由次级报道分子识别的预定多肽表位(例如，亮氨酸拉链对序列、关于二抗的结合位点、金属结合结构域、和表位标签)；和磁性试剂，诸如钆螯合物。
测。关于多肽的标记实例包括但不限于下述：放射性同位素或放射性核素(例如，H、C、
35 90 99 111 125 131 177 166 153
S、Y、Tc、In、 I、I、 Lu、Ho、或 Sm)；荧光标记(例如，FITC、罗丹明、和镧系磷光体)，酶促标记(例如，辣根过氧化物酶、萤光素酶、碱性磷酸酶)；化学发光标记；生物素化基团；由次级报道分子识别的预定多肽表位(例如，亮氨酸拉链对序列、关于二抗的结合位点、金属结合结构域、和表位标签)；和磁性试剂，诸如钆螯合物。
[0118] 术语“抗体缀合物”指与第二化学部分，诸如治疗或细胞毒性剂化学连接的结合蛋白诸如抗体。如本文使用，术语“药剂”表示化合物、化合物混合物、生物大分子、或由生物学材料制备的提取物。在一个方面，治疗或细胞毒性剂包括但不限于，百日咳毒素、紫素、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷(tenoposide)、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、阿霉素、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光辉霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、心得安、和嘌呤霉素及其类似物或同源物。
[0119] 术语“晶体”和“结晶的”指以晶体形式存在的抗体或其抗原结合部分。晶体是物质固态的一种形式，它不同于其他形式诸如无定形固态或液晶态。晶体由规则、重复、三维排列的原子、离子、分子(例如，蛋白诸如抗体)、或分子装配体(assembly)(例如，抗原/抗体复合物)组成。这些三维排列根据本领域充分了解的特定数学关系排列。晶体中重复的基本单位或构件被称为不对称单位。符合给定、明确的晶体学对称性的排列中的不对称单位重复提供了晶体的“晶胞”。通过在所有3个维度中规则平移的晶胞重复提供了晶体。参见Giegé和Ducruix (1999) 在Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, a Practical Approach, 第二版，第1章(Ducruix 和Giegé, 编) (Oxford University Press, New York, 1999)第1-16页。
[0120] 术语“多核苷酸”意指2个或更多核苷酸的聚合形式，所述核苷酸为核糖核苷酸或脱氧核苷酸，或任一类型核苷酸的修饰形式。该术语包括单和双链形式的DNA 或RNA，但在一个实施方案中是双链DNA。
[0121] 术语“分离的多核苷酸”意指下述多核苷酸(例如，基因组的、cDNA、或合成来源的或其组合)，其不与在自然界中它与之结合、在自然界中它与之可操作地连接、或在自然界中它与之作为较大序列的部分存在的全部或部分多核苷酸结合。
[0122] 术语“载体”指能够运输它已与之连接的另一种核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，它指另外的DNA区段可以连接到其内的环状双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体，其中另外的DNA区段可以连接到病毒基因组内。某些载体能够在它们已引入其内的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和游离型哺乳动物载体)。其他载体(例如非游离型哺乳动物载体)在引入宿主细胞内后可以整合到宿主细胞基因组内，且因此连同宿主基因组一起进行复制。此外，某些载体能够指导它们与之可操作地连接的基因表达。此种载体在本文中被称为“重组表达载体”(或简单地，“表达载体”)。一般而言，在重组DNA技术中使用的表达载体通常为质粒的形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可以互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，本发明意在包括这种其他形式的表达载体，诸如提供等价功能的病毒载体(例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
[0123] 术语“可操作地连接的”指组分的定位，从而使得它们以其预期方式起作用。与编码序列“可操作地连接的”控制序列以这样的方式连接，从而使得编码序列的表达在与控制序列相容的条件下完成。“可操作地连接的”序列包括与目的核酸邻接的表达控制序列，反式起作用即定位于与目的核酸不同的核酸分子上但仍发挥对于目的核酸的控制的表达控制序列，和定位于与目的核酸相同的核酸分子上但隔一段距离的表达控制序列。如本文使用，术语“表达控制序列”指实现它们与之连接的编码序列表达和加工所必需的多核苷酸序列。表达控制序列包括合适的转录起始、终止、启动子和增强子序列；有效的RNA加工信号诸如剪接和多腺苷酸化信号；稳定细胞质mRNA的序列；增强翻译效率的序列(即，Kozak共有序列)；增强蛋白稳定性的序列；和需要时，增强蛋白分泌的序列。此种控制序列的性质依赖于宿主生物而不同；在原核生物中，此种控制序列一般包括启动子，核糖体结合位点，和转录终止序列；在真核生物中，此种控制序列一般包括启动子和转录终止序列。术语“控制序列”预期包括其存在是表达和加工必需的组分，且还可以包括其存在是有利的另外组分，例如前导序列和融合伴侣序列。
[0124] “转化”指外源DNA通过其进入宿主细胞的任何方法。转化可以使用本领域众所周知的各种方法在天然或人工条件下发生，例如，用于将外来核酸序列插入原核或真核宿主细胞内。该方法基于待转化的宿主细胞进行选择，且可以包括但不限于，病毒感染、电穿孔、脂质转染、和粒子轰击。此种“转化的”细胞包括其中插入的DNA能够作为自主复制质粒或作为宿主染色体部分复制的稳定转化的细胞。它们还包括瞬时表达插入的DNA或RNA有限时间段的细胞。
[0125] 如本文使用，术语“重组宿主细胞”(或简单地“宿主细胞”)意指其中已引入外源DNA的细胞。此种术语不仅意指特定的受试细胞，还意指此种细胞的后代。如本文使用，因为由于突变或环境影响可能在随后世代中出现某些修饰，所以此种后代实际上可能不等同于亲本细胞，但仍包括在术语“宿主细胞”的范围内。在一个方面，宿主细胞包括选自任何生物界的原核和真核细胞。真核细胞包括原生生物、真菌、植物和动物细胞。在另一个方面，宿主细胞包括但不限于原核细胞系大肠杆菌(Escherichiacoli)；哺乳动物细胞系CHO、HEK293、和COS；昆虫细胞系Sf9；和真菌细胞酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
[0126] 标准技术可以用于重组DNA、寡核苷酸合成、以及组织培养和转化(例如，电穿孔和脂质转染)。酶促反应和纯化技术可以根据制造商的说明书或如本领域通常完成的或如本文所述的来进行。前述技术和程序一般可以根据本领域众所周知以及如各种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法来进行，所述参考文献在本说明书自始至终引用和讨论。参见例如，Sambrook等人, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989)。
[0127] 术语“转基因生物”指具有包含转基因的细胞的生物，其中引入生物(或生物祖先)内的转基因表达在该生物中非天然表达的多肽。“转基因”是DNA构建体，所述DNA构建体稳定且可操作地整合到转基因生物由其发育的细胞的基因组内，从而指导编码的基因产物在转基因生物的一种或多种细胞类型或组织中表达。
[0128] 术语“调控”和“调节”可以互换使用，且指目的分子活性(例如，hIL-1α的生物学活性)中的变化或改变。调谐可以是目的分子的某一活性或功能量级中的增加或减少。分子的示例性活性和功能包括但不限于，结合特征、酶促活性、细胞受体激活、和信号转导。
[0129] 相应地，术语“调节剂”是能够变化或改变目的分子活性或功能(例如，hIL-1α的生物学活性)的化合物。例如，与在不存在调节剂的情况下观察到的活性或功能量级相比较，调节剂可以引起分子某一活性或功能量级中的增加或减少。在某些实施方案中，调节剂是减少分子至少一种活性或功能量级的抑制剂。示例性抑制剂包括但不限于，蛋白、肽、抗体、肽体(peptibodies)、碳水化合物或小有机分子。肽体在例如PCT公开号 WO01/83525中描述。
[0130] 术语“激动剂”指当与目的分子接触时，与在不存在激动剂的情况下观察到的活性或功能量级相比较，引起分子某一活性或功能量级中的增加的调节剂。具体目的激动剂可以包括但不限于，多肽、核酸、碳水化合物、或与IL-1α 和/或 IL-1β结合的任何其他分子。
[0131] 术语“拮抗剂”或“抑制剂”指当与目的分子接触时，与在不存在拮抗剂的情况下观察到的活性或功能量级相比较，引起分子某一活性或功能量级中的减少的调节剂。拮抗剂包括阻断或调节IL-1α 和/或 IL-1β生物学或免疫活性的那些。IL-1α拮抗剂和抑制剂可以包括但不限于，与IL-1α结合的多肽、核酸、碳水化合物、或任何其他分子。IL-1β拮抗剂和抑制剂可以包括但不限于，与IL-1β结合的多肽、核酸、碳水化合物、或任何其他分子。
[0132] 术语“有效量”指治疗的量，其足以减少或改善病症或其一种或多种症状的严重性和/或持续时间，预防病症进展，引起病症消退，预防与病症相关的一种或多种症状复发、发展、发作或进展，检测病症，或增强或改善另一种治疗(例如，预防或治疗剂)的预防或治疗作用。
[0133] 术语“样品”以其最广泛的含义使用。“生物学样品”包括但不限于，来自生物(living thing)或从前生物的任何量的物质。此种生物包括但不限于，人、小鼠、大鼠、猴、狗、兔和其他动物。此种物质包括但不限于，血液、血清、尿、滑液、细胞、器官、组织、骨髓、淋巴结和脾。
[0134] “亲和力成熟的”抗体是在其一个或多个CDRs或构架中具有一种或多种改变的抗体，与没有那些改变的亲本抗体相比较，所述改变导致抗体对抗原的亲和力改善。优选的亲和力成熟的抗体将对靶抗原具有纳摩尔或甚至皮摩尔的亲和力。亲和力成熟的抗体通过本领域已知的程序来产生。Marks等人(1992) BioTechnology 10: 779-783描述了通过VH和VL结构域改组的亲和力成熟。CDR和/或构架残基的随机诱变由下述描述：Barbas等人(1994) Proc Nat. Acad. Sci. USA 91: 3809-3813; Schier等人(1995) Gene 169:147-155; Yelton等人(1995) J. Immunol. 155: 1994-2004; Jackson等人(1995) J. Immunol. 154(7): 3310-3319;和Hawkins等人(1992) J. Mol. Biol., 226: 889-896。
[0135] 在疼痛初始原因已消失后在个体中持续的疼痛不再是症状，而是以其自身公认的疾病。如本文使用的术语"异常疼痛"是指其中个体对通常无害刺激(通常为机械性质的刺激，诸如掠过皮肤)经受疼痛反应的病状。异常疼痛不涉及疼痛感受器，且因此也可以称为“非疼痛感受性”疼痛。如本文使用的术语“痛觉过敏”是指其中个体对由有害刺激(尤其是激活疼痛感受器的刺激，诸如疼痛的机械刺激、热刺激或化学刺激)产生的疼痛敏感性增强的状况。激活疼痛感受器的刺激引起疼痛。痛觉过敏是其中个体对通常的有害刺激具有增强的疼痛反应的状况。个体可患有异常疼痛、痛觉过敏或异常疼痛与痛觉过敏的组合。
[0136] I. 生成结合IL-1α和IL-1β两者的DVD-Ig™结合蛋白已描述能够结合一个或多个目标抗原(或表位)的双重可变结构域免疫球蛋白
(DVD-Ig™)结合蛋白的设计和产生(参见例如PCT公开号WO 2007/024715)。可用于本文所述的用于治疗骨关节炎的方法和组合物中的DVD-Ig结合蛋白结合IL-1α和IL-1β。
在一个实施方案中，DVD-Ig™结合蛋白包含至少两条多肽链，其中所述第一条多肽链包含VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n ，其中VD1是第一个重链可变结构域，VD2是第二个重链可变结构域，C 是重链恒定结构域，X1是接头，条件是其不是CH1，且X2是Fc 区；并且其中所述第二条多肽链包含VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中VD1是第一个轻链可变结构域，VD2是第二个轻链可变结构域，C 是轻链恒定结构域，X1是接头，条件是其不是CH1，且X2不包含Fc 区；
且n是0 或 1。由第一和第二多肽链组成的DVD-Ig™结合蛋白具有2个抗原结合位点。
(DVD-Ig™)结合蛋白的设计和产生(参见例如PCT公开号WO 2007/024715)。可用于本文所述的用于治疗骨关节炎的方法和组合物中的DVD-Ig结合蛋白结合IL-1α和IL-1β。
在一个实施方案中，DVD-Ig™结合蛋白包含至少两条多肽链，其中所述第一条多肽链包含VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n ，其中VD1是第一个重链可变结构域，VD2是第二个重链可变结构域，C 是重链恒定结构域，X1是接头，条件是其不是CH1，且X2是Fc 区；并且其中所述第二条多肽链包含VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中VD1是第一个轻链可变结构域，VD2是第二个轻链可变结构域，C 是轻链恒定结构域，X1是接头，条件是其不是CH1，且X2不包含Fc 区；
且n是0 或 1。由第一和第二多肽链组成的DVD-Ig™结合蛋白具有2个抗原结合位点。
[0137] 在另一个实施方案中，DVD-Ig™结合蛋白包含四条多肽链，其中所述第一个两条多肽链的每一条分别包含VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中VD1是第一个重链可变结构域，VD2是第二个重链可变结构域，C 是重链恒定结构域，X1是接头，条件是其不是CH1，且X2是Fc 区；且所述第二个两条多肽链的每一条分别包含VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中VD1是第一个轻链可变结构域，VD2是第二个轻链可变结构域，C 是轻链恒定结构域，X1是接头，条件是其不是CH1，且X2不包含Fc 区；且n是0 或 1。这样的DVD-Ig™结合蛋白具有4个抗原结合位点。
[0138] 例如，可用于本文所述的用于治疗个体骨关节炎的方法和组合物中的DVD-Ig结合蛋白可进行工程改造以具有通过两个(第一和第二多肽)的VD1可变结构域结合形成的IL-1β的结合位点和通过两个(第一和第二多肽)的VD2可变结构域结合形成的IL-1α的结合位点。在可替代的排列中，可用于本文所述的用于治疗个体骨关节炎的方法和组合物中的DVD-Ig结合蛋白可具有通过两个(第一和第二多肽)的VD1可变结构域结合形成的IL-1α的结合位点和通过两个(第一和第二多肽)的VD2可变结构域结合形成的IL-1β的结合位点。
[0139] A. 亲本单克隆抗体的产生DVD结合蛋白的可变结构域可以从亲本抗体获得，包括能够结合目的抗原的多克隆和单克隆抗体。这些抗体可以是天然存在的或可以通过重组技术产生的。
[0140] 单克隆抗体可以使用本领域已知的广泛多样的技术来制备，包括使用杂交瘤技术、重组技术、和噬菌体展示技术，或其组合。例如，单克隆抗体可以使用杂交瘤技术来产生，包括本领域已知和下列教导的那些：例如于Harlow 等人，Antibodies: A Laboratory Manual, 第2版, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988); Hammerling, 等人，Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas (Elsevier, N.Y., 1981), 第563-581页 (所述参考文献通过引用完整地并入本文)。如本文使用，术语“单克隆抗体” (缩写为"mAb")不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。术语“单克隆抗体”指来源于单一克隆，包括任何真核、原核、或噬菌体克隆的抗体，而不是指产生其的方法。使用标准方法，杂交瘤进行选择、克隆和进一步筛选所需特征，包括强杂交瘤生长、高抗体产生和所需抗体特征。杂交瘤可以在同系动物体内、在缺乏免疫系统的动物例如裸鼠、或在体外细胞培养中培养和扩增。选择、克隆和扩增杂交瘤的方法是本领域普通技术人员众所周知的。在优选的实施方案中，杂交瘤是小鼠杂交瘤。在另一个实施方案中，杂交瘤在非人、非小鼠物种，诸如大鼠、绵羊、猪、山羊、牛或马中产生。在另一个实施方案中，杂交瘤是人杂交瘤，其中人非分泌性骨髓瘤与表达能够结合特定所需抗原(诸如IL-1α 或IL-1β)的抗体的人细胞融合。
[0141] 重组单克隆抗体也使用本领域中称为选择淋巴细胞抗体法(SLAM)的程序从单一、分离的淋巴细胞中产生，所述SLAM如美国专利号5,627,052、PCT公开号WO 92/02551和Babcook等人(1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7843-7848中所述。在这种方法中，鉴定分泌目的抗体的单一细胞，例如来源于免疫的动物的淋巴细胞，且通过逆转录酶PCR从细胞中拯救重和轻链可变区cDNAs，随后可以在合适的免疫球蛋白恒定区(例如，人恒定区)背景中，在哺乳动物宿主细胞诸如COS或CHO细胞中表达这些可变区。用扩增的免疫球蛋白序列转染的、来源于体内选择的淋巴细胞的宿主细胞，随后可以经历进一步的体外分析和选择，例如通过淘选转染的细胞以分离表达针对目的抗原的抗体的细胞。扩增的免疫球蛋白序列进一步可以进行体外操作，诸如通过体外亲和力成熟法，诸如PCT公开号 WO 97/29131和PCT公开号 WO 00/56772中描述的那些。
[0142] 单克隆抗体也通过用目的抗原免疫非人动物来产生，所述非人动物包含一些或全部人免疫球蛋白基因座。在一个实施方案中，非人动物是XENOMOUSE转基因小鼠，其是包含人免疫球蛋白基因座大片段且在小鼠抗体产生方面有缺陷的工程改造的小鼠品系。参见例如Green等人(1994) Nature Genetics 7:13-21和美国专利号5,916,771; 5,939,598;5,985,615; 5,998,209; 6,075,181; 6,091,001; 6,114,598;和6,130,364。还参见PCT公开号WO 91/10741; WO 94/02602; WO 96/34096; WO 96/33735; WO 98/16654; WO
98/24893; WO 98/50433; WO 99/45031; WO 99/53049; WO 00/09560; 和WO 00/037504。
XENOMOUSE转基因小鼠产生全人抗体的成体样人所有组成成分，且产生抗原特异性人单克隆抗体。通过引入兆碱基大小的、人重链基因座和x轻链基因座的种系构型YAC片段，XENOMOUSE转基因小鼠包含约80％人抗体所有组成成分。参见Mendez 等人(1997) Nature Genet. 15:146-156以及Green和Jakobovits (1998) J. Exp. Med. 188:483-495。
98/24893; WO 98/50433; WO 99/45031; WO 99/53049; WO 00/09560; 和WO 00/037504。
XENOMOUSE转基因小鼠产生全人抗体的成体样人所有组成成分，且产生抗原特异性人单克隆抗体。通过引入兆碱基大小的、人重链基因座和x轻链基因座的种系构型YAC片段，XENOMOUSE转基因小鼠包含约80％人抗体所有组成成分。参见Mendez 等人(1997) Nature Genet. 15:146-156以及Green和Jakobovits (1998) J. Exp. Med. 188:483-495。
[0143] 体外方法也可以用于制备亲本抗体，其中筛选抗体文库以鉴定具有所需结合特异性的抗体。关于重组抗体文库的此种筛选的方法是本领域众所周知的，且包括在下述参考文献中描述的方法：例如，美国专利号5,223,409；PCT公开号WO 92/18619; WO 91/17271; WO 92/20791; WO 92/15679; WO 93/01288; WO 92/01047; WO 92/09690; WO 97/29131；和Fuchs等人(1991) Bio/Technology 9: 1369-1372；Hay等人(1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3: 81-85；Huse 等 人 (1989) Science 246: 1275-1281；McCafferty 等人 (1990) Nature 348: 552-554；Griffiths 等 人 (1993) EMBO J. 12: 725-734；
Hawkins等人(1992) J. Mol. Biol. 226: 889-896；Clackson等人(1991) Nature 352:
624-628；Gram等人(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 3576-3580；Garrard等人(1991) Bio/Technology 9: 1373-1377；Hoogenboom 等人(1991) Nucl. Acid Res. 19:
4133-4137；和Barbas等人(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7978-7982，以及美国专利公开号2003/0186374。
Hawkins等人(1992) J. Mol. Biol. 226: 889-896；Clackson等人(1991) Nature 352:
624-628；Gram等人(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 3576-3580；Garrard等人(1991) Bio/Technology 9: 1373-1377；Hoogenboom 等人(1991) Nucl. Acid Res. 19:
4133-4137；和Barbas等人(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7978-7982，以及美国专利公开号2003/0186374。
[0144] 可用于本发明中的亲本抗体也可以使用本领域已知的各种噬菌体展示方法来产生。在噬菌体展示方法中，功能性抗体结构域在噬菌体颗粒表面上展示，所述噬菌体颗粒携带编码其的多核苷酸序列。具体地，此种噬菌体可以用于展示由所有组成成分或组合抗体文库(例如，人或鼠)表达的抗原结合结构域。表达结合目的抗原的抗原结合结构域的噬菌体可以用抗原进行选择或鉴定，例如使用标记的抗原或被固体表面或珠粒结合或捕获的抗原。这些方法中使用的噬菌体一般是包括fd和M13结合结构域的丝状噬菌体，所述结合结构域由具有Fab、Fv或二硫键稳定的Fv抗体结构域的噬菌体表达，所述抗体结构域与噬菌体基因III或基因VIII蛋白重组融合。可以用于制备本发明的抗体的噬菌体展示方法的实例包括下述参考文献中公开的那些：Brinkman 等人(1995) J. Immunol. Methods182:41-50；Ames等人(1995) J. Immunol. Methods 184:177-186；Kettleborough等人(1994) Eur. J. Immunol. 24: 952-958；Persic等人(1997) Gene 187: 9-18；Burton等人(1994) Adv. Immunol. 57:191-280；PCT申请号PCT/GB91/01134；PCT公开号WO
90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; 和WO 95/20401；以及美国专利号5,698,426; 5,223,409; 5,403,484; 5,580,717;
5,427,908; 5,821,047; 5,571,698; 5,427,908; 5,516,637; 5,780, 225; 5,658,727;
5,733,743 和5,969,108。
90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; 和WO 95/20401；以及美国专利号5,698,426; 5,223,409; 5,403,484; 5,580,717;
5,427,908; 5,821,047; 5,571,698; 5,427,908; 5,516,637; 5,780, 225; 5,658,727;
5,733,743 和5,969,108。
[0145] 如上述参考文献中所描述的，噬菌体选择后，来自噬菌体的抗体编码区可以进行分离并用于产生完整抗体，且在任何所需宿主中表达，所述完整抗体包括人抗体或任何其他所需抗原结合片段，所述宿主包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母和细菌，例如，如下文详细描述的。例如，也可以采用重组产生Fab、Fab'、和F(ab')2 片段的技术，其中使用本领域已知的方法，诸如下述参考文献中公开的那些：PCT公开号 WO 92/22324；Mullinax等人(1992) BioTechniques 12(6): 864-869；和Sawai等人(1995) AJRI 34:
26-34；和Better等人(1988) Science, 240: 1041-1043。可以用于产生单链Fvs和抗体的技术实例包括下述参考文献中描述的那些：美国专利号4,946,778和5,258,498；Huston等人(1991) Methods Enzymol. 203: 46-88；Shu等人(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 7995-7999；以及Skerra等人(1988) Science 240: 1038-1041。
26-34；和Better等人(1988) Science, 240: 1041-1043。可以用于产生单链Fvs和抗体的技术实例包括下述参考文献中描述的那些：美国专利号4,946,778和5,258,498；Huston等人(1991) Methods Enzymol. 203: 46-88；Shu等人(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 7995-7999；以及Skerra等人(1988) Science 240: 1038-1041。
[0146] 作为通过噬菌体展示筛选重组抗体文库的替代，本领域已知的用于筛选大组合文库的其他方法可以应用于亲本抗体的鉴定。如Szostak和Roberts的PCT公开号WO98/31700，以及Roberts, R.W. 和Szostak, J.W. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
94: 12297-12302中描述的，一类可替代的表达系统是其中重组抗体文库作为RNA-蛋白融合物表达的表达系统。在这种系统中，通过在其3’末端上携带嘌呤霉素－肽基受体抗生素的合成mRNAs的体外翻译，在mRNA及其编码的肽或蛋白之间产生共价融合。因此，基于编码的肽或蛋白例如抗体或其部分的性质，诸如抗体或其部分与双重特异性抗原的结合，特定mRNA可以从mRNAs的复杂混合物(例如，组合文库)中富集。由此种文库筛选回收的编码抗体或其部分的核酸序列，可以通过如上文所述的重组方法(例如，在哺乳动物宿主细胞中)表达，且此外可以通过mRNA-肽融合物的另外筛选循环，或通过如上文所述用于重组抗体体外亲和力成熟的其他方法实施进一步的亲和力成熟，在所述mRNA-肽融合物中已将突变引入最初选择的序列内。
94: 12297-12302中描述的，一类可替代的表达系统是其中重组抗体文库作为RNA-蛋白融合物表达的表达系统。在这种系统中，通过在其3’末端上携带嘌呤霉素－肽基受体抗生素的合成mRNAs的体外翻译，在mRNA及其编码的肽或蛋白之间产生共价融合。因此，基于编码的肽或蛋白例如抗体或其部分的性质，诸如抗体或其部分与双重特异性抗原的结合，特定mRNA可以从mRNAs的复杂混合物(例如，组合文库)中富集。由此种文库筛选回收的编码抗体或其部分的核酸序列，可以通过如上文所述的重组方法(例如，在哺乳动物宿主细胞中)表达，且此外可以通过mRNA-肽融合物的另外筛选循环，或通过如上文所述用于重组抗体体外亲和力成熟的其他方法实施进一步的亲和力成熟，在所述mRNA-肽融合物中已将突变引入最初选择的序列内。
[0147] 在另一种方法中，亲本抗体也可以使用本领域已知的酵母展示方法来产生。在酵母展示方法中，使用遗传方法以使抗体结构域束缚于酵母细胞壁，且将它们展示在酵母表面上。具体地，此种酵母可以用于展示由所有组成成分或组合抗体文库(例如，人或鼠)表达的抗原结合结构域。可用于制备亲本抗体的酵母展示方法的实例包括美国专利号6,699,658中公开的那些。
[0148] 上文所述抗体可以进一步进行修饰以产生CDR嫁接的和人源化的亲本抗体。CDR嫁接的亲本抗体包含来自人抗体的重和轻链可变区序列，其中VH和/或VL的一个或多个CDR区替换为能够结合目的抗原的鼠抗体的CDR序列。来自任何人抗体的构架序列可以充当用于CDR嫁接的模板。然而，在此种构架上的直接链替换通常导致与抗原的结合亲和力的一些丧失。人抗体与最初鼠抗体越同源，使鼠CDRs与人构架组合将在CDRs中引入可减小亲和力的变形的可能性越小。因此，优选的是，选择替换除CDRs外的鼠可变构架的人可变构架与鼠抗体可变区构架具有至少65％的序列同一性。更优选的是，除CDRs外的人和鼠可变区具有至少70％的序列同一性。甚至更优选的是，除CDRs外的人和鼠可变区具有至少75％的序列同一性。最优选的是，除CDRs外的人和鼠可变区具有至少80％的序列同一性。
用于产生此种抗体的方法是本领域已知的(参见EP 239,400；PCT公开号 WO 91/09967；
美国专利号5,225,539；5,530,101；和5,585,089), 镶面(veneering)或表面重建(resurfacing)( EP 592,106; EP 519,596；Padlan (1991) Mol. Immunol. 28(4/5):
489-498；Studnicka等人(1994) Protein Engineering 7(6): 805-814；Roguska等人(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 969-973)，和链改组(美国专利号5,565,352)。
用于产生此种抗体的方法是本领域已知的(参见EP 239,400；PCT公开号 WO 91/09967；
美国专利号5,225,539；5,530,101；和5,585,089), 镶面(veneering)或表面重建(resurfacing)( EP 592,106; EP 519,596；Padlan (1991) Mol. Immunol. 28(4/5):
489-498；Studnicka等人(1994) Protein Engineering 7(6): 805-814；Roguska等人(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 969-973)，和链改组(美国专利号5,565,352)。
[0149] 人源化抗体是来自结合所需抗原的非人物种抗体的抗体分子，具有来自非人物种的一个或多个互补性决定区(CDRs)和来自人免疫球蛋白分子的构架区。已知的人Ig序列在下述中公开，例如，每个完整地通过引用并入本文。如本领域已知的，此种输入的序列可以用于减少免疫原性，或减少、增强或修饰结合、亲和力、结合速率、解离速率、抗体亲抗原性、特异性、半衰期、或任何其他合适的特征。
[0150] 人构架区中的构架残基可以用来自CDR供体抗体的相应残基取代，以改变，优选地改善抗原结合。这些构架取代通过本领域众所周知的方法鉴定，例如通过对CDR和构架残基的相互作用建模以鉴定对抗原结合重要的构架残基，和序列比较以鉴定在特定位置上的罕见构架残基。参见例如，美国专利号5,585,089；Riechmann等人(1988) Nature332:323。三维免疫球蛋白模型通常是可获得的且是本领域技术人员熟悉的。举例说明且展示所选候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序是可获得的。这些展示的检查允许分析残基在候选免疫球蛋白序列功能发挥中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。以这种方式，可以从共有和输入序列选择且组合FR残基，从而使得达到所需抗体特征，诸如对一种或多种靶抗原的亲和力增加。一般而言，CDR残基直接且最重要地参与影响抗原结合。抗体可以使用本领域已知的多种技术进行人源化，诸如但不限于下述参考文献中描述的那些：
。
。
[0151] 亲本单克隆抗体可以选自各种能够结合IL-1α 或 IL-1β的单克隆抗体。
[0152] 亲本单克隆抗体还可以选自批准用于在临床试验，或临床用途开发中使用的各种治疗性抗体。
[0153] B. DVD-Ig 分子的构建双重可变结构域免疫球蛋白(DVD-Ig)分子进行这样设计，从而使得来自2种不同亲本单克隆抗体的2个不同轻链可变结构域(VL)通过重组DNA技术直接或通过短接头串联连接，随后为轻链恒定结构域。类似地，重链包含串联连接的2个不同重链可变结构域(VH)，随后为恒定结构域CH1和Fc区。参见，PCT 公开号WO 2007/024715。
[0154] 可变结构域可以使用重组DNA技术从亲本抗体获得，所述亲本抗体通过上文所述方法中的任何一种生成。在优选的实施方案中，可变结构域是鼠重或轻链可变结构域。更优选地，可变结构域是CDR嫁接的或人源化的可变重或轻链结构域。最优选地，可变结构域是人重或轻链可变结构域。
[0155] 在一个实施方案中，第一个和第二个可变结构域使用重组DNA技术直接互相连接。在另一个实施方案中，可变结构域通过接头序列进行连接。优选地，连接2个可变结构域。3个或更多可变结构域也可以直接或通过接头序列进行连接。可变结构域可以结合相同抗原或可以结合不同抗原。本发明的DVD-Ig分子可以包括1个免疫球蛋白可变结构域和1个非免疫球蛋白可变结构域，诸如受体的配体结合结构域，酶活性结构域。DVD-Ig分子也可以包含2个或更多非-Ig结构域。
[0156] 接头序列可以是单一氨基酸或多肽序列。可用于设计和产生可用于本文所述的方法和组合物中的DVD-Ig结合蛋白的接头序列的实例包括但不限于：接头序列的选择基于几种Fab分子的晶体结构分析。在Fab或抗体
分子结构中的可变结构域和CH1/CL恒定结构域之间存在天然柔性键。这种天然键包含约
10-12个氨基酸残基，由来自V结构域的C末端的4-6个残基和来自CL/CH1结构域的N末端的4-6个残基促成。在一个实施方案中，可用于本发明中的DVD-Ig分子，使用CL或CH1的N末端5-6个氨基酸残基或11-12个氨基酸残基分别作为DVD-Ig分子的轻链和重链中的接头来贡献。CL或CH1结构域的N末端残基，特别是前5-6个氨基酸残基，采取环构象而无强二级结构，且因此可以充当2个可变结构域之间的柔性接头。CL或CH1结构域的N末端残基是可变结构域的天然延伸，因为它们是免疫球蛋白序列的部分，且因此使可能由接头和接点引起的任何免疫原性很大程度地降到最低。
分子结构中的可变结构域和CH1/CL恒定结构域之间存在天然柔性键。这种天然键包含约
10-12个氨基酸残基，由来自V结构域的C末端的4-6个残基和来自CL/CH1结构域的N末端的4-6个残基促成。在一个实施方案中，可用于本发明中的DVD-Ig分子，使用CL或CH1的N末端5-6个氨基酸残基或11-12个氨基酸残基分别作为DVD-Ig分子的轻链和重链中的接头来贡献。CL或CH1结构域的N末端残基，特别是前5-6个氨基酸残基，采取环构象而无强二级结构，且因此可以充当2个可变结构域之间的柔性接头。CL或CH1结构域的N末端残基是可变结构域的天然延伸，因为它们是免疫球蛋白序列的部分，且因此使可能由接头和接点引起的任何免疫原性很大程度地降到最低。
[0157] 其他接头序列可以包括任何长度的CL/CH1结构域的任何序列，但不是CL/CH1结构域的所有残基；例如CL/CH1结构域的前5-12个氨基酸残基；轻链接头可以来自Cκ 或 Cλ；且重链接头可以来源于任何同种型的CH1，包括Cγ1, Cγ2, Cγ3, Cγ4, Cα1, Cα2，Cδ, Cε, 和Cμ。接头序列还可以来源于其他蛋白诸如Ig-样蛋白，(例如，TCR、FcR、KIR)；基于G/S的序列(例如，G4S (SEQ ID NO:88)重复)；铰链区衍生的序列；和来自其他蛋白的其他天然序列。
[0158] 在一个实施方案中，使用重组DNA技术使恒定结构域与2个连接的可变结构域连接。优选地，包含连接的重链可变结构域的序列与重链恒定结构域连接，且包含连接的轻链可变结构域的序列与轻链恒定结构域连接。优选地，当DVD-Ig结合蛋白是用于人时，恒定结构域分别是人重链恒定结构域和人轻链恒定结构域。优选地，DVD-Ig重链与Fc区进一步连接。Fc区可以是天然序列Fc区，或变体Fc区。最优选地，Fc区是人Fc区。在优选的实施方案中，Fc区包括来自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE、或IgD的Fc区。
[0159] 在一个实施方案中，两条重链DVD-Ig多肽和两条轻链DVD-Ig多肽组合形成DVD-Ig分子。已描述能够结合特定目标的特定DVD-Ig分子和其制备方法的实例的详细描述。参见例如PCT公开号WO 2007/024715。
[0160] C. DVD-Ig 结合蛋白的产生结合IL-1α和IL-1β且可用于本文所述的治疗骨关节炎的方法和组合物中的
DVD-Ig蛋白可通过本领域中已知的许多技术中的任一种来制备。参见例如，PCT公开号
2007/024715。例如，来自宿主细胞的表达，其中编码DVD-Ig重和DVD-Ig轻链的一种或多种表达载体通过标准技术转染到宿主细胞内。术语“转染”的各种形式预期包含通常用于将外源DNA引入原核或真核宿主细胞内的广泛多样的技术，例如，电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染等。尽管可能在原核或真核宿主细胞中表达DVD-Ig结合蛋白，但在真核细胞中表达DVD-Ig蛋白是优选的，且最优选在哺乳动物宿主细胞中，因为此种真核细胞(且特别是哺乳动物细胞)比原核细胞更可能装配和分泌正确折叠和免疫学活性的DVD-Ig蛋白。
DVD-Ig蛋白可通过本领域中已知的许多技术中的任一种来制备。参见例如，PCT公开号
2007/024715。例如，来自宿主细胞的表达，其中编码DVD-Ig重和DVD-Ig轻链的一种或多种表达载体通过标准技术转染到宿主细胞内。术语“转染”的各种形式预期包含通常用于将外源DNA引入原核或真核宿主细胞内的广泛多样的技术，例如，电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染等。尽管可能在原核或真核宿主细胞中表达DVD-Ig结合蛋白，但在真核细胞中表达DVD-Ig蛋白是优选的，且最优选在哺乳动物宿主细胞中，因为此种真核细胞(且特别是哺乳动物细胞)比原核细胞更可能装配和分泌正确折叠和免疫学活性的DVD-Ig蛋白。
[0161] 用于表达本发明的重组抗体的优选的哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括在Urlaub和Chasin (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216-4220中描述, 与DHFR选择标记一起使用的dhfr- CHO细胞，例如，如R.J. Kaufman和P.A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159: 601-621中描述的)、NS0骨髓瘤细胞、COS细胞、和SP2细胞。当编码DVD-Ig蛋白的重组表达载体被引入哺乳动物宿主细胞内时，通过将宿主细胞培养足够时间期间以允许DVD-Ig蛋白在宿主细胞中表达，或更优选地，DVD-Ig蛋白分泌到其中宿主细胞生长的培养基内而产生DVD-Ig蛋白。DVD-Ig蛋白可以使用标准蛋白纯化法从培养基中回收。
[0162] 在用于重组表达可用于本发明中的DVD-Ig蛋白的优选系统中，编码DVD-Ig重链和DVD-Ig轻链两者的重组表达载体通过磷酸钙介导的转染引入dhfr-CHO细胞内。在重组表达载体内，DVD-Ig重和轻链基因各自与CMV增强子/AdMLP启动子调节元件可操作地连接，以驱动基因的高水平转录。重组表达载体还携带DHFR基因，所述DHFR基因允许使用氨甲蝶呤选择/扩增选择已用载体转染的CHO细胞。培养所选转化体宿主细胞以允许表达DVD-Ig重和轻链，且从培养基中回收完整的DVD-Ig蛋白。使用标准分子生物学技术以制备重组表达载体、转染宿主细胞、选择转化体、培养宿主细胞和从培养基中回收DVD-Ig蛋白。又进一步本发明提供了合成本发明的DVD-Ig蛋白的方法，其通过在合适的培养基中培养本发明的宿主细胞直至合成本发明的DVD-Ig蛋白。该方法可以进一步包含从培养基中分离DVD-Ig蛋白。
[0163] DVD-Ig结合蛋白的重要特征是它可以以与常规抗体相似的方式产生和纯化。DVD-Ig结合蛋白的产生导致具有所需双重特异性活性的均质、单一的主要产物，而无恒定区的任何序列修饰或任何种类的化学修饰。生成“双特异性”、“多特异性”和“多特异性多价”全长结合蛋白的其他先前描述的方法不导致单一的主要产物，而是导致装配的无活性、单特异性、多特异性、多价、全长结合蛋白，和具有不同结合位点组合的多价全长结合蛋白的混合物的细胞内或分泌的产生。作为实例，基于由Miller和Presta (PCT公开号WO2001/077342描述的设计，存在重和轻链的16种可能组合。因此只有6.25％的蛋白可能处于所需活性形式。使用标准层析技术使完全活性形式的蛋白与无活性和部分活性形式的蛋白分离仍有待证实，所述标准层析技术一般在大规模制备中使用。
[0164] 令人惊讶的是，DVD-Ig 结合蛋白(其为“双重-特异性多价全长结合蛋白”)的设计导致双重可变结构域轻链和双重可变结构域重链，所述轻链和重链主要装配成所需“双重特异性多价全长结合蛋白”，即功能性DVD-Ig 结合蛋白。参见，PCT公开号WO2007/024715。
[0165] II. 结晶和衍生化的结合蛋白本发明包括治疗骨关节炎的方法和组合物，其中结合蛋白为晶体。在一个实施方案中，结晶结合蛋白具有比结合蛋白的可溶性对应物更长的体内半衰期。在另一个实施方案中，结合蛋白在结晶化后保留生物学活性。
[0166] 可用于本发明中的结晶结合蛋白可以根据本领域已知的和如PCT公开号 WO02072636(通过引用并入本文)公开的方法来产生。
[0167] 本发明的另一个实施方案使用了糖基化的结合蛋白，其中结合蛋白或其抗原结合部分包含一个或多个碳水化合物残基。新生体内蛋白产生可以经历称为翻译后修饰的进一步加工。特别地，糖(糖基)残基可以酶促添加，这个过程称为糖基化。所得到的具有共价连接的寡糖侧链的蛋白被称为糖基化蛋白或糖蛋白。抗体是在Fc结构域以及可变结构域中具有一个或多个碳水化合物残基的糖蛋白。Fc结构域中的碳水化合物残基对Fc结构域的效应子功能有重要作用，对抗体的抗原结合或半衰期有最低的作用(Jefferis (2005) Biotechnol. Prog., 21: 11–16)。相比之下，可变结构域的糖基化可能对抗体的抗原结合活性有作用。可变结构域中的糖基化可能对抗体结合亲和力具有负面作用，可能是由于空间位阻(Co等人(1993) Mol. Immunol. 30: 1361-1367), 或导致对抗原的亲和力增加(Wallick等人(1998) Exp. Med. 168:1099-1109；Wright等人(1991) EMBO J.10:2717-2723)。
[0168] 也可以生成糖基化位点突变体，其中s结合蛋白的O-或N-连接的糖基化位点已进行突变。本领域技术人员可以使用标准的技术来生成此种突变体。保留生物学活性但具有增加或减少的结合活性的糖基化位点突变体也可用于本文所述的治疗骨关节炎的方法和组合物中。
[0169] 可修饰可用于本发明的方法和组合物中的结合蛋白或其抗原结合部分的糖基化。例如，可以制备无糖基化(aglycoslated)抗体(即该抗体缺乏糖基化)。糖基化可以进行改变，以例如增加抗体对抗原的亲和力。此种碳水化合物修饰可以通过例如改变抗体序列内的一个或多个糖基化位点来完成。例如，可以制备导致一个或多个可变区糖基化位点消除的一个或多个氨基酸取代，以从而消除该位点的糖基化。此种无糖基化可以增加抗体对抗原的亲和力。此种方法在PCT公开号WO 2003/016466和美国专利号5,714,350和
6,350,861中进一步详细描述。
6,350,861中进一步详细描述。
[0170] 此外或可替代地，可以制备具有改变的糖基化类型的可用于本发明中的修饰的结合蛋白，诸如具有减少量的岩藻糖基残基的岩藻糖基化不足(hypofucosylated)抗体或具有增加的等分GlcNAc结构的抗体。此种改变的糖基化模式已显示增加抗体的ADCC能力。此种碳水化合物修饰可以通过例如在具有改变的糖基化机制的宿主细胞中表达结合蛋白来完成。具有改变的糖基化机制的细胞已在本领域得到描述，且可以用作在其中表达本发明的重组抗体的宿主细胞，以从而产生具有改变的糖基化的抗体。参见例如，Shields等人(2002) J. Biol. Chem. 277: 26733-26740；Umana等人(1999) Nat. Biotech. 17:
176-181, 以及欧洲专利号EP 1,176,195；和PCT公开号WO 03/035835和WO 99/5434280。
176-181, 以及欧洲专利号EP 1,176,195；和PCT公开号WO 03/035835和WO 99/5434280。
[0171] 蛋白糖基化取决于目的蛋白的氨基酸序列，以及在其中表达蛋白的宿主细胞。不同生物可以产生不同的糖基化酶(例如，糖基转移酶和糖苷酶)，且具有不同的可用底物(核苷酸糖)。由于这些因素，蛋白糖基化模式和糖基残基组成可以依赖于在其中表达特定蛋白的宿主系统而不同。在本发明中有用的结合蛋白的糖基残基可以包括但不限于，葡萄糖、半乳糖、甘露糖、岩藻糖、n-乙酰葡糖胺和唾液酸。优选地，糖基化的结合蛋白包含糖基残基，从而使得糖基化模式是人的。
[0172] 不同的蛋白糖基化可以导致不同的蛋白特征，这是本领域技术人员已知的。例如，与哺乳动物细胞诸如CHO细胞系中表达的相同蛋白的效力相比较，在微生物宿主诸如酵母中产生和利用酵母内源性途径糖基化的治疗蛋白的效力可能是减少的。此种糖蛋白在人中也可以是免疫原性的，且在施用后显示减少的体内半衰期。人和其他动物中的特定受体可以识别特定糖基残基且促进蛋白从血流中快速清除。其他不利效应可以包括蛋白折叠、可溶性、对蛋白酶的敏感性、运输、转运、区室化、分泌、由其他蛋白或因子识别、抗原性、或变应原性中的变化。因此，从业者可能偏好具有特定糖基化组成和模式(例如等同于或至少类似于在人细胞或预期受试动物的物种特异性细胞中产生的糖基化组成和模式的糖基化组成和模式)的治疗蛋白。
[0173] 表达不同于宿主细胞那种的糖基化蛋白可以通过遗传修饰宿主细胞以表达异源糖基化酶来完成。使用本领域已知的技术，从业者可以生成显示人蛋白糖基化的抗体或其抗原结合部分。例如，酵母菌株已进行遗传修饰以表达非天然存在的糖基化酶，从而使得在这些酵母菌株中产生的糖基化蛋白(糖蛋白)显示等同于动物细胞特别是人细胞的蛋白糖基化的蛋白糖基化(美国专利公开号2004/0018590和2002/0137134以及PCT公开号 WO2005/100584)。
[0174] 此外，本领域技术人员将理解，目的蛋白可以使用宿主细胞文库来表达，所述宿主细胞进行基因工程改造以表达各种糖基化酶，从而使得文库的成员宿主细胞产生具有变体糖基化模式的目的蛋白。从业者随后可以选择并分离具有特定新糖基化模式的目的蛋白。优选地，具有特定选择的新糖基化模式的蛋白显示改善或改变的生物学性质。
[0175] IV. 药物组合物本发明的方法采用用于治疗个体的骨关节炎或疼痛的药物组合物，所述药物组合物包含一种或多种结合IL-1α和/或IL-1β的结合蛋白。该组合物还可包含药学可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂、或向该组合物提供除结合IL-1α和/或IL-1β的一种或多种结合蛋白的活性以外的所需治疗、药学或药理学益处的任何其他一种或多种化合物。在一个实施方案中，本发明的可用于治疗个体的骨关节炎或疼痛的组合物包含结合IL-1α的结合蛋白(例如抗IL-1α抗体)和结合IL-1β的结合蛋白(诸如抗IL-1β抗体)，或结合IL-1α和/或IL-1β两者的结合蛋白(诸如IL-1α/β DVD-Ig结合蛋白)。
[0176] 可用于本发明的方法中的结合蛋白可以并入适合于给受试者施用的药物组合物内。一般地，药物组合物包含一种或多种结合IL-1α 和/或 IL-1β的结合蛋白和药学可接受的载体。如本文使用，“药学可接受的载体”广泛地包括生理学相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。药学可接受的载体的实例包括下述一种或多种：水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等，及其组合。在许多情况下，优选在组合物中包括等渗剂，例如糖、多元醇(例如，甘露糖醇或山梨糖醇)、或氯化钠。药学可接受的载体可以进一步包含少量辅助物质，诸如湿润剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂，所述辅助物质增强抗体或抗体部分的保存期限或效力。
[0177] 各种递送系统是已知的，且可以用于施用一种或多种可用于本发明中的结合蛋白或一种或多种结合蛋白与预防剂或其他治疗剂的组合，用于预防、管理、治疗或改善个体的骨关节炎或疼痛，例如被囊化在脂质体中、微粒、微胶囊、能够表达结合蛋白或片段的重组细胞、和受体介导的胞吞(参见例如，Wu和Wu (1987) J. Biol. Chem., 262: 4429-4432)、构建作为逆转录病毒或其他载体部分的核酸等。施用结合IL-1α 和/或 IL-1β的结合蛋白到个体的方法包括但不限于，肠胃外施用(例如，皮内、肌内、腹膜内、静脉内和皮下)，硬膜外施用，瘤内施用和粘膜施用(例如，鼻内和经口途径)。此外，可以使用肺施用，例如利用吸入器或喷雾器，和含气溶胶化剂(aerosolizing agent)的制剂。参见例如，美国专利号6,019,968; 5,985,320; 5,985,309; 5,934,272; 5,874,064; 5,855,913; 和5,290,540；以及PCT公开号WO 92/19244, WO 97/32572, WO 97/44013, WO 98/31346, 和WO 99/66903。在一个实施方案中，可用于本发明中的结合蛋白使用Alkermes AIR®肺药物递送技术(Alkermes, Inc., Cambridge, Mass.)来施用。在特定的实施方案中，可用于本发明中的结合蛋白通过肌内、静脉内、瘤内、经口、鼻内、肺、或皮下施用。结合蛋白可以通过任何方便的途径施用，例如通过输注或推注注射，通过通过上皮或粘膜皮肤保护层(lining)(例如，口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)吸收，且可以连同其他生物学活性剂一起施用。施用可以是全身或局部的。
[0178] 在特定的实施方案中，可能需要将结合蛋白局部施用在需要治疗的区域，诸如直接进入关节区域。这可以通过例如但不限于局部输注、注射、或通过植入物来完成，其中所述植入物为多孔或无孔材料，包括膜和基质，诸如硅橡胶(sialastic)膜、聚合物、纤维基质(例如，Tissuel®)、或胶原基质。在一个实施方案中，当另有发生骨关节炎、包括疼痛，有效量的一种或多种结合蛋白局部施用于受影响关节，以治疗、管理、改善和/或预防软骨变性的进一步发展。在另一个实施方案中，有效量的一种或多种结合蛋白，与有效量的除结合蛋白外的一种或多种其他治疗剂(例如，一种或多种预防或治疗剂)组合，局部施用于受影响关节，以预防、治疗、管理、和/或改善骨关节炎或其一种或多种症状，包括疼痛。
[0179] 在另一个实施方案中，IL-1α 和 IL-1β结合蛋白可以在控释或持续释放系统中递送。在一个实施方案中，可以使用泵以实现控释或持续释放 (参见Langer (1990) Science 249:1527-1533; Sefton (1987) CRC Crit. Rev. Biomed. Eng., 14:201-240; Buchwald等人(1980) Surgery, 88: 507-516; Saudek等人(1989) N. Engl. J. Med., 321: 574-579)。在另一个实施方案中，聚合材料可以用于达到可用于本发明中的结合蛋白的控释或持续释放 (参见例如，Medical Applications of Controlled Release, (Langer和Wise,编) (CRC Press, Inc., Boca Raton, 1984); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, (Smolen 和 Ball, 编) (Wiley, New York, 1984); Langer和Peppas (1983) J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. Phys., C23: 61-126; 还参见Levy等人(1985) Science 228:190-192; During等人(1989) Ann. Neurol., 25: 351-356; Howard 等人(1989) J. Neurosurg.
71:105-112); 美 国 专 利 号 5,679,377; 5,916,597; 5,912,015; 5,989,463; 和
5,128,326; 以及PCT 公开号WO 99/15154和WO 99/20253。在持续释放制剂中使用的聚合物的实例包括但不限于，聚甲基丙烯酸2-羟乙酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚丙烯酸、乙烯-乙酸乙烯酯共聚物、聚甲基丙烯酸、聚乙交酯(PLG)、聚酐、聚N-乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、聚乙二醇、聚丙交酯(PLA)、丙交酯-乙交酯共聚物(PLGA)、和聚原酸酯。在一个实施方案中，持续释放制剂中使用的聚合物是惰性的、不含可滤出杂质、贮藏稳定、无菌和生物可降解的。在又另一个实施方案中，控释或持续释放系统可以接近预防或治疗目标放置，从而只需要全身剂量的部分(参见例如，Goodson, J.M., 第6章, Medical Applications of Controlled Release, Vol. II, Applications and Evaluation, (Langer 和Wise，编)(CRC Press, Inc., Boca Raton, 1984), 第115-138页)。
71:105-112); 美 国 专 利 号 5,679,377; 5,916,597; 5,912,015; 5,989,463; 和
5,128,326; 以及PCT 公开号WO 99/15154和WO 99/20253。在持续释放制剂中使用的聚合物的实例包括但不限于，聚甲基丙烯酸2-羟乙酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚丙烯酸、乙烯-乙酸乙烯酯共聚物、聚甲基丙烯酸、聚乙交酯(PLG)、聚酐、聚N-乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、聚乙二醇、聚丙交酯(PLA)、丙交酯-乙交酯共聚物(PLGA)、和聚原酸酯。在一个实施方案中，持续释放制剂中使用的聚合物是惰性的、不含可滤出杂质、贮藏稳定、无菌和生物可降解的。在又另一个实施方案中，控释或持续释放系统可以接近预防或治疗目标放置，从而只需要全身剂量的部分(参见例如，Goodson, J.M., 第6章, Medical Applications of Controlled Release, Vol. II, Applications and Evaluation, (Langer 和Wise，编)(CRC Press, Inc., Boca Raton, 1984), 第115-138页)。
[0180] 控释系统在Langer, Science, 249: 1527-1533 (1990)的综述中讨论。本领域技术人员已知的任何技术都可以用于产生包含本发明的一种或多种治疗剂的持续释放制剂。参见例如，美国专利号4,526,938；PCT公开号WO 91/05548和WO 96/20698；Ning等人(1996) Radiother. Oncol., 39: 179-189；Song等人(1996) PDA J. Pharm. Sci. Technol., 50: 372-377；Cleek等人(1997) Proceed. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24: 853-854；和Lam 等人(1997) Proceed. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater., 24: 759-760。
[0181] 在特定的实施方案中，当可用于本发明中的组合物是编码结合IL-1α 和/或 IL-1β的蛋白的核酸时，核酸可以体内施用以促进其编码的预防或治疗剂的表达，这通过下述实现，将其构建为合适的核酸表达载体的部分且施用它，从而使得其成为细胞内的，例如通过利用逆转录病毒载体(参见例如，美国专利号4,980,286)，或通过直接注射，或通过使用微粒轰击(例如，基因枪；Biolistic，DuPont )，或用脂质或细胞表面受体或转染剂包被，或通过与已知进入核的同源异型框样肽连接施用它(参见例如，Joliot等人(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1864-1868)。可替代地，核酸可以细胞内引入且通过同源重组并入宿主细胞DNA内用于表达。
[0182] 用于治疗骨关节炎或疼痛的可用于本发明中的药物组合物配制为与其预期施用途径相容。施用途径的实例包括但不限于，肠胃外，例如，静脉内、皮内、皮下、经口、鼻内(例如，吸入)、经皮(例如，局部)、跨粘膜、和直肠施用。在特定的实施方案中，组合物根据常规程序配制为药物组合物，所述药物组合物适合于静脉内、皮下、肌内、经口、鼻内或局部施用于人类。一般地，用于静脉内施用的组合物是在无菌等渗水性缓冲液中的溶液。必要时，组合物还可以包括增溶剂和局部麻醉剂诸如利诺卡因(lignocamne)，以减轻注射部位处的疼痛。
[0183] 如果用于治疗骨关节炎或疼痛的可用于本发明中的组合物将局部施用，那么组合物可以配制为软膏、乳膏、经皮贴剂、洗剂、凝胶、洗发剂样物(shampoo)、喷雾剂、气溶胶、溶液、乳剂形式或本领域技术人员众所周知的其他形式。参见例如，Remington's Pharmaceutical Sciences and Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, 第19版, (Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania, 1995)。对于不可喷雾的局部剂型，通常使用包含与局部应用相容的载体或一种或多种赋形剂，且优选地具有大于水的动态粘度的粘性至半固体或固体形式。其他合适的制剂包括但不限于，悬浮液、粉末、搽剂、油膏等。在一个实施方案中，此制剂进行除菌或与助剂(例如防腐剂、稳定剂、湿润剂、缓冲剂或盐)混合用于影响各种性质，诸如，例如，渗透压。其他合适的局部剂型包括可喷雾的气溶胶制剂，其中活性成分，例如，与固体或液体惰性载体组合，包装在与加压挥发物(例如，气体推进剂，诸如FREON®)的混合物中或包装在挤压瓶中。必要时保湿剂(moisturizer)或湿润剂也可以加到药物组合物和剂型中。此种另外成分的实例是本领域众所周知的。
[0184] 如果用于治疗骨关节炎或疼痛的本发明的方法包括组合物的鼻内施用，那么组合物可以配制为气溶胶形式、喷雾剂、雾或滴剂形式。特别地，根据本发明使用的结合蛋白可以以从加压包装或喷雾器呈递的气溶胶喷雾剂形式方便地递送，使用合适的推进剂(例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适的气体)。在加压气溶胶的情况下，剂量单位可以通过提供阀来确定，以递送计量的量。可以配制包含化合物和合适粉末基诸如乳糖或淀粉的粉末混合物的胶囊和药液筒(cartridges)(由例如明胶构成)，用于在吸入器或吹入器中使用。
[0185] 如果用于治疗骨关节炎或疼痛的本发明的方法包括经口施用，那么组合物可以配制为片剂、胶囊、扁囊剂、软胶囊(gelcaps)、溶液、悬浮液等经口形式。片剂或胶囊可以通过常规方法用药学可接受的赋形剂制备，所述赋形剂诸如粘合剂(例如，预凝胶玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、或羟丙基甲基纤维素)；填充剂(例如，乳糖、微晶纤维素、或磷酸氢钙)；润滑剂(例如，硬脂酸镁、滑石粉或硅石)；崩解剂(例如，马铃薯淀粉或羟基乙酸淀粉钠)；
或湿润剂(例如，十二烷基硫酸钠)。片剂可以通过本领域众所周知的方法进行包衣。用于经口施用的液体制剂可以采取下述形式，但不限于下述形式，溶液、糖浆或悬浮液，或它们可以呈现为干燥产品，用于在使用前用水或其他合适的媒介物构建。此种液体制剂可以通过常规方法用药学可接受的添加剂制备，所述添加剂诸如悬浮剂(例如，山梨糖醇糖浆、纤维素衍生物、或氢化可食用脂肪)；乳化剂(例如，卵磷脂或阿拉伯胶)；非水媒介物(例如，杏仁油、油酯、乙醇、或分馏植物油)；和防腐剂(例如，对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸)。适当时制剂还可以包含缓冲盐、调味剂、着色剂和甜味剂。用于经口施用的制剂可以适当地配制，用于缓慢释放、控释、或持续释放一种或多种用于治疗骨关节炎或疼痛的可用于本发明的结合蛋白。
或湿润剂(例如，十二烷基硫酸钠)。片剂可以通过本领域众所周知的方法进行包衣。用于经口施用的液体制剂可以采取下述形式，但不限于下述形式，溶液、糖浆或悬浮液，或它们可以呈现为干燥产品，用于在使用前用水或其他合适的媒介物构建。此种液体制剂可以通过常规方法用药学可接受的添加剂制备，所述添加剂诸如悬浮剂(例如，山梨糖醇糖浆、纤维素衍生物、或氢化可食用脂肪)；乳化剂(例如，卵磷脂或阿拉伯胶)；非水媒介物(例如，杏仁油、油酯、乙醇、或分馏植物油)；和防腐剂(例如，对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸)。适当时制剂还可以包含缓冲盐、调味剂、着色剂和甜味剂。用于经口施用的制剂可以适当地配制，用于缓慢释放、控释、或持续释放一种或多种用于治疗骨关节炎或疼痛的可用于本发明的结合蛋白。
[0186] 根据本发明用于治疗骨关节炎的方法或治疗疼痛的方法可以包括用气溶胶化剂(aerosolizing agent)配制的组合物的肺施用，例如利用吸入器或喷雾器。参见例如，美国专利号 6,019, 968; 5,985,320; 5,985,309; 5,934,272; 5,874,064; 5,855,913; 和5,290,540; 以及PCT 公开号WO 92/19244; WO 97/32572; WO 97/44013; WO 98/31346; 和WO 99/66903。在特定的实施方案中，用于治疗骨关节炎的结合IL-1α 和/或 IL-1β的结合蛋白、或组合治疗，使用Alkermes AIR®肺药物递送技术(Alkermes, Inc., Cambridge, Massachusetts)来施用。
[0187] 本发明的方法可以包括配制用于通过注射(例如通过推注注射或连续输注)肠胃外施用的组合物的施用，所述组合物包含结合IL-1α 和/或 IL-1β的结合蛋白。用于注射的制剂可以与添加的防腐剂一起以单位剂型(例如，在安瓿或多剂量容器中)呈递。组合物可以采取此种形式，如在油性或水性媒介物中的悬浮液、溶液或乳剂，且可以包含配制试剂诸如悬浮、稳定和/或分散剂。可替代地，结合蛋白可以为粉末形式用于在使用前用合适的媒介物(例如，无菌无致热原水)构建。
[0188] 本发明的方法可以另外包括配制为积存(depot)制剂的组合物的施用。此种长效制剂可以通过植入(例如皮下或肌内)或通过肌内注射来施用。因此，例如，组合物可以用合适的聚合或疏水材料(例如，作为在可接受的油中的乳剂)或离子交换树脂配制，或配制为微溶衍生物(例如，作为微溶盐)。
[0189] 本发明的方法包括配制为中性或盐形式的组合物的施用。药学可接受的盐包括由阴离子形成的那些，诸如来源于盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的那些，以及由阳离子形成的那些，诸如来源于氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的那些。
[0190] 一般地，组合物的成分分开或混合在一起以单位剂型提供，例如，作为在指示活性剂的量的密封容器中的干冷冻干燥粉末或无水浓缩物，所述密封容器诸如安瓿或囊剂。当施用方式是输注时，组合物可以用包含无菌药物级别的水或盐水的输注瓶分配。当施用方式是通过注射时，可以提供无菌注射用水或盐水的安瓿，从而使得成分可以在施用前进行混合。
[0191] 本发明还提供一种或多种结合IL-1α和/或IL-1β的结合蛋白或包含该结合蛋白的包装在密闭容器(诸如指示药剂量的安瓿或药囊)中的药物组合物。在一个实施方案中，一种或多种结合IL-1α 和/或 IL-1β的结合蛋白或包含此类一种或多种结合蛋白的药物组合物，作为在密封容器中的干无菌冷冻干燥粉末或无水浓缩物提供，且可以重构(例如，用水或盐水)至合适浓度以用于给受试者施用，以治疗关节炎或疼痛。在一个实施方案中，一种或多种结合IL-1α 和/或 IL-1β的结合蛋白或包含此类一种或多种结合蛋白的药物组合物，作为在密封容器中的干无菌冷冻干燥粉末提供，其单位剂量为至少约5 mg、至少约10 mg、至少约15 mg、至少约25 mg、至少约35 mg、至少约45 mg、至少约50 mg、至少约75 mg、或至少约100 mg。冷冻干燥的一种或多种结合蛋白或包含此类一种或多种结合蛋白的药物组合物应在其原容器中贮存于约2℃-约8℃，并且一种或多种结合蛋白或包含此类一种或多种结合蛋白的药物组合物应在重构后1周内、5天内、72小时内、48小时内、24小时内、12小时内、6小时内、5小时内、3小时内、或1小时内施用。在可替代的实施方案中，一种或多种结合IL-1α 和/或 IL-1β的结合蛋白或包含此类一种或多种结合蛋白的药物组合物，以液体形式在指示药剂的量和浓度的密封容器中提供。在一个实施方案中，液体形式的施用的组合物在密封容器中提供，其量为至少约0.25 mg/ml，至少约0.5 mg/ml、至少约1 mg/ml、至少约2.5 mg/ml、至少约5 mg/ml、至少约8 mg/ml、至少约10 mg/ml、至少约15 mg/kg、至少约25 mg/ml、至少约50 mg/ml、至少约75 mg/ml或至少约100 mg/ml。
液体形式应在其原容器中贮存于约2℃-约8℃。
液体形式应在其原容器中贮存于约2℃-约8℃。
[0192] 本文所述的可用于本方法和组合物中的结合蛋白可以并入适用于肠胃外施用的药物组合物内。在一个方面，结合蛋白将制备为包含约0.1 mg/ml-约250 mg/ml抗体的可注射溶液。可注射溶液可以由在燧石或琥珀色小瓶、安瓿或预装注射器中的液体或冷冻干燥剂型组成。缓冲剂可以是L-组氨酸(约1 mM –约50 mM)，最佳约5 mM –约10 mM，约pH 5.0-约7.0(最佳约pH 6.0)。其他合适的缓冲剂包括但不限于，琥珀酸钠、柠檬酸钠、磷酸钠或磷酸钾。氯化钠在浓度约0-约300 mM(对于液体剂型最佳约150 mM)可以用于改变溶液的毒性。对于冷冻干燥剂型可以包括冷冻保护剂，主要为约0％-约10％蔗糖(最佳约0.5％-约1.0％)。其他合适的冷冻保护剂包括海藻糖和乳糖。对于冷冻干燥剂型可以包括膨胀剂，主要为约1％-约10％甘露糖醇(最佳约2% -约4％)。稳定剂可以在液体和冷冻干燥剂型中使用，主要为约1 mM –约50 mM L-甲硫氨酸(最佳约5 mM –约10 mM)。其他合适的膨胀剂包括甘氨酸、精氨酸，可以被包括为约0%-约0.05％的聚山梨醇酯-80(最佳约0.005％-约0.01％)。另外的表面活性剂包括但不限于，聚山梨醇酯20和BRIJ表面活性剂。
[0193] 本发明用于治疗骨关节炎或疼痛的组合物可以为多种形式。这些包括例如，液体、半固体和固体剂型，诸如液体溶液(例如，可注射和可输注溶液)、分散体或悬浮液、片剂、丸剂、粉末、脂质体和栓剂。特殊形式取决于预期施用方式和治疗应用。一般的组合物为可注射或可输注溶液形式，诸如类似于由抗体被动免疫人使用的那些的组合物。施用方式是肠胃外的(例如，静脉内、皮下、腹膜内、肌内)。在一个实施方案中，抗体通过静脉内输注或注射来施用。在另一个实施方案中，抗体通过肌内或皮下注射来施用。
[0194] 治疗组合物一般在制备和贮存条件下必须是无菌且稳定的。组合物可以配制为溶液、微乳剂、分散体、脂质体、或适合于高药物浓度的其他有序结构。无菌可注射溶液可以通过下述制备：将需要量的活性化合物(即，抗体或其抗原结合部分)与上文列举的一种成分或成分组合一起并入合适的溶剂中，必要时随后进行过滤除菌。一般地，分散体通过将活性化合物并入无菌媒介物内来制备，所述无菌媒介物包含基本分散介质和来自上文列举那些的所需的其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌、冷冻干燥粉末的情况下，示例性制备方法是真空干燥和喷雾干燥，所述方法由其先前无菌过滤的溶液产生活性成分加任何另外所需成分的粉末。溶液的正确流动性可以通过下述来维持，例如通过利用包衣诸如卵磷脂，通过在分散体的情况下维持所需颗粒大小和通过利用表面活性剂。可注射组合物的延长吸收可以通过在组合物中包括延迟吸收的试剂来引起，所述试剂例如单硬脂酸盐和明胶。
[0195] 根据本发明可用于治疗骨关节炎或疼痛的结合蛋白可以通过本领域已知的多种方法来施用，尽管示例性施用途径/模式是皮下注射、静脉内注射、或输注。如技术人员将认识到的，施用途径和/或模式将根据所需结果而变化。在某些实施方案中，一种或多种结合蛋白可以与载体一起制备，所述载体将保护一种或多种结合蛋白免于快速释放，诸如控释制剂，包括植入物、经皮贴剂、和微囊化递送系统。可以使用生物可降解的、生物相容的聚合物，诸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备此种制剂的许多方法是获得专利保护的或是本领域技术人员一般已知的。参见例如，Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, 编, (Marcel Dekker, Inc., New York, 1978。
[0196] 在某些实施方案中，可用于本发明的结合蛋白可以例如，与惰性稀释剂或可吸收食用载体一起经口施用。一种或多种结合蛋白(和若需要，其他成分)也可以装入硬或软壳明胶胶囊中，压缩成片剂，或直接并入受试者的饮食内。对于经口治疗施用，化合物可以与赋形剂掺合，且以可摄食片剂、口腔含化片剂、锭剂、胶囊、酏剂、悬浮液、糖浆、薄片(wafer)等的形式使用。为了通过除肠胃外施用外施用本发明的化合物，可能有必要用材料包衣化合物、或将化合物与材料共施用，以防止其失活。
[0197] 补充性活性化合物也可以并入组合物内。在某些实施方案中，可用于本发明的结合蛋白(例如抗体)或其抗原结合部分与一种或多种另外的治疗剂共配制和/或共施用，所述治疗剂可用于治疗骨关节炎或疼痛。例如，结合hIL-1α 和/或 hIL-1β的结合蛋白或其抗原结合部分可以与结合其他目标的一种或多种另外的抗体(例如，结合其他细胞因子或结合细胞表面分子的抗体)共配制和/或共施用。此外，一种或多种结合蛋白可以与一种或更多其他治疗剂组合使用。此种组合治疗可以有利地利用较低剂量的施用的治疗剂，从而避免与各种单一治疗相关的可能毒性或并发症。
[0198] 在某些实施方案中，结合IL-1α 和/或 IL-1β的蛋白或其结合部分与本领域已知的半衰期延长媒介物连接。此种媒介物包括但不限于，Fc结构域、聚乙二醇、和葡聚糖。此种媒介物在例如美国专利号6,660,843中描述。
[0199] 在特定实施方案中，施用含有编码结合蛋白的一种或多种多肽的核苷酸序列的核酸分子，以经由基因治疗治疗、预防、管理或改善骨关节炎。基因治疗指通过给受试者施用表达的或可表达核酸来进行的治疗。在本发明的该实施方案中，核酸产生其所编码的结合蛋白的结合多肽，所述结合蛋白结合IL-1α和/或IL-1β且介导关于骨关节炎或疼痛的预防或治疗作用。
[0200] 根据本发明，可以使用任何在本领域中可获得的用于基因治疗的方法。关于基因治疗方法的一般综述，参见Goldspiel 等人(1993) Clin. Pharm. 12:488-505; Wu 和 Wu (1991) Biotherapy 3: 87-95; Tolstoshev (1993) Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol.32: 573-596; Mulligan (1993) Science 260: 926-932; Morgan和Anderson (1993) Ann. Rev. Biochem. 62:191-217; 以及Robinson, C. (1993) Trends Biotechnol.
11(5):155。可使用的重组DNA技术领域中通常已知的方法描述于Ausubel等人(编), Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, New York, 1993);和Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, (Stockton Press, New York, 1990)。各种基因治疗方法的详细描述在美国专利申请公开号 2005/0042664中公开。
11(5):155。可使用的重组DNA技术领域中通常已知的方法描述于Ausubel等人(编), Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, New York, 1993);和Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, (Stockton Press, New York, 1990)。各种基因治疗方法的详细描述在美国专利申请公开号 2005/0042664中公开。
[0201] 结合IL-1α和/或IL-1β的结合蛋白可单独使用或与一种或多种可用于治疗骨关节炎或疼痛的其他药剂组合使用。例如，其他药剂可以是本领域公认的可用于治疗骨关节炎的一种或多种症状或影响除IL-1以外的与疼痛相关的目标的治疗剂。其他药剂也可以是赋予治疗组合物有利属性的药剂，例如影响待施用于个体的组合物粘度的药剂。
[0202] 应进一步理解的是，包括在本发明中的组合是对其预期目的有用的那些组合。下文所述药剂的目的是举例说明且不希望是限制性的。组合，其是本发明的一部分，可以是结合IL-1α 和/或 IL-1β的结合蛋白和至少一种提供所需性质的另外药剂。组合还可以包括超过一种另外的药剂，例如，2种或3种另外的药剂，如果组合是这样的，从而使得形成的组合物可以行使其预期功能。优选的治疗骨关节炎或疼痛的组合包括非类固醇抗炎药，也称为"NSAIDS"，它包括药物如布洛芬。其他优选的组合是抗炎药，包括皮质类固醇，诸如强的松龙；当与结合IL-1α 和/或 IL-1β的结合蛋白组合治疗患者时，通过逐渐减少所需的类固醇剂量，可以减少或甚至消除类固醇使用的众所周知的副作用。用于治疗患有骨关节炎或疼痛的个体的治疗剂的非限制性实例可包括但不限于以下一种或多种：布地奈德，表皮生长因子，皮质类固醇，环孢菌素、柳氮磺吡啶，氨基水杨酸盐，6-巯基嘌呤，硫唑嘌呤，甲硝唑，脂肪加氧酶抑制剂，美沙拉秦，奥沙拉嗪，巴柳氮，抗氧化剂，血栓烷抑制剂，IL-1受体拮抗剂，抗-IL-1β单克隆抗体，抗-IL-6 单克隆抗体，生长因子，弹性蛋白酶抑制剂，吡啶基-咪唑化合物，TNF、LT、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-18、IL-23、EMAP-II、GM-CSF、FGF、和PDGF的抗体，CD2、CD3、CD4、CD8、CD-19、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD90或其配体的抗体, 氨甲蝶呤、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、霉酚酸酯、来氟洛米、NSAID、布洛芬、皮质类固醇、强的松龙、磷酸二酯酶抑制剂、腺苷激动剂、抗凝剂、补体抑制剂、肾上腺素能药、IRAK、NIK、IKK、p38、MAP激酶抑制剂、IL-1β转换酶抑制剂、TNFα转换酶抑制剂、T-细胞信号传递抑制剂、金属蛋白酶抑制剂、柳氮磺吡啶、硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤、血管紧张素转换酶抑制剂、可溶性细胞因子受体、可溶性p55受体、可溶性p75 TNF受体、sIL-1RI、sIL-1RII、sIL-6R、抗炎细胞因子、IL-4、IL-10、IL-11、IL-13、和TGFβ。
[0203] 本发明的药物组合物可以包括“治疗有效量”或“预防有效量”的一种或多种结合IL-1α 和/或 IL-1β的结合蛋白。“治疗有效量”指在所需剂量和时间段有效达到所需治疗结果的量。结合蛋白的治疗有效量可以由本领域技术人员来确定，且可以根据下述因素而变化，诸如个体疾病状态、年龄、性别、和重量，以及结合蛋白在个体中引起所需应答的能力。治疗有效量也是其中治疗有利作用大于结合蛋白或其部分的任何毒性或有害作用的量。“预防有效量”指在所需剂量和时间段有效达到所需预防结果(诸如预防骨关节炎的患病关节中关节软骨的进一步退化或损失或预防疼痛发作或加剧)的量。一般地，因为预防剂量在疾病前或疾病早期时在受试者中使用，所以预防有效量将小于治疗有效量。
[0204] 在一个实施方案中，本发明提供用于治疗个体疼痛的方法，其中该个体患有与IL-1积聚相关的疾病或病症。个体中的该IL-1积聚可以是IL-1表达减少或IL-1代谢减少的结果。IL-1积聚可在个体的血液(包括血浆、血清)或局部组织中发生。
[0205] 在一个实施方案中，本发明提供用于治疗个体疼痛的方法，其中该个体患有与IL-1积聚相关的疾病或病症。
[0206] 在一个实施方案中，本文所述的组合物和方法可用于治疗患有疾病或病症的个体的疼痛，所述疾病或病症选自骨关节炎、类风湿性关节炎、青少年慢性关节炎、脓毒性关节炎、莱姆关节炎、牛皮癣性关节炎、反应性关节炎、脊椎关节病、系统性红斑狼疮、克罗恩病、溃疡性结肠炎、炎性肠病、胰岛素依赖性糖尿病、甲状腺炎、哮喘、变应性疾病、牛皮癣、皮炎、硬皮病、移植物抗宿主病、器官移植排斥、与器官移植相关的急性或慢性免疫性疾病、肉状瘤病、动脉粥样硬化、弥散性血管内凝血、川崎氏病、Grave氏病、肾病综合症、慢性疲乏综合症、韦格纳氏肉芽肿病、Henoch-Schoenlein紫癜(Henoch-Schoenlein purpurea)、肾显微血管炎、慢性活动性肝炎、葡萄膜炎、脓毒性休克、中毒性休克综合症、脓毒病综合症、恶病质、感染病、寄生虫病、急性横贯性脊髓炎、亨廷顿氏舞蹈病、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、中风、原发性胆汁性肝硬变、溶血性贫血、恶性肿瘤、心力衰竭、心肌梗塞、阿狄森氏病、散发性多腺性I型缺乏、多腺性II型缺乏 (Schmidt氏综合症)、成人(急性)呼吸窘迫综合症、秃头、斑秃(alopecia areata)、血清反应阴性关节病、关节病、Reiter氏病、牛皮癣性关节病、溃疡性结肠炎性关节病、肠病性滑膜炎、衣原体相关性关节病、耶尔森氏菌相关性关节病、沙门氏菌相关性关节病、脊椎关节病、动脉粥样化疾病/动脉硬化、特应性变态反应、自身免疫性大疱性疾病、寻常天疱疮、落叶状天疱疮、类天疱疮、线性IgA疾病、自身免疫性溶血性贫血、Coombs阳性溶血性贫血、获得性恶性贫血、青少年性恶性贫血、肌痛脑炎/Royal Free疾病、慢性粘膜皮肤念珠菌病、巨细胞性动脉炎、原发性硬化性肝炎、隐原性自身免疫性肝炎、获得性免疫缺陷综合症、获得性免疫缺陷相关病、乙型肝炎、丙型肝炎、常见的各种免疫缺陷(常见的可变低丙种球蛋白血症)、扩张型心肌病、女性不育、卵巢衰竭、过早卵巢衰竭、纤维化肺疾病、隐原性纤维化肺泡炎、炎症后间质性肺病、间质性肺炎、结缔组织病相关性间质性肺病、混合型结缔组织病相关性肺病、全身性硬皮病相关性间质性肺病、类风湿性关节炎相关性间质性肺病、系统性红斑狼疮相关性肺病、皮肌炎/多肌炎相关性肺病、斯耶格伦氏病相关性肺病、强直性脊柱炎相关性肺病、脉管炎性弥散性肺病、含铁血黄素沉着病相关性肺病、药物诱导的间质性肺病、纤维化、放射性纤维化、闭塞性细支气管炎、慢性嗜酸性肺炎、淋巴细胞性浸润性肺病、感染后间质性肺病、痛风性关节炎、自身免疫性肝炎、1型自身免疫性肝炎(传统自身免疫性或狼疮样肝炎)、2型自身免疫性肝炎(抗LKM抗体肝炎)、自身免疫介导的低血糖、具有黑棘皮症的B型胰岛素抵抗、甲状旁腺机能减退、与器官移植相关的急性免疫性疾病、与器官移植相关的慢性免疫性疾病、骨关节病、原发性硬化性胆管炎、1型牛皮癣、2型牛皮癣、特发性白细胞减少(leucopaenia)、自身免疫性嗜中性白细胞减少症、肾脏病NOS、肾小球肾炎(glomerulonephritides)、肾显微血管炎、莱姆病、盘状红斑狼疮、特发性男性不育症或NOS、精子自身免疫性、多发性硬化(所有亚型)、交感性眼炎、结缔组织病继发的肺动脉高压、Goodpasture氏综合症、结节性多动脉炎的肺表现、急性风湿热、类风湿性脊椎炎、Still氏病、全身性硬皮病、斯耶格伦氏综合症、高安氏病/动脉炎、自身免疫性血小板减少症、特发性血小板减少症、自身免疫性甲状腺病、甲状腺机能亢进、甲状腺肿性(goitrous)自身免疫性甲状腺功能减退(桥本氏病)、萎缩性自身免疫性甲状腺功能减退、原发性粘液性水肿、晶状体性(phacogenic)葡萄膜炎、原发性血管炎、白癜风、急性肝病、慢性肝病、酒精性肝硬变、酒精诱导的肝损伤、胆汁郁积(cholestasis)、特应性肝病、药物诱导的肝炎、非酒精性脂肪性肝炎、变态反应、B群链球菌(GBS)感染、精神障碍(例如，抑郁和精神分裂症)、Th2型和Th1型介导的疾病、急性和慢性痛(不同形式的疼痛)、癌症诸如肺、乳腺、胃、膀胱、结肠、胰、卵巢、前列腺和直肠癌以及造血恶性肿瘤(白血病和淋巴瘤)、无β脂蛋白血症、手足发绀、急性和慢性寄生或感染过程、急性白血病、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓细胞样白血病(AML)、急性或慢性细菌感染、急性胰腺炎、急性肾功能衰竭、腺癌、心房(atrial)异位搏动、AIDS痴呆复征、酒精诱导的肝炎、变应性结膜炎、过敏性接触性皮炎、变应性鼻炎、同种异体移植物排斥、α-1-抗胰蛋白酶缺乏、肌萎缩性侧索硬化、贫血、心绞痛、前角细胞(horn cell)变性、抗-CD3治疗、抗磷脂综合症、抗受体超敏反应、主动脉和周围性动脉瘤(aneuryisms)、主动脉壁夹层形成、高动脉压、动脉硬化、动静脉瘘、共济失调、心房纤维颤动(持续性或阵发性)、心房扑动、房室传导阻滞、B细胞淋巴瘤、骨移植物排斥、骨髓移植(BMT)排斥、束支传导阻滞、Burkitt氏淋巴瘤、烧伤、心律失常、心脏震晕综合症、心脏肿瘤、心肌病、心肺分流术炎症应答、软骨移植排斥、小脑皮质变性、小脑病症、紊乱性或多源性房性心动过速、化学治疗相关病症、慢性髓细胞性白血病(CML)、慢性酒精中毒、慢性炎性病理学、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性阻塞性肺部疾病(COPD)、慢性水杨酸盐中毒、结肠直肠癌、充血性心力衰竭、结膜炎、接触性皮炎、肺源性心脏病、冠状动脉疾病、克雅氏病、培养物阴性脓毒病、囊性纤维化、细胞因子治疗相关病症、拳击员痴呆、脱髓鞘病、登革出血热、皮炎、皮肤病学状况、多尿症(diabetes)、糖尿病性动脉硬化性疾病、弥漫性Lewy小体病、扩张性充血性心肌病、基底神经节病症、中年唐氏综合症、由阻断CNS多巴胺受体的药物诱导的药物诱导的运动障碍、药物敏感性、湿疹、脑脊髓炎、心内膜炎、内分泌病、会厌炎、EB病毒感染、红斑性肢痛病、锥体外束和小脑病症、家族性噬血性淋巴组织细胞增多症、胎儿胸腺移植排斥、Friedreich氏共济失调、功能性外周性动脉病症、真菌性脓毒病、气性坏疽病、胃溃疡、肾小球肾炎、任何器官或组织的移植物排斥、革兰氏阴性脓毒病、革兰氏阳性脓毒病、由于细胞内生物的肉芽肿、毛细胞性白血病、Hallervorden-Spatz病、桥本氏甲状腺炎、枯草热、心脏移植排斥、血色素沉着症、血液透析、溶血性尿毒性综合症/血栓溶解性血小板减少性紫癜、出血、甲型肝炎、希氏束心律失常、HIV感染/HIV神经病、何杰金氏病、运动过度性运动障碍、超敏反应、超敏感性肺炎、高血压、运动机能减退性运动障碍、下丘脑-垂体-肾上腺轴评价、特发性阿狄森氏病、特发性肺纤维化、抗体介导的细胞毒性、虚弱、婴儿型脊髓性肌萎缩、主动脉炎症、甲型流行性感冒、电离辐射照射、虹膜睫状体炎/葡萄膜炎/视神经炎、缺血性再灌注损伤、缺血性中风、青少年类风湿性关节炎、青少年脊髓性肌萎缩、卡波西氏肉瘤、肾移植排斥、军团杆菌、利什曼病、麻风病、皮层脊髓系统损伤、脂肪水肿、肝移植排斥、淋巴水肿、疟疾、恶性淋巴瘤、恶性组织细胞增多症、恶性黑素瘤、脑膜炎、脑膜炎球菌血症、代谢性偏头痛、特发性偏头痛、线粒体多系统病症、混合型结缔组织病、单克隆丙种球蛋白病、多发性骨髓瘤、多系统变性(Menzel, Dejerine-Thomas, Shy-Drager, 和Machado-Joseph)、重症肌无力、鸟胞内分支杆菌、结核分支杆菌、骨髓异常增生综合症、心肌梗塞、心肌缺血性病症、鼻咽癌、新生儿慢性肺病、肾炎、肾变病、神经变性疾病、神经原性肌萎缩、嗜中性粒细胞减少性发热、非何杰金淋巴瘤、腹主动脉及其分支闭塞、闭塞性动脉病症、OKT3®治疗、睾丸炎/附睾炎(epididymitis)、睾丸炎/输精管切除术逆转术、器官巨大症、骨质疏松症、胰移植排斥、胰癌、恶性肿瘤的肿瘤相关综合症/高钙血症、甲状旁腺移植排斥、盆腔炎症性疾病、常年性鼻炎、心包疾病、外周性动脉粥样硬化疾病、外周血管病症、腹膜炎、恶性贫血、卡氏肺囊虫性肺炎、肺炎、POEMS综合症(多发性神经病、器官巨大症、内分泌病、单克隆丙种球蛋白病和皮肤变化综合症)、灌注后综合症、泵后综合症、MI心切开术后综合症、先兆子痫、进行性核上(supranucleo)麻痹、原发性肺动脉高压、放射治疗、Raynaud氏现象、Raynaud氏病、Refsum氏病、常规狭窄QRS心动过速、肾血管性高血压、再灌注损伤、限制性心肌病、肉瘤、老年性舞蹈病、Lewy小体型老年性痴呆、血清反应阴性关节病、中风、镰状细胞贫血、皮肤同种异体移植物排斥、皮肤变化综合症、小肠移植排斥、实体瘤、特殊心律失常、脊髓性共济失调、脊髓小脑变性、链球菌肌炎、小脑结构损伤、亚急性硬化性全脑炎、晕厥、心血管系统梅毒、全身性过敏反应(anaphalaxis)、全身炎症反应综合症、全身发作性青少年类风湿性关节炎、T细胞或FAB ALL、毛细血管扩张、血栓闭塞性脉管炎、血小板减少症、毒性、移植物、创伤/出血、III型超敏反应、IV型超敏反应、不稳定心绞痛、尿毒症、尿脓毒病、荨麻疹、心脏瓣膜疾病、静脉曲张、血管炎、静脉疾病、静脉血栓形成、心室纤维性颤动、病毒和真菌感染、病毒性脑炎/无菌性脑膜炎、病毒相关性噬红细胞(hemophagocytic)综合症、Wernicke-Korsakoff综合症、Wilson氏病、任何器官或组织的异种移植排斥、急性冠状动脉综合症、急性特发性多神经炎、急性炎性脱髓鞘性多发性神经根性神经病、急性缺血、成人Still氏病、斑秃、过敏反应、抗磷脂抗体综合症、再生障碍性贫血、动脉硬化、特应性湿疹、特应性皮炎、自身免疫性皮炎、与链球菌感染相关的自身免疫性病症、自身免疫性肠病、自身免疫性听力丧失、自身免疫性淋巴细胞增生综合症(ALPS)、自身免疫性心肌炎、自身免疫性过早卵巢衰竭、睑炎、支气管扩张、大疱性类天疱疮、心血管病、灾变性抗磷脂综合症、乳糜泻、颈椎关节强硬、慢性缺血、疤痕性类天疱疮、具有多发性硬化风险的临床孤立综合症(CIS)、儿童期发病性精神病、慢性阻塞性肺部疾病(COPD)、泪囊炎、皮肌炎、糖尿病性视网膜病、椎间盘突出、盘脱垂、药物诱导的免疫性溶血性贫血、心内膜炎、子宫内膜异位、眼内炎、巩膜外层炎、多形性红斑、重型多形性红斑、妊娠期类天疱疮、格林巴利综合症(GBS)、枯草热、Hughes综合症、特发性帕金森氏病、特发性间质性肺炎、IgE介导的变态反应、免疫性溶血性贫血、内含体肌炎、感染性眼炎性疾病、炎性脱髓鞘疾病、炎性心脏病、炎性肾病、IPF/UIP、虹膜炎、角膜炎、干燥性角膜结膜炎、Kussmaul病或Kussmaul-Meier病、Landry氏麻痹、朗格汉斯细胞组织细胞增多症、网状青斑、黄斑变性、显微镜下多脉管炎、白赫铁列夫症(Morbus Bechterev)、运动神经元病症、粘膜类天疱疮、多器官衰竭、重症肌无力、脊髓异常增生综合症、心肌炎、神经根障碍、神经病、非甲非乙型肝炎、视神经炎、骨质溶解、卵巢癌、少关节的JRA、周围动脉闭塞性疾病(PAOD)、周围血管疾病(PVD)、外周动脉疾病(PAD)、静脉炎、结节性多动脉炎(或结节性动脉外膜炎)、多软骨炎、风湿性多肌痛、白发症、多关节的JRA、多发性内分泌缺陷综合症、多肌炎、风湿性多肌痛(PMR)、泵后综合症、原发性帕金森综合症、前列腺癌和直肠癌和造血性恶性病(白血病和淋巴瘤)、前列腺炎、单纯红细胞再生障碍、原发性肾上腺机能不足、复发型视神经脊髓炎、再狭窄、风湿性心脏病、SAPHO(滑膜炎、痤疮、脓疱病、骨肥厚和骨炎)、继发性淀粉样变性、休克肺、巩膜炎、坐骨神经痛、继发性肾上腺机能不足、聚硅氧烷相关的结缔组织病、Sneddon-Wilkinson皮肤病、关节强硬性脊椎炎、Stevens-Johnson综合症(SJS)、全身性炎症应答综合症、颞动脉炎、弓形体视网膜炎、中毒性表皮坏死松解、横贯性脊髓炎、TRAPS(肿瘤坏死因子受体1型(TNFR)相关周期性综合症)、I型变态反应、II型糖尿病、荨麻疹、普通型间质性肺炎(UIP)、脉管炎、春季结膜炎、病毒性视网膜炎、Vogt-Koyanagi-Harada综合症(VKH综合症)、湿黄斑变性和伤口愈合。
[0207] 本文所述的组合物和方法可用于治疗患有疾病的个体的疼痛，所述疾病选自原发性和转移性癌症，包括乳腺、结肠、直肠、肺、口咽、下咽、食道、胃、胰、肝、胆囊和胆管、小肠、尿道(包括肾、膀胱和尿道上皮)、女性生殖道(包括子宫颈、子宫和卵巢，以及绒毛膜癌和妊娠性滋养层细胞病)、男性生殖道(包括前列腺、精囊、睾丸和生殖细胞肿瘤)、内分泌腺(包括甲状腺、肾上腺和脑下垂体)和皮肤的癌，以及血管瘤，黑素瘤，肉瘤(包括从骨和软组织产生的肉瘤以及卡波西氏肉瘤)，脑、神经、眼和脑膜(包括星形细胞瘤、神经胶质瘤、成胶质细胞瘤、视网膜母细胞瘤、神经瘤、成神经细胞瘤、神经鞘瘤(Schwannomas)和脑膜瘤)的肿瘤，从造血恶性肿瘤诸如白血病和淋巴瘤(何杰金与非何杰金淋巴瘤)产生的实体瘤。
[0208] 剂量方案可以进行调整以提供最佳所需应答(例如，治疗或预防应答)。例如，可以施用单一大剂量，几个分份剂量可以随着时间而施用，或剂量可以如治疗情形的紧急状态所指示的按比例减少或增加。为了易于施用和剂量一致，以单位剂型配制肠胃外组合物是特别有利的。如本文使用，单位剂型指适合作为单位剂量用于待治疗的哺乳动物受试者的物理上不连续单位；每个单位包含与所需药学载体相关的计算为产生所需疗效的预定量的活性化合物。关于本发明的单位剂型的详细说明由下述指示且直接取决于下述：(a) 结合IL-1α 和/或 IL-1β的结合蛋白的独特特征和待达到的具体治疗或预防作用，和(b)复合这种用于治疗个体的蛋白的领域固有的局限性。
[0209] 关于可用于治疗骨关节炎或疼痛的结合蛋白的治疗或预防有效量的示例性、非限制性范围是0.1-20 mg/kg，更优选1-10 mg/kg。应当指出的是，剂量值可以随着待减轻的状况类型和严重性而变化。应进一步理解的是，对于任何特定受试者，根据个体需要和施用或监督组合物施用的人的专业判断，具体剂量方案应当随着时间进行调整，并且本文所述的剂量范围仅是示例性的，且不希望限制要求保护的组合物的范围或实践。
[0210] 对于本领域技术人员将显而易见的是，本文描述的本发明的方法和组合物的其他合适修改和调整是显而易见的，且在不背离本发明的范围或本文公开的实施方案的情况下可以使用合适的等同方案进行。尽管本发明目前已得到详细描述，但通过参考下述实施例将更清楚地理解本发明，所述实施例被包括仅用于举例说明性目的且不希望是本发明的限制。实施例
[0211] 实施例1. 生成双重可变结构域免疫球蛋白(DVD-Ig)蛋白设计双重可变结构域免疫球蛋白(DVD-Ig)分子，从而使得通过重组DNA技术使来自两种不同亲本mAb的两个不同轻链可变结构域(VL)以串联方式直接连接或经由短接头连接，随后为轻链恒定结构域。类似地，重链包含以串联方式直接连接或经由短接头连接的两个不同重链可变结构域(VH)，随后为恒定结构域CH1和Fc区。参见图1A。已描述从亲本单克隆抗体设计和产生DVD-Ig结合蛋白，包括由亲本抗IL-1α单克隆抗体和亲本抗IL-1β单克隆抗体产生的结合于IL-1α和IL-1β的DVD-Ig结合蛋白的实例。参见PCT公开号WO 2007/024715 A2和Wu等人, Nature Biotechnol., 25(11):1290-1297 (2007)，其通过引用并入本文。本文提供了所选IL-1α和IL-1β的单克隆抗体和其作为亲本单克隆抗体用于产生结合IL-1α和IL-1β两者的DVD-Ig分子的用途的描述。使用类风湿性关节炎和骨关节炎的已知动物模型表征DVD-Ig分子的可能的治疗活性。
[0212] 实施例1.1. 生成IL-1α和IL-1β的鼠单克隆抗体如下使用标准杂交瘤技术生成IL-1α和IL-1β的单克隆抗体(mAb)。
[0213] 实施例1.1.A. 免疫小鼠使用纯化的重组人IL-1α和鼠IL-1β(R&D Systems)作为滴度测定和筛选ELISA中
的免疫原以及包被抗原。对于初次免疫和加强免疫两者，所有抗原的免疫剂量在5.0至
20.0 μg/小鼠/注射的范围内。ImmunEasy佐剂购自Qiagen (Waltham, MA)且以20 ml ImmunEasy佐剂/每10.0 μg抗原的佐剂/抗原比使用。各组待免疫动物含有五只从Yoichiro Iwakura博士(University of Tokyo, Minato-ku, Tokyo, Japan)获得的IL-1αβ KO小鼠。根据如下所述的给药时程免疫小鼠。MRC-5细胞购自ATCC (Manassas, VA)且用于IL-1生物测定。人IL-8 ELISA试剂盒和对照小鼠抗hIL-1α抗体和抗hIL-1β抗体(MAB200和MAB201)购自R&D Systems(Minneapolis, MN)。
的免疫原以及包被抗原。对于初次免疫和加强免疫两者，所有抗原的免疫剂量在5.0至
20.0 μg/小鼠/注射的范围内。ImmunEasy佐剂购自Qiagen (Waltham, MA)且以20 ml ImmunEasy佐剂/每10.0 μg抗原的佐剂/抗原比使用。各组待免疫动物含有五只从Yoichiro Iwakura博士(University of Tokyo, Minato-ku, Tokyo, Japan)获得的IL-1αβ KO小鼠。根据如下所述的给药时程免疫小鼠。MRC-5细胞购自ATCC (Manassas, VA)且用于IL-1生物测定。人IL-8 ELISA试剂盒和对照小鼠抗hIL-1α抗体和抗hIL-1β抗体(MAB200和MAB201)购自R&D Systems(Minneapolis, MN)。
[0214] 简而言之，通过使用涡旋在小瓶中首先轻微混合佐剂来制备佐剂-抗原混合物。从小瓶中移取所需量的佐剂且放入热压处理过的1.5 mL微量离心管中。在PBS或盐水中以范围在0.5-1.0 mg/ml的浓度制备抗原。然后将计算量的抗原与佐剂一起添加至微量离心管中且通过轻微地上下吹打5次来混合溶液。在室温下将佐剂-抗原混合物孵育15分钟且随后再通过轻微地上下吹打5次来混合。将佐剂-抗原溶液抽取至适当注射器中用于动物注射。注射在50-100 μl体积中的总共5-20 μg抗原。免疫各动物，且随后根据滴度加强2至3次。给予具有良好滴度的动物最后一次静脉内加强，随后融合并生成杂交瘤。
[0215] 实施例1.1.B. 筛选杂交瘤筛选如上所述生成的杂交瘤且使用ELISA测定抗体滴度。将蛋白抗原直接包被
在ELISA板上以便使用标准ELISA程序检测特异性抗体。简而言之，在4℃下，用100 μl rhIL-1α或rhIL-1β(1.0 μg/ml，在PBS中)包被ELISA板过夜。用250 μl
PBS/0.5%Tween20洗涤板3次且用200 μl封闭缓冲液(2%BSA，在PBS中，具有0.5%Tween20)封闭。将稀释的血清或杂交瘤上清液(100 μl)添加至各孔中，且在室温下孵育2小时。然后用PBS/0.5%Tween20洗涤板3次。使用HRP-山羊抗鼠IgG进行检测，且在450 nm下观察结合OD。亚克隆产生在ELISA中显示高特异性结合活性的抗体的杂交瘤克隆并纯化，且如下表征抗体的亲和力(Biacore)和效价(MRC-5生物测定)。
在ELISA板上以便使用标准ELISA程序检测特异性抗体。简而言之，在4℃下，用100 μl rhIL-1α或rhIL-1β(1.0 μg/ml，在PBS中)包被ELISA板过夜。用250 μl
PBS/0.5%Tween20洗涤板3次且用200 μl封闭缓冲液(2%BSA，在PBS中，具有0.5%Tween20)封闭。将稀释的血清或杂交瘤上清液(100 μl)添加至各孔中，且在室温下孵育2小时。然后用PBS/0.5%Tween20洗涤板3次。使用HRP-山羊抗鼠IgG进行检测，且在450 nm下观察结合OD。亚克隆产生在ELISA中显示高特异性结合活性的抗体的杂交瘤克隆并纯化，且如下表征抗体的亲和力(Biacore)和效价(MRC-5生物测定)。
[0216] 实施例1.1.C. IL-1α和IL-1β的鼠单克隆抗体的表征使用以下测定法表征由实施例1.1.B中所述的杂交瘤产生的抗体。
[0217] 实施例1.1.C.1. 表面等离子共振使用BIAcore系统(Biacore AB, Uppsala, Sweden)，根据制造商说明书和标准程序，通过表面等离子共振(SPR)测量在生物传感器基质上经由山羊抗小鼠IgG捕获的抗体(小鼠抗重组mIL-1抗体)与rmIL-1之间的实时结合相互作用。简而言之，将rmIL-1在HBS运行缓冲液(Biacore AB)中稀释，且将50 μl等分试样以5 ml/分钟的流动速率注射通过固定的蛋白基质。所用rhIL-1的浓度为62.5、125、187.5、250、375、500、750、1000、1500、和
2000 nM。为了测定解离常数(解离速率(off-rate))、结合常数(结合速率)，使用BIAcore动力学评价软件(版本3.1)。
2000 nM。为了测定解离常数(解离速率(off-rate))、结合常数(结合速率)，使用BIAcore动力学评价软件(版本3.1)。
[0218] 实施例1.1.C.2. 抗IL-1生物测定MRC-5细胞系是响应于人IL-1α和IL-1β以剂量依赖性方式产生IL-8的人肺成纤维细胞系(参见Dinarello, Muegge, 和Durum (2000) Curr.Protocols Immunol.6:1)。在
10% FBS完全MEM中培养MRC-5细胞且使其在37℃下在5% CO2培养箱中生长。为了测定针对重组人IL-1α或IL-1β的单克隆抗体(mAb)的中和效价，将不同浓度(0-10 μg/ml)的mAb(50 μl)添加至96孔板中且在37℃下与50 μl rhIL-1α或rhIL-1β(10-50 pg/ml)一起预孵育1小时。收获上清液，稀释且使用标准IL-8 ELISA试剂盒(R&D Systems)通过ELISA测量IL-8浓度。通过抗体抑制MRC-5细胞产生IL-8的能力测定其效价。
10% FBS完全MEM中培养MRC-5细胞且使其在37℃下在5% CO2培养箱中生长。为了测定针对重组人IL-1α或IL-1β的单克隆抗体(mAb)的中和效价，将不同浓度(0-10 μg/ml)的mAb(50 μl)添加至96孔板中且在37℃下与50 μl rhIL-1α或rhIL-1β(10-50 pg/ml)一起预孵育1小时。收获上清液，稀释且使用标准IL-8 ELISA试剂盒(R&D Systems)通过ELISA测量IL-8浓度。通过抗体抑制MRC-5细胞产生IL-8的能力测定其效价。
[0219] 基于Biacore和MRC-5生物测定，鉴定许多具有高亲和力和效价的鼠抗hIL-1α和抗hIL-1β抗体，如下表1中所示：表1. 鼠抗Hil-1α/β mAb的生成和表征
[0220] 实施例1.1.D. IL-1α和IL-1β的鼠单克隆抗体(mAb)的克隆和测序根据制造商说明书，在使用Trizol试剂(Invitrogen)从各杂交瘤细胞系分离和纯化总RNA之后，进行表1(上方)中所述的所有抗IL-1α/β mAb和其他抗体的可变重链(VH)和轻链(VL)基因的克隆和测序。使用来自小鼠Ig引物组(Novagen, Madison, WI)的IgGVH和IgκVL寡核苷酸和制造商建议的一管式RT-PCR试剂盒(Qiagen)进行VH和VL基因两者的扩增。根据制造商说明书，将由生产性扩增产生的DNA片段克隆至pCR-TOPO载体(Invitrogen)中。然后使用ABI 3000测序仪(Applied Biosystems, Foster City, CA)，通过双脱氧链终止法对多个VH和VL克隆进行测序。所有mAb VL和VH基因的序列显示于表2中。
[0221] 表2. 能够结合人IL-1α或IL-1β的鼠单克隆抗体
[0222] 实施例1.2 鼠-人嵌合抗体的生成和表征将上述所有mAb转化为嵌合抗体(具有人恒定区)且表达，纯化并表征以证实活性。抗体还用于随后DVD-Ig结合蛋白分析的对照。为了将3D12.E3转化为嵌合形式，使用引物P1和P2 PCR扩增3D12.E3-VL；同时使用引物P3和P4扩增人Cκ基因(在内部生成的pBOS载体中，Abbott Bioresearch Center, Worcester, MA)。根据标准PCR技术和程序进行两个PCR反应。将两个PCR产物凝胶纯化，且一起用作用于后续使用引物P1和P4使用标准PCR条件的重叠PCR反应的重叠模板。根据制造商说明书，通过TOPO克隆将最终PCR产物嵌合轻链3D12.E3-VL-hCκ亚克隆至pEF6 TOPO哺乳动物表达载体(Invitrogen)中。表
3显示用于此程序中的各PCR引物的序列。
3显示用于此程序中的各PCR引物的序列。
[0223] 表3. PCR引物
[0224] 为了将3D12.E3重链转化为嵌合形式，使用引物P5和P6 PCR扩增3D12.E3-VH；同时使用引物P7和P8扩增人Cγ1基因(在ABC内部生成的pBOS载体中)。根据标准PCR技术和程序进行两个PCR反应。将两个PCR产物凝胶纯化，且一起用作用于后续使用引物P5和P8使用标准PCR条件的重叠PCR反应的重叠模板。根据制造商说明书，将最终PCR产物嵌合轻链3D12.E3-VH-hCγ1亚克隆至pcDNA3.1 TOPO哺乳动物表达载体(Invitrogen)中。表4显示用于此程序中的各PCR引物的序列。
[0225] 表4. PCR引物
[0226] 类似地，使用引物P21/P22(对于VH)和P7/P8(对于hCγ1)生成嵌合13F5.G5-VH-Cγ1且克隆至pcDNA3.1 TOPO载体中，且使用引物P23/P24(对于VL)和P3/P4(对于hCκ)生成嵌合13F5.G5-VL-Cκ并克隆至pEF6 TOPO载体中。表5显示用于此程序中的各PCR引物的序列。
[0227] 表5. PCR引物
[0228] 为了表达嵌合抗体，使用Lipofectamin(Invitrogen)在COS细胞中共表达13F5.G5-VL-Cκ和13F5.G5-VH-Cγ1持续72小时，且收集培养基并通过蛋白A层析纯化IgG。类似地，使用Lipofectamin (Invitrogen)在COS中共表达13F5.G5-VL-Cκ和13F5.G5-VH-Cγ1持续72小时，且收集培养基并通过蛋白A层析纯化IgG。两种纯化的嵌合Ab通过Biacore和MRC-5生物测定进行表征以证实活性。结果显示这些嵌合Ab显示与初始鼠mAb的亲和力和效价类似的亲和力和效价。
[0229] 实施例1.3. IL-1α/β双重可变结构域免疫球蛋白(DVD-Ig)分子的构建、表达和纯化用于生成能够结合hIL-1α和hIL-1β的DVD-Ig结合蛋白的构建体图解于图1B中。
简而言之，通过分别用重组IL-1α蛋白(rhIL-1α)和重组IL-1β蛋白(rhIL-1β)免疫Balb/c小鼠来获得包括两种高亲和力鼠抗体抗hIL-1α(克隆3D12.E3)和抗hIL-1β(克隆13F5.G5)的亲本mAb。使用小鼠Ig引物试剂盒(Novagen, Madison, WI)通过RT-PCR分离这两个杂交瘤克隆的VL/VH基因。将VL/VH基因首先转化为嵌合抗体(具有人恒定区)以证实活性和效价。为了生成DVD1-Ig结合蛋白，将13F5.G5的VH和VL分别直接融合至
3D12.E3的VH和VL的N端(如图1B中所示)。除DVD2-Ig结合蛋白在轻链(接头序列为
ADAAP)和重链(接头序列为AKTTPP)两者的两个可变结构域之间具有接头之外，以类似方式构建DVD2-Ig结合蛋白。这些序列选自鼠Ck和CH1序列的N端。这些选自鼠Ck和CH1的N端的接头序列是可变结构域的自然延伸，且基于几种Fab晶体结构的分析显示出无明显二级结构的柔性构型。PCR克隆的详细程序描述如下。
简而言之，通过分别用重组IL-1α蛋白(rhIL-1α)和重组IL-1β蛋白(rhIL-1β)免疫Balb/c小鼠来获得包括两种高亲和力鼠抗体抗hIL-1α(克隆3D12.E3)和抗hIL-1β(克隆13F5.G5)的亲本mAb。使用小鼠Ig引物试剂盒(Novagen, Madison, WI)通过RT-PCR分离这两个杂交瘤克隆的VL/VH基因。将VL/VH基因首先转化为嵌合抗体(具有人恒定区)以证实活性和效价。为了生成DVD1-Ig结合蛋白，将13F5.G5的VH和VL分别直接融合至
3D12.E3的VH和VL的N端(如图1B中所示)。除DVD2-Ig结合蛋白在轻链(接头序列为
ADAAP)和重链(接头序列为AKTTPP)两者的两个可变结构域之间具有接头之外，以类似方式构建DVD2-Ig结合蛋白。这些序列选自鼠Ck和CH1序列的N端。这些选自鼠Ck和CH1的N端的接头序列是可变结构域的自然延伸，且基于几种Fab晶体结构的分析显示出无明显二级结构的柔性构型。PCR克隆的详细程序描述如下。
[0230] 实施例1.3.A. hIl-1α/β DVD1-Ig结合蛋白的分子克隆使用引物P21和P25 PCR扩增13F5.G5-VH。使用引物P14和P8扩增3D12.E3-VH-hCγ1。
根据标准PCR技术和程序进行两个PCR反应。将两个PCR产物凝胶纯化，且一起用作用于后续使用引物P21和P8使用标准PCR条件的重叠PCR反应的重叠模板。根据制造商说明书，将最终PCR产物DVD1-Ig重链hIL-1α/β DVD1-VH-hCγ1亚克隆至pcDNA3.1 TOPO哺乳动物表达载体(Invitrogen)中。表6显示用于此程序中的PCR引物的序列。
根据标准PCR技术和程序进行两个PCR反应。将两个PCR产物凝胶纯化，且一起用作用于后续使用引物P21和P8使用标准PCR条件的重叠PCR反应的重叠模板。根据制造商说明书，将最终PCR产物DVD1-Ig重链hIL-1α/β DVD1-VH-hCγ1亚克隆至pcDNA3.1 TOPO哺乳动物表达载体(Invitrogen)中。表6显示用于此程序中的PCR引物的序列。
[0231] 表6 . PCR引物
[0232] 为了生成hIL-1α/β DVD1-Ig轻链，使用引物P23和P26 PCR扩增13F5.G5-VL；同时使用引物P16和P4扩增3D12.E3-VL-hCκ。根据标准PCR技术和程序进行两个PCR反应。将两个PCR产物凝胶纯化，且一起用作用于后续使用引物P23和P4使用标准PCR条件的重叠PCR反应的重叠模板。根据制造商说明书，将最终PCR产物hIL-1α/β DVD1-Ig轻链hIL-1α/β DVD1-VL-hCκ亚克隆至pEF6 TOPO哺乳动物表达载体(Invitrogen)中。
表7显示用于此程序中的各PCR引物的序列。
表7显示用于此程序中的各PCR引物的序列。
[0233] 表7 . PCR引物
[0234] 实施例1.3.B. hIL-1α/β DVD2-Ig的分子克隆使用引物P21和P17 PCR扩增13F5.G5-VH。使用引物P18和P8扩增3D12.E3-VH-hCγ1。
根据标准PCR技术和程序进行两个PCR反应。将两个PCR产物凝胶纯化，且一起用作用于后续使用引物P21和P8使用标准PCR条件的重叠PCR反应的重叠模板。根据制造商说明书，将最终PCR产物DVD2-Ig重链hIL-1α/β DVD2-VH-hCγ1亚克隆至pcDNA3.1 TOPO哺乳动物表达载体(Invitrogen)中。表8显示用于此程序中的各PCR引物的序列。
根据标准PCR技术和程序进行两个PCR反应。将两个PCR产物凝胶纯化，且一起用作用于后续使用引物P21和P8使用标准PCR条件的重叠PCR反应的重叠模板。根据制造商说明书，将最终PCR产物DVD2-Ig重链hIL-1α/β DVD2-VH-hCγ1亚克隆至pcDNA3.1 TOPO哺乳动物表达载体(Invitrogen)中。表8显示用于此程序中的各PCR引物的序列。
[0235] 表8 . PCR引物
[0236] 为了生成hIL-1α/β DVD2-Ig轻链，使用引物P23和P19 PCR扩增13F5.G5-VL。使用引物P20和P4扩增3D12.E3-VL-hCκ。根据标准PCR技术和程序进行两个PCR反应。
将两个PCR产物凝胶纯化，且一起用作用于后续使用引物P23和P4使用标准PCR条件的重叠PCR反应的重叠模板。根据制造商说明书，将最终PCR产物hIL-1α/β DVD2-Ig轻链hIL-1α/β DVD2-VL-hCκ亚克隆至pEF6 TOPO哺乳动物表达载体(Invitrogen)中。表9显示用于此程序中的各PCR引物的序列。
将两个PCR产物凝胶纯化，且一起用作用于后续使用引物P23和P4使用标准PCR条件的重叠PCR反应的重叠模板。根据制造商说明书，将最终PCR产物hIL-1α/β DVD2-Ig轻链hIL-1α/β DVD2-VL-hCκ亚克隆至pEF6 TOPO哺乳动物表达载体(Invitrogen)中。表9显示用于此程序中的各PCR引物的序列。
[0237] 表9 . PCR引物
[0238] hIL-1α/β DVD1-Ig和hIL-1α/β DVD2-Ig的最终序列描述于表10中。
[0239] 表10. hIl-1α/β DVD1-Ig和hIl-1α/β DVD2-Ig结合蛋白的氨基酸序列[0240] 实施例1.3.C. hIL-1α/β DVD1-Ig结合蛋白的表达和纯化将各构建体的重链和轻链分别亚克隆至pcDNA3.1 TOPO和pEF6 TOPO载体
(Invitrogen Inc.)中，且测序以确保准确性。分别使用Lipofectamine 2000和293fectin试剂在COS细胞以及人胚肾293细胞(美国典型培养物保藏中心，Manassas, VA)中瞬时表达编码各构建体的重链和轻链的质粒。瞬时转染后72小时收获细胞培养基且根据制造商说明书，使用蛋白A层析(Pierce, Rockford, IL)纯化抗体。通过SDS-PAGE分析抗体且通过A280和BCA(Pierce, Rockford, IL)进行定量。表11显示hIL-1α/β DVD1-Ig和hIL-1α/β DVD2-Ig的表达水平与嵌合抗体的表达水平相当，表明DVD-Ig结合蛋白可在哺乳动物细胞中有效地表达。
(Invitrogen Inc.)中，且测序以确保准确性。分别使用Lipofectamine 2000和293fectin试剂在COS细胞以及人胚肾293细胞(美国典型培养物保藏中心，Manassas, VA)中瞬时表达编码各构建体的重链和轻链的质粒。瞬时转染后72小时收获细胞培养基且根据制造商说明书，使用蛋白A层析(Pierce, Rockford, IL)纯化抗体。通过SDS-PAGE分析抗体且通过A280和BCA(Pierce, Rockford, IL)进行定量。表11显示hIL-1α/β DVD1-Ig和hIL-1α/β DVD2-Ig的表达水平与嵌合抗体的表达水平相当，表明DVD-Ig结合蛋白可在哺乳动物细胞中有效地表达。
[0241] 表11. hIL-1α/β DVD-Ig结合蛋白的表达和分子量分析
[0242] 通过质谱分析实验测定的DVD1-Ig结合蛋白和DVD2-Ig结合蛋白的轻链、重链和全长的分子量显示于圆括号中。
[0243] 实施例1.4. hIL-1α/β DVD-Ig结合蛋白的质谱和SEC分析为了测量DVD-Ig结合蛋白轻链和重链的分子量(MW)，用1.0 M DTT溶液(5 μL)还
原10 μL DVD-Ig分子(0.8 μg/μL)。使用PLRP-S, 8μ, 4000A和1×150 mm蛋白柱(Michrom BioResource, Auburn, MA)分离DVD-Ig分子的重链和轻链。将Agilent HP1100毛细管HPLC(Agilent Technologies Inc., Pala Alto, CA)与质谱仪QSTAR(Applied Biosystems, Foster City, CA)一起使用。将valco阀设定在10分钟以便将来自废液的物流切换至MS用于使样品脱盐。缓冲液A为0.02% TFA、0.08% FA、0.1% ACN和99.8% HPLC-H2O。缓冲液B含有0.02% TFA、0.08% FA、0.1% HPLC-H2O和99.8% ACN。HPLC流动速率为50 μL/min且样品注射体积为8.0 mL。柱温箱的温度设定在60℃，且分离梯度为：5%B持续5分钟；5%B至65%B持续35分钟；65%B至95%B再持续5分钟和95%B至5%B持续5分钟。TOFMS扫描为从800至2500 amu，且周期为3600。为了测定全长DVD-Ig结合蛋白的MW，使用蛋白MicroTrap滤筒(Michrom BioResource, Auburn, MA)以使样品脱盐。HPLC梯度为：5%B持续5分钟；5%B至95%B持续1分钟；和95%B至5%B再持续4分钟。QSTAR TOFMS扫描为2000至3500 amu，且周期为899。使用Analyst QS软件(Applied Biosystems)分析所有MS初始数据。对于DVD-Ig结合蛋白的SEC分析，将PBS中纯化的DVD-Ig结合蛋白和嵌合抗体施加于Superose 6 10/300 G2, 300×10 mm柱(Amersham Bioscience, Piscataway, NJ)上。使用HPLC仪器型号10A(Shimadzu, Columbia, MD)进行SEC。使用UV检测在280 nm和214 nm下测定所有蛋白。在0.5 mL/分钟的流动速率下，洗脱为等度的。对于稳定性研究，PBS中浓度范围为0.2-0.4 mg/ml的样品在-80℃至25℃之间经受3次冻融循环，或在4℃、25℃或40℃下孵育4周和8周，随后进行SEC分析。
原10 μL DVD-Ig分子(0.8 μg/μL)。使用PLRP-S, 8μ, 4000A和1×150 mm蛋白柱(Michrom BioResource, Auburn, MA)分离DVD-Ig分子的重链和轻链。将Agilent HP1100毛细管HPLC(Agilent Technologies Inc., Pala Alto, CA)与质谱仪QSTAR(Applied Biosystems, Foster City, CA)一起使用。将valco阀设定在10分钟以便将来自废液的物流切换至MS用于使样品脱盐。缓冲液A为0.02% TFA、0.08% FA、0.1% ACN和99.8% HPLC-H2O。缓冲液B含有0.02% TFA、0.08% FA、0.1% HPLC-H2O和99.8% ACN。HPLC流动速率为50 μL/min且样品注射体积为8.0 mL。柱温箱的温度设定在60℃，且分离梯度为：5%B持续5分钟；5%B至65%B持续35分钟；65%B至95%B再持续5分钟和95%B至5%B持续5分钟。TOFMS扫描为从800至2500 amu，且周期为3600。为了测定全长DVD-Ig结合蛋白的MW，使用蛋白MicroTrap滤筒(Michrom BioResource, Auburn, MA)以使样品脱盐。HPLC梯度为：5%B持续5分钟；5%B至95%B持续1分钟；和95%B至5%B再持续4分钟。QSTAR TOFMS扫描为2000至3500 amu，且周期为899。使用Analyst QS软件(Applied Biosystems)分析所有MS初始数据。对于DVD-Ig结合蛋白的SEC分析，将PBS中纯化的DVD-Ig结合蛋白和嵌合抗体施加于Superose 6 10/300 G2, 300×10 mm柱(Amersham Bioscience, Piscataway, NJ)上。使用HPLC仪器型号10A(Shimadzu, Columbia, MD)进行SEC。使用UV检测在280 nm和214 nm下测定所有蛋白。在0.5 mL/分钟的流动速率下，洗脱为等度的。对于稳定性研究，PBS中浓度范围为0.2-0.4 mg/ml的样品在-80℃至25℃之间经受3次冻融循环，或在4℃、25℃或40℃下孵育4周和8周，随后进行SEC分析。
[0244] 通过蛋白A层析纯化DVD-Ig结合蛋白和嵌合抗体。对于各蛋白，纯化产量(3-5 mg/L)与表达培养基的hIgG定量一致。在还原条件和非还原条件下，通过SDS-PAGE分析纯化的DVD-Ig结合蛋白和嵌合抗体的组成和纯度。在非还原条件下，四种蛋白各以单一条带迁移。如预期，DVD-Ig蛋白显示比嵌合抗体更大的分子量。在非还原条件下，四种蛋白各产生两个条带，一条重链和一条轻链。同样，DVD-Ig结合蛋白的重链和轻链在大小上比嵌合抗体的重链和轻链更大。SDS-PAGE显示各DVD-Ig结合蛋白表达为单一种类，且重链和轻链有效配对形成IgG样分子。两种DVD-Ig分子的重链和轻链以及全长蛋白的大小与其基于氨基酸序列所计算的分子量一致(参见表11)。
[0245] 为了测定DVD-Ig结合蛋白的精确分子量，采用质谱分析。如表1中所示，实验测定的各DVD-Ig结合蛋白(包括轻链、重链和全长蛋白)的分子量与预测值良好一致。为了进一步研究DVD-Ig结合蛋白在溶液中的物理性质，使用大小排阻层析(SEC)来分析各蛋白。嵌合抗体与DVD2-Ig结合蛋白两者展现单一峰，证明作为单体蛋白的物理均质性。3D12.E3嵌合抗体显示物理大小小于13F5.G5嵌合抗体，表明3D12.E3嵌合抗体采用较紧密的球形。
DVD1-Ig结合蛋白显示主峰以及在右侧的肩峰，提示部分DVD1-Ig结合蛋白可能在当前缓冲条件下呈聚集形式。
DVD1-Ig结合蛋白显示主峰以及在右侧的肩峰，提示部分DVD1-Ig结合蛋白可能在当前缓冲条件下呈聚集形式。
[0246] 实施例1.5：hIL-1α/βDVD-Ig结合蛋白的体外稳定性分析DVD-Ig的物理稳定性测试如下。PBS中浓度范围为0.2-0.4 mg/ml的纯化的抗体
在-80℃至25℃之间经受3次冻融循环，或在4℃、25℃或40℃下孵育4周和8周，随后使用大小排阻层析(SEC)分析进行分析(参见表12)。
在-80℃至25℃之间经受3次冻融循环，或在4℃、25℃或40℃下孵育4周和8周，随后使用大小排阻层析(SEC)分析进行分析(参见表12)。
[0247] 表12. 通过SEC的hIl-1α/β DVD-Ig的体外稳定性分析聚集和片段化程度以百分比显示，而Ab的百分比表示完整分子。
Agg：聚集物；
Ab：完整抗体；
Frgm：片段。
Agg：聚集物；
Ab：完整抗体；
Frgm：片段。
[0248] 两种嵌合抗体显示微小的聚集和片段化程度，常规IgG分子则正常。在纯化后，DVD1-Ig结合蛋白在SEC上显示一定聚集。在稳定性分析中，DVD1-Ig结合蛋白还在不同条件下显示在PBS中聚集；然而，DVD1-Ig结合蛋白聚集形式的百分比并没有在延长储存期间或在较高温度下增加。与嵌合3D12.E3抗体的片段化形式类似，DVD1-Ig结合蛋白的片段化形式的百分比在正常范围内。相比之下，DVD2-Ig结合蛋白显示非凡的稳定性。在所有测试条件下，检测到DVD2-Ig结合蛋白既不聚集也不片段化，且100%的DVD2-Ig结合蛋白以完整单体分子形式保留。
[0249] 实施例1.6. 测定hIL-1α/β DVD-Ig结合蛋白的抗原结合亲和力与rhIL1-α 和rhIL1-β结合的DVD-Ig分子的动力学通过基于表面等离子共振的
测量，用Biacore 3000仪器(Biacore AB，Uppsala，瑞典)使用HBS-EP(10 mM HEPES, pH
7.4, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA，和0.005％表面活性剂P20)于25℃进行测定。所有化学品都得自Biacore AB(Uppsala，瑞典)或否则来自如本文中所述的不同来源。使用标准胺偶联试剂盒根据制造商的说明书和程序在25 mg/ml时，将在10 mM 乙酸钠(pH 4.5)中稀释的约5000 RU山羊抗人IgG Fcγ片段特异性多克隆抗体(Pierce Biotechnology Inc, Rockford, IL)直接固定化在CM5研究级生物传感器芯片上。生物传感器表面上未反应的部分用乙醇胺封闭。在流动室2和4中的修饰的羧甲基葡聚糖表面用作反应表面。流动室
1和3中不含山羊抗人IgG的未修饰的羧甲基葡聚糖用作参考表面。对于动力学分析，使用Bioevaluation 4.0.1软件，使来源于1：1 Langmuir结合模型的速率方程式同时对所有10次注射(使用总体拟合分析)的结合和解离相拟合。纯化DVD-Ig样品在HEPES缓冲盐水中进行稀释，以用于在山羊抗人IgG Fc 特异性反应表面上捕获，并且以5 ml /分钟的流速注射在反应基质上。结合和解离速率常数，kon (M-1s-1) 和 koff (s-1)在25 ml /分钟的连续流速下进行测定。通过在1.25 - 1000 nM的10个不同抗原浓度下进行动力学结合测量来获得速率常数。随后通过下式由动力学速率常数来计算DVD-Ig分子和rhIL1α/β之间反应的平衡解离常数(M)：KD = koff/kon。rhIL1α/β样品的等分试样也同时注射在空白参考和反应CM表面上以记录并减去任何非特异性结合背景来消除大部分折射指数变化和注射噪声。随后以5 ml/分钟的流动速率注射25 ml 10 mM甘氨酸(pH 1.5)两次以使表面再生。使固定抗Fc抗体的表面彻底再生且保留其超过十二个循环的完全捕获能力。
在饱和结合条件(稳态平衡)下，使用下式计算捕获的DVD-Ig-rhIL1α/β复合物的表观化学计量：
。
测量，用Biacore 3000仪器(Biacore AB，Uppsala，瑞典)使用HBS-EP(10 mM HEPES, pH
7.4, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA，和0.005％表面活性剂P20)于25℃进行测定。所有化学品都得自Biacore AB(Uppsala，瑞典)或否则来自如本文中所述的不同来源。使用标准胺偶联试剂盒根据制造商的说明书和程序在25 mg/ml时，将在10 mM 乙酸钠(pH 4.5)中稀释的约5000 RU山羊抗人IgG Fcγ片段特异性多克隆抗体(Pierce Biotechnology Inc, Rockford, IL)直接固定化在CM5研究级生物传感器芯片上。生物传感器表面上未反应的部分用乙醇胺封闭。在流动室2和4中的修饰的羧甲基葡聚糖表面用作反应表面。流动室
1和3中不含山羊抗人IgG的未修饰的羧甲基葡聚糖用作参考表面。对于动力学分析，使用Bioevaluation 4.0.1软件，使来源于1：1 Langmuir结合模型的速率方程式同时对所有10次注射(使用总体拟合分析)的结合和解离相拟合。纯化DVD-Ig样品在HEPES缓冲盐水中进行稀释，以用于在山羊抗人IgG Fc 特异性反应表面上捕获，并且以5 ml /分钟的流速注射在反应基质上。结合和解离速率常数，kon (M-1s-1) 和 koff (s-1)在25 ml /分钟的连续流速下进行测定。通过在1.25 - 1000 nM的10个不同抗原浓度下进行动力学结合测量来获得速率常数。随后通过下式由动力学速率常数来计算DVD-Ig分子和rhIL1α/β之间反应的平衡解离常数(M)：KD = koff/kon。rhIL1α/β样品的等分试样也同时注射在空白参考和反应CM表面上以记录并减去任何非特异性结合背景来消除大部分折射指数变化和注射噪声。随后以5 ml/分钟的流动速率注射25 ml 10 mM甘氨酸(pH 1.5)两次以使表面再生。使固定抗Fc抗体的表面彻底再生且保留其超过十二个循环的完全捕获能力。
在饱和结合条件(稳态平衡)下，使用下式计算捕获的DVD-Ig-rhIL1α/β复合物的表观化学计量：
。
[0250] Biacore分析表明嵌合抗体具有与初始杂交瘤单克隆抗体类似的对于IL-1的结合动力学和亲和力，表明已分离正确的VL/VH序列(表13)。两种DVD-Ig结合蛋白对hIL-1α的总体结合参数相似，其中DVD-Ig结合蛋白的亲和力仅小于嵌合3D12.E3抗体的亲和力2-3倍。DVD2-Ig结合蛋白对hIL-1β的结合亲和力略微小于嵌合抗体13F5.G5，但比DVD1-Ig结合蛋白的结合亲和力高3倍。如对IL-1的化学计量评估所指示，两种DVD-Ig结合蛋白对hIL-1的亲和力与嵌合抗体对hIL-1的亲和力相比是类似的。两种嵌合抗体均为二价单特异性的，分别以1.6和1.7的化学计量结合于Biacore上的IL-1α和IL-1β。对于IgG而言，当抗体密集地固定于Biacore传感器芯片上时，由于分子间干扰导致化学计量在1.5至2.0的范围内是常见的。两种DVD-Ig结合蛋白对于hIL-1α和hIL-1β的化学计量与两种嵌合抗体对于hIL-1α和hIL-1β的化学计量类似，表明两种DVD-Ig结合蛋白对各抗原具有二价结合能力。
[0251] 表13. IL-1结合蛋白的功能表征通过Biacore测量亲和力和化学计量；通过MRC-5生物测定测定效价(IC50)；Ch =嵌合。
[0252] 此外，还通过Biacore分析DVD-Ig结合蛋白的四价双重特异性抗原结合(表14)。首先在Biacore传感器芯片上经由山羊抗人Fc抗体捕获DVD-Ig结合蛋白，且注射第一抗原并观察结合信号。当第一抗原使DVD-Ig结合蛋白饱和时，然后注射第二抗原并观察第二信号。对于DVD2-Ig结合蛋白，通过首先注射IL-1β随后注射IL-1α或通过首先注射IL-1α然后注射IL-1β而进行。在任一顺序中，检测到双重结合活性。对于DVD1-Ig结合蛋白，获得类似结果。因此，各DVD-Ig结合蛋白能够作为双重特异性四价分子同时结合两种抗原。如表14中所示，两种DVD-Ig结合蛋白对第一抗原(hIL-1α或hIL-1β)的化学计量均大于1.5，与单特异性二价结合的化学计量类似。在注射第二抗原后，虽然DVD-Ig结合蛋白已经由第一抗原所占据，但两种DVD-Ig结合蛋白对第二抗原(即hIL-1α或hIL-1β)的化学计量为1.0至1.3。因此，DVD-Ig结合蛋白能够结合两个IL-1α和两个IL-β分子。首先在Biacore传感器芯片上经由山羊抗人Fc抗体捕获DVD-Ig结合蛋白，且注射第一抗原并观察结合信号，随后注射第二抗原。
[0253] 表14. hIL-1α/β DVD-Ig结合蛋白在四价双重特异性结合于IL-1α/β中的化学计量分析
[0254] 实施例1.7. 测定DVD-Ig分子的功能均匀性因为DVD2-Ig结合蛋白通过蛋白A层析而非目标特异性亲和层析纯化，所以可通过针对两个不同抗原的结合研究评估任何潜在的错误折叠和/或错配的VL/VH结构域(如果存在)。该结合分析通过大小排阻液相层析(SEC)来进行。DVD2-Ig结合蛋白在单独或在37℃下以等摩尔比与IL-1α、IL-1β或IL-1α和IL-1β二者一起孵育120分钟期间后，施加于柱上。各抗原也作为对照单独运行。SEC结果表明DVD2-Ig结合蛋白能够在溶液中结合IL-1α和IL-1β，且该结合导致SEC信号移位，表明当DVD2-Ig结合蛋白与任一抗原复合时，其动态大小增大。DVD2-Ig结合蛋白信号的移位为100%(并非部分)，提示所有DVD2-Ig分子能够结合抗原。在IL-1α和IL-1β两者均存在下，存在DVD2-Ig结合蛋白信号的进一步完全移位，表明所有DVD2-Ig分子能够以均匀方式结合两种抗原。该实验证明DVD-Ig结合蛋白表达为功能上均匀的蛋白。这具有重要意义，因为其证明DVD-Ig结合蛋白可作为均匀的单一功能种类产生，其不同于所有先前描述的双特异性、多特异性和多价免疫球蛋白样和免疫球蛋白衍生的分子。
[0255] 实施例1.8. 测定DVD-Ig结合蛋白的生物活性使用MRC-5生物测定测量DVD-Ig的生物活性。MRC-5细胞系是人肺成纤维细胞系，其以剂量依赖的方式响应于人IL-1α或β产生IL-8。MRC-5细胞从ATCC获得且在5% CO2培养箱中，在37℃下在10% FBS完全MEM中培养。为了测定DVD-Ig针对人IL-1α或IL-1β-7 -12
的中和活性，将MEM/10%FBS中的50 μl抗体(1 x 10 至1 x 10 M)添加至96孔板中，且在37℃、5% CO2下，与50 μl hIL-1α或hIL-1β(200 pg/ml)一起预孵育1小时。然
5
后将1 x 10/ml浓度的MRC-5细胞添加(100 μl)至所有孔中，且在5% CO2培养箱中，在
37℃下孵育该板过夜。收获上清液且通过标准ELISA(R&D Systems, Minneapolis, MN)测量人IL-8产生。通过DVD-Ig结合蛋白抑制IL-8产生的能力测定其中和活性。
的中和活性，将MEM/10%FBS中的50 μl抗体(1 x 10 至1 x 10 M)添加至96孔板中，且在37℃、5% CO2下，与50 μl hIL-1α或hIL-1β(200 pg/ml)一起预孵育1小时。然
5
后将1 x 10/ml浓度的MRC-5细胞添加(100 μl)至所有孔中，且在5% CO2培养箱中，在
37℃下孵育该板过夜。收获上清液且通过标准ELISA(R&D Systems, Minneapolis, MN)测量人IL-8产生。通过DVD-Ig结合蛋白抑制IL-8产生的能力测定其中和活性。
[0256] 如表13中所示，两种DVD-Ig结合蛋白能够中和hIL-1α和hIL-1β。与对于hIL-1α的结合亲和力一致，DVD1-Ig结合蛋白和DVD2-Ig结合蛋白针对hIL-1α的中和活性也相似，即，比嵌合抗体针对hIL-1α的中和活性小3倍(参见表13)。与DVD2-Ig结合蛋白对于hIL-1β的结合亲和力一致，DVD2-Ig结合蛋白对于hIL-1β的中和活性略微小于嵌合抗体13F5.G5对于hIL-1β的中和活性，但比DVD1-Ig结合蛋白对于hIL-1β的中和活性高3倍。与初始单克隆抗体相比，DVD-Ig分子的生物学活性总体没有明显降低。
[0257] 为了确定DVD-Ig结合蛋白是否能够在IL-1α和IL-1β两者存在下抑制IL-8产生，在MRC-5测定法的相同培养系统中添加等量hIL-1α和hIL-1β。在IL-1α和IL-1β两者均存在下，DVD1-Ig结合蛋白和DVD2-Ig结合蛋白两者均能够抑制MRC-5细胞合成IL-8，其活性与其中仅存在一种细胞因子的单测定法的活性类似(表13)。在其中IL-1α和IL-1β两者都存在的该测定法中，DVD2-Ig结合蛋白的双重抑制活性(1.2 nM)高于DVD1-Ig结合蛋白的双重抑制活性(2.2 nM)。
[0258] 实施例2. 分析DVD-Ig结合蛋白中的接头大小和可变结构域定向构建如表15中所示的具有不同亲本mAb对的其他DVD-Ig分子。对于各对mAb，生成
四种不同DVD-Ig构建体：2种具有短接头且2种具有长接头，每种呈两种不同的结构域定向：a-b-C(α-β-恒定结构域)和b-a-C(β-α-恒定结构域)。接头序列来源于人Ck或CH1结构域的N端序列，如下：短接头：轻链：TVAAP (SEQ ID NO:71)；重链：ASTKGP (SEQ ID NO:79)；和长接头：轻链：TVAAPSVFIFPP (SEQ ID NO:72)；重链：ASTKGPSVFPLAP (SEQ ID NO:80)。
四种不同DVD-Ig构建体：2种具有短接头且2种具有长接头，每种呈两种不同的结构域定向：a-b-C(α-β-恒定结构域)和b-a-C(β-α-恒定结构域)。接头序列来源于人Ck或CH1结构域的N端序列，如下：短接头：轻链：TVAAP (SEQ ID NO:71)；重链：ASTKGP (SEQ ID NO:79)；和长接头：轻链：TVAAPSVFIFPP (SEQ ID NO:72)；重链：ASTKGPSVFPLAP (SEQ ID NO:80)。
[0259] 将所有重链和轻链构建体亚克隆至pBOS表达载体中，且在COS细胞或freestyle293细胞中表达。
[0260] 如关于hIL-1α/β DVD1-Ig和hIL-1α/β DVD2-Ig所述，为了构建新DVD-Ig克隆，首先使用重叠PCR串联接合两个mAb的可变结构域(轻链和重链两者)。然后使用同源重组将接合片亚克隆于pBOS载体中。简而言之，通过限制消化将载体线性化(在O+缓冲液中用FspAI和BsiWI消化2 μg pBOS-hCk载体，且在O+缓冲液中用FspAI和SaII消化2 μg pBOS-hCγ z,non a载体)。将消化的样品在1%琼脂糖凝胶上迁移且在50 μl水中纯化骨架片段。为了同源重组和转化，在冰上融化DH5α感受态细胞，且与20-50 ng接合的PCR产物和20-50 ng线性化载体(每50 μl DH5α细胞)混合。轻微地混合混合物且在冰上孵育45分钟，然后在42℃下热休克1分钟。然后添加100 μl SOC培养基且在
37℃下孵育1小时。将转化培养物接种于含有氨苄西林的LB/琼脂平板上且在37℃下孵育
18-20小时。分离细菌克隆，从其纯化DNA且经受测序分析。如先前所述，将最终序列验证的克隆共转染(匹配相同抗体对的HV和LC)于COS或293细胞中以便表达和纯化抗体。
37℃下孵育1小时。将转化培养物接种于含有氨苄西林的LB/琼脂平板上且在37℃下孵育
18-20小时。分离细菌克隆，从其纯化DNA且经受测序分析。如先前所述，将最终序列验证的克隆共转染(匹配相同抗体对的HV和LC)于COS或293细胞中以便表达和纯化抗体。
[0261] 纯化的DVD-Ig蛋白的特征概述于表16中。表16的左侧部分显示用于构建新hIL-1α/β DVD-Ig分子的2对mAb的特异性、结合亲和力和中和效价。使用抗体18F4.2C8和1B12.4H4(参见实施例1.1.D)来构建hIL-1α/β DVD3a-Ig、hIL-1α/β DVD4a-Ig、hIL-1α/β DVD3b-Ig 和 hIL-1α/β DVD4b-Ig。hIL-1α/β DVD3a-Ig 和 hIL-1α/β DVD4a-Ig呈a-b-C定向，分别具有短接头和长接头。hIL-1α/β DVD3b-Ig和hIL-1α/β DVD4b-Ig呈b-a-C定向，分别具有短接头和长接头。使用抗体6H3.1A4和6B12.4F6来构 建 hIL-1α/βDVD5a-Ig、hIL-1α/βDVD6a-Ig、hIL-1α/β DVD5b-Ig和 hIL-1α/β DVD6b-Ig。hIL-1α/β DVD5a-Ig和hIL-1α/βDVD6a-Ig呈a-b-C定向，分别具有短接头和长接头。hIL-1α/β DVD5b-Ig和hIL-1α/β DVD6b-Ig呈b-a-C定向，分别具有短接头和长接头。使用先前关于hIL-1α/β DVD1-Ig所述的程序(参见实施例1.3)，使用重叠PCR程序进行这些其他hIL-1α/β DVD-Ig结合蛋白的分子克隆。这些其他hIL-1α/β DVD-Ig结合蛋白的氨基酸序列公开于表15中。
[0262] 表15.六种能够结合IL-1α和IL-1β的DVD-Ig蛋白的重链和轻链的氨基酸序列
[0263] 新DVD-Ig构建体的特征概述于表16中。分别通过Biacore和MRC-5生物测定测定亲和力(Kd)和生物活性(IC50)。所有新DVD-Ig蛋白的SDS-PAGE分析在还原和非还原条件下显示与常规抗体和DVD1/2-Ig类似的常规迁移模式。
[0264] 表16.来源于新mAb对的新DVD-Ig分子的表征mAb = 单克隆抗体；NA = 无所检测的中和活性。
[0265] 新DVD-Ig分子的功能表征显示，在任一定向下，就结合和中和两种抗原而言，具有长接头的DVD-Ig分子表现优于具有短接头的DVD-Ig分子。关于具有长接头的DVD-Ig分子，具有b-a-C定向的DVD-Ig分子显示良好结合于两种抗原且中和两种抗原，而具有a-b-C定向的DVD-Ig分子显示良好的结合于IL-1α且中和IL-1α且结合于IL-1β和中和IL-1β降低(例如DVD4b相比于DVD4a)。DVD-Ig分子DVD4b以低于nM的水平结合且中和IL-1α和IL-1β两者且完全保留亲本mAb的结合和中和特征。
[0266] 实施例3. 生成mIL-1α/β DVD-Ig分子为了研究与DVD-Ig分子的药代动力学、体内效力、组织穿透性和免疫原性有关的关键问题，如下所述构建小鼠抗小鼠IL-1α/β DVD-Ig分子。
[0267] 实施例3.1. 构建mIL-1α/β DVD-Ig分子使用从IL-1αβ双重KO小鼠生成的两种小鼠抗小鼠IL-1α/β单克隆抗体(9H10和
10G11)构建小鼠抗小鼠IL-1α/β DVD-Ig分子。通过分别用小鼠IL-1α或小鼠IL-1β免疫IL-1α/β双重KO小鼠来生成小鼠抗小鼠IL-1α单克隆抗体(mAb)和小鼠抗小鼠IL-1β单克隆抗体(mAb)。选择一个小鼠抗小鼠IL-1α mAb(克隆9H10)和一个小鼠抗小鼠IL-1β mAb(克隆10G11)，且用于生成mIL-1α/β DVD-Ig分子。测试各种接头大小和不同结构域定向。以V(抗mIL-1β)-接头-V(抗mIL-1α)-鼠恒定区(Cγ2a和Cκ)的定向构建最终功能性mIL-1α/β DVD-Ig分子。克隆、表达和纯化程序与hIL-1α/β DVD-Ig结合蛋白的那些程序类似。使用与关于hIL-1α/β DVD3-Ig所述类似的重叠PCR和同源重组进行mIL-1α/β DVD-Ig结合蛋白的克隆。mIL-1α/β DVD-Ig结合蛋白的序列显示于下表17中。
10G11)构建小鼠抗小鼠IL-1α/β DVD-Ig分子。通过分别用小鼠IL-1α或小鼠IL-1β免疫IL-1α/β双重KO小鼠来生成小鼠抗小鼠IL-1α单克隆抗体(mAb)和小鼠抗小鼠IL-1β单克隆抗体(mAb)。选择一个小鼠抗小鼠IL-1α mAb(克隆9H10)和一个小鼠抗小鼠IL-1β mAb(克隆10G11)，且用于生成mIL-1α/β DVD-Ig分子。测试各种接头大小和不同结构域定向。以V(抗mIL-1β)-接头-V(抗mIL-1α)-鼠恒定区(Cγ2a和Cκ)的定向构建最终功能性mIL-1α/β DVD-Ig分子。克隆、表达和纯化程序与hIL-1α/β DVD-Ig结合蛋白的那些程序类似。使用与关于hIL-1α/β DVD3-Ig所述类似的重叠PCR和同源重组进行mIL-1α/β DVD-Ig结合蛋白的克隆。mIL-1α/β DVD-Ig结合蛋白的序列显示于下表17中。
[0268] 表17. mIL-1α/β DVD-Ig结合蛋白的氨基酸序列
[0269] 鼠mIL-1α/β DVD-Ig 结 合 蛋 白 保 留 针 对 鼠IL-1α(mIL-1α) 和 鼠IL-1β(mIL-1β)两者的亲和力/体外效价。表18显示mAb 9H10(抗mIL-1α)、10G11(抗mIL-1β)和mIL-1α/β DVD-Ig结合蛋白的表征。
[0270] 表18. mDVD4-Ig的表征
[0271] 实施例3.2. mIL-1α/β DVD-Ig结合蛋白在类风湿性关节炎模型中的体内活性在本领域中众所周知的胶原蛋白诱导的关节炎小鼠模型中评估抗IL-1α、抗IL-1β、组合的抗IL-1α/抗IL-1β和鼠IL-1α/β DVD4-Ig的治疗作用。简而言之，在尾巴根部用CFA中的牛II型胶原蛋白免疫雄性DBA-1小鼠。在第21天，用酵母聚糖(Zymosan)腹膜内(i.p)加强小鼠。在第24-27天疾病发作后，选择小鼠且分成各10只小鼠的独立组。在处理开始时，对照组和抗细胞因子组的平均关节炎得分相当。为了中和IL-1，每隔一天用1-3 mg/kg的抗IL-1α mAb、抗IL-1β mAb、抗IL-1α mAb与抗IL-1β mAb的组合或鼠IL-1α/β DVD4-Ig腹膜内注射小鼠。一周三次仔细地检查小鼠在外周关节的关节炎的外观，且确定疾病活动度得分。
[0272] 在治疗模式中阻断IL-1有效降低关节炎的严重度，其中抗IL-1β显示比抗IL-1α(与对照组相比，平均关节炎得分降低10%)大的功效(与对照组相比，平均关节炎得分降低24%)。在抗IL-1α与抗IL-1β之间观察到累加效应，其中用抗IL-1α mAb和抗IL-1β mAb两者处理的小鼠平均关节炎得分降低40%。令人惊讶的是，在相同剂量水平下，mDVD-Ig结合蛋白的处理显示平均关节炎得分降低47%，证明mDVD-Ig结合蛋白的体内治疗效力。在该动物模型的关节肿胀测量中也观察到类似效力。
[0273] 实施例3.3. 鼠IL-1α/β DVD-Ig结合蛋白在骨关节炎模型中的体内活性以上研究显示对于类风湿性关节炎，在小鼠胶原蛋白诱导的关节炎(CIA)模型中，用抗小鼠IL-1α和IL-1β抗体的组合以及鼠抗小鼠IL-1α/β DVD-Ig结合蛋白阻断IL-1α和IL-1β两者明显比单独任何单一抗体有效(还参见Wu等人, Nature Biotech.,25(11): 12901297 (2007))。在两种OA动物模型(即小鼠关节不稳定模型("JIM")和小鼠内侧半月板去稳定("DMM")模型)中研究抗IL-1治疗对骨关节炎(OA)的效力。
[0274] 实施例3.3.1. 小鼠抗鼠IL-1α和抗鼠IL-1β单克隆抗体在小鼠骨关节炎的关节不稳定模型(JIM)中的体内活性实施例3.3.1.A. 研究设计
在小鼠骨关节炎的关节不稳定模型(JIM)中，mIL-1α/β DVD-Ig分子的体内活性的研究设计显示于表19中。所有组含有25只称重约30克(BW=30 g)的小鼠(n=25)。在21天后终止研究。用异氟烷麻醉剂使每笼5只圈养的两个半月大雄性Swiss Webster小鼠(25只/组/时间点)麻醉。在第0天，对右膝和左膝施用前十字韧带(ACL)创伤以试图诱导OA病变。在ACL创伤当天开始用IL-1抑制性抗体IL-1α(9H10)和IL-1β(10G11)(单独和组合)进行腹膜内(ip)治疗，且每4天(q4d)继续治疗，持续20天。用于非治疗对照的媒介物为PBS。在第21天收集右膝和左膝，且将组织病理学变化评分并表征。仅使用具有指示成功不稳定诱导的增殖反应的关节分析数据。将增殖反应/不稳定评分为0-3，且在最终分析中仅使用不稳定关节(1、2或3的评分)。将内侧和外侧股骨和胫骨软骨退化关于软骨退化严重度以0-5的量度评分。在最后一次抗体剂量后4天，从各组所有动物抽取血液进行血清收集。每周记录体重。在最后一天，向动物(组1、2、3、4中的10只动物)给药酵母聚糖A，且(在终止)4小时后采血进行IL-6(IL-1/TNF依赖性)的血清分析。在第21天杀死动物且将右膝关节和左膝关节收集至福尔马林中。
在小鼠骨关节炎的关节不稳定模型(JIM)中，mIL-1α/β DVD-Ig分子的体内活性的研究设计显示于表19中。所有组含有25只称重约30克(BW=30 g)的小鼠(n=25)。在21天后终止研究。用异氟烷麻醉剂使每笼5只圈养的两个半月大雄性Swiss Webster小鼠(25只/组/时间点)麻醉。在第0天，对右膝和左膝施用前十字韧带(ACL)创伤以试图诱导OA病变。在ACL创伤当天开始用IL-1抑制性抗体IL-1α(9H10)和IL-1β(10G11)(单独和组合)进行腹膜内(ip)治疗，且每4天(q4d)继续治疗，持续20天。用于非治疗对照的媒介物为PBS。在第21天收集右膝和左膝，且将组织病理学变化评分并表征。仅使用具有指示成功不稳定诱导的增殖反应的关节分析数据。将增殖反应/不稳定评分为0-3，且在最终分析中仅使用不稳定关节(1、2或3的评分)。将内侧和外侧股骨和胫骨软骨退化关于软骨退化严重度以0-5的量度评分。在最后一次抗体剂量后4天，从各组所有动物抽取血液进行血清收集。每周记录体重。在最后一天，向动物(组1、2、3、4中的10只动物)给药酵母聚糖A，且(在终止)4小时后采血进行IL-6(IL-1/TNF依赖性)的血清分析。在第21天杀死动物且将右膝关节和左膝关节收集至福尔马林中。
[0275] 表19.在骨关节炎的关节不稳定动物模型中的研究设计
[0276] 实施例3.3.1.B. 组织制备和分析组织制备：在脱钙固定剂(Surgipath Decalifier, Surgipath Medical Ind., Inc., Richmond VA)中2-3天后，修剪两个膝关节的外部组织，包埋额状面且切片。在额状面的近似中点处获取各动物(2个关节/阻断)的一个切片。所有切片为8 μm且用甲苯胺蓝染色。由委员会认证的兽医学病理学家在不知道研究组名称的情况下检查载玻片，且根据如下方法评分。统计分析使用Microsoft Excel来进行，且包括使用95%置信水平比较所有处理组与对照组的2尾t检验。
[0277] 关节的组织病理学评分：使用以下系统关于软骨退化的严重度对内侧和外侧股骨和胫骨软骨退化进行评分：软骨细胞和蛋白聚糖损失与纤维化的深度/程度：1=超过50%或更多的区带表面有表面损伤、胶原蛋白的切线层缺失，或区带中病灶或扩散分布中有多达10%的蛋白聚糖和/或软骨细胞损失
2=50%或更多的区带面积的基质损失延伸至上部1/4，或区带中病灶或扩散分布中有多达25%的蛋白聚糖和/或软骨细胞损失
3=超过50%或更多的区带的基质损失延伸穿过软骨厚度的1/2，或区带中病灶或扩散分布中有多达50%的蛋白聚糖和/或软骨细胞损失
4=超过50%或更多的区带的基质损失延伸穿过软骨厚度的3/4，或区带中病灶或扩散分布中有多达75%的蛋白聚糖和/或软骨细胞损失
5=超过50%或更多的区带的基质损失延伸穿过整个软骨厚度，或区带中病灶或扩散分布中有多达100%的蛋白聚糖和/或软骨细胞损失
针对病变的分区(内部、中间和外部)分布来指定评分，且对各三分之一的得分(0-5)就关节的各区域且随后就完整关节进行求和。
2=50%或更多的区带面积的基质损失延伸至上部1/4，或区带中病灶或扩散分布中有多达25%的蛋白聚糖和/或软骨细胞损失
3=超过50%或更多的区带的基质损失延伸穿过软骨厚度的1/2，或区带中病灶或扩散分布中有多达50%的蛋白聚糖和/或软骨细胞损失
4=超过50%或更多的区带的基质损失延伸穿过软骨厚度的3/4，或区带中病灶或扩散分布中有多达75%的蛋白聚糖和/或软骨细胞损失
5=超过50%或更多的区带的基质损失延伸穿过整个软骨厚度，或区带中病灶或扩散分布中有多达100%的蛋白聚糖和/或软骨细胞损失
针对病变的分区(内部、中间和外部)分布来指定评分，且对各三分之一的得分(0-5)就关节的各区域且随后就完整关节进行求和。
[0278] 使用数字软件(NIS-Elements版本3.0)测量骨赘(对胫骨或股骨表面上的最大者进行评估)。
[0279] 骨赘评估=根据大小的1、2或3用于表示小、中或大小骨赘= 1(至多达150 μm)
中骨赘= 2(151-300 μm)
大骨赘= 3(>301 μm)
相对于(如果存在)不包括于评分中的炎症类型和程度描述并表征滑液反应。
中骨赘= 2(151-300 μm)
大骨赘= 3(>301 μm)
相对于(如果存在)不包括于评分中的炎症类型和程度描述并表征滑液反应。
[0280] 测定各动物的各种不同参数的平均值±SE并求和以得到总关节得分。
[0281] 通过内侧滑膜和侧韧带中增殖变化的存在鉴定具有不稳定诱导的组织学证据的关节。此外，根据以下标准记录各关节的不稳定得分。
[0282] 0=无不稳定1=轻度不稳定(韧带和边缘区中的最小至轻度增殖变化)
2=中度不稳定(韧带和边缘区中的中度增殖变化)
3=重度不稳定(韧带和边缘区中的严重增殖变化)
结果：在最终数据分析中仅使用具有1、2或3(或2、3)的评分的不稳定关节。最后基于全患病关节而非患病动物分析数据。该研究结果表明用抗IL-1α单克隆抗体或IL-1β单克隆抗体处理的动物的关节显示与媒介物处理的对照关节中所见类似的软骨退化。然而，使用小鼠抗小鼠IL-1α mAb (9H10)和小鼠抗小鼠IL-1β mAb(10G11)两者的组合治疗显著减小内侧胫骨的软骨退化得分。图2显示不同治疗组中的动物关节的软骨退化评分条形图。
2=中度不稳定(韧带和边缘区中的中度增殖变化)
3=重度不稳定(韧带和边缘区中的严重增殖变化)
结果：在最终数据分析中仅使用具有1、2或3(或2、3)的评分的不稳定关节。最后基于全患病关节而非患病动物分析数据。该研究结果表明用抗IL-1α单克隆抗体或IL-1β单克隆抗体处理的动物的关节显示与媒介物处理的对照关节中所见类似的软骨退化。然而，使用小鼠抗小鼠IL-1α mAb (9H10)和小鼠抗小鼠IL-1β mAb(10G11)两者的组合治疗显著减小内侧胫骨的软骨退化得分。图2显示不同治疗组中的动物关节的软骨退化评分条形图。
[0283] 实施例3.3.2. mIL-1α/β DVD-Ig结合蛋白在小鼠骨关节炎的关节不稳定模型(JIM)中的体内活性如上文实施例3.3.1中所述的骨关节炎的关节不稳定模型也用于比较由小鼠抗
mIL-1α单克隆抗体(9H10)与小鼠抗mIL-1β单克隆抗体(10G11)的组合提供的抗IL-1治疗与由从这两种单克隆抗体生成的mIL-1α/β DVD-Ig结合蛋白提供的抗IL-1治疗的效力。
mIL-1α单克隆抗体(9H10)与小鼠抗mIL-1β单克隆抗体(10G11)的组合提供的抗IL-1治疗与由从这两种单克隆抗体生成的mIL-1α/β DVD-Ig结合蛋白提供的抗IL-1治疗的效力。
[0284] 实施例3.3.2.A. 研究设计本研究设计与上文实施例3.3.1中所述的研究设计类似。在第0天，用异氟烷麻醉剂使每笼圈养5只的两个半月大雄性Swiss Webster小鼠(25只/组/时间点)麻醉，且钳夹右膝和左膝区域并准备对十字韧带进行关节内创伤手术。对动物每4天一次(Q4D)进行给药(在第0天开始，ip)，在第21天终止(对于组2)。对动物每周三次进行给药(在第
0天开始，ip)，在第21天终止(对于组1、3和4)。在最后一次抗体剂量后四天，每组的所有动物已采血进行血清收集。每周记录体重。在最后一天，向动物(组1、2、3、4中的10只动物)给药酵母聚糖A，且(在终止)4小时后采血进行IL-6(IL-1/TNF依赖性)的血清分析。在第21天将动物处死且将右膝关节和左膝关节收集至福尔马林中。参见如下研究设计表。
0天开始，ip)，在第21天终止(对于组1、3和4)。在最后一次抗体剂量后四天，每组的所有动物已采血进行血清收集。每周记录体重。在最后一天，向动物(组1、2、3、4中的10只动物)给药酵母聚糖A，且(在终止)4小时后采血进行IL-6(IL-1/TNF依赖性)的血清分析。在第21天将动物处死且将右膝关节和左膝关节收集至福尔马林中。参见如下研究设计表。
[0285] 表20. 骨关节炎的关节不稳定动物模型的研究设计
[0286] 实施例3.3.2.B. 组织制备和分析如上文实施例3.3.1中所述进行各个治疗组中的动物关节的关节软骨的组织制备和组织学评分。
[0287] 结果：结果表明用mIL-1α/β 10G11-9H10 DVD-Ig结合蛋白治疗小鼠显著抑制骨关节炎的进展(相比于媒介物，P < 0.05)，具有与亲本mAb 9H10和10G11的组合相当的效力。图3显示各个治疗组中的动物关节的软骨退化评分条形图。如图3中所示，就预防骨关节炎病变而言，用6或12 mg/kg DVD-Ig结合蛋白治疗的结果与其效力类似。(使用3 mg/kg DVD-Ig结合蛋白的治疗对软骨退化没有影响且结果与媒介物治疗的关节类似。参见下文实施例3.3.3。) 本研究结果表明在骨关节炎的小鼠模型中使用抗IL-1α单克隆抗体与抗IL-1β单克隆抗体的组合或使用IL-1α/β DVD-Ig结合蛋白治疗对组织病理学参数具有明显有益的作用。
[0288] 实施例3.3.3. 骨关节炎的关节不稳定模型中的追踪研究以比较使用抗IL-1β单克隆抗体和其他结合蛋白的处理使用骨关节炎的关节不稳定模型进行追踪研究以便更精密地测定与其他处理相比，仅用抗IL-1β单克隆抗体处理的动物中是否可以对内侧胫骨软骨退化评分具有任何明显作用。在21天研究中评估用抗IL-1β单克隆抗体处理的作用。
[0289] 实施例3.3.3.A. 研究设计本研究设计与上文实施例3.3.1中所述的研究设计类似。
[0290] 表21. 21天骨关节炎的关节不稳定动物模型的设计
[0291] 实施例3.3.3.B. 组织制备和分析如上文实施例3.3.1中所述进行各个治疗组中的动物关节的关节软骨的组织制备和组织学评分。
[0292] 结果：如图4中所示，结果证实其中指示类似阳性治疗作用的那些先前研究使用抗IL-1α单克隆抗体与抗IL-1β单克隆抗体的组合，且仅使用抗IL-1β单克隆抗体的处理在任何测试剂量下均无法有效预防软骨退化。
[0293] 实施例3.3.4. 关节不稳定模型研究中酵母聚糖诱导的白介素-6(IL-6)产生如药效动力学读出值以确定抗IL-1α单克隆抗体和抗IL-1β单克隆抗体以及mIL-1α/β DVD-Ig结合蛋白是否是功能性的且是否能够体内中和IL-1α和IL-1β一样，在OA的关节不稳定模型研究中测量酵母聚糖诱导(IL-1α和IL-1β依赖性)的白介素
6(IL-6)产生。
6(IL-6)产生。
[0294] 简而言之，在第21天，在模型中，将酵母聚糖悬浮于PBS媒介物中且置于沸水中半小时，然后使其冷却，随后使用。然后用在0.5 ml PBS中悬浮(在注射前充分混合)的50 mg/kg酵母聚糖ip注射小鼠。然后在酵母聚糖注射后4小时对小鼠放血。收集血清用于IL-6测量。
[0295] 结果：如图5中所示，与媒介物处理的对照动物相比，抗IL-1α单克隆抗体(6 mg/kg)与抗IL-1β单克隆抗体(6 mg/kg)的组合以及mIL-1α/β DVD-Ig结合蛋白(6 mg/kg或12 mg/kg)显著中和酵母聚糖诱导的IL-6产生。因此，抗体显示体内功能活性。
[0296] 实施例3.3.5. 细胞因子抑制性抗体处理对于SV129小鼠中由内侧半月板去稳定(DMM)模型诱导的骨关节炎的作用也采用可替代动物模型来研究抗IL-1α和抗IL-1β活性对于减缓骨关节炎的软骨退化进展的影响。骨关节炎的小鼠内侧半月板去稳定(DMM)模型比JIM程序(参见上文)具有较小侵袭性和炎症性，且主要在胫骨内侧坪和股骨内侧髁的中心承重区上导致病变。当与JIM相比时，在DMM后病变的严重度和位置更一致。
[0297] 实施例3.3.5.A. 研究设计在第0天，腹膜内(ip)施用氯胺酮/甲苯噻嗪混合液使每笼圈养5只的重量约30克
的雄性SV129小鼠麻醉，且随后通过钝性分离暴露内侧侧韧带并横切以反映出朝向股骨的半月板。用8-0 vicryl缝合线闭合关节间隙。用伤口胶闭合皮肤。对于假手术，在膝内侧造成垂直皮肤切口并打开关节囊。用8-0 vicryl缝合线闭合关节囊且用伤口胶闭合皮肤。
然后根据以下研究设计表，以腹膜内(ip)注射抗体或媒介物来处理动物组。两只性别匹配、年龄匹配且品系匹配的未实验小鼠也包括在本研究中。在8周处理后，使动物安乐死，且将膝关节收获在10%中性缓冲福尔马林中。
的雄性SV129小鼠麻醉，且随后通过钝性分离暴露内侧侧韧带并横切以反映出朝向股骨的半月板。用8-0 vicryl缝合线闭合关节间隙。用伤口胶闭合皮肤。对于假手术，在膝内侧造成垂直皮肤切口并打开关节囊。用8-0 vicryl缝合线闭合关节囊且用伤口胶闭合皮肤。
然后根据以下研究设计表，以腹膜内(ip)注射抗体或媒介物来处理动物组。两只性别匹配、年龄匹配且品系匹配的未实验小鼠也包括在本研究中。在8周处理后，使动物安乐死，且将膝关节收获在10%中性缓冲福尔马林中。
[0298] 表22. 使用骨关节炎的内侧半月板去稳定(DMM)模型的研究设计
[0299] 实施例3.3.5.B. 组织检查将福尔马林固定的样品脱钙，且将标本在额状面上各自切成15层切片。每层切片约6 μm厚，且各层切片相隔70 μm。所有载玻片用甲苯胺蓝(T. Blue)染色。由委员会认证的兽医病理学家根据Chambers方法(Chambers method，Chambers等人(2001) Arthritis Rheum 44:1455-65)关于软骨退化(参见下文)评估载玻片。根据下表中的量表，将四种软骨表面股骨内侧髁(MFC)、胫骨内侧坪(MTP)、股骨外侧髁(LFC)和胫骨外侧坪(LTP)中每种以0-6进行评分。
[0300] 表23. 软骨退化的Chambers评分系统等级骨关节损伤
0 无损伤
1 关节表面变粗糙和少量纤维化
2 纤维化向下至紧靠表面层以下的层(区2)和损失一些表面薄层
3 表面薄层损失且纤维化向下延伸至钙化软骨
4 严重纤维化且软骨侵蚀向下至软骨下骨
5 严重纤维化且侵蚀多达80%的软骨
6 超过80%的软骨损失
0 无损伤
1 关节表面变粗糙和少量纤维化
2 纤维化向下至紧靠表面层以下的层(区2)和损失一些表面薄层
3 表面薄层损失且纤维化向下延伸至钙化软骨
4 严重纤维化且软骨侵蚀向下至软骨下骨
5 严重纤维化且侵蚀多达80%的软骨
6 超过80%的软骨损失
[0301] 使用GraphPad Prism软件版本4.03，使用曼-惠特尼U检验(Mann-Whitney U test)进行统计分析。
[0302] 实施例3.3.5.C. 结果如图6中所示，使用抗小鼠IL-1α单克隆抗体(9H10，6 mg/kg)和抗小鼠IL-1β单克隆抗体(10G11，6 mg/kg)两者或使用IL-1α/β DVD-Ig结合蛋白(6 mg/kg)的组合治疗显著降低骨关节炎的小鼠DMM模型中的软骨退化。
[0303] 实施例3.3.6. 在小鼠骨关节炎的内侧半月板去稳定(DMM)模型中滴定抗IL-1α和抗IL-1β活性(8周研究)针对骨关节炎的DMM模型中响应于不同剂量的抗mIL-1α单克隆抗体(9H10 mAb)和
抗mIL-1β单克隆抗体(10G11 mAb)(单独或组合)和不同剂量的mIL-1α/β 10G11-9H10 DVD-Ig结合蛋白对于软骨退化的作用进行8周研究。
抗mIL-1β单克隆抗体(10G11 mAb)(单独或组合)和不同剂量的mIL-1α/β 10G11-9H10 DVD-Ig结合蛋白对于软骨退化的作用进行8周研究。
[0304] 实施例3.3.6.A. 研究设计在第0天，腹膜内(ip)施用氯胺酮/甲苯噻嗪混合液使每笼圈养5只的重量约30克的雄性SV129小鼠麻醉，且随后通过钝性分离暴露内侧侧韧带并横切以反映出朝向股骨的半月板。用8-0 vicryl缝合线闭合关节间隙。用伤口胶闭合皮肤。对于假手术，在膝内侧造成垂直皮肤切口并打开关节囊。用8-0 vicryl缝合线闭合关节囊且用伤口胶闭合皮肤。然后根据以下研究设计表(表24)，以腹膜内(ip)注射抗mIL-1α单克隆抗体、抗mIL-1β(单独或组合)、mIL-1α/βDVD-Ig结合蛋白或媒介物来处理动物组。在8周处理后，使动物安乐死，且将膝关节收获在10%中性缓冲福尔马林中。
[0305] 表24. 在骨关节炎的DMM模型中测试各种治疗的研究设计
[0306] 上表第3列(动物数)中括号中的数字是数据集中包括的实际动物数目。排除的简要描述如下：组B：仅9只动物包括在组B中。一只动物从数据集中排除，因为在组织学检查下发现内侧半月板完整且基本上不存在骨关节炎变化。
[0307] 组C：仅5只动物包括在组C中。五只动物从数据集中排除，因为在组织学检查下发现内侧半月板大部分完整且存在很少骨关节炎变化。
[0308] 组D：仅8只动物包括在组D中。一只动物的载玻片不存在。另一只动物从数据集中排除，因为在组织学检查下发现内侧半月板大部分完整且存在很少骨关节炎变化。
[0309] 组E：仅8只动物包括在组E中。排除两只动物，因为其被视为异常值。
[0310] 组F：仅9只动物包括在组F中。一只动物从数据集中排除，因为在组织学检查下发现内侧半月板完整且基本上不存在骨关节炎变化。
[0311] 实施例3.3.6.B. 组织制备和检查如上文实例3.3.5中所述制备组织并评分。
[0312] 实施例3.3.6.C. 结果结果如图7中所示。与骨关节炎的关节不稳定模型(JIM)中获得的结果(上文)类似，仅用抗IL-1α单克隆抗体(9H10)或抗IL-1β单克隆抗体(10G11)治疗导致软骨退化减少，其与媒介物对照关节中观察到的结果没有统计学显著性差异。然而，使用两种单克隆抗体或使用IL-1α/β DVD-Ig结合蛋白(除1.5 mg/kg的IL-1α/β DVD之外)的组合治疗显著降低平均Chambers得分总和(表明总体软骨退化)和平均最大Chambers得分(关节中最受影响的区域)。在mIL-1α/β DVD-Ig处理组中观察到平均Chambers得分总和的统计学显著性剂量作用。因此，在本研究中，用抗mIL-1α单克隆抗体和抗mIL-1β单克隆抗体两者(各6 mg/kg)和用mIL-1α/β DVD-Ig结合蛋白(3 mg/kg和6 mg/kg)治疗
8周改善骨关节炎的DMM模型中诱导的软骨退化的进展。
8周改善骨关节炎的DMM模型中诱导的软骨退化的进展。
[0313] 实施例3.3.7. 在骨关节炎的内侧半月板去稳定(DMM)模型中抗IL-1α和抗IL-1β活性和小分子处理对于动物软骨退化的作用已显示多西环素预防骨关节炎的DMM模型中的软骨退化(Effects of
Disease-modifying Osteoarthritis Drugs in an in-vivo Animal Model1Silva 等人, Univ. Mass. Med. School, Worcester, MA, USA, Trans ORS 2009 –需要完整引用)且还在人临床试验中预防软骨退化(Brandt等人(2005) Arthrit. Rheum.
52(7):2015-2025)。在此研究中，在DMM模型中，用多西环素处理动物的作用与用抗IL-1α单克隆抗体与抗IL-1β单克隆抗体的组合处理动物的作用相当。
Disease-modifying Osteoarthritis Drugs in an in-vivo Animal Model1Silva 等人, Univ. Mass. Med. School, Worcester, MA, USA, Trans ORS 2009 –需要完整引用)且还在人临床试验中预防软骨退化(Brandt等人(2005) Arthrit. Rheum.
52(7):2015-2025)。在此研究中，在DMM模型中，用多西环素处理动物的作用与用抗IL-1α单克隆抗体与抗IL-1β单克隆抗体的组合处理动物的作用相当。
[0314] 实施例3.3.7.A. 研究设计重量约30克的雄性SV129小鼠已通过钝性分离暴露内侧侧韧带，且横切以反映出朝向股骨的半月板。用8-0 vicryl缝合线闭合关节间隙。用伤口胶闭合皮肤。对于假手术，在膝内侧造成垂直皮肤切口并打开关节囊。用8-0 vicryl缝合线闭合关节囊且用伤口胶闭合皮肤。然后根据以下研究设计表，口服(po)或经由腹膜内(ip)注射媒介物或治疗剂来处理动物组。三只性别匹配、年龄匹配且品系匹配的未实验小鼠也包括在本研究中。在4周处理后，使动物安乐死，且将膝关节收获在10%中性缓冲福尔马林中。
[0315] 表25.在骨关节炎的DMM模型中测试各种抗IL-1抗体和多西环素处理的研究设计
[0316] 实施例3.3.7.B. 组织制备和检查如上文实施例3.3.5中所述制备组织并评分。
[0317] 实施例3.3.7.C. 结果结果如图8中所示。在研究条件下，用各180 µg/小鼠给药的抗IL-1α单克隆抗体与抗IL-1β单克隆抗体的组合处理4周导致雄性SV129小鼠中由内侧半月板去稳定诱导的骨关节炎变化显著改善。与媒介物对照组相比，该组合处理显著降低平均Chambers得分总和和平均最大Chambers得分，且尤其降低平均Chambers得分总和。30 mg/kg的多西环素处理也导致类似治疗作用，但抗体组合治疗更有效。
[0318] 实施例4. 抗IL-1α/β治疗的疼痛效力DMM模型也生成小鼠的可测量疼痛。近来，Malfait等人(参见Malfait等人(2010) Osteoarthritis Cartilage, 18: 572-580)显示在DMM而非假手术后，后爪的缩爪阈值(paw withdrawal threshold)(疼痛的机械异常疼痛指示)明显减小。在DMM动物模型中研究抗IL-1α/β治疗的效力。如该系列研究中所示，进行DMM手术的小鼠早在手术后第
7天即出现异常疼痛且直至第35天显示缩爪阈值减小。
7天即出现异常疼痛且直至第35天显示缩爪阈值减小。
[0319] 在OA的DMM小鼠模型中在机械异常疼痛方面测试抗IL-1治疗改善疼痛的潜能。在手术当天开始IL-1α mAb与IL-1β mAb的组合的给药且每周重复两次，持续5周。仅用PBS媒介物、用IgG同种型对照或用抗IL-1α mAb与抗IL-1β mAb的组合(对于各mAb，剂量为6 mg/kg)处理动物。每周测试动物的缩爪阈值。用PBS或IgG同种型对照处理的组的同侧(手术)肢与对侧(非手术)肢相比或与已进行假手术的动物相比表现异常疼痛(疼痛)。参见图9。相比之下，在第5周(第35天)，用抗IL-1α mAb与抗IL-1β mAb的组合处理的组证明缩爪阈值显著较高，表明与PBS媒介物或IgG同种型治疗组相比异常疼痛(疼痛)发展减慢。参见图10。该疼痛减轻早在治疗后第1周即发现(数据未显示)。
[0320] 为了评估IL-1治疗在确定疼痛中的作用，在第35天用抗IL-1α单克隆抗体与抗IL-1β单克隆抗体的组合处理IgG对照组中患有确定OA和机械异常疼痛的动物，且在24小时后(第36天)测试缩爪阈值。数据证明使用抗IL-1α mAb与抗IL-1β mAb的组合治疗逆转患有确定疾病的动物的异常疼痛(减轻OA疼痛)。这些数据表明抗IL-1治疗提供不依赖于潜在的疾病缓解作用的镇痛作用。参见图11。
[0321] 实施例5. 抗IL-1α/β组合治疗的疼痛效力的进一步研究在机械异常疼痛方面进一步评估抗IL-1治疗在OA的DMM小鼠模型(参见上文)中改
善疼痛的潜能。在手术当天开始IL-1α mAb与IL-1β mAb的组合的给药且每周重复两次，持续4周。仅用PBS媒介物、用抗IL-1α mAb(6 mg/kg)、用抗IL-1β mAb(6 mg/kg)或用抗IL-1α mAb(6 mg/kg)与抗IL-1β mAb(6 mg/kg)的组合处理DMM动物，每周腹膜内(ip)施用两次，持续四周。在第28天测试动物的异常疼痛。用媒介物处理的组的同侧(手术)肢与对侧(非手术)肢相比或与已进行假手术的动物相比表现异常疼痛(疼痛)。参见图
12。类似地，仅用抗IL-1α mAb或抗IL-1β mAb治疗的组表现异常疼痛(疼痛)。相比之下，用抗IL-1α mAb与抗IL-1β mAb的组合处理的组证明缩爪阈值显著较高，表明与媒介物处理组相比异常疼痛(疼痛)发展减慢(图12)。
善疼痛的潜能。在手术当天开始IL-1α mAb与IL-1β mAb的组合的给药且每周重复两次，持续4周。仅用PBS媒介物、用抗IL-1α mAb(6 mg/kg)、用抗IL-1β mAb(6 mg/kg)或用抗IL-1α mAb(6 mg/kg)与抗IL-1β mAb(6 mg/kg)的组合处理DMM动物，每周腹膜内(ip)施用两次，持续四周。在第28天测试动物的异常疼痛。用媒介物处理的组的同侧(手术)肢与对侧(非手术)肢相比或与已进行假手术的动物相比表现异常疼痛(疼痛)。参见图
12。类似地，仅用抗IL-1α mAb或抗IL-1β mAb治疗的组表现异常疼痛(疼痛)。相比之下，用抗IL-1α mAb与抗IL-1β mAb的组合处理的组证明缩爪阈值显著较高，表明与媒介物处理组相比异常疼痛(疼痛)发展减慢(图12)。
[0322] 实施例6. 抗IL-1α/β组合治疗的剂量依赖性疼痛效力在DMM小鼠模型中，在对动物进行手术的当天开始抗IL-1α mAb与抗IL-1β mAb的组合的给药，且每周重复两次，持续四周。仅用PBS媒介物或用抗IL-1α mAb与抗IL-1β mAb的组合处理动物，两者均以1 mg/kg、3 mg/kg或6 mg/kg腹膜内(ip)施用，每四天一次，持续四周。在第28天测试动物的缩爪阈值。用媒介物处理的组的同侧(手术)肢显示缩爪阈值明显减小，表明与对侧(非手术)肢相比或与已进行假手术的动物相比表现异常疼痛(疼痛)(图13)。相比之下，用抗IL-1α mAb与抗IL-1β mAb的组合处理的组证明缩爪阈值的剂量依赖性增大，表明与媒介物处理组相比异常疼痛(疼痛)发展减慢(图13)。
[0323] 实施例7. 确定疼痛中的抗IL-1α/β组合治疗为了评估抗IL-1α/β组合治疗在确定疼痛中的作用，在第27天用抗IL-1α mAb与抗IL-1β mAb的组合处理DMM小鼠模型中患有确定OA和机械异常疼痛的动物，两者均以
1 mg/kg、3 mg/kg或6 mg/kg腹膜内(ip)施用，24小时后(第28天)测试异常疼痛。结果显示于图14中。数据证明使用抗IL-1α mAb与抗IL-1β mAb的组合治疗以剂量相关方式逆转患有确定疾病的动物中的机械异常疼痛(减轻的OA疼痛)(图14)。
1 mg/kg、3 mg/kg或6 mg/kg腹膜内(ip)施用，24小时后(第28天)测试异常疼痛。结果显示于图14中。数据证明使用抗IL-1α mAb与抗IL-1β mAb的组合治疗以剂量相关方式逆转患有确定疾病的动物中的机械异常疼痛(减轻的OA疼痛)(图14)。
[0324] 实施例8. 抗IL-1α/β组合治疗的抗痛觉过敏作用为了评估中和IL-1α和IL-1β是否在炎性疼痛状况中产生镇痛作用，评估抗IL-1α mAb和抗IL-1β mAb在疼痛感受性疼痛的小鼠角叉菜胶爪模型中逆转确定疼痛的能力。
[0325] 在小鼠角叉菜胶模型中评估抗IL-1α mAb和抗IL-1β mAb在单独或组合施用时的效力(图15)。在小鼠的不同组中，在足底角叉菜胶注射后30小时，施用900 μg抗IL-1α mAb、抗IL-1β mAb或其组合。在角叉菜胶注射后48小时和96小时，进行热痛觉过敏测试。如先前研究所示，900 μg剂量组合显著减弱热痛觉过敏(在48小时，相比PBS组4.98±0.34 s，角叉菜胶爪8.11±0.62 s，p<0.01，图15A；在96小时，相比PBS组4.45±0.55s，角叉菜胶爪7.62±0.45 s，p<0.01，图15B)。900 μg组合组中的抗疼痛感受性效应在48小时为53±7%，且在96小时为82±11%。双氯芬酸(非类固醇抗炎镇痛剂)阳性对照组同样显示显著减弱热痛觉过敏(在两个时间点下p<0.01)。相比之下，在小鼠角叉菜胶炎性疼痛模型中，当单独施用抗IL-1α mAb和抗IL-1β mAb时，在两个时间点均未发现显著抗疼痛感受性效应，表明同时中和IL-1α和IL-1β两者是抗疼痛感受性效力所必需的。
[0326] 实施例9. 抗IL-1α/β组合治疗的剂量依赖性抗痛觉过敏效应如图16中所示，如对辐射热刺激的缩爪潜伏期减小所证明，小鼠(雌性BALB/c)足底注射角叉菜胶产生持久的热痛觉过敏(在角叉菜胶注射后48小时和96小时进行测试；对于在两个时间点下对照未受伤爪相比PBS媒介物组中的角叉菜胶爪，p<0.01)。在角叉菜胶注射后30小时，用媒介物或抗IL-1α mAb与抗IL-1β mAb的组合(各mAb 100、300或
900 μg/小鼠)处理不同动物组。由抗IL-1α mAb与抗IL-1β mAb的900 μg剂量组合显著减弱热痛觉过敏可看出剂量相关效应(在48小时，PBS中的角叉菜胶爪3.23±0.34 s相比于900 μg组中的7.88±0.93 s，p<0.01，图16A；在96小时，PBS中的角叉菜胶爪
4.45±0.55 s相比于900 μg组中的7.62±0.45 s，p<0.01，图16B)。900 μg处理组的抗疼痛感受性效应在48小时为70±9%，且在96小时为62±4%。非类固醇抗炎镇痛剂双氯芬酸(30 mg/kg)作为阳性对照包括在该研究中，且当在测试前60分钟经口施用时，其使受伤爪的平均缩爪潜伏期增加至48小时的7.01±0.58 s和96小时的7.48±0.34 s(在两个时间点下，p<0.01)。IgG对照组和低剂量100 μg mAb组在任一时间点下均未减弱热痛觉过敏。mAb和双氯芬酸未显著改变对照未受伤爪的缩爪潜伏期值。
900 μg/小鼠)处理不同动物组。由抗IL-1α mAb与抗IL-1β mAb的900 μg剂量组合显著减弱热痛觉过敏可看出剂量相关效应(在48小时，PBS中的角叉菜胶爪3.23±0.34 s相比于900 μg组中的7.88±0.93 s，p<0.01，图16A；在96小时，PBS中的角叉菜胶爪
4.45±0.55 s相比于900 μg组中的7.62±0.45 s，p<0.01，图16B)。900 μg处理组的抗疼痛感受性效应在48小时为70±9%，且在96小时为62±4%。非类固醇抗炎镇痛剂双氯芬酸(30 mg/kg)作为阳性对照包括在该研究中，且当在测试前60分钟经口施用时，其使受伤爪的平均缩爪潜伏期增加至48小时的7.01±0.58 s和96小时的7.48±0.34 s(在两个时间点下，p<0.01)。IgG对照组和低剂量100 μg mAb组在任一时间点下均未减弱热痛觉过敏。mAb和双氯芬酸未显著改变对照未受伤爪的缩爪潜伏期值。
[0327] 实施例10. 抗IL-1α/β组合治疗在CFA疼痛模型中的效力CFA(完全弗氏佐剂)炎性疼痛模型用于测试抗IL-1α与抗IL-1β mAb组合是否产
生针对机械终点的效力。因此，在动物(雌性BALB/c小鼠)足底注射CFA后48小时，使用von Frey单丝评估其机械异常疼痛。如图17A中所示，如仅用PBS媒介物处理的CFA注射爪的缩爪阈值减小所证明，足底CFA产生加强的机械异常疼痛(0.052±0.028 g相比于对侧未受伤爪的0.860±0.090 g，p<0.01)。在CFA注射后30小时，用IgG同种型对照或抗IL-1α mAb与抗IL-1β mAb的组合(各mAb 900 μg/小鼠)处理各动物组。mAb处理组显示机械异常疼痛显著减弱(0.419±0.101 g，相比于PBS媒介物p<0.01，图17A)。效力量级(% MPE)为65.51±12.35%(图17B)。抗炎镇痛阳性对照双氯芬酸(30 mg/kg，1小时预处理)也通过增加缩爪阈值(0.359±0.088 g，相比于PBS媒介物，p<0.01)减弱机械异常疼痛，其中MPE%为64.51±10.20%。
生针对机械终点的效力。因此，在动物(雌性BALB/c小鼠)足底注射CFA后48小时，使用von Frey单丝评估其机械异常疼痛。如图17A中所示，如仅用PBS媒介物处理的CFA注射爪的缩爪阈值减小所证明，足底CFA产生加强的机械异常疼痛(0.052±0.028 g相比于对侧未受伤爪的0.860±0.090 g，p<0.01)。在CFA注射后30小时，用IgG同种型对照或抗IL-1α mAb与抗IL-1β mAb的组合(各mAb 900 μg/小鼠)处理各动物组。mAb处理组显示机械异常疼痛显著减弱(0.419±0.101 g，相比于PBS媒介物p<0.01，图17A)。效力量级(% MPE)为65.51±12.35%(图17B)。抗炎镇痛阳性对照双氯芬酸(30 mg/kg，1小时预处理)也通过增加缩爪阈值(0.359±0.088 g，相比于PBS媒介物，p<0.01)减弱机械异常疼痛，其中MPE%为64.51±10.20%。
[0328] 实施例11. 抗IL-1α/β组合治疗在神经痛中的效力在小鼠(雄性CD1)的L5/L6脊神经结扎(SNL)模型中检查抗IL-1α与抗IL-1β mAb
组合治疗是否将在神经痛状况中产生效力。在SNL手术后6天、用mAb组合(各mAb 900 μg/小鼠)处理动物后24小时和72小时进行测试。如对von Frey单丝刺激的缩爪阈值减小所证明，在SNL手术后仅用PBS媒介物处理的小鼠中观察到机械异常疼痛(在24小时，
0.073±0.032 g相比于对侧爪的0.735±0.109 g，图18A；在72小时，0.128±0.048 g相比于对侧爪的0.732±0.132 g，图18B；在两个时间点下，p<0.01)。mAb处理组显示在两个时间点下机械异常疼痛显著减弱(在24小时，0.477±0.131 g，相比于PBS媒介物p<0.01，图18A；在72小时，0.527±0.111 g，相比于PBS媒介物p<0.01，图18B)。效力量级(% MPE)为24小时的72.20±14.39%和72小时的80.62±12.33%(图19)。阳性对照加巴喷丁(100 mg/kg，1小时预处理)通过显著增加缩爪阈值在减弱机械异常疼痛中完全有效(在24小时的0.858±0.077 g和在72小时的1.138±0.096 g，在两个时间点下相比于PBS媒介物，p<0.01)。相比之下，IgG对照组在两个时间点下均未对机械异常疼痛产生任何影响。
组合治疗是否将在神经痛状况中产生效力。在SNL手术后6天、用mAb组合(各mAb 900 μg/小鼠)处理动物后24小时和72小时进行测试。如对von Frey单丝刺激的缩爪阈值减小所证明，在SNL手术后仅用PBS媒介物处理的小鼠中观察到机械异常疼痛(在24小时，
0.073±0.032 g相比于对侧爪的0.735±0.109 g，图18A；在72小时，0.128±0.048 g相比于对侧爪的0.732±0.132 g，图18B；在两个时间点下，p<0.01)。mAb处理组显示在两个时间点下机械异常疼痛显著减弱(在24小时，0.477±0.131 g，相比于PBS媒介物p<0.01，图18A；在72小时，0.527±0.111 g，相比于PBS媒介物p<0.01，图18B)。效力量级(% MPE)为24小时的72.20±14.39%和72小时的80.62±12.33%(图19)。阳性对照加巴喷丁(100 mg/kg，1小时预处理)通过显著增加缩爪阈值在减弱机械异常疼痛中完全有效(在24小时的0.858±0.077 g和在72小时的1.138±0.096 g，在两个时间点下相比于PBS媒介物，p<0.01)。相比之下，IgG对照组在两个时间点下均未对机械异常疼痛产生任何影响。
[0329] 疼痛治疗研究的结论本文所述的疼痛研究的结果表明本发明的抗IL-1α/β组合治疗有效治疗任何疼痛形式且并非仅有效治疗与骨关节炎相关的疼痛。该抗IL-1α/β组合治疗可用于治疗患有任何类型疼痛状况的个体的疼痛，其包括但不限于疼痛状况异常疼痛、痛觉过敏和异常疼痛与痛觉过敏的组合。抗IL-1α/β组合治疗可通过向个体施用IL-1α结合蛋白与IL-1β结合蛋白的组合(例如混合物、同时施用或连续施用)，诸如抗IL-1α单克隆抗体与抗IL-1β单克隆抗体的组合；或通过向个体施用结合IL-α和IL-1β两者的蛋白，诸如结合IL-α和IL-1β两者的双特异性抗体或IL-1α/β DVD-Ig结合蛋白而向该个体提供。
[0330] 通过引用并入本申请自始至终可能引用的所有引用的参考文献(包括文献来源、专利、专利申请和网站)的内容在此特别整体通过引用并入，其中引用的参考文献也一样。除非另有说明，本发明的实践将采用药学、免疫学、分子生物学和细胞生物学的常规技术，这是本领域众所周知的。
[0331] 等价方案本发明可以以其他具体形式体现，而不背离其精神或基本特征。前述实施方案因此在所有方面视为本文描述的本发明的举例说明而不是限制。本发明的范围因此通过附加权利要求而不是前述说明书指出，并且在权利要求等价的含义和范围内的所有改变因此预期在本文中涵盖。
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