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一种用于检测乙肝病毒的双探针组合物及 试剂盒

阅读：564发布：2023-03-11

专利汇可以提供一种用于检测乙肝病毒的双探针组合物及试剂盒专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种用于检测乙肝病毒的双探针组合物，包括正向引物、反向引物、第一探针和第二探针，第一探针和第二探针为两条错位双向探针，第一探针与反向模板相匹配，第二探针与正向模板相匹配。一种包括上述的用于检测乙肝病毒组合物的用于检测乙肝病毒的试剂盒，还包括PCR缓冲液、dNTPs、Taq酶、UNG酶和核酸提取试剂。采用乙型肝炎病毒A-H共8个型别多个亚型生物信息学分析，在S区段保守区设定引物探针区段，能很好覆盖 8个HBV型别和各个亚型。探针采用两条错位双向探针，使探针能同时覆盖两个区段序列，同时针对两个保守基因区段进行检测，同时由于探针不进行互补配对，因此不会影响探针之间的结合效率。，下面是一种用于检测乙肝病毒的双探针组合物及试剂盒专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种用于检测乙肝病毒的双探针组合物，其特征在于，包括正向引物、反向引物、第一探针和第二探针，所述第一探针和第二探针为两条错位双向探针，所述第一探针与反向模板相匹配，所述第二探针与正向模板相匹配。
2.根据权利要求1所述的用于检测乙肝病毒的引物组，其特征在于，所述正向引物具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列，所述反向引物具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，所述第一探针具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，所述第二探针具有SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的用于检测乙肝病毒的双探针组合物，其特征在于，还包括内标探针，所述内标探针具有SEQ ID NO.5所示核苷酸序列。
4.根据权利要求3所述的用于检测乙肝病毒的双探针组合物，其特征在于，所述第一探针、第二探针和内标探针三者的两端均分别标记有荧光基团和淬灭基团，所述第一探针和第二探针两者的荧光基团与内标探针的荧光基团不同。
5.根据权利要求3所述的用于检测乙肝病毒的双探针组合物，其特征在于，所述正向引物、反向引物、第一探针、第二探针和内标探针的至少之一的核苷酸序列中的一个或多个胸腺嘧啶碱基替换为尿嘧啶碱基。
6.根据权利要求3所述的用于检测乙肝病毒的双探针组合物，其特征在于，所述第一探针、第二探针和/或内标探针的5’端和/或3’端增加多个碱基使其形成二级结构。
7.包括权利要求4所述的用于检测乙肝病毒组合物的用于检测乙肝病毒的试剂盒，其特征在于，还包括PCR缓冲液、dNTPs、Taq酶、UNG酶和核酸提取试剂。
8.权利要求7所述用于检测乙肝病毒试剂盒，其特征在于：所述引物、探针、PCR缓冲液、dNTPs、Taq酶、UNG酶混合并加入无DNase和RNase纯化水成为PCR反应预混液，所述PCR反应预混液的配方如下：
PCR缓冲液10μL；
100mM dNTPs(ATCGU)0.27-1.35μL；
50μM正向引物0.25-1.5μL；
50μM反向引物0.25-1.5μL；
50μM第一探针0.05-0.8μL；
50μM第二探针0.05-0.8μL；
50μM内标探针0.05-0.8μL；
Taq酶0.5-1μL；
UNG酶0.02-0.15μL；
加入无DNase和RNase纯化水至终体积20μL。
9.权利要求7所述用于检测乙肝病毒试剂盒，其特征在于：所述核酸提取试剂包括细胞裂解液450μL、磁珠混合液40μL、第一洗涤液500μL、第二洗涤液500μL和洗脱液30-120μL；
所述细胞裂解液包括2.5M异硫氰酸胍、10％曲拉通X100和15％异丙醇；
所述磁珠混合液包括超顺纳米磁性粒子、蛋白酶K、62.5copy/μL内标质粒和50％甘油；
所述第一洗涤液包括1M异硫氰酸胍和50％无水乙醇；
所述第二洗涤液包括TRIS/氯化钠和50％无水乙醇；
所述洗脱液为无DNase和RNase去离子水。

说明书全文

一种用于检测乙肝病毒的双探针组合物及试剂盒

技术领域

[0001] 本发明涉及乙型肝炎病毒(HBV)的检测技术领域，尤其涉及一种用于检测乙肝病毒的双探针组合物及试剂盒。

背景技术

[0002] 乙型肝炎病毒(HBV)是一种严重危害全球人类健康的感染性病毒，病毒感染呈世界性流行，我国属于乙型肝炎感染地方性流行区。急性和慢性HBV感染易引发多器官损坏，可能导致肝硬化、肝癌、肝衰竭等疾病的发生。因此，在乙型肝炎的抗病毒治疗中对乙肝感染患者体内HBV载量准确定量检测显得非常重要。

[0003] 此外，乙型肝炎病毒基因组具有多基因型和高突变性，市场上HBV DNA检试剂一般针对HBV基因中遗传变异较小的S区基因进行检测，虽然该区域相对保守，但HBV基因组的高突变型和同基因型个别位点多态性等特点，在引物探针结合区域的碱基序列难以完全覆盖所有亚型间的保守区段，另外对于未发现基因亚型或突变多态性位点，往往容易出现漏检的情况。

[0004] 目前已有类似针对不同区段进行同时检测的报道，如凯杰生物工程(深圳)有限公司在专利“用于检测人乙型肝炎病毒的引物组和探针”中提出同时检测HBV S区和前核心区的报道；再有珠海丽珠试剂股份有限公司在专利“检测乙型肝炎病毒核酸的引物组、探针、试剂盒和检测方法”中提出使用三组引物探针同时检测HBV基因组的三个保守基因区域的报道。虽然两组引物探针和三组引物探针现对于单基因检测，能大大降低漏检的风险，同时能避免单个位点突变导致无法检出的假阴性的风险，但反应体系中同时存在两组或三组引物使扩增反应成为双重或三重PCR，由于不同的引物组具有较大差异的扩增效率、退火温度、引物组间竞争以及二聚体情况，所以对于试剂的灵敏度和准确度具有较大的影响。为此，仍然需要一种高度准确、灵敏度、特异性更好、突变包容性更好的HBV核酸定量检测组合物。

发明内容

[0005] 本发明的目的在于提出一种用于检测乙肝病毒的双探针组合物，具有灵敏度高的特点。

[0006] 本发明的另一目的在于提出一种用于检测乙肝病毒的试剂盒，具有灵敏度高的特点。

[0007] 为达此目的，本发明采用以下技术方案：

[0008] 一种用于检测乙肝病毒的双探针组合物，包括正向引物、反向引物、第一探针和第二探针，第一探针和第二探针为两条错位双向探针，第一探针与反向模板相匹配，第二探针与正向模板相匹配。

[0009] 进一步的，正向引物具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列，反向引物具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，第一探针具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，第二探针具有SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。

[0010] 进一步的，还包括内标探针，内标探针具有SEQ ID NO.5所示核苷酸序列。

[0011] 进一步的，第一探针、第二探针和内标探针三者的两端均分别标记有荧光基团和淬灭基团，第一探针和第二探针两者的荧光基团与内标探针的荧光基团不同。

[0012] 进一步的，正向引物、反向引物、第一探针、第二探针和内标探针的至少之一的核苷酸序列中的一个或多个胸腺嘧啶碱基替换为尿嘧啶碱基。

[0013] 进一步的，第一探针、第二探针和/或内标探针的5’端和/或3’端增加多个碱基使其形成二级结构。

[0014] 一种包括上述的用于检测乙肝病毒组合物的用于检测乙肝病毒的试剂盒，还包括PCR缓冲液、dNTPs、Taq酶、UNG酶和核酸提取试剂。

[0015] 进一步的，引物、探针、PCR缓冲液、dNTPs、Taq酶、UNG酶混合并加入无DNase和RNase纯化水成为PCR反应预混液，PCR反应预混液的配方如下：

[0016] PCR缓冲液10μL；

[0017] 100mM dNTPs(ATCGU)0.27-1.35μL；

[0018] 50μM正向引物0.25-1.5μL；

[0019] 50μM反向引物0.25-1.5μL；

[0020] 50μM第一探针0.05-0.8μL；

[0021] 50μM第二探针0.05-0.8μL；

[0022] 50μM内标探针0.05-0.8μL；

[0023] Taq酶0.5-1μL；

[0024] UNG酶0.02-0.15μL；

[0025] 加入无DNase和RNase纯化水至终体积20μL。

[0026] 进一步的，核酸提取试剂包括细胞裂解液450μL、磁珠混合液40μL、第一洗涤液500μL、第二洗涤液500μL和洗脱液30-120μL；

[0027] 细胞裂解液包括2.5M异硫氰酸胍、10％曲拉通X100和15％异丙醇；

[0028] 磁珠混合液包括超顺纳米磁性粒子、蛋白酶K、62.5copy/μL内标质粒和50％甘油；

[0029] 第一洗涤液包括1M异硫氰酸胍和50％无水乙醇；

[0030] 第二洗涤液包括TRIS/氯化钠和50％无水乙醇；

[0031] 洗脱液为无DNase和RNase去离子水。

[0032] 本发明的有益效果为：

[0033] 1、采用乙型肝炎病毒A-H共8个型别多个亚型生物信息学分析，在S区段保守区设定引物探针区段，能很好覆盖8个HBV型别和各个亚型。

[0034] 2、引物选取高CG区段，在提高序列TM值的同时能有效缩短序列长度(≤20bp)，减少引物自身折叠，使引物有效与模板搭配；同时由于引物序列碱基的减少，使试剂定量标准品与检测样本环境差异(干扰核酸，干扰蛋白等)的影响降到最低，引物在较宽的干扰环境下仍能保持稳定的模板结合效率进行扩增，有效提高试剂定量的准确度。

[0035] 3、探针采用两条错位双向探针，一条探针与反向模板匹配，另一条探针与正向模板匹配，使探针能同时覆盖两个区段序列，同时针对两个保守基因区段进行检测，避免未知突变导致探针无法匹配出现的假阴性，同时由于探针不进行互补配对，因此不会影响探针之间的结合效率,探针设计方面，选取高CG区段，由于探针长度(≤22bp)减少，减少探针自身折叠，使探针有效与模板搭配；同时探针长度缩短使淬灭基团更有效吸收荧光信号，有效降低整个反应体系的荧光本底噪音，提高试剂灵敏度和准确度。附图说明

[0036] 图1是本发明实施例1中定量浓度对数与理论浓度对数的线性范围和相关系数图；

[0037] 图2是本发明实施例2的各亚型各浓度扩增曲线图；

[0038] 图3是本发明实施例4中10000IU/mL浓度20复孔精密度图；

[0039] 图4是本发明实施例4中1000IU/mL浓度20复孔精密度图；

[0040] 图5是本发明实施例4中100IU/mL浓度20复孔精密度图；

[0041] 图6是本发明实施例5中15IU/mL其中10复孔扩增曲线图；

[0042] 图7是本发明实施例5中7.5IU/mL其中10复孔扩增曲线图；

[0043] 图8是本发明实施例5中3.5IU/mL其中10复孔扩增曲线图；

[0044] 图9是本发明实施例5中2IU/mL其中10复孔扩增曲线图。

具体实施方式

[0045] 下面结合附图及具体实施方式进一步说明本发明的技术方案。

[0046] 一种用于检测乙肝病毒的双探针组合物，其特征在于，包括正向引物、反向引物、第一探针和第二探针，第一探针和第二探针为两条错位双向探针，第一探针与正向模板相匹配，第二探针与反向模板相匹配。

[0047] 两条错位双向探针的设计能使探针能同时覆盖两个区段序列，同时针对两个保守基因区段进行检测，避免未知突变导致探针无法匹配出现的假阴性，同时由于探针不进行互补配对，因此不会影响探针之间的结合效率。

[0048] 进一步的，正向引物具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列，反向引物具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，第一探针具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，第二探针具有SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。

[0049] 进一步的，还包括内标探针，内标探针具有SEQ ID NO.5所示核苷酸序列。

[0050] 引物组、两条检测探针及内标探针的碱基序列如表1所示。

[0051] 表1

[0052]名称碱基序列(5’-3’) 长度
SEQ ID NO.1 TGTATTCCCATCCCATCATC 20
SEQ ID NO.2 ACAGTGGGGGAAAGCC 16
SEQ ID NO.3 CCTATGGGAGTGGGCCTCAG 20
SEQ ID NO.4 TGGCACTAGTAAACTGAGCCA 21
SEQ ID NO.5 CGTCAGACCACTCCTACACG 20

[0053] 第一探针、第二探针和内标探针三者的两端均分别标记有荧光基团和淬灭基团，第一探针和第二探针两者的荧光基团与内标探针的荧光基团不同。

[0054] 荧光基团可以但不限于是FAM、ROX、CY5、HEX、JOE、CY3、NED、TAMRA、TAXAS、RED、VIC、TET中的任一种；淬灭基团可以但不限于是BHQ、TAMRA、MGB、DABCYL中的任一种。

[0055] 正向引物、反向引物、第一探针、第二探针和内标探针可以进行修饰，包括甲基化、通过天然核苷类似物取代一个或多个天然核苷酸和核苷酸间的修饰、在核苷酸序列中或两端添加一个或多个核苷酸残基、基团或将序列中的一个或多个核苷酸残基替换成另外的核苷酸残基等。

[0056] 具体的，正向引物、反向引物、第一探针、第二探针和内标探针的至少之一是经甲基化修饰的。正向引物、反向引物、第一探针、第二探针和内标探针的至少之一的核苷酸序列中的一个或多个胸腺嘧啶碱基替换为尿嘧啶碱基。特别地，对第一探针、第二探针和内标探针的修饰还可以是在5’端和/或3’端增加几个碱基使其形成某种二级结构，如分子信标的颈-环结构，但不限于此。

[0057] 一种包括上述的用于检测乙肝病毒组合物的用于检测乙肝病毒的试剂盒，还包括PCR缓冲液、dNTPs、Taq酶、UNG酶和核酸提取试剂。

[0058] 本发明的试剂盒为适应较短引物探针序列以及减少反应体系内部组分由于纯度等原因引起的干扰情况，使用最简单体系配方不添加任何添加物质。

[0059] 进一步的，引物、探针、PCR缓冲液、dNTPs、Taq酶、UNG酶混合并加入无DNase和RNase纯化水成为PCR反应预混液，PCR反应预混液的配方如下：

[0060] PCR缓冲液10μL；

[0061] 100mM dNTPs(ATCGU)0.27-1.35μL；

[0062] 50μM正向引物0.25-1.5μL；

[0063] 50μM反向引物0.25-1.5μL；

[0064] 50μM第一探针0.05-0.8μL；

[0065] 50μM第二探针0.05-0.8μL；

[0066] 50μM内标探针0.05-0.8μL；

[0067] Taq酶0.5-1μL；

[0068] UNG酶0.02-0.15μL；

[0069] 加入无DNase和RNase纯化水至终体积20μL。

[0070] 该PCR反应预混液采用最简单的体系配方，适应较短引物探针序列以及减少反应体系内部组分由于纯度等原因引起的干扰情况，保证定量的准确性。

[0071] 进一步的，核酸提取试剂包括细胞裂解液450μL、磁珠混合液40μL、第一洗涤液500μL、第二洗涤液500μL和洗脱液30-120μL；

[0072] 细胞裂解液包括2.5M异硫氰酸胍、10％曲拉通X100和15％异丙醇；

[0073] 磁珠混合液包括超顺纳米磁性粒子、蛋白酶K、62.5copy/μL内标质粒和50％甘油；

[0074] 第一洗涤液包括1M异硫氰酸胍和50％无水乙醇；

[0075] 第二洗涤液包括TRIS/氯化钠和50％无水乙醇；

[0076] 洗脱液为无DNase和RNase去离子水。

[0077] 采用上述核酸提取试剂进行核酸提取纯化的生物样本包括来自人体的组织匀浆、细胞、全血、血清、血浆、拭子浸泡液等。

[0078] 使用磁珠和蛋白酶K混合液作为试剂盒内标质粒的稀释和保存，在磁珠和蛋白酶K混合液中，由于蛋白酶K能对蛋白质类酶系进行有效的分解消化，因此内标质粒能有效避免DNA酶的降解，提高内标质粒浓度的准确性和保存的稳定性。

[0079] 实施例1-5中，试剂准备及临床样品核酸提取方法如下。

[0080] 一、试剂准备如下：

[0081] 1、WHO HBV核酸分型盘

[0082] WHO HBV核酸分型盘(WHO International Reference Panel for Hepatitis B Virus Genotypes for Nucleic Acid Amplification Techniques-Based Assays PEI,批号：5086/08)进行制备。分型盆含A-G共7个型别，15瓶(A型3瓶、B型3瓶、C型3瓶、D型3瓶、E型1瓶、F型1瓶、G型1瓶)分别用0.5mL纯化水复溶，浓度参照分型盘说明书。然后用阴性且外观澄清的血清稀释至合适的浓度。

[0083] 2、国家定量标准品(National Reference Standard forHBV DNA批号：300022-201601)。国家定量标准品浓度为1.0×108IU/mL。然后用阴性且外观澄清的血清稀释至合适的浓度。

[0084] 3、阴性质控品：阴性且外观澄清的血清。

[0085] 4、临界阳性质控品和强阳性质控品。使用阴性且外观澄清的血清对HBV全基因组质粒进行稀释，使用可溯源至国家定量标准品的标准品进行赋值。

[0086] 5、定量标准品A-D：使用阴性且外观澄清的血清对HBV全基因组质粒进行稀释，使其浓度在107-102之间使用可溯源至国家定量标准品的标准品进行赋值。

[0087] 二、临床样品核酸提取方法。

[0088] 核酸提取步骤包括(1)-(4)，具体如下：

[0089] (1)在1.5mL离心管中加入450μL细胞裂解液、40μL磁珠混合液250μL样本，混匀2分钟后室温静置10分钟。进行短暂离心，吸附磁珠，弃除所有溶液。

[0090] (2)加入500μL第一洗涤液，混匀2分钟后室温静置2分钟。进行短暂离心，吸附磁珠，弃除所有溶液。

[0091] (3)加入500μL第二洗涤液，混匀2分钟后室温静置2分钟。今次那个短暂离心，吸附磁珠，弃除所有溶液。

[0092] (4)室温晾干磁珠10分钟后加入80μL洗脱液，混匀2分钟后室温静置5分钟。进行短暂离心，吸附磁珠，收集纯化好的DNA溶液。

[0093] 实施例1

[0094] 配制荧光定量PCR反应液

[0095] PCR反应液：表2

[0096]名称 1测试
PCR反应预混液 20μL
HBV DNA 30μL

[0097] PCR反应预混液配方：表3

[0098]组分名称浓度单反应用量范围
PCR缓冲液 5× 10μL
dNTPs(ATCGU) 100mM 0.72μL
正向引物 50μM 1μL
反向引物 50μM 1μL
第一探针 50μM 0.05μL
第二探针 50μM 0.05μL
内标探针 50μM 0.05μL
Taq酶 5U/μL 0.79μL
UNG酶 1U/μL 0.01μL
无DNase和RNase纯化水 / 加至终体积20μL
HBV DNA / 30μL
total / 50μL

[0099] 表3中正向引物具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列，反向引物具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，第一探针具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，第二探针具有SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列，内标探针具有SEQ ID NO.5所示核苷酸序列。第一探针、第二探针和内标探针三者的两端均分别标记有荧光基团和淬灭基团，第一探针和第二探针两者的荧光基团与内标探针的荧光基团不同。

[0100] PCR反应条件如表4所示。

[0101] 表4

[0102]

[0103] 试剂盒线性准确度实验

[0104] 使用阴性血清将高值临床样本(经由罗氏公司的COBAS AmpliPrep COBAS TaqMan HBV Test，Version2.0试剂盒进行定量)稀释至240600000IU/mL、20000000IU/mL、2000000IU/mL、200000IU/mL、20000IU/mL、2000IU/mL、200IU/mL、180IU/mL、90IU/mL、45IU/mL、15IU/mL、7.5IU/mL，每个浓度做3个重复，通过一下标准判断结果的准确度：样本定量浓度绝对偏差不超过±0.3log，浓度对数CV％不超过10％，理论浓度对数与实测浓度对数线性相关系数R2≥0.99。

[0105] 表5

[0106]

[0107]

[0108] 表5中：B＝︱M-T︱；B：绝对偏差；M：实测浓度对数；T：理论浓度对数。结果如表5和图1所示，线性范围内7.5至2.4×108IU/mL浓度对数绝对偏差均不超过±0.5log，理论浓度对
2
数与实测浓度对数线性相关系数R ≥0.99。图1是定量浓度对数与理论浓度对数的线性范围和相关系数图，从图1上看定量浓度对数与理论浓度对数有良好的线性关系，R2＝0.996。
由此可知，采用本实施例的试剂盒进行样本检测灵敏度高。

[0109] 实施例2试剂盒的亚型分析能力

[0110] 使用实施例1中的方法荧光定量PCR检测使用阴性血清将分型盘中15个样本稀释至500IU/mL做1个重复、15IU/mL做2重复。

[0111] 表6

[0112]

[0113]

[0114] 结果如表6所示，15种不同型别和亚型均能检出，且15IU/mL浓度均在准确度范围内±0.5lg。图2为各亚型各浓度扩增曲线图，可以卡出，各亚型都有良好的扩增速度。

[0115] 实施例3错配质粒验证检出率

[0116] 用实施例1中的方法荧光定量PCR检测使用阴性血清稀释三种重组质粒稀释至5.6×105copy/μL、56copy/μL、0.56copy/μL，每个浓度做25个重复。

[0117] 三种重组质粒序列如表7所示。

[0118]

[0119] 表8

[0120]

[0121]

[0122] 结果如表8所示，第一探针和第二探针结合位点分别发生突变，不影响试剂检出，最低浓度0.56copy/μL质粒检出率100％。

[0123] 实施例4试剂盒精密度实验

[0124] 使用实施例1中的方法荧光定量PCR检测使用阴性血清将HBV DNA国家定量标准品稀释至10000IU/mL、1000IU/mL、100IU/mL，每个浓度做20个重复，计算每个浓度样本的定量检出结果对数值的平均值，并计算每个浓度样本的精密度。通过以下标准判断结果的准确度：同一浓度样本检测结果对数值的变异系数(CV)不高于5％。

[0125] 表9

[0126]

[0127] 表9中， C.V：变异系数；SD：标准偏差；实测浓度对数的平均数。结果如表9所示，三个浓度的样本变异系数(CV)均小于5％，说明体系具有较好的检测精密度。图3-5分别是10000IU/mL、1000IU/mL、100IU/mL浓度20复孔精密度。

[0128] 实施例5试剂盒的最低检出限

[0129] 使用实施例1中的方法荧光定量PCR检测使用阴性血清将HBV DNA国家定量标准品稀释至15IU/mL、7.5IU/mL、3.5IU/mL、2IU/mL，每个浓度做24个重复，计算各浓度下的检出率，从而确定最低检出限。

[0130] 表10

[0131]

[0132] 结果如表10所示，显示7.5IU/mL样本的检出率达到95.83％，说明试剂的最低检出限为7.5IU/mL。图6-9是分别是15IU/mL、7.5IU/mL、3.5IU/mL、2IU/mL浓度模板复孔扩增曲线图，可知各浓度模板有较好的扩增速度，多次复孔有很好的稳定性。

[0133] 实施例6

[0134] 一种用于检测乙肝病毒的双探针组合物，包括正向引物、反向引物、第一探针、第二探针和内标探针，第一探针和第二探针为两条错位双向探针，第一探针与正向模板相匹配，第二探针与反向模板相匹配。

[0135] 正向引物具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列，反向引物具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，第一探针具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，第二探针具有SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。内标探针具有SEQ ID NO.5所示核苷酸序列。

[0136] 第一探针、第二探针和内标探针三者的两端均分别标记有荧光基团和淬灭基团，第一探针和第二探针两者的荧光基团与内标探针的荧光基团不同。

[0137] 本实施例还提供了一种包括上述的用于检测乙肝病毒组合物的用于检测乙肝病毒的试剂盒，还包括PCR缓冲液、dNTPs、Taq酶、UNG酶和核酸提取试剂。

[0138] 引物、探针、PCR缓冲液、dNTPs、Taq酶、UNG酶混合并加入无DNase和RNase纯化水成为PCR反应预混液，PCR反应预混液的配方如下：

[0139]组分名称浓度单反应用量范围
PCR缓冲液 5× 10μL
dNTPs(ATCGU) 100mM 0.27μL
正向引物 50μM 0.25μL
反向引物 50μM 0.25μL
靶点探针1 50μM 0.05μL
靶点探针2 50μM 0.05μL
内标探针 50μM 0.05μL
Taq酶 5U/μL 0.5μL
UNG酶 1U/μL 0.02μL
无DNase和RNase纯化水 / 加至终体积20μL

[0140] 核酸提取试剂包括细胞裂解液450μL、磁珠混合液40μL、第一洗涤液500μL、第二洗涤液500μL和洗脱液30-120μL；细胞裂解液包括2.5M异硫氰酸胍、10％曲拉通X100和15％异丙醇；磁珠混合液包括超顺纳米磁性粒子、蛋白酶K、62.5copy/μL内标质粒和50％甘油；第一洗涤液包括1M异硫氰酸胍和50％无水乙醇；第二洗涤液包括TRIS/氯化钠和50％无水乙醇；洗脱液为无DNase和RNase去离子水。

[0141] 实施例7

[0142] 本实施例与实施例6基本相同，不同之处在于，PCR反应预混液的配方如下：

[0143]组分名称浓度单反应用量范围
PCR缓冲液 5× 10μL
dNTPs(ATCGU) 100mM 0.85μL
正向引物 50μM 0.8μL
反向引物 50μM 0.8μL
靶点探针1 50μM 0.4μL
靶点探针2 50μM 0.4μL
内标探针 50μM 0.4μL
Taq酶 5U/μL 0.8μL
UNG酶 1U/μL 0.1μL
无DNase和RNase纯化水 / 加至终体积20μL

[0144] 实施例8

[0145] 本实施例与实施例6基本相同，不同之处在于，PCR反应预混液的配方如下：

[0146]组分名称浓度单反应用量范围
PCR缓冲液 5× 10μL
dNTPs(ATCGU) 100mM 1.35μL
正向引物 50μM 1.5μL
反向引物 50μM 1.5μL
靶点探针1 50μM 0.8μL
靶点探针2 50μM 0.8μL
内标探针 50μM 0.8μL
Taq酶 5U/μL 1μL
UNG酶 1U/μL 0.15μL
无DNase和RNase纯化水 / 加至终体积20μL

[0147] 实施例6-8的用于检测乙肝病毒的双探针组合物及试剂盒，能很好覆盖8个HBV型别和各个亚型；具有较高的定量准确度；具有较高的灵敏度。实施例6-8的用于检测乙肝病毒的双探针组合物及试剂盒有很好的亚型分析能力，15种不同型别和亚型均能检出；有良好的错配质粒验证检出率，第一探针和第二探针结合位点分别发生突变，不影响试剂检出；具有较好的检测精密度。

[0148] 以上结合具体实施例描述了本发明的技术原理。这些描述只是为了解释本发明的原理，而不能以任何方式解释为对本发明保护范围的限制。基于此处的解释，本领域的技术人员不需要付出创造性的劳动即可联想到本发明的其它具体实施方式，这些方式都将落入本发明的保护范围之内。

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一种用于检测乙肝病毒的双探针组合物及试剂盒

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