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基于流通顺 磁性颗粒的细胞分离和顺磁性颗粒移除

阅读：66发布：2020-05-11

专利汇可以提供基于流通顺磁性颗粒的细胞分离和顺磁性颗粒移除专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本公开涉及用于在包括结合的和非结合的细胞的细胞悬浮液中流通分离顺磁性颗粒结合的细胞的系统和方法，以及用于从顺磁性颗粒结合的细胞或从具有非结合的细胞的细胞悬浮液中移除顺磁性颗粒的方法和系统。其还涉及流通磁性分离/去珠化模块以及流通旋转膜去珠化模块。，下面是基于流通顺磁性颗粒的细胞分离和顺磁性颗粒移除专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种细胞处理系统，其包括：
至少一个细胞悬浮液模块；
至少一个缓冲液模块；
至少一个流通磁性分离/去珠化模块；
至少一个非磁性输出模块；以及
至少一个磁性输出模块。
2.如权利要求1所述的细胞处理系统，还包括至少一个返回回路，其返回至少一个流通磁性分离/去珠化模块的上游。
3.如权利要求1所述的细胞处理系统，其包括至少两个平行的流通磁性分离/去珠化模块。
4.如权利要求1所述的细胞处理系统，其包括至少两个串联的流通磁性分离/去珠化模块。
5.如权利要求1所述的细胞处理系统，其还包括至少一个其他模块。
6.如权利要求5所述的细胞处理系统，其中，所述至少一个其他模块包括至少一个旋转膜去珠化模块。
7.如权利要求6所述的细胞处理系统，其包括至少两个平行的旋转膜去珠化模块。
8.如权利要求6所述的细胞处理系统，其包括至少两个串联的旋转膜去珠化模块。
9.如权利要求5所述的细胞处理系统，其中，所述至少一个其他模块包括至少一个物理分离模块。
10.如权利要求9所述的细胞处理系统，其中，所述至少一个其他模块包括至少一个磁性柱模块。
11.如权利要求5所述的细胞处理系统，其中，所述至少一个其他模块包括至少一个介质交换模块。
12.如权利要求5所述的细胞处理系统，其中，所述至少一个其他模块包括至少一个细胞浓缩模块。
13.如权利要求5所述的细胞处理系统，其中，所述至少一个其他模块包括至少一个细胞洗涤模块。
14.如权利要求1所述的细胞处理系统，其中，所述流通磁性分离/去珠化模块包括：
由壁限定并且具有x方向、y方向和z方向的腔室；
以y方向布置在所述腔室的相对端的入口和出口；以及
邻近或靠近所述腔室壁的至少两个磁体，并将其布置成在所述入口和所述出口之间于所述腔室内形成零梯度线。
15.如权利要求6所述的细胞处理系统，其中，所述旋转膜去珠化模块包括：
由圆柱形侧壁部分限定的去珠化腔室；
具有内部并与所述圆柱形侧壁同轴定向的多孔旋转膜；
样品入口；
连接所述旋转膜内部的废料输出模块；以及
连接所述去珠化腔室的细胞输出模块。
16.如权利要求15所述的细胞处理系统，其中所述旋转膜去珠化模块还包括邻近或靠近所述圆柱形侧壁的至少一个磁体。
17.一种流通磁性分离/去珠化模块，其包括：
由壁限定并且具有x方向、y方向和z方向的腔室；
以y方向布置在所述腔室的相对端的入口和出口；以及
邻近或靠近所述腔室壁的至少两个磁体，并将其布置成在所述入口和所述出口之间于所述腔室内形成零梯度线。
18.如权利要求17所述模块，其包括至少两个入口和至少两个出口。
19.如权利要求17所述的模块，其还包括邻近或靠近所述腔室壁的至少三个磁体，并将其布置成在所述入口和所述出口之间于所述腔室内形成至少两条零梯度线。
20.如权利要求17所述的模块，其还包括至少四个磁体，布置为所述腔室z方向相对侧上的两个阵列。
21.如权利要求18所述的模块，其还包括至少四个磁体，所述至少四个磁体布置为所述腔室z方向相对侧上的两个阵列，并且交叉定位为在x-y平面上从接近入口之一至腔室z方向相对侧上接近出口之一。
22.如权利要求17所述的方法，其还包括：
邻近所述腔室壁并邻近至少两个磁体的亚膜注射端口；和
邻近所述亚膜的膜。
23.一种旋转膜去珠化模块，其包括：
由圆柱形侧壁部分限定的去珠化腔室；
具有内部并与所述圆柱形侧壁同轴定向的多孔旋转膜；
样品入口；
与所述旋转膜的内部连接的废料输出模块；
连接所述去珠化腔室的细胞输出模块；以及
邻近或靠近所述圆柱形侧壁的至少一个磁体。
24.如权利要求23所述的旋转膜去珠化模块，其还包括试剂模块。
25.如权利要求23所述的旋转膜去珠化模块，其中所述多孔旋转膜的孔尺寸大于待去珠化颗粒的尺寸且小于待去珠化细胞的尺寸。
26.一种流通细胞处理的方法，其包括将包括顺磁性颗粒结合的细胞的细胞悬浮液流过流通磁性分离/去珠化模块，以产生非结合的细胞产物，
其中，所述顺磁性颗粒结合的细胞通过所述流过步骤在流通磁性分离/去珠化模块中继续移动，并且
其中，所述流通磁性分离/去珠化模块包括：
由壁限定的流动腔室，所述细胞悬浮液从其中流过；以及
邻近或靠近至少一个壁布置的至少两个磁体。
27.如权利要求26所述的方法，其中，所述细胞悬浮液以层状流过所述流通磁性分离/去珠化模块。
28.如权利要求26所述的方法，其中所述细胞悬浮液还包括非结合的细胞，并且将所述细胞悬浮液流过所述流通磁性分离/去珠化模块使所述顺磁颗粒结合的细胞和所述非结合的细胞分离。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述细胞悬浮液还包括游离的顺磁性颗粒，并且将所述细胞悬浮液流过所述流通磁性分离/去珠化模块使所述游离的顺磁颗粒和所述非结合的细胞分离。
30.如权利要求28所述的方法，其还包括使用返回回路使分离的非结合的细胞第二次或续次流过所述流通磁性分离/去珠化模块。
31.如权利要求28所述的方法，其还包括使用返回回路使分离的顺磁性颗粒结合的细胞第二次或续次流过所述流通磁性分离/去珠化模块。
32.如权利要求31所述的方法，其还包括在所述第二次或续次期间将所述顺磁性颗粒结合的细胞在所述流通磁性分离/去珠化模块中去珠化，以产生顺磁性颗粒以及去珠的、非结合的细胞。
33.如权利要求32所述的方法，其还包括将产生的顺磁性颗粒以及去珠的、非结合的细胞第三次或续次流过所述流通磁性分离/去珠化模块，以分离所述顺磁性颗粒和所述去珠的、非结合的细胞。
34.如权利要求26所述的方法，其中，将所述磁体定向以形成与流动方向交叉的一条零梯度线，使得顺磁性颗粒结合的细胞仅在一个方向上被拉至该零梯度线，但不受另两个不同方向的所述两个磁体的磁场的影响。
35.如权利要求26所述的方法，其中，所述腔室还包括：
磁性入口，任何顺磁性颗粒通过其进入所述流动腔室；
非磁性入口；
与所述非磁性入口相对的磁性出口；以及
与所述磁性入口相对的非磁性出口，其中所述零梯度线将所有顺磁性颗粒和任何结合的细胞引导至所述磁性出口。
36.如权利要求35所述的方法，其中，所述细胞悬浮液还包括非结合的细胞，并且其中非磁性入口比所述磁性入口大，并且所述非磁性出口比磁性出口大，其中从所述非磁性入口流入的流体穿行至所述非磁性出口，防止任何非结合的细胞流入所述磁性出口。
37.如权利要求35所述的方法，其中所述细胞悬浮液还包括非结合的细胞，其中所述非磁性入口和磁性入口的尺寸基本相同或所述非磁性出口与所述磁性出口的尺寸基本相同，或者两者皆是，并且其中调节各所述流体进入所述入口的各自流速、各所述流体离开所述出口的各自流速、或两者，从而使得从所述非磁性入口流入的流体穿行至所述非磁性出口，防止任何非结合的细胞流入所述磁性出口。
38.如权利要求26所述的方法，其还包括将所述顺磁性颗粒结合的细胞流过旋转膜去珠化模块，以产生非结合的细胞产物，其中所述旋转膜去珠化模块包括：
圆柱形去珠化腔室，所述顺磁性颗粒结合的细胞从其中流过，所述腔室由圆柱形侧壁部分限定，并且包括同轴的旋转膜；和
布置在邻近或靠近所述圆柱形侧壁的至少一个磁体，以在所述圆柱形去珠化腔室内形成至少一条零梯度线。
39.如权利要求26所述的方法，其还包括将所述顺磁性颗粒结合的细胞流过磁性柱模块，以产生所述非结合的细胞产物。
40.如权利要求26所述的方法，其还包括将所述顺磁性颗粒结合的细胞或所述非结合的细胞产物流过细胞洗涤模块。
41.如权利要求26所述的方法，其还包括将所述顺磁性颗粒结合的细胞或所述非结合的细胞产物流过介质交换模块。
42.如权利要求26所述的方法，其还包括将所述顺磁性颗粒结合的细胞或所述非结合的细胞产物流过细胞浓缩模块。
43.一种制造细胞治疗组合物的方法，所述方法包括：
将细胞群与用一种或多种试剂包覆的顺磁性磁性颗粒接触，所述试剂有助于在所述细胞群内扩增一种或多种细胞类型；
将核酸引入所述细胞群内的细胞；
扩增所述细胞群内的细胞；
根据权利要求26-42中任一项所述的方法，或使用权利要求1-16中任一项所述的系统或权利要求17-25中任一项所述的模块将所述细胞群去珠化；并且
配制用于细胞治疗的所述细胞群。
44.如权利要求43所述的方法，其中所述有助于扩增一种或多种细胞类型的一种或多种试剂包括抗-CD3抗体或其抗原结合片段，抗-CD28抗体或抗原结合片段，以及其组合。
45.如权利要求43-44中任一项所述的方法，其中，所述核酸通过慢病毒或mRNA转导引入。
46.如权利要求43-45中任一项所述的方法，其中，所述细胞治疗是嵌合抗原受体T细胞治疗。
47.如权利要求46所述的方法，其中，所述细胞治疗是抗-CD19的嵌合抗原受体T细胞治疗。

说明书全文

基于流通顺磁性颗粒的细胞分离和顺磁性颗粒移除

技术领域

[0001] 本公开涉及用于在包括结合的和非结合的细胞的细胞悬浮液中流通(flow-through)分离顺磁性颗粒结合的细胞的系统和方法，以及用于从顺磁性颗粒结合的细胞或从具有非结合的细胞的细胞悬浮液中移除顺磁性颗粒的方法和系统。

背景技术

[0002] 颗粒可能由于许多原因存在于细胞的外部环境中。例如，颗粒常常被生长诱导剂包覆，其导致混合细胞或单细胞培养物中应答细胞生长和分裂。颗粒也经常被附着特定类型的细胞的结合剂包覆，这使其在相同的混合细胞悬浮液中与其他类型的细胞分离。这种基于细胞类型的分离允许所需细胞与不需要的细胞分离。

[0003] 尽管颗粒对其预期的功能是有用的，但是细胞产物中存在颗粒后续可能是有害的。例如，颗粒本身可能对接受该细胞产物进行细胞治疗的患者构成危害。在其他情况中，这些颗粒可能会妨碍细胞的进一步生长和分裂，或者可能需要将它们移除，以使生长和分裂减慢或允许细胞分化。

[0004] 可以多种方式将各种类型的颗粒从细胞产物中去除，但是通常使用顺磁性颗粒，因为其对磁体的吸引使其既能够从非结合的细胞分离顺磁性颗粒结合的细胞，也能够从顺磁性颗粒结合的细胞移除顺磁性颗粒。

[0005] 目前使用顺磁性颗粒进行细胞分离的系统和方法将包含顺磁性颗粒结合的细胞的细胞悬液以悬浮液流体置于腔室中，然后将磁体放置在腔室壁附近。游离的顺磁性颗粒以及那些结合细胞的颗粒被磁体吸引，并且因此被保留在邻近磁体的腔室内壁的位置。含有任何非结合的细胞的剩余悬浮液流被除去。然后将磁体从腔室壁移开，释放顺磁性颗粒和任何顺磁性颗粒结合的细胞。

[0006] 这样的系统和方法可以用于顺磁性颗粒结合的细胞的正向或负向选择，但是其在任何一种情况中都有许多缺点。一个缺点是顺磁性颗粒和顺磁结合的细胞可能经由非结合的细胞输出部分进入非结合的细胞产物，因为腔室壁上没有足够的表面积来容纳它们，因为其他细胞阻碍它们到达腔室壁，因为它们是细胞团的一部分，而细胞团太大以至于不能保持磁性附着于腔室壁，或出于其他原因。如果在临床上使用非结合的细胞，这种污染是对健康有害的。如果非结合的细胞是废料，那么所需的细胞就会丢失。

[0007] 另一个缺点是非结合的细胞可能被困于顺磁性颗粒结合的细胞层中，从而再次导致细胞处于错误的细胞输出部分，而这可能导致浪费或不希望的污染。

[0008] 将细胞在腔室壁上成层还存在另一个缺点，这种分层可能导致细胞结块，干扰后续处理或应用，或者它们对于营养物质的获取。成层甚至可能导致一些细胞被压碎，其破坏所需细胞或将细胞裂解污染物引入细胞悬浮液。

[0009] 类似的系统和方法在被称为去珠化(debeading)的过程中被用于从细胞去除顺磁性颗粒。在去珠化中，细胞悬液被置于腔室之中，并将磁体接近腔室壁放置，以吸引顺磁性颗粒。

[0010] 这样的系统和方法也有许多缺点，包括可能在非结合的细胞部分和最终非结合的细胞产物中包含具有顺磁性颗粒的细胞，而这通常仅仅是因为它们不被吸引到壁上。例如，因为磁场与磁铁距离的平方成反比，所以当将其远离腔室壁时，磁场快速下降。如果使用的腔室过大或磁体太弱，顺磁性颗粒结合的细胞最终在非结合的细胞产物中的可能性更高。

[0011] 因此需要既能够分离或使得顺磁性颗粒结合的细胞去珠化，还能够处理这些缺点中的一个或多个的方法和系统。

[0012] 发明概述

[0013] 在一方面，本公开提供了一种细胞处理系统，其包括：至少一个细胞悬浮液模块；至少一个缓冲液模块；至少一个流通磁性分离/去珠化模块；至少一个非磁性输出模块；以及至少一个磁性输出模块。

[0014] 在该系统的一些变形中，其还包括返回至少一个流通磁性分离/去珠化模块的上游的至少一个返回回路；至少两个平行的流通磁性分离/去珠化模块；至少两个串联的流通磁性分离/去珠化模块；至少一个其他模块，或其任意组合。所述至少一个其他模块可包括至少一个旋转膜(spinning membrane)去珠化模块；至少两个平行的旋转膜去珠化模块；或至少两个串联的旋转膜去珠化模块。任旋转膜去珠化模块可以包括邻近或靠近圆柱形侧壁的至少一个磁体。

[0015] 在一个更具体的变形中，流通磁性分离/去珠化模块包括由壁限定并且具有x方向、y方向和z方向的腔室；以y方向布置在所述腔室的相对端的入口和出口；以及邻近或靠近所述腔室壁的至少两个磁体，并将其设置成在所述入口和所述出口之间于所述腔室内形成零梯度线。

[0016] 在可以单独存在或与第一个更具体的变形相联合的另一个更具体的变形中，旋转膜去珠化模块包括，由圆柱形侧壁部分限定的去珠化腔室；具有内部并与圆柱形侧壁同轴定向的多孔旋转膜；样品入口；连接旋转膜内部的废料输出模块；以及连接去珠化腔室的细胞输出模块。

[0017] 在另一方面，本公开提供了流通磁性分离/去珠化模块，其包括由壁限定并且具有x方向、y方向和z方向的腔室；以y方向布置在所述腔室的相对端的入口和出口；以及邻近或靠近所述腔室壁的至少两个磁体，并将其布置成在所述入口和所述出口之间于所述腔室内形成零梯度线。

[0018] 该模块的一些变形中，其包括至少两个入口和至少两个出口；

[0019] 邻近或靠近所述腔室壁的至少三个磁体，并将其布置成在入口和出口之间于腔室内形成至少两条零梯度线；以两个阵列以z方向布置在腔室的相对侧的至少四个磁体；至少四个磁体布置为所述腔室z方向相对侧上的两个阵列，并且交叉定位为在x-y平面上从接近入口之一至腔室z方向对侧上接近出口之一；邻近腔室壁也邻近至少两个磁体的亚膜(sub-membrane)注射端口，以及邻近亚膜的膜；或其任意组合。

[0020] 在另一方面，本公开提供了旋转膜去珠化模块，其包括：由圆柱形侧壁部分限定的去珠化腔室；具有内部并与圆柱形侧壁同轴定向的多孔旋转膜；样品入口；与旋转膜内部连接的废料输出模块；连接去珠化腔室的细胞输出模块；以及邻近或靠近圆柱形侧壁的至少一个磁体。

[0021] 在该模块的一些变形中，其可以包括这样孔尺寸的试剂模块，所述孔尺寸大于待去珠化的颗粒并且小于待去珠化的细胞，或二者。

[0022] 在又一方面中，本公开提供了一种流通细胞处理的方法，其将包括顺磁性颗粒结合的细胞的细胞悬浮液流过流通磁性分离/去珠化模块，以产生非结合的细胞产物顺磁性颗粒结合的细胞通过流动步骤在流通磁性分离/去珠化模块中继续移动。流通磁性分离/去珠化模块包括由壁限定的流动腔室，细胞悬浮液从其中流过，以及在邻近或靠近至少一个壁处布置的至少两个磁体。

[0023] 在该方法的一些变形中，细胞悬浮液以层状(laminarly)流过所述流通磁性分离/去珠化模块；细胞悬浮液还包括非结合的细胞，并且将细胞悬浮液流过流通磁性分离/去珠化模块分离所述顺磁性颗粒结合的细胞和非结合的细胞；细胞悬浮液还包括游离的顺磁性颗粒，并且将细胞悬浮液流过流通磁性分析/去珠化模块分离游离的顺磁性颗粒和非结合的细胞，或其任意组合。

[0024] 该方法还可以包括使用返回回路(return loop)使分离的非结合的细胞第二次或续次流过流通磁性分离/去珠化模块；使用返回回路使分离的磁性颗粒结合的细胞第二次或续次流过流通磁性分离/去珠化模块；在所述第二次或续次期间将顺磁性颗粒结合的细胞在流通磁性分离/去珠化模块中去珠化，以产生顺磁性颗粒以及去珠的、非结合的细胞；将产生的顺磁性颗粒以及去珠的、非结合的细胞第三次或续次流过流通磁性分离/去珠化模块，以分离顺磁性颗粒和去珠的、非结合的细胞，或其任意组合。

[0025] 在可与所有其它变形相联合的另一变形中，将磁体定向以形成与流动方向交叉的一条零梯度线，使得顺磁性颗粒结合的细胞仅在一个方向上被拉至零梯度线，但不受以两个不同方向来自磁体的磁场的影响。

[0026] 在可与所有其它变形相联合的另一变形中，腔室还包括：磁性入口，任何顺磁性颗粒从其进入流动腔室；非磁性入口；与非磁性入口相对的磁性出口；以及与磁性入口相对的非磁性出口，其中零梯度线将所有顺磁性颗粒和任何顺磁性颗粒结合的细胞引导至所述磁性出口。

[0027] 细胞悬浮液还包括结合的细胞，并且非磁性入口可以比磁性入口大，而非磁性入口比磁性出口大，因此从非磁性入口流入的流体穿行至非磁性出口，防止任何非结合的细胞流入磁性出口。

[0028] 或者，细胞悬浮液还包括非结合的细胞，并且非磁性入口和磁性入口可以是基本上相同的尺寸，或者非磁性出口和磁性出口可以是基本上相同的尺寸，或者两者均有，并且可以调节各流体进入入口的各自流速，各流体离开出口的各自流速，或两者，从而使得从非磁性入口流入的流体穿行至非磁性出口，防止任何非结合的细胞流入非磁性出口。

[0029] 在可与所有其它变形相联合的另一变形中，方法可以包括将顺磁性颗粒结合的细胞流过旋转膜去珠化模块，以产生非结合的细胞产物。旋转膜去珠化模块可以包括顺磁性颗粒结合的细胞从其中流过的圆柱形去珠化腔室，该腔室部分由圆柱形侧并限定，并且包括同轴的旋转膜；以及布置在邻近或靠近圆柱形侧壁的至少一个磁体，以在圆柱形去珠化腔室内形成至少一条零梯度线。

[0030] 在另一方面，本公开提供了制造细胞治疗组合物的方法，其通过将细胞群与用一种或多种试剂包覆的顺磁性磁性颗粒接触，所述试剂有助于在细胞群内扩增一种或多种细胞类型；将核酸引入细胞群内的细胞中；根据上述任一种系统或方法，或本文所述的任何其它系统或方法将细胞群去珠化；并且配制用于细胞治疗的细胞群。

[0031] 在一些变形中，有助于扩增一种或多种细胞类型的一种或多种试剂包括抗-CD3抗体或其抗原结合片段，抗-CD28抗体或抗原结合片段，以及其组合；核酸可以通过慢病毒或mRNA转导引入；细胞治疗可以是嵌合抗原受体T细胞治疗；细胞治疗是抗-CD19嵌合抗原受体T细胞治疗；或其任意组合。

[0032] 附图的简要说明

[0033] 可通过参考以下说明结合附图获得对本发明及其优点的更完整理解，附图中相同的编号表示相同的特征。通过结合附图参考以下说明可获得对本公开及其优点更完整的理解，其中附图不按比例，并且其中相同的附图标记表示相同的特征：

[0034] 图1A：具有流通磁性分离/去珠化模块的细胞处理系统的示意图；

[0035] 图1B：具有多个平行的流通磁性分离/去珠化模块的细胞处理系统的示意图；

[0036] 图1C：具有多个串联的流通磁性分离/去珠化模块的细胞处理系统的示意图；

[0037] 图1D：具有返回回路的细胞处理系统的示意图；

[0038] 图1E：具有分别连接流通磁性分离/去珠化模块的细胞悬浮液和缓冲液模块的细胞处理系统的示意图；

[0039] 图1F：包括旋转膜去珠化模块的细胞处理系统的示意图；

[0040] 图1G：细胞处理系统的示意图，其包括流通磁性分离/去珠化模块和多个旋转膜去珠化模块；

[0041] 图1H：具有流通磁性分离/去珠化模块的细胞处理系统的另一示意图；

[0042] 图2A：以x方向的磁体构型的流通磁性分离/去珠化模块的横向截面示意图；

[0043] 图2B：图2A的流通磁性分离/去珠化模块的半透明、三维示意图；

[0044] 图3：具有膜和亚膜流体注射端口的流通磁性分离/去珠化模块的侧面纵向截面示意图；

[0045] 图4A：在零梯度构型中流通磁性分离/去珠化模块的横向截面示意图；

[0046] 图4B：图4A的流通磁性分离/去珠化模块的半透明、三维示意图。

[0047] 图4C：产生零梯度过滤的零梯度构型中流通磁性分离/去珠化模块的顶部纵向截面示意图；

[0048] 图4D：在产生多种零梯度过滤的多种零梯度构型中流通磁性分离/去珠化模块的顶部纵向截面示意图；

[0049] 图5A：旋转膜去珠化模块的纵向截面示意图；

[0050] 图5B：具有第一磁体构型的旋转膜去珠化模块的横向截面示意图；

[0051] 图5C：具有第二磁体构型的旋转膜去珠化模块的横向截面示意图；

[0052] 图6：细胞上流体力(fluidic force)和磁力的示意图。

[0053] 图7A、7B和7C：存在细胞的情况下，图2B的流通磁性分离/去珠化模块在磁性分离期间的示意图；

[0054] 图8A和8B：存在细胞的情况下，图2B的流通磁性分离/去珠化模块在磁性分离期间的示意图；

[0055] 图9：比较使用图2A和2B的流通磁性分离/去珠化模块去珠化结果，以及使用传统停流模块(方框表示四分位数和中位数)去珠化结果的图表；

[0056] 图10A：具有接近模块入口(左)和接近模块出口(右)的顺磁性颗粒结合的细胞的流通磁性分离/去珠化模块的顶部纵向x-y截面示意图；

[0057] 图10B：具有接近模块入口(左)和接近模块出口(右)的顺磁性颗粒结合的细胞的流通磁性分离/去珠化模块的侧面纵向截面示意图；

[0058] 图11：在磁性分离顺磁性颗粒结合的细胞和非结合的细胞期间与图4A的流通磁性分离/去珠化模块相似的流通磁性分离/去珠化模块的图；

[0059] 图12：在磁性分离顺磁性颗粒结合的细胞和非结合的细胞期间，存在细胞的图4C的流通磁性分离/去珠化模块的图；

[0060] 图13：在从去珠的、非结合的细胞磁性分离顺磁性颗粒期间，存在细胞的图4C的流通磁性分离/去珠化模块的图；

[0061] 图14：在细胞存在的情况下，图5旋转膜去珠化模块在去珠化期间的图；

[0062] 图15：非流通去珠化过程和流通去珠化过程的收获率与输入细胞数量关系的图表；和

[0063] 图16：非流通去珠化过程和流通去珠化过程的收获率与输入细胞数量关系的箱形图(binned graph)。

[0064] 发明详述

[0065] 本公开涉及用于将细胞悬浮液中顺磁性颗粒结合的细胞或存在于顺磁性颗粒中的非结合的细胞流通分离、去珠化、顺磁性颗粒分离或其任一组合的方法和系统。该系统或方法使用流通磁性分离/去珠化模块、旋转膜去珠化模块或两者。尽管本文所述系统和方法可以用于从任何种类的细胞移除顺磁性颗粒，但是它们特别适合用于从待用于细胞治疗的细胞中移除顺磁性颗粒。此外，尽管本说明书的一些部分着重于顺磁性颗粒结合的细胞的阳性选择，因为去珠化通常仅在阳性选择方法期间进行，但是该系统和方法也可以用于阴性选择。当将其用于阴性选择时，通常将所有去珠化模块和步骤去除。

[0066] 分离和去珠化系统和模块

[0067] 图1A是细胞处理系统2的示意图，所述细胞处理系统2用于将细胞悬浮液中顺磁性颗粒结合的细胞流通分离、去珠化、顺磁性颗粒分离或其任意组合。系统2包括细胞悬浮模块4、缓冲液模块6、流通磁性分离/去珠化模块8、非磁性输出模块10和磁性输出模块12。任选地，系统2可以还包括至少一个其他模块16、至少一个返回回路14或两者。

[0068] 另外，系统2可以包括流体导管，如管或软管、连接器、阀、开关、夹具、焊接位点、外壳、电机、泵、其它机械机构、电路、监测装置和控制装置。系统2可以还包括计算机，其被编程以控制系统2或其任何部件以进行流通分离过程、流通去珠化过程、流通顺磁性颗粒分离过程，或其任何组合。

[0069] 系统2可以具有静态构造，或者其可以具有可适用构造。一个可适用构造可以允许交换模块或插入其他模块。另一可适用构型可以具有不可改变的模块组，但是可以允许改变流体到至少一个模块的路径。其它可适用构型可以允许模块的交换和添加，以及流体路径的改变。系统2的部件可以便于该可适用构型。例如，系统2中编程的计算机可以检测或使用关于存在哪个模块的信息，或者其可以控制流体路径。此外，系统2可以具有外壳或流体导管以及相关的连接器、阀、夹或开关，以便在相同的位置移除或插入不同的模块。模块或其它部件可以包括识别元件，如条形码或射频识别(RFID)芯片，以允许自动检测它们的存在或不存在。模块或其它部件可以还包含一个或多个指示元件，这可以确保其符合良好生产规程以及其它安全安全规程。例如，温度敏感指示元件可以指示模块或其它部件已被加热灭菌或不在某一可能损害其完整性和有效性的温度下使用。指示元件还可以清楚地识别使用的模块或其它部件。指示元件还可以通过系统2被自动检测，从而有助于最小化人为错误。

[0070] 特定过程所不需要的系统2的部件可以不存在，不连接或关闭。例如，如图1H所示，可以存在单一输出模块，而不是分离的非磁性输出模块10和磁性输出模块12。此外，如图1H所示，取决于阀、夹、焊接位点、开关和连接器的构型，系统2的部件可以具有这样的流体导管，其具有不同于图1A所示的路径和连接。

[0071] 细胞悬浮液模块4包括悬浮于悬浮液流体中待分离或去珠化的细胞。如果该细胞是待分离的，那么该细胞悬浮液通常包含顺磁性颗粒结合的细胞和非结合的细胞。顺磁性颗粒结合的细胞可能是所需细胞，那么在这种情况中，将会在系统2中发生针对顺磁性颗粒结合的细胞的阳性选择，或者顺磁性颗粒结合的细胞不是所需的，那么在这种情况中，将会发生针对顺磁性颗粒结合的细胞的阴性选择。

[0072] 如果细胞待去珠化，或者如果顺磁性颗粒待从细胞分离，那么顺磁性颗粒结合的细胞是所需细胞。它们可能之前已经使用系统2或其它系统从不需要的细胞分离。在存在不需要的细胞不造成问题时，或者在没有不需要的细胞待分离的示例中，待去珠化的细胞可能之前没有进行分离过程。

[0073] 细胞可以直接获得自生物样品，如血液，或从细胞培养物获得。

[0074] 悬浮液流体可以是能够在整个分离、去珠化或颗粒移除过程中支持细胞活力的任何流体。例如，其可以是培养基，冷冻剂，如含DMSO的流体，具有设定的或受控的pH的另一种流体，或具有营养物的另一种流体。其也可以是缓冲液，该缓冲液可以是与缓冲液模块6中缓冲液相同或不同的缓冲液。悬浮液流体可以具有与缓冲液不同的黏度。其还可以具有与细胞进入系统2的培养基不同的黏度，该黏度可以是非常密集的，如高密度聚蔗糖。

[0075] 缓冲液模块6中的缓冲液可以是任何这样的流体，其可以与悬浮液流体联合，并且允许悬浮液流体继续支持细胞活力。例如，该缓冲液可以具有设定的或受控的pH。缓冲剂可以包括一种或超过一种细胞相容的盐。尽管缓冲液在缓冲液模块6中分别提供，但是一旦缓冲液与细胞悬浮液混合，其被认为是悬浮液流体的一部分。

[0076] 悬浮液流体或缓冲液可以包括抗微生物剂，但是如果这些细胞稍后将提供给患者，则悬浮液流体或缓冲液通常不包括抗微生物剂，除非系统2将会经由如旋转膜去珠化模块或另一模块将这些试剂除去，或者除非这些试剂将会在其后通过其它步骤、模块或系统除去。

[0077] 顺磁性颗粒可以由任何顺磁性和/或可磁化的材料，如金属或金属合金形成。典型地，这些顺磁材料对细胞或对其后将会接受这些细胞的任何患者是没有毒性的，或者其被包覆以避免毒性。可以选择顺磁性材料，以实现高磁性饱和通量(ms)。通常，何种顺磁材料是合适的是由系统2中所使用的磁体以及使用该磁体的模块的构型所影响的，这是因为这些元件的影响使得这些顺磁材料实现磁饱和。

[0078] 可以用结合剂包覆这些顺磁性颗粒，如生长剂、受体或配体、抗原、抗体、或其任何结合片段或嵌合的变体，如嵌合抗原受体配体。在一些情况中，结合剂可以是可逆的，其允许顺磁性颗粒自发地或使用特定化学试剂进行分离。结合剂可以还包括可光切割的(photo-cleavable)接头，在这种情况中，系统2可以包括一个光源，特别是高功率的光源，将其作为一个模块或作为另一模块的部分以允许接头的光切割(photo-cleavage)以及细胞和顺磁性颗粒的分离。在一些情况中，包覆可以与细胞相互作用。在一些情况中，包覆可以与至少一种待移除的不需要的细胞悬浮液成分相互作用。该不需要的成分可以是活化的或失活的，并且其可能之前对于细胞或细胞悬浮液流体提供了有用的功能。不需要的成分的示例包括：抗体、生长因子、其它蛋白质和聚合物。

[0079] 不同类型的顺磁性颗粒，如具有不同的结合剂或由可能存在于一些细胞悬浮液中的不同的磁材料形成的颗粒允许结合剂的复杂分离或迭代除去。此外，也可以用任何结合剂包覆非顺磁性颗粒，而其也可以结合细胞。

[0080] 非顺磁性的其它颗粒也可以存在于细胞悬浮液中，并且可以用用于包覆顺磁性颗粒的任何物质将其包覆。

[0081] 可以由任何生物相容的材料，如细胞储存袋构成模块，或用其作为内衬。与细胞悬浮液或缓冲液接触的系统2的流体导管或任何其它部件也可以由任一生物相容材料构成，或用其作为内衬。

[0082] 在接触细胞悬浮液之前，将接触细胞悬浮液或缓冲液的系统2的部件可以是无菌的。

[0083] 系统2的部件可以是一次性的。特别是接触细胞悬浮液的部件，其可以是一次性的，以避免污染和染菌。

[0084] 图2A是以x方向的磁体构型的流通磁性分离/去珠化模块8的横向截面示意图，而图2B是以相同构型的相同磁性分离模块8的半透明、三维示意图。流通磁性分离/去珠化模块8包括由壁52限定的流动腔室50。外部偶极磁铁52产生磁力线56。磁体54被安放在可移动平台60上。流通磁性分离/去珠化模块8还包括入口62和出口64，细胞悬浮液可以从其以y方向流入模块8。

[0085] 尽管图2A和2B描述了磁性54的一个阵列，但是流通磁体134分离/去珠化模块8可以有两个或多个阵列，如图4A中所述，并且其可以在一个阵列中有超过两个磁体。另外，磁体54可以在一个固定的位置，在这种情况中，分离/去珠化模块8可能没有可移动平台60或者可能有可移动的流动腔室50。此外，尽管磁体54以x方向的构型示出，但是其可以处于以x-y平铺的任何角度，包括y方向或x-y交叉方向。

[0086] 入口62和出口64可以具有能够形成流过腔室50的层流的任何构型。入口几何结构、出口几何结构和流速都影响流过腔室50的细胞悬浮液液流。在一些情况中，可以接受湍流。

[0087] 壁52可以是刚性结构，或者可以是柔性的。例如，其可以是细胞储存袋或其它相似部件的壁。当壁52是柔性的，在z方向上腔室50的尺寸可以根据流过腔室50的细胞悬浮液的流速而变化。

[0088] z方向上腔室50的尺寸可以在5μm和100μm之间、5μm和500μm之间、或5μm和1000μm之间、5μm和1cm之间、或通常是100μm、500μm、1000μm、或1cm或更少。可以限制x、y和z方向上的尺寸，以实现足够高的流体力，其将细胞或顺磁性颗粒移动通过腔室50。

[0089] 磁体54可以具有高磁场强度。例如，其可以含有稀土类金属，如与另一种金属(如钴)合金化的钐或钕。如所述，磁体54可以是偶极磁体，或其可以是其他类型的磁体，如四极磁铁。磁体54可以具有可调节的磁场强度。例如，其可以是电磁体。可以将磁体54布置成以使腔室50的相同侧磁体的磁性吸引力最大化，以使腔室50的相对侧磁的磁性吸引力最大化，或两者。尽管图2A描述了特定的磁体构型，但是根据需要实现的作用，可以使用磁体极性是相反或相一致的构型。

[0090] 图3是在亚膜液体注射端口72和磁体54上方具有膜70的流通磁性分离/去珠化模块8的侧面纵向截面示意图。通过液体注射入口72可以将来自缓冲液模块6或其它液体模块的液体引入，以帮助位于接近膜70的去珠化的细胞。

[0091] 可移动平台60可以以z方向移动，从而允许z方向上的磁体54从如图2A和2B所示腔室50邻近的位置或靠近腔室50(未示出)的位置移动到远离腔室50的位置(如图7C所示)。例如，该远离腔室50的位置可以离开最接近的壁52至少1cm。该位置距离足以防止磁体54经由其磁场对腔室50中任何顺磁性颗粒的任何实质性影响。如果将磁性绝缘材料插在磁体54和腔室50之间，该位置距离可能会小很多。如果磁体54具有可调节的磁场强度，而不是通过移动的，那么起可以简单地将其调节至较低的磁场强度或零磁场强度，以避免对腔室50中任何顺磁性颗粒的实质性影响。

[0092] 特别是当使用零梯度构型时，模块8可以具有磁体54的顶部阵列和磁体54的底部阵列，如图4A和4B所描述。可移动平台60可以在x-y平面旋转，或者可以将磁体54永久地定向，从而使得磁体54处于x-y交叉定向的构型中，这样的构型在图4C中流通磁性分离/去珠化模块8的顶部纵向截面示意图中描述。为了用于零梯度构型中，流通磁性分离/去珠化模块8可以具有两个入口62，非磁性入口62a和磁性入口62b，以及两个出口64，磁性出口64a或非磁性出口64b。在该情况中，当使用模块8时，零梯度线58以x-y交叉定向的方向形成零梯度过滤。如图4D所阐释，将其它磁体54包括在内可以在相同的模块8中提供58a和58b两条零梯度线，这允许将不同的顺磁性颗粒分离到不同的出口64a和64b，或提供备用过滤器。

[0093] 如果磁体54彼此之间被充分地间隔，而不是如图2A和2B所描述的彼此之间邻近，零梯度线58可以是以x方向具有尺寸的零梯度条带。

[0094] 用于流通磁性分离/去珠化模块的磁体可以位于细胞悬浮液流过的腔室的外部，或者是腔室的内部。如果磁体位于内部，那么可用生物相容性材料将其包覆。具体地，如果磁体位于内部，那么其可以是一次性的。

[0095] 图1B是细胞处理系统2的示意图，其包括多个平行的流通磁性分离/去珠化模块8a、8b和8c。尽管只示出了3个流通磁性分离/去珠化模块8，但是多个可以是大于2的任何数量。当流通磁性分离/去珠化模块是平行的时，模块通常是以相同类型并且以相同构型，从而使得相同的功能由各模块进行。当与其他模块联合时，平行的流通磁性分离/去珠化模块
8对于快速的细胞悬浮液处理或流体体积的管理特别有用。并且，将流通磁性分离/去珠化模块8以平行的方式放置在控制流体流中提供了灵活性，因为需要同时使用所有模块。

[0096] 图1C是细胞处理系统2的示意图，其包括多个串联的流通磁性分离/去珠化模块8a、8b和8c。尽管只示出了3个流通磁性分离/去珠化模块8，但是多个可以是大于2的任何数量。当流通磁性分离/去珠化模块8是串联时，其可以是以相同类型和构型，从而使得相同的功能由各模块进行，但是，通常，其是不同的类型和构型，从而又各模块进行不同的功能。例如，模块8a可以将顺磁性颗粒结合的细胞和非结合的细胞分离，模块8b可以将顺磁性颗粒结合的细胞去珠化，并且模块8c可以在更强的磁场梯度下将顺磁性颗粒结合的细胞去珠化。

[0097] 图1D是细胞处理系统2的示意图，其中返回回路14引导顺磁性颗粒结合的细胞流回流通磁性分离/去珠化模块8。这样的系统相较于没有返回回路14的相似系统，可以用于实现顺磁性颗粒结合的细胞和非结合的细胞更好的分离，或实现非结合的细胞和顺磁性颗粒更好的去珠化或分离。可以通过阀或开关引导流体至返回回路14或至磁性输出模块。

[0098] 图1E是细胞处理系统2的示意图，其中细胞悬浮液和缓冲液模块分别连接流通磁性分离/去珠化模块8。当如图5中所示并描述，流通磁性分离/去珠化模块8具有两个入口62和两个出口64和以x-y交叉定向构型的磁体54时，这样的系统是特别有用的。

[0099] 图1F是细胞处理系统2的示意图，其具有位于流通磁性分离/去珠化模块8下游的旋转膜去珠化模块18。旋转膜去珠化模块18连接废料输出模块20和细胞输出模块22。在该系统2中，流通磁性分离/去珠化模块8将顺磁性颗粒结合的细胞和非结合的细胞分离，而旋转膜去珠化模块18进行所有去珠化，或者流通磁性分离/去珠化模块8也可以进行去珠化。如果将试剂(如化学剂)加入旋转膜去珠化模块18中的悬浮液流体，试剂模块24可以任选地存在。尽管图1阐述了一个旋转膜去珠化模块18，但是系统2可以包括多个串联或平行的模块18。当模块18是串联时，化学剂可只加入到最后的模块18，以最小化暴露于化学剂的细胞。

[0100] 试剂模块24中的试剂可以是减弱颗粒和细胞间结合的任何化学剂。颗粒可以是顺磁性颗粒，或者其可以是非顺磁性颗粒。

[0101] 图5A是旋转膜去珠化模块18的纵向截面示意图。模块18包括入口80，其允许细胞悬浮液流体流入圆柱形去珠化腔室82，所述圆柱形去珠化腔室82由圆柱形侧壁84所部分限定，并且包含同轴定向的圆柱形旋转膜86。壁84外部排布有磁体88。去珠化腔室18允许流过旋转膜86的流体经由废料输出模块20排出，而剩余的流体和细胞通过细胞输出模块22排出。旋转膜86具有小于细胞平均直径的孔尺寸，但是其大于待通过去珠化移除的任何非顺磁性颗粒。平均孔尺寸也可以大于待移除的任何顺磁性颗粒，这允许把通过旋转膜将这些顺磁性颗粒移除作为主要颗粒移除方法，或作为磁性移除的备用。

[0102] 如图5B所示，磁体可以基本上被壁84所包围，或者如图5C所示，其可以被沿着壁84的间隔所隔开。可以将磁体88安装在可移动平台，以允许其从邻近壁88的位置，如图5A-5C所示，或从靠近壁88(未显示)的位置移动到远离壁84的位置。例如，该远离位置可以是离壁84至少1cm。该向远离位置的移动防止了磁体88经由其磁场对腔室82中任何顺磁性颗粒的实质性影响。如果将磁性绝缘材料插入磁体88和腔室82之间，该远离位置可以小于不存在该磁性绝缘材料的情况。如果磁体88具有可调节的磁场强度，而不是被移动，那么起可以简单地将其调节至较低的磁场强度或零磁场强度，以避免对腔室82中顺磁性颗粒的实质性影响。

[0103] 尽管图5中示出了多个磁体88，但是也有可能只具有单一的磁体88。

[0104] 磁体88可以具有高磁场强度。例如，其可以含有稀土类金属，如与另一种金属(如钴)合金化的钐或钕。磁体88可以是偶极磁体、四极磁体或任何其它类型的磁铁。磁体88可以具有可调节的磁场强度，例如，其可以是电磁体。磁体88可以经布置以使磁场吸引最小化，例如布置成缠绕构型。

[0105] 用于旋转膜模块的磁体可以位于细胞悬浮液流过的腔室的外部，或者是腔室的内部。如果磁体位于内部，那么可用生物相容性材料将其包覆。具体地，如果磁体位于内部，那么其可以是一次性的。

[0106] 适合用于本文公开模块的示例性旋转膜包括用于细胞处理系统(费森尤斯卡比公司(Fresenius Kabi)，Fenwal，伊利诺伊州苏黎世湖)的4-μm跟踪蚀刻聚碳酸酯旋转膜，以及用于磁性细胞分离系统(Baxter公司，伊利诺伊州迪尔菲尔德)的旋转膜。

[0107] 取决于所要进行的特定细胞处理，来自图1A-1F的元件，包括如图2-4中所描述的流通磁性分离/去珠化模块8或如图5中所描述的旋转膜去珠化模块，可在细胞处理系统2中彼此联合。可以如所描述或在其他合理的变形中将元件联合。例如，可以将试剂模块24包括在系统或如图1A所描述的系统中，从而当流通磁性分离/去珠化模块8用于去珠化时，将化学剂加入到其中的悬浮液流体。可以布置模块，特别是其它缓冲液模块或输出模块，并且将其用于保证适当的流体体积和流速，特别是在模块8和18中的。

[0108] 结合多个模块和回路的细胞处理系统2的一个示例在图1G中阐述。该系统包括连接第一流通磁性分离/去珠化模块8a的细胞悬浮模块4和缓冲液模块6a、所述模块8具有非磁性输出模块10和磁性输出模块12a。磁性输出模块12a连接第二串联的流通磁性分离/去珠化模块8b，所述模块8b还连接缓冲液模块6b并且具有非磁性输出模块10b和磁性输出模块12，以及返回回路14a。返回回路14a导向返回模块8b。磁性输出模块12b导向第一旋转膜去珠化模块18a，所述模块18a具有废料输出模块20a和细胞输出模块22a。细胞输出模块22a导向第二串联的旋转膜去珠化模块18b，所述模块还连接试剂模块24以及废料输出模块20b，返回回路14b，以及细胞输出模块22b。返回回路14b导向返回第二串联的流通磁性分离/去珠化模块8b。

[0109] 图11示出具有各种其他模块的细胞处理系统的另一个示例，所述各种其他模块具有特定的流体导管。可以是空的或者可以包含缓冲液的卫星模块30和细胞悬浮液模块4连接流通磁性分离/去珠化模块8。流通磁性分离/去珠化模块8分别连接缓冲液模块6和储库模块26。储库模块26还连接回收模块28。许多连接使用刺突管(spike tubing)32制成。该系统还包括，沿着各种流体导管，辊夹34、焊接位点36、夹片38、弹簧夹40。

[0110] 细胞处理系统2可以包括各种其他模块16，如磁性柱，其他物理分离模块，细胞洗涤模块，细胞浓缩模块(cell concentration module)，和介质交换模块。

[0111] 细胞分离和去珠化方法

[0112] 系统2可以用于在流通过程中分离顺磁性颗粒结合的细胞和非结合的细胞，将磁性颗粒结合的细胞去珠化，分离顺磁性颗粒和非结合的细胞，或其任意组合。在流通过程中，所有细胞在流通磁性分离/去珠化模块8中继续移动。没有、不超过0.01％、或不超过0.05％、或不超过1％的通过模块8的顺磁性颗粒结合的细胞沿着壁52停止。

[0113] 流通磁性分离/去珠化过程

[0114] 在使用图1A系统的流通过程中，流通磁性分离/去珠化模块8可以任选地这样进行准备，通过从缓冲液模块6将缓冲液从其中流过，到达非磁性输出模块10或磁性输出模块12，或另一输出或其他模块16。包括顺磁性颗粒结合的细胞的细胞悬浮液从模块8流过。

[0115] 如果系统2用于分离，那么将细胞悬浮液引导至非磁性输出模块10。模块8可以定期地设置成不吸引顺磁性颗粒，同时来自缓冲液6的缓冲液从其中流过到达磁性输出模块12。为了确保更好的细胞分离，以及磁性或非磁性细胞产物的高纯度，可以引导细胞悬浮液通过回路14进行通过模块8的第二或者后续通路。可以引导顺磁性颗粒结合的细胞至其他组件16，如用于进行去珠化流通磁性分离/去珠化模块8，或者至旋转膜去珠化模块18。

[0116] 如果将系统2用于去珠化，那么在流过模块8之后，将细胞悬浮液引导至非磁性输出模块10。或者，再将细胞悬浮液引导至非磁性输出模块10之前，可以引导其通过回路14进行通过模块8的第二次或者后续通路。

[0117] 使用流通磁性分离/去珠化模块8的处理使得有至少一个结合的顺磁性颗粒102的各顺磁性颗粒结合的细胞100受到流体(剪切或拖拽)力。各细胞100还受到磁力106，如图6所示。流体力104和磁力106可以保持顺磁性颗粒102结合顺磁性颗粒结合的细胞100的方式联合，允许待分离的细胞100形成非结合的细胞。流体力104和磁力106也可以导致顺磁性颗粒102与顺磁性颗粒结合的细胞脱离的方式联合，允许细胞100的去珠化。二次力，如扩散和重力，也作用于顺磁性颗粒102，但其对去珠化的作用通常比流体力和磁力小很多，并且当计算通过模块的适当流速时常常将其忽略。

[0118] 通常可以对系统2进行设置，以便尽快使所需要的细胞不再受制于模块间的通道，减少创伤细胞。例如，在去珠化构型中，只有磁性输出模块12可能包括向流通磁性分离/去珠化模块8的返回回路，允许易去珠化的细胞通过模块8的次数比那些具有更难结合的顺磁性颗粒通过模块8的次数更少。

[0119] 流过模块8的液流可以是层流或是湍流。磁力106受到顺磁性颗粒102的饱和通量(ms)的影响。磁力106同样受到顺磁性颗粒102所受磁场56的强度的影响，其受到磁体54的强度以及以z方向腔室50的深度和细胞100在腔室内位置的影响。磁力106还受到这样的磁场梯度的影响，当顺磁性颗粒102移动通过腔室50时受到该磁场梯度的作用，这受到磁体54的位置和强度以及顺磁性颗粒102相对于磁体54位置的影响。

[0120] 此外，流体力受到流体流动速度的影响，所述流体流动速度通常在腔室的中心最高并且在壁为零，这表明附着于壁的细胞可能无法受到足以将其从顺磁性颗粒脱离的流体力，并且沿着壁的细胞可能大部分是静止的并且可能屏蔽下游细胞免受流体力。这导致所需细胞的损失，并且通过将细胞悬浮液连续地流过腔室50避免。该损失可以通过流通途径避免，在该途径中细胞不会因为磁力而静止。该损失也可以通过其中位于壁的速度不是零或者接近零的模块避免，如活塞式流通模块，其中流体流动速度均匀的穿过腔室。

[0121] 流通分离过程

[0122] 流通分离过程可以使用如图2A和2B所示构型中的流通磁性分离/去珠化模块8进行。流速可以使得流体力104和磁力106允许顺磁性颗粒102保持与细胞100的结合。流速还可以使得细胞100不会被流体力所裂解。

[0123] 图7A显示了当顺磁性颗粒结合的细胞100和非结合的细胞110刚刚进入腔室50时图2B的模块8。在图7B中，细胞100已经停止，而非结合的细胞110继续以其原始速度运行。在图7C中，磁体已经被移开，并且细胞100继续移动，但是非结合的细胞110已经离开腔室50。

[0124] 当磁体54邻近或靠近腔室50时，离开腔室50的悬浮液流体进入非磁性输出模块10。定期地，将流自细胞悬浮液模块4的细胞悬浮液停止，并且在磁体54移开腔室50时将缓冲液由缓冲液模块6流入腔室50，以允许顺磁性颗粒结合的细胞100被缓冲液冲进磁性输出模块12。

[0125] 该流通分离过程，特别是当将其重复以允许细胞通过模块8的多次通路，可以在细胞悬浮液进入非磁性输出模块10之前，从细胞悬浮液中移除至少80％、至少90％、至少95％或至少99％的顺磁性颗粒结合的细胞100。对于其中细胞只从模块8通过一次的单次通过过程而言，其效率可能较低。例如，在一单次通过过程中，在细胞悬浮液进入非磁性输出模块10之前，模块8可以从细胞悬浮液移除至少25％或至少50％的顺磁性颗粒结合的细胞100。
流过流通磁性分离/去珠化模块8的非磁性输出或磁性输出的单次或多次通过可以产生下述产物：顺磁性颗粒结合的细胞产物，在进行流通分离过程之前细胞悬浮液中具有不超过
1％非结合的细胞100并且包含至少99％顺磁性颗粒结合的细胞100；非结合的细胞产物，在进行流通分离过程之前细胞悬浮液体中具有不超过1％顺磁性颗粒结合的细胞100并且包含至少99％非结合的细胞；或两种产物都有。

[0126] 流通去珠化过程

[0127] 流通去珠化过程还可以使用如图2A和2B所示构型中的流通磁性分离/去珠化模块8进行。流速使得，在当细胞100通过腔室50时，流体力104和磁力106相对于细胞悬浮液中的细胞平均将至少一个顺磁性颗粒102从细胞100分离。流速还使得细胞不会被流体力所裂解。

[0128] 图8A显示了当顺磁性颗粒结合的细胞100a和100b刚刚进入腔室50时图2B的模块8。细胞100a具有一个顺磁性颗粒102，而细胞100b具有两个顺磁性颗粒102。在图8B中，一个顺磁性颗粒102从细胞100a和细胞100b各自分离并且在壁52上静止，而细胞100a和100b继续通过腔室50。细胞100a不在具有任何顺磁性颗粒102，而细胞100b保留一个顺磁性颗粒
102。可以将细胞100b第二次通过模块8，以移除这个第二顺磁性颗粒102。或者，与图7中顺磁性颗粒结合的细胞相似，模块8被设置成使得细胞100b在腔室50中留存，而细胞100a流出腔室50。

[0129] 该流通去珠化过程可以从细胞移除至少99％的顺磁性颗粒。

[0130] 当使用包含来自磁性输出模块12的再循环回路14的系统2对CLT0119T细胞进行去珠化时，磁性输出中的细胞在来自缓冲液模块6的缓冲液中重悬，并且第二次流过模块8，然后再次进行第三次。图9中提供了该过程结果与传统停流过程结果的比较。图9显示了端至端产率(end-to-end yield)，其是最终产物中细胞数量与进入去珠化系统的细胞数量的比例。

[0131] 可以将图3中所示流通磁性分离/去珠化模块8以与图2A和2B中所示模块8相似的方式用于对细胞进行去珠化。通过端口72引入的流体为细胞100提供了足以将其从膜70分离的力。因为悬浮液流体的速度在接近膜70处接近零，这些细胞可能因此不被分离或去珠化，或可能会丢失。

[0132] 该流通去珠化过程还可以从细胞移除至少99％的顺磁性颗粒。

[0133] 流通零梯度过滤过程

[0134] 流通分离过程可以使用如图4A和4B所示构型中的流通磁性分离/去珠化模块8进行。流速可以使得流通力104和磁力106允许顺磁性颗粒102保持与细胞100的结合。流速还可以使得细胞100不会在腔室50中停止，并且还不会被流体力所裂解。图10-13中示出了各种构型并且可以对其进行修改，例如，调整入口62和出口64的数量和比例尺寸，以使用不同的零梯度过滤过程。例如，通过不同尺寸的入口62和出口64所实现的作用也可以通过从相同尺寸的入口和出口提供通常由泵所控制的不同流速而予以实现。

[0135] 图10显示了对于顺磁性颗粒结合的细胞100是如何在零梯度构型中流过模块8的基本描述。如图10A所示，在进入模块8(左图)后，细胞100以x方向被拉动至零梯度线58，直到其接近输出模块8(右图)。如图10A和10B所示，当细胞100进入模块8(左图)或甚至靠近出口(右图)之时，细胞100以y方向或z方向并不受到磁力作用。

[0136] 图11显示了具有如图4A所示定向的磁体54的零梯度模块8。在该模块中，流体通过入口62进入。具有磁性颗粒102的细胞100沿着零梯度线58，并且被引导到磁性出口64b。非结合的细胞110并不受到零梯度线58的影响，并且流向非磁性出口64a和64c。在该构型中，一些非结合的细胞100也会进入磁性出口64b。

[0137] 图12显示了移动通过图4C的模块8的细胞。具有顺磁性颗粒102的细胞100沿着零梯度线58，并且被引导到磁性出口64a。非结合的细胞110并不受到零梯度线58的影响，并且流向非磁性出口64b。因此，零梯度线58作为磁性过滤，其允许所有细胞继续移动通过腔室50，而不将其推向任何壁52。如图所示，非磁性入口62a比磁性入口62b大，并且非磁性出口
64b比磁性出口64a大。如果流入模块8中的流体是层状的，来自非磁性入口62a的流体横跨到非磁性出口64b，这防止任何非结合的细胞100进入磁性出口64a。该方法也可以用于湍流，但是由于非结合的细胞在磁性出口64a的损失，其效率较低。

[0138] 该流通分离过程可以在细胞悬浮液进入非磁性输出模块10之前，从中移除至少80％、至少90％、至少95％或至少99％的顺磁性颗粒结合的细胞100。经由流通磁性分离/去珠化模块8进行的非磁性输出或磁性输出的多次通过可以产生下述产物：顺磁性颗粒结合的细胞产物，在进行流通分离过程之前细胞悬浮液中具有不超过1％非结合的细胞11并且包含至少99％顺磁性颗粒结合的细胞100；非结合的细胞产物，在进行流通分离过程之前细胞悬浮液体中具有不超过1％顺磁性颗粒结合的细胞100并且包含至少99％非结合的细胞；
或两种产物。

[0139] 流通零梯度顺磁性颗粒分离过程

[0140] 流通顺磁性颗粒分离过程可以使用以如图4C所示构型中的流通磁性分离/去珠化模块8进行。图13显示了去珠化的、非结合的细胞110和顺磁性颗粒102移动通过模块8。细胞110之前被去珠化，例如，通过旋转膜去珠化模块18、非旋转膜去珠化模块，或去珠化构型中相同或分离的模块8。或者，细胞110可能已经存在顺磁性颗粒102，但是没有与之结合。顺磁性颗粒102沿着零梯度线58，并且被引导到磁性出口64a。去珠化的、非结合的细胞110并不受到零梯度线58的影响，并且流向非磁性出口64b。因此，零梯度线58作为磁性过滤，其允许细胞110继续移动通过腔室50，而不将其推向任何壁52。

[0141] 该流通顺磁性颗粒分离过程可以从细胞悬浮液移除至少80％、至少90％、至少95％或至少99％的珠。

[0142] 该过程，联合移除顺磁性颗粒，也可以移除不需要的细胞悬浮液成分。

[0143] 尽管细胞分离过程和颗粒分离过程分别如上述描述，但是其可以在相同的模块或系统中同时发生。例如，分离模块通常将从细胞悬浮液移除顺磁性颗粒结合的细胞以及游离的颗粒。

[0144] 旋转膜去珠化过程

[0145] 在使用图1F的系统2的流通过程中，分离的顺磁性颗粒结合的细胞100经由样品入口80被引导到如图14所示的旋转膜模块18中。在去珠化模块82中，除了通过从入口80流过腔室82至出口20和22所生成的流体力以外，旋转膜86在细胞悬浮液中生成引起流体力的再循环的泰勒-库埃特流(Taylor-Couette flow)。因此，尽管顺磁性颗粒102仍然受到流体力和磁力，但是这些力之间的关系以及其如何引起去珠化仍然难以模型化。然而，流体力至少受到旋转膜80的尺寸和旋转速率，通过腔室82的细胞悬浮液流速，和悬浮液流体的黏度的影响。磁力受到下述的影响：顺磁性颗粒102的性质，磁体88的性质以及模块18的设计，特别是细胞100和磁体88之间距离。通常，流体力并不高到裂解细胞。泰勒-库埃特流足以保持细胞远离或者避免接触壁84和旋转膜86。

[0146] 从细胞100移除的顺磁性颗粒102迁移到壁84，并且特别是迁移到沿着壁84的零梯度线或条带。任何非顺磁性颗粒120也通过流体力从细胞100移除。非顺磁性颗粒120通过旋转膜86中的孔，然后经由废料输出模块20排出腔室82。从任选的试剂腔室24添加的任何化学剂122也通过旋转膜86的孔，并且经由废料输出模块20排出腔室82。这限制了细胞100暴露于化学剂120。去珠化、非结合的细胞110经由细胞输出模块22配出腔室82。

[0147] 可以定期将顺磁性颗粒102从壁84移除，例如，通过将流过腔室82的细胞悬浮液停止，将磁体88移动到远离壁84的位置，然后将缓冲液流过腔室82。

[0148] 一些顺磁性颗粒102还可以通过旋转膜80，并且被移除。如果没有磁体88或者其离腔室82足够远，可以通过旋转膜80实现所有的顺磁性颗粒移除。

[0149] 该流通分离去珠化过程也可以从细胞移除至少80％、至少90％、至少95％或至少99％的顺磁性颗粒，从细胞移除至少80％、至少90％、至少95％或至少99％的非顺磁性颗粒，或两者皆可。

[0150] 旋转膜还可以用于分离来自非结合的细胞102的顺磁性颗粒102。

[0151] 旋转膜86可以具有这样的孔尺寸，所述孔尺寸小到能够排除细胞悬浮液中的所有细胞。

[0152] 旋转膜模块18还可以用于从细胞悬浮液移除不需要的成分。这些成分可以简单地通过旋转膜88过滤，或者其可以与顺磁性颗粒102、非顺磁性颗粒120或两者的包覆相互作用，然后用颗粒移除。去珠化和不需要的成分移除可以分别或同时发生。

[0153] 其它去珠化和顺磁性颗粒分离过程

[0154] 由于系统2的模块化设计，其也与其它去珠化和顺磁性颗粒分离过程兼容。只需要插入适当的其他模块16即刻。例如，柱，包括磁性柱和物理分离方法常常被用于将细胞去珠化，并且可以将其作为其他模块16包括。

[0155] 其他整合的过程

[0156] 由于系统2的模块化设计，其与其它整合的过程兼容。这些过程可以发生在至少一个其他模块16中。例如，可以将一个模块用于洗涤细胞。也可以将一个模块用于浓缩细胞。可以将一个模块用于交换细胞所处的介质。可以将一个模块用于一个以上的这些步骤。

[0157] 多模块的流通过程

[0158] 如图1G中所示的系统2可以用于多模块的流通过程中。任选地，可以将来自缓冲液模块6a的缓冲液流过流通磁性分离/去珠化模块8，并且任选地以及一个或多个模块8b、18a和18b。将包含所需的、顺磁性颗粒和非顺磁性颗粒结合的细胞以及不需要的非结合的细胞的细胞悬浮液流过模块8a，所述模块8a如图4所示设置以进行分离，但是或者，可以将其如图2A和2B设置以进行分离。非结合的细胞作为废料被引导至非磁性输出模块10a。顺磁性颗粒结合的细胞经由磁性输出模块12a被引导至流通磁性分离/去珠化模块8b。如图2A和2B设置模块8b以进行去珠化。顺磁性颗粒结合的细胞在以废料进入磁性输出模块12b前，至少流过返回回路14a一次。去珠化的、非结合的细胞经由非磁性输出模块10b被送至旋转膜去珠化模块18a。移除所有剩余的顺磁性颗粒和非顺磁性颗粒，其中非顺磁性颗粒流入废料输出模块20a，而非结合的顺磁性颗粒保留在模块18中，并且非结合的细胞和具有顺磁性颗粒、非顺磁性颗粒或两者的细胞流入细胞输出模块22a。细胞输出模块22a通向第二旋转膜模块18b。能够促进顺磁性颗粒材料或非顺磁性颗粒或两者从细胞移除的化学剂由试剂模块24加入。非顺磁性颗粒和化学剂流入废料模块20b。顺磁性颗粒保留在模块18中。再将非结合的细胞和具有顺磁性颗粒、非顺磁性颗粒材料或两者的细胞作为流通过程的最终产物送至细胞输出模块22b之前，将其至少一次流过返回回路14b。

[0159] 临床应用

[0160] 本文所有的过程都可以根据临床良好生产实施(cGMP)标准进行。

[0161] 该过程可以用于细胞纯化、富集、收获、洗涤、浓缩或用于细胞介质交换，特别是在在制造过程开始时收集原始、起始物质(特别是细胞)，以及在制造过程中用于选择或扩增用于细胞治疗的细胞。

[0162] 细胞可以包括任何数量的细胞。细胞可以是相同的细胞类型，或混合的细胞类型。此外，细胞可以来自供体，如进行细胞治疗的自体供体或单一同种异体供体。可以通过，例如，白细胞去除术或血浆分离置换法由患者获得细胞。细胞可以包括T细胞，例如，可以包括具有大于50％T细胞、大于60％T细胞、大于70％T细胞、大于80％T细胞或90％T细胞的群。

[0163] 选择过程可以在培养和扩增之前选择细胞中特别有用。例如，用抗-CD3和/或抗CD28包覆的顺磁性颗粒可以被用于选择用于扩增或用于引入编码嵌合抗原受体(CAR)或其他蛋白质的核酸的T细胞。这样的过程被用于生产用于急性淋巴细胞白血病(ALL)治疗的CTL019T细胞。

[0164] 本文所公开的去珠化过程和模块在生产用于细胞治疗的细胞中特别有用，例如，在培养和扩增之前或之后纯化细胞。例如，用抗-CD3和/或抗CD28抗体包覆的顺磁性颗粒可以被用于选择性扩增T细胞，例如，通过引入编码嵌合抗原受体(CAR)或其他蛋白质的核酸的T细胞进行修饰或将会进行修饰的T细胞，从而使得CAR通过T细胞表达。在生产这样的T细胞期间，可以使用去珠化过程或模块以从顺磁性颗粒分离T细胞。这样的去珠化过程或模块被用于生产，例如，用于急性淋巴细胞白血病(ALL)治疗的CTL019T细胞。

[0165] 在这样一个过程中，通过示例的方式说明，细胞，例如，T细胞经由血浆分离置换法(例如，白细胞去除术)从供体(例如，待用自体嵌合抗原受体T细胞产物处理的患者)收集。然后，可以对收集的细胞进行任选地纯化，例如，通过淘洗步骤。然后，可以将顺磁性颗粒，例如，抗-CD3/抗-CD28包覆的顺磁性颗粒加入细胞群，以扩增T细胞。该过程可以还包括转导步骤，其中将编码一种或多种所需蛋白质(例如，CAR，例如，靶向CD19的CAR)的核酸引入细胞。可以在慢病毒中将核酸引入。然后，可以扩增细胞，例如慢病毒转导细胞数天，例如，
1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或更多天，例如，在合适的介质存在的情况下。扩增之后，可以使用本文公开的去珠化过程/模块以从顺磁性颗粒分离所需的T细胞。该过程可以包括根据本公开过程的一个或多个去珠化步骤。然后可以将去珠化的细胞进行配制，用于给予患者。CAR T细胞的示例以及其生产在例如WO2012/079000中进一步描述，其内容被纳入本文作为参考。本公开的系统和方法可以用于WO2012/079000中所述或与之相关的任何细胞分离/纯化/去珠化。

[0166] 相较于传统系统和方法，本文所述系统和方法可以通过浪费较少的期望的细胞，引起较少的细胞损伤，并且以较少或不暴露于化学剂的方式更可靠地从细胞去除去磁性和任何非顺磁性颗粒，而类似地有利于其它细胞治疗产品。实施例

[0167] 下述提供的实施例仅是为了说明性目的，且并不意图包括整个发明。该实施的一些方面可以与上述发明的其他一些方面联合。

[0168] 在该实施例中，T细胞在培养物中进行9天的扩增，然后根据现有过程使用非流通去珠化过程或根据本公开使用流通去珠化过程进行收集和去珠化。样品具有约1e8到约3e10的成核活细胞。顺磁性颗粒与成核活细胞的比例在约3：1到1：3之间，其中具有较低总成核活细胞的样品展现出较高的顺磁性颗粒与成核活细胞的比例。顺磁性颗粒与细胞的比例在细胞回收中是一个显著因素。较高的顺磁性颗粒与成核活细胞比例增加成核活细胞结合顺磁性颗粒并且在顺磁性颗粒移除过程中丢失的机会。

[0169] 在非流通去珠化过程中，在1升血小板袋(platelet bag)(泰尔茂医疗公司(Terumo Medical Corp.)新泽西州萨默塞特)中收集样品，并将其以0度静态放置在平坦磁性板顶部(DYNAMAGTM CTSTM，赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)，马萨诸塞州沃尔瑟姆)5分钟，随后以30度倾角放置1分钟。然后，从袋中释放袋中包含非磁性部分的液体，以形成最终产物。保留在袋中的磁性部分作为废料。

[0170] 在流通去珠化过程中，将样品连续流过CSD400Y9 CRYOSTORETM锥形袋(OriGen生物医学公司(OriGen Biomedical)，得克萨斯州奥斯汀)并放置在平坦磁性板顶部(DYNAMAGTM CTSTM，赛默飞世尔科技公司，马萨诸塞州沃尔瑟姆)。由于连续流过该袋以及磁体，该样品被动态去珠化，其中当样品移动通过袋时，顺磁性颗粒被从成核活细胞剥离。通过该袋后的液体在一段时间后形成最终产物。保留在袋中的磁性部分作为废料。极少的成核活细胞被困于磁性部分。这与非流通去珠化过程形成对比，其中结合顺磁性颗粒的成核活细胞被磁体吸引并且被在废料中丢失。

[0171] 38次非流通去珠化过程和36次流通去珠化过程的元数据分析显示，当使用流通去珠化过程时，成核活细胞的回收显著地增长。图15。成核活细胞回收的增长在细胞数量较低的样品中(如少于1.6e9总成核的活细胞)特别显著。以这样的总成核活细胞数量，相较于非流通去珠化过程仅为34％的平均回收率，流通去珠化过程表现出76％的平均回收率。图16。同样在具有高细胞数的样品中观察到10-20％的回收率增长。

[0172] 回收率的差异是因为流通去珠化过程从成核活细胞动态移除顺磁性颗粒的能力，因此即使它们在收获之前最初与顺磁性颗粒结合，这些细胞也没有丢失。

[0173] 尽管上面仅详细描述了本公开的示例性实施方式，但是应理解，在不偏离本公开的精神和预期保护范围的情况下，可以对这些示例进行改进和变化。例如，包括这些示例的磁性模块和系统可以按照除了所描述的那些以外的各种构型而布置和使用。此外，系统和方法可以包括并未在本文具体描述的其他部件和方法。例如，方法可以包括预处理(priming)，其中首先将流体引入部件以除去气泡并减少对细胞悬浮液或缓冲液运动的阻力。此外，实施方式可以只包括使用本文所述的方法的本文所述系统的一部分。例如，实施方式可以涉及可以用于非一次性设备内的一次性模块、软管等，以形成能够分离或将细胞去珠化以产生细胞产物的完整系统。

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基于流通顺磁性颗粒的细胞分离和顺磁性颗粒移除

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