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一种用于检测乙肝病毒的引物组、组合物及 试剂盒

阅读：485发布：2023-03-13

专利汇可以提供一种用于检测乙肝病毒的引物组、组合物及试剂盒专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种用于检测乙肝病毒的引物组，包含具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的正向引物和具有SE ID NO.2所示的核苷酸序列的反向引物。一种包括上述的用于检测乙肝病毒的引物组的用于检测乙肝病毒的组合物，还包括靶点探针，靶点探针具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列，靶点探针的两个末端分别标记荧光基团和淬灭基团。一种包括上述的用于检测乙肝病毒组合物的用于检测乙肝病毒的试剂盒，还包括PCR缓冲液、dNTPs、Taq酶、UNG酶和核酸提取试剂。采用乙型肝炎病毒A-H共8个型别多个亚型生物信息学分析，在S区段保守区设定引物探针区段，能很好覆盖 8个HBV型别和各个亚型。，下面是一种用于检测乙肝病毒的引物组、组合物及试剂盒专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种用于检测乙肝病毒的引物组，其特征在于，包含具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的反向引物。
2.根据权利要求1所述的用于检测乙肝病毒的引物组，其特征在于，所述正向引物和反向引物的至少之一的核苷酸序列中的一个或多个胸腺嘧啶碱基替换为尿嘧啶碱基。
3.包括权利要求1或2所述的用于检测乙肝病毒的引物组的用于检测乙肝病毒的组合物，其特征在于，还包括靶点探针，所述靶点探针具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列，所述靶点探针的两个末端分别标记荧光基团和淬灭基团。
4.根据权利要求3所述的用于检测乙肝病毒的组合物，其特征在于，还包括内标探针或靶点探针的反向序列，所述内标探针具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列，所述内标探针的两个末端分别标记荧光基团和淬灭基团，所述靶点探针和内标探针标记的荧光基团不同。
5.根据权利要求4所述的用于检测乙肝病毒的组合物，其特征在于，所述靶点探针和内标探针的至少之一是经甲基化修饰的。
6.根据权利要求4所述的用于检测乙肝病毒的组合物，其特征在于，所述靶点探针和内标探针的至少之一的核苷酸序列中的一个或多个胸腺嘧啶碱基替换为尿嘧啶碱基。
7.包括权利要求4所述的用于检测乙肝病毒组合物的用于检测乙肝病毒的试剂盒，其特征在于，还包括PCR缓冲液、dNTPs、Taq酶、UNG酶和核酸提取试剂。
8.权利要求7所述用于检测乙肝病毒试剂盒，其特征在于：所述引物、探针、PCR缓冲液、dNTPs、Taq酶、UNG酶混合并加入无DNase和RNase纯化水成为PCR反应预混液，所述PCR反应预混液的配方如下：
PCR缓冲液10μL；
100mM dNTPs(ATCGU)0.27-1.35μL；
50μM正向引物0.25-1.5μL；
50μM反向引物0.25-1.5μL；
50μM靶点探针0.05-0.8μL；
50μM内标探针0.05-0.8μL；
Taq酶0.5-1μL；
UNG酶0.02-0.15μL；
加入无DNase和RNase纯化水至终体积20μL。
9.权利要求7所述用于检测乙肝病毒试剂盒，其特征在于：所述核酸提取试剂包括细胞裂解液450μL、磁珠混合液40μL、第一洗涤液500μL、第二洗涤液500μL和洗脱液30-120μL；
所述细胞裂解液包括2.5M异硫氰酸胍、10％曲拉通X100和15％异丙醇；
所述磁珠混合液包括超顺纳米磁性粒子、蛋白酶K、62.5copy/μL内标质粒和50％甘油；
所述第一洗涤液包括1M异硫氰酸胍和50％无水乙醇；
所述第二洗涤液包括TRIS/氯化钠和50％无水乙醇；
所述洗脱液为无DNase和RNase去离子水。

说明书全文

一种用于检测乙肝病毒的引物组、组合物及试剂盒

技术领域

[0001] 本发明涉及乙型肝炎病毒(HBV)的检测技术领域，尤其涉及一种用于检测乙肝病毒的引物组、组合物及试剂盒。

背景技术

[0002] 乙型肝炎病毒(HBV)是一种严重危害全球人类健康的感染性病毒，病毒感染呈世界性流行，我国属于乙型肝炎感染地方性流行区。急性和慢性HBV感染易引发多器官损坏，可能导致肝硬化、肝癌、肝衰竭等疾病的发生。因此，定期对乙肝感染患者体内HBV载量准确定量检测对乙型肝炎的抗病毒治疗的适应症和监控显得非常重要。

[0003] 乙型肝炎病毒核酸的定量检测除用于乙型肝炎的治疗时间和监控外，乙肝感染患者外周血中病毒载量也是抗病毒治疗目标判断的重要依据。因此，高准确度的HBV核酸定量检测具有重要的临床意义。

[0004] 目前国内大部分医疗机构普遍采用一步法定量检测试剂来监控患者外周血中的HBV病毒载量，此类试剂虽然价格便宜，操作简便，但存在准确度低，抗干扰能力差，灵敏度不足等问题。具体的，一步法定量检测试剂缺陷：无核酸提取纯化过程，外周血中的杂质难以完全去除，导致PCR过程容易发生抑制或干扰，导致无法检测等情况；不同患者外周血干扰物质浓度和种类不同(血脂、血红蛋白、治疗药物等)，导致定量的个体差异大、重复性差和准确度低；外周血不经过病毒核酸浓度过程，导致灵敏度低。

[0005] 对于中低水平的病毒载量(低于103IU/mL)容易出现无法检出或定量浓度偏差大等问题，同时中低水平的病毒载量是抗病毒治疗目标判断的关键区段。为此国内大中型医疗机构对于抗病毒治疗目标判断则主要应用进口试剂罗氏的COBAS AmpliPrep COBAS TaqMan HBV Test，该方法具有自动化、准确度高、线性范围宽、重复性好等优点，但其采用封闭式设备和试剂，费用昂贵，患者负担大等原因，导致目前难以在临床上广泛应用。临床上亦有部分高敏HBV核酸定量检测试剂，采用柱提或磁珠提取方法进行核酸浓度纯化，荧光PCR定量检测，但由于试剂存在噪音本底高，导致灵敏度低、准确度不高等问题。

[0006] 其他含提取纯化试剂的定量检测试剂缺陷：探针序列设计过长(≥25bp)使荧光基团与淬灭基团距离过大，淬灭基团无法有效吸收荧光信号，使整个反应体系本底偏高，最终导致试剂灵敏度下降，同时过长的探针序列容易使探针自身折叠，导致在退火阶段无法有效跟模板匹配，是准确度下降。由于探针TM(TM 是两段互补的碱基序列解链50％时的温度)一般与引物TM差异在5-10℃，因此相应的引物序列也在22bp以上，同时也存在引物自身折叠和模板结合受阻等问题。

发明内容

[0007] 本发明的目的在于提出一种用于检测乙肝病毒的引物组，具有定量准确度高的特点。

[0008] 本发明的另一目的在于提出一种用于检测乙肝病毒的组合物，具有定量准确度高的特点。

[0009] 本发明的另一目的在于提出一种用于检测乙肝病毒的试剂盒，具有定量准确度高的特点。

[0010] 为达此目的，本发明采用以下技术方案：

[0011] 一种用于检测乙肝病毒的引物组，包含具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的反向引物。

[0012] 进一步的，正向引物和反向引物的至少之一的核苷酸序列中的一个或多个胸腺嘧啶碱基替换为尿嘧啶碱基。

[0013] 一种包括上述的用于检测乙肝病毒的引物组的用于检测乙肝病毒的组合物，还包括靶点探针，靶点探针具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列，靶点探针的两个末端分别标记荧光基团和淬灭基团。

[0014] 进一步的，还包括内标探针，内标探针具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列，内标探针的两个末端分别标记荧光基团和淬灭基团，靶点探针和内标探针标记的荧光基团不同。

[0015] 进一步的，靶点探针和内标探针的至少之一的核苷酸序列中的一个或多个胸腺嘧啶碱基替换为尿嘧啶碱基。

[0016] 一种包括上述的用于检测乙肝病毒组合物的用于检测乙肝病毒的试剂盒，还包括PCR缓冲液、dNTPs、Taq酶、UNG酶和核酸提取试剂。

[0017] 进一步的，引物、探针、PCR缓冲液、dNTPs、Taq酶、UNG酶混合并加入无DNase和RNase纯化水成为PCR反应预混液，PCR反应预混液的配方如下：

[0018] PCR缓冲液10μL；

[0019] 100mM dNTPs(ATCGU)0.27-1.35μL；

[0020] 50μM正向引物0.25-1.5μL；

[0021] 50μM反向引物0.25-1.5μL；

[0022] 50μM靶点探针0.05-0.8μL；

[0023] 50μM内标探针0.05-0.8μL；

[0024] Taq酶0.5-1μL；

[0025] UNG酶0.02-0.15μL；

[0026] 加入无DNase和RNase纯化水至终体积20μL。

[0027] 进一步的，核酸提取试剂包括细胞裂解液450μL、磁珠混合液40μL、第一洗涤液500μL、第二洗涤液500μL和洗脱液30-120μL；

[0028] 细胞裂解液包括2.5M异硫氰酸胍、10％曲拉通X100和15％异丙醇；

[0029] 磁珠混合液包括超顺纳米磁性粒子、蛋白酶K、62.5copy/μL内标质粒和50％甘油；

[0030] 第一洗涤液包括1M异硫氰酸胍和50％无水乙醇；

[0031] 第二洗涤液包括TRIS/氯化钠和50％无水乙醇；

[0032] 洗脱液为无DNase和RNase去离子水。

[0033] 本发明的有益效果为：

[0034] 1、采用乙型肝炎病毒A-H共8个型别多个亚型生物信息学分析，在S区段保守区设定引物区段，能很好覆盖8个HBV型别和各个亚型。

[0035] 2、引物选取高CG区段，在提高序列TM值的同时能有效缩短序列长度 (≤20bp)，减少引物自身折叠，使引物有效与模板搭配；同时由于引物序列碱基的减少，使试剂定量标准品与检测样本环境差异(干扰核酸，干扰蛋白等) 的影响降到最低，引物在较宽的干扰环境下仍能保持稳定的模板结合效率进行扩增，有效提高试剂定量的准确度。

[0036] 3、采用乙型肝炎病毒A-H共8个型别多个亚型生物信息学分析，在S区段保守区设定引物探针区段，能很好覆盖8个HBV型别和各个亚型。

[0037] 4、探针选取高CG区段，由于探针长度(≤20bp)减少，减少探针自身折叠，使探针有效与模板搭配；同时探针长度缩短使淬灭基团更有效吸收荧光信号，有效降低整个反应体系的荧光本底噪音，提高试剂灵敏度和准确度。

[0038] 5、使用磁珠和蛋白酶K混合液作为试剂盒内标质粒的稀释和保存，在磁珠和蛋白酶K混合液中，由于蛋白酶K能对蛋白质类酶系进行有效的分解消化，因此内标质粒能有效避免DNA酶的降解，提高内标质粒浓度的准确性和保存的稳定性。

[0039] 6、本发明的试剂盒采用竞争性内标监控假阴性，内标采用与靶点相同的引物对序列，扩增产物长度与靶点扩增产物长度相同，同时具有相同的CG含量，因此能最大限度与靶点保持相同的扩增效率，达到最佳的监控假阴性效果。

[0040] 7、本发明的试剂盒为适应较短引物探针序列以及减少反应体系内部组分由于纯度等原因引起的干扰情况，使用最简单体系配方(PCR缓冲液、dNTPs、引物探针、去DNase和RNase纯化水、Taq酶和UNG酶)不添加任何添加物质。附图说明

[0041] 图1是本发明实施例1的各浓度模板一个复孔的扩增曲线图；

[0042] 图2是本发明实施例1中定量浓度对数与理论浓度对数的线性范围和相关系数图；

[0043] 图3是本发明实施例4中180IU/mL浓度模板其中10复孔扩增曲线图；

[0044] 图4是本发明实施例4中90IU/mL其中10复孔扩增曲线图；

[0045] 图5是本发明实施例4中45IU/mL其中10复孔扩增曲线图；

[0046] 图6是本发明实施例4中20IU/mL其中10复孔扩增曲线图；

[0047] 图7是本发明实施例5中10000IU/mL浓度20复孔精密度图；

[0048] 图8是本发明实施例5中1000IU/mL浓度20复孔精密度图；

[0049] 图9是本发明实施例5中100IU/mL浓度20复孔精密度图。

具体实施方式

[0050] 下面结合附图及具体实施方式进一步说明本发明的技术方案。

[0051] 一种用于检测乙肝病毒的引物组，包含具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的反向引物。其中，如表1 所示，SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的长度为16bp，GC％为63％；SEQ ID NO.2 所示核苷酸序列的长度为17bp，GC％为59％。

[0052] 表1

[0053]名称碱基序列(5’-3’) GC％长度
SEQ ID NO.1 GATGTGTCTGCGGCGT 63％ 16
SEQ ID NO.2 CGGGCAACATACCTTGG 59％ 17

[0054] 引物对为特异性扩增HBV S区基因。采用乙型肝炎病毒A-H共8个型别多个亚型生物信息学分析，在S区段保守区设定引物区段，能很好覆盖8个HBV 型别和各个亚型。

[0055] 引物选取高CG区段，在提高序列TM值的同时能有效缩短序列长度 (≤20bp)，减少引物自身折叠，使引物有效与模板搭配；同时由于引物序列碱基的减少，使试剂定量标准品与检测样本环境差异(干扰核酸，干扰蛋白等) 的影响降到最低，引物在较宽的干扰环境下仍能保持稳定的模板结合效率进行扩增，有效提高试剂定量的准确度。

[0056] 在其他实施方式中，正向引物和反向引物可以用本领域公知的方法进行修饰，包括甲基化、通过天然核苷类似物取代一个或多个天然核苷酸和核苷酸间的修饰、在核苷酸序列中或两端添加一个或多个核苷酸残基、基团或将序列中的一个或多个核苷酸残基替换成另外的核苷酸残基等。

[0057] 在其他实施方式中，正向引物和反向引物的至少之一的核苷酸序列中的一个或多个胸腺嘧啶碱基替换为尿嘧啶碱基。修饰后的引物对，仍具有较好的定量准确度。

[0058] 本发明还提供了一种包括上述的用于检测乙肝病毒的引物组的用于检测乙肝病毒的组合物，还包括靶点探针，靶点探针具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列，靶点探针的两个末端分别标记荧光基团和淬灭基团。其中，SEQ ID NO.3 所示核苷酸序列的长度为19bp，GC％为58％。

[0059] 采用乙型肝炎病毒A-H共8个型别多个亚型生物信息学分析，在S区段保守区设定引物探针区段，能很好覆盖8个HBV型别和各个亚型。

[0060] 探针选取高CG区段，由于探针长度(≤20bp)减少，减少探针自身折叠，使探针有效与模板搭配；同时探针长度缩短使淬灭基团更有效吸收荧光信号，有效降低整个反应体系的荧光本底噪音，提高试剂灵敏度和准确度。

[0061] 进一步的，该用于检测乙肝病毒的组合物还包括内标探针，内标探针具有 SEQ ID NO.4所示核苷酸序列，内标探针的两个末端分别标记荧光基团和淬灭基团，靶点探针和内标探针标记的荧光基团不同。其中，SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的长度为19bp，GC％为58％。

[0062] 表2

[0063]名称碱基序列(5’-3’) GC％长度
SEQ ID NO.3 CCTGCTGCTATGCCTCATC 58％ 19
SEQ ID NO.4 CGTCAGACCACTCCTACAC 58％ 19

[0064] 荧光基团可以但不限于是FAM、ROX、CY5、HEX、JOE、CY3、NED、 TAMRA、TAXAS、RED、VIC、TET中的任一种；淬灭基团可以但不限于是 BHQ、TAMRA、MGB、DABCYL中的任一种。

[0065] 靶点探针和内标探针可以用本领域公知的方法进行修饰，包括甲基化、通过天然核苷类似物取代一个或多个天然核苷酸和核苷酸间的修饰、在核苷酸序列中或两端添加一个或多个核苷酸残基、基团或将序列中的一个或多个核苷酸残基替换成另外的核苷酸残基等。

[0066] 具体的，靶点探针和内标探针的至少之一是经甲基化修饰的；靶点探针和内标探针的至少之一的核苷酸序列中的一个或多个胸腺嘧啶碱基替换为尿嘧啶碱基。修饰后的靶点探针和内标探针，仍具有较好的定量准确度。

[0067] 本发明还提供了一种包括上述的用于检测乙肝病毒组合物的用于检测乙肝病毒的试剂盒，还包括PCR缓冲液、dNTPs、Taq酶、UNG酶和核酸提取试剂。

[0068] 本发明的试剂盒为适应较短引物探针序列以及减少反应体系内部组分由于纯度等原因引起的干扰情况，使用最简单体系配方不添加任何添加物质。

[0069] 进一步的，引物、探针、PCR缓冲液、dNTPs、Taq酶、UNG酶混合并加入无DNase和RNase纯化水成为PCR反应预混液，PCR反应预混液的配方如下：

[0070] PCR缓冲液10μL；

[0071] 100mM dNTPs(ATCGU)0.27-1.35μL；

[0072] 50μM正向引物0.25-1.5μL；

[0073] 50μM反向引物0.25-1.5μL；

[0074] 50μM靶点探针0.05-0.8μL；

[0075] 50μM内标探针0.05-0.8μL；

[0076] Taq酶0.5-1μL；

[0077] UNG酶0.02-0.15μL；

[0078] 加入无DNase和RNase纯化水至终体积20μL。

[0079] 该PCR反应预混液采用最简单的体系配方，适应较短引物探针序列以及减少反应体系内部组分由于纯度等原因引起的干扰情况，保证定量的准确性。

[0080] 进一步的，核酸提取试剂包括细胞裂解液450μL、磁珠混合液40μL、第一洗涤液500μL、第二洗涤液500μL和洗脱液30-120μL；

[0081] 细胞裂解液包括2.5M异硫氰酸胍、10％曲拉通X100和15％异丙醇；

[0082] 磁珠混合液包括超顺纳米磁性粒子、蛋白酶K、62.5copy/μL内标质粒和50％甘油；

[0083] 第一洗涤液包括1M异硫氰酸胍和50％无水乙醇；

[0084] 第二洗涤液包括TRIS/氯化钠和50％无水乙醇；

[0085] 洗脱液为无DNase和RNase去离子水。

[0086] 采用上述核酸提取试剂进行核酸提取纯化的生物样本包括来自人体的组织匀浆、细胞、全血、血清、血浆、拭子浸泡液等。

[0087] 使用磁珠和蛋白酶K混合液作为试剂盒内标质粒的稀释和保存，在磁珠和蛋白酶K混合液中，由于蛋白酶K能对蛋白质类酶系进行有效的分解消化，因此内标质粒能有效避免DNA酶的降解，提高内标质粒浓度的准确性和保存的稳定性。

[0088] 实施例1

[0089] 一、试剂准备如下：

[0090] 1、国家定量标准品(National Reference Standard forHBV DNA批号： 300022-201601)。国家定量标准品浓度为1.0×108IU/mL。然后用阴性且外观澄清的血清稀释至合适的浓度。

[0091] 2、阴性质控品：阴性且外观澄清的血清。

[0092] 3、临界阳性质控品和强阳性质控品。使用阴性且外观澄清的血清对HBV 全基因组质粒进行稀释，使用可溯源至国家定量标准品的标准品进行赋值。

[0093] 4、定量标准品A-D：使用阴性且外观澄清的血清对HBV全基因组质粒进行稀释，使其浓度在107-102之间使用可溯源至国家定量标准品的标准品进行赋值。

[0094] 二、临床样品核酸提取方法。

[0095] 核酸提取步骤包括(1)-(4)，具体如下：

[0096] (1)在1.5mL离心管中加入450μL细胞裂解液、40μL磁珠混合液250μL 样本，混匀2分钟后室温静置10分钟。进行短暂离心，吸附磁珠，弃除所有溶液。

[0097] (2)加入500μL第一洗涤液，混匀2分钟后室温静置2分钟。进行短暂离心，吸附磁珠，弃除所有溶液。

[0098] (3)加入500μL第二洗涤液，混匀2分钟后室温静置2分钟。今次那个短暂离心，吸附磁珠，弃除所有溶液。

[0099] (4)室温晾干磁珠10分钟后加入80μL洗脱液，混匀2分钟后室温静置5 分钟。进行短暂离心，吸附磁珠，收集纯化好的DNA溶液。

[0100] 三、配制荧光定量PCR反应液

[0101] PCR反应液：表3

[0102]名称 1测试
PCR反应预混液 20μL
HBV DNA 30μL

[0103] PCR反应预混液配方：表4

[0104]组分名称浓度单反应用量范围
PCR缓冲液 5× 10μL
dNTPs(ATCGU) 100mM 0.27μL
正向引物 50μM 0.25μL
反向引物 50μM 0.25μL
靶点探针 50μM 0.05μL
内标探针 50μM 0.05μL
Taq酶 5U/μL 0.5μL
UNG酶 1U/μL 0.02μL
无DNase和RNase纯化水 / 加至终体积20μL

[0105] 其中，正向引物具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列；反向引物具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；靶点探针具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列；内标探针具有SEQ ID NO.4所示核苷酸序列。靶点探针的两个末端分别标记荧光基团和淬灭基团，内标探针的两个末端分别标记荧光基团和淬灭基团，靶点探针和内标探针标记的荧光基团不同。

[0106] 四、反应条件如表5所示。

[0107] 表5

[0108]

[0109] 五、试剂盒线性准确度实验

[0110] 使用阴性血清将高值临床样本(经由罗氏公司的COBAS AmpliPrep COBAS TaqMan HBV Test，Version2.0试剂盒进行定量)稀释至400000000IU/mL、 200000000IU/mL、20000000IU/mL、2000000IU/mL、200000IU/mL、20000IU/mL、 2000IU/mL、200IU/mL、100IU/mL、50IU/mL、20IU/mL、15IU/mL、7.5IU/mL，每个浓度做3个重复，通过以下标准判断结果的准确度：样本定量浓度绝对偏差不超过±0.3log，浓度对数CV％不超过10％。

[0111] 表6

[0112]

[0113]

[0114] 表6中：B＝︱M-T︱；B：绝对偏差；M：实测浓度对数；T：理论浓度对数。结果如表6所示，线性范围内20至4×108IU/mL浓度对数绝对偏差均不超过±0.3log，且各浓度CV％均不大于10％。

[0115] 图1为400000000IU/mL、200000000IU/mL、20000000IU/mL、2000000IU/mL、 200000IU/mL、20000IU/mL、2000IU/mL、200IU/mL、100IU/mL、50IU/mL、 20IU/mL、15IU/mL、
7.5IU/mL模板，每个浓度3个复孔，其中每个浓度一个复孔的扩增曲线图。从图1可以看出，各浓度模板有较好的扩增速度。

[0116] 图2是定量浓度对数与理论浓度对数的线性范围和相关系数，从图2上看定量浓度对数与理论浓度对数有良好的线性关系。

[0117] 由此可知，采用本实施例的试剂盒进行样本定量检测准确度高。

[0118] 实施例2

[0119] 本实施例的PCR反应液配方如表7所示。

[0120] 表7

[0121]组分名称浓度单反应用量范围
PCR缓冲液 5× 10μL
dNTPs(ATCGU) 100mM 0.81μL
正向引物 50μM 0.875μL
反向引物 50μM 0.875μL
靶点探针 50μM 0.4μL
内标探针 50μM 0.4μL
Taq酶 5U/μL 0.75μL
UNG酶 1U/μL 0.15μL
无DNase和RNase纯化水 / 加至终体积20μL
HBV DNA / 30μL
total / 50μL

[0122] 使用实施例1中的方法荧光定量PCR检测使用阴性血清将高值临床样本(经由罗氏公司的COBAS AmpliPrep COBAS TaqMan HBV Test，Version2.0试剂盒进行定量)稀释至400000000IU/mL、200000000IU/mL、20000000IU/mL、 2000000IU/mL、200000IU/mL、20000IU/mL、2000IU/mL、200IU/mL、100IU/mL、 50IU/mL、20IU/mL、15IU/mL、7.5IU/mL，每个浓度做3个重复。通过以下标准判断结果的准确度：样本定量浓度绝对偏差不超过±
0.3log，浓度对数CV％不超过10％。

[0123] 表8

[0124]

[0125]

[0126] 表8中：B＝︱M-T︱；B：绝对偏差；M：实测浓度对数；T：理论浓度对数。结果如表8所示，线性范围内20至4×108IU/mL浓度对数绝对偏差均不超过±0.3log，且各浓度CV％均不大于10％。由此可知，采用本实施例的试剂盒进行样本定量检测准确度高。

[0127] 实施例3

[0128] 本实施例的PCR反应液配方如表9所示。

[0129] 表9

[0130]组分名称浓度单反应用量范围
PCR缓冲液 5× 10μL
dNTPs(ATCGU) 100mM 1.35μL
正向引物 50μM 1.5μL
反向引物 50μM 1.5μL
靶点探针 50μM 0.8μL
内标探针 50μM 0.8μL
Taq酶 5U/μL 1μL
UNG酶 1U/μL 0.15μL
无DNase和RNase纯化水 / 加至终体积20μL
HBV DNA / 30μL
total / 50μL

[0131] 使用实施例1中的方法荧光定量PCR检测使用阴性血清将高值临床样本(经由罗氏公司的COBAS AmpliPrep COBAS TaqMan HBV Test，Version2.0试剂盒进行定量)稀释至400000000IU/mL、200000000IU/mL、20000000IU/mL、 2000000IU/mL、200000IU/mL、20000IU/mL、2000IU/mL、200IU/mL、100IU/mL、 50IU/mL、20IU/mL、15IU/mL、7.5IU/mL，每个浓度做3个重复。通过以下标准判断结果的准确度：样本定量浓度绝对偏差不超过±
0.3log，浓度对数CV％不超过10％。

[0132] 表10

[0133]

[0134]

[0135] 表10中：B＝︱M-T︱；B：绝对偏差；M：实测浓度对数；T：理论浓度对数。结果如表10所示，线性范围内20至4×108IU/mL浓度对数绝对偏差均不超过±0.3log，且各浓度CV％均不大于10％。由此可知，采用本实施例的试剂盒进行样本定量检测准确度高。

[0136] 实施例4确定试剂盒定量限(LOQ)和最低检出量(LOD)

[0137] 本实施例的PCR反应液配方如表11所示。

[0138] 表11

[0139]组分名称浓度单反应用量范围
PCR缓冲液 5× 10μL
dNTPs(ATCGU) 100mM 0.72μL
正向引物 50μM 1μL
反向引物 50μM 1μL
靶点探针 50μM 0.2μL
内标探针 50μM 0.2μL
Taq酶 5U/μL 0.75μL
UNG酶 1U/μL 0.08μL
无DNase和RNase纯化水 / 加至终体积20μL
HBV DNA / 30μL
total / 50μL

[0140] 使用实施例1中的方法荧光定量PCR检测使用阴性血清将HBV DNA国家定量标准品稀释至180IU/mL、90IU/mL、45IU/mL、20IU/mL、15IU/mL、7.5IU/mL，每个浓度做25个重复。通过以下标准判断结果的准确度：样本定量浓度绝对偏差不超过±0.3log，浓度对数CV％不超过10％。

[0141] 表12

[0142]

[0143]

[0144]

[0145]

[0146]

[0147] 表12中：B＝︱M-T︱；B：绝对偏差；M：实测浓度对数；T：理论浓度对数。结果如表128
所示，线性范围内20至4×10IU/mL浓度对数绝对偏差均不超过±0.3log，且各浓度CV％均不大于10％。

[0148] 表13

[0149]

[0150] 由表13可知，本实施例的试剂盒的定量限(LOQ)为20IU/mL，最低检出量(LOD)低于7.5IU/mL。

[0151] 图3-6分别为180IU/mL、90IU/mL、45IU/mL、20IU/mL浓度模板的10复孔扩增曲线图，可知各浓度模板有较好的扩增速度，多次复孔有很好的稳定性。

[0152] 实施例5试剂盒精密度实验

[0153] 本实施例的PCR反应液配方如表14所示。

[0154] 表14

[0155]

[0156]

[0157] 使用实施例1中的方法荧光定量PCR检测使用阴性血清将HBV DNA国家定量标准品稀释至10000IU/mL、1000IU/mL、100IU/mL，每个浓度做20个重复，计算每个浓度样本的定量检出结果对数值的平均值，并计算每个浓度样本的精密度。通过以下标准判断结果的准确度：同一浓度样本检测结果对数值的变异系数(CV)不高于5％。

[0158] 表15

[0159]

[0160] 表15中， C.V：变异系数；SD：标准偏差；实测浓度对数的平均数。结果如表15所示，三个浓度的样本变异系数(CV)均小于5％，说明体系具有较好的检测精密度。图7-9分别是10000IU/mL、1000IU/mL、 100IU/mL浓度20复孔精密度。

[0161] 实施例6本发明的试剂盒精密度实验

[0162] 本实施例的PCR反应液配方如表16所示。

[0163] 表16

[0164]组分名称浓度单反应用量范围
PCR缓冲液 5× 10μL
dNTPs(ATCGU) 100mM 1.35μL
正向引物 50μM 1.5μL
反向引物 50μM 1.5μL
靶点探针 50μM 0.8μL
内标探针 50μM 0.8μL
Taq酶 5U/μL 1μL
UNG酶 1U/μL 0.15μL
无DNase和RNase纯化水 / 加至终体积20μL
HBV DNA / 30μL
total / 50μL

[0165] 使用实施例1中的方法荧光定量PCR检测使用阴性血清将HBV DNA国家定量标准品稀释至10000IU/mL、1000IU/mL、100IU/mL，每个浓度做20个重复，计算每个浓度样本的定量检出结果对数值的平均值，并计算每个浓度样本的精密度。通过以下标准判断结果的准确度：同一浓度样本检测结果对数值的变异系数(CV)不高于5％。

[0166] 表17

[0167]

[0168] 表17中， C.V：变异系数；SD：标准偏差；实测浓度对数的平均数。结果如表17所示，三个浓度的样本变异系数(CV)均小于5％，说明体系具有较好的检测精密度。

[0169] 以上结合具体实施例描述了本发明的技术原理。这些描述只是为了解释本发明的原理，而不能以任何方式解释为对本发明保护范围的限制。基于此处的解释，本领域的技术人员不需要付出创造性的劳动即可联想到本发明的其它具体实施方式，这些方式都将落入本发明的保护范围之内。

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