向肺部系统中递送治疗剂已被用于治疗局部的肺病，如哮喘、囊肿 性纤维化、慢性阻塞性肺疾病(参见文献A.J.Hickey编著，Inhalation Aerosols：Physical and Biological Basis for Therapy，纽约：Marcel Dekker 公司，1996)。与口服或注射方式的系统给药相比，将呼吸道药物局部 递送至肺部具有优势，这是因为其：(1)需要较小的药物剂量；并且 (2)通过将药物直接递送至患病部位而使全身毒性降至最低程度。人 们对全身性作用药剂的递送方式也进行了研究，如Patton等人在文献 “Inhaled insulin”，Adv.Drug.Deliv.Rev.35，第235-247页(1999年) 中所述的用于蛋白质和多肽(例如，胰岛素)给药的方式。
然而，药物的肺部递送受限于几个主要的问题，这些问题包括：药 物在呼吸道内的沉积效率较差和药物被口咽腔过量除去，难以对药物在 呼吸道的沉积部位进行控制，由于患者的呼吸模式不同而导致给药剂量 的重现性较差以及药物从肺部系统内被过快地清除和/或吸收，这些问 题可能导致靶部位的药物浓度不合适，甚至产生毒性作用。
用于将药物局部递送到肺部的控释递送系统能够提供一种非常有 利的方法，从而有效地治疗呼吸系统疾病和全身性疾病。此外，呼吸道 药物的控制释放通过以下方式可使数百万患有呼吸道疾病的患者在临 床上显著受益，所述方式为：使得这些患者不用频繁地接受诸如哮喘等 疾病的治疗，并且使患者的病情缓解期限得以延长和控制。药物在肺部 中的控制释放还通过调节速释药物的峰值和谷值(其可造成毒性的增加 或效力的降低)而为改善安全性提供了潜在的可能。另外，对两种或多 种治疗剂从被递送至肺部系统的单一一种颗粒体系中的释放进行控制， 对于药剂在呼吸道内的共同定位具有显著的优势。这样便会显著提高药 物间的协同作用或加合作用的可能性。
目前可用于肺部给药的系统并不理想，从而使这些系统的给药剂量 并不准确，需要频繁服药，并在给药过程中损失大量药物。大部分通过 吸入给药的哮喘用药物为速释制剂，其必须每天多次吸入(参见文献 Cochrane等，Inhaled Corticosteroids for Asthma Therapy：Patient Compliance，Devices，and Inhalation Technique Chest.117，542-550页， 2000年)。这种频繁吸入的给药方式易于降低患者的顺应性。当患者 忘记服用他们的药物时，他们可能会遭受并发症，这可能导致他们被送 入急诊室和住院的次数增加。在最近公布的患者对哮喘药物的顺应性研 究的分析中，患者每天仅仅服用建议药物剂量的20％至73％(参见文献 Cochrane等，Inhaled Corticosteroids for Asthma Therapy：Patient Compliance，Devices，and Inhalation Technique Chest.117，542-550页， 2000年)。减量用药的天数的百分比为24％至69％。此外，速释制剂 通常释放产生峰值和峰谷的药物浓度水平，从而造成不利的毒性作用或 效力不足。
虽然吸入型制剂具有潜力，但是其在在更长时间内保持肺内的有效 浓度方面面临艰巨的挑战。造成肺部给药后药物作用持续时间较短的因 素包括：(1)黏液纤毛的清除速率较快(约1.7mm/分钟-4.9mm/分钟)， 从而导致吸入的颗粒的半衰期极短(约0.5小时-2小时)(参见文献 Lansley，A.B.，1993.Mucociliary clearance and drug delivery via the respiratory tract.Adv Drug Del Rev.11，299-327)；(2)肺泡巨噬细胞 使得颗粒被吞噬；以及(3)药物分子(Mw<1000Da)被快速吸收至 全身循环中，其平均吸收半衰期<2小时。
肺部区域具有几种颗粒清除机制。各清除机制的相对重要性随着颗 粒的物理化学性质而改变。颗粒在肺部区域中的保留时间要比在具有纤 毛的呼吸道中的保留时间长。在沉积后，肺泡巨噬细胞对颗粒的摄取非 常迅速。最初的快速清除阶段与肺泡巨噬细胞所致的吞噬作用有关。
可用于避开呼吸道自发性清除机制的技术是有限的，而所述的清除 机制在很大程度上抑制了缓释型颗粒发挥作用。多篇现有的技术文献描 述了被设计为具有低密度的颗粒(大的多孔颗粒)，所述文献包括(但 不限于)美国专利No.6,136,295(Edward等)和6,730,322(Bernstein 等)。尽管这些颗粒的几何体积较大，但其空气动力学体积要小得多。
一般来说，为了达到缓释的目的，必须将颗粒递送至气道内，并避 免黏膜纤毛的清除、被肺泡巨噬细胞摄取并防止其被肺部快速吸收。可 通过避免颗粒沉积在具有纤毛上皮细胞的气管支气管区域来避免黏膜 纤毛的清除。一般来说，为了达到这一目的，颗粒的空气动力学粒径必 须小于约5μm。一旦颗粒沉积于不存在黏膜纤毛清除机制的外围气道 中，颗粒必须避免可快速清除治疗化合物的肺泡巨噬细胞的摄取。可通 过如下方式避开巨噬细胞，所述方法为：(1)制备不会被视为外来微 粒的颗粒(隐形颗粒)；(2)提供物理尺寸足够大而不能被巨噬细胞 吞噬的颗粒或提供被延迟吞噬的颗粒；或者(3)提供尺寸足够小而不 会被巨噬细胞识别的颗粒(纳米颗粒)。
如所引用的现有技术文献所述，目前的肺部缓释系统通常包括较大 的多孔颗粒技术。这些系统的主要问题在于：颗粒基质中的可载药量较 低，包含在这些颗粒系统中的药物需要具有特定的物理化学性质，并且 药物持续释放的时间有限。本发明通过使用溶胀性颗粒来改善持续释 放，从而克服了这些问题。本发明的溶胀性颗粒包括在具有生物相容性 的、可溶胀的生物降解性基质之上或之内被递送的药物或其他作用剂 (working agent)，其中所述的基质优选能够递送至较深的肺部，并避 免被肺泡巨噬细胞清除。此外，可对基质材料加以改性，以调节药物的 释放性质，或改善药物与基质体系的相容性。

本发明提供经改善的用于递送至肺部系统的可溶胀颗粒，本发明还 涉及作用剂的引入方法和施用方法，所述作用剂例如包括(但不限于) 治疗剂、诊断剂、预防剂或成像剂。所述的可溶胀颗粒具有能够将颗粒 递送至呼吸道(例如，递送至上呼吸道的气管支气管气道和/或深肺部 的气泡区域)内的脱水(干态)空气动力学粒径；并且其水化后的体均 直径大于6μm，以延迟或防止其被存在于呼吸道气道内的巨噬细胞所 吞噬。
在本发明的示例性实施方案中，脱水(干态)颗粒由可生物降解的 材料制成，其质量中值空气动力学粒径为0.5μm至5μm，并且其能够 溶胀至水化后的几何粒径(体均直径)为大于6μm。在本发明的优选 实施方案中，至少90％的颗粒、更优选95％至99％的颗粒的空气动力 学直径不超过5μm，并且其溶胀后的体均直径超过6μm。这些颗粒可 以由可生物降解材料形成，所述可生物降解材料包括(但不限于)：可 生物降解的天然聚合物或合成聚合物、蛋白质、碳水化合物或其组合。 例如，所述颗粒可由多支链聚乙二醇水凝胶聚合物形成。其他例子包括 由可生物降解聚合物形成的颗粒，所述可生物降解聚合物例如为葡聚 糖、丙烯酸羟乙基甲酯或其他具有生物相容性的、可溶胀的生物降解性 聚合物体系。可使用所述的可溶胀颗粒来增强将一种或多种作用剂递送 至呼吸道气道内，包括递送至肺部的肺泡区域内。含有一种或多种作用 剂的颗粒可被有效地雾化，以将其施用至呼吸道内，从而能够将多种治 疗剂和其他药剂进行全身递送或局部递送。可任选的是，可将这些颗粒 与较大的载体颗粒(未载有治疗剂或其他药剂)共同递送，其中所述较 大的载体颗粒的平均直径例如为约50μm至150μm。
本发明的优点在于脱水后(干态)的颗粒具有这样的空气动力学直 径，其使得：a)这些颗粒能够到达呼吸道的一个或多个靶区域，包括 到达上呼吸道的气管支气管气道和/或深肺部的气泡区域；b)这些颗 粒能够递送有效载量的一种或多种作用剂，而不会发生过早释放；c) 这些颗粒在气道内可通过水化作用而溶胀至能够延迟或防止其被巨噬 细胞摄取或清除的尺寸；以及d)这些颗粒可在水化之后以可预测的 速率使得一种或多种作用剂进行控制释放。
本发明的其他特征和优点通过下面的详细描述是显而易见的。
发明详述
本发明提供一种可溶胀的生物降解性颗粒，以用于改善将治疗剂和 其他作用剂递送至呼吸道内。可通过所述颗粒而被递送的作用剂包括 (但不限于)：治疗剂、诊断剂、预防剂、成像剂或其组合。
在本发明的示例性实施方案中，可溶胀颗粒最初包含这样的脱水 (干态)粉末颗粒，该颗粒的质量中值空气动力学粒径为5μm或更小， 以能够将该颗粒递送至呼吸道(例如，递送至上呼吸道的气管支气管气 道和/或深肺部的气泡区域)内，并且其水化后的体均粒径大于6μm， 以延迟或防止它们被存在于呼吸道气道内的巨噬细胞所吞噬。脱水(干 态)颗粒的质量中值空气动力学直径通常为0.5μm至5μm，并且其通 常能够溶胀至水化后的体均粒径为大于6μm至50μm。至少90％的颗 粒、更优选90％至95％的颗粒的空气动力学直径为5μm或更小，并且 其溶胀至体均粒径大于6μm的尺寸。
质量中值空气动力学直径(MMAD)通常通过常规的气溶胶粒度 分析仪获得，所述的气溶胶粒度分析仪例如为级联冲击器和/或飞行时 间谱仪，如TSI Aerodynamic Particles Sizer(得自TSI Incorporated公司， Shoreview，明尼苏达州)。在以空气动力学粒径来分类颗粒时，在50 质量％的颗粒小于该直径(即MMAD)的情况下进行上述粒度的测量。 即，50质量％的颗粒直径小于MMAD，而且50质量％的颗粒的直径大 于MMAD。这种粒度的测量方法将所测定的颗粒(其可具有不同的密 度、形状、表面以及空气动力学阻力)转化为密度等于1的球体，并且 提供球体等效直径，即使在颗粒可能为片状、针状或其他非球体形状时 也是如此。例如，空气动力学直径被定义为密度是1g/cm3(水滴的密 度)、并且与该颗粒具有相同的沉降速率的球体的直径，该空气动力学 直径可由下面的方程式表示(参见文献Hinds，W.I.，“Uniform Particle Motion”，in Aerosol Technology 1999，第42-74页，John Wiley and Sons 公司)：da＝dp(ρp)1/2，其中dp为颗粒直径，ρp是以g/cm3为单位的密度。 空气动力学直径可被视作具有与颗粒相同的空气动力学性质的球形水 滴的直径。例如，如果颗粒的空气动力学直径为1μm，则无论该颗粒 的实际尺寸、形状或密度如何，在空气动力学上其行为与1μm的水滴 是相同的。通过调节气溶胶群的中位直径和密度，可将颗粒调节为具有 将其递送至特定肺部区域所需的精确的空气动力学直径。样品中的可溶 胀颗粒的直径可随着诸如颗粒组成以及合成方法等因素而改变。可对样 品中颗粒的粒度分布加以选择，以便能够使颗粒在呼吸道内的靶部位处 的沉积达到最佳。
球体等效直径使得人们能够直接比较具有不同颗粒几何形状的颗 粒，并且只需根据空气动力学即可进行比较，其中所述的空气动力学是 对于将颗粒递送至呼吸道内来说重要的功能性尺寸特征。选择MMAD 以对脱水(干态)颗粒进行描述，因为其可用于预测干态粉末颗粒在呼 吸道内的沉积行为。
体均直径用来描述水化后的颗粒，这是因为颗粒在呼吸道中发生水 化之后，其尺寸会发生溶胀。无论颗粒形状如何，其体均直径在由干态 转化至水化状态时会增加。体均直径也是球体等效直径，因此即使在颗 粒可能为片状、针状、或其他非球体形状时，也可将所测量的颗粒转化 为等效体积的球体。就功能性而言，颗粒的体积是重要的，这是因为颗 粒体积与呼吸道内的巨噬细胞能够多大程度地清除颗粒有关；即，颗粒 体积对于延迟或避免呼吸道的清除机制而言是重要的。可按照如下方法 进行试验来确定体均直径，所述方法为：使用分散于缓冲液中的水凝胶 颗粒，可以使用激光散射仪来测量在发生水化时颗粒几何形状的体积直 径的改变。也可使用低能量液体分散用附加装置将颗粒聚集降低至最小 程度。可供选用的另外一种方式是，可通过共聚焦显微镜对颗粒溶胀进 行定量。
可溶胀颗粒可由任何可生物降解的、并优选为具有生物相容性的聚 合物、共聚物或共混物形成，这些材料能够形成质量中值空气动力学直 径为0.5μm至5μm的颗粒，但是该颗粒还能够溶胀至其几何直径超过 6μm(体均直径)。出于解释而并非进行限制的目的，可以由可溶胀的 生物降解性天然聚合物、合成聚合物、蛋白质、碳水化合物或其组合来 形成所述颗粒。例如，可由多支链聚乙二醇(PEG)水凝胶聚合物来形 成所述颗粒。其他例子包括由可生物降解的聚合物形成的颗粒，所述可 生物降解的聚合物例如为葡聚糖、丙烯酸羟乙基甲酯或其他的具有生物 相容性的、可溶胀的生物降解性聚合物体系。
出于进一步解释而并非进行限制的目的，也可由容积溶蚀性(bulk eroding)水凝胶聚合物来制备可溶胀颗粒，如在本发明的实践中可使用 基于聚酯(其包括聚羟酸)的那些溶剂溶蚀性水凝胶聚合物。此外，可 使用诸如聚酸酐等表面溶蚀性聚合物来形成溶胀性颗粒。例如，可使用 诸如聚[(对羧基苯氧基)-己烷酸酐](PCPH)之类的聚酸酐。例如，可 使用聚乙醇酸(PGA)或聚乳酸(PLA)或其共聚物来形成可溶胀的颗 粒，其中所述聚酯已在其内结合有带电基团或官能性基团，如下述的氨 基酸。其他聚合物包括聚酰胺、聚碳酸酯、聚亚烷基类(如聚乙烯、聚 丙烯、聚环氧乙烷、聚对苯二甲酸乙二醇酯)、聚乙烯基化合物(如聚 乙烯醇、聚乙烯基醚和聚乙烯基酯)、丙烯酸和甲基丙烯酸的聚合物、 纤维素和其他多糖、以及多肽或蛋白质、或它们的共聚物或共混物，这 些物质能够形成如上所述的可溶胀颗粒。可对聚合物进行选择或改性， 以使其针对不同的控制给药应用而在体内具有合适的稳定性和降解速 率。
可溶胀颗粒的特征(这些特征有助于溶胀)包括聚合物的交联度、 单体尺寸以及孔隙率。粗糙的颗粒表面结构也可以降低颗粒的聚集，并 且提供高度流动性的粉末，这对于通过干粉吸入装置进行雾化是有利 的，从而能够减少颗粒在嘴中、喉咙内以及吸入装置内的沉积。此外， 通过雾化将可溶胀颗粒施用至肺部，可将治疗用气溶胶递送于肺部深处 (在此，颗粒可在气道表面上水化之后发生溶胀)。为了在给药系统中 起到有效的药物载体的作用，可溶胀颗粒优选为具有生物降解性和生物 相容性，并且可任选的是，其能够针对药物的递送而以可控的速率进行 生物降解。
在本发明的示例性实施方案中，如文献Hubbel等，Journal of Controlled Release 76：11-25(2001)所述的那样，可生物降解和/或具有 生物相容性的水凝胶颗粒由与二硫苏糖醇交联的丙烯酸酯化8-臂PEG (20kDa)形成，其教导以引用的方式被并入本文。对丙烯酸酯化聚合 物进行交联的可供选用的其他方法包括光聚合法、其他共价交联法(聚 半胱氨酸)、离子交联法以及物理交联法(高度支化聚合物与高分子量 聚合物之间的缠结)。
在合成时，反应物的分子量、支化度(例如8-臂至4-臂)以及浓 度均可改变，以改变水凝胶的孔隙大小，由此调节治疗剂在聚合物基质 中的释放速率。
可供选用的另外一种方式是，生物相容性水凝胶颗粒可由多种聚合 物分子形成，即形成共聚物水凝胶，其被选择为赋予对系统具有特定的、 有利的性质。在一个优选的实施方案中，水凝胶由重复单元为聚乳酸 (PLA)和聚乙二醇的嵌段共聚物结构构成。PLA提供可快速水解的酯 键，而PEG骨架防止聚合物的快速水解，并防止蛋白质被吸附在水凝 胶的表面上以及随后被免疫系统除去。
可使用多种颗粒形成方法来制备具有多种颗粒形状的可溶胀颗粒。 例如，可使用喷雾干燥法、溶剂蒸发法、聚合物微粉化法以及其他本领 域的普通技术人员熟知的方法来制备溶胀性聚合物颗粒。包含水凝胶的 可溶胀颗粒可在水相与非水相的乳化过程中合成，从而形成水凝胶微 球，该水凝胶微球的尺寸可通过改变乳化参数(例如非水相的组成、反 应物浓度、混合速率和引入乳液中的剪切力、表面活性剂的存在及表面 活性剂类型等)来调节。也可在喷雾过程中合成包含水凝胶的可溶胀颗 粒，使得在分散成为液滴的同时形成水凝胶颗粒并交联。可供选用的另 外一种方式是，可合成得到盘状、球状、立方体状、不规则形状、薄膜 状的水凝胶，然后利用研磨和微粉化方法将其破碎(粉碎)成为小的可 吸入的、可溶胀的颗粒。粉碎后的颗粒可以是片状、针状、或其他非球 形的形状。
例如，可使用旋转叶片式粉碎机(M 20 Universal mill，Werke GmbH，德国)将所制备的干态水凝胶破碎成为大颗粒。随后可使用流 能磨(其利用冲击气体射流来将材料微细化)将颗粒的尺寸减小，从而 得到适于吸入的窄分散的微米尺寸颗粒。可通过流能磨的参数(气压) 来控制所得材料的颗粒尺寸，并且还可使用空气分级器将其分离。可使 用Sympatec Helos激光衍射仪以及常规的级联式撞击技术来测定颗粒 尺寸。与未经研磨的颗粒相比，经研磨的颗粒由于可用于水吸收的表面 积得到增加而表现出更快的溶胀速率。
可通过(例如)筛选法或空气分离法来制造或分离可溶胀颗粒，从 而提供具有预选尺寸分布的颗粒样品以获得干粉状态的所需MMAD。 如上所述，对一定百分比的颗粒必须落入的选择范围进行控制，使得至 少90％、或者甚至更优选为95％或99％的颗粒的空气动力学直径为0.5 μm至5μm。
制备可溶胀颗粒的具体方法由水化薄膜或水凝胶体开始，随后可将 其加工，以降低其颗粒尺寸并微粉化。例如，可通过微细的小孔或筛眼 将水化薄膜或水凝胶体挤出，以降低其颗粒尺寸。随后可将颗粒脱水。 可供选用的另外一种方式是，可在对水凝胶薄膜进行脱水后再制备颗 粒。使用诸如真空炉干燥法、冻干法、通过挥发进行的溶剂置换法等方 法来进行脱水。可使用旋转叶片式粉碎机(M 20 Universal mill， Werke GmbH，德国)将干态的水凝胶破碎成为颗粒。随后可使用流能 磨(其利用冲击气体射流来将材料微细化)将颗粒的尺寸减小，从而得 到适于吸入的窄分散的微米尺寸颗粒。
可使用可溶胀颗粒来增强将一种或多种作用剂递送至呼吸道的气 道(包括肺部的肺泡区域)内。可以有效地将含有一种或多种作用剂的 颗粒雾化，以将其施用至呼吸道内，从而可以将多种治疗剂进行全身给 药或局部给药。例如，所吸入的气溶胶的粒度是颗粒在气道内的沉积模 式的首要决定因素。可任选的是，可将这些颗粒与更大的载体颗粒(即， 未载有作用剂的颗粒)共同递送，其中所述更大的载体颗粒的平均直径 例如为约50μm至150μm。
可采用多种方法将治疗剂或其他作用剂引入到颗粒中。例如，可通 过如下方式将作用剂包合/引入到包含本文所述的水凝胶的颗粒中，所 述方式为：将作用剂包封于水凝胶聚合物网络内，以便以具体所需的速 率控制药物(或其他作用剂)从颗粒中的释放。可通过以下方式进行包 封，所述方式为：在作用剂(例如药物)的存在下将聚合物进行交联， 使得作用剂(例如，药物)被包封在形成了水凝胶网络的聚合物网络中。 还可通过以下方式进行包封，所述方式为：先将聚合物进行交联，然后 在作用剂(例如，药物)的存在下放置水凝胶，使得通过作用剂扩散至 水凝胶内而将其包封于聚合物网络中。另外，由于可通过不同的负载方 式或使用相同的方法来获得有利的释放速率，因此可使用相同或不同的 方法将多种作用剂(例如，药物)负载于相同的可溶胀颗粒中。
待负载于可溶胀水凝胶颗粒中的治疗剂(或其他作用剂)可采用多 种形式，其包括：分散于溶液中的药物，使得该药物在整个水凝胶颗粒 中处于分子分散状态；分散在整个水凝胶颗粒中的悬浮液、胶体分散液、 纳米颗粒体系中的药物；或者分散在整个水凝胶颗粒中的脂质体、脂质 分散体、纳米胶囊、聚合物纳米颗粒等中的药物。
出于进一步解释而并非进行限制的目的，可通过如下方法将治疗剂 (或其他作用剂)引入颗粒中，所述方法为：
a)将治疗剂包覆于纳米颗粒中，并将纳米颗粒置于所述颗粒内。 例如，可将布洛芬包覆于直径为200nm至400nm的卵磷脂(磷脂酰胆 碱)的纳米颗粒中。可使用文献Chen等，2002(Chen，X.，Young，T.J.， Sarkari，M.，Williams，R.O.，Johnston，K.P.，Preparation of cyclosporine A nanoparticles by evaporative precipitation into aqueous solution， International Journal of Pharmaceutics 242，(2002)3-14)中的方法来制备 纳米颗粒。可通过将纳米颗粒物理包封在水凝胶网络中(通过在纳米颗 粒的存在下、在20kDa的8-臂丙烯酸酯化PEG与二硫苏糖醇的反应溶 液中进行交联反应而实现，如下文针对示例性实施方案所述的那样)而 将其引入可溶胀颗粒中。可根据纳米颗粒的相对尺寸、亲水性、离子特 性和扩散系数对纳米颗粒进行设计，以使其从可溶胀颗粒释放的速率不 同。
b)将分子直接包覆在可溶胀颗粒的聚合物网络(例如PEG水凝胶 网络)的基质内。例如，可在20kDa的8-臂丙烯酸酯化PEG与二硫苏 糖醇的交联反应(如下文针对示例性实施方案所述的那样)过程中，将 若丹明治疗剂包封于聚合物网络(PEG水凝胶网络)中。
c)通过化学相互作用(共价键、离子键和氢键)将治疗剂连接在 聚合物网络本身(PEG水凝胶网络)上。例如，可通过N-乙酰半胱氨 酸上的硫醇基团和二硫苏糖醇上的一个硫醇基团与二硫苏糖醇(其与聚 合物网络的丙烯酸酯基团相连)上的其他硫醇基团之间的共价键，将 N-乙酰半胱氨酸黏液溶解剂连接在与二硫苏糖醇交联的8-臂丙烯酸酯 化PEG的聚合物网络上。N-乙酰半胱氨酸黏液溶解剂能够可逆地与颗 粒的水凝胶网络共价键合，使得N-乙酰半胱氨酸可通过使相邻的半胱 氨酸残基间形成的二硫键断裂而起到降低黏液粘性的作用。由于二硫键 在半胱氨酸残基间转移，因此很容易使黏液的二硫键断裂。这有助于使 黏液溶解剂在水凝胶颗粒结构附近的释放得到延长和定位，从而增加其 通过CF黏液环境的转运速率。
借助这些包覆方法，可将多种治疗剂和其他作用剂(包括小的亲水 性作用剂至大的疏水性作用剂)引入可溶胀颗粒中，以对囊肿性纤维化、 肺癌、哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、急性支气管炎、肺气肿、肺 结核或全身性疾病进行雾化治疗。例如，已经实现了在聚合过程中或在 制成颗粒之后，将若丹明治疗剂负载于本文所述的PEG水凝胶颗粒中。 可使用这两种方法来获得高载药量。例如，在从水凝胶颗粒上洗去表面 的药物之后所存在的若丹明治疗剂的含量为约35％(重量/重量)。
可将多种治疗剂、预防剂、诊断剂、成像剂(如放射性同位素)或 其他活性作用剂引入可溶胀颗粒中。可使用可溶胀颗粒来将各种治疗剂 局部地或系统地递送至呼吸道内。作用剂的例子包括：合成的无机化合 物和有机化合物、蛋白质和多肽、多糖和其他糖、脂质以及具有治疗、 预防、诊断或成像活性的核酸序列。核酸序列包括基因、反义分子(其 与互补DNA相结合以抑制转录)以及核酶。待引入的作用剂可具有多 种生物活性，如血管活性剂、神经活性剂、激素、抗凝血剂、免疫调节 剂、细胞毒性剂、预防剂、抗生素、抗病毒剂、反义剂、抗原以及抗体。 在一些情况中，蛋白质可以是抗体或抗原，否则这些抗体或抗原必须通 过注射进行施用，以引起适当的反应。可包覆的化合物的分子量范围很 广，例如其分子量可为100克/摩尔至500,000克/摩尔。
蛋白质被定义为包含100个或更多个氨基酸残基；多肽所包含的氨 基酸残基数目小于100个。除非另有说明，否则术语蛋白质既表示蛋白 质，又表示多肽。其例子包括胰岛素和其他激素。也可施用多糖，如肝 素。
可溶胀的聚合物气溶胶可用作多种吸入治疗剂的载体。这些可溶胀 的聚合物气溶胶可用于包覆较小的药物和较大的药物，可在数小时至数 月的一段时间内释放被包封的药物，并可在雾化时或在肺部沉积之后承 受极端的环境(否则，其可能会损害所包覆的药物)。
例如，可溶胀的颗粒可包含用于在肺部局部给药的治疗剂(如用于 治疗哮喘、肺气肿或囊肿性纤维化的药剂)或用于全身性治疗的药剂。 例如，可施用用于治疗诸如囊肿性纤维化等疾病的基因，也可施用治疗 哮喘所用的β-激动剂。其他具体的治疗剂包括(但不限于)：胰岛素、 降血钙素、亮丙瑞林(或者LHRH)、G-CSF、甲状旁腺激素相关性多 肽、生长抑素、睾丸素、黄体酮、雌二醇、烟碱、芬太尼、炔诺酮、可 乐定、东莨菪碱、水杨酸盐、色甘酸钠、沙美特罗、福莫特罗、沙丁胺 醇以及安定。
可将含有治疗剂的颗粒单独施用，或包含在任何合适的药用载体 (例如，通常用于粉末型吸入剂中的惰性糖颗粒体系)中，以将其施用 至呼吸系统内。可将上述颗粒与质均直径为(例如)50μm至150μm 的大载体颗粒(其不含有治疗剂)共同递送。
可按照以下文献中所述的那样，针对具体的治疗应用来选择气溶胶 的剂量、配方以及递送系统，所述文献例如为Gonda，I.的“Aerosols for delivery of therapeutic and diagnostic agent to the respiratory tract” (Critical Reviews in Therapeutic Drug arrier Systems，6：273-313，1990) 和Moren的“Aerosol dosage，forms and formulations”(Aerosols in Medicine.Principles，Diagnosis and Therapy，Moren等人，Eds，Esevier， Amsterdam，1985)，其内容以引用的方式被并入本文。
沉积于肺部深处的尺寸相对较大的已溶胀的气溶胶颗粒会最大程 度地降低由颗粒吞噬所造成的潜在药物损耗。可溶胀的聚合物基质作为 治疗剂载体也有利于产生这样的优点：可生物降解聚合物在肺部的控制 释放以及长期的局部作用或系统生物利用度。由于大分子药物被容纳于 聚合物基质的壳内并受到保护，因此可以最大程度地降低大分子药物在 雾化过程中的变性。同时包覆多肽和肽酶抑制剂可最大程度地减少多肽 的酶促降解。
出于进一步解释而并非进行限制的目的，可溶胀颗粒可包含这样的 作用剂，其仅包含黏液溶解剂，或者同时还包含另一种作用剂，例如抗 生素、细胞毒性剂、其他黏液溶解剂、包括siRNA和miRNA在内的 RNA干扰剂、基因或其组合。出于进一步解释的目的，所述作用剂还 可包含多种细胞毒性剂、细胞毒性剂与RNA干扰剂或者作用剂的其他 组合。
与不可溶胀的颗粒相比，由于根据本发明的可溶胀颗粒的尺寸被排 除在噬菌细胞的胞质腔的尺寸之外，因此其可以更成功地避免颗粒被肺 泡噬菌细胞吞噬以及从肺部中被清除。如以下文献所述的那样，当颗粒 直径超过3μm时，由肺泡巨噬细胞产生的颗粒吞噬作用会大大降低， 所述文献为：Kawaguchi，H.等，Biomaterials 7：61-66(1986)；Krenis，L. J.和Strauss.B.，Proc.Soc.Exp.Med.，107：748-750(1961)；以及Rudt， S.和Muller，R.H.，J.Contr.Rel.，22：263-272(1992)。对于统计学上 具有各向同性形状(平均上来说，粉末中的颗粒不具有不同的取向)的 颗粒(如具有粗糙表面的球体)而言，颗粒包络体积(envelope volume) 大致相当于巨噬细胞内用于吞噬完整的颗粒所需的胞质腔的体积。
因此，可溶胀颗粒能够较长时间地释放治疗剂或其他作用剂。可溶 胀的生物降解性颗粒被吸入后，其能够沉积于肺部(由于其尺寸相对较 小所致)，并随后发生溶胀，缓慢的降解和药物释放，而绝大部分的颗 粒不会被肺泡巨噬细胞所吞噬。可将药物相对缓慢地递送到肺泡液内， 并以可控的速率将其递送到血流中，从而最大程度地降低暴露的细胞对 过高的药物浓度的可能的毒性反应。因此可溶胀颗粒非常适于吸入疗 法，尤其适于控制释放应用中的吸入疗法。用于吸入疗法的可溶胀颗粒 的质量中值空气动力学直径优选为0.5μm至5μm(溶胀之前)。在溶 胀后，颗粒在气道内的几何尺寸大于6μm(体均直径)。
可将颗粒构造为具有合适的材料、表面粗糙度、直径、密度以及溶 胀特性，以将其局部递送至呼吸道的选定区域内，如深肺部或上呼吸道。 例如，可使用较大的颗粒或更为致密的颗粒来进行上呼吸道递送，或者 在一次施用时将样品(其含有相同或不同的治疗剂)中的不同尺寸的颗 粒的混合物施用至肺部的不同的靶区域中。
可通过使用抛射剂驱动型计量吸入器的吸入法来递送可溶胀颗粒， 其中在这些制剂中，氢氟烷和/或烷烃液化气抛射剂与为了使制剂稳定 而包含的其他辅料一同被使用。干粉吸入器可使用为雾化和吸入而制备 的可溶胀水凝胶颗粒。使用干粉吸入器可能需要与所谓的“载体”颗粒 混合(参见文献Smyth和Hickey，Carriers in Drug Powder Delivery： Implications for Inhalation System Design，American Journal of Drug delivery，第3卷，2005年第2期，第117-132页)。这些载体颗粒通 常为乳糖、蔗糖、葡萄糖或与用于雾化的可溶胀颗粒相混合的其他颗粒。 通过筛选分析测定，这些载体颗粒的粒度通常为50μm至500μm，并 且占用于分散和吸入气溶胶的吸入器中的粉末的90％至99％(重量/ 重量)。还可使用干粉吹入法、液体喷雾系统以及喷雾器来递送可溶胀 颗粒。
此外，可利用对气溶胶颗粒的空气动力学直径进行调节来针对气道 道的不同靶区域。将靶向配体连接到可溶胀颗粒的表面上可使其定位到 呼吸系统的特定部位中，例如对于肺癌而言，可使靶向配体与主要在肺 癌中表达的受体(如叶酸受体)结合。当颗粒处于病变部位所特有的微 环境(例如肺部感染时的环境，其中肺部对微生物的炎症反应引起较高 浓度的化学物质和调节剂，它们可以使水凝胶积极地改变其性质)中时， 还可通过使水凝胶颗粒的化学键或构象发生改变来实现靶向递送。这可 在水凝胶网络中引起pH敏感性变化，使得当pH降低时，负载于水凝 胶颗粒内的药物被快速释放，以便将药物释放集中在疾病最为明显的区 域。
实施例1-PEG水凝胶的合成
如Elbert，D.L.等在文献“Self-selective Reductions in the Design of Material for Controlled Delivery of Proteins”，Journal of Controlled Release，2001.76：第11-25页中所述，对具有末端羟基的八臂PEG(其 总的数均分子量(Mw)为约10kD和20kD)进行共沸蒸馏、然后在 三乙胺的存在下使其与丙烯酰氯反应之后，使其丙烯酸酯化至官能化度 超过95％。通过将所选的PEG-丙烯酸酯与二硫苏糖醇或PEG-二硫醇 (Mw为3.1kD)在50mM的磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.8)中混合来 形成水凝胶，其中丙烯酸酯与硫醇的化学计量比为1:1。将各反应物分 别溶解于等分量的PBS中。改变PBS的量，以获得混合时所需的总的 前体浓度(重量％)。将两种溶液在1.5mL的塑料管中充分混合并进 行离心分离，以除去气泡。将含有该混合物的密封管置于37℃下，并 使其反应过夜以确保完全转化。
在生理学条件下利用这种反应来形成凝胶对于药物递送应用具有 显著的毒性学上的优点和相容性的优点(参见文献Peppas，N.A.等， Physicochemical foundations and structural design of hydrogelst in medicine and biology，Annu.Rev.Biomed.Eng.，2000.2：第9-29页)。 聚合物的降解速率取决于多种因素，包括水凝胶网络的初始水含量。该 初始水含量由交联剂以及PEG丙烯酸酯的分子量所控制。药物从水凝 胶中的释放由药物分子的相对尺寸和交联网络的网孔尺寸来决定。如果 假定药物尺寸保持恒定(但是，在一些情况下可根据需要对药物悬浮颗 粒进行调节)，则可通过降低网孔的尺寸来调节药物的释放。这通过减 小聚合物的长度(分子量)来实现。
利用与下述文献所述的方法类似的方法来合成聚(丙烯酸-共-丙烯 酰胺)水凝胶，所述文献为Chen等，“Synthesis and characterization of superporous hydrogel composites”，Journal of Controlled Release 65：73-82 页，1999，其内容以引用的方式被并入本文。
可供选用的另外一种方式是，可由具有不同的聚酯/氨基酸骨架以 及接枝的氨基酸侧链的聚合物或聚合物的共混物来形成用于肺部药物 递送的可溶胀颗粒。例如，可使用聚(乳酸-共-赖氨酸-接枝-丙氨酸-赖氨 酸)(PLAL-Ala-Lys)或PLAL-Lys与聚(乳酸-共-乙醇酸-嵌段-聚乙二醇 (PLGA-PEG)(PLAL-Lys-PLGA-PEG)的共混物。
在合成过程中，可对接枝共聚物进行调节，以优化溶胀性颗粒的不 同特性，其包括：i)待递送的药剂与共聚物之间的相互作用，用来使 药剂稳定，并且在递送后保持活性；ii)聚合物的降解速率，以及由此 产生的药物释放行为的速率；iii)通过化学改性产生的表面性质以及靶 向能力；和iv)颗粒的孔隙率。
实施例2-用于囊肿性纤维化的、具有双重作用的黏液溶解剂-治疗药 物递送载体
从雾化的药物由计量给药吸入器或喷雾器喷出并进入嘴中开始，直 至其通过咽喉、向下通过气管和支气管进入朝向作用部位的呼吸道内较 深的凹处，并最终发生降解并被清除为止，雾化的药剂受到多种因素的 影响，可将这些因素归为两类。那些决定雾化的药剂沉积在呼吸道的内 腔表面上的决定因素称为物理性质，其包括颗粒的直径和密度。那些决 定药物在接触内腔表面之后的行为(包括药物的吸收、代谢以及排泄) 的性质被称为药物动力学因素。
因此，必须准确地设计雾化颗粒的物理因素和药物动力学因素，以 使其以递送最为有效的剂量的方式相互补充，同时最大程度地降低药物 的损耗以及避免不利的副反应。
考虑到这些因素，根据另一示例性实施方案，本实施例提供了一种 新的用于治疗囊肿性纤维化的、具有双重作用的黏液溶解剂-治疗剂水 凝胶药物递送载体，以作为显著提高经FDA批准的囊肿性纤维化疗法 的效力的手段。此外，尽管该递送系统最初仅为囊肿性纤维化特定设计 的，但其也可以用作其他肺部疾病(包括肺癌、COPD和哮喘)的治疗 性递送载体。
由于我们每次呼吸都会吸入大量病菌和碎屑，因此肺部拥有多道防 线以防止感染并维持体内平衡。由气管至末端细支气管(即统称为中央 气道的区域)，其内腔上皮细胞的表面覆盖有由溶胶相和凝胶相构成的 液体膜(其分别被称为纤周液体层和黏液层)。这两层中的每一层在保 持肺部清除病菌方面均起到重要作用，并且其精确的组成对于有效地将 外来颗粒清除出呼吸道是非常重要的。上面覆盖的较厚的并且粘稠的黏 液起到屏障的作用，以防止吸入的病菌及其他外来碎屑进入下面的上皮 细胞中。纤周液体层虽然不像上覆的黏液层那样作为直接的屏障，但其 在确保肺部清除病菌方面同样重要。随着纤周液体内的上皮纤毛的具有 节奏的且一致的摆动，黏液会沿着头部方向被推至咽喉内，并通过痰液 从呼吸道中除去，或者被吞入胃肠道内，上述过程被称之为黏膜纤毛活 动梯(mucociliary escalator)。因此，任何包封在黏液层中的雾化剂都 会被移走，并立刻被清除出呼吸道。
纤周液体被保持为最优的体积，这确保只有纤毛的末端能够接触到 覆盖于其上的黏液，并将其向前推动。纤周液体的体积和离子组成是 H2O和离子(具体为Na+和Cl-)的吸收和排泄达到精确平衡后的最终 结果。该平衡通过位于肺部上皮细胞的上表面内的离子通道的共同作用 而被严格控制。液体的吸收主要受到对阿米洛利敏感的上皮细胞钠离子 通道(ENAC)的活性所控制。具有渗透活性的Na+离子由纤周液体被 吸收至上皮细胞，将水从细胞的上表面驱动至基底外侧面，从而降低了 纤周液体的体积。该作用与外向整流氯离子通道(ORCC)和囊性纤维 化跨膜传导调节剂(CFTR)通道的作用相反，这使得氯离子流出细胞 并进入内腔，从而运载水并恢复纤周液体的体积。
在囊肿性纤维化(CF)(其为白种人中最为常见的常染色体隐性 遗传疾病)中，编码CFTR通道的基因包含能够导致缺陷蛋白质翻译的 突变。大部分突变的CFTR蛋白通过26S蛋白体在内质网中发生降解， 而少量未到达上表面细胞质膜的突变CFTR蛋白则不能正常工作，并不 再允许氯离子进入肺腔内。这种氯离子输送的降低导致进入纤周液体的 水量减少，并且由于Na+通道仍以常规的速率吸收水，因此纤周液体的 体积大大降低。纤毛的上部分区域会嵌入黏液层内，从而显著地阻碍了 纤毛的运动，并导致黏膜纤毛活动梯的停止。粘液层的黏度越来越高并 停滞，从而使细菌菌落迅速积聚在整个肺部。这种越来越严重的感染会 导致身体免疫细胞做出剧烈反应，其随着时间的推移而使肺部显著衰 竭，并最终导致死亡。
理想的解决办法应该是接受基因治疗，其将染色体内的缺陷拷贝替 换为对起作用的CFTR通道进行编码的拷贝。不幸的是，虽然这是非常 活跃的研究领域，但是由于频频受挫，因此基因治疗仍不是可行的选择， 并且治疗遗传疾病的体征表现(physical manifestation)仍是治疗CF的 唯一途径。目前的疗法主要包括：施用黏液溶解性的N-乙酰半胱氨酸， 其切断相邻粘蛋白之间的结合，并降低黏液的粘度；以及施用多种针对 感染CF患者的肺部的多种菌落的抗生素。这些治疗可以以雾化的形式 进行给药，并且可以独立地或先后地给药。虽然这种治疗的确可减轻一 些CF并发症，但是其程序极为繁琐，并且存在众多余地来改善其效力， 同时降低时间成本和金钱成本。例如，抗生素仅在其刚刚沉积于气道时 才对遇到的细菌有效。一旦治疗药物接触到粘稠的黏液，其就会被捕获 在黏液中，从而完全丧失其抗菌活性。与此形成对比的是，无论黏液溶 解剂落在何处，它都能降低其附近停滞的黏液的粘度。但是，仅靠粘液 溶解剂不足以对抗位于呼吸道内的众多菌落，而这些菌落正是CF并发 症的直接根源。
本实施例提供了用于在同一气溶胶剂量中同时递送黏液溶解剂和 治疗剂的可溶胀颗粒。通过该方式，黏液溶解剂可降低黏液的粘度，并 增加治疗剂的扩散范围，从而使其能够接触到更多的细菌，并显著提高 其功效。针对上述目的而使用可溶胀颗粒是因为通过这种方式(其中治 疗剂和黏液溶解剂以自由(即，未被包覆)的形式被递送)施用的任何 治疗药物的作用时间都较短。治疗药物的直接作用使得纤毛的摆动频率 增加，并提高了黏膜纤毛活动梯的功能，这进而随着治疗的进行而将大 部分黏液和细菌从肺部中除去。但是，由于这种治疗无法解决潜在的基 因缺陷，因此黏液还会再次变得停滞并粘稠，从而给残余的细菌留下分 裂和繁殖的机会，使得给药后不久肺部中的状况又回到治疗之前的状 态。平均而言，囊肿性纤维化患者每天必需花费约三小时来进行自主用 药。这种严格且不具灵活性的治疗程序不仅对这些患者的生活质量具有 巨大影响，而且还使患者不能顺应规定的疗法。由于对患者的治疗本身 非常严格，因此他们可能会偶尔或故意放弃一两天的治疗，并且认为短 暂地回避药物治疗不会对他们的健康造成不利影响。然而，在对抗仅需 数小时便能完成复制的细菌时，这种疏忽可产生严重的后果。那么该怎 样解决这样一种两难的问题，使得以改善患者的顺应性的方式减轻上述 疗法的严格性，同时又确保递送规定剂量的药物呢？人们在缓释疗法中 找到了上述问题的解决方法，其中在缓释疗法中，治疗药物在数天(如 果不是数周的话)的一段时间内被连续释放，从而使患者接受其规定的 剂量，同时又增加了给药的间隔时间。
针对上述目标而使用可溶胀颗粒应考虑到这样的问题：通过雾化颗 粒的递送完全忽略了决定雾化颗粒在肺部内沉积的空气动力学。在气溶 胶中，一个非常重要的性质是颗粒的空气动力学直径(da)。空气动力 学直径是用于将颗粒的空气动力学性质标准化的方法，而与颗粒的形 状、密度、尺寸或实际直径无关，并且空气动力学直径可被视为具有上 述相同的空气动力学性质的水滴的直径。由空气动力学直径得到的最为 重要的信息是，具有给定的空气动力学直径的颗粒在空气动力学上与那 些具有相同空气动力学直径的颗粒(其具有不同的尺寸、形状、直径或 密度)是相同的。
如上段所证实的那样，雾化颗粒的空气动力学性质主要同时取决于 颗粒的直径以及密度，因此这两个性质中任何一个性质的微小变化都会 导致颗粒沉积在肺部的不同区域。因此，试图以自由的形式或者包覆在 不同的递送载体中的形式来递送黏液溶解剂和治疗剂的混合物，会使其 沉积不均匀，这是因为上述两者不具有相同的直径和密度，因此也就不 具有相同的空气动力学性质。所以，本实施例提供了一种使用可溶胀颗 粒同时递送黏液溶解剂和治疗剂的方法。
此外，可溶胀颗粒提供了一种优选的CF治疗载体，以使治疗剂持 续释放，并且还能够同时负载黏液溶解剂和治疗剂。另外，在设计用于 人体使用的递送载体时，重要的是该载体具有生物相容性、无毒性并且 不具有免疫原性。上述的将治疗剂和黏液溶解剂包覆在交联的、亲水性 聚合物网络中的水凝胶颗粒可以实现药剂的持续释放。例如，当水凝胶 被置于水性环境中时，其容易吸收水分并发生溶胀，从而伸展其聚合物 链并产生大量孔隙，使得内部药物扩散出去。水凝胶尤其适合于肺部的 药物递送，这是因为递送载体遇到的最初表面是主要由亲水性粘蛋白 (其容易吸引水分)构成的粘稠的黏液。因此，亲水性聚合物水凝胶非 常适于将水从黏液中虹吸出来，从而使水凝胶溶胀并释放其治疗药物。
在开发水凝胶网络时，最为重要的因素是选择适合的亲水性聚合 物，由于聚乙二醇(PEG)具有众多有利的性质，因此在上面对其进行 了描述。使这种经FDA批准的聚合物具有吸引力的性质包括：其无毒， 具有生物相容性、非免疫原性以及强的亲水性，这使得PEG从黏液中 吸出水分以促使水凝胶发生溶胀。另外，PEG表现出几乎不吸附蛋白质 的性质，从而使其避开游走于肺部通道迷路的无处不在的巨噬细胞。这 些特征的结合使得PEG成为用于肺部给药的最有希望的候选聚合物。
用于治疗CF的抗生素包括妥布霉素和庆大霉素，它们是较大的并 且容积大的疏水性大分子。尽管这些抗生素的疏水性质使得不能将其以 自由形式引入，但是该性质可以使得将这些抗生素容易地包覆于脂质体 纳米颗粒的核内。而脂质体纳米颗粒具有亲水性表面，这使得其容易地 被引入水凝胶基质内。另外，通过调节脂质体纳米颗粒的尺寸以及聚合 物基质的孔隙大小，可精确地控制抗生素从水凝胶中的释放速率。
接下来的步骤是将黏液溶解剂(例如N-乙酰半胱氨酸，其被命名 为NACS)包覆于水凝胶中。由于NACS尺寸较小，并具有亲水性，因 此如果将其以游离状态简单地负载于水凝胶中，则水凝胶一旦开始溶 胀，NACS便会以不利的单一、快速的突释方式释放到肺部。为了克服 该问题，将NACS与PEG聚合物网络共价键合，同时仍保持其黏液溶 解活性。这一方法的优点在于，随着容易发生水解的酯键的断裂，NACS 会被持续地释放至周围环境中。这将确保黏液溶解剂的释放贯穿于水凝 胶的整个存在期限内，从而可能达到缓释的作用，同时抗生素从凝胶中 扩散出来。
如上所述，NACS极易溶于水(100mg/mL)，因此会防止其被引 入到与包覆有疏水性抗生素的纳米颗粒相似的纳米颗粒中。

N-乙酰半胱氨酸(如上图所示)的结构为我们提供了两个官能团， 利用这些官能团可产生易于水解的键，以将黏液溶解剂与PEG聚合物 网络结合。治疗剂的释放速率既取决于药物-网络连接的断裂/降解的动 力学(其用合适的速率常数描述)，又取决于游离分子从聚合物网络基 质中扩散的扩散速率。在我们的水凝胶中所使用的交联剂为二硫苏糖 醇，其具有两个硫醇部分，该硫醇部分可以在体温及生理pH值、并且 不需要有机溶剂的条件下容易地与我们的官能化PEG8-丙烯酸酯反应。

然而，由于NACS仅含有一个硫醇，因此其可以与另一个NACS 形成二硫键，或者其可以与聚合物的丙烯酸酯基团反应。无论是哪种方 式，NACS作为黏液溶解剂的作用即使未被完全消除，也会受到极大地 破坏。

由上面的反应图(该反应图仅示出了8-臂PEG-丙烯酸酯的丙烯酸 酯端基与DTT的硫醇官能化端基的偶联反应)所示，初始的步骤是硫 醇与丙烯酸酯基团发生迈克尔加成反应。在该反应之后，接下来的步骤 是酯的水解反应，其中形成了醇和羧酸(费歇尔酯化反应的逆反应)。 但是可看出，硫原子(由于二硫苏糖醇的每个分子含有两个S-H基团， 因此所形成的物质实际上是二羧酸)不再以还原性硫醇的形式存在。取 而代之的是，如下所示，所述硫原子与两个碳原子键合，从而形成C-S-C 键，因此其不会再与粘蛋白聚合物的硫醇部分键合形成二硫键。

因此，可通过在二硫苏糖醇与8-臂PEG聚合物进行交联反应前， 将其与N-乙酰半胱氨酸以至少约4:1的摩尔比(DTT:NACS)进行反应， 来达到对NACS的控制释放。这会使得DTT的硫醇与NACS的硫醇发 生反应。NACS的优点在于其已经是FDA批准的药物，并且其与其他 硫醇化合物类似，能够在不需要有害的溶剂或反应条件的情况下容易地 发生反应。断裂后(酯化水解之后)的分子结构如下所示：

与之前的化合物不同，该分子含有二硫键S-S，其容易与粘蛋白聚 合物的二硫键发生竞争，这是因为所发生的唯一转化是由一个二硫键转 化为另一个二硫键(与从低能量键转化为高能量键(这是热动力学不利 的，并且具有较大的转换阻碍)不同，这种转化不需要较大的能量成本)， 并且这种二硫键间的转化在极为温和的条件(基本上就是将化学物质在 PBS缓冲液中混合)下便能发生。
虽然肯定会存在一些NACS-NACS二硫键，但是这并不是不可逆 的化学键，并且大量存在的DTT会确保绝大部分的NACS与交联剂键 合(从理论上来说，每分子NACS便会产生一个S-S活性黏液溶解键)。 通过增加DTT的用量，我们可以确保水凝胶的绝大多数可交联部分都 被占用，从而保持结构稳定性，同时具有足够的DTT-NACS，以使水 凝胶渗透通过黏液的能力表现出显著增强。虽然任何与NACS键合的 DTT均确实不能与另一个PEG分子形成交联，但是最近的实验表明， 当交联剂浓度占聚合物的至少30％(也就是说在理论上存在足够的DTT 分子而占PEG丙烯酸酯基团的30％)时，即可形成牢固的水凝胶。
由8-臂PEG丙烯酸酯合成含有若丹明和N-乙酰半胱氨酸的生物相容性 水凝胶
根据上述的文献Hubbel等，Journal of Controlled Release 76：11-25 (2001)中的方法来进行最初的丙烯酸酯化8-臂PEG(Mw＝10kDa和 20kDa)的合成。例如，将十(10)克8-臂PEG(20kDa，Nektar)溶 解于200mL甲苯中，并进行共沸蒸馏2小时。随后在氩气气氛下将所 得的溶液冷却至50℃。将两(2)毫升三乙胺加入到50mL三氯甲烷中， 随后将其加入反应溶液中。随后逐滴加入一定量(1.3mL)的丙烯酰氯， 并将该反应在氩气气氛、黑暗的条件下进行20小时。随后将所得的不 透明浅黄色液体过滤多次直至其澄清为止。向溶液中加入无水碳酸钠并 搅拌两小时，以除去所存在的任何水分。将溶液过滤以除去碳酸钠，随 后在减压条件下蒸发。随后向溶液中加入二乙醚，并将反应烧瓶置于冰 浴中，以使产物(丙烯酸酯化PEG)沉淀。通过过滤收集产物，并用二 乙醚反复洗涤。其平均产率约为85％。
在丙烯酸酯:硫醇的化学计量比>1、且硫醇含量低至所存在的丙烯 酸酯部分的量的60％(硫醇/丙烯酸酯的比值为0.6)的条件下，可形成 牢固且稳定的PEG水凝胶。一般来说，每分子具有两个硫醇的二硫苏 糖醇会在聚合物分子间形成交联键，从而形成水凝胶网络。为了形成 N-乙酰半胱氨酸黏液溶解剂与水凝胶网络共价键合的水凝胶，我们将5 mg二硫苏糖醇与1.1mg N-乙酰半胱氨酸进行反应，其中二硫苏糖醇和 N-乙酰半胱氨酸均分别溶解于20μl的1X PBS(pH为7.4)中。N-乙 酰半胱氨酸能够在其硫醇基团与丙烯酸酯化聚合物之间或者在其硫醇 基团与二硫苏糖醇之间通过由2个硫醇基团形成的S-S二硫键而成键。 从化学计量上来看，在上述浓度的反应物条件下，如果N-乙酰半胱氨 酸上的所有硫醇基团均与一个单独的二硫苏糖醇分子成键，则二硫苏糖 醇上还会剩余足够的游离硫醇基团，以在聚合物分子之间形成足够的交 联键，从而形成稳定的水凝胶。将该溶液加入到溶解于200μl的1X PBS (pH为7.4)中的0.160克丙烯酸酯化8-臂PEG(20kDa)中。向该溶 液中加入10μl若丹明治疗剂(40mg/毫升，在1X PBS(pH为7.4)中)。 将七十(70)微升等分量的溶液置于涂有SigmaCote(得自Sigma Chemical公司)的显微镜载片之间，并用1mm的隔片将其分开。将凝 胶在37℃的湿环境下固化24小时。在干燥后，将固化的凝胶在用液氮 冷却的微型球磨机(得自Dentsply Rinn公司，Elgin，伊利诺伊州)中 研磨，从而制得体均直径为1.1μm至3μm、且跨度为2.2(跨度 ＝(D90-D10)/D50)的可溶胀颗粒，其中D50为中值直径，而D10和D90 分别为第10百分比直径和第90百分比直径(例如，对于D10来说， 10％的颗粒粒径小于该直径)。
如上所讨论的那样，在本实施例中，黏液溶解剂和治疗剂的双重递 送可通过以下方式而起到显著增强目前的CF疗法的效力的作用，所述 方式为：增加治疗剂的扩散范围；允许其接触到较多量的细菌；同时提 高黏膜纤毛活动梯的功能。但是，这种双重作用的雾化水凝胶并不仅局 限于用在囊肿性纤维化的治疗上。如上所述，在生理学条件下，肺部通 道的内腔上覆盖有一层黏液，这层黏液起到阻挡吸入颗粒的作用。该黏 液通过黏膜纤毛活动梯而被连续地除去，其需要约10小时以将吸入的 碎屑从肺部最深处排出，而仅需要很短的时间就可以清除上部通道，其 中绝大部分恶性肿瘤存在于所述的上部通道。由于黏膜纤毛活动梯不能 分辨出治疗性气溶胶和病原体，因此黏膜纤毛活动梯以同等的力度将有 益物质和有害物质一同排出。因此，任何吸入的治疗剂仅具有很短的时 间窗来渗透过黏液屏障，到达黏液层下面的上皮细胞，并递送其治疗药 物，否则其将永远丧失发挥其功效的机会。此外，当人们考虑到肿瘤在 整个肺部的分布并不均匀，并且所述的治疗剂仅在特定的区域才会有效 时，则上述发挥作用的短暂的时间窗又进一步变窄。通过颗粒的直径和 密度来对颗粒的空气动力学性质加以控制，可调控气溶胶，使得大部分 颗粒都能到达肺部的所需部位。然而，一旦颗粒落于内腔的表面上，则 完全依靠颗粒在被肺部排除之前渗入黏液内。
因此，显而易见的是，颗粒通过粘稠的黏液的速度越快，则其发挥 有益效果的机会就越大。通过将黏液溶解剂与细胞毒性剂、皮质类甾醇 或支气管扩张剂(其分别用于治疗肺癌、COPD和哮喘)联合使用，会 增加治疗的效力，并且可大大降低由黏膜纤毛活动梯的作用所浪费的药 物的量。
可通过颗粒上的反应性官能团将靶向分子连接在溶胀性颗粒上。例 如，可将靶向分子连接在官能化的聚酯接枝共聚物颗粒(如PLAL-Lys 颗粒)的氨基酸基团上。靶向分子可使颗粒与特定的受体部位(例如， 位于肺部内的那些受体部位)发生结合相互作用。可通过连接上配体(其 与特定靶位特异性地或非特异性地结合)来使颗粒具有靶向性。示例性 的靶向分子包括抗体及其片断，其包括能够与(例如)靶细胞表面上的 受体特异性结合的可变区、外源凝集素和激素，或者其他有机分子。
尽管以上参照特定的示例性实施方案对本发明进行了描述，但本领 域的技术人员将会认识到，可在不脱离本发明所附权利要求限定的精神 和范围的条件下，对本发明进行改变、修改等。
本专利申请要求于2006年4月4日提交的临时专利申请No. 60/788,942的优先权和权利，其全部内容以引用的方式被并入本文。