用于分离方法的组合物
阅读：248发布：2023-03-09
专利汇可以提供用于分离方法的组合物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 一般地涉及分离和转化技术领域，并更具体地涉及用于 切向流过滤 技术的物质。切向流物质广泛用于分离和转化过程，包括依赖于 反渗透 、微滤、 超滤 或纳滤半渗透过滤膜的那些，并提供用于纯化或制备多种目标物质，包括用于切向流过滤的 生物 聚合物 微粒的有效方法。，下面是用于分离方法的组合物专利的具体信息内容。
1.一种用于从源材料分离目标物质的纯化方法，该方法包括（a）提供源材料，（b）用至少一个半渗透过滤器切向流过滤所述源材料，和（c）回收目标物质，其中一种或多种源材料、半渗透过滤器、或所述切向流过滤中所用的一种或多种溶液包含一种或多种聚合物微粒，并且其中一种或多种聚合物微粒包含
i.选自聚酯、聚硫酯或聚羟基烷酸酯的生物聚合物；或
ii.形成聚合物微粒的多肽，例如聚合物合酶或聚合物合酶融合；或
iii.结合聚合物微粒的多肽；
iv.多肽融合配偶体；
v.亲和配体；
vi.酶；
vii.包含以上的两种或多种的融合多肽；或
viii.以上（i）至（vii）的任意两种或多种的任意结合。
2.权利要求1的方法，其中一种或多种聚合物微粒包含选自聚酯、聚硫酯或聚羟基烷酸酯的生物聚合物和
i.形成聚合物微粒的多肽，例如聚合物合酶或聚合物合酶融合；或
ii.结合聚合物微粒的多肽；
iii.多肽融合配偶体；
iv.亲和配体；
v.酶；
vi.包含以上的两种或多种的融合多肽；或
vii.以上（i）至（vi）的任意两种或多种的任意结合。
3.权利要求1的方法，其中一种或多种聚合物微粒包含能够结合目标物质的配体。
4.权利要求1或权利要求2的纯化方法，其中目标物质为一种或多种抗体。
5.权利要求1的纯化方法，其中目标物质为一种或多种聚合物微粒。
6.一种用于从源材料制备一种或多种目标物质的方法，该方法包括使源材料与无定形聚合物微粒群接触一段时间以足以使得无定形聚合物微粒结合一种或多种目标物质或一种或多种目标物质前体或一种或多种污染物，通过切向流过滤从微粒结合的目标物质或其前体分离一种或多种污染物或从微粒结合的污染物分离一种或多种目标物质或其前体，和回收目标物质。
7.权利要求6的方法，其中无定形聚合物微粒群为均质群。
8.权利要求6的方法，其中无定形聚合物微粒群为异质群。
9.权利要求6的方法，其中一种或多种无定形聚合物微粒包含选自聚酯、聚硫酯或聚羟基烷酸酯的一种或多种生物聚合物。
10.权利要求6的方法，其中一种或多种无定形聚合物微粒为或能够通过微粒形成蛋白合成。
11.权利要求10的方法，其中基本上全部的聚合物微粒群为或能够通过微粒形成蛋白合成。
12.权利要求6的方法，其中一种或多种无定形聚合物微粒包含聚合物微粒形成蛋白，例如聚合物合酶或聚合物合酶融合。
13.权利要求6的方法，其中目标物质的回收通过从聚合物微粒洗脱进行。
14.权利要求6的方法，其中目标物质的回收通过收集切向流过滤渗透物进行。
15.权利要求6的方法，其中目标体系的回收通过收集切向流过滤滞留物进行。
16.一种用于从源材料分离或纯化一种或多种目标物质的方法，该方法包括使源材料与聚合物微粒群接触一段时间以足以使得一种或多种聚合物微粒结合一种或多种目标物质，通过切向流过滤从微粒结合的目标物质分离一种或多种污染物，和回收目标物质，其中一种或多种聚合物微粒包含
i.选自聚酯、聚硫酯或聚羟基烷酸酯的生物聚合物；或
ii.形成聚合物微粒的多肽，例如聚合物合酶或聚合物合酶融合；或
iii.结合聚合物微粒的多肽；
iv.多肽融合配偶体；
v.亲和配体；
vi.酶；
vii.包含以上的两种或多种的融合多肽；或
viii.以上（i）至（vii）的任意两种或多种的任意结合。
17.一种用于从源材料分离或纯化一种或多种目标物质的方法，该方法包括使源材料与聚合物微粒群接触一段时间以足以使得一种或多种聚合物微粒结合一种或多种污染物，通过切向流过滤从微粒结合的污染物分离一种或多种目标物质，和回收目标物质，其中一种或多种聚合物微粒包含
i.选自聚酯、聚硫酯或聚羟基烷酸酯的生物聚合物；或
ii.形成聚合物微粒的多肽，例如聚合物合酶或聚合物合酶融合；或
in.结合聚合物微粒的多肽；
iv.多肽融合配偶体；
v.亲和配体；
vi.酶；
vii.包含以上的两种或多种的融合多肽；或
viii.以上（i）至（vii）的任意两种或多种的任意结合。
18.一种用于制备一种或多种反应产物的方法，该方法包括通过切向流过滤使包含一种或多种反应底物的源材料与一种或多种聚合物微粒接触一段时间以足以使得一种或多种聚合物微粒结合一种或多种反应底物所需级份，任选地通过切向流过滤从聚合物微粒分离一种或多种污染物，和回收反应产物，其中一种或多种聚合物微粒包含反应催化剂，和其中一种或多种聚合物微粒包含
i.选自聚酯、聚硫酯或聚羟基烷酸酯的生物聚合物；或
ii.形成聚合物微粒的多肽，例如聚合物合酶或聚合物合酶融合；或
iii.结合聚合物微粒的多肽；
iv.多肽融合配偶体；
v.亲和配体；
vi.酶；
vii.包含以上的两种或多种的融合多肽；或
viii.以上（i）至（vii）的任意两种或多种的任意结合。
19.一种用于制备聚合物微粒的方法，其中一种或多种聚合物微粒包含
ix.选自聚酯、聚硫酯或聚羟基烷酸酯的生物聚合物；或
x.形成聚合物微粒的多肽，例如聚合物合酶或聚合物合酶融合；或
xi.结合聚合物微粒的多肽；
Xll.多肽融合配偶体；
Xlll.亲和配体；
xiv.酶；
xv.包含以上的两种或多种的融合多肽；或
xvi.以上（i）至（vii）的任意两种或多种的任意结合；
并且其中该方法包含通过切向流过滤从聚合物微粒分离一种或多种污染物，和回收聚合物微粒。
20.一种用于从源材料分离或纯化一种或多种聚合物微粒的方法，该方法包括通过切向流过滤从聚合物微粒分离一种或多种污染物，和回收一种或多种聚合物微粒，其中一种或多种微粒包含
i.选自聚酯、聚硫酯或聚羟基烷酸酯的生物聚合物；或
ii.形成聚合物微粒的多肽，例如聚合物合酶或聚合物合酶融合；或
iii.结合聚合物微粒的多肽；
iv.多肽融合配偶体；
v.亲和配体；
vi.酶；
vii.包含以上的两种或多种的融合多肽；或
viii.以上（i）至（vii）的任意两种或多种的任意结合。
21.一种用于纯化一种或多种抗体的纯化方法，其包含提供包含一种或多种抗体的源材料，用至少一个半渗透过滤器切向流过滤所述源材料，其中一种或多种源材料、半渗透过滤器、所述切向流过滤中所用的一种或多种溶液包含一种或多种聚合物微粒，并且其中一种或多种聚合物微粒包含能够结合抗体的配体，和回收抗体。
22.一种用于制造用于切向流过滤的半渗透过滤器的方法，该方法包括提供可渗透或半渗透载体，将一种或多种聚合物微粒结合至载体以提供半渗透过滤器，其中一种或多种聚合物微粒包含
i.选自聚酯、聚硫酯或聚羟基烷酸酯的生物聚合物；或
ii.形成聚合物微粒的多肽，例如聚合物合酶或聚合物合酶融合；或
iii.结合聚合物微粒的多肽；
iv.多肽融合配偶体；
v.亲和配体；
vi.酶；
vii.包含以上的两种或多种的融合多肽；或
viii.以上（i）至（vii）的任意两种或多种的任意结合。
23.用于切向流过滤的组合物、膜、过滤器或过滤器设备，其中组合物、膜、过滤器或过滤器设备包含一种或多种包含以下的聚合物微粒
i.选自聚酯、聚硫酯或聚羟基烷酸酯的生物聚合物；或
ii.形成聚合物微粒的多肽，例如聚合物合酶或聚合物合酶融合；或
iii.结合聚合物微粒的多肽；
iv.多肽融合配偶体；
v.亲和配体；
vi.酶；
vii.包含以上的两种或多种的融合多肽；或
viii.以上（i）至（vii）的任意两种或多种的任意结合。
24.一种包含以下的聚合物微粒
i.选自聚酯、聚硫酯或聚羟基烷酸酯的生物聚合物；或
ii.形成聚合物微粒的多肽，例如聚合物合酶或聚合物合酶融合；或
iii.结合聚合物微粒的多肽；
iv.多肽融合配偶体；
v.亲和配体；
vi.酶；
vii.包含以上的两种或多种的融合多肽；或
viii.以上（i）至（vii）的任意两种或多种的任意结合，
其中一种或多种多肽为或包含来自链球菌的蛋白G的GB1域。
25.一种包含形成聚合物微粒的多肽和来自链球菌的蛋白G的一个或多个GB1域的融合多肽。
26.权利要求24的微粒或权利要求25的多肽，其中多肽为或包含通过具有12个或多个邻接核苷酸SEQ ID NO.4的多核苷酸序列编码的GB1域。
27.权利要求24的微粒或权利要求25的多肽，其中多肽为或包含通过具有12个或多个邻接核苷酸SEQ ID NO.4的多核苷酸序列编码的多肽。
28.权利要求24至27任一项的微粒，其中聚合物微粒具有大于30mg免疫球蛋白/g湿聚合物微粒的免疫球蛋白结合能力。
29.权利要求28的微粒，其中结合能力为至少约35mg免疫球蛋白/g湿聚合物微粒，约
40mg免疫球蛋白/g湿聚合物微粒，约45mg免疫球蛋白/g湿聚合物微粒，约50mg免疫球蛋白/g湿聚合物微粒，约55mg免疫球蛋白/g湿聚合物微粒，或约60mg免疫球蛋白/g湿聚合物微粒。
30.权利要求28或29的微粒，其中免疫球蛋白为IgG。
31.权利要求1-18、20或21任一项的方法，其中源材料为或源自细胞裂解物，或为或源自蛋白表达系统。
32.权利要求1-18、20或21任一项的方法，其中源材料为或源自食品，包括奶制品或乳品加工流、包括葡萄酒或啤酒发酵液的发酵液。
33.权利要求1-18、20或21任一项的方法，其中源材料为溶液，包括反应溶液、化学合成溶液、化学合成中间体。
34.权利要求1-18、20或21任一项的方法，其中目标物质为多肽，包括例如，重组多肽、抗体、酶、荷尔蒙。
35.权利要求1-18、20或21任一项的方法，其中目标物质为多核苷酸，包括例如，重组多核苷酸，载体，寡核苷酸，RNA分子例如rRNA、mRNA、miRNA、siRNA、或tRNA，或DNA分子例如cDNA。
36.权利要求1-18、20或21任一项的方法，其中目标物质为细胞代谢产物，包括分泌代谢产物。
37.权利要求1-22任一项的方法、权利要求23的组合物、膜、过滤器或过滤器设备、或权利要求24或26至30任一项的微粒，其中聚合物微粒包含选自聚酯、聚硫酯或聚羟基烷酸酯（PHA）的生物聚合物。
38.权利要求1-22任一项的方法、权利要求23的组合物、膜、过滤器或过滤器设备、或权利要求24或26至30任一项的微粒，其中聚合物包含聚羟基烷酸酯，优选聚(3-羟基丁酸酯)（PHB）。
39.权利要求1-22任一项的方法、权利要求23的组合物、膜、过滤器或过滤器设备、或权利要求24或26至30任一项的微粒，其中构成微粒的聚合物基本上由、或由选自聚酯、聚硫酯或聚羟基烷酸酯（PHA）的生物聚合物组成。
40.权利要求1-22任一项的方法、权利要求23的组合物、膜、过滤器或过滤器设备、或权利要求24或26至30任一项的微粒，其中聚合物微粒包含通过磷脂单层封装的聚合物微粒。
41.前述权利要求的任一项，其中当存在时，聚合物合酶结合至聚合物微粒或结合至磷脂单层或结合至二者。
42.前述权利要求的任一项，其中聚合物微粒包含两种或多种不同的融合多肽。
43.前述权利要求的任一项，其中当存在时，聚合物合酶共价或非共价结合至其所形成的聚合物微粒。
44.前述权利要求的任一项，其中当存在时，聚合物合酶为来自革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌、或来自古细菌的PHA聚合物合酶。
45.前述权利要求的任一项，其中当存在时，聚合物合酶包含来自保藏号分别为AY836680、AE004091、AB205104、AF109909、YP137339、AB049413和AF150670的钩虫贪铜菌（C.necator）、铜绿假单胞菌（P.aeruginosa）、酒色异着色菌（A.vinosum）、巨大芽孢杆菌（B.megaterium）、死海盐盒菌（H.marismortui）、致黄假单胞菌（P.aureofaciens）、或恶臭假单胞菌（P.putida）的PHA聚合物合酶。
46.权利要求1-22任一项的方法、权利要求23的组合物、膜、过滤器或过滤器设备、或权利要求24或26至30任一项的微粒，其中一种或多种聚合物微粒持久地与可渗透或半渗透载体结合。
47.权利要求1-22任一项的方法、权利要求23的组合物、膜、过滤器或过滤器设备、或权利要求24或26至30任一项的微粒，其中一种或多种聚合物微粒可逆地与可渗透或半渗透载体结合。
48.权利要求1-22任一项的方法、权利要求23的组合物、膜、过滤器或过滤器设备、或权利要求24或26至30任一项的微粒，其中一种或多种聚合物微粒共价或非共价结合至半渗透过滤器。
49.权利要求1-22任一项的方法、权利要求23的组合物、膜、过滤器或过滤器设备、或权利要求24或26至30任一项的微粒，其中一种或多种聚合物微粒吸附于半渗透载体或膜之上。
50.权利要求1-22任一项的方法、权利要求23的组合物、膜、过滤器或过滤器设备、或权利要求24或26至30任一项的微粒，其中一种或多种聚合物微粒包含能够结合至半渗透载体或膜的配体。
51.一种基本上如本文所述并参考实施例和附图的用于从源材料分离或纯化一种或多种目标物质或聚合物微粒的方法。
52.基本上如本文所述并参考实施例和附图的组合物、膜、过滤器、过滤器设备或聚合物微粒。
用于分离方法的组合物
技术领域
[0001] 本发明一般地涉及分离和转化技术领域，更具体地涉及用于切向流过滤技术的物质。切向流物质广泛地应用于分离和转化过程，包括依赖于反渗透、微滤、超滤或纳滤半渗透过滤膜的那些，和提供了有效的用于纯化或制备多种目标物质的方法。
发明背景
[0002] 自不需要的物质，例如自复杂组合物分离想要的目标物质为许多重要日用品，包括食品、化学品、医药品、和生物制剂例如细胞、病毒、多肽、多核苷酸和代谢物的制备中的基本步骤。类似地，将一种或多种前体物质转化成目标物质，例如通过酶转化，任选与目标物质的富集或分离偶联，例如自前体物质，是许多制造方法的基本步骤。
[0003] 因此，已有很大的支出以发展能够有效分离和制备所需目标物质的方法和技术。例如，用于自第二成分，例如另一种液体或一种或多种溶解的或悬浮的固体分离一种或多种所需物质，典型的一种或多种液体的反渗透（RO）、微滤（MF）、超滤（UF）、和纳滤（NF）技术已发展许多年。
[0004] 最常使用填充床色谱，其中将树脂微粒填充于床中并使含有目标分子的溶液通过柱和目标物结合至树脂。该方法的一个具体挑战是形成不规则流体通道。这些不规则流体通道阻碍了目标物的有效纯化并阻碍了树脂的有效清洗，从而造成了潜在污染。
[0005] 在单克隆抗体的制备中，例如，已提出用十倍过量树脂填充床可处理不规则流路问题。无疑地，采用该建议存在成本和效率后果。在有权使用全部可用介质的体系中，将可能减少所需的树脂量，因此降低制备成本。
[0007] 切向流（也称作横流）过滤过程（其中料流越过半渗透膜表面的表面、且浓缩料流典型地在进料流路的下游回收）具有处理这些问题中的某些的潜力。已开发多种半渗透膜用于这些和其它过滤过程。
[0008] 现有切向流技术，虽然满足实现特定的分离，但不太适用于从复杂给料制备或分离某些目标物质，例如多肽。具有高水平微粒的源液体或利用微粒的过滤技术通常不适用于切向流过滤，典型地因为它们可形成凝胶层或另外阻塞或黏住过滤器膜，从而降低效率。解决该问题的尝试已集中于使用大的刚性微粒（处于100-300微米级）。虽然大尺寸和刚性降低了结垢风险或程度，但减少的表面积/体积比呈现出更少的目标物结合位点，这需要使用更多的树脂。
[0009] 本发明的一个目的特别是通过切向流过滤克服或至少改善部分上述缺点，以提供改进的用于制备和纯化目标物质的组合物和方法，或者至少为公众提供可用的选择。
[0010] 本发明的其它目的通过仅作为实例给出的以下说明而变得显而易见。发明概述
[0011] 本发明涉及一种用于从源材料制备一种或多种目标物质的方法，该方法包括使源材料与无定形聚合物微粒群接触一段时间以足以使得无定形聚合物微粒结合一种或多种目标物质或一种或多种目标物质前体或一种或多种污染物，通过切向流过滤从微粒结合的目标物质或其前体分离一种或多种污染物，或从微粒结合的污染物分离一种或多种目标物质或其前体，和回收目标物质。
[0012] 在一个实施方案中，无定形聚合物微粒群为均质群。在另一个实施方案中，无定形聚合物微粒群为异质群。
[0013] 在一个实施方案中，一种或多种无定形聚合物微粒包含一种或多种选自聚酯、聚酯、聚硫酯或聚羟基烷酸酯的生物聚合物。
[0014] 在一个实施方案中，一种或多种无定形聚合物微粒能够通过微粒形成蛋白合成。在一个实施方案中，基本上全部的聚合物微粒群能够通过微粒形成蛋白合成。
[0015] 在一个实施方案中，一种或多种无定形聚合物微粒包含聚合物微粒形成蛋白，例如聚合物合酶或聚合物合酶融合。
[0016] 在一个实施方案中，目标物质通过从聚合物微粒洗脱回收。在一个实施方案中，目标物质通过收集切向流过滤渗透物回收。在一个实施方案中，目标体系通过收集切向流过滤滞留物回收。
[0017] 相应地，在一方面中，本发明提供了一种用于从源材料分离或纯化一种或多种目标物质的方法，该方法包括使源材料与聚合物微粒群接触一段时间以足以使得一种或多种聚合物微粒结合一种或多种目标物质，通过切向流过滤从微粒结合的目标物质分离一种或多种污染物，和回收目标物质，其中一种或多种聚合物微粒包含：■选自聚酯、聚硫酯或聚羟基烷酸酯的生物聚合物；或
■形成聚合物微粒的多肽，例如聚合物合酶或聚合物合酶融合；或
■兼而有之。
■形成聚合物微粒的多肽，例如聚合物合酶或聚合物合酶融合；或
■兼而有之。
[0018] 相应地，在另一方面中，本发明提供了一种用于从源材料分离或纯化一种或多种目标物质的方法，该方法包括使源材料与聚合物微粒群接触一段时间以足以使得一种或多种聚合物微粒结合一种或多种污染物，通过切向流过滤从微粒结合的污染物分离一种或多种目标物质，和回收目标物质，其中一种或多种聚合物微粒包含：■选自聚酯、聚酯、聚硫酯或聚羟基烷酸酯的生物聚合物；或
■形成聚合物微粒的多肽，例如聚合物合酶或聚合物合酶融合；或
■兼而有之。
■形成聚合物微粒的多肽，例如聚合物合酶或聚合物合酶融合；或
■兼而有之。
[0019] 在另一方面中，本发明提供了一种用于制备一种或多种反应产物的方法，该方法包括通过切向流过滤使包含一种或多种反应物质的源材料与一种或多种聚合物微粒接触一段时间以足以使得一种或多种聚合物微粒结合一种或多种反应物质的所需级份，任选地通过切向流过滤从聚合物微粒分离一种或多种污染物，和回收反应产物，其中一种或多种聚合物微粒包含反应催化剂，并且其中一种或多种聚合物微粒包含：■选自聚酯、聚酯、聚硫酯或聚羟基烷酸酯的生物聚合物；或
■形成聚合物微粒的多肽，例如聚合物合酶或聚合物合酶融合；或
■兼而有之。
■形成聚合物微粒的多肽，例如聚合物合酶或聚合物合酶融合；或
■兼而有之。
[0020] 本发明进一步涉及一种用于从源材料分离目标物质的纯化方法，该方法包括（a）提供源材料，（b）用至少一个半渗透过滤器切向流过滤所述源材料，其中源材料或半渗透过滤器包含一种或多种聚合物微粒，和（c）回收目标物质，其中一种或多种源材料、半渗透过滤器、或所述切向流过滤中所用的一种或多种溶液包含一种或多种聚合物微粒，其中一种或多种聚合物微粒包含能够结合目标物质的配体，并且其中一种或多种聚合物微粒包含：i.选自聚酯、聚硫酯或聚羟基烷酸酯的生物聚合物；或
ii.形成聚合物微粒的多肽，例如聚合物合酶或聚合物合酶融合；或
iii.结合聚合物微粒的多肽；
iv.多肽融合配偶体；
v.亲和配体；
vi.酶；
vii.包含以上的两种或多种的融合多肽；或
viii.以上（i）至（vii）的任意两种或多种的任意结合。
ii.形成聚合物微粒的多肽，例如聚合物合酶或聚合物合酶融合；或
iii.结合聚合物微粒的多肽；
iv.多肽融合配偶体；
v.亲和配体；
vi.酶；
vii.包含以上的两种或多种的融合多肽；或
viii.以上（i）至（vii）的任意两种或多种的任意结合。
[0021] 相应地，在一个示例性实施方案中，本发明提供了一种用于纯化一种或多种抗体的纯化方法，包括：提供包含一种或多种抗体的源材料，用至少一个包含一种或多种聚合物微粒的半渗透过滤器切向流过滤所述源材料，其中一种或多种聚合物微粒包含能够结合抗体的配体，和回收抗体。
[0022] 相应地，在另一个示例性实施方案中，本发明提供了一种用于纯化一种或多种聚合物微粒的纯化方法，包括：提供包含一种或多种聚合物微粒的源材料，用至少一个半渗透过滤器切向流过滤所述源材料，其中一种或多种聚合物微粒包含：■选自聚酯、聚硫酯或聚羟基烷酸酯的生物聚合物；或
■形成聚合物微粒的多肽，例如聚合物合酶或聚合物合酶融合；或
■兼而有之。
■形成聚合物微粒的多肽，例如聚合物合酶或聚合物合酶融合；或
■兼而有之。
[0023] 本发明另一方面提供包含以下的聚合物微粒■选自聚酯、聚硫酯或聚羟基烷酸酯的生物聚合物；或
■形成聚合物微粒的多肽，例如聚合物合酶或聚合物合酶融合；或
■兼而有之；和
其中一种或多种融合多肽为或包含来自链球菌的蛋白G的GB1域。
■形成聚合物微粒的多肽，例如聚合物合酶或聚合物合酶融合；或
■兼而有之；和
其中一种或多种融合多肽为或包含来自链球菌的蛋白G的GB1域。
[0024] 融合多肽包含形成聚合物微粒的多肽和一种或多种来自链球菌的蛋白G的GB1域。
[0025] 在一个实施方案中，融合多肽为或包含通过包含12个或多个邻接核苷酸SEQ ID NO.4的多核苷酸序列编码的GB1域。在另一个实施方案中，融合多肽为或包含通过包含12个或多个邻接核苷酸SEQ ID NO.4的多核苷酸序列编码的多肽。
[0026] 在一个实施方案中，所述聚合物微粒具有大于30mg免疫球蛋白/g湿聚合物微粒的免疫球蛋白结合能力。
[0027] 在一个实施方案中，结合能力为至少约35mg免疫球蛋白/g湿聚合物微粒，约40mg免疫球蛋白/g湿聚合物微粒，约45mg免疫球蛋白/g湿聚合物微粒，约50mg免疫球蛋白/g湿聚合物微粒，约55mg免疫球蛋白/g湿聚合物微粒，或约60mg免疫球蛋白/g湿聚合物微粒。
[0028] 在一个实施方案中，免疫球蛋白为IgG。
[0029] 在进一步的方面中，本发明提供了一种用于制造用于切向流过滤的半渗透过滤器的方法，该方法包括提供可渗透或半渗透载体，将一种或多种聚合物微粒结合至载体以提供半渗透过滤器，其中一种或多种聚合物微粒包含：■选自聚酯、聚硫酯或聚羟基烷酸酯的生物聚合物；或
■形成聚合物微粒的多肽，例如聚合物合酶或聚合物合酶融合；或
■兼而有之。
■形成聚合物微粒的多肽，例如聚合物合酶或聚合物合酶融合；或
■兼而有之。
[0030] 在进一步的方面中，本发明提供了一种用于制备聚合物微粒的方法，其中一种或多种聚合物微粒包含：■选自聚酯、聚硫酯或聚羟基烷酸酯的生物聚合物；或
■形成聚合物微粒的多肽，例如聚合物合酶或聚合物合酶融合；或
■兼而有之；
其中该方法包含通过切向流过滤从聚合物微粒分离一种或多种污染物，和回收聚合物
微粒。
■形成聚合物微粒的多肽，例如聚合物合酶或聚合物合酶融合；或
■兼而有之；
其中该方法包含通过切向流过滤从聚合物微粒分离一种或多种污染物，和回收聚合物
微粒。
[0031] 在另一个方面中，本发明提供了一种用于从源材料分离或纯化一种或多种聚合物微粒的方法，该方法包括通过切向流过滤从聚合物微粒分离一种或多种污染物，和回收一种或多种聚合物微粒，其中一种或多种微粒包含■选自聚酯、聚硫酯或聚羟基烷酸酯的生物聚合物；或
■形成聚合物微粒的多肽，例如聚合物合酶或聚合物合酶融合；或
■兼而有之。
■形成聚合物微粒的多肽，例如聚合物合酶或聚合物合酶融合；或
■兼而有之。
[0032] 本发明进一步提供了包含一种或多种此处所述聚合物微粒的组合物、膜、过滤器和过滤器设备（例如滤筒），。该组合物、膜、过滤器、和过滤器设备特别适用于切向流过滤。
[0033] 以下实施方案可涉及以上方面的任一个。
[0034] 在多个实施方案中，一种或多种聚合物微粒包含以下的一种或多种：■结合聚合物微粒的多肽；
■多肽融合配偶体；
■亲和配体；
■酶；
■包含以上的两种或多种的融合多肽；或
■以上任意两种或多种的任意结合。
■多肽融合配偶体；
■亲和配体；
■酶；
■包含以上的两种或多种的融合多肽；或
■以上任意两种或多种的任意结合。
[0035] 在多个实施方案中，基本上全部的聚合物微粒包含：■生物聚合物，例如选自聚β-羟基酸、生物聚乳酸酯、生物聚硫酯和生物聚酯的生物聚合物；或
■形成聚合物微粒的多肽，例如聚合物合酶或聚合物合酶融合；或
■兼而有之。
■形成聚合物微粒的多肽，例如聚合物合酶或聚合物合酶融合；或
■兼而有之。
[0036] 在一个实施方案中，形成聚合物微粒的多肽共价结合至微粒的表面。
[0037] 在一个实施方案中，一种或多种聚合物微粒包含一个或多个置于其表面的配体。
[0038] 在一个实施方案中，聚合物微粒结合至半渗透载体、与半渗透载体结合或包含半渗透载体，例如半渗透膜、树脂、切向流过滤器、切向流滤筒等。
[0039] 在一个实施方案中，源材料为或源自细胞裂解物。在一个实施方案中，源材料为或源自蛋白表达系统，包括体外蛋白表达系统。
[0041] 在一个实施方案中，源材料为溶液，包括反应溶液、化学合成溶液、化学合成中间体等。
[0042] 在一个实施方案中，目标物质为多肽，包括例如，重组多肽、抗体、酶、荷尔蒙等。
[0043] 在一个实施方案中，目标物质为多核苷酸，包括例如，重组多核苷酸、载体、寡核苷酸、RNA分子例如rRNA、mRNA、miRNA、siRNA、或tRNA，或DNA分子例如cDNA。
[0044] 在一个实施方案中，目标物质为细胞代谢产物，包括分泌代谢产物。
[0045] 在不同的实施方案中，聚合物微粒包含选自聚酯、聚硫酯或聚羟基烷酸酯（PHA）的生物聚合物。最优选地，聚合物包含聚羟基烷酸酯，优选聚(3-羟基丁酸酯)（PHB）。
[0046] 在不同的实施方案中，构成微粒的聚合物基本上由，或由选自聚酯、聚硫酯或聚羟基烷酸酯（PHA）的生物聚合物组成。最优选地，聚合物包含聚羟基烷酸酯，优选聚(3-羟基丁酸酯)（PHB）。
[0047] 在不同的实施方案中，聚合物微粒包含通过磷脂单层封装的聚合物微粒。
[0048] 在不同的实施方案中，聚合物合酶结合至聚合物微粒或结合至磷脂单层或结合至二者。
[0049] 在不同的实施方案中，聚合物微粒包含两个或多个不同的融合多肽。
[0050] 在不同的实施方案中，聚合物微粒包含处于聚合物微粒表面之上的两个或多个不同的融合多肽。
[0051] 在不同的实施方案中，聚合物微粒包含三个或多个不同的融合多肽，例如处于聚合物微粒表面的三个或多个不同的融合多肽。
[0052] 在不同的实施方案中，聚合物微粒还包含至少一个结合至或合并入聚合物微粒、或其结合的物质。
[0053] 在不同的实施方案中，所述物质通过交联结合至聚合物微粒。
[0054] 在不同的实施方案中，聚合物合酶结合至聚合物微粒或结合至磷脂单层或结合至二者。
[0055] 在不同的实施方案中，聚合物合酶共价或非共价结合至其所形成的聚合物微粒。
[0056] 在不同的实施方案中，聚合物合酶为选自不动杆菌属（Acinetobacter）、弧菌属（Vibrio）、气单胞菌属（Aeromonas）、色杆菌属（Chromobacterium）、假单胞菌属（Pseudomonas）、动胶菌属（Zoogloea）、产碱菌属（Alcaligenes）、代尔夫特菌属（Delftia）、伯 克霍尔德菌属（Burkholderia）、雷尔氏 菌属（Ralstonia）、红 球菌属（Rhodococcus）、戈 登氏 菌属（Gordonia）、红 细菌 属（Rhodobacter）、副球 菌属（Paracoccus）、立克次体属（Rickettsia）、柄杆菌属（Caulobacter）、甲基杆菌属（Methylobacterium）、固氮根瘤菌属（Azorhizobium）、农杆菌属（Agrobacterium）、根瘤菌属（Rhizobium）、中华根瘤菌属（Sinorhizobium）、立克次体属（Rickettsia）、泉古菌门（Crenarchaeota）、集胞藻属（Synechocystis）、外硫红螺菌属（Ectothiorhodospira）、荚硫菌属（Thiocapsa）、囊硫菌属（Thyocystis）和异着色菌属（Allochromatium）的1型PHA合酶；来自伯克霍尔德菌属（Burkholderia）和假单胞菌属（Pseudomonas）的2型PHA合酶，或来自芽孢杆菌属（Bacillus）的4型PHA合酶，更优选来自不动杆菌（Acinetobacter sp.）RA3849、霍乱弧菌（Vibrio cholerae）、副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、斑点气单胞菌（Aeromonas punctata）FA440、嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）、紫色色杆菌（Chromobacterium violaceum）、假单胞菌（Pseudomonas sp.）61-3、生枝动胶菌（Zoogloea ramigera）、肥大产碱菌（Alcaligenes latus）、产碱菌（Alcaligenes sp.）SH-69、食酸代尔夫特菌（Delftia acidovorans）、伯克霍尔德菌（Burkholderia sp.）DSMZ9242、真养产碱杆菌（Ralstonia eutrophia）H16、洋葱伯克霍尔德菌（Burkholderia cepacia）、赤红球菌（Rhodococcus rubber）PP2、戈登氏菌（Gordonia rubripertinctus）、普氏立克次体（Rickettsia prowazekii）、集胞藻（Synechocystis sp.）PCC6803、沙氏外硫红螺菌（Ectothiorhodospira shaposhnikovii）N1、普氏荚硫菌（Thiocapsa pfennigii）9111、酒色异着色菌（Allochromatium vinosum）D、紫囊硫菌（Thyocystis violacea）2311、类球红细菌（Rhodobacter sphaeroides）、脱氮副球菌（Paracoccus denitrificans）、荚膜红细菌（Rhodobacter capsulatus）、新月柄杆菌（Caulobacter crescentus）、扭脱甲基杆菌（Methylobacterium extorquens）、茎瘤固氮根瘤菌（Azorhizobium caulinodans）、根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）、苜蓿中华根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）41、深红红螺菌（Rhodospirillum rubrum）HA和深红红螺菌ATCC25903的1型PHA合酶；来自石竹伯克霍尔德菌（Burkholderia caryophylli）、绿针假单胞菌（Pseudomonas chloraphis）、假单胞菌Pseudomonas sp.）61-3、恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）U、食油假单胞菌Pseudomonas oleovorans）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、食树脂假单胞菌（Pseudomonas resinovorans）、斯氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）、门多萨假单胞菌（Pseudomonas mendocina）、类产碱假单胞菌（Pseudomonas pseudolcaligenes）、恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）BM01、硝基还原假单胞菌（Pseudomonas nitroreducins）、绿针假单胞菌（Pseudomonas chloraphis）的2型PHA合酶；以及来自巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）和芽孢杆菌（Bacillus sp.）INT005的4型PHA合酶。
[0057] 在其它实施方案中，聚合物合酶为来自革兰氏阴性和革兰氏阳性真细菌或来自古细菌的PHA聚合物合酶。
[0058] 在多个实例中，聚合物合酶可以包含来自保藏号分别为AY836680、AE004091、AB205104、AF109909、YP137339、AB049413和AF150670的钩虫贪铜菌（C.necator）、铜绿假单胞菌（P.aeruginosa）、酒色异着色菌（A.vinosum）、巨大芽孢杆菌（B.megaterium）、死海盐盒菌（H.marismortui）、致黄假单胞菌（P.aureofaciens）或恶臭假单胞菌（P.putida）的PHA聚合物合酶。
[0059] 其它适用于本发明的聚合物合酶包括来自分别以保藏号标识的生物的聚合物合酶：真养产碱杆菌（A34341）、普氏荚硫菌（X93599）、斑点气单胞菌（O32472）、假单胞菌61-3（AB014757和AB014758）、类球红细菌（AAA72004）、紫色色杆菌（AAC69615）、泊库岛食烷菌（A.borkumensis）SK2（CAL17662）、泊库岛食烷菌SK2（CAL16866）、类球红细菌KD131（ACM01571和YP002526072）、不透明红球菌（R.opacus）B4（BAH51880和YP002780825）、多噬伯克霍尔德菌（B.multivorans）ATCC17616（YP001946215和BAG43679）、泊库岛食烷菌SK2（YP693934和YP693138）、深红红螺菌（AAD53179）、γ变形菌（gamma proteobacterium）HTCC5015（ZP05061661和EDY86606）、固氮弧菌（Azoarcus sp.）BH72（YP932525）、紫色色杆菌ATCC12472（NP902459）、湖沉积杆菌（Limnobacter sp.）MED105（ZP01915838和EDM82867）、M.algicola DG893（ZP01895922和EDM46004）、类球红细菌（CAA65833）、紫色色杆菌ATCC12472（AAQ60457）、肥大产碱菌（AAD10274、AAD01209和AAC83658）、嗜麦芽窄食单孢菌（S.maltophilia）K279a（CAQ46418和YP001972712）、茄科雷尔氏菌（R.solanacearum）IPO1609（CAQ59975和YP002258080）、多噬伯克霍尔德菌ATCC17616（YP001941448和BAG47458）、假单胞菌gl13（ACJ02400）、假单胞菌gl06（ACJ02399）、假单胞菌gl01（ACJ02398）、根瘤菌（R.sp.）gl32（ACJ02397）、豌豆根瘤菌（R.leguminosarum bv.viciae）3841（CAK10329和YP770390）、固氮弧菌BH72（CAL93638）、假单胞菌LDC-5（AAV36510）、L.nitroferrum2002（ZP03698179）、索氏菌（Thauera sp.）MZ1T（YP002890098和ACR01721）、耐辐射甲基杆菌（M.radiotolerans）JCM2831（YP001755078和ACB24395）、甲 基 杆 菌4-46（YP001767769 和ACA15335）、L.nitroferrum2002（EEG08921）、脱 氮副球菌（BAA77257）、格瑞菲斯瓦尔德磁螺菌（M.gryphiswaldense）（ABG23018）、假单胞菌USM4-55（ABX64435和ABX64434）、嗜水气单胞菌（AAT77261和AAT77258）、芽孢杆菌INT005（BAC45232和BAC45230）、恶臭假单胞菌（AAM63409和AAM63407）、戈登氏菌（G.rubripertinctus）（AAB94058）、巨大芽孢杆菌（AAD05260）、食酸代尔夫特菌（BAA33155）、嗜丝氨酸副球菌（P.seriniphilus）（ACM68662）、假单胞菌14-3（CAK18904）、假单胞菌LDC-5（AAX18690）、假单胞菌PC17（ABV25706）、假单胞菌3Y2（AAV35431、AAV35429和AAV35426）、门多萨假单胞菌（AAM10546和AAM10544）、硝基还原假单胞菌（P.nitroreducens）（AAK19608）、类产碱假单胞菌（AAK19605）、食树脂假单胞菌（AAD26367和AAD26365）、假单胞菌USM7-7（ACM90523和ACM90522）、荧光假单胞菌（P.fluorescens）（AAP58480）和其它未培养细菌（BAE02881、BAE02880、BAE02879、BAE02878、BAE02877、BAE02876、BAE02875、BAE02874、BAE02873、BAE02872、BAE02871、BAE02870、BAE02869、BAE02868、BAE02867、BAE0286、BAE02865、BAE02864、BAE02863、BAE02862、BAE02861、BAE02860、BAE02859、BAE02858、BAE02857、BAE07146、BAE07145、BAE07144、BAE07143、BAE07142、BAE07141、BAE07140、BAE07139、BAE07138、BAE07137、BAE07136、BAE07135、BAE07134、BAE07133、BAE07132、BAE07131、BAE07130、BAE07129、BAE07128、BAE07127、BAE07126、BAE07125、BAE07124、BAE07123、BAE07122、BAE07121、BAE07120、BAE07119、BAE07118、BAE07117、BAE07116、BAE07115、BAE07114、BAE07113、BAE07112、BAE07111、BAE07110、BAE07109、BAE07108、BAE07107、BAE07106、BAE07105、BAE07104、BAE07103、BAE07102、BAE07101、BAE07100、BAE07099、BAE07098、BAE07097、BAE07096、BAE07095、BAE07094、BAE07093、BAE07092、BAE07091、BAE07090、BAE07089、BAE07088、BAE07053、BAE07052、BAE07051、BAE07050、BAE07049、BAE07048、BAE07047、BAE07046、BAE07045、BAE07044、BAE07043、BAE07042、BAE07041、BAE07040、BAE07039、BAE07038、BAE07037、BAE07036、BAE07035、BAE07034、BAE07033、BAE07032、BAE07031、BAE07030、BAE07029、BAE07028、BAE07027、BAE07026、BAE07025、BAE07024、BAE07023、BAE07022、BAE07021、BAE07020、BAE07019、BAE07018、BAE07017、BAE07016、BAE07015、BAE07014、BAE07013、BAE07012、BAE07011、BAE07010、BAE07009、BAE07008、BAE07007、BAE07006、BAE07005、BAE07004、BAE07003、BAE07002、BAE07001、BAE07000、BAE06999、BAE06998、BAE06997、BAE06996、BAE06995、BAE06994、BAE06993、BAE06992、BAE06991、BAE06990、BAE06989、BAE06988、BAE06987、BAE06986、BAE06985、BAE06984、BAE06983、BAE06982、BAE06981、BAE06980、BAE06979、BAE06978、BAE06977、BAE06976、BAE06975、BAE06974、BAE06973、BAE06972、BAE06971、BAE06970、BAE06969、BAE06968、BAE06967、BAE06966、BAE06965、BAE06964、BAE06963、BAE06962、BAE06961、BAE06960、BAE06959、BAE06958、BAE06957、BAE06956、BAE06955、BAE06954、BAE06953、BAE06952、BAE06951、BAE06950、BAE06949、BAE06948、BAE06947、BAE06946、BAE06945、BAE06944、BAE06943、BAE06942、BAE06941、BAE06940、BAE06939、BAE06938、BAE06937、BAE06936、BAE06935、BAE06934、BAE06933、BAE06932、BAE06931、BAE06930、BAE06929、BAE06928、BAE06927、BAE06926、BAE06925、BAE06924、BAE06923、BAE06922、BAE06921、BAE06920、BAE06919、BAE06918、BAE06917、BAE06916、BAE06915、BAE06914、BAE06913、BAE06912、BAE06911、BAE06910、BAE06909、BAE06908、BAE06907、BAE06906、BAE06905、BAE06904、BAE06903、BAE06902、BAE06901、BAE06900、BAE06899、BAE06898、BAE06897、BAE06896、BAE06895、BAE06894、BAE06893、BAE06892、BAE06891、BAE06890、BAE06889、BAE06888、BAE06887、BAE06886、BAE06885、BAE06884、BAE06883、BAE06882、BAE06881、BAE06880、BAE06879、BAE06878、BAE06877、BAE06876、BAE06875、BAE06874、BAE06873、BAE06872、BAE06871、BAE06870、BAE06869、BAE06868、BAE06867、BAE06866、BAE06865、BAE06864、BAE06863、BAE06862、BAE06861、BAE06860、BAE06859、BAE06858、BAE06857、BAE06856、BAE06855、BAE06854、BAE06853 和BAE06852）。
[0060] 在不同的实施方案中，聚合物合酶可通过使底物(R)-羟基酰基-CoA或其它CoA硫酯或其衍生物聚合或促进其聚合作用而用于在体外制备聚合物微粒。
[0062] 在不同的实施方案中，催化剂为酶。在代表性实例中，催化剂为酶，前体物质为酶底物，并且目标物质为酶催化反应产物。在进一步实施方案中，聚合物微粒群可包含多于一种或多种酶。特别预期的是其中聚合物微粒群包含两种或多种酶的实施方案，其中反应产物被另一种酶催化，例如，包含部分或全部合成或催化路径的两种或多种酶。
[0063] 在一个实施方案中，一种或多种聚合物微粒持久地与可渗透或半渗透载体结合。在另一个实施方案中，一种或多种聚合物微粒可逆地与可渗透或半渗透载体结合。
[0064] 在不同的实施方案中，一种或多种聚合物微粒共价或非共价结合至半渗透过滤器。例如，一种或多种聚合物微粒吸附于半渗透载体或膜之上。在另一个实例中，一种或多种聚合物微粒包含能够结合至半渗透载体或膜的配体。在不同的实施方案中，半渗透载体包含以下的一种或多种：聚醚砜、PVDF、PP、PEES HDPE（高密度聚乙烯）、PP（聚丙烯）、PEEK（聚醚醚酮）、PET和FEP（氟化乙烯丙烯）。在另一个实施方案中，半渗透载体包含包括，例如，纤维素、派生纤维素或稳定纤维素的多糖。在又一个实施方案中，半渗透载体包含一种或多种陶瓷。
[0065] 在不同的实施方案中，半渗透过滤器为以下构造之一：卷曲、盘架、平板、中空纤维、旋转盘或管状。其实例可便利地作为盒或筒提供。
[0066] 在不同的实施方案中，在以下的一种或多种存在下，通过切向流过滤制备、分离或纯化一种或多种聚合物微粒：清洁剂、pH调节剂、一种或多种溶剂、一种或多种离液剂、一种或多种酶和一种或多种硫醇。例如，切向流过滤包括化学处理剂例如酸或碱处理剂。在不同的实施方案中，该方法包含一种或多种本文所示例的化学处理剂，例如，一种或多种实施例12中所示例的处理。
[0067] 在不同的实施方案中，使用切向流过滤制备、分离或纯化一种或多种物质或一种或多种聚合物微粒的方法包含均质化、微流化、超声、离心或其任意结合，或在均质化、微流化、超声、离心或其任意结合之前或之后。
[0068] 在不同的实施方案中，能够结合抗体的配体选自蛋白A、蛋白G、蛋白A/G、蛋白L、其重组变体、包括其重组功能性片段的其功能性片段（例如蛋白A的Z域）、和其任意结合（例如包含邻接重复蛋白A的Z域的ZZ域）。
[0069] 意欲对本文所公开的数值范围的提及（例如，1-10）也具体表现为对全部处于该范围之内的有理数（例如，1、1.1、2、3、3.9、4、5、6、6.5、7、8、9和10）以及处于该范围之内的有理数的任何范围（例如，2-8、1.5-5.5和3.1-4.7）的提及，因此，本文明确公开的全部范围的全部子范围因此被明确地公开。这些仅是明确意指的实例，并且与此类似，所列举的最低值和最高值之间所有可能的数值组合应视为明确陈述于本申请中。
[0070] 在本说明书引用专利说明书、其它外部文献或其它信息源的情况下，通常是为了提供讨论本发明特征的背景的目的。除非另有明确说明，对该外部文献的引用不被解释为以承认该文献或该信息源为现有技术或构成部分本领域的公知常识。
[0072] 图1呈现了切向流过滤示意图（图1A）和示例性简单切向流过滤体系（图IB），所述体系利用进料泵以允许体系中的渗透物由进料储罐穿过切向流过滤膜筒而再循环。
[0073] 图2-4显示了可用以使用本发明方法由源液体纯化或制备一种或多种目标物质的通用方案。
[0074] 图5呈现了如本文实施例所述用于IgG免疫球蛋白的切向流过滤纯化的ZZPhaC-聚合物微粒的聚合物微粒蛋白图（Coomassie蓝和银染色）SDS-PAGE分析照片。线
1，MW标记；线2，未过滤颗粒；线3，来自100kDa过滤的滞留物；线4，来自0.1μm过滤的滞留物；线3，来自0.2μm过滤的滞留物。
1，MW标记；线2，未过滤颗粒；线3，来自100kDa过滤的滞留物；线4，来自0.1μm过滤的滞留物；线3，来自0.2μm过滤的滞留物。
[0075] 图6呈现了如本文实施例所述用于IgG免疫球蛋白的切向流过滤纯化的ZZPhaC-聚合物微粒的聚合物微粒蛋白图GC/MS谱，。
[0077] 图8为显示来自BSA和IgG混合物TFF渗滤的渗滤级份洗脱曲线的图。A5BSA未结合至包含Z-域的本发明聚合物微粒并容易地自该体系移除。在浓缩和用50mM柠檬酸盐
150mM盐（pH3.0）处理滞留物珠之后（处于级份13），IgG自该珠释放并容易地自该滞留物渗滤。
150mM盐（pH3.0）处理滞留物珠之后（处于级份13），IgG自该珠释放并容易地自该滞留物渗滤。
[0078] 图9描绘了渗滤级份的SDS-PAGE分析，所述渗滤级份如本文实施例2所述来自由BSA得到的人类IgGTFF分离。图9A显示了第一TFF280nm峰中含BSA级份的洗脱（1x PBS pH7.4洗涤级份）。图9B显示了用柠檬酸盐（pH3.0）渗滤包含Z-域珠的本发明聚合物微粒之后含IgG级份的洗脱。
[0079] 图10为显示了自山羊血清纯化山羊IgG的洗脱曲线，如实施例3所述，所述纯化使用包含来自蛋白G的GB1-域的本发明聚合物微粒和TFF。用包含GB1-域微粒的5g湿重本发明聚合物微粒与50mL1:10稀释（于PBS中）山羊血清悬浮液一起孵育并随后对其渗滤
2
（50cm 筒，0.1um）以移除血清蛋白。浓缩至20mL后洗脱IgG并于级份15处针对于150mM NaCl中的50mM柠檬酸钠（pH3.0）渗滤。
2
（50cm 筒，0.1um）以移除血清蛋白。浓缩至20mL后洗脱IgG并于级份15处针对于150mM NaCl中的50mM柠檬酸钠（pH3.0）渗滤。
[0080] 图11显示了来自山羊血清的IgG纯化TFF渗滤级份的SDS-PAGE分析。图11A显示了洗脱自TFF的银染色血清蛋白。图11B显示了用pH为3.0的柠檬酸盐渗滤之后洗脱
自TFF的蛋白，作为洗脱级份中主要蛋白，IgG重链和IgG轻链清晰可见。
自TFF的蛋白，作为洗脱级份中主要蛋白，IgG重链和IgG轻链清晰可见。
[0081] 图12显示了如实施例4所述使用TFF和包含金结合-域的本发明聚合物微粒使2
胶状金从溶液移除的测量图。使0.005%胶状金的30ml悬浮液在具有20cm、0.2um中空纤维微滤筒的TFF体系中循环，渗透物流为9ml/min。于8、13和29分钟（*）处，向滞留物分别加入30mg、300mg和300mg包含金结合-域的本发明聚合物微粒。于520nm处测量渗透
物中胶状金的吸光率。
胶状金从溶液移除的测量图。使0.005%胶状金的30ml悬浮液在具有20cm、0.2um中空纤维微滤筒的TFF体系中循环，渗透物流为9ml/min。于8、13和29分钟（*）处，向滞留物分别加入30mg、300mg和300mg包含金结合-域的本发明聚合物微粒。于520nm处测量渗透
物中胶状金的吸光率。
[0082] 图13显示了如本文实施例5所述使用TFF从淀粉生物转化介导的淀粉酶结合微粒回收麦芽糖的图。使用2g聚Enz-Amy珠将可溶淀粉悬浮液（300ml%、4%和8%w/v）转化为麦芽糖。通过TFF过滤悬浮液以回收渗透物中的麦芽糖和在滞留物级份中包含该珠。
[0083] 图14显示了如实施例7所述TFF期间使用有机磷水解酶结合微粒的甲基对硫磷2
向对硝基苯酚的转化。使30ml甲基对硫磷溶液（200uM）在具有20cm、0.2um中空纤维筒的TFF体系中循环。记录相同条件下的两轮生物转化。
向对硝基苯酚的转化。使30ml甲基对硫磷溶液（200uM）在具有20cm、0.2um中空纤维筒的TFF体系中循环。记录相同条件下的两轮生物转化。
[0084] 图15显示了如本文实施例7所述使用TFF渗滤从有机磷水解酶结合微粒悬浮液中移除对硝基苯酚。
[0085] 图16显示了如本文实施例8所述用于纯化直接来自细胞匀浆的PHB聚合物微粒的简单化小规模横流过滤处理方案图。设计策略以允许通过使用广泛微流化来高度分散匀浆悬浮液。均质化之后，在过滤之前加入DNA酶和MgCl2以缩小DNA片段的尺寸。向EDTA大量过量地加入MgCl2以允许DNA酶活化。在TFF期间，将匀浆悬浮液渗滤入八体积的渗滤缓冲液以移除宿主细胞蛋白和核酸。
[0086] 图17A描绘了如本文实施例9所述250ml粗细胞匀浆的渗透物洗脱曲线TFF。在2
细胞匀浆上、在110cm0.1μm中空纤维筒上使用8渗滤体积的PBS-EDTA-20%乙醇进行TFF纯化。图7B为来自细胞匀浆TFF纯化的渗滤级份上的Bradford蛋白试验图。图7C为渗
滤级份的SDS-PAGE。在15%Gel（线1，mw std；线2，20μm最终珠悬浮液）上运行20μm试样量的渗滤级份1-8（线3-10）。样品通过体积装载并且没有调节蛋白含量。
细胞匀浆上、在110cm0.1μm中空纤维筒上使用8渗滤体积的PBS-EDTA-20%乙醇进行TFF纯化。图7B为来自细胞匀浆TFF纯化的渗滤级份上的Bradford蛋白试验图。图7C为渗
滤级份的SDS-PAGE。在15%Gel（线1，mw std；线2，20μm最终珠悬浮液）上运行20μm试样量的渗滤级份1-8（线3-10）。样品通过体积装载并且没有调节蛋白含量。
[0087] 图18描绘了如本文实施例10所述通过用0.2%脱氧胆酯TFF纯化的PHB微粒的渗透物分析。如图所示，符号代表跨越12渗滤体积收集的渗滤级份A260（Δ）和A280nm（■）吸光率测量，同时也显示了测量的pH（o）。针对8体积的10mM Tris10mM EDTA0.2%脱氧胆酯pH11、随后4体积的PBS（pH7.4）渗滤微粒。
[0088] 图19显示了如本文实施例10所述TFF纯化后，包含Z-域的本发明聚合物微粒的IgG结合能力试验。渗滤之后，在多个含0.2%脱氧胆酯的溶液（表2）中，于室温下在PBS（pH7.4）中用5mg人类IgG与50mg试样量珠30分钟一起孵育。孵育后，离心聚合物微粒以移除未结合的级份并随后用糖胶缓冲液（pH2.7）洗脱，以从包含Z-域的本发明聚合物微粒洗脱IgG。再次离心聚合物微粒并使用Bradford蛋白试验测量回收的洗出上清液中的IgG。
[0089] 图20描绘了如本文实施例11所述使用开放式流道TFF体系的包含GB1-域的本发明聚合物微粒的渗透物分析。将卢布若尔（lubrol）-萃取的PHB聚合物微粒填装至Millipore Prostak–4轴体系。悬浮该珠以产生1.3升滞留物，和收集并分析1升渗滤级份。
[0090] 图21显示了如本文实施例11所述TFF纯化后，包含GB1-域的本发明聚合物微粒的IgG结合能力试验。自甘油梯度或TFF-卢布若尔基过程纯化之后，于室温下在PBS
（pH7.4）中用5mg人类IgG与50mg试样量的聚合物微粒30分钟一起孵育。孵育后，分离聚合物微粒以移除未结合的级份和随后用糖胶缓冲液（pH2.7）洗脱，以从聚合物微粒洗脱IgG。再次离心聚合物微粒并使用Bradford蛋白试验测量回收的洗出上清液中的IgG。
（pH7.4）中用5mg人类IgG与50mg试样量的聚合物微粒30分钟一起孵育。孵育后，分离聚合物微粒以移除未结合的级份和随后用糖胶缓冲液（pH2.7）洗脱，以从聚合物微粒洗脱IgG。再次离心聚合物微粒并使用Bradford蛋白试验测量回收的洗出上清液中的IgG。
[0091] 图22为多种萃取剂对宿主细胞蛋白/核酸移除和细胞提取物中从包含Z-域的本发明聚合物微粒的残留结合活性影响的描绘图。图22A显示了稀释于PBS中（20%，在需要的地方）的批洗涤上清液A260nm和A280nm吸光率结果。图22B显示了IgG结合活性，其中粗聚合物微粒球在PBS中洗涤1次、于5000xg下离心20分钟并称重变干小球和测定重量正常化IgG结合活性。
[0093] 图24显示了如本文实施例14所述通过SDS清洁剂萃取，宿主细胞生物质从PHB聚合物微粒的移除。将两个单独的亚批次生物质（1.1-1.2kg）悬浮至2.7升的0.08%SDS、
25mM Tris10mM EDTA（pH11）并微流化。分别于2.7L、1L和1L体积在溶解缓冲液、10mM硫代甘油和0.1M NaOH中进行相继化学洗涤。测定每个处理步骤中粗聚合物微粒的湿重。
25mM Tris10mM EDTA（pH11）并微流化。分别于2.7L、1L和1L体积在溶解缓冲液、10mM硫代甘油和0.1M NaOH中进行相继化学洗涤。测定每个处理步骤中粗聚合物微粒的湿重。
[0094] 图25描绘了如本文图14所述用SDS基TFF纯化过程纯化的、包含Z-域的本发明聚合物微粒的渗透物分析。将SDS萃取PHB珠装填于具有3个二轴模型的Millipore
2
Prostak体系（0.41m）。将珠悬浮以产生2升滞留物和两升渗滤级份，然后收集并分析260、
280、600nm吸光率和pH。
2
Prostak体系（0.41m）。将珠悬浮以产生2升滞留物和两升渗滤级份，然后收集并分析260、
280、600nm吸光率和pH。
[0095] 图26描绘了如实施例14所述用SDS基TFF过程纯化的PHB珠的SDS-PAGE分析。将具有5ul样品缓冲液和20μl每个样品的试样量（25μl）装填于8-15%梯度凝胶上。样品标记为1.MW标记，2.粗细胞裂解物，3.溶解后聚合物微粒，4.溶解缓冲液（SDS）洗涤后聚合物微粒，5.硫代甘油洗涤后聚合物微粒，6.NaOH洗涤后聚合物微粒（TFF前），7.TFF纯化后聚合物微粒。
发明详述
发明详述
[0096] 本发明涉及用于切向流过滤技术的方法和组合物。切向流过滤为一种分离技术，其中给料切向流至膜（相对于死端过滤中基本垂直于膜）。该切向流沿着膜产生不同的压力。作为结果，某些微粒穿过膜，而其它微粒继续沿着膜流动（参见图1A），其在某些情况下用以清洁膜。当与死端过滤相比较，切向流通常将减慢微粒进入过滤器饼的堵塞。其它通过切向流过滤体系实现的益处将为本领域技术人员所熟知，并包括高液体体积容量、高目标物质结合能力、聚合物微粒、色谱树脂、膜容易再生，等等。定义
[0097] 如本文所用，术语"无定形聚合物"被理解为无论分子链的不规则排列而于室温下为固体的那些聚合物。这些聚合物基本上是非晶的，并且它们的结晶度通常低于20%、优选低于15%、低于10%、低于5%、优选低于2%、或为0%。那些无定形聚合物特别适合于玻璃化转变温度TG为0°-60℃、优选0°-50℃、优选0°-40℃、优选0°-35℃，并特别为0°-30℃的那些。
[0098] 如本文所用，术语"生物聚合物"被理解为可通过生物学体系或实体合成的那些聚合物，例如但不限于有机体、细胞或蛋白。相应地，术语"生物聚酯"和"生物聚硫酯"分别被理解为可通过生物学体系或实体合成的那些聚酯和聚硫酯。实例包括通过多种细菌和古细菌制备的聚酯和聚羟基羧酸酯，典型地作为一种储存碳或能量的手段，例如但不限于聚硫酯和聚羟基烷酸酯。
[0099] 术语"编码区"或"开放阅读框"（ORF）指的是能够在适当的调控序列控制下制备转录产物和/或多肽的基因组DNA序列或cDNA序列的有义链。编码序列通过5'翻译起始密码子和3'翻译终止密码子的存在来识别。当插入遗传构建体中时，当其有效连接至启动子和终止子序列时，"编码序列"能够被表达。
[0100] 本说明书中所用的术语"包含（comprising）"意指"至少部分地由……组成"。当解释本说明书中每个包括术语"包含"的语句时，也可存在除以该术语开始的那个或那些之外的特征。有关的术语例如"包含（comprises）"被以相同的方式解释。
[0101] 术语"污染物"指的是源材料中不同于目标物质的物质，并理想地从最终目标物质制备中除去。典型的生物学源材料污染物包括核酸、蛋白、肽、内毒素、病毒等。可通过本发明方法的实践移除的污染物具有一种或多种不同于所需产物性质的性质，例如分子量、电荷、对于多种配体的特异性亲和力等。
[0102] 术语"切向流过滤器"和语法等同体在本文指的是一类包含多孔、可渗透或半渗透过滤器元件的过滤器模块或过滤器盒，待过滤的源介质越过所述元件表面以切向流方式流动，例如用于穿过该过滤器元件渗透所选源介质元件或污染物。
[0103] 如本文所用的术语"偶联剂"指的是适用于结合至少一种物质的无机或有机化合物，或者适用于在一侧结合偶联剂并在另一侧结合至少一种物质的其它偶联剂。适当的偶联剂实例、以及它们应用的包括适用于本发明微粒或融合蛋白化学修饰方法的示例性方法介绍于公开号为WO2004/020623的PCT/DE2003/002799（Bernd Rehm），在此通过参考以其整体并入。
[0104] 术语"表达构建体"指的是包括允许转录插入的多核苷酸分子、并任选地将转录物翻译成多肽的元件的遗传构建体。表达构建体在5'至3'方向典型地包含：（1）启动子，在待引入构建体的宿主细胞中起作用，
（2）待表达的多核苷酸，和
（3）终止子，在待引入构建体的宿主细胞中起作用。
（2）待表达的多核苷酸，和
（3）终止子，在待引入构建体的宿主细胞中起作用。
[0105] 本发明的表达构建体被插入用于克隆或用于表达的可复制载体中，或被合并入宿主基因组。
[0106] 适合调整而适用于本发明的表达构建体实例提供于公开号为WO2004/020623的PCT/DE2003/002799（Bernd Rehm）和公开号为WO2007/037706的PCT/NZ2006/000251（Bernd Rehm）中，在此全文并入作为参考。
[0107] 本文在微粒形成蛋白中使用的术语"形成聚合物微粒"和"聚合物微粒的形成"指的是如本文所讨论的微粒形成蛋白的活性。
[0108] 多肽"片段"为行使酶活性或结合活性所需功能和/或提供多肽三维结构的多肽亚序列。
[0109] 如本文所用的术语"融合多肽"指的是包含两个或多个氨基酸序列的多台，例如两个或多个多肽结构域通过各自的氨基和羧基残基以肽键融合以形成单个连续多肽的多肽。应当理解，两个或多个氨基酸序列可直接融合，或经由连接子或间隔臂或附加多肽通过它们各自氨基和羧基端而间接融合。
[0110] 在一个实施方案中，包含融合多肽的氨基酸序列之一包含微粒形成蛋白。在一个实施方案中，包含融合多肽的氨基酸序列之一包含聚合物合酶。
[0111] 在一个实施方案中，包含融合多肽的氨基酸序列之一包含融合配偶体。
[0112] 如本文所用的术语"融合配偶体"指的是多肽，例如蛋白、蛋白片段、结合域、目标结合域、结合蛋白、结合蛋白片段、抗体、抗体片段、抗体重链、抗体轻链、单链抗体、单域抗体（例如VHH）、Fab抗体片段、Fc抗体片段、Fv抗体片段、F(ab')2抗体片段、Fab'抗体片段、单链Fv（scFv）抗体片段、抗体结合域（例如ZZ域）、抗原、抗原决定簇、抗原决定基、半抗原、免疫原、免疫原片段、生物素、生物素衍生物、亲和素、链霉亲和素、底物、酶、抗体酶、辅因子、受体、受体片段、受体亚基、受体亚基片段、配体、抑制因子、激素、凝集素、多聚组氨酸、偶联域、DNA结合域、FLAG表位、半胱氨酸残基、文库肽、报告肽、亲和纯化肽、或其任意两种或多种的任意结合。
[0113] 应当理解，以上所列的两个或多个多肽可形成融合配偶体。
[0114] 在一个实施方案中，融合多肽的氨基酸序列经由连接子或间隔臂间接融合，所述融合多肽的氨基酸序列排列顺序为：聚合物合酶-连接子-融合配偶体，或融合配偶体-连接子-聚合物合酶。在其它实施方案中，融合多肽的氨基酸序列经由附加多肽间接融合或包含附加多肽，其排列顺序为：聚合物合酶-附加多肽-融合配偶体，或聚合物合酶-连接子-融合配偶体-附加多肽。再次，本文特别考虑了聚合物合酶的N-末端延长。
[0115] 在一个示例性实施方案中，融合多肽的氨基酸序列经由连接子或间隔臂间接融合，例如，所述融合多肽的氨基酸序列的排列顺序为：聚合物合酶-连接子-抗体结合多肽，或抗体结合多肽-连接子-聚合物合酶、或聚合物合酶-连接子-酶或酶-连接子-聚合物合酶。在其它示例性实施方案中，融合多肽的氨基酸序列经由附加多肽间接融合或包含附加多肽，其排列顺序为：聚合物合酶-附加多肽-抗体结合多肽，或聚合物合酶-附加多肽-酶、或聚合物合酶-连接子-抗体结合多肽-附加多肽，或聚合物合酶-连接子-酶-附加多肽。再次，本文特别考虑了聚合物合酶的N-末端延长。
[0116] 根据本发明的融合多肽也可包含插入在另一多肽序列中的一个或多个多肽序列。例如，将多肽序列如蛋白酶识别序列插入到包含微粒结合域的蛋白的可变区中。
[0117] 便利地，本发明的融合多肽通过单个核酸序列编码，其中核酸序列包含至少两个分别编码多肽或多肽域的亚序列。在某些实施方案中，所述至少两个亚序列以"同一阅读框"存在以构成单个开放阅读框从而编码如本文所预期的融合多肽。在其它实施方案中，所述至少两个亚序列"不同阅读框"存在，并被核糖体阅读框移码位点或促进阅读框移码的其它序列隔开，从而在翻译后形成融合多肽。在某些实施方案中，至少两个亚序列是邻接的。在其它实施方案中，例如以上所讨论的其中至少两个多肽或多肽域经由附加多肽间接融合的那些，至少两个亚序列是不邻接的。
[0118] 对"结合域"或"能够结合的域"的旨在表示互补结合对的一半，并可包括来自以上所列的结合对。例如，抗体-抗原、抗体-抗体结合域、生物素-链霉亲和素、受体-配体、酶-抑制因子对。目标结合域将结合样品中的目标分子，并例如为抗体或抗体片段。多肽-结合域将结合多肽，并例如为抗体或抗体片段、或来自受体或信号蛋白的结合域。
[0119] 通过结合域结合的物质实例包括蛋白、蛋白片段、肽、多肽、多肽片段、抗体、抗体片段、抗体结合域、抗原、抗原片段、抗原决定簇、表位、半抗原、免疫原、免疫原片段、药物活性剂、生物活性剂、佐剂或其任意两种或多种的任意结合。该物质为根据本发明方法分析的样品中"目标组分″。
[0120] 相应地，"能够结合目标物质的域"和语法等同体将被理解为指的是互补结合对中的一种组分，其中另一种组分为目标物质。
[0121] 术语"遗传构建体"指的是多核苷酸分子，通常为双链DNA，其可能已插入其其他多核苷酸分子（插入的多核苷酸分子）例如，但不限于，cDNA分子。遗传构建体可含有允许转录插入的多核苷酸分子，并任选地，将该转录物翻译成多肽所必需的元件。在多个实施方案中，插入的多核苷酸分子衍生自宿主细胞，或来源于不同细胞或有机体和/或为重组多核苷酸。在一个实施方案中，一旦进入宿主细胞，遗传构建体整合到宿主基因组，例如宿主染色体DNA中。在一个实例中，遗传构建体连接于载体。
[0122] 术语"宿主细胞"指的是细菌细胞、真菌细胞、酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞或动物细胞例如哺乳动物宿主细胞，其为1）天然PHA微粒制备宿主细胞、或2）携带表达构建体的宿主细胞，所述表达构建体包含编码至少硫解酶和还原酶和任选的种子凝集素的核酸序列。需要何种基因来增加宿主细胞对于聚合物微粒形成所缺少的要素将取决于宿主细胞的基因构成和培养基中所提供的何种底物。
[0123] 如本文所用术语"连接子或间隔臂"涉及间接融合两个或多个多肽或编码两个或多个多肽的两个或多个核酸序列的氨基酸或核苷酸序列。在某些实施方案中，连接子或间隔臂长约1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或约100个氨基酸或核苷酸。在其它实施方案中，连接子或间隔臂长约100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或 约 1000个氨基酸或核苷酸。在仍然其它实施方案中，连接子或间隔臂长约1-约1000个氨基酸或核苷酸、长约10-约1000、约50-约1000、约100-约1000、约200-约1000、约300-约1000、约400-约1000、约500-约1000、约600-约1000、约700-约1000、约800-约1000、或约
900-约1000个氨基酸或核苷酸。
900-约1000个氨基酸或核苷酸。
[0124] 在一个实施方案中，连接子或间隔臂可包含限制性酶识别位点。在另一个实施方案中，连接子或间隔臂可包含蛋白酶裂解识别序列，例如肠激酶、凝血酶或Xa因子识别序列，或自剪接元件例如内含子。在另一个实施方案中，连接子或间隔臂促进融合多肽的独立折叠。
[0125] 如本文所用的术语"混合群"指的是两个或多个实体群，处于混合群之内的每个实体群在某些方面与处于该混合群之内的另一实体群存在差异。例如，当用来表述混合的表达构建体群时，这指的是两个或多个表达构建体群，其中每个表达构建体群就该群成员所编码的融合多肽而言、或就构建体的某些其它方面（例如构建体中存在的启动子的特性）而言存在差异。或者，当用来表述融合多肽混合群时，这指的是两个或多个融合多肽群，其中每个融合多肽群就多肽，例如聚合物合酶、融合配偶体例如抗体结合域或酶、该群所含成员而言存在差异。例如，在用于纯化抗体的制备情况下，融合多肽混合群指的是两个或多个融合多肽群，其中每个融合多肽群就多肽，例如聚合物合酶、抗体结合域、该群所含成员而言存在差异。类似地，在用于目标物质的制备情况下，融合多肽混合群指的是两个或多个融合多肽群，其中每个融合多肽群就多肽，例如聚合物合酶、酶、前体结合域、或酶-底物结合域、该群所含成员而言存在差异。仍然进一步地，当用于表述聚合物微粒混合群时，这指的是两个或多个聚合物微粒群，其中每个聚合物微粒群就该群成员所携带的融合多肽而言存在差异。特别考虑了包含两个或多个聚合物微粒亚群的聚合物微粒混合群，其中每个亚群可包含一种或多种本文所描述的融合多肽（例如以上的那些）。
[0126] 如本文所用的术语"核酸"指的是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸碱基或天然核苷酸已知类似物、或其混合物的单链或双链聚合物。除非另有说明，该术语包括对具体序列及其互补序列的引述。术语"核酸"和"多核苷酸"在本文可互换使用。
[0127] "有效连接"意指待表达的序列置于调控元件的控制之下，调控元件包括启动子、组织特异性调控元件、瞬时调控元件、增强子、阻遏子和终止子。
[0128] 术语"过表达"通常指的是超过正常或未转化宿主细胞中制备水平的宿主细胞中基因产物制备。当用于表述信使RNA水平时，术语"过表达"优选表示表达水平比对照宿主细胞或未转化细胞中通常观察到的高至少约3倍。更优选地，表达水平比对照宿主细胞或未转化细胞中通常观察到的高至少约5倍、约10倍、约15倍、约20倍、约25倍、约30倍、约35倍、约40倍、约45倍、约50倍、约55倍、约60倍、约65倍、约70倍、约75倍、约
80倍、约85倍、约90倍、约95倍、或约100倍或以上。
80倍、约85倍、约90倍、约95倍、或约100倍或以上。
[0129] mRNA水平利用本领域技术人员已知的多种技术中的任一种测量，包括但不限于，RNA印迹（Northern blot）分析和RT-PCR，包括定量RT-PCR。
[0130] 如本文所用的术语"微粒结合蛋白"指的是能够结合微粒的蛋白和蛋白域。该结合可通过与聚合物相互作用而直接介导，或经由与结合至聚合物的基团，例如共价结合至聚合物的聚合物合酶相互作用而介导。适用于本文的微粒结合蛋白包括一种或多种来自能够结合聚合物微粒核的蛋白的微粒结合域，例如PHA合酶蛋白C-末端片段或聚合物解聚微粒结合域。
[0131] 术如本文所用语"微粒形成蛋白"指的是微粒形成中所涉及的蛋白。例如，其可选自聚合物解聚酶、聚合物调控蛋白、聚合物合酶和微粒尺寸决定蛋白。微粒形成蛋白优选选自硫解酶、还原酶、聚合物合酶和种子凝集素（phasin）。微粒形成蛋白例如合酶可通过聚合底物或底物衍生物以形成聚合物微粒来催化聚合物微粒的形成。或者，微粒形成蛋白例如硫解酶、还原酶或种子凝集素可通过促进聚合来促进聚合物微粒的形成。例如，硫解酶或还原酶可催化产生聚合酶的适宜底物。种子凝集素可控制所形成的聚合物微粒的大小。优选微粒形成蛋白包含微粒结合域和微粒形成域。
[0132] 如本文所用，术语"微粒形成反应混合物"在宿主细胞或表达构建体包含合酶催化域的情况下至少指的是聚合物合酶底物，或者在宿主细胞或表达构建体包含其他微粒形成蛋白或并非聚合物合酶催化域的微粒结合域的情况下至少指的是聚合物合酶和其底物。
[0133] "微粒大小决定蛋白"指的是控制聚合物微粒尺寸的蛋白。其可例如衍生自种子凝集素样蛋白家族，优选选自来自雷尼尔菌属（Ralstonia）、产碱菌属（Alcaligenes）和假单胞菌属（Pseudomonas）的那些，更优选来自Ralstonia eutropha的种子凝集素基因phaP和来自食油假单胞菌（Pseudomonas oleovorans）的种子凝集素基因phaF。种子凝集素为分子量14-28kDa的两性蛋白，其与聚合物微粒的疏水表面紧密结合。这也可包含结合微粒并影响微粒尺寸的其它宿主细胞蛋白。
[0134] 聚合物合酶至少包含位于合酶蛋白C-末端的合酶催化域，其介导聚合物的聚合反应以及合酶蛋白与微粒核的连接。用于本发明的聚合物合酶详述于Rehm，2003，其通过引用以其整体并入本文。例如，聚合物合酶为来自不动杆菌属（Acinetobacter）、弧菌属（Vibrio）、气 单胞 菌属（Aeromonas）、色 杆菌 属（Chromobacterium）、假 单胞菌属（Pseudomonas）、动胶菌属（Zoogloea）、产碱菌属（Alcaligenes）、代尔夫特菌属（Delftia）、伯克霍尔德菌属（Burkholderia）、雷尔氏菌属（Ralstonia）、红球菌属（Rhodococcus）、戈 登氏 菌属（Gordonia）、红 细菌 属（Rhodobacter）、副球 菌属（Paracoccus）、立克次体属（Rickettsia）、柄杆菌属（Caulobacter）、甲基杆菌属（Methylobacterium）、固氮根瘤菌属（Azorhizobium）、农杆菌属（Agrobacterium）、根瘤菌属（Rhizobium）、中华根瘤菌属（Sinorhizobium）、立克次体属（Rickettsia）、泉古菌门（Crenarchaeota）、集胞藻属（Synechocystis）、外硫红螺菌属（Ectothiorhodospira）、荚硫菌属（Thiocapsa）、囊硫菌属（Thyocystis）和异着色菌属（Allochromatium）的1型PHA合酶；来自伯克霍尔德菌属（Burkholderia）和假单胞菌属（Pseudomonas）的2型PHA合酶，或来自芽孢杆菌属（Bacillus）的4型PHA合酶，更优选来自不动杆菌（Acinetobacter sp.）RA3849、霍乱弧菌（Vibrio cholerae）、副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、斑点气单胞菌（Aeromonas punctata）FA440、嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）、紫色色杆菌（Chromobacterium violaceum）、假单胞菌（Pseudomonas sp.）61-3、生枝动胶菌（Zoogloea ramigera）、肥大产碱菌（Alcaligenes latus）、产碱菌（Alcaligenes sp.）SH-69、食酸代尔夫特菌（Delftia acidovorans）、伯克霍尔德菌（Burkholderia sp.）DSMZ9242、真养产碱杆菌（Ralstonia eutrophia）H16、洋葱伯克霍尔德菌（Burkholderia cepacia）、赤红球菌（Rhodococcus rubber）PP2、戈登氏菌（Gordonia rubripertinctus）、普氏立克次体（Rickettsia prowazekii）、集胞藻（Synechocystis sp.）PCC6803、沙氏外硫红螺菌（Ectothiorhodospira shaposhnikovii）N1、普氏荚硫菌（Thiocapsa pfennigii）9111、酒色异着色菌（Allochromatium vinosum）D、紫囊硫菌（Thyocystis violacea）2311、类球红细菌（Rhodobacter sphaeroides）、脱氮副球菌（Paracoccus denitrificans）、荚膜红细菌（Rhodobacter capsulatus）、新月柄杆菌（Caulobacter crescentus）、扭脱甲基杆菌（Methylobacterium extorquens）、茎瘤固氮根瘤菌（Azorhizobium caulinodans）、根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）、苜蓿中华根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）41、深红红螺菌（Rhodospirillum rubrum）HA和深红红螺菌ATCC25903的1型PHA合酶；来自石竹伯克霍尔德菌（Burkholderia caryophylli）、绿针假单胞菌（Pseudomonas chloraphis）、假单胞菌Pseudomonas sp.）61-3、恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）U、食油假单胞菌Pseudomonas oleovorans）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、食树脂假单胞菌（Pseudomonas resinovorans）、斯氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）、门多萨假单胞菌（Pseudomonas mendocina）、类产碱假单胞菌（Pseudomonas pseudolcaligenes）、恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）BM01、硝基还原假单胞菌（Pseudomonas nitroreducins）、绿针假单胞菌（Pseudomonas chloraphis）的2型PHA合酶；以及来自巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）和芽孢杆菌（Bacillus sp.）INT005的4型PHA合酶
[0135] 适用于本发明的其它聚合物合酶包括来自以下有机体、分别以保藏号标识的聚合物合酶：钩虫贪铜菌（C.necator）（AY836680）、铜绿假单胞菌（P.aeruginosa）（AE004091）、酒色异着色菌（A.vinosum）（AB205104）、巨大芽孢杆菌（B.megaterium）（AF109909）、死海盐盒菌（H.marismortui）（YP137339）、致黄假单胞菌（P.aureofaciens）（AB049413）、恶臭假单胞菌（P.putida）（AF150670）、真养产碱杆菌（R.eutropha）（A34341）、普氏荚硫菌（T.pfennigii）（X93599）、斑点气单胞菌（A.punctata）（O32472）、假单胞菌（A.borkumensis）61-3（Pseudomonas sp.）（AB014757和 AB014758）、类 球 红 细 菌（R.sphaeroides）（AAA72004）、紫色色杆菌（C.violaceum）（AAC69615）、泊库岛食烷菌（A.borkumensis）SK2（CAL17662）、泊库岛食烷菌（A.borkumensis）SK2（CAL16866）、类球红细菌（R.sphaeroides）KD131（ACM01571和YP002526072）、不透明红球菌（R.opacus）B4（BAH51880和YP002780825）、多噬伯克霍尔德菌（B.multivorans）ATCC17616（YP001946215和BAG43679）、泊库岛食烷菌（A.borkumensis）SK2（YP693934和YP693138）、深红红螺菌（R.rubrum）（AAD53179）、γ变 形 菌（gamma proteobacterium）HTCC5015（ZP05061661和EDY86606）、固氮弧菌（Azoarcus sp.）BH72（YP932525）、紫色色杆菌（C.violaceum）ATCC12472（NP902459）、湖沉积杆菌（Limnobacter sp.）MED105（ZP01915838和EDM82867）、M.algicola DG893（ZP01895922和EDM46004）、类球红细菌（R.sphaeroides）（CAA65833）、紫色色杆菌（C.violaceum）ATCC12472（AAQ60457）、肥大产碱菌（A.latus）（AAD10274、AAD01209和AAC83658）、嗜 麦 芽 窄 食 单 孢 菌（S.maltophilia）K279a（CAQ46418 和YP001972712）、茄科雷尔氏菌（R.solanacearum）IPO1609（CAQ59975和YP002258080）、多噬伯克霍尔德菌（B.multivorans）ATCC17616（YP001941448和BAG47458）、假单胞菌（Pseudomonas sp.）gl13（ACJ02400）、假单胞菌（Pseudomonas sp.）gl06（ACJ02399）、假单胞菌（Pseudomonas sp.）gl01（ACJ02398）、根瘤菌（R.sp.）gl32（ACJ02397）、豌豆根瘤菌（R.leguminosarum bv.viciae）3841（CAK10329和YP770390）、固氮弧菌（Azoarcus sp.）BH72（CAL93638）、假单胞菌（Pseudomonas sp.）LDC-5（AAV36510）、L.nitroferrum2002（ZP03698179）、索氏菌（Thauera sp.）MZ1T（YP002890098和ACR01721）、耐辐射甲基杆菌（M.radiotolerans）JCM2831（YP001755078和ACB24395）、甲基杆菌（Methylobacterium sp.）4-46（YP001767769 和ACA15335）、L.nitroferrum2002（EEG08921）、脱 氮 副 球菌（P.denitrificans）（BAA77257）、格 瑞菲斯瓦尔 德磁螺菌（M.gryphiswaldense）（ABG23018）、假单胞菌（Pseudomonas sp.）USM4-55（ABX64435和ABX64434）、嗜水气单胞 菌（A.hydrophila）（AAT77261和AAT77258）、芽 孢杆 菌（Bacillus sp.）INT005（BAC45232和BAC45230）、恶臭假单胞菌（P.putida）（AAM63409和AAM63407）、戈登氏菌（G.rubripertinctus）（AAB94058）、巨大芽孢杆菌（B.megaterium）（AAD05260）、食酸代尔夫特菌（D.acidovorans）（BAA33155）、嗜丝氨酸副球菌（P.seriniphilus）（ACM68662）、假单胞菌（Pseudomonas sp.）14-3（CAK18904）、假单胞菌（Pseudomonas sp.）LDC-5（AAX18690）、假单胞菌（Pseudomonas sp.）PC17（ABV25706）、假单胞菌（Pseudomonas sp.）3Y2（AAV35431、AAV35429和AAV35426）、门多萨假单胞菌（P.mendocina）（AAM10546和AAM10544）、硝基还原假单胞菌（P.nitroreducens）（AAK19608）、类产碱假单胞菌（P.pseudoalcaligenes）（AAK19605）、食树脂假单胞菌（P.resinovorans）（AAD26367和AAD26365）、假单胞菌（Pseudomonas sp.）USM7-7（ACM90523和ACM90522）、荧光假单胞菌（P.fluorescens）（AAP58480）和其它未培养细菌（BAE02881、BAE02880、BAE02879、BAE02878、BAE02877、BAE02876、BAE02875、BAE02874、BAE02873、BAE02872、BAE02871、BAE02870、BAE02869、BAE02868、BAE02867、BAE0286、BAE02865、BAE02864、BAE02863、BAE02862、BAE02861、BAE02860、BAE02859、BAE02858、BAE02857、BAE07146、BAE07145、BAE07144、BAE07143、BAE07142、BAE07141、BAE07140、BAE07139、BAE07138、BAE07137、BAE07136、BAE07135、BAE07134、BAE07133、BAE07132、BAE07131、BAE07130、BAE07129、BAE07128、BAE07127、BAE07126、BAE07125、BAE07124、BAE07123、BAE07122、BAE07121、BAE07120、BAE07119、BAE07118、BAE07117、BAE07116、BAE07115、BAE07114、BAE07113、BAE07112、BAE07111、BAE07110、BAE07109、BAE07108、BAE07107、BAE07106、BAE07105、BAE07104、BAE07103、BAE07102、BAE07101、BAE07100、BAE07099、BAE07098、BAE07097、BAE07096、BAE07095、BAE07094、BAE07093、BAE07092、BAE07091、BAE07090、BAE07089、BAE07088、BAE07053、BAE07052、BAE07051、BAE07050、BAE07049、BAE07048、BAE07047、BAE07046、BAE07045、BAE07044、BAE07043、BAE07042、BAE07041、BAE07040、BAE07039、BAE07038、BAE07037、BAE07036、BAE07035、BAE07034、BAE07033、BAE07032、BAE07031、BAE07030、BAE07029、BAE07028、BAE07027、BAE07026、BAE07025、BAE07024、BAE07023、BAE07022、BAE07021、BAE07020、BAE07019、BAE07018、BAE07017、BAE07016、BAE07015、BAE07014、BAE07013、BAE07012、BAE07011、BAE07010、BAE07009、BAE07008、BAE07007、BAE07006、BAE07005、BAE07004、BAE07003、BAE07002、BAE07001、BAE07000、BAE06999、BAE06998、BAE06997、BAE06996、BAE06995、BAE06994、BAE06993、BAE06992、BAE06991、BAE06990、BAE06989、BAE06988、BAE06987、BAE06986、BAE06985、BAE06984、BAE06983、BAE06982、BAE06981、BAE06980、BAE06979、BAE06978、BAE06977、BAE06976、BAE06975、BAE06974、BAE06973、BAE06972、BAE06971、BAE06970、BAE06969、BAE06968、BAE06967、BAE06966、BAE06965、BAE06964、BAE06963、BAE06962、BAE06961、BAE06960、BAE06959、BAE06958、BAE06957、BAE06956、BAE06955、BAE06954、BAE06953、BAE06952、BAE06951、BAE06950、BAE06949、BAE06948、BAE06947、BAE06946、BAE06945、BAE06944、BAE06943、BAE06942、BAE06941、BAE06940、BAE06939、BAE06938、BAE06937、BAE06936、BAE06935、BAE06934、BAE06933、BAE06932、BAE06931、BAE06930、BAE06929、BAE06928、BAE06927、BAE06926、BAE06925、BAE06924、BAE06923、BAE06922、BAE06921、BAE06920、BAE06919、BAE06918、BAE06917、BAE06916、BAE06915、BAE06914、BAE06913、BAE06912、BAE06911、BAE06910、BAE06909、BAE06908、BAE06907、BAE06906、BAE06905、BAE06904、BAE06903、BAE06902、BAE06901、BAE06900、BAE06899、BAE06898、BAE06897、BAE06896、BAE06895、BAE06894、BAE06893、BAE06892、BAE06891、BAE06890、BAE06889、BAE06888、BAE06887、BAE06886、BAE06885、BAE06884、BAE06883、BAE06882、BAE06881、BAE06880、BAE06879、BAE06878、BAE06877、BAE06876、BAE06875、BAE06874、BAE06873、BAE06872、BAE06871、BAE06870、BAE06869、BAE06868、BAE06867、BAE06866、BAE06865、BAE06864、BAE06863、BAE06862、BAE06861、BAE06860、BAE06859、BAE06858、BAE06857、BAE06856、BAE06855、BAE06854、BAE06853和BAE06852）。
[0136] PHA合酶蛋白的N-末端片段（约氨基酸1-200、或1-150、或1-100）高度可变，并且在某些实例中缺失或替换为酶、抗体结合域、或另一融合配偶体，而不会使合酶失活或阻碍合酶经由聚合物微粒结合域（即C-末端片段）与聚合物核共价相连。合酶的聚合物微粒结合域至少包含介导聚合物核聚合以及聚合物微粒形成的合酶蛋白催化域。
[0137] 在某些实施方案中，PHA合酶蛋白的C-末端片段被修饰、部分缺失或部分替换为酶、抗体结合域、或另一融合配偶体，而不会使合酶失活或阻碍合酶与聚合物微粒共价相连。
[0138] 在某些情况下，酶、抗体结合域、或另一融合配偶体融合至PHA合酶蛋白的N-末端和/或C-末端，而不会使合酶失活或阻碍合酶与聚合物微粒共价相连。类似地，在其它情况下，酶、抗体结合域、或另一融合配偶体插入PHA合酶蛋白中，或者实际上位于微粒形成蛋白之中。PhaC融合实例在本领域已知且已于本文中呈现。
[0139] 在一个具体实例中，PHA合酶蛋白的N-末端片段（约氨基酸1-200、或1-150、或1-100）缺失或替换为抗体结合域例如蛋白A的Z域或相同衔接重复，而不会使合酶失活或阻碍合酶与聚合物微粒的共价相连。
[0140] 如本文所用的"聚合物解聚酶"指的是能够将既有的聚合物（例如发现于聚合物微粒中的聚合物）水解成水溶性单体和低聚物的蛋白。聚合物解聚酶的实例存在于广泛多种的PHA降解细菌和真菌之中，并包括来自Paucimonas lemoignei的PhaZ1-PhaZ7细胞外解聚酶、来自食酸菌（Acidovorax sp.）、粪产碱菌（A.faecalis）（AE122和T1菌株）、食酸代尔夫特菌（丛毛单胞菌）（Delftia（Comamonas）acidovorans）菌株YM1069、睾丸酮丛毛单胞菌（Comamonas testosteroni）、丛毛单胞菌（Comamonas sp.）、纤发菌（Leptothrix sp.）菌株HS、假单胞菌（Pseudomonas sp.）菌株GM101（保藏号AF293347）、荧光假单胞菌（P.fluorescens）菌株GK13、斯氏假单胞菌（P.stutzeri）、皮氏雷尔氏菌（R.pickettii）（A1和K1菌株，保藏号JO4223、D25315）、脱叶链霉菌（S.exfoliates K10）和吸水链霉菌（Streptomyces hygroscopicus）的PhaZ解聚酶（参见Jendrossek D.，和Handrick，R.，Microbial Degredation of Polyhydroxyalkanoates，Annual Review of Microbiology，
2002，56：403-32)。
2002，56：403-32)。
[0141] 如本文所用的术语"多肽"包含任何长度的氨基酸链，但优选至少5个氨基酸，包括全长蛋白，其中氨基酸残基通过共价肽键连接。本发明多肽为纯化的天然产物，或者部分或完全利用重组或合成技术制备。该术语可指多肽、多肽聚集体例如二聚体或其他多聚体、融合多肽、多肽变体、或其衍生物。
[0143] 术语"终止子"指的是终止转录的序列，其见于翻译序列下游基因的3'非翻译末端。终止子是mRNA稳定性的重要决定因素，并且在某些情况下发现具有空间调控功能。
[0144] 当表述结合至或吸附入或合并入聚合物微粒时，术语"物质"旨在表示通过融合配偶体结合的物质或能够吸附入或合并入聚合物微粒的物质。
[0145] 如本文所用的术语"变体"指的是与特定识别序列不同的多核苷酸或多肽序列，其中一个或多个核苷酸或氨基酸残基被缺失、取代或添加。变体为天然存在的等位基因变体、或非天然存在的变体。变体来自相同或其他物种，并且可包含同源物、旁系同源物和直系同源物。在某些实施方案中，多核苷酸和多肽变体拥有与野生型多核苷酸或多肽相同或相似的生物学活性。述及多核苷酸和多肽的术语"变体"包含如本文所定义的所有形式的多核苷酸和多肽。多核苷酸和多肽变体
[0146] 如本文所用的术语"多核苷酸"表示任何长度的单链或双链脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，但优选至少15个核苷酸，并且作为非限制性实例包括基因编码和非编码序列、有义和反义互补序列、外显子、内含子、基因组DNA、cDNA、前mRNA、mRNA、rRNA、siRNA、miRNA、tRNA、核酶、重组多肽、分离的和纯化的天然存在的DNA或RNA序列、合成RNA和DNA序列、核酸探针、引物和片段。许多核酸类似物为本领域所熟知并也预期的。
[0147] 本文所提供的多核苷酸序列"片段"为连续核苷酸的亚序列，优选长至少15个核苷酸。本发明的片段优选包含本发明多核苷酸的至少20个核苷酸，更优选至少30个核苷酸，更优选至少40个核苷酸，更优选至少50个核苷酸和最优选至少60个连续核苷酸。多核苷酸序列片段可用于反义、基因沉默、三螺旋或核酶技术中，或作为引物、探针、纳入在微阵列之中、或用于多核苷酸基选择方法。
[0149] 优选本发明启动子多核苷酸序列片段包含本发明启动子多核苷酸的至少20个，更优选至少30个，更优选至少40个，更优选至少50个，更优选至少100个，更优选至少200个，更优选至少300个，更优选至少400个，更优选至少500个，更优选至少600个，更优选至少700个，更优选至少800个，更优选至少900个和最优选至少1000个连续核苷酸。
[0150] 术语"引物"指的是短多核苷酸，通常具有游离3′OΗ基团，其杂交至模板并用于引发与该模板互补的多核苷酸聚合反应。该引物优选长至少5个，更优选至少6个，更优选至少7个，更优选至少9个，更优选至少10个，更优选至少11个，更优选至少12个，更优选至少13个，更优选至少14个，更优选至少15个，更优选至少16个，更优选至少17个，更优选至少18个，更优选至少19个，更优选至少20个核苷酸。
[0151] 术语"探针"指的是短多核苷酸，其用于在杂交基测定法中检测与该探针互补的多核苷酸序列。探针可由如本文所定义的多核苷酸"片段"组成。优选该探针长至少5个，更优选至少10个，更优选至少20个，更优选至少30个，更优选至少40个，更优选至少50个，更优选至少100个，更优选至少200个，更优选至少300个，更优选至少400个和最优选至少500个核苷酸。
[0152] 如本文所用的术语"变体"指的是与特定识别序列不同的多核苷酸或多肽序列，其中一个或多个核苷酸或氨基酸残基被缺失、取代、或添加。变体为天然存在的等位基因变体、或非天然存在的变体。变体来自相同或其它物种，并可包含同源物、旁系同源物和直系同源物。在某些实施方案中，多核苷酸和多肽变体拥有与野生型多核苷酸或多肽相同或相似的生物学活性。述及多核苷酸和多肽的术语"变体"包含如本文所定义的所有形式的多核苷酸和多肽。多核苷酸变体
[0153] 变体多核苷酸序列优选与指定多核苷酸序列呈现至少50%、更优选至少51%、至少52%、至少53%、至少54%、至少55%、至少56%、至少57%、至少58%、至少59%、至少60%、至少
61%、至少62%、至少63%、至少64%、至少65%、至少66%、至少67%、至少68%、至少69%、至少
70%、至少71%、至少72%、至少73%、至少74%、至少75%、至少76%、至少%、至少77%、至少78%、至少79%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%的同一性。就指定多核苷酸序列的至少20个核苷酸位置、优选至少50个核苷酸位置、至少100个核苷酸位置的比较窗口或全长来寻找同一性。
61%、至少62%、至少63%、至少64%、至少65%、至少66%、至少67%、至少68%、至少69%、至少
70%、至少71%、至少72%、至少73%、至少74%、至少75%、至少76%、至少%、至少77%、至少78%、至少79%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%的同一性。就指定多核苷酸序列的至少20个核苷酸位置、优选至少50个核苷酸位置、至少100个核苷酸位置的比较窗口或全长来寻找同一性。
[0154] 多核苷酸序列同一性可按以下方式来确定。利用可由NCBI（ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/）公开获得的BLASTN（来自BLAST程序套，2.2.10版[2004年10月]）通过bl2seq（Tatiana A.Tatusova，Thomas L.Madden(1999)，″Blast2sequences-a new tool for comparing protein and nucleotide sequences″，FEMS Microbiol Lett.174：247-250）将目标多核苷酸序列与候选多核苷酸序列进行比较。使用bl2seq的默认参数，不过应当关闭对低复杂度部分的过滤。
[0155] 可利用如下unix命令行参数来检查多核苷酸序列的同一性：bl2seq-i nucleotideseq1-j nucleotideseq2-F F-p blastn
[0157] 多核苷酸序列的同一性也可利用全局序列比对程序（例如Needleman，S.B.and Wunsch，C.D.(1970)J.Mol.Biol.48，443-453）就候选和目标多核苷酸序列重叠部分的全长来计算。Needleman-Wunsch全局序列比对算法的完整执行见可由http://www.hgmp.mrc.ac.uk/Software/EMBOSS/ 获 得 的 EMBOSS 包（Rice，P.Longden，I.and Bleasby，A.EMBOSS：The European Molecular Biology Open Software Suite，Trends in Genetics June2000，vol16，No6.pp.276-277）中的needle程序。欧洲生物信息研究所（European Bioinformatics Institute）服务器也于http:/www.ebi.ac.uk/emboss/align/在线提供执行两序列间的EMBOSS-needle全局比对工具。
[0158] 或者可利用GAP程序，其计算两序列的最佳全局比对而不会对末端缺口进行罚分。GAP描述于以下文献：Huang，X.(1994)On Global Sequence Alignment.Computer Applications in the Biosciences10，227-235。
[0159] 本发明的多核苷酸变体也包含与一个或多个特定识别序列呈现相似性的序列，其很可能保留了那些序列的等同功能，这不可能合理预期会随机发生。就多肽而言，该序列相似性利用可公开获得的来自NCBI（ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/）的BLAST程序套（2.2.10版[2004年10月]）的bl2seq程序来测定。
[0160] 可利用如下unix命令行参数来检查多核苷酸序列的相似性：bl2seq-i nucleotideseq1-j nucleotideseq2-F F-p tblastx
[0161] 参数-F F关闭对低复杂度区段的过滤。参数-p为序列对选择适当的算法。该程序寻找序列间的相似性区域，并就每一个这样的区域给出"E值"报告，其为在固定参照大小的含随机序列的数据库中预期偶然见到此类匹配的预期次数。数据库的大小由bl2seq程序默认设置。对于远远小于1的小E值而言，该E值约等于此类随机匹配的概率。
[0162] 变体多核苷酸序列优选与任一特定识别序列相比呈现小于1x10-10、更优选小于-20 -30 -40 -50 -60 -70 -801x10 、小于1x10 、小于1x10 、小于1x10 、小于1x10 、小于1x10 、小于1x10 、小于-90 -100 -110 -120 -123
1x10 、小于1x10 、小于1x10 、小于1x10 或小于1x10 的E值。
1x10 、小于1x10 、小于1x10 、小于1x10 或小于1x10 的E值。
[0163] 或者，本发明的变体多核苷酸与指定的多核苷酸序列、或其互补物在严谨条件下杂交。
[0164] 术语“在严谨条件下杂交”、及其语法等同体指的是多核苷酸分子在限定的温度和盐浓度条件下与目标多核苷酸分子（例如DNA或RNA印迹如Southern印迹或Northern印迹上固定的目标多核苷酸分子）杂交的能力。在严谨杂交条件下杂交的能力可通过最初在低严谨条件下杂交、而后提高严谨性至期望的严谨性来测定。
[0165] 就长度大于约100个碱基的多核苷酸分子而言，典型的严谨杂交条件比天然双链体的熔化温度（Tm）低不超过25-30℃（例如10℃）（一般性地参见Sambrook et al.，Eds，1987，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2nd Ed.Cold Spring Harbor Press；
Ausubel et al.，1987，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing）。
大于约100个碱基的多核苷酸分子的Tm可按照公式Tm＝81.5+0.41%(G+C-log(Na+)来计
算（Sambrook et al.，Eds，1987，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2nd Ed.Cold Spring Harbor Press；Bolton and McCarthy，1962，PNAS84：1390）。长度大于100个碱基的多核苷酸的典型严谨条件为这样的杂交条件，例如以6X SSC，0.2%SDS溶液预洗；65℃，6X SSC，0.2%SDS过夜杂交；接着于65℃以1X SSC，0.1%SDS洗涤两次，每次30分钟，并于65℃以0.2X SSC，0.1%SDS洗涤两次，每次30分钟。
Ausubel et al.，1987，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing）。
大于约100个碱基的多核苷酸分子的Tm可按照公式Tm＝81.5+0.41%(G+C-log(Na+)来计
算（Sambrook et al.，Eds，1987，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2nd Ed.Cold Spring Harbor Press；Bolton and McCarthy，1962，PNAS84：1390）。长度大于100个碱基的多核苷酸的典型严谨条件为这样的杂交条件，例如以6X SSC，0.2%SDS溶液预洗；65℃，6X SSC，0.2%SDS过夜杂交；接着于65℃以1X SSC，0.1%SDS洗涤两次，每次30分钟，并于65℃以0.2X SSC，0.1%SDS洗涤两次，每次30分钟。
[0166] 就长度小于100个碱基的多核苷酸分子而言，示例性的严谨杂交条件是比Tm低5-10℃。平均而言，长度小于100bp的多核苷酸分子的Tm降低约（500/寡核苷酸长度）℃。
[0167] 就公知为肽核酸（PNA）的DNA模拟物（Nielsen et al.，Science.1991Dec6；254(5037)：1497-500）而言，Tm值比DNA-DNA或DNA-RNA杂合体的Tm值高，并可利用Giesen et al.，Nucleic Acids Res.1998Nov1；26(21)：5004-6中所述的公式来计算。长度小于
100个碱基的DNA-PNA杂合体的示例性严谨杂交条件比Tm低5-10℃。
100个碱基的DNA-PNA杂合体的示例性严谨杂交条件比Tm低5-10℃。
[0168] 本发明的变体多核苷酸也包含这样的多核苷酸，其与本发明的序列不同，但是由于遗传密码子的简并性，其编码的多肽与本发明多核苷酸所编码的多肽具有相似的活性。不改变多肽氨基酸序列的序列变异为“沉默变异”。除ATG（甲硫氨酸）和TGG（色氨酸）以外，在某些实例中，通过本领域认可技术改变同一氨基酸的其它密码子，例如以在特定宿主生物体中优化密码子表达。
[0169] 本发明也包括导致所编码的多肽序列中一个或几个氨基酸保守取代而不显著改变其生物学活性的多核苷酸序列变异。技术人员会明了进行表型沉默氨基酸取代的方法（参见例如Bowie et al.，1990，Science247，1306）。
[0170] 由于沉默变异和所编码多肽序列中保守取代而致的变体多核苷酸可如前所述利用可公开获得的来自NCBI（ftp://ttp.ncbi.nih.gov/blast/）的BLAST程序套（2.2.10版[2004年10月]）中的bl2seq程序借助tblastx算法来测定。多肽变体
[0171] 就多肽而言的术语“变体”包含天然存在的、重组以及合成制备的多肽。变体多肽序列优选与本发明的序列呈现至少50%、更优选至少51%、至少52%、至少53%、至少54%、至少55%、至少56%、至少57%、至少58%、至少59%、至少60%、至少61%、至少62%、至少63%、至少64%、至少65%、至少66%、至少67%、至少68%、至少69%、至少70%、至少71%、至少72%、至少73%、至少74%、至少75%、至少76%、至少%、至少77%、至少78%、至少79%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的同一性。就本发明多肽的至少20个氨基酸位置、优选至少50个氨基酸位置、至少100个氨基酸位置的比较窗口或就全长来寻找同一性。
[0172] 多肽序列同一性可按以下方式来测定。利用可由NCBI（ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/）公开获得的BLASTP（来自BLAST程序套，2.2.10版[2004年10月]）通过bl2seq将目标多肽序列与候选多肽序列进行比较。使用bl2seq的默认参数，不过应当关闭对低复杂度区域的过滤。
[0173] 多肽序列同一性也可利用全局序列比对程序就候选和目标多核苷酸序列重叠部分的全长来计算。如上文所讨论的EMBOSS-needle（可获自http:/www.ebi.ac.uk/emboss/align/）和GAP（Huang，X.(1994)On Global Sequence Alignment.Computer Applications in the Biosciences10，227-235）也是计算多肽序列同一性的适当的全局序列比对程序。
[0174] 本发明多肽变体也包含与一个或多个特定识别序列呈现相似性的序列，其很可能保留了那些序列的等同功能且这不可能合理预期会随机发生。就多肽而言，该序列相似性可利用可公开获得的来自NCBI（ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/）的BLAST程序套（2.2.10版[2004年10月]）中的bl2seq程序来测定。可利用如下unix命令行参数来检
查多肽序列的相似性：
bl2seq-i peptideseq1-j peptideseq2-F F-p blastp
查多肽序列的相似性：
bl2seq-i peptideseq1-j peptideseq2-F F-p blastp
[0175] 当与任一特定识别序列相比较时，变体多肽序列优选呈现小于1x10-10、更优选小-20 -30 -40 -50 -60 -70 -80于1x10 、小于1x10 、小于1x10 、小于1x10 、小于1x10 、小于1x10 、小于1x10 、-90 -100 -110 -120 -123
小于1x10 、小于1x10 、小于1x10 、小于1x10 或小于1x10 的E值。
小于1x10 、小于1x10 、小于1x10 、小于1x10 或小于1x10 的E值。
[0176] 参数-F F关闭对低复杂度区段的过滤。参数-p为序列对选择适当的算法。该程序寻找序列间的相似性区域，并就每一个这样的区域给出“E值”报告，其为在固定参照大小的含随机序列的数据库中预期偶然见到此类匹配的预期次数。对于远远小于1的小E值而言，该E值约等于此类随机匹配的概率。
[0177] 本发明也包括所述多肽序列中不显著改变其生物学活性的一个或几个氨基酸保守取代。技术人员会明了进行表型沉默的氨基酸取代的方法（参见例如Bowie et al.，1990，Science247，1306）。
[0178] 本发明的多肽变体也包含由编码多肽的核酸产生、但与野生型多肽不同的多肽，这是由于加工不同以致其具有改变了的氨基酸序列。例如，通过初级RNA转录物的替代剪接模式与产生野生型多肽的不同而产生变体。
[0179] 术语“载体”指的是多核苷酸分子，通常为双链DNA，其用以将遗传构建体输送到宿主细胞中。在某些实例中，载体能够在至少一个另外的宿主系统，例如大肠杆菌（E.coli）中复制。切向流过滤
[0180] 通常，本发明发现应用于切向流过滤技术。例如，在一个实施方案中，本发明涉及一种用于由源液体制备一种或多种目标物质的方法，该方法包括：在切向流过滤体系中或在加入切向流过滤体系之前，使源液体与生物聚合物微粒群接触，其中进行一个或多个以下步骤：浓缩聚合物微粒群，
从一种或多种聚合物微粒结合的目标物质或其聚合物微粒结合前体分离一种或多种
污染物，例如通过渗滤，
从聚合物微粒洗脱目标物质；
和回收目标物质。
从一种或多种聚合物微粒结合的目标物质或其聚合物微粒结合前体分离一种或多种
污染物，例如通过渗滤，
从聚合物微粒洗脱目标物质；
和回收目标物质。
[0181] 在涉及微粒结合的目标物质前体的实施方案中，一种或多种聚合物微粒包含一种或多种能够催化前体转化为目标物质、或转化为进一步的目标物质前体的酶。例如，在一个实施方案中，目标物质前体为能够催化底物转化为目标物质的酶底物、和一种或多种包含酶的聚合物微粒。在另一个实例中，目标物质前体为能够催化底物转化为进一步的目标物质前体的酶底物（其自身为能够催化进一步的前体转化为目标物质的第二酶底物）、和一种或多种包含第一酶、第二酶、或第一酶和第二酶的聚合物微粒。应当理解：通过提供一种或多种包含适当选择的酶的聚合物微粒，可在前体向目标物质的转化中使用一系列催化步骤。
[0182] 在另一个实施方案中，本发明涉及一种用于从源液体制备一种或多种目标物质的方法，该方法包括：在切向流过滤体系中或在加入切向流过滤体系之前，使源液体与生物聚合物微粒群接触，其中进行一个或多个以下步骤：浓缩聚合物微粒群，
从一种或多种聚合物微粒结合的污染物分离一种或多种目标物质或其前体，例如通过
渗滤，
和回收目标物质。
从一种或多种聚合物微粒结合的污染物分离一种或多种目标物质或其前体，例如通过
渗滤，
和回收目标物质。
[0183] 在一个实施方案中，源液体与生物聚合物微粒群的接触通过在切向流过滤体系中循环生物聚合物微粒和源液体进行。
[0184] 在另一个实施方案中，本发明涉及一种用于从源液体制备一种或多种目标物质的方法，该方法包含向切向流过滤体系加入包含生物聚合物微粒群和任选的一种或多种目标物质或其前体和/或一种或多种污染物的源液体，和浓缩聚合物微粒群，和/或从聚合物微粒分离一种或多种目标物质或其前体和/或一种或多种污染物，和回收聚合物微粒、目标物质、或污染物。
[0185] 本发明组合物、方法、和聚合物微粒已与现有的切向流体系和技术联合应用。存在大量的该体系。在切向流过滤体系中，通过液体介质流动施加于过滤器元件外部的剪切力趋向于阻止固体积聚于过滤器元件表面上。
[0186] 切向流过滤器包括微滤、超滤、纳滤和反渗透过滤器体系。在一个示例性实施方案中，切向流过滤器包含多种以有效多层结构排列的过滤纸（过滤膜），例如，其中过滤纸与渗透物和滞留物纸交替使用，并且当待过滤的液体流过过滤纸时，没有渗透过去的物质，例如固体或直径大于过滤纸孔径的高分子量物质被保留并进入滞留物流，而液体随着渗透过去的物质穿过过滤纸扩散并进入渗透物流。
[0187] 如将理解地，目前可使用许多切向流技术（也称作横流技术）并适用于与本发明联合使用。可商购的切向流技术（包括切向流膜过滤器），包括，例如，来自Vivascience的Vivaflow过滤器（包括例如，Vivaflow200、100,000MWCO，PES，VivaScience）、来自Sartorius的 和聚醚砜微滤和超滤膜，而适当的切向流过滤器模块和该类型的过滤片不同地描述于U.S.Pat.No.4,867,876；U.S.Pat.No.4,882,050；U.S.Pat.
No.5,034,124；U.S.Pat.No.5,034,124；U.S.Pat.No.5,049,268；U.S.Pat.No.5,232,589；
U.S.Pat.No.5,342,517；U.S.Pat.No.5,593,580；U.S.Pat.No.5,868,930；和公 开号 为WO/2010/107677的PCT国际申请PCT/US10/027266；其全部公开内容通过引用以其各自整体并入本文。
No.5,034,124；U.S.Pat.No.5,034,124；U.S.Pat.No.5,049,268；U.S.Pat.No.5,232,589；
U.S.Pat.No.5,342,517；U.S.Pat.No.5,593,580；U.S.Pat.No.5,868,930；和公 开号 为WO/2010/107677的PCT国际申请PCT/US10/027266；其全部公开内容通过引用以其各自整体并入本文。
[0188] 适用于本发明的示例性切向流过程的总体概况示于图1-4中。切向流过滤（TFF）或横流过滤（本文可互换使用）为一种过滤通过平行于过滤介质表面流动溶液或悬浮流路径实现的过程（图1A）。示例性、简单的TFF体系利用进料泵以允许体系中渗透物自进料储罐穿过TFF膜筒而再循环（图1B）。小化合物和溶液作为渗透物穿过过滤器。滞留物中的大化合物以这种方式可被浓缩。通过加入额外的溶液储罐，滞留物可通过过滤（渗滤的）渗析。在某些实施方案中渗滤因此用作从较小化合物分离大化合物的过程（悬浮液中的分子、细胞、固体）。处于亚微范围例如0.1-0.6μm的TF过滤器的应用通常称作微滤。对于图2所示一般方案，如随后的纯化所需要的，源液体可任选地被预处理（例如，以移除微粒或固体物质（例如通过本领域所熟知的离心或过滤技术））、浓缩、或稀释。然后使源液体与生物聚合物微粒群接触一段时间以形成微粒：目标复合物。
[0189] 通常，使源液体与生物聚合物微粒接触一段时间以足以导致目标与生物聚合物微粒所需比例的结合。源液体和生物聚合物微粒的混合例如通过搅拌或穿过切向流过滤体系处理将通常有利于确保目标的最佳接触和结合。
[0190] 微粒：目标复合物穿过切向流过滤体系循环，并因此穿过切向流过滤器，其中（a）复合物被浓缩、（b）复合物相对渗滤液体（通常选择以从微粒：目标复合物分离非特定结合的污染物）而被渗滤、（c）从微粒洗脱目标物质（通常通过用第二渗滤液体渗滤以分离微粒：目标物质复合物）、（d）目标物质随后从生物聚合物微粒分离（例如，目标物质被渗滤出），从而以回收纯化的目标物质。目标物质可任选地被（e）进一步处理，例如通过浓缩。
[0191] 在图3所描绘的另一示例性实施方案中，源液体包含目标物质前体，例如，一种或多种酶底物，其产物为所需目标物质。在该实施方案中，包含前体物质的源液体与一种或多种包含一种或多种酶的生物聚合物微粒接触，所述酶能够催化前体转化为目标物质。如上所述，源液体和生物聚合物微粒接触一段时间以足以形成复合物，在该情况下为微粒：酶-底物复合物。源液体和生物聚合物微粒混合物维持一段时间以足以使所需比例的前体能够与生物聚合物微粒结合、并使前体分子能够转化为目标物质。
[0192] 图4显示了使用本发明方法纯化目标物质的一般方案，其中生物聚合物微粒用以通过移除一种或多种污染物富集目标物质。在该情况下，源液体与一种或多种能够结合一种或多种存在于源液体中的污染物的聚合物微粒群接触。此时，微粒：污染物复合物的形成允许渗滤目标物质，所述目标物质可随后被进一步处理（包括例如，经由如本文所述的一种或多种本发明切向流方法）。渗滤（通常用第二渗滤液体）允许分离微粒：污染物复合物，其中生物聚合物微粒可被再循环用以进一步使用。
[0193] 相应地，本领域技术人员将认识到本发明的多个实施方案（包括以上所概述的那些代表性实例）考虑了滞留物中或渗透物中所需的目标物质自切向流过滤体系的洗脱，取决于所用聚合物微粒的具体结构或具体群。源材料
[0194] 本发明涉及从源材料制备目标物质。如本文所用的"源材料"指的是通常为液体的含有至少一种物质并且通常含有一种以上物质的材料，其通常为生物学物质、或为试图从存在于该源材料的其它物质萃取或纯化的有价值产物。通常，源材料可例如为水性溶液、有机溶剂体系、或水性/有机溶剂混合物或溶液。源材料经常为含有许多生物学分子例如蛋白、抗体、荷尔蒙和病毒以及小分子例如盐、糖、脂质等的复杂混合物或溶液。虽然典型的生物起源源材料可作为水性溶液或悬浮液起始，但其也可含有较早分离步骤所用的有机溶剂，所述较早分离步骤例如溶剂沉淀、萃取等。可含有有价值生物学物质、适用于本发明纯化方法的源液体实例包括，但不限于，来自生物反应器的培养物上清液、均质细胞悬浮液、血浆、血浆成分、和乳品加工流例如牛奶、初乳和乳清例如干酪乳清。
[0195] 在多个实施方案中，源材料包含一种或多种选自血清、血浆、血浆成分、全血、牛奶、初乳、乳清、细胞液、组织培养液、植物细胞液、植物细胞匀浆和组织匀浆的液体。例如，源材料为植物提取物，例如果汁或蔬菜汁。特别期待的是发酵物，如培养物或培养物上清液，特别是表达一种或多种重组蛋白的那些培养物，例如一种或多种单克隆抗体。
[0196] 在其它实施方案中，源材料包含培养物上清液，例如来自生物反应器，其包含本发明的聚合物微粒。本领域技术人员将认识到该源材料包含显著量的其它生物学物质，其在某些环境下可为考虑到的污染物。例如，在一个示例性实施方案中，源材料为培养物上清液或包含用以制备本发明聚合物微粒的细菌的细胞制备物。在其它特别预期的实施方案中，源材料为培养物上清液或来自制备本发明聚合物微粒的细胞和制备一种或多种目标物质或其前体的细胞的细胞制备物。在某些实施方案中，源材料为培养物上清液或包含制备本发明聚合物微粒和一种或多种目标物质或其前体的细胞群的细胞制备物。目标物质
[0197] 如上，本发明涉及从源材料，包括包含目标物质前体的源材料制备目标物质。如本文所用的术语"目标物质"指的是一种或多种从源液体制备或纯化的所需产物。目标物质通常为有价值的生物学产物，例如，免疫球蛋白、凝血因子、疫苗、抗原、抗体、选定蛋白或糖蛋白、肽、酶、代谢物等。
[0198] 在不同的实施方案中，目标物质选自疫苗、凝血因子、免疫球蛋白、抗原、抗体、蛋白、糖蛋白、肽、糖、碳水化合物和酶。
[0199] 在不同的实施方案中，一种或多种亲和配体结合至少一种目标物种，所述目标物种选自蛋白、核酸、病毒、糖、碳水化合物、免疫球蛋白、凝血因子、糖蛋白、肽、抗体、抗原、荷尔蒙、或多核苷酸。
[0200] 然而，本发明发现应用于除通常被认为是“生物学的”那些之外的多种目标物质的制备，如将被认识为可与本文所描述的聚合物微粒结合的多功能性基团识别。例如，本发明聚合物微粒可用金属或金属离子结合基团，例如金属或金属离子协调多肽来便利地功能化，例如通过聚合物合酶：金属结合多肽融合多肽的表达。事实上，将一种或多种蛋白功能融合至包含聚合物微粒的聚合物形成蛋白或聚合物结合蛋白的能力允许应用于极为广泛范围目标物质的制备。
[0201] 包含本发明生物聚合物微粒的融合多肽可便利地使用本领域所熟知的生物技术来制备，包括使用一种或多种表达构建体。将认识到在某些实施方案中，包含本发明生物聚合物微粒的融合多肽为本文所预期的目标物质本身。表达构建体
[0202] 制备和利用表达构建体在微生物、植物细胞或动物细胞（细胞表达系统）中或在无细胞表达系统中表达融合多肽的方法，以及包含用于形成本发明所用聚合物微粒的表达构建体的宿主细胞为本领域所熟知（例如，Sambrook et al.，1987；Ausubel et al.，1987）。
[0203] 在一个实施方案中，用于本发明方法的表达构建体插入到可复制载体中用于克隆或表达，或在另一个实施方案中，整合到宿主基因组中。多种载体可公开获得。载体例如为质粒、粘粒、病毒粒子或噬菌体的形式。适当的核酸序列可通过多种程序插入到载体中。通常，利用本领域已知技术将DNA插入到适当的限制性核酸内切酶位点。载体组分一般包括但不限于：一个或多个信号序列、复制原点、一个或多个可选择标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。含有一个或多个这些组分的适宜载体的构建采用本领域已知的标准连接技术。
[0204] 表达和克隆载体均含有使载体能够在一种或多种选择的宿主细胞中复制的核酸序列。对于多种细菌、酵母和病毒而言，此类序列是公知的。
[0205] 在一个实施方案中，表达构建体存在于高拷贝数载体之中。
[0206] 在一个实施方案中，高拷贝数载体选自那些在每个宿主细胞中以20-3000个拷贝存在的载体。
[0207] 在一个实施方案中，高拷贝数载体含有高拷贝数复制原点（ori），例如ColE1或ColE1衍生的复制原点。例如，ColE-1衍生的复制原点可包含pUC19复制原点。
[0208] 众多适用于本发明载体的高拷贝数复制原点为本领域技术人员所公知。这些包括来自pBR322及其衍生物的ColE1衍生的复制原点以及其它高拷贝数复制原点，例如M13FR ori或p15A ori。2μ质粒原点适用于酵母，而多种病毒原点（SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV）用于哺乳动物细胞中的克隆载体。
[0209] 优选地，高拷贝数复制原点包含ColE1衍生的pUC19复制原点。
[0210] 限制性位点位于复制原点之中，从而将插入片段克隆到该限制性位点会使该原点失活，使之不能指导载体复制。或者，至少一个限制性位点位于该原点之内，从而将插入片段克隆到该限制性位点会使之仅能够支持载体以低拷贝数或单拷贝数复制。
[0211] 表达和克隆载体将典型地含有选择基因，也成为可选择标记，以检测所转化的宿主细胞中该载体的存在。典型的选择基因编码（a）赋予抗生素或其它毒素，例如，青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四环素抗性的蛋白，（b）补充营养缺陷型的蛋白，或（c）供应不能够从复合介质中获得的关键养分的蛋白，例如，为杆菌（Bacilli）编码D-丙氨酸消旋酶的基因。
[0212] 常用于植物转化的可选择标记包括赋予卡那霉素抗性的新霉素磷酸转移酶II基因（NPT II）；赋予壮观霉素和链霉素抗性的aadA基因；用于Ignite（AgrEvo）和Basta（Hoechst）抗性的膦丝菌素乙酰转移酶（bar基因）；和用于潮霉素抗性的潮霉素磷酸转移酶基因（hpt）。
[0213] 用于哺乳动物细胞的适当可选择标记的实例为能够鉴定有能力摄入表达构建体的细胞的那些标记，例如DHFR或胸苷激酶。采用野生型DHFR时，适当的宿主细胞是如Urlaub et al.，1980所述制备和传代的DHFR活性缺陷型CHO细胞系。用于酵母的适当选择基因为存在于酵母质粒YRp7中的trp1基因（Stinchcomb et al.，1979；Kingsman et al.，
1979；Tschemper et al.，1980）。trp1基因为缺乏在色氨酸中生长能力的酵母突变株例如ATCC No.44076或PEP4-1提供选择标记[Jones，Genetics，85：12(1977)]。
1979；Tschemper et al.，1980）。trp1基因为缺乏在色氨酸中生长能力的酵母突变株例如ATCC No.44076或PEP4-1提供选择标记[Jones，Genetics，85：12(1977)]。
[0214] 用于形成聚合物微粒的表达构建体优选包括启动子，其控制至少一个编码聚合物合酶、微粒形成蛋白或融合多肽的核酸表达。
[0215] 多种潜在宿主细胞所识别的启动子是公知的。适用于原核宿主的启动子包括β-内酰胺酶和乳糖启动子系统（Chang et al.，1978；Goeddel et al.，1979）、碱性磷酸酶、色氨酸（trp）启动子系统（Goeddel，Nucleic Acids Res.，8：4057(1980)；EP36,776）、和杂合启动子例如tac启动子（deBoer et al.，1983）。用于细菌系统的启动子还会含有Shine-Dalgarno（S.D.）序列，其有效连接至编码聚合物合酶、微粒形成蛋白或融合多肽的核酸。
[0216] 用于酵母宿主的适当启动子序列的实例包括3-磷酸甘油酸激酶（Hitzemanet al.，1980）或其它糖酵解酶（Hess et al.，1968；Holland，1978）的启动子，例如烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸葡萄糖异构酶和葡糖激酶。
[0217] 其它为具有通过生长条件控制转录的额外优势的诱导型启动子的酵母启动子为醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酶、与氮代谢相关的降解酶、金属硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、和负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子区域。
[0218] 用于植物宿主细胞、包括单子叶或双子叶植物的组织或器官的适宜启动子实例包括细胞、组织和器官特异性启动子，细胞周期特异性启动子，瞬时启动子，诱导型启动子，在大多数植物组织中有活性的组成型启动子，和重组启动子。启动子的选择将取决于所期望的克隆多核苷酸的时间和空间表达。启动子为来自宿主细胞的那些、或为衍生自其它植物、病毒和植物致病性细菌和真菌的基因的启动子。本领域技术人员无需过度劳动，就能够选择适用于修饰和调节使用包含本发明多核苷酸序列的遗传构建体的表达构建体的启动子。组成型植物启动子的实例包括CaMV35S启动子、胭脂碱合酶启动子和章鱼碱合酶启动子、和来自玉米的Ubi1启动子。在特定组织中有活性、响应内部发育信号或外部非生物或生物胁迫的植物启动子描述于科研文献中。示例性的启动子描述于例如WO02/00894中，其通过引用并入本文。
[0219] 用于哺乳动物宿主细胞的适当启动子的实例包含获自病毒（例如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒（例如2型腺病毒）、牛乳头瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙肝病毒和猴病毒40（SV40））基因组、异源哺乳动物启动子（例如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子）、和热激启动子（只要此类启动子与宿主细胞系统相容即可）的那些。
[0220] 在某些实例中，通过将增强子序列插入载体中而增加高等真核细胞中表达构建体的转录。增强子为DNA顺式作用元件，通常约10-300bp，其作用于启动子而增加其转录。目前已知许多来自哺乳动物基因（珠蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、α-胎蛋白、和胰岛素）的增强子序列。然而人们通常将使用来自真核细胞病毒的增强子。实例包括位于复制原点下游（bp100-270）的SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、位于复制原点下游的多瘤病毒增强子、和腺病毒增强子。增强子通常剪接到载体中聚合物合酶、微粒形成蛋白或融合多肽编码序列5'或3'位置，但优选位于启动子的5'位点。
[0221] 在真核宿主细胞（酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人类、或来自其它多细胞生物的有核细胞）中使用的表达载体还会含有终止转录以及稳定mRNA所必需的序列。此类序列常来自于真核或病毒DNA或cDNA的5'和偶尔的3'非翻译区。这些区域中含有转录为mRNA非翻译区多聚腺苷酸化区段的核苷酸区段，所述mRNA编码聚合物合酶、微粒形成蛋白或融合多肽。
[0222] 在一个实施方案中，表达构建体含有上游诱导型启动子，例如通过阿拉伯糖诱导的BAD启动子。
[0223] 在一个实施方案中，表达构建体包含组成型或调控型启动子系统。
[0224] 在一个实施方案中，调控型启动子系统是诱导型或阻遏型启动子系统。
[0225] 尽管在制备重组蛋白中期望使用强启动子，但这些启动子的调控至关重要，因为异源蛋白的组成型过表达导致生长速度、质粒稳定性和培养物生存能力的下降。
[0226] 许多启动子通过阻遏子蛋白与操纵子（启动子下游区域）相互作用来调控。最著名的操纵子为来自lac操纵元和噬菌体A的那些。有关E.coli调控型启动子的综述提供于Friehs&Reardon，1991的表1中。
[0227] 标准细菌培养与涉及重组大肠杆菌（E.coli）的培养之间的一个主要差异在于生长阶段与制备或诱导阶段的分隔。重组蛋白制备经常利用调控型启动子，以在生长阶段（此时启动子“关闭”，宿主细胞的代谢负荷轻）实现高细胞密度，而随后在诱导阶段（在诱导之后“开启”启动子）实现高速异源蛋白制备。
[0228] 在一个实施方案中，调控型启动子系统选自LacI、Trp、噬菌体γ和噬菌体RNA聚合酶。
[0229] 在一个实施方案中，启动子系统选自lac或Ptac启动子和lacI阻遏子，或trp启动子和rpR阻遏子。
[0230] 在一个实施方案中，LacI阻遏子通过添加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）失活，IPTG与活性阻遏子结合导致自操纵子解离从而允许表达。
[0231] 在一个实施方案中，trp启动子系统应用具有明确色氨酸浓度的合成培养基，以致当浓度降至低于阈值水平时该系统变成自身诱导型。在一个实施方案中，添加3-β-吲哚-丙烯酸以使TrpR阻遏子失活。
[0232] 在一个实施方案中，启动子系统可利用噬菌体γ阻遏子cI。该阻遏子利用γ原噬菌体并通过与两个称为OL和OR的操纵子相互作用而阻止全体裂解基因的表达。这些操纵子分别与两个强启动子PL和PR重叠。cI阻遏子的存在阻止了RNA聚合酶的结合。cI阻遏子可通过UV-辐射或用丝裂霉素C处理细胞而失活。允许重组多肽表达的一个更为便利的途径是应用温度敏感型cI阻遏子cI857。携带γ基表达系统的宿主细胞可于低温下生长至对数中期并随后移至高温以诱导重组多肽的表达。
[0233] 一种广泛使用的表达系统利用噬菌体T7RNA聚合酶，其仅识别见于T7DNA的启动子，而非宿主细胞染色体中存在的启动子。因此，表达构建体可含有重组基因与之融合的一个T7启动子（通常启动子位于基因10之前）。编码T7RNA聚合酶的基因位于该表达构建体上、另一相容的表达构建体上或者整合入宿主细胞染色体中。在所有三种情况下，基因都与允许其在表达阶段转录和翻译的诱导型启动子融合。
[0234] 大肠杆菌（E.coli）菌株BL21（DE3）和BL21（DE3）pLysS（Invitrogen，CA）为携带T7RNA聚合酶基因的宿主细胞实例（有一些非常适合的可商购的E.coli菌株，其含有T7RNA聚合酶基因例如KRX和XJ（自溶性））。其它携带T7RNA聚合酶基因的细胞株为本领域已知，例如T7RNA聚合酶基因整合在其基因组中的Pseudomonas aeruginosa ADD1976（Brunschwig&Darzins，1992）和T7RNA聚合酶基因整合在其基因组中在phaP启动子控制之下的钩虫贪铜菌（Cupriavidus necator）（从前称作真养产碱杆菌（Ralstonia eutropha））（Barnard et al.，2004）。
[0235] T7RNA聚合酶与宿主细胞酶相比具有3个优点：第一，其仅由一个亚单位组成，第二，其发挥更高的处理性能，和第三，其对利福平不敏感。后一个特征可特别地通过在诱导编码T7RNA聚合酶的基因之后约10分钟添加该抗生素来用于增强融合多肽的含量。在那期间，已合成足够的聚合酶，以允许融合多肽的高水平表达，并抑制宿主细胞酶，防止质粒和染色体上所有其它基因的进一步表达。抑制细菌RNA聚合酶而非T7RNA聚合酶的其它抗生素在本领域已知，例如链霉溶菌素和曲张链菌素。
[0236] 由于所有的启动子系统都有渗漏，编码T7RNA聚合酶的基因低水平表达在那些重组多肽编码毒性蛋白的情况下对细胞可能是有害的。在生长阶段存在的这些聚合酶分子可通过表达T7编码的溶菌酶基因来抑制。该酶为双功能蛋白，其裂解宿主细胞细胞壁中的链键并通过与其结合而选择性抑制T7RNA聚合酶，这是一种确保T7感染期间可控转录爆发的反馈机制。大肠杆菌（E.coli）菌株BL21（DE3）pLysS是一个携带组成型表达T7溶菌酶的质粒pLysS的宿主细胞实例。
[0237] 在一个实施方案中，启动子系统利用诸如API或APR的启动子，其通过温度变化而被诱导或“开启”以起始诱导周期，例如通过将温度由约30-37℃升高到42℃来起始诱导周期。
[0238] 强启动子可在体内制备期间增强微粒表面的融合多肽密度。
[0239] 用于本发明一个实施方案的优选融合多肽包含（i）聚合物合酶和（ii）包含至少一个抗体结合域的融合配偶体。
[0240] 用于本文的编码（i）和（ii）两者的核酸序列包含编码聚合物合酶的核酸和编码包含至少一个抗体结合域的融合配偶体的核酸。一经表达，融合多肽能够形成或促进聚合物微粒的形成。
[0241] 在一个实施方案中，编码至少聚合物合酶的核酸序列通过期望长度的多核苷酸连接子或间隔臂序列而与编码微粒形成蛋白的核酸序列或编码融合配偶体的核酸间接融合。
[0242] 在一个实施方案中，编码至少一个融合配偶体的融合蛋白的氨基酸序列与包含聚合物合酶的氨基酸序列C-末端邻接。
[0243] 在一个实施方案中，包含至少一个融合配偶体的融合蛋白的氨基酸序列，通过期望长度的促进融合多肽独立折叠的肽连接子或间隔臂与包含聚合物合酶片段的氨基酸序列N-末端间接融合。
[0244] 在一个实施方案中，编码至少一个融合配偶体的融合多肽的氨基酸序列与包含微粒形成蛋白或C-末端合酶片段的氨基酸序列N-末端邻接。
[0245] 在一个实施方案中，编码至少一个融合配偶体的融合蛋白的氨基酸序列，通过期望长度的促进融合多肽独立折叠的肽连接子或间隔臂，与包含微粒形成蛋白或N-末端聚合物合酶片段的氨基酸序列C-末端间接融合。
[0246] 在一个实施方案中，编码至少一个融合配偶体的融合多肽的氨基酸序列与编码解聚酶、或C-末端解聚酶片段的氨基酸序列N-末端邻接。
[0247] 根据本发明融合多肽的一个优点在于，修饰与聚合物微粒表面结合的蛋白并不影响参与聚合物微粒形成的蛋白的功能。例如，聚合物合酶的功能在重组多肽与其N-末端融合时得以保留，从而导致在微粒表面产生重组多肽。如果蛋白的功能性还是因为融合而削弱，那么这个缺点可通过行使相同功能并以活性状态存在的额外微粒形成蛋白来弥补。
[0248] 以该方式，可以确保结合至聚合物微粒的重组多肽借助于微粒形成蛋白而稳定键合。
[0249] 应理解，融合多肽中蛋白的排布顺序取决于质粒中所含核酸的基因序列的次序。
[0250] 例如，可能期望制备其中融合配偶体与聚合物合酶间接融合的融合多肽。术语“间接融合”指的是包含微粒形成蛋白（优选聚合物合酶）和至少一个融合配偶体的融合多肽，其通过可为期望在融合多肽中表达的任何蛋白的其它蛋白分隔开。
[0251] 在一个实施方案中，如以上所讨论的，其它蛋白选自微粒形成蛋白或融合多肽、或促进融合多肽独立折叠的连接子或间隔臂。在该实施方案中，有必要对质粒中基因序列进行排序，以反映融合多肽的期望排列。
[0252] 在一个实施方案中，融合配偶体直接融合至聚合物合酶。术语“直接融合”在本文用以表示两个或多个肽经由肽键相连。
[0253] 也可以形成这样的微粒，其中微粒包含至少两个与聚合物微粒结合的截然不同的融合多肽。例如，包含能够结合至少一个酶产物（融合至聚合物合酶）的结合域的第一融合多肽可结合至聚合物微粒，而包含酶的第二融合多肽可结合至聚合物微粒。
[0254] 在一个实施方案中，表达构建体在体内表达。优选表达构建体为在微生物，优选Eschericbia coli中表达的质粒。
[0255] 在一个实施方案中，表达构建体在体外表达。优选表达构建体利用无细胞表达系统在体外表达。
[0256] 在一个实施方案中，一个或多个基因可插入单个表达构建体中，或一个或多个基因可整合入宿主细胞基因组中。在所有情况下，可通过如上所述的启动子来控制表达。
[0257] 在一个实施方案中，表达构建体进一步编码至少一个附加融合多肽，所述附加融合多肽包含能够引发细胞介导免疫应答的抗原或能够与至少一个能够引发细胞介导免疫应答的抗原结合的结合域和微粒形成蛋白，优选聚合物合酶，如上文所讨论的。
[0258] 用于本文的质粒示于实施例中并在公开号为WO2004/020623（Bernd Rehm）的PCT/DE2003/002799和公开号为WO2007/037706（Bernd Rehm）的PCT/NZ2006/000251中详细说明，其分别通过引用以其整体并入本文。用于微粒制备的宿主
[0259] 本发明的微粒便利地利用如本文所述的一个或多个表达构建体在宿主细胞中制备。本发明的聚合物微粒可通过使宿主细胞表达该表达构建体而制备。这可通过首先将表达构建体引入宿主细胞或宿主细胞的先祖细胞中而实现，例如通过用表达构建体转化或转染宿主细胞或宿主细胞的先祖细胞，或通过其它方式确保表达构建体存在于宿主细胞之中。
[0260] 转化之后，在适用于自表达构建体表达融合多肽和形成聚合物微粒的条件下维持转化的宿主细胞。如本领域所公知的，此类条件包含适用于所选表达构建体，例如质粒在适当生物体中表达的那些条件。例如，特别是当期望高产量或过表达时，在培养基中提供适当底物允许融合多肽的微粒形成蛋白组分形成聚合物微粒。
[0261] 优选宿主细胞为，例如，细菌细胞、真菌细胞、酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞或动物细胞，优选分离的或非人类宿主细胞。在谨记本文讨论的考虑事项之后，用于制备重组聚合物微粒的本领域所熟知的方法（例如Sambrook et al.，1987；Ausubel et al.，1987）中使用的宿主细胞经常适用于本发明的方法。
[0262] 适宜的原核宿主细胞包含，例如，真细菌，例如革兰氏阴性或革兰氏阳性有机体，例如，肠杆菌科（Enterobacteriaceae）如大肠杆菌（E.coli）。多种大肠杆菌菌株可公开获得，例如大肠杆菌K12菌株MM294（ATCC31,446）；大肠杆菌X1776（ATCC31,537）；大肠杆菌菌株W3110（ATCC27,325）和K5772（ATCC53,635）。其它适当的原核宿主细
胞包括其它肠杆菌科例如埃希氏菌（Escherichia spp.）、肠杆菌属（Enterobacter）、欧文氏菌属（Erwinia）、克雷伯氏菌属（Klebsiella）、变形杆菌属（Proteus）、沙门氏菌属（Salmonella）例如伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）、沙雷氏菌属（Serratia）例如粘质沙雷氏菌（Serratia marcescans）和志贺氏菌属（Shigella），以及芽孢杆菌属（Bacilli）例如枯草芽孢杆菌（B.subtilis）和地衣芽孢杆菌（B.licheniformis）、假单胞菌属（Pseudomonas）例如铜绿假单胞菌（P.aeruginosa）、及放线菌（Actinomycetes）例如链霉菌属（Streptomyces）、红球菌属（Rhodococcus）、棒状杆菌属（Corynebacterium）和分枝杆菌属（Mycobaterium）。
胞包括其它肠杆菌科例如埃希氏菌（Escherichia spp.）、肠杆菌属（Enterobacter）、欧文氏菌属（Erwinia）、克雷伯氏菌属（Klebsiella）、变形杆菌属（Proteus）、沙门氏菌属（Salmonella）例如伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）、沙雷氏菌属（Serratia）例如粘质沙雷氏菌（Serratia marcescans）和志贺氏菌属（Shigella），以及芽孢杆菌属（Bacilli）例如枯草芽孢杆菌（B.subtilis）和地衣芽孢杆菌（B.licheniformis）、假单胞菌属（Pseudomonas）例如铜绿假单胞菌（P.aeruginosa）、及放线菌（Actinomycetes）例如链霉菌属（Streptomyces）、红球菌属（Rhodococcus）、棒状杆菌属（Corynebacterium）和分枝杆菌属（Mycobaterium）。
[0263] 例如，在某些实施方案中，可使用大肠杆菌菌株W3110，因为它为常见的用于重组DNA产物发酵的宿主菌株。优选宿主细胞分泌最小量的蛋白水解酶。例如，可修饰菌株W3110以实现编码宿主内源蛋白的基因中遗传突变，此类宿主的实例包括大肠杆菌W3110菌株1A2，其具有完整的tonA基因型；大肠杆菌W3110菌株9E4，其具有完整的tonA ptr3基因型；大肠杆菌W3110菌株27C7（ATCC55,244），其具有完整的tonA ptr3phoA E15（argF-lac）169degP ompT kanr基因型；大肠杆菌W3110菌株37D6，其具有完整的tonA ptr3phoA E15（argF-lac）169degP ompT rbs7ilvG kanr基因型；大肠杆菌W3110菌株
40B4，其为具有非卡那霉素抗性degP缺失突变的菌株37D6。
40B4，其为具有非卡那霉素抗性degP缺失突变的菌株37D6。
[0264] 例如，在某些优选实施方案中，可使用不产生脂多糖内毒素的乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）菌株。乳酸乳球菌菌株的实例包括MG1363和乳酸乳球菌乳脂亚种（Lactococcus lactissubspecies cremoris）NZ9000。
[0265] 例如，除了原核生物，真核细胞微生物例如丝状真菌或酵母也为用于本发明方法的适当克隆和表达宿主。实例包括酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），一
种常用的低等真核宿主微生物。其它实例包括栗酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces
pombe）（Beach和Nurse，1981；EP139,383）、克鲁维酵母属（Kluyveromyces）宿主（美国专利No.4,943,529；Fleer et al.，1991）例如乳酸克鲁维酵母（K.lactis）（MW98-8C、CBS683、CBS4574；Louvencourt et al.，1983）、脆 壁 橱 克 鲁 维 酵 母（K.fragilis）（ATCC12,424）、保加利亚克鲁维酵母（K.bulgaricus）（ATCC16,045）、维克汉姆克鲁维酵母（K.wickeramii）（ATCC24,178）、瓦尔特克鲁维酵母（K.waltii）（ATCC56,500）、果蝇克鲁维酵母（K.drosophilarum）（ATCC36,906；Van den Berg et al，1990）、耐热克鲁维酵母（K.thermotolerans）、和马克斯克鲁维酵母（K.marxianus）、耶氏酵母属（yarrowia）（EP402,226）；巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）（EP183,070；Sreekrishna et al.，
1988）；假丝酵母属（Candida）；里氏木霉（Trichoderma reesia）（EP244,234）；粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）（Case et al.，1979）；许旺酵母属（Schwanniomyces）例如西方许旺酵母（Schwanniomyces occidentalis）（EP394,538，1990年10月31日公开）；和丝状真菌例如脉孢菌属（Neurospora）、青霉属（Penicillium）、弯颈霉属（Tolypocladium）（WO91/00357，1991年1月10日公开）、和黑曲霉属（Aspergillus）宿主例如构巢曲霉（A.nidulans）（Ballance et al.，1983；Tilburn et al.，1983；Yelton et al.，1984）和黑曲霉（A.niger）（Kelly和Hynes，1985）。甲基营养酵母适用于本文并包含能够在甲醇上生长的选自以下类的酵母：汉逊酵母属（Hansenula）、假丝酵母属（Candida）、克勒克酵母属（Kloeckera）、毕赤酵母属（Pichia）、酵母属（Saccharomyces）、球拟酵母属（Torulopsis）和红酵母属（Rhodotorula）。作为此类酵母实例的具体物种清单可见于Anthony，1982。
种常用的低等真核宿主微生物。其它实例包括栗酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces
pombe）（Beach和Nurse，1981；EP139,383）、克鲁维酵母属（Kluyveromyces）宿主（美国专利No.4,943,529；Fleer et al.，1991）例如乳酸克鲁维酵母（K.lactis）（MW98-8C、CBS683、CBS4574；Louvencourt et al.，1983）、脆 壁 橱 克 鲁 维 酵 母（K.fragilis）（ATCC12,424）、保加利亚克鲁维酵母（K.bulgaricus）（ATCC16,045）、维克汉姆克鲁维酵母（K.wickeramii）（ATCC24,178）、瓦尔特克鲁维酵母（K.waltii）（ATCC56,500）、果蝇克鲁维酵母（K.drosophilarum）（ATCC36,906；Van den Berg et al，1990）、耐热克鲁维酵母（K.thermotolerans）、和马克斯克鲁维酵母（K.marxianus）、耶氏酵母属（yarrowia）（EP402,226）；巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）（EP183,070；Sreekrishna et al.，
1988）；假丝酵母属（Candida）；里氏木霉（Trichoderma reesia）（EP244,234）；粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）（Case et al.，1979）；许旺酵母属（Schwanniomyces）例如西方许旺酵母（Schwanniomyces occidentalis）（EP394,538，1990年10月31日公开）；和丝状真菌例如脉孢菌属（Neurospora）、青霉属（Penicillium）、弯颈霉属（Tolypocladium）（WO91/00357，1991年1月10日公开）、和黑曲霉属（Aspergillus）宿主例如构巢曲霉（A.nidulans）（Ballance et al.，1983；Tilburn et al.，1983；Yelton et al.，1984）和黑曲霉（A.niger）（Kelly和Hynes，1985）。甲基营养酵母适用于本文并包含能够在甲醇上生长的选自以下类的酵母：汉逊酵母属（Hansenula）、假丝酵母属（Candida）、克勒克酵母属（Kloeckera）、毕赤酵母属（Pichia）、酵母属（Saccharomyces）、球拟酵母属（Torulopsis）和红酵母属（Rhodotorula）。作为此类酵母实例的具体物种清单可见于Anthony，1982。
[0266] 无脊椎宿主细胞的实例包括昆虫细胞例如果蝇（Drosophila）S2和灰翅夜蛾（Spodoptera）Sf9；以及植物细胞，例如棉花、玉米、马铃薯、大豆、矮牵牛、番茄、和烟草的细胞培养物。已经鉴定了众多杆状病毒株和变体和对应的来自宿主例如草地贪夜蛾
（Spodoptera frugiperda）（毛虫）、埃及伊蚊（Aedes aegypti）（蚊子）、白纹伊蚊（Aedes albopictus）（蚊子）、黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）（果蝇）和家蚕（Bombyx mori）的许可性昆虫宿主细胞。多种用于转染的病毒株可公开获得，例如，苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒（Autographa californica）NPV的L-1变体和家蚕核多角体病毒（Bombyx mori）NPV的Bm-5株，并且此类病毒可在本文中用作根据本发明的病毒，特别是用于转染草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）细胞。
（Spodoptera frugiperda）（毛虫）、埃及伊蚊（Aedes aegypti）（蚊子）、白纹伊蚊（Aedes albopictus）（蚊子）、黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）（果蝇）和家蚕（Bombyx mori）的许可性昆虫宿主细胞。多种用于转染的病毒株可公开获得，例如，苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒（Autographa californica）NPV的L-1变体和家蚕核多角体病毒（Bombyx mori）NPV的Bm-5株，并且此类病毒可在本文中用作根据本发明的病毒，特别是用于转染草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）细胞。
[0267] 可用的哺乳动物宿主细胞系的实例为SV40转化的CV1猴肾细胞系（COS-7，ATCC CRL1651）；人胚肾细胞系（293或经亚克隆进行悬浮培养的293细胞，Graham et al.，J.Gen Virol.36：59(1977)）；幼仓鼠肾细胞系（BHK，ATCC CCL10）；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR（CHO，Urlaub et al.，1980）；小鼠睾丸支持细胞（TM4，Mather，1980）；猴肾细胞（CV1ATCC CCL70）；非洲绿猴肾细胞（VERO-76，ATCC CRL-1587）；人宫颈癌细胞（HELA，ATCC CCL2）；犬肾细胞（MDCK，ATCC CCL34）；布法罗大鼠肝细胞（BRL3A，ATCC CRL1442）；人肺细胞（W138，ATCC CCL75）；人肝细胞（Hep G2，HB8065）；小鼠乳腺癌细胞（MMT060562，ATCC CCL51）；TRI细胞（Mather et al.，1982）；MRC5细胞；FS4细胞；和人类肝癌细胞系（Hep G2）。
[0268] 例如，当融合配偶体，例如酶或抗体结合域需要一种或多种翻译后修饰，例如糖基化作用时，将优选真核细胞系，例如哺乳动物细胞系。例如，一个或多个酶可能需要翻译后修饰以具有最佳活性，并因此可在能进行此类翻译后修饰的表达宿主中有效表达。
[0269] 在一个实施方案中，宿主细胞为具有氧化性胞浆的细胞，例如大肠杆菌Origami菌株（Novagen）。
[0270] 在另一个实施方案中，宿主细胞为具有还原性胞浆的细胞，优选大肠杆菌。
[0271] 例如，宿主细胞可选自以下类：雷尔氏菌属（Ralstonia）、产碱菌属（Acaligenes）、假单胞菌属（Pseudomonas）和盐二型菌属（Halobiforma）。例如，优选所用的微生物选自：真养产碱杆菌（Ralstonia eutropha）、肥大产碱菌（Alcaligenes latus）、大肠杆菌（Escherichia coli）、脆假单胞菌（Pseudomonas fragi）、恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）、食油假单胞菌（Pseudomonas oleovorans）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）、和盐二型菌（Halobiforma haloterrestris）。该组既包含天然地能够制备生物相容的、生物可降解微粒的微生物，又包含微生物如大肠杆菌（其由于其基因组成而不能如此作）。如上文所述引入为使后者所述微生物能够制备微粒所需的基因。
[0272] 极端嗜盐古细菌制备具有更低水平蛋白非特异性结合的聚合物微粒，使得从这些细胞中分离和纯化微粒更为容易。
[0273] 原则上，任何可培养的宿主细胞均可通过上述方法用于制备聚合物微粒，即便是宿主细胞由于不同的代谢而不能制备形成聚合物微粒所需的底物。在这种情况下，向培养基中加入必需底物并随后通过已经引入细胞的基因所表达的蛋白将其转化成聚合物微粒。
[0274] 用于使后者所述宿主细胞能够制备聚合物微粒的基因包括例如硫解酶、还原酶或聚合物合酶，例如来自真养产碱杆菌（Ralstonia eutropha）的phaA硫解酶、phaB酮脂酰还原酶或phaC合酶。需要何种基因来增加宿主细胞对于聚合物微粒形成所缺少的要素将取决于宿主细胞的基因构成和培养基中所提供的何种底物。
[0275] 参与形成聚羟基烷酸酯（PHA）微粒的基因和蛋白、和有关微粒形成的总体考虑事项报道于Madison，et al，1999；公开的PCT国际申请WO2004/020623（Bernd Rehm）；和Rehm，2003；Brockelbank JA.et al.，2006；Peters和Rehm，2006； et al，
(2006)和Rehm(2006)，其全部通过引用并入本文。
(2006)和Rehm(2006)，其全部通过引用并入本文。
[0276] 聚合物合酶可单独在任何以(R)-羟基酰基-CoA或其它CoA硫酯或其衍生物作为底物的宿主细胞中使用。
[0277] 聚合物微粒也可体外形成。例如，优选使用无细胞表达系统。在该系统中提供聚合物合酶。优选纯化的聚合物合酶，例如可由重组制备获得的，或在能够进行蛋白翻译的无细胞系统中，可通过引入编码聚合物合酶的表达构建体而在无细胞系统自身中获得的聚合物合酶。为了制备允许微粒体外形成的环境，培养基中应当包括聚合物微粒形成所必需的底物。
[0278] 聚合物合酶可利用例如(R)-羟基酰基-CoA或其它CoA硫酯作为底物而用于体外制备功能化聚合物微粒。
[0279] 在用于体外聚合物微粒制备之前，融合多肽可利用细胞分选仪、离心、过滤或亲和色谱而从裂解细胞中纯化。
[0280] 体外聚合物微粒形成能够优化控制表面组成，包括融合多肽覆盖水平、磷脂组成等等。
[0281] 应理解，聚合物微粒的特性可通过控制制备聚合物微粒的条件加以影响或控制。例如，这可包括宿主细胞的基因组成，例如制备大颗粒的细胞分裂突变体，如Peters和Rehm，2005中所讨论的。还有维持宿主细胞的条件，例如温度、底物的存在、一个或多个微粒形成蛋白例如微粒尺寸决定蛋白的存在、聚合物调节剂的存在，等等。
[0282] 在一个实施方案中，聚合物微粒的一个期望特性是持久性。术语“持久性”指的是聚合物微粒在选定的环境中抗降解的能力。聚合物微粒的另一个期望特性是其由聚合物合酶或微粒形成蛋白形成，并在微粒组装期间结合至聚合物合酶或微粒形成蛋白的C-或N-末端。
[0283] 在本发明某些实施方案中，期望在宿主细胞中实现表达构建体的过表达。特定表达构建体的过表达机制为本领域所熟知，并将取决于构建体自身、待表达它的宿主、和其它因素，包括期望或需要的过表达程度。例如，可通过如下方式实现过表达：i）在原核宿主中利用强启动子系统，例如T7RNA聚合酶启动子系统；ii）利用高拷贝数质粒，例如含有colE1复制原点的质粒；或iii）稳定信使RNA，例如通过应用融合序列；或iv）通过例如优化密码子使用、核糖体结合位点、或终止位点等来优化翻译。过表达的益处可允许在期望时制备较小微粒和制备更高数目的聚合物微粒。
[0284] 形成聚合物微粒的聚合物组成可影响聚合物微粒的机械或理化性能。例如，聚合物组成有别的聚合物微粒可能半寿期不同，或者可能以不同的速率释放生物活性物质，特别是药物活性成分。例如，由C6-C143-羟基脂肪酸组成的聚合物微粒由于该聚合物的低结晶度而呈现较高的聚合物降解速率。增加聚合物骨架上侧链相对大的聚合物组份的分子比，通常会降低结晶度并导致更为突出的弹性性能。通过控制按照本文所述和本领域已知方法的聚合物组成，可相应地影响聚合物微粒的生物可降解性并因此影响聚合物微粒（和当存在时一种或多种融合配偶体）在例如，切向流过滤体系中的持续时间，或影响一种或多种目标物质或其前体向聚合物微粒的结合、对聚合物微粒的催化、或自聚合物微粒的释放。
[0285] 优选将至少一种具有功能性侧基的脂肪酸作为形成聚合物微粒的底物引入培养基，其中特别优选引入至少一种羟基脂肪酸和/或至少一种巯基脂肪酸和/或至少一种β-氨基脂肪酸。“具有功能性侧基的脂肪酸”应理解为表示饱和或不饱和脂肪酸。这些也包括含有选自以下的功能性侧基的脂肪酸：甲基、烷基、羟基、苯基、巯基、伯胺基、仲胺基和叔胺基、醛基、酮基、醚基、羧基、O-酯基、硫酯基、羧酸酰胺基、半缩醛基、缩醛基、磷酸单酯基和磷酸双酯基。底物的使用通过聚合物微粒期望组成和期望性能来决定。
[0286] 底物或底物混合物可包含至少一种任选取代的氨基酸、乳酸盐、酯或者饱和或不饱和脂肪酸，优选乙酰基-CoA。
[0287] 在一个实施方案中，底物混合物中提供一种或多种物质并于聚合物微粒形成期间合并入聚合物微粒，或扩散到聚合物微粒中。
[0288] 聚合物微粒可包含选自例如聚β-羟基酸、聚乳酸酯、聚硫酯和聚酯的聚合物。最优选聚合物包含聚羟基烷酸酯（PHA），优选聚(3-羟基丁酸酯)（PHB）。
[0289] 聚合物合酶或聚合物微粒优选包含封装聚合物微粒的磷脂单层。优选所述微粒形成蛋白横跨所述脂质单层。
[0290] 聚合物合酶或微粒形成蛋白优选结合至聚合物微粒结合、或与磷脂单层结合，或与两者均结合。
[0291] 微粒形成蛋白优选共价或非共价结合至其所形成的聚合物微粒。
[0292] 优选聚合物微粒至少约1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%的表面覆盖有融合多肽。
[0293] 在某些环境下，可能期望控制本发明方法所制备的微粒大小，例如以制备特别适于给定应用的微粒。例如，可能期望制备相对大的包含一个或多个融合配偶体的聚合物微粒，例如以支持强大的耐久性。例如，在用于制备一种或多种抗体的微粒情况下，可能期望制备相对大的包含一个或多个抗体结合域的聚合物微粒以确保切向流过滤体系的耐久性和功能性。在其它实例中，例如在酶底物向目标物质的催化中，可能期望制备相对小的包含一个或多个酶的聚合物微粒，例如以使切向流过滤体系能有相对高的酶浓度。控制聚合物微粒大小的方法描述于公开号为WO2004/020623的PCT/DE2003/002799和公开号为WO2007/037706的PCT/NZ2006/000251中。
[0294] 例如，在某些实施方案中，微粒大小通过控制微粒形成蛋白的表达、或者如果存在的话通过控制微粒大小决定蛋白的表达来控制。
[0295] 例如，在本发明的其它实施方案中，微粒大小控制可通过控制底物的可利用性、例如培养基中底物的可利用性来实现。在某些实例中，按足以确保控制聚合物微粒大小的量向培养基中添加底物。
[0296] 应理解可组合应用此类方法，从而可以对微粒大小实现更为有效的控制。
[0297] 例如，在不同的实施方案中，可控制微粒大小以制备粒径约10nm至3μm、优选约10nm至约900nm、约10nm至约800nm、约10nm至约700nm、约10nm至约600nm、约10nm至约
500nm、约10nm至约400nm、约10nm至约300nm、约10nm至约200nm、和特别优选约10nm至约100nm的微粒。
500nm、约10nm至约400nm、约10nm至约300nm、约10nm至约200nm、和特别优选约10nm至约100nm的微粒。
[0298] 例如，在其它实施方案中，可控制微粒大小以制备粒径约10nm至约90nm、约10nm至约80nm、约10nm至约70nm、约10nm至约60nm、约10nm至约50nm、约10nm至约40nm、约10nm至约30nm、或约10nm至约20nm的微粒。
[0299] 特别考虑了平均聚合物大小的其它范围，例如，包括落于上述范围之内的范围，例如粒径约50至约500nm、约150至约250nm、或约100至约500nm等的聚合物微粒。
[0300] 例如，在不同的实施方案中，所制备的微粒中90%粒径约200nm或以下、80%粒径约150nm或以下、60%粒径约100nm或以下、45%粒径约80nm或以下、40%粒径约60nm或以下、
25%粒径约50nm或以下、和5%粒径约35nm或以下。
25%粒径约50nm或以下、和5%粒径约35nm或以下。
[0301] 例如，在不同的实施方案中，该方法制备平均粒径小于约200nm、小于约150nm、或小于约110nm的聚合物微粒。
[0302] 本发明由前述内容组成，也设想下文仅作为举例给出的构架。实施例
实施例1：通过切向流过滤纯化IgG
实施例1：通过切向流过滤纯化IgG
[0303] 该实施例描述了代表抗体-结合多肽域的聚合物微粒与多种可商购切向流膜联合用于纯化IgG免疫球蛋白的用途。物质和方法
[0304] 全部过滤用Sartorius Crossflow Slice200体系进行。使用购自Sartorius的以下膜：0.1μm聚醚砜、0.2μm Hydrosart、和100kDa Hydrosart。压力控制
[0305] 将P1、P2和P3连至压力传感器，由每个点记录并将信号送至中央控制器。P1、P2和P3初始通过夹紧管子来控制，而后在一次运行期间置于不碰触（水通量和渗滤）。因此，通过自动改变泵进料速率来维持跨膜压力（TMP）。微粒制备
[0306] 在生物反应器中，通过培养携带pET14b-ZZ(-)phaC质粒的E.coli BL21细菌来制备ZZPhaC聚合物微粒。（Brockelbank等，2006）。所有生物质用BugBuster方案溶解并在50mM磷酸钾缓冲液（pH7.5）中洗涤3次。
[0307] 将2.69g聚合物微粒再悬浮于50mL的50mM磷酸钾缓冲液（pH7.5）中，得到53.8g/L聚合物微粒悬浮液。
[0308] 将15mL的53.8g/L聚合物微粒悬浮液加入100mL的50mM磷酸盐缓冲液（pH7.5），得到8.07g/L聚合物微粒悬浮液。
[0309] 该100mL的8.07g/L聚合物微粒悬浮液在切向流过滤期间用于渗滤。清水通量
[0310] 在聚合物微粒悬浮液渗滤之前和之后进行清水通量以监控过滤器膜品质。0.1μm过滤器：-
渗滤之前，TMP=1.1bar，渗透物流=272mL/min。
渗滤之后，用1M NaOH（40℃）将膜灭菌15min，然后再次灭菌30min，并用MQ水冲洗。
使0.1M NaOH在膜中循环用于储存。
TMP=1bar，渗透物流=248mL/min。
0.2μm过滤器：-
渗滤之前，TMP=1.1bar，渗透物流=284mL/min。
渗滤之后，用1M NaOH（40℃）将膜灭菌30min，然后50min，然后再次30min，并用MQ水冲洗。使0.1M NaOH在膜中循环用于储存。
TMP=1.1bar，渗透物流=228mL/min。
100kDa过滤器：-
渗滤之前，TMP=1.3bar，渗透物流=136mL/min。
渗滤之后，用1M NaOH（40℃）将膜灭菌15min，并用MQ水冲洗。使0.1M NaOH在膜中
循环用于储存。
TMP=1.3bar，渗透物流=120mL/min。
渗滤
渗滤之前，TMP=1.1bar，渗透物流=272mL/min。
渗滤之后，用1M NaOH（40℃）将膜灭菌15min，然后再次灭菌30min，并用MQ水冲洗。
使0.1M NaOH在膜中循环用于储存。
TMP=1bar，渗透物流=248mL/min。
0.2μm过滤器：-
渗滤之前，TMP=1.1bar，渗透物流=284mL/min。
渗滤之后，用1M NaOH（40℃）将膜灭菌30min，然后50min，然后再次30min，并用MQ水冲洗。使0.1M NaOH在膜中循环用于储存。
TMP=1.1bar，渗透物流=228mL/min。
100kDa过滤器：-
渗滤之前，TMP=1.3bar，渗透物流=136mL/min。
渗滤之后，用1M NaOH（40℃）将膜灭菌15min，并用MQ水冲洗。使0.1M NaOH在膜中
循环用于储存。
TMP=1.3bar，渗透物流=120mL/min。
渗滤
[0311] 用2L的50mM磷酸钾缓冲液（pH7.5）渗滤100mL的8.7g/L聚合物微粒悬浮液。进行过滤，直至用完2L（约18-20min）。在多种泵进料流速期间TMP保持不变。结果
滞留物分析
滞留物分析
[0312] 对初始给料进行聚合物微粒蛋白图SDS-PAGE（Coomassie蓝染色，参见图5）、IgG纯化、GC/MS（参见图6）、和TEM（参见图7）分析（分别为图6A和7A）和对切向流过滤滞留物进行聚合物微粒蛋白图SDS-PAGE（Coomassie蓝染色，参见图5）、IgG纯化、GC/MS（参见图6）、和TEM（参见图7）分析（分别为图6B和7B）。
[0313] 可以看出，使用本发明的聚合物微粒实现极好的流速、渗透物收集速率、和IgG免疫球蛋白的最终高效纯化。GC/MS分析显示移除了脂肪酸污染物。
[0314] 这些数据还显示了在典型的用于切向流过滤的条件下，本发明聚合物微粒不遭受变形（参见图7B）或损害（图6B和图7B）。GC/MS分析未显示聚合物降解产物证据。这些数据显示使用本发明聚合物微粒的切向流技术（包括膜、过滤器和过滤器设备）抵抗损害和污垢并因此将不会污染目标物质，并可容易地再生以再次使用。讨论
[0315] 本实施例清晰地证明了在切向流过滤技术中使用如本文所述聚合物微粒的本发明方法非常适用于从复杂混合物分离和制备有价值的目标分子。实施例2.从混合溶液纯化人类IgG
介绍
介绍
[0316] 该实施例描述了包含Z-域聚合物微粒和TFF在自混合溶液纯化人类IgG中的用途。
物质和方法
物质和方法
[0317] 将5g包含Z-域的本发明聚合物微粒（如以上实施例所述）加入至BSA和IgG溶液（于PBS中的50ml悬浮液，pH7.4）。允许IgG结合至聚合物微粒一段设定的时期（30min）。预孵育之后，在TFF（0.1um膜）上渗滤聚合物微粒-IgG-BSA悬浮液几次渗滤体积。通过
280nm处吸光率测量收集的渗滤级份中存在的蛋白（A280，50ml级份），并绘制洗脱图（以观察BSA的移除）。当A280达到0时，通过加入柠檬酸盐（pH3.0）洗脱IgG，并且渗透物中IgG的洗脱随后是A280和通过SDS-PAGE分析渗滤级份（银染色）。
结果
280nm处吸光率测量收集的渗滤级份中存在的蛋白（A280，50ml级份），并绘制洗脱图（以观察BSA的移除）。当A280达到0时，通过加入柠檬酸盐（pH3.0）洗脱IgG，并且渗透物中IgG的洗脱随后是A280和通过SDS-PAGE分析渗滤级份（银染色）。
结果
[0318] 如图8所示，BSA说明初始A280吸光率。在级份13处，当渗滤级份吸光率为零时，加入柠檬酸盐并用作渗滤缓冲液、同时洗脱IgG。使用各自的摩尔消光系数计算IgG和BSA的相对量。该计算结果显示存在渗滤级份中IgG和BSA以它们在初始溶液中所制备比例的定量回收。
[0319] 为了确定A280的第一峰和第二峰分别为BSA、和IgG，运行SDS-PAGE以检验每个渗滤级份中的蛋白。图9A中凝胶显示了初始溶液和来自TFF分析的渗滤级份1-13的每一个。该凝胶确认了BSA主要存在于前洗脱渗滤级份中（存在痕量的未结合IgG）。如图9B中所示，运行第二凝胶以观察渗滤级份14-26中的蛋白。在加入柠檬酸盐（pH3.0）之后立即收集这些级份和随后的洗脱IgG。
[0320] 这些结果显示IgG主要从聚合物微粒洗脱进入渗透物。讨论
[0321] 该结果清晰地证明了在TFF中利用包含Z-域的聚合物微粒的本发明方法对于从包含污染蛋白（BSA）的溶液纯化IgG是有效的。类似地，本发明方法对于制备已移除了IgG的溶液是有效的，这证明了本发明方法在例如无免疫球蛋白血清制备中的效用。实施例3.GBl-域聚合物微粒和TFF在从山羊血清纯化山羊IgG中的应用。
介绍
介绍
[0322] 本实施例描述了在TFF中制备和使用包含蛋白G的GB1域的聚合物微粒以从复杂混合物纯化山羊IgG。物质和方法
表达质粒的构建
表达质粒的构建
[0323] 如 下 构 建 质 粒 pET-14b PhaC-(GB1)3。 通 过 Genscript Inc.合 成 DNA序列（所 附序 列ID列表 中SEQ ID NO.1），所述 DNA序列编 码N-末端 连接 子（LEVLAVIDKRGGGGGSGGGSGGGSGGGG，[SEQ ID NO.2]）和三个来自蛋白G的GBl结合域
（Streptococcus sp.），每个通过连接子域（SGGGSGGGSGGGGS，[SEQ ID NO.3]）分隔。引入的XhoI/BamHI位点用以替代质粒pET14b PhaC-MalE中的MalE编码DNA域（Jahns和
Rehm，2009）。这形成具有所附序列ID列表中如SEQ ID NO.4所述DNA序列的质粒pET-14b PhaC-(GB1)3。
（Streptococcus sp.），每个通过连接子域（SGGGSGGGSGGGGS，[SEQ ID NO.3]）分隔。引入的XhoI/BamHI位点用以替代质粒pET14b PhaC-MalE中的MalE编码DNA域（Jahns和
Rehm，2009）。这形成具有所附序列ID列表中如SEQ ID NO.4所述DNA序列的质粒pET-14b PhaC-(GB1)3。
[0324] 将质粒pET-14b PhaC-(GB1)3引入持有质粒pMCS69的大肠杆菌菌株（Amara和Rehm，2003）能够制备显示(GB1)3的PHB聚合物微粒。
IgG纯化
IgG纯化
[0325] 使用TFF基IgG结合和纯化方案以从山羊血清结合和纯化IgG。将5mL山羊血清样品加入至35.5ml（5g）包含GBl-域的本发明聚合物微粒悬浮液。以计算浓度加入聚合物微粒以完全结合IgG（例如5g湿重聚合物微粒悬浮液>220mg的IgG结合能力）并调节至
50ml的最终体积以制得1:10于PBS中的最终血清稀释液。用PBS渗滤混合物直至在通过
A280nm测量（图10）和通过SDS-PAGE测量（图11）时完全移除血清蛋白。用具有0.1nm孔
2
径的50cm 中空纤维筒进行渗滤。一旦移除血清蛋白，将滞留物浓缩至20ml和然后使用柠檬酸钠盐（pH3.0）洗脱50ml滞留物中的山羊IgG。
结果
50ml的最终体积以制得1:10于PBS中的最终血清稀释液。用PBS渗滤混合物直至在通过
A280nm测量（图10）和通过SDS-PAGE测量（图11）时完全移除血清蛋白。用具有0.1nm孔
2
径的50cm 中空纤维筒进行渗滤。一旦移除血清蛋白，将滞留物浓缩至20ml和然后使用柠檬酸钠盐（pH3.0）洗脱50ml滞留物中的山羊IgG。
结果
[0326] 图10和11所示数据证明了IgG成功从山羊血清移除，因此制备了无IgG的血清蛋白，和然后纯化的IgG能够自滞留物中的聚合物微粒洗脱并使用低pH缓冲液渗滤使纯化的IgG穿过渗透物得以释放。
讨论
讨论
[0327] 该结果证明了在TFF中利用包含GB1-域的聚合物微粒的本发明方法对于从复杂混合物首先纯化无IgG的血清蛋白制剂、和随后纯化IgG是有效的。因此，通过选择适当的渗滤条件，本发明方法能够从复杂混合物相继提供所需的成分级份。实施例4.金-结合肽聚合物微粒和TFF在从水纯化无机胶状金中的应用。
介绍
介绍
[0328] 本实施例描述了TFF和包含金结合域的本发明聚合物微粒在从溶液移除无机物质（胶状金）中的用途。方法
[0329] 如描述制备包含金结合肽的聚合物微粒（参见Jahns，A.C等，Bioconjugate Chem.2008，19，2072-2080）。在30ml去离子水中制备10nm胶状金微粒的0.005%溶液并将2
其平衡于20cm、0.2um中空纤维微滤筒上。在完全再循环下运行该体系，将渗透物进料回滞留物罐。通过520nm处吸光率测量金微粒的量。在测量渗透物级份中胶状金溶液的吸光率之后，将30mg（最终1mg/ml）的聚合物微粒加入至滞留物储罐。以4分钟间隔自进料流取样渗透物级份。于8和29分钟处，将额外300mg的聚合物微粒加入至滞留物以进一步结合溶液中残留金。
结果
其平衡于20cm、0.2um中空纤维微滤筒上。在完全再循环下运行该体系，将渗透物进料回滞留物罐。通过520nm处吸光率测量金微粒的量。在测量渗透物级份中胶状金溶液的吸光率之后，将30mg（最终1mg/ml）的聚合物微粒加入至滞留物储罐。以4分钟间隔自进料流取样渗透物级份。于8和29分钟处，将额外300mg的聚合物微粒加入至滞留物以进一步结合溶液中残留金。
结果
[0331] 本实施例清晰地证明了本发明方法在回收无机化合物和从溶液移除它们中的效用。该方法既可以应用于无机化合物是有价值的、并需要回收其的环境，也可以应用于无机化合物是污染物并需要将其从溶液或其它溶液中存在的其它成分移除的环境。实施例5.淀粉酶连接聚合物微粒和TFF在从可溶淀粉制备和回收麦芽糖中的用途。
介绍
介绍
[0332] 本实施例描述了TFF和包含酶的聚合物微粒在生物处理生物分子中的用途。此时，包含淀粉酶的聚合物微粒用以将可溶淀粉悬浮液转化为麦芽糖。方法
[0333] 如描述制备包含淀粉酶的聚合物微粒（参见Rasiah，I.，Rehm，B.H.A.，(2009)One-step production of immobilised a-amylase in recombinant Escherichia coli.Appl Environ.Microbiol.75：2012-2016）。于50℃下，用2g聚合物微粒振荡孵育（分批操作）1%w/v、4%w/v和8%w/v的可溶淀粉PBS悬浮液（300ml）。孵育2小时后，将1%淀粉-聚2
合物微粒悬浮液渗滤入固定有110cm、0.1um微滤筒的TFF体系。收集渗滤级份（50ml）并稍后测量麦芽糖浓度。另外，通过渗滤过200ml PBS缓冲液而从聚合物微粒洗涤麦芽糖。
合物微粒悬浮液渗滤入固定有110cm、0.1um微滤筒的TFF体系。收集渗滤级份（50ml）并稍后测量麦芽糖浓度。另外，通过渗滤过200ml PBS缓冲液而从聚合物微粒洗涤麦芽糖。
[0334] 完全收集1%溶液之后，将4%淀粉-聚合物微粒悬浮液加入至相同的滞留物并渗滤过该体系，并以相同的方式从8%悬浮液回收麦芽糖。一旦完成TFF，测定渗透物中回收的麦芽糖量（图13）。结果
[0335] 如可由图13清晰所见，结合至聚合物微粒的淀粉酶能够在TFF体系内催化麦芽糖的制备，这证明了微粒-连接催化剂能用于高温应用并且产物（麦芽糖）可容易地从反应悬浮液移除。讨论
[0336] 在该实施例中，聚合物微粒和高分子量淀粉保留于允许水解发生的滞留物级份中，而低分子量产物麦芽糖可连续地分离进入渗滤级份。
[0338] 本实施例描述了从放射土壤杆菌（A.radiobacter）制备包含有机磷酸水解酶（OpdA）的聚合物微粒和该微粒在大肠杆菌（Escherichia coli.）的表达。OpdA经由设计的连接子域而N-末端融合至真养产碱杆菌（Ralstonia eutropha）的聚合物微粒形成酶PhaC（参见Blatchford等，in press Biotech.Bioeng.）。物质和方法
细菌菌株和生长条件
细菌菌株和生长条件
[0339] 本研究中所用细菌菌株列于下表1。除非另有说明，全部大肠杆菌菌株生长于37℃下。当需要时，以以下浓度加入抗生素：青霉素（75μg/ml）、氯霉素（50μg/ml）和四环素（12.5μg/ml）。对于聚合物微粒制备，细胞于37℃下生长至OD600为0.45，然后通过添加
1mM IPTG来诱导。诱导后，培养物在振荡瓶中于30℃下培养44小时。
表1.细菌菌株、质粒和寡核苷酸
r r r
Tc-四环素抗性，Ap-青霉素抗性，Cm-氯霉素抗性
质粒和寡核苷酸
1mM IPTG来诱导。诱导后，培养物在振荡瓶中于30℃下培养44小时。
表1.细菌菌株、质粒和寡核苷酸
r r r
Tc-四环素抗性，Ap-青霉素抗性，Cm-氯霉素抗性
质粒和寡核苷酸
[0340] 本研究所用质粒列于上表1。使用本领域通常已知的方法进行一般克隆程序和DNA离析。DNA引物、脱氧核苷三磷酸、T4DNA连接酶和Taq聚合酶购自Integrated DNA Technologies，（CA，USA）。化学试剂购自Sigma Aldrich（St.Louis，MO）。用于制备功能性OpdA聚酯颗粒的质粒的构建
[0341] 作为质粒pETMCSI的插入物，由CSIRO，Canberra，Australia获得编码有机磷降解蛋白的opdA DNA序列。用设计的5'和3'限制性位点设计引物。5'引物（5'–XhoI，[SEQ ID NO.5]携带XhoI限制性位点，3'引物（3'–BamHI，[SEQ ID NO.6]携带BamHI限制性位点。用Sigma制造的引物进行Pfx PCR以扩大OpdA编码区。该片段为聚A结尾的并捕入质粒pGEM-T Easy。使用蓝/白选择在指示板上筛选转化株。通过确认顺序筛分重组白色菌落用于opdA插入物。通过用XhoI和BamHI限制性酶水解，opdA序列从质粒pGEM-T Easy裂解。质粒pET14b PhaC-连接子-MalE用作OpdA蛋白N末端疏水性分析之后包含连接子
域所必需的适当载体。用XhoI和BamHI水解质粒pET14b PhaC-连接子-MalE以从质粒裂
解MalE域。将opdA序列克隆入质粒骨干pET14b PhaC-连接子的XhoI和BamHI位点，得到质粒pET14b PhaC-连接子-OpdA。这用以转化携带质粒pMCS69的大肠杆菌BL21λ（DΕ3）感受态细胞，其介导聚合物微粒形成所需的前体R-3-羟基丁酰基-辅酶A（CoA）的合成。
新质粒载体的DNA序列通过确定DNA顺序来证实。为了制备不显示OpdA活性的对照聚合
物微粒，质粒pETC（其仅编码真养产碱杆菌的野生型PhaC）在质粒pMCS69的存在下用于大肠杆菌BL21λ（DΕ3）。
蛋白分析
域所必需的适当载体。用XhoI和BamHI水解质粒pET14b PhaC-连接子-MalE以从质粒裂
解MalE域。将opdA序列克隆入质粒骨干pET14b PhaC-连接子的XhoI和BamHI位点，得到质粒pET14b PhaC-连接子-OpdA。这用以转化携带质粒pMCS69的大肠杆菌BL21λ（DΕ3）感受态细胞，其介导聚合物微粒形成所需的前体R-3-羟基丁酰基-辅酶A（CoA）的合成。
新质粒载体的DNA序列通过确定DNA顺序来证实。为了制备不显示OpdA活性的对照聚合
物微粒，质粒pETC（其仅编码真养产碱杆菌的野生型PhaC）在质粒pMCS69的存在下用于大肠杆菌BL21λ（DΕ3）。
蛋白分析
[0342] 通过十二烷基磺酸钠（SDS）-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分析聚酯蛋白图，如Laemmli，U.K.1970.Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.Nature227：680-5中所描述的。凝胶用Coomassie brilliant blue G250染色。使用Bradford蛋白定量方法测定蛋白浓度。使用MALDI-TOF质谱指纹识别分析胰蛋白酶肽
[0343] 为了鉴别PhaC-OpdA融合蛋白，将目标蛋白带从凝胶切出并进行胰蛋白酶消化、随后如之前所述（15）通过MALDI-TOF质谱分析所得的胰蛋白酶肽。聚酯分析
[0344] 通过气相色谱/质谱（GC/MS）定性和定量测定聚酯，聚羟基丁酸酯（其显示聚酯合酶体内活性）的制备，如Brandl，H.，R.A.Gross，R.W.Lenz，和R.C.Fuller.1988.Pseudomonas oleovorans as a Source of Poly(beta-Hydroxyalkanoates)for Potential Applications as Biodegradable Polyesters.Appl.Env.Microbiol.54：1977-1982中所描述的。聚合物微粒
[0345] 使用机械细胞破碎并在甘油上梯度超速离心，从重组大肠杆菌细胞分离聚 合 物 微 粒，如 Jahns，A.C，R.G.Haverkamp，和B.H.Rehm.2008.Multifunctional inorganic-binding polymer particles self-assembled inside engineered bacteria.Bioconj.Chem.19：2072-80中所描述的。从携带pMCS69和pETC的大肠杆菌BL21λ（DΕ3）细胞制备对照聚合物微粒。
显微镜方法
显微镜方法
[0346] Nile红染色后，用荧光显微镜显现细菌细胞内生成的聚酯颗粒，如Peters，V.，和B.H.Rehm.2005.In vivo monitoring of PHA granule formation using GFP-labeled PHA synthases.FEMS Microbiol.Lett.248：93-100中所描述的。酶试验
[0347] 使 用 Dumas 和 coworkers（Dumas，D.P.，S.R.Caldwell，J.R.Wild， 和F.M.Raushel.1989.Purification and properties of the phosphotriesterase from Pseudomonas diminuta.J.Biol.Chem.264：19659-19665） 和 Harcourt 等（Harcourt，R.L.，I.Horne，T.D.Sutherland，B.D.Hammock，R.J.Russell，和 J.G.Oakeshott.2002.Development of a simple and sensitive fluorimetric method for isolation of coumaphos-hydrolysing bacteria.Lett.Appl.Microbiol.34：263-268）所描述的方法，通过使用甲基对硫磷（O,O-二乙基O-(4-硝基苯基)硫代磷酸酯；Sigma）作为底物测定结合PhaC-OpdA的聚合物微粒和结合PhaC的聚酯的有机磷水解酶活性。
[0348] 使用Spectromax90分光光度计（Molecular Devices），通过405nm处吸光率的增加（由对硝基苯酚的释放引起）来监控甲基对硫磷的水解速率。酶活性单位被定义为每分钟转化的μmol甲基对硫磷。结果
[0349] 编码全长OpdA的质粒pET14b PhaC-连接子-OpdA翻译融合至聚酯合酶PhaC（介导重组大肠杆菌B121λ（DΕ3）中聚羟基丁酸酯（PHB）聚合物微粒的形成）的C末端，导致总聚酯含量占生物质的约48%，当与仅表达野生型聚酯合酶的重组大肠杆菌B121λ（DΕ3）所制备的59%含量相比时其略小。通过Nile红染色细胞荧光显微镜方法额外确认了细胞内球形微粒的形成（未显示数据）。分离的聚合物微粒所附的蛋白分析清晰地显示了PhaC-OpdA融合蛋白的过度制备，所述PhaC-OpdA融合蛋白的身份通过胰蛋白酶肽指纹识别分析确认（未显示数据）。
[0350] 使用甲基对硫磷作为底物，测试显示PhaC和PhaC-OpdA融合的聚合物微粒的有机磷水解酶活性。PhaC聚合物微粒不具有可检测有机磷水解酶活性，然而显示聚合物微粒的PhaC-OpdA融合蛋白具有每克湿聚合物微粒质量约1,840U的活性。讨论
[0351] 本实施例显示了可通过融合至聚酯合酶PhaC的C末端来制备本发明的催化聚合物微粒，其中酶（本情况中为OpdA）以高密度和功能性被有效固定。使用标准细菌发酵技术，可工业规模地制备这些聚合物微粒，并且这些聚合物微粒适用于TFF。实施例7.催化聚合物微粒在TFF基转化和除毒中的用途。
[0352] 在该实施例中，通过TFF使用包含酶基团的聚合物微粒，从溶液催化和分离有机低分子量化合物。另外，证明了本方法中酶活性可以循环。方法
[0353] 200μΜ甲基对硫磷于CHES缓冲液中的50ml溶液形成滞留物溶液。采用使用了2
0.2μm、20cmPES微滤筒的TFF体系并在全循环下运行该50ml TFF滞留物，同时每5分钟收集0.5ml级份（～30ml或1DV），用以测量吸光率并返回至滞留物。运行10分钟后，将
500mg聚合物微粒加入至悬浮液并于405nm处观察到MP向PNP的转化（图14）。反应完成后，渗滤滞留物以移除所收集的50ml级份中的全部PNP（图15）。移除全部PNP后，将剩余的聚合物微粒再悬浮于45ml并将5ml MP浓缩物加入以生成200μΜ甲基对硫磷，重复浓缩和批转化过程直至完全再循环，并于520nm处以5分钟间隔测量反应进程（图14）。
结果
0.2μm、20cmPES微滤筒的TFF体系并在全循环下运行该50ml TFF滞留物，同时每5分钟收集0.5ml级份（～30ml或1DV），用以测量吸光率并返回至滞留物。运行10分钟后，将
500mg聚合物微粒加入至悬浮液并于405nm处观察到MP向PNP的转化（图14）。反应完成后，渗滤滞留物以移除所收集的50ml级份中的全部PNP（图15）。移除全部PNP后，将剩余的聚合物微粒再悬浮于45ml并将5ml MP浓缩物加入以生成200μΜ甲基对硫磷，重复浓缩和批转化过程直至完全再循环，并于520nm处以5分钟间隔测量反应进程（图14）。
结果
[0354] 如可清晰地由图14和15所见，本发明方法可经由催化过程的多次循环来移除污染的低分子量有机化合物。图14清晰地显示了甲基对硫磷在TFF期间与聚合物微粒接触下向对硝基苯酚的快速转化。由图14可知，完成甲基对硫磷向对硝基苯酚的催化转化之后，用CHES缓冲液渗滤30ml聚合物微粒悬浮液。通过测量渗滤级份于405nm处的吸光率监控对硝基苯酚的移除。一旦对硝基苯酚被移除，聚合物微粒被循环用于又一轮的除毒。实施例8.切向流过滤在PHB聚合物微粒纯化中的用途
[0355] 本实施例描述了TFF用于工业级纯化PHB聚合物微粒和用于多种应用的广义用途。在一个示例性实施方案中，TFF用于从细胞匀浆移除宿主细胞污染物。将细菌生物质悬浮于包括加工赋形剂例如溶解酵素和EDTA的缓冲溶液（以破坏细菌细胞壁）并通过本领域所熟知的多种方法，包括超声、细胞破碎仪或微流化中的任一种进行溶解。一旦溶解，使用所需尺寸（例如0.1μm-0.45μm）的微滤从聚合物微粒分离小的亚细胞成分。代表性处理方案示于图6。
实施例9.通过TFF、使用中空纤维横流过滤器-渗透物分析移除宿主细胞污染物
实施例9.通过TFF、使用中空纤维横流过滤器-渗透物分析移除宿主细胞污染物
[0356] 实施例9中的代表性处理方案用于本制备实施例中，其描述了使用TFF制备聚合物微粒组合物。方法
[0357] 用1mM EDTA将约20g含PHB聚合物微粒的大肠杆菌生物质在250ml磷酸盐缓冲2
的盐（PBS）中微流化。直接将250ml匀浆加入至具有0.1μm孔110cmTFF筒的中空纤维
TFF体系，并用8体积（8x250ml）的PBS-20%乙醇进行渗滤（图17）。
结果
的盐（PBS）中微流化。直接将250ml匀浆加入至具有0.1μm孔110cmTFF筒的中空纤维
TFF体系，并用8体积（8x250ml）的PBS-20%乙醇进行渗滤（图17）。
结果
[0358] 如可由图17所见，正如通过观察渗滤级份的含量（通过渗滤级份于260、280和600nm处的吸光率）（图17A），渗滤级份的蛋白浓度（图17B）、和通过分析SDS PAGE上的渗滤级份（图17C）来证明的那样，容易地实现了宿主细胞污染物的移除。由于可溶蛋白（A280）和核酸（A260）从聚合物微粒移除进入渗透物，纯化得以证明。
实施例10.清洁剂（脱氧胆酸）在使用中空纤维切向流过滤的PHB聚合物微粒纯化中的
用途。
实施例10.清洁剂（脱氧胆酸）在使用中空纤维切向流过滤的PHB聚合物微粒纯化中的
用途。
[0359] 本实施例证明了宿主细胞蛋白和膜的分离通过使用清洁剂（在该实施例中为脱氧胆酸（DOC））而被进一步增强。方法
[0360] 使用多种缓冲液来均质化宿主细胞（以及释放PHB聚合物微粒），每种含有0.2%DOC。所用的均质化缓冲液组成列于下表2。这些相同的缓冲液也用于中空纤维TFF方法中的渗滤以纯化聚合物微粒悬浮液（图18）。将大肠杆菌生物质（～20g）在250ml的多
2
种缓冲液中微流化。随后在110cm 中空纤维切向流筒上，用8体积（8x250ml）的相同缓冲液渗滤该匀浆。针对PBS-20%乙醇额外TFF渗滤之后，评价聚合物微粒的IgG结合活性。
结果
2
种缓冲液中微流化。随后在110cm 中空纤维切向流筒上，用8体积（8x250ml）的相同缓冲液渗滤该匀浆。针对PBS-20%乙醇额外TFF渗滤之后，评价聚合物微粒的IgG结合活性。
结果
[0361] 如可由图19所见，在多种越来越苛刻的条件下，通过TFF渗滤处理之后保持了IgG-结合活性。表2.用于IgG纯化的匀质化和TFF缓冲液条件
实施例11.清洁剂（卢布若尔）在使用开放式流道切向流过滤的PHB聚合物微粒纯化中
的用途。
实施例11.清洁剂（卢布若尔）在使用开放式流道切向流过滤的PHB聚合物微粒纯化中
的用途。
[0362] 使用设计用于中试规模的开放式流道横流体系，清洁剂增强的PHB聚合物微粒TFF纯化的使用也得以大规模发展。清洁剂例如脱氧胆酯、卢布若尔和SDS被证明对于增强这些聚合物微粒的纯化是有效的。方法
[0363] 通过微流化于0.5%卢布若尔50mM Tris-10mM EDTA缓冲液（pH10）中，将325g含有包含Z-域的本发明聚合物微粒的大肠杆菌生物质均质化。通过于16000xg下离心该细胞匀浆30分钟来回收粗聚合物微粒以移除富含宿主细胞DNA、蛋白和脂质的上清液。2
[0364] 将粗聚合物微粒匀浆应用于总开放式流道表面积为0.34m 的MilliporeProstak–4轴膜筒。用8体积的0.1%卢布若尔处理粗聚合物微粒悬浮液以进行渗滤。20mM Tris-10mM EDTA钠（pH10）、8体积的25mM柠檬酸钠盐（pH3.0）和8体积的PBS-20%乙醇（pH7.4）。使用pH3.0柠檬酸盐缓冲液的处理被设计为模拟聚合物微粒洗脱条件和移除任何残留的、可在酸性条件下洗脱的宿主细胞蛋白。PBS-20%乙醇用以在不支持微生物生长的环境中控制最终产物的pH和盐度。
结果
结果
[0365] 图20所示渗透物分析显示了显著降低的蛋白和核酸，这很大程度上归因于在TFF之前经由粗聚合物微粒离心而移除了这些污染物。
[0366] 分析从滞留物回收的、包含GB1-域的本发明聚合物微粒的IgG结合活性并与原始宿主细胞生物质的甘油梯度纯化样品的结合活性相比较（参见图21）。结合数据显示，衍生自这些聚合物微粒的所得IgG产率与非可扩展甘油梯度处理和可扩展TFF-清洁剂萃取处理的相似。因此，不仅是PHB聚合物微粒功能性被保留，而且用于微粒制备的TFF基方法能够大规模生产。实施例12.增强聚合物微粒的TFF纯化的化学方法
[0367] 本实施例证明通过使用化学萃取剂实现了聚合物微粒纯化的增强。在该方法中，用多种化学条件的任一种处理细菌匀浆以增强细胞碎片的分散和通过移除污染物的纯化。化学条件的范围可构成化学萃取模型。另外，测试该化学处理剂以测定该化学处理剂是否影响聚合物微粒的活性。
方法
方法
[0368] 用于增强本发明方法中从PHB-聚合物微粒萃取污染物的多种化学条件列于下表3。
表3.化学萃取模型
批洗涤研究
表3.化学萃取模型
批洗涤研究
[0369] 用多种化学处理剂萃取含有包含Z-域的本发明聚合物微粒（IgG结合PHB聚合物微粒）的粗生物质匀浆，所述化学处理剂包括酸和碱处理剂、高盐、螯合剂、清洁剂和离液剂。在离心聚合物微粒/匀浆（15000xg，20分钟）之后，通过测量上清液吸光率来量化污染物移除度。将粗聚合物微粒球再次悬浮于PBS（pH7.4）中并测定IgG结合的残留度（与PBS对照相比）。
结果
结果
[0370] 如可由图22A所见，取决于所用的化学处理剂，通过A260和A280量化的污染物移除度显著变化。此外，如图22B所示，取决于制备方法中所用的化学处理剂，IgG结合残留度显著变化。实施例13.用于纯化PHB聚合物微粒的可变规模方法
[0371] 一种合并了化学萃取和TFF的用于纯化聚合物微粒的可扩展方法示于图23中。该方法可自20g生物质量至多公斤规模运行。另外，化学萃取条件并不限于本文所明确示例的那些——清洁剂类型、浓度二者，并可改变化学处理剂以适于聚合物微粒制备过程的特定要求。
[0372] 化学萃取后，将纯化的聚合物微粒块应用于装载有可扩展膜表面的Prostak体2 2
系，根据要求，所述可扩展膜表面为0.17m-数m。
系，根据要求，所述可扩展膜表面为0.17m-数m。
[0373] TFF渗滤之后，当从Prostak体系回收时，将纯化的聚合物微粒储存于PBS-乙醇中，或者在更小规模的中空纤维体系中浓缩至特定“浆料”浓度。进行多种分析测量法以表征最终聚合物微粒制备或贯穿该方法按需进行多种分析测量。实施例14.PHB聚合物微粒从大肠杆菌生物质的中试规模萃取
[0374] 在本实施例中，用如以上实施例13所述的可变规模方法处理中试规模量的含有PHB聚合物微粒的大肠杆菌生物质（1100-1200g）。方法
[0375] 将聚合物微粒在SDS-Tris-EDTA碱液中微流化以均质化细胞并回收粗聚合物微粒。在第二阶段中，溶解过程中的粗聚合物微粒块（其被广泛压实）（参见图24）随后用溶解清洁剂，硫代甘油和0.1N NaOH洗涤。各步骤间，以16000xg收取聚合物微粒30分钟。
[0376] 萃取之后，中和粗聚合物微粒并装填于Prostak体系上，所述Prostak体系装填有2
膜面积为0.41m 的可扩展膜表面，并用20体积的0.04%SDS-TRIS EDTA、7体积的柠檬酸盐缓冲液（pH3.0）和最高10体积的10mM硫酸钠、150mM NaCl（pH7.4）-20%乙醇渗滤，直至悬浮液的pH达到pH7.4（图25）。
结果
膜面积为0.41m 的可扩展膜表面，并用20体积的0.04%SDS-TRIS EDTA、7体积的柠檬酸盐缓冲液（pH3.0）和最高10体积的10mM硫酸钠、150mM NaCl（pH7.4）-20%乙醇渗滤，直至悬浮液的pH达到pH7.4（图25）。
结果
[0377] 本实施例所用纯化方法的效力由SDS-PAGE分析（参见图26）和聚合物微粒悬浮液中内毒素减少鉴定（如下表3所示）所清晰可见。表3–TFF纯化之前和之后的内毒素水平
讨论
讨论
[0378] 本实施例证明通过使用本文所述方法容易地实现了经由TFF的聚合物微粒中试规模制备。经由TFF从粗生物质分离实现了污染蛋白的大幅移除、以及内毒素水平的大幅降低。因此，对于利用TFF方法可扩展制备纯化聚合物微粒而言，本发明方法是经得起检验的。。工业应用
[0379] 本发明聚合物微粒和方法已广泛应用于纯化和制备技术，包括从复杂组合物分离目标物质和从包含一种或多种反应底物的组合物制备反应产物。
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