技术领域
[0001] 本
发明属于医疗检测技术领域，具体涉及一种HER2基因过表达的乳腺癌细胞系的构建方法。
背景技术
[0002] 乳腺癌是女性常见的
恶性肿瘤之一，全世界每年约有130万妇女发生乳腺癌，有50万妇女死于乳腺癌。其发病率始终处于上升状态，尤以近20年来最为显著。乳腺癌的发生涉及细胞凋亡与增殖失衡、细胞的分化紊乱、癌基因与抑癌基因的功能失调以及相关
信号传导系统等多种生命活动的异常。随着现代分子
生物学、分子免疫学、肿瘤免疫学、
生物工程学研究的迅速进展，人们对乳腺癌的研究已进入了一个活跃阶段。
[0003] 表皮生长因子受体-2(Epidermal growth factor receptor-2，HER2)，是一种位于乳腺和乳腺癌细胞表面的受体，能够控制癌细胞的生长、浸润和癌细胞的转移，大约20％的乳腺癌病例中存在HER2基因和/或蛋白
水平增加，它是乳腺癌的独立
预后因子，在乳腺癌的靶向
治疗和预后判断中的作用已经得到了全世界临床医生的认可。HER2阳性的肿瘤是一种高危肿瘤，HER2癌基因的扩增预示病情进展迅速，局部复发的危险性高，化疗缓解期短，无病生存期(DFS)和总生存期(OS)缩短，对某些常规的化疗和
激素治疗
反应性差。目前最为常用并经FDA批准的适用于治疗HER2过度表达或HER2基因扩增的乳腺癌的药物是曲妥珠单抗(赫赛汀)，由于这种药物只有针对HER2基因扩增和蛋白过度表达的病人才有效，因此准确评价HER2基因和蛋白水平至关重要。
[0004] 但肿瘤特异性
抗原表达的缺失会造成假阴性结果。后者是根据细胞大小的差异，利用过滤的方法将体积较大的肿瘤细胞筛选富集。该技术的优势在于方法简单、价格低廉，分离获得的CTCs具有活性可用于后续研究；但由于缺乏形态学诊断金标准，该富集技术特异性相对较差。传统上的质控品倾向于使用乳腺癌患者的组织样本作为检测质控品，但是这种质控品来源局限，一致性较差，在应用的过程中存在较大的局限性。此外，患者来源的质控品只能随机测定HER2阳性与阴性，无法特定地反映出HER2基因表达水平以及多体造成的
假阳性。
发明内容
[0005] 针对以上技术问题，本发明提供一种HER2基因过表达的乳腺癌细胞系的构建方法。
[0006] 本发明的技术方案：一种HER2基因过表达的乳腺癌细胞系的构建方法，包括以下步骤：
[0007] S1：将新鲜的乳腺癌细胞在含有10％FBS的液体培养基中，在
温度为30-35℃的条件下培养1-2h,然后用FBS充分洗涤后，置于转动
频率为50-80r/min、温度为20℃的恒温摇床上进行悬浮细胞培养，对培养后的细胞通过灭菌处理，再100目过滤，进行转接培养3-5次，再在水浴温度为30℃、通气量为5-10m3/h的条件下震荡处理2-4h，得到乳腺癌细胞；
[0008] S2：提取乳腺癌细胞的总mRNA，将总mRNA进行稀释后放入到反应离心管，在温度为60-75℃的条件下，加入反转录缓冲液，然后温度按照1.5℃/min的降温速率下降至20-30℃，向其加入反转录酶、DNA聚合酶，期间不断用磁
力棒搅拌处理，处理30-45min，得到cDNA，再对得到的cDNA通过上下引物分别进行PCR扩增，通过切酶SnaBI剪切，进行琼脂凝胶
电泳，通过pBS-T Mini Kit中
片段连接的方法，分别克隆到pBS-T载体中，通过电泳结果筛选及其琼脂糖凝胶电泳，获得质粒；
[0009] S3：所述质粒作为模板，pGenesil-1载体，构建出相应的pGenesil-ETV1A(含有靶点序列ETV1A)、pGenesil-ETV1B(含有含有靶点序列ETV1B)、pGenesil-ETV1C(含有靶点序列ETV1C)、pGenesil-NC(含有乱序序列的阴性对照)重组siRNA表达载体；在200μlPCR管中配制如下连接体系：pGenesil-1/HindⅢ/BamHⅠ载体大片段1μl；双链片段DNA5ul；T4DNAligase1ul；10×T4DNAligasebuffer1ul；ddH2O2μl；以上体系配制好后放入金属浴，16℃反应4小时，将连接产物全部加入到100μlDH5α感受态中，
冰浴15min，加入500μlLB液体培养基，在温度为30℃，70rpm的条件下，振荡培养1h，然后在35℃热激90s后立即冰浴100s，取
150μl培养物涂布于LB/Kan平板上37℃倒置培养10小时；
[0010] S4：对培养后培养物进行
转染Marc-145细胞，通过消化，振荡过滤将Marc-145细胞重选，调节细胞悬浮液
密度，培养3-6h，然后将培养后的Marc-145细胞放入到四孔板中培养，待细胞密度为60-70％时，向四孔中分别加入转染
试剂离心搅拌，观察细胞病变，培养4代后，加入含有乳腺癌细胞的新鲜培养基培养3-5h，洗涤，观察细胞状态及
荧光强度。
[0011] 进一步地，所述步骤S1中液体培养液为
硝酸铵15-20g/L、黄豆粉3-7g/L、
磷酸氢二
钾0.03-1g/L。
[0012] 进一步地，步骤S2中PCR反应体系及反应条件：通过无菌超纯水稀释至10μM/L；取已经稀释好的两条互补的mRNA靶点序列片段各1.5μl，10×T4buffer1μl，加水至总体积20μl，放于200μl的PCR管中，RT产物8.7uL，4×PCR缓冲液3uL，15mM的
氯化钾3uL，PCR引物溶液1.5uL，DNA聚合酶0.5uL混匀后加入到87孔样品板上进行PCR反应，反应条件：85℃，8min；90℃，25min，60℃，30秒钟，65℃，2min，循环30次；70℃1min；4℃直至收取PCR产物。
[0013] 进一步地，步骤S2中所得的质粒通过阳性克隆筛选，进行阳性克隆筛选时，先平均取得质粒，均匀涂布到含去去甲基金霉素培养基平板上，培养6h，然后抽提质粒，将培养物在温度为20-30℃条件下，滤
膜过滤，通过EcoRI进行单酶切鉴定，被EcoRI切开的可能是阳性克隆。
[0014] 进一步地，所述步骤S3中通过利用氯化镁和酒精沉淀Dig-HER2探针，进行纯化。
[0015] 进一步地，步骤S4中从-70℃中取出质粒细胞，冰上放置4min，待质粒细胞解冻后，加入9μL连接产物，轻柔混匀内容物，冰中放置10min；然后将之放到预加温到30℃的水浴锅中，静置70s；快速将离心管转移到冰浴中，使细胞冷却6min；向离心管加入800μLLB培养基，然后转移到37℃摇床，搅拌速率为250r/min；取200μL培育后的细胞均匀涂布于含50μg/mLAmpicillinLB平板上，平板上液体被吸收后，将平板倒置于37℃
培养箱中，培养16h；从培养好的平板上挑取4个单独、饱满的菌落，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布含100μg/mL
氨苄青霉素的LB平板，37℃过夜培养，挑取单克隆进行扩大培养和质粒提取，将试管置于细菌摇床中培养，在温度为37℃，250r/min的条件下，培养16h；通过用质粒小提
试剂盒抽提质粒。
[0016] 进一步地，步骤S4中，将状态良好的乳腺癌细胞以5×60个/孔加入96孔板，50μl/孔，然后放入温度为40℃、6％CO2的培养箱中培养，然后加入病毒液，首先取6μl病毒原液用培养基1：6连续稀释6个梯度；然后吸取96孔板每个孔中培养基10μl，加入稀释好的病毒液10μl，然后再放入温度为37℃、5％CO2的培养箱中培养，最后去除含病毒的培养基，更换新鲜培养基，感染48h后，观察GFP绿色荧光表达情况，在荧光
显微镜下观察不同梯度病毒稀释液处理下带有荧光细胞的数量。
[0017] 进一步地，步骤S1中进行细胞培养时，灭菌过滤后，在滤液中再加入20mL DMEM培养基混悬，在转速为600rpm条件下离心3min，弃上清，轻轻重悬沉淀物并加入15ml DMEM培养液和3mL Percoll混匀，弃上清后再次用培养基重悬，在转速为700rpm条件下离心1min，加入用0.25％胰酶消化，在温度为4℃转速为2000rpm条件下离心5min。
[0018] 与
现有技术相比，本发明的有益效果为：能够提高细胞筛选富集率的同时，该技术设备要求不高，方法易于掌握，并能实时监测，具有临床推广应用可能，通过该方法，不用取材乳腺癌组织即可检测到晚期乳腺癌患者HER2基因表达情况，可以将外源基因有效地整合到宿主基因组序列中，从而形成稳定遗传物质，使得目的基因在细胞中可稳定长期表达，在感染能力方面，具有整合效率高，假阳性率低等优点，通过挑选出单克隆进行PCR凝胶电泳进行阳性克隆的筛选，内切酶酶切图谱分析所建的真核重组质粒，获得序列正确的重组质粒转染乳腺癌细胞，筛选稳定过表达HER2的乳腺癌细胞，观察稳定过表达HER2的细胞生物学特性。而且其筛选标记物可扩展到标记物中，在后续的筛选中可轻易进行识别和筛选。
具体实施方式
[0020] 一种HER2基因过表达的乳腺癌细胞系的构建方法，包括以下步骤：
[0021] S1：将新鲜的乳腺癌细胞在含有10％FBS的液体培养基中，液体培养液为硝酸铵15g/L、黄豆粉3g/L、
磷酸氢二钾0.03g/L，在温度为30℃的条件下培养1h,然后用FBS充分洗涤后，置于转动频率为50℃/min、温度为20℃的恒温摇床上进行悬浮细胞培养，对培养后的细胞通过灭菌处理，再100目过滤，步骤S1中进行细胞培养时，灭菌过滤培养后，在滤液中再加入20mL DMEM培养基混悬，在转速为600rpm条件下离心3min，弃上清，轻轻重悬沉淀物并加入15ml DMEM培养液和3mL Percoll混匀，弃上清后再次用培养基重悬，在转速为700rpm条件下离心1min，加入用0.25％胰酶消化，在温度为4℃转速为2000rpm条件下离心5min,进行转接培养3次，再在水浴温度为30℃、通气量为5m3/h的条件下震荡处理2h，得到乳腺癌细胞；
[0022] S2：提取乳腺癌细胞的总mRNA，将总mRNA进行稀释后放入到反应离心管，在温度为60℃的条件下，加入反转录缓冲液，然后温度按照1.5℃/min的降温速率下降至20℃，向其加入反转录酶、DNA聚合酶，期间不断用磁力棒搅拌处理，处理30min，得到cDNA，再对得到的cDNA通过上下引物分别进行PCR扩增，通过无菌超纯水稀释至10μM/L；取已经稀释好的两条互补的mRNA靶点序列片段各1.5μl，10×T4buffer1μl，加水至总体积20μl，放于200μl的PCR管中，RT产物8.7uL，4×PCR缓冲液3uL，15mM的氯化钾3uL，PCR引物溶液1.5uL，DNA聚合酶
0.5uL混匀后加入到87孔样品板上进行PCR反应，反应条件：85℃，8min；90℃，25min，60℃，
30秒钟，65℃，2min，循环30次；70℃1min；4℃直至收取PCR产物，通过切酶SnaBI剪切，进行琼脂凝胶电泳，通过pBS-T Mini Kit中片段连接的方法，分别克隆到pBS-T载体中，进行阳性克隆筛选时，先平均取得质粒，均匀涂布到含去去甲基金霉素培养基平板上，培养6h，然后抽提质粒，将培养物在温度为20℃的条件下，滤膜过滤，通过EcoRI进行单酶切鉴定，被EcoRI切开的可能是阳性克隆，通过电泳结果筛选及其琼脂糖凝胶电泳，获得质粒；
[0023] S3：所述质粒作为模板，pGenesil-1载体，构建出相应的pGenesil-ETV1A(含有靶点序列ETV1A)、pGenesil-ETV1B(含有含有靶点序列ETV1B)、pGenesil-ETV1C(含有靶点序列ETV1C)、pGenesil-NC(含有乱序序列的阴性对照)重组siRNA表达载体；在200μlPCR管中配制如下连接体系：pGenesil-1/HindⅢ/BamHⅠ载体大片段1μl；双链片段DNA5ul；T4DNAligase1ul；10×T4DNAligasebuffer1ul；ddH2O2μl；以上体系配制好后放入金属浴，16℃反应4小时，将连接产物全部加入到100μlDH5α感受态中，冰浴15min，加入500μlLB液体培养基，在温度为30℃，70rpm的条件下，振荡培养1h，然后在35℃热激90s后立即冰浴100s，取
150μl培养物涂布于LB/Kan平板上37℃倒置培养10小时；
[0024] S4：从-70℃中取出质粒细胞，冰上放置4min，待质粒细胞解冻后，加入9μL连接产物，轻柔混匀内容物，冰中放置10min；然后将之放到预加温到30℃的水浴锅中，静置70s；快速将离心管转移到冰浴中，使细胞冷却6min；向离心管加入800μLLB培养基，然后转移到37℃摇床，搅拌速率为250r/min；取200μL培育后的细胞均匀涂布于含50μg/mLAmpicillinLB平板上，平板上液体被吸收后，将平板倒置于37℃培养箱中，培养16小时；从培养好的平板上挑取4个单独、饱满的菌落，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布含100μg/mL氨苄青霉素的LB平板，37℃过夜培养，挑取单克隆进行扩大培养和质粒提取，将试管置于细菌摇床中培养，在温度为37℃，250r/min的条件下，培养16h；通过用质粒小提试剂盒抽提质粒，对培养后培养物进行转染Marc-145细胞，通过消化，振荡过滤将Marc-145细胞重选，调节细胞悬浮液密度，培养4h，然后将培养后的Marc-145细胞放入到四孔板中培养，待细胞密度为65％时，向四孔中分别加入转染试剂离心搅拌，观察细胞病变，培养4代后，加入含有乳腺癌细胞的新鲜培养基培养4h，洗涤，将状态良好的乳腺癌细胞以5×60个/孔加入96孔板，50μl/孔，然后放入温度为40℃、6％CO2的培养箱中培养，然后加入病毒液，首先取6μl病毒原液用培养基1：6连续稀释6个梯度；然后吸取96孔板每个孔中培养基10μl，加入稀释好的病毒液10μl，然后再放入温度为37℃、5％CO2的培养箱中培养，最后去除含病毒的培养基，更换新鲜培养基，感染48h后，观察GFP绿色荧光表达情况，在荧光显微镜下观察不同梯度病毒稀释液处理下带有荧光细胞的数量。
[0025] 实施例2
[0026] 一种HER2基因过表达的乳腺癌细胞系的构建方法，包括以下步骤：
[0027] S1：将新鲜的乳腺癌细胞在含有10％FBS的液体培养基中，液体培养液为硝酸铵18g/L、黄豆粉5g/L、磷酸氢二钾0.5g/L，在温度为33℃的条件下培养1h,然后用FBS充分洗涤后，置于转动频率为60r/min、温度为20℃的恒温摇床上进行悬浮细胞培养，对培养后的细胞通过灭菌处理，再100目过滤，进行转接培养4次，再在水浴温度为30℃、通气量为8m3/h的条件下震荡处理3h，得到乳腺癌细胞；
[0028] S2：提取乳腺癌细胞的总mRNA，将总mRNA进行稀释后放入到反应离心管，在温度为70℃条件下，加入反转录缓冲液，然后温度按照1.5℃/min的降温速率下降至25℃，向其加入反转录酶、DNA聚合酶，期间不断用磁力棒搅拌处理，处理35min，得到cDNA，再对得到的cDNA通过上下引物分别进行PCR扩增，通过无菌超纯水稀释至10μM/L；取已经稀释好的两条互补的mRNA靶点序列片段各1.5μl，10×T4buffer1μl，加水至总体积20μl，放于200μl的PCR管中，RT产物8.7uL，4×PCR缓冲液3uL，15mM的氯化钾3uL，PCR引物溶液1.5uL，DNA聚合酶
0.5uL混匀后加入到87孔样品板上进行PCR反应，反应条件：85℃，8min；90℃，25min，60℃，
30秒钟，65℃，2min，循环30次；70℃1min；4℃直至收取PCR产物，通过切酶SnaBI剪切，进行琼脂凝胶电泳，通过pBS-T Mini Kit中片段连接的方法，分别克隆到pBS-T载体中，进行阳性克隆筛选时，先平均取得质粒，均匀涂布到含去去甲基金霉素培养基平板上，培养6h，然后抽提质粒，将培养物在温度为25℃的条件下，滤膜过滤，通过EcoRI进行单酶切鉴定，被EcoRI切开的可能是阳性克隆，通过电泳结果筛选及其琼脂糖凝胶电泳，获得质粒；
[0029] S3：所述质粒作为模板，pGenesil-1载体，构建出相应的pGenesil-ETV1A(含有靶点序列ETV1A)、pGenesil-ETV1B(含有含有靶点序列ETV1B)、pGenesil-ETV1C(含有靶点序列ETV1C)、pGenesil-NC(含有乱序序列的阴性对照)重组siRNA表达载体。在200μlPCR管中配制如下连接体系：pGenesil-1/HindⅢ/BamHⅠ载体大片段1μl；双链片段DNA5ul；T4DNAligase1ul；10×T4DNAligasebuffer1ul；ddH2O2μl，以上体系配制好后放入金属浴，16℃反应4小时，将连接产物全部加入到100μlDH5α感受态中，冰浴15min，加入500μlLB液体培养基，在温度为30℃，70rpm条件下，振荡培养1h，然后在35℃热激90s后立即冰浴100s，取
150μl培养物涂布于LB/Kan平板上37℃倒置培养10小时；
[0030] S4：从-70℃中取出质粒细胞，冰上放置4min，待质粒细胞解冻后，加入9μL连接产物，轻柔混匀内容物，冰中放置10min；然后将之放到预加温到30℃的水浴锅中，静置70s；快速将离心管转移到冰浴中，使细胞冷却6min；向离心管加入800μLLB培养基，然后转移到37℃摇床，搅拌速率为250r/min；取200μL培育后的细胞均匀涂布于含50μg/mLAmpicillinLB平板上，平板上液体被吸收后，将平板倒置于37℃培养箱中，培养16小时；从培养好的平板上挑取4个单独、饱满的菌落，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布含100μg/mL氨苄青霉素的LB平板，37℃过夜培养，挑取单克隆进行扩大培养和质粒提取，将试管置于细菌摇床中培养，在温度为37℃，250r/min的条件下，培养16小时；通过用质粒小提试剂盒抽提质粒，对培养后培养物进行转染Marc-145细胞，通过消化，振荡过滤将Marc-145细胞重选，调节细胞悬浮液密度，培养5h，然后将培养后的Marc-145细胞放入到四孔板中培养，待细胞密度为65％时，向四孔中分别加入转染试剂离心搅拌，观察细胞病变，培养4代后，加入含有乳腺癌细胞的新鲜培养基培养4h，洗涤，将状态良好的乳腺癌细胞以5×60个/孔加入96孔板，50μl/孔，然后放入温度为40℃、6％CO2的培养箱中培养，然后加入病毒液，首先取6μl病毒原液用培养基1：6连续稀释6个梯度；然后吸取96孔板每个孔中培养基10μl，加入稀释好的病毒液10μl，然后再放入温度为37℃、5％CO2的培养箱中培养，最后去除含病毒的培养基，更换新鲜培养基，感染48h后，观察GFP绿色荧光表达情况，在荧光显微镜下观察不同梯度病毒稀释液处理下带有荧光细胞的数量。
[0031] 实施例3
[0032] 一种HER2基因过表达的乳腺癌细胞系的构建方法，包括以下步骤：
[0033] S1：将新鲜的乳腺癌细胞在含有10％FBS的液体培养基中，液体培养液为硝酸铵20g/L、黄豆粉7g/L、磷酸氢二钾1g/L，在温度为35℃的条件下培养2h,然后用FBS充分洗涤后，置于转动频率为80r/min、温度为20℃的恒温摇床上进行悬浮细胞培养，对培养后的细胞通过灭菌处理，再100目过滤，进行转接培养5次，再在水浴温度为30℃、通气量为10m3/h的条件下震荡处理4h，得到乳腺癌细胞；
[0034] S2：提取乳腺癌细胞的总mRNA，将总mRNA进行稀释后放入到反应离心管，在温度为75℃条件下，加入反转录缓冲液，然后温度按照1.5℃/min的降温速率下降至30℃，向其加入反转录酶、DNA聚合酶，期间不断用磁力棒搅拌处理，处理45min，得到cDNA，再对得到的cDNA通过上下引物分别进行PCR扩增，通过无菌超纯水稀释至10μM/L；取已经稀释好的两条互补的mRNA靶点序列片段各1.5μl，10×T4buffer1μl，加水至总体积20μl，放于200μl的PCR管中，RT产物8.7uL，4×PCR缓冲液3uL，15mM的氯化钾3uL，PCR引物溶液1.5uL，DNA聚合酶
0.5uL混匀后加入到87孔样品板上进行PCR反应，反应条件：85℃，8min；90℃，25min，60℃，
30秒钟，65℃，2min，循环30次；70℃1min；4℃直至收取PCR产物，通过切酶SnaBI剪切，进行琼脂凝胶电泳，通过pBS-T Mini Kit中片段连接的方法，分别克隆到pBS-T载体中，进行阳性克隆筛选时，先平均取得质粒，均匀涂布到含去去甲基金霉素培养基平板上，培养6h，然后抽提质粒，将培养物在温度为30℃的条件下，滤膜过滤，通过EcoRI进行单酶切鉴定，被EcoRI切开的可能是阳性克隆，通过电泳结果筛选及其琼脂糖凝胶电泳，获得质粒；
[0035] S3：所述质粒作为模板，pGenesil-1载体，构建出相应的pGenesil-ETV1A(含有靶点序列ETV1A)、pGenesil-ETV1B(含有含有靶点序列ETV1B)、pGenesil-ETV1C(含有靶点序列ETV1C)、pGenesil-NC(含有乱序序列的阴性对照)重组siRNA表达载体。在200μlPCR管中配制如下连接体系：pGenesil-1/HindⅢ/BamHⅠ载体大片段1μl；双链片段DNA5ul；T4DNAligase1ul；10×T4DNAligasebuffer1ul；ddH2O2μl；以上体系配制好后放入金属浴，16℃反应4小时，将连接产物全部加入到100μlDH5α感受态中，冰浴15min，加入500μlLB液体培养基，在温度为30℃，70rpm条件下，振荡培养1h，然后在35℃热激90s后立即冰浴100s，取
150μl培养物涂布于LB/Kan平板上37℃倒置培养10小时。
[0036] S4：从-70℃中取出质粒细胞，冰上放置4min，待质粒细胞解冻后，加入9μL连接产物，轻柔混匀内容物，冰中放置10min；然后将之放到预加温到30℃的水浴锅中，静置70s；快速将离心管转移到冰浴中，使细胞冷却6min；向离心管加入800μLLB培养基，然后转移到37℃摇床，搅拌速率为250r/min；取200μL培育后的细胞均匀涂布于含50μg/mLAmpicillinLB平板上，平板上液体被吸收后，将平板倒置于37℃培养箱中，培养16小时；从培养好的平板上挑取4个单独、饱满的菌落，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布含100μg/mL氨苄青霉素的LB平板，37℃过夜培养，挑取单克隆进行扩大培养和质粒提取，将试管置于细菌摇床中培养，在温度为37℃，250r/min的条件下，培养16h；通过用质粒小提试剂盒抽提质粒，对培养后培养物进行转染Marc-145细胞，通过消化，振荡过滤将Marc-145细胞重选，调节细胞悬浮液密度，培养6h，然后将培养后的Marc-145细胞放入到四孔板中培养，待细胞密度为70％时，向四孔中分别加入转染试剂离心搅拌，观察细胞病变，培养4代后，加入含有乳腺癌细胞的新鲜培养基培养5h，洗涤，将状态良好的乳腺癌细胞以5×60个/孔加入96孔板，50μl/孔，然后放入温度为40℃、6％CO2的培养箱中培养，然后加入病毒液，首先取6μl病毒原液用培养基1：6连续稀释6个梯度；然后吸取96孔板每个孔中培养基10μl，加入稀释好的病毒液10μl，然后再放入温度为37℃、5％CO2的培养箱中培养，最后去除含病毒的培养基，更换新鲜培养基，感染48h后，观察GFP绿色荧光表达情况，在荧光显微镜下观察不同梯度病毒稀释液处理下带有荧光细胞的数量。
[0037] 最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行
修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围。
