一种用于哺乳动物核酸样品质量控制的引物、探针及分子检测方法
阅读：1015发布：2020-12-03
专利汇可以提供一种用于哺乳动物核酸样品质量控制的引物、探针及分子检测方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种用于 哺乳动物 核酸样品 质量 控制的引物、探针及分子检测方法。所述的引物和探针如SEQ ID NO.1-4所示。所述分子检测方法是用上述引物和探针对核酸样品进行PCR扩增，根据PCR过程中 荧光 强度的变化，以及PCR扩增产物在琼脂糖凝胶 电泳 的条带，对核酸样品进行定量或/和分型。使用本发明可以方便、有效地监控在样品采集、运输、保存、提取等任何环节出现的潜在问题，为提高PCR的可信度、降低其假阴性报告率等提供技术支持。，下面是一种用于哺乳动物核酸样品质量控制的引物、探针及分子检测方法专利的具体信息内容。
1.一种用于哺乳动物核酸样品质量控制的引物和探针，其特征在于，所述引物和探针如下：
上游引物-1： 5’-TACCTGACTGGAGGAGTCTGGAGTCT-3’
上游引物-2： 5’-GCCAGGCTGATGCCCAGGTTCT-3’
6-FAM探针： 5’-AGCAHGAAGATGGYCCWGA-6-FAM-3’
LCRed640探针： 5’-LCRED640-GATGAYCCACAGCTGGTRG-Phosphate-3’。
2.一种用于哺乳动物核酸样品质量控制分子检测方法，其特征在于，用权利要求1所述引物和探针对核酸样品进行PCR扩增，根据PCR过程中荧光强度的变化，以及PCR扩增产物在琼脂糖凝胶电泳的条带，对核酸样品进行定量或/和分型。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，合成羟甲基胆色烷合成酶基因的代表序列,计算其所含的基因拷贝的绝对数目而制备成一系列不同拷贝数的标准品，在同一系统扩增标准品和样品核酸，根据标准品产生的标准曲线对样品核酸进行精确定量。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，对PCR扩增产物进行基因测序后，与羟甲基胆色烷合成酶基因标准序列比对，对哺乳动物进行分型。
一种用于哺乳动物核酸样品质量控制的引物、探针及分子
检测方法
技术领域
[0001] 本发明建立了一套基于羟甲基胆色烷合成酶基因、适用于所用哺乳动物PCR质量控制的内源基因系统。该系统能高度敏感、特异地扩增来自9个国家(津巴布韦，尼加拉瓜，哥斯达尼加，多米尼格，格林纳达，蒙特塞拉特，尼维斯，圣基茨，中国)的、人和12种哺乳动物(猴,猫,狗,牛,驴,山羊,绵羊,马,豹子,狮子,猪和老虎)的核酸、二种小鼠品系的11种组织器官(心脏、肝脏、脑、脾脏、肺脏、脂肪、肾脏、肌肉、毛发、骨、皮肤)的核酸，而不扩增细菌、寄生虫、病毒、食用植物油的核酸。此外，本发明设计的扩增片断包含的一段基因序列区，所有哺乳动物在该区有显著差异，测序此区可快速方便地鉴定哺乳动物的种类。
背景技术
[0002] PCR技术自1986年发明以来，已经被广泛地应用于医学、生物学和农业科学等各个领域，由于其无与伦比的高度特异性和敏感性，PCR技术成为现代分子检测学的必不可少的核心组成部分。而PCR结果的可信性很大程度上依赖于待检样品的核酸水平和质量。影响最终待检样品中核酸的质量和水平的因素包括：1)样品采集。采集的样品中目的核酸的含量、样品的采集过程以及采集缓冲液和抗凝剂的选择；2）样品的储存和运输。样品的不科学的储存和处理、反复冻融、溶血等会引起核酸的降解；3）样品的核酸提纯。不恰当的核酸提纯方式、残留PCR抑制剂等都会影响样品的质量。为此，科学家们成功地建立了一种在样品中添加外部控制基因的办法来监控待检样品核酸提纯效率等而确保PCR的可信度。然而，加入外源性控制基因的手段不能监控样品采集、运输、保存等环节上出现的核酸降解和污染等问题。目前世界范围内,还没有一个全程监控待检样品的核酸水平和质量并方便地用于PCR质量控制的系统。因此，亟需建立一种能够有效及全程地监控从样品采集到核酸提纯等环节的质量控制系统，从而确保PCR结果的可信度。
发明内容
[0003] 为了解决现有技术存在的不足，本发明提供一种基于羟甲基胆色烷合成酶基因的哺乳动物核酸定量和分型的分子检测方法，使用本发明可以方便、有效地监控在样品采集、运输、保存、提取等任何环节出现的潜在问题，为提高PCR的可信度、降低其假阴性报告率等提供技术支持。
[0004] 本发明的原理和最核心的思路是发明一种高度灵敏的、可以用于任何哺乳动物PCR系统的外源性基因控制系统。确保此系统不扩增非哺乳动物以外的核酸，如细菌、病毒、寄生虫和植物等。本发明选择了一个相对保守的看家基因（羟甲基胆色烷合成酶）作为目标基因，此基因主要存在于哺乳动物,而不存在于植物和细菌等微生物。总体的思路是：巧妙地设计一对引物和探针，特异地扩增所有哺乳动物的核酸；此PCR扩增产物的羟甲基胆色烷合成酶基因在哺乳动物中高度多样性的区域（90个核酸在哺乳动物中的相似率仅为19%，图1）。因此，PCR扩增后对PCR扩增产物进行基因测序可以方便地确定哺乳动物的种类；此设计测试不同种类和来源的核酸样品，而保证其高度的特异性和敏感性。
[0005] 从GenBank（www.ncbi.nlm.nih.gov）获取如下羟甲基胆色烷合成酶基因的序列后，用Clustal Multiple Alignment Algorithm的方法对所有序列进行比对（如图1所示）：人：NG_008093,猴子：NC_007871,狗：NC006587,猫：NC_018732,牛：AC000712,羊：NC019472,猪：NC_010451,马：NC_009150,小鼠：NC_000075,大鼠：NC_005107。据此，本发明设计的引物和探针为：
[0006] 上游引物-1：5’-TACCTGACTGGAGGAGTCTGGAGTCT-3’（SEQ ID NO.1）[0007] 上游引物-2：5’-GCCAGGCTGATGCCCAGGTTCT-3’（SEQ ID NO.2）[0008] 6-FAM探针:5’-AGCAHGAAGATGGYCCWGA-6-FAM-3’（SEQ ID NO.3）[0009] LCRed640 探 针：5’-LCRED640-GATGAYCCACAGCTGGTRG-Phosphate-3’（SEQ ID NO.4）。
[0010] 本发明还公开了用于哺乳动物核酸样品质量控制分子检测方法，即用上述引物和探针对核酸样品进行PCR扩增，根据PCR过程中荧光强度的变化，以及PCR扩增产物在琼脂糖凝胶电泳的条带大小，对核酸样品进行定量或/和分型。
[0011] 所述的定量，是合成羟甲基胆色烷合成酶基因的代表序列,计算其所含的基因拷贝的绝对数目而制备成一系列不同拷贝数的标准品，在同一系统扩增标准品和样品核酸，根据标准品产生的标准曲线对样品核酸进行精确定量。
[0012] 由于本发明的PCR扩增产物包含一段在所有哺乳动物中高度多样性的区域。因此，PCR扩增后对PCR扩增产物进行基因测序后，与GenBank中的羟甲基胆色烷合成酶基因标准序列进行比对可以确定哺乳动物的种类。
[0013] 羟甲基胆色烷合成酶-PCR（HMBS-PCR）特异性的确定。本发明的特异性从五个方面得到保证：
[0014] 1)设计的引物和探针经过GenBank的BLAST搜索，确认本发明设计的引物能特异地扩增哺乳动物，而不扩增其它非哺乳动物的核酸。同时，通过BLAST确认,一对上下游引物和二个探针能特异地扩增和检测所有的哺乳动物核酸；
[0015] 2）本发明特异敏感地检测人和12种哺乳动物的血液核酸，而不扩增其它非哺乳动物（如细菌、植物食用油、寄生虫）的核酸；
[0016] 3)本发明检测小鼠的11种器官和组织的核酸,保证此基因在不同组织器官均表达,而且此基因拷贝数在不同小鼠品系、性别和组织器官无明显差异；
[0017] 4）观察以上扩增对象在PCR过程中荧光强度（640nm）的变化，以及PCR扩增产物在琼脂糖凝胶电泳的条带的大小。荧光在640nm波长出现或增强，显示阳性；PCR扩增产物在琼脂糖凝胶电泳显示预期的176bp的条带；
[0018] 5）对扩增的176bp的PCR产物进行测序，测序的结果和GenBank中的羟甲基胆色烷合成
[0019] 酶基因标准序列进行比对。
[0020] 羟甲基胆色烷合成酶-PCR灵敏度的确定：由IDT合成羟甲基胆色烷合成酶基因的代表序列。依据合成物的分子量和绝对重量以及PicoGreen的DNA定量技术，计算合成物所含的基因拷贝的绝对数目。随后，对合成物进行稀释，制备每10μl合成物的稀释试剂含10000拷贝、1000拷贝、100拷贝、10拷贝的基因。用本发明系统扩增含不同基因浓度，来确定本发明检测此基因的灵敏度。此外，50微升的小鼠血液用于核酸提纯，然后10倍稀释，用于本发明的PCR测定。结果显示，此发明的单个反应系统可以扩增0.5nl小鼠血液DNA，这等同于一个反应系统中5个拷贝的羟甲基胆色烷合成酶基因(图3)。上述确定敏感性的标准品系统（每10μl合成物的稀释试剂含10000拷贝、1000拷贝、100拷贝、10拷贝的基因）会产生一个标准曲线的几何公式。使用本发明同时扩增标准品系统和样品核酸，由标准品系统产生的标准曲线可以精确的决定样品核酸的浓度，用于精确的定量。
[0021] 在各个行业、大学、研究所、研发机构、检测中心等，PCR都是必不可少的手段。绝大多数这些研究都是和哺乳动物样品相关。本发明将是世界范围内，第一个通用的、检测样品采集、运输、储存、核酸提取全过程的质量控制系统，本发明专利将会产生理想的经济效益。附图说明
[0022] 图1.10种哺乳动物HMBS-PCR扩增产物序列的比对。引物和探针以及对应的哺乳动物的碱基序列显示在实线框中。实线框的上方是引物和探针的序列，黑点表示哺乳动物的碱基序列和引物和探针的序列、人HMBS基因的序列相同，破折号表示碱基缺失。
[0023] 图2小鼠11种组织和脏器中HMBS基因拷贝数的比较。HMBS基因的拷贝数在C57BL/6和BALB/c两种小鼠之间没有统计学的差异，而雌性小鼠的HMBS拷贝数显著高于雄性小鼠。在心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏的表达量显著高于脂肪、骨头、毛发。横线表示该组HMBS拷贝数的平均值，不同的字母（a或b）表示统计学显著差异。
[0024] 图3.HMBS-PCR系统能够灵敏地检测0.5μl的血液核酸。50μl小鼠的全血核酸提取后,经10倍连续稀释用于HMBS-PCR，确定此PCR系统的检测灵敏度为一个反应体系能够检测0.5nl小鼠血样的DNA，等同于5个拷贝的HMBS基因。
[0025] 图4.犬血液核酸的DNA含量和HMBS拷贝数的比较。横坐标表示PicoGreen确定的样品核酸的绝对浓度,纵坐标代表每10微升血样中的HMBS基因拷贝数。空心圆圈代表2012年采自哥斯达黎加的犬血液样品（39只），实心圆圈是2013年采自中国内蒙古的犬血液的核酸样品（40只）。
[0026] 图5.蚊子所吸血液的HMBS含量、血液量及血液宿主的确定。从某大学校园的三个地点（教学楼、稻田、动物房：横坐标）捕捉的137只蚊子，经HMBS-PCR扩增得到的HMBS拷贝数，换算成血液的绝对量（纵坐标）。此外，对HMBS-PCR的阳性产品进行基因测序，确定蚊子的吸血对象包括哺乳动物（小鼠、山羊、猪、狗、猫）和人。
具体实施方式
[0027] 1.HMBS-PCR检测方法所用引物和探针的核苷酸序列如下：
[0028] 上游引物-1： 5’-TACCTGACTGGAGGAGTCTGGAGTCT-3’
[0029] 上游引物-2： 5’-GCCAGGCTGATGCCCAGGTTCT-3’
[0030] 6-FAM探针： 5’-AGCAHGAAGATGGYCCWGA-6-FAM-3’
[0031] LCRed640探针： 5’-LCRED640-GATGAYCCACAGCTGGTRG-Phosphate-3’[0032] 2.制备PCR用的标准定量试剂。由IDT合成HMBS基因的核酸序列，此序列涵盖此PCR的扩增区域。依据合成物的分子量和绝对重量以及PicoGreen的DNA定量技术，计算合成物所含的HMBS的基因拷贝数目。随后，对合成物进行稀释，制备每10μl合成物的稀释试剂含10000拷贝、1000拷贝、100拷贝、10拷贝的HMBS，作为PCR用的标准定量试剂；
[0033] 3.制备待检样品的DNA模板。本发明所用的检测模板包括人和动物的全血样品、小鼠的器官和组织、蚊子、寄生虫、细菌、食用植物油等。
[0034] 1）收集的全血样品保存于含EDTA的试管，用商业化试剂盒提纯核酸，最后洗脱在200μl T10E0.1（含10mM Tris-HCl,0.1mM EDTA，pH8.5）作为PCR的扩增模板；
[0035] 2）称量约20毫克小鼠的11种器官和组织，立即保存于含有800微升核酸保护剂的试管，经PRECELLUS粉碎器经30秒粉碎后，用于DNA纯化；最后洗脱在100μl T10E0.1作为PCR的扩增模板；
[0036] 3）被捕捉的单个蚊子经属种鉴定后，立即保存于含有400微升核酸保护剂的试管，经PRECELLUS粉碎器20秒粉碎后，用于DNA纯化；最后洗脱在80μl T10E0.1作为PCR的扩增模板；
[0037] 4）大肠杆菌和沙门菌ATCC标准株的提纯，按照常用的煮沸法进行。约107CFU对数生长期的细菌用于核酸提纯，洗脱至100微升的T10E0.1洗脱液，用作PCR的扩增模板；
[0038] 5）球虫和弓形虫的核酸由某大学寄生虫学实验室提供（含核酸浓度等信息）；
[0039] 6）使用某品牌的粪便核酸提取试剂盒提取食用植物油的核酸。约800微升的食用植物油经14，000转离心后，取沉降物用于核酸提纯，最后洗脱在200μl T10E0.1作为PCR的扩增模板。
[0040] 4.PCR扩增体系。20μl的扩增体系包含10μl的样品DNA模板或者定量标准试剂、1xPCR缓冲液、1μM上游引物-1、1μM下游引物、0.2μM的6-FAM探针、0.2μM的LCRed640探针、2个单位的商业化Taq酶、200μM dNTP。
[0041] 5.PCR扩增循环参数。PCR扩增包括18个温度递减的高严谨循环和25个欠严谨的荧光获得循环。18个温度递减的高严谨循环：6x15sec@95℃,60sec@74℃;9x15sec@95℃,60sec@72℃;3x15sec@95℃,10sec@70℃,15sec@72℃.25个欠严谨的荧光获得循环：25x15sec@95℃,8sec@56℃,10sec@65℃,and15sec@72℃。
[0042] 6.PCR结果的判定和定量分析。DNA模板的制备过程均设有DNA提取的阴性和阳性对照，随后的PCR扩增对象包括待测样品的DNA模板、DNA提取的阴性和阳性对照、定量4 3 2 1
的标准试剂（每10μl standard含10，10，10，10 拷贝的HMBS基因）。此外,50微升的小鼠血液样品用于核酸提纯,然后10倍连续稀释,用于测定此发明的灵敏度。此发明的灵敏度为检测0.5nl的小鼠血样核酸，等同于5个HMBS拷贝。此发明有着高度的特异性，不扩增细菌、寄生虫、食用植物油等哺乳动物以外的核酸。
的标准试剂（每10μl standard含10，10，10，10 拷贝的HMBS基因）。此外,50微升的小鼠血液样品用于核酸提纯,然后10倍连续稀释,用于测定此发明的灵敏度。此发明的灵敏度为检测0.5nl的小鼠血样核酸，等同于5个HMBS拷贝。此发明有着高度的特异性，不扩增细菌、寄生虫、食用植物油等哺乳动物以外的核酸。
[0043] 实施例1：检测来自9个国家13个物种的383个血液样品的HMBS拷贝数。
[0044] 使用本发明建立的HMBS FRET-PCR系统，检测来自8个国家的、人和12种哺乳动物的、经历不同运输和储存环境的383个血液样品的核酸的HMBS拷贝数，为样品的合理采集和储存运输提供理论基础。样品的来源、种类和HMBS拷贝数见表1。采集自中国的504 5
头奶牛的全血，18头没有被检测到HMBS基因，此组的HMBS拷贝数（5.8×10±2.3×10）在被检测的383个样品中显著最低。此外，在中国采集的犬全血的样品的HMBS拷贝
5 4
数(1×10±9×10)也显著的低于在加勒比海采集的同类血液样品（哥斯达尼加：
6 6 6 5
2.3x10±2.5x10 ；尼加拉瓜：1.7x10±8.8x10）。综合比较在不同采集、保存、运输条件下样品的以及HMBS数表明，核酸提纯前的冻融比在样品提纯后的冻融对样品的质量影响大。
可能的解释是，样品提纯前细胞内释放的核酸酶分解HMBS和其他核酸。
头奶牛的全血，18头没有被检测到HMBS基因，此组的HMBS拷贝数（5.8×10±2.3×10）在被检测的383个样品中显著最低。此外，在中国采集的犬全血的样品的HMBS拷贝
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数(1×10±9×10)也显著的低于在加勒比海采集的同类血液样品（哥斯达尼加：
6 6 6 5
2.3x10±2.5x10 ；尼加拉瓜：1.7x10±8.8x10）。综合比较在不同采集、保存、运输条件下样品的以及HMBS数表明，核酸提纯前的冻融比在样品提纯后的冻融对样品的质量影响大。
可能的解释是，样品提纯前细胞内释放的核酸酶分解HMBS和其他核酸。
[0045] 表1.来自不同国家和不同物种血液样品的HMBS拷贝数。
[0046]
[0047]
[0048]
[0049] 实施例2：检测小鼠11个组织器官的HMBS拷贝数。
[0050] 从8只BALB/c和C57BL/6小鼠（每个品种各有二只阳性和二只阴性小鼠）采集血液和11种组织器官，用于核酸提纯和HMBS-PCR。小鼠样品的HMBS拷贝数在小鼠品系、性别以及各个组织器官之间有较小的差异。雌性小鼠的HMBS拷贝数（102.67±100.53）显著的高于雄性小鼠（102.37±100.68)。HMBS拷贝数在心脏(102.98±100.26),肝脏(102.70±100.39),脾脏(103.15±100.39),肺脏(102.82±100.39)和肾脏(103.11±100.32)显著的高于在脂肪(102.05±100.29),骨骼(101.49±100.67)和毛发(101.73±100.24)的HMBS拷贝数(图2)。
[0051] 实施例3：比较本发明的HMBS拷贝数和PicoGreen法测定核酸的绝对含量。
[0052] PicoGreen荧光方法被广泛地应用于定量测定双股DNA的绝对含量。我们比较本发明的HMBS拷贝数和DNA绝对含量的相关性。测定了采集自哥斯达黎加的39个狗的血液样品和来自中国内蒙古的40个狗的血样的HMBS拷贝数和DNA绝对含量。哥斯达黎加的血液样品采集没有溶血的现象，在核酸提纯前没有样品的冻融发生。然而，采集内蒙古的血样经历了几次冻融，出现明显的溶血现象。图4所示，没有经历冻融的哥斯达黎加样品的HMBS拷贝数，显著地高于经历冻融的内蒙古血样；然而，DNA的含量呈相反的趋势，内蒙古样品的绝对含量显著高于哥斯达黎加的样品。按照每ng的DNA所含HMBS拷贝数计算，哥斯达黎加的血样是内蒙古的约10倍。
[0053] 实施例4：检测蚊子体内血液的含量和种类。
[0054] 从某大学三个地点（教学楼、稻田、动物房）捕捉的137只蚊子用于HMBS-PCR得到HMBS后换算成血液的绝对量。此外，对HMBS-PCR的阳性产品进行基因测序，被蚊子吸血的哺乳动物（小鼠、山羊、猪、狗、猫）和人。从教室内采集的12只蚊子中，4只是HMBS阳性，测序表明均为人的血液，吸血量为1,552±3,084nl。从稻田里采集的31只蚊子中，二只含蚊子的血液，11只含野鼠的血液，平均吸血量为1,308±4,683nl.在靠近动物房的草坪上采集的95只蚊子中，2只有山羊的血液，9只有人的血液，8只有猪的血液，4只含狗的血液，1只含猫的血液，平均吸血量为398±1,503nl，图5)。
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