基于荧光定量的牦牛应激型HSPA2基因表达谱建立
阅读：1010发布：2020-11-10
专利汇可以提供基于荧光定量的牦牛应激型HSPA2基因表达谱建立专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且基于 荧光 定量的牦 牛 应激型HSPA2基因表达谱建立本 发明 公开了一种牦牛应激型HSPA2基因组织表达分布的SYBRGreenI荧光定量PCR检测方法。该方法包括如下步骤：（1）牦牛各组织RNA的提取及cDNA合成；（2）引物设计；（3）标准曲线的建立；（4）荧光定量PCR方法的优化和建立；（5）采用建立好的方法检测牦牛应激型HSPA2基因在各组织的表达分布；（6）采用相对定量的2–△△CT法进行数据分析，计算出HSPA2基因各组织的相对表达量,构建组织表达谱。本发明采用的SYBRGreenI荧光定量方法避免了设计、标记荧光探针和价格昂贵等问题，并且该方法检测灵敏度高，特异性强，重复性好，PCR反应结束后，可立即观察结果，不需要 电泳 、 染色 等操作，因此比采用其它方法来建立组织表达谱适用性更强。，下面是基于荧光定量的牦牛应激型HSPA2基因表达谱建立专利的具体信息内容。
1.一种检测牦牛应激型HSPA2基因组织表达分布的SYBR Green I荧光定量PCR方法
及基因组织表达谱的建立，其特征在于根据牛HSPA2、β-actin基因序列设计特异性检测引物，利用Real-time技术对HSP1A基因在不同组织中的表达量进行定量分析。
2.如权利1所述根据牛HSPA2、β-actin基因序列设计特异性检测引物，所设计引物
如下：
HSPA2S: 5’- GATTTCTACACTTCCATCACCC-3’;
HSPA2A: 5’- CTGACTTGTCCCCAATGAGA-3’;
β-actin-S： 5’-ACATCCGCAAGGACCTCTAC-3’;
β-actin-A 5’-GCCAATCTCATCTCGTTTTC-3’。
3.如权利1所述HSPA2基因组织表达谱的建立，其特征在于对公牦牛11种组织样品
（心、肝、脾、肺、肾、大肠、小肠、肌肉、胃、睾丸、脑），母牦牛12种组织样品（心、肝、脾、肺、肾、大肠、小肠、肌肉、胃、卵巢、乳腺、脑）进行基因相对定量分析，构建组织表达谱。
基于荧光定量的牦牛应激型HSPA2基因表达谱建立
技术领域
[0001] 本发明属于一种生物技术领域，具体涉及一种检测牦牛应激型HSPA2基因组织表达分布的SYBR Green I荧光定量PCR方法及对应的组织表达谱的建立。该方法避免了设计、标记荧光探针和价格昂贵等问题，并且该方法检测灵敏度高，特异性强，重复性好，因此比采用其它方法来建立组织表达谱适用性更强。
背景技术
[0002] 热休克蛋白（Heat Shock Protiens，HSPs），也叫热激蛋白，广泛分布于真核生物和原核生物中，外界各种各样的应激源（比如高温、低温、缺氧、重金属等）能够诱导热休克蛋白的产生，从而使生物体免受应激因素的损害。HSP70家族是热休克蛋白家族中最重要的一员，同时也是生物体内高度保守的蛋白质家族之一。该家族成员众多，其中最常见的可以分为两类，一类是应激型的HSP70；另一类是结构型的HSC70（Heat Shock Cognate，热应激同源蛋白70），前者在正常细胞内表达量较低或者不表达，但是在热应激或者其他应激源的作用下，表达量迅速增加；后者在正常细胞内均有不同程度的表达，受到外界环境应激因素的影响表达量有不同程度的上升，应激型HSP70已成为现阶段研究的热点之一。HSP70对维持细胞内稳态，改善细胞的生存能力和减轻有害应激损伤有非常重要作用。
[0003] HSP70在应激状态下帮助需要的蛋白质正确折叠，加快正常蛋白质合成的恢复；在细胞保护方面，HSP70表达的增加可以缓解细胞所受伤害，增强机体对应激的抵抗力；同时，HSP70在抗细胞凋亡、抗氧化和免疫反应中也起着重要作用。HSPA2是HSP70应激型中的一主要类型，对其的研究能够更好地理解HSP70应激型在环境适应中的功能性。牦牛是生活在高原环境下的特有物种，与高原人民的生活息息相关。为了加强牦牛资源的保护和开发利用，以牦牛作为高原模式动物，应激型HSPA2基因在牦牛各组织的表达谱的建立有助于更好地了解应激型HSPA2基因在各组织的作用机理，有助于保护牦牛免受高原恶劣环境应激因素的影响，使其能够更加顺利地生产与繁殖。
[0004] 目前关于牦牛应激型HSPA2基因组织表达谱建立还尚未见报告，本发明旨在建立一种基于SYBR Green I荧光定量方法的牦牛应激型HSPA2基因组织表达谱，该表达谱的建立为进一步研究HSPA2基因在牦牛的环境的适应性上提供基础。
发明内容
[0005] 本发明旨在建立一种基于SYBR Green I荧光定量方法的牦牛应激型HSPA2基因组织表达谱的建立。该定量方法具有操作简便，检测灵敏度高，重复性好，污染少，PCR反应结束后，可立即观察结果，不需要电泳、染色等操作等优点，因此比采用其它方法来建立组织表达谱适用性更强。
[0006] 本发明的技术方案是通过如下步骤来实现的：1、牦牛各组织RNA的提取
分别提取3头公牦牛11种组织（心、肝、脾、肺、肾、大肠、小肠、肌肉、胃、睾丸、脑），3头母牦牛12种组织（心、肝、脾、肺、肾、大肠、小肠、肌肉、胃、卵巢、乳腺、脑）样品，称量约1g后迅速转移至液氮预冷的研钵中，用研杵研磨组织，期间不断加入液氮，直至研磨成粉末状。
加入1 mL的Trizol，室温静置直至样品完全融化，吸取1 mL至无RNA酶的离心管中，加入
200 μL的氯仿，剧烈振荡，室温静置5 min。4 ℃、12000 r/min离心15 min，小心吸取500 μL上清液，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，室温静置10 min。4 ℃、12000 r/min离心10 min，弃上清，沉淀加入1 mL 75 %的乙醇洗涤，4 ℃、12000 r/min离心5 min，弃上清，室温干燥沉淀，以30 μL DEPC水溶解RNA。
分别提取3头公牦牛11种组织（心、肝、脾、肺、肾、大肠、小肠、肌肉、胃、睾丸、脑），3头母牦牛12种组织（心、肝、脾、肺、肾、大肠、小肠、肌肉、胃、卵巢、乳腺、脑）样品，称量约1g后迅速转移至液氮预冷的研钵中，用研杵研磨组织，期间不断加入液氮，直至研磨成粉末状。
加入1 mL的Trizol，室温静置直至样品完全融化，吸取1 mL至无RNA酶的离心管中，加入
200 μL的氯仿，剧烈振荡，室温静置5 min。4 ℃、12000 r/min离心15 min，小心吸取500 μL上清液，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，室温静置10 min。4 ℃、12000 r/min离心10 min，弃上清，沉淀加入1 mL 75 %的乙醇洗涤，4 ℃、12000 r/min离心5 min，弃上清，室温干燥沉淀，以30 μL DEPC水溶解RNA。
[0007] 2、cDNA的反转录合成TM
按照Fermentas公司的RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit反转录酶
TM
说明书，采用20 μL体系：oligo dT18、1 μL，5×Reaction Bμffer、4 μL，Ribolock TM
Rnase Inhibitor(20 μ/μl)、1 μL，10 mM dNTP Mix、2 μL，RevertAid M-MμLV Reverse Transcriptase(200 μ/μl)、1 μL，模板1 μL，最后用RNase Free dH2O补足20 μL，按以下程序进行反转录反应：42 ℃、60 min；70 ℃、5 min。
按照Fermentas公司的RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit反转录酶
TM
说明书，采用20 μL体系：oligo dT18、1 μL，5×Reaction Bμffer、4 μL，Ribolock TM
Rnase Inhibitor(20 μ/μl)、1 μL，10 mM dNTP Mix、2 μL，RevertAid M-MμLV Reverse Transcriptase(200 μ/μl)、1 μL，模板1 μL，最后用RNase Free dH2O补足20 μL，按以下程序进行反转录反应：42 ℃、60 min；70 ℃、5 min。
[0008] 3、引物设计根据GenBank中登陆的牛HSPA2（登录号为NM_174344）、内参β-actin（登录号为NM_173979）基因序列各设计一对特异性引物。引物序列如下：
HSPA2：上游引物5’- GATTTCTACACTTCCATCACCC -3’;
HSPA2：下游引物5’- CTGACTTGTCCCCAATGAGA -3’;
β-actin：上游引物5’-ACATCCGCAAGGACCTCTAC-3;
β-actin：下游引物5’-GCCAATCTCATCTCGTTTTC-3’。
HSPA2：上游引物5’- GATTTCTACACTTCCATCACCC -3’;
HSPA2：下游引物5’- CTGACTTGTCCCCAATGAGA -3’;
β-actin：上游引物5’-ACATCCGCAAGGACCTCTAC-3;
β-actin：下游引物5’-GCCAATCTCATCTCGTTTTC-3’。
[0009] 预计扩增长度分别为155bp、170bp。
[0010] 4、标准曲线的建立。
[0011] （1）以25 μL的PCR反应体系：PCR Mix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，模板1 μL，dH2O 9.5 μL；扩增程序为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸25 s，36个循环，最后72 ℃延伸10 min；分别将HSPA2和β-actin进行PCR扩增，反应结束后，取PCR产物进行体积分数10g/L的琼脂糖凝胶电泳，观察结果并回收、纯化产物。
[0012] （2）将回收、纯化的产物与克隆载体pMD19-T进行连接，转化DH5α感受态细胞并在Amp+琼脂平板上涂菌，挑取单个菌落接种于含Amp+的LB液体培养基中。经PCR鉴定后，将阳性重组质粒送往Invitrogen（英潍捷基上海）公司进行测序。
[0013] （3）提取经过测序鉴定正确的重组质粒，应用紫外分光光度计测定重组质粒浓度，计算出基因拷贝数，将重组质粒进行10倍梯度稀释，将其作为标准质粒模板。
[0014] （4）取标准质粒模板，构建反应体系，进行SYBR Green I荧光定量PCR扩增，获得扩增标准曲线。
[0015] 5、荧光定量PCR检测方法的优化和建立（1）引物特异性实验：选用一头公牦牛的脑组织cDNA为模板进行荧光定量PCR，进行3次重复，并设置以dH2O为模板的阴性对照，检验设计引物的特异性。
[0016] （2）荧光定量PCR反应条件的优化：对荧光定量PCR的循环条件进行了两步法和三步法的摸索，并将退火温度从56 ℃依次递增至60 ℃，每次递增1 ℃，对退火温度进行优化。
[0017] 6、采用建立好的方法检测牦牛应激型HSPA2基因在各组织的表达分布TM
（1）反应体系为20 μL：SYBR Premix Ex Taq II 10 μL，上、下游引物各0.8 μL，模板2 μL，dH2O 6.4 μL。
（1）反应体系为20 μL：SYBR Premix Ex Taq II 10 μL，上、下游引物各0.8 μL，模板2 μL，dH2O 6.4 μL。
[0018] （2）扩增程序为：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，39个循环，添加一个溶解曲线，设置以dH2O为模板的阴性对照，每个组织进行3次重复。
[0020] 图1为HSPA2荧光定量PCR标准曲线。
[0021] 图2为β-actin荧光定量PCR标准曲线。
[0022] 图3为引物特异性实验溶解曲线，β-actin融解温度为Tm=82.5 ℃±0.5 ℃，HSPA2融解温度为Tm=89.5 ℃±0.5 ℃。
[0023] 图4为HSPA2的扩增曲线。
[0024] 图5为β-actin的扩增曲线。
[0025] 图6为公、母牦牛HSPA2基因各组织的表达谱。
具体实施方式
[0026] 为了使本发明的技术方案更加清楚明白，下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
[0027] 实施例：（1）牦牛各组织RNA的提取
分别提取3头公牦牛11种组织（心、肝、脾、肺、肾、大肠、小肠、肌肉、胃、睾丸、脑），
3头母牦牛12种组织（心、肝、脾、肺、肾、大肠、小肠、肌肉、胃、卵巢、乳腺、脑）样品，称量约
1g后迅速转移至液氮预冷的研钵中，用研杵研磨组织，期间不断加入液氮，直至研磨成粉末状。加入1 mL的Trizol，室温静置直至样品完全融化，吸取1 mL至无RNA酶的离心管中，加入200 μL的氯仿，剧烈振荡，室温静置5 min。4 ℃、12000 r/min离心15 min，小心吸取500 μL上清液，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，室温静置10 min。4 ℃、12000 r/min离心10 min，弃上清，沉淀加入1 mL 75 %的乙醇洗涤，4 ℃、12000 r/min离心5 min，弃上清，室温干燥沉淀，以30 μL DEPC水溶解RNA。
分别提取3头公牦牛11种组织（心、肝、脾、肺、肾、大肠、小肠、肌肉、胃、睾丸、脑），
3头母牦牛12种组织（心、肝、脾、肺、肾、大肠、小肠、肌肉、胃、卵巢、乳腺、脑）样品，称量约
1g后迅速转移至液氮预冷的研钵中，用研杵研磨组织，期间不断加入液氮，直至研磨成粉末状。加入1 mL的Trizol，室温静置直至样品完全融化，吸取1 mL至无RNA酶的离心管中，加入200 μL的氯仿，剧烈振荡，室温静置5 min。4 ℃、12000 r/min离心15 min，小心吸取500 μL上清液，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，室温静置10 min。4 ℃、12000 r/min离心10 min，弃上清，沉淀加入1 mL 75 %的乙醇洗涤，4 ℃、12000 r/min离心5 min，弃上清，室温干燥沉淀，以30 μL DEPC水溶解RNA。
[0028] （2）cDNA的反转录合成TM
按照Fermentas公司的RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit反转录酶说明书，按以下程序进行反转录反应：42 ℃、60 min；70 ℃、5 min.，反应体系为：
oligo dT18 1 μL；
5×Reaction Bμffer 4 μL；
TM
Ribolock Rnase Inhibitor(20 μ/μl) 1 μL；
10 mM dNTP Mix 2 μL；
TM
RevertAid M-MμLV Reverse Transcriptase(200 μ/μl) 1 μL；
模板 1 μL；
RNase Free dH2O 10 μL。
按照Fermentas公司的RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit反转录酶说明书，按以下程序进行反转录反应：42 ℃、60 min；70 ℃、5 min.，反应体系为：
oligo dT18 1 μL；
5×Reaction Bμffer 4 μL；
TM
Ribolock Rnase Inhibitor(20 μ/μl) 1 μL；
10 mM dNTP Mix 2 μL；
TM
RevertAid M-MμLV Reverse Transcriptase(200 μ/μl) 1 μL；
模板 1 μL；
RNase Free dH2O 10 μL。
[0029] （3）引物设计根据GenBank中登陆的牛HSPA2（登录号为NM_174344）、内参β-actin（登录号为NM_173979）基因序列各设计一对特异性引物，引物由上海Invitrogen（英潍捷基）公司合成。引物序列如下：
HSPA2：上游引物5’- GATTTCTACACTTCCATCACCC -3’；
HSPA2：下游引物5’- CTGACTTGTCCCCAATGAGA -3’；
β-actin：上游引物5’-ACATCCGCAAGGACCTCTAC-3；
β-actin：下游引物5’-GCCAATCTCATCTCGTTTTC-3’；
预计扩增长度分别为155bp、170bp。
HSPA2：上游引物5’- GATTTCTACACTTCCATCACCC -3’；
HSPA2：下游引物5’- CTGACTTGTCCCCAATGAGA -3’；
β-actin：上游引物5’-ACATCCGCAAGGACCTCTAC-3；
β-actin：下游引物5’-GCCAATCTCATCTCGTTTTC-3’；
预计扩增长度分别为155bp、170bp。
[0030] （4）标准曲线的建立①以25 μL的PCR反应体系，扩增程序为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸25 s，36个循环，最后72 ℃延伸10 min；分别将HSPA2和β-actin进行PCR扩增，反应结束后，取PCR产物进行体积分数10g/L的琼脂糖凝胶电泳，观察结果并回收、纯化产物，反应体系为：
PCR Mix 12.5 μL；
上、下游引物（各） 1 μL；
模板 1 μL；
dH2O 9.5 μL。
PCR Mix 12.5 μL；
上、下游引物（各） 1 μL；
模板 1 μL；
dH2O 9.5 μL。
[0031] ②将回收、纯化的产物与克隆载体pMD19-T进行连接过夜，连接后的产物直接用于转化。
[0032] ③冰上溶解50 μL DH5α感受态细胞，加入10 μL连接产物，冰浴30 min，然后42.5℃水浴锅热激90s，再冰浴15 min，加入940 μL不含抗生素的LB液体培养基，37℃、
200rpm振荡培养1h。将摇好的菌4000rpm离心2 min，弃600 μL上清液，重悬沉淀，在Amp+琼脂平板上涂菌，37℃培养14-16h。
200rpm振荡培养1h。将摇好的菌4000rpm离心2 min，弃600 μL上清液，重悬沉淀，在Amp+琼脂平板上涂菌，37℃培养14-16h。
[0033] ④挑取单个菌落接种于含Amp+的LB液体培养基中。经PCR鉴定后，将阳性重组质粒送往Invitrogen（英潍捷基上海）公司进行测序。
[0034] ⑤提取经过测序鉴定正确的重组质粒，应用紫外分光光度计测定重组质粒浓度，计算出基因拷贝数，将重组质粒进行10倍梯度稀释，将其作为标准质粒模板。
[0035] ⑥取标准质粒模板，构建反应体系，进行SYBR Green I荧光定量PCR扩增，获得扩增标准曲线。
[0036] （5）荧光定量PCR检测方法的优化和建立①引物特异性实验：选用一头公牦牛的脑组织cDNA为模板进行荧光定量PCR，进行
3次重复，并设置以dH2O为模板的阴性对照，检验设计引物的特异性。由图2分析可知：
β-actin在溶解温度为Tm=82 ℃±0.5 ℃、HSPA2在溶解温度为Tm=89.5 ℃±0.5 ℃时出现单一的特异性峰，表明该引物、该反应特异性良好。
3次重复，并设置以dH2O为模板的阴性对照，检验设计引物的特异性。由图2分析可知：
β-actin在溶解温度为Tm=82 ℃±0.5 ℃、HSPA2在溶解温度为Tm=89.5 ℃±0.5 ℃时出现单一的特异性峰，表明该引物、该反应特异性良好。
[0037] ②荧光定量PCR反应条件的优化：对荧光定量PCR的循环条件进行了两步法和三步法的摸索，并将退火温度从56 ℃依次递增至60 ℃，每次递增1 ℃，对退火温度进行优化。
[0038] （6）采用建立好的方法检测牦牛应激型HSPA2基因在各组织的表达分布。
[0039] 扩增程序为：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，39个循环，添加一个溶解曲线，设置以dH2O为模板的阴性对照，每个组织进行3次重复。反应体系为：
TM
SYBR Premix Ex Taq II 10 μL；
上、下游引物（各） 0.8 μL；
模板 2 μL；
dH2O 6.4 μL。
TM
SYBR Premix Ex Taq II 10 μL；
上、下游引物（各） 0.8 μL；
模板 2 μL；
dH2O 6.4 μL。
[0040] （7）采用相对定量的2–△△CT法进行数据分析，计算出HSPA1A基因各组织的相对表达量，构建组织表达谱。
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