技术领域
[0001] 本
发明涉及果树的分子指纹图谱构建领域，具体地涉及一种草莓杂交种的SSR分子指纹图谱的构建方法及应用。
背景技术
[0002] 草莓是蔷薇科草莓属多年生
植物，是重要的
园艺经济作物，在世界浆果生产中居第二位。现代栽培草莓是异源八倍体，高度杂合、具杂交特性的作物，
无性繁殖是品种特性保持所必需，然而，田间长期无性繁殖给病毒病危害草莓生产埋下隐患，同时，也带来生产上品种混乱问题。
[0003] 草莓
炭疽病是在草莓繁苗期为草莓带来毁灭性的
真菌病害，通过分子标记辅助筛选手段、室内接种病原菌悬浮孢子和田间进行草莓炭疽病抗性鉴定，发现‘申阳’草莓的抗炭疽病能
力显著强于‘丰香’‘、红颜’、‘章姬’等草莓品种‘，申阳’草莓对炭疽病表现出高抗性，进一步试验表明‘，申阳’草莓还表现出适应性强、早果、丰产等特性，对炭疽病抗性能稳定遗传。
[0004] 草莓杂交种‘申阳’于2014年9月
申请并通过了上海市
农作物品种审定委员会审定(审定编号为:沪农品认果树2014第010号)并于2015年4月申请国家植物新品种权保护(申请号：20150527.3)‘。申阳’草莓的大力推广应用将为我国东部、中部等夏季高温高湿、炭疽病高发区域草莓产业健康发展带来重要契机。
[0005] 而新品种在推广应用过程中需要有效控制品种的遗传特性，保持种质资源的优异特性，同时，需要有准确快速的品种鉴定方法，因此，建立植物新品种鉴定和保护体系对保护育种者权益、促进植物品种创新、有效利用植物种质资源和促进产业发展具有重要意义。
[0006] 在
现有技术中，虽然在无菌条件和有限空间内，通过组织培养可快速繁殖获得大量植物种苗，而草莓组培微繁育苗技术也较为普遍，但是，生产上常常遇到组培来源的苗会发生
体细胞变异的问题，这给生产应用带来很多问题，以至于不少种植户宁可利用易感染病毒病的田间繁殖途径也不愿意冒
风险采用组培微繁苗，究其主要原因，在于不适宜的组培微繁过程引起的体细胞变异会导致植物多方面性状发生改变，如：开花结果时间、果实外观、风味、产量等性状都可能改变，其中，开花延迟、在生产期间无花或果实品质退化的现象最为常见。
[0007] 由于不同植物的拥有不同的基因型，即使是同一物种的不同品种，所需组培微繁条件是不同的，在组培过程中需要的
激素种类及配比也会不同，只有采用适宜的增殖培养激素配比和培养条件，杜绝
玻璃化和愈伤组织形成，限制增殖系数和增殖继代的代数，才能有效控制品种遗传特性，保持种质资源的优异特性。
[0008] 而在新品种的鉴定方法的建立时，分子标记因其稳定、不受表型及环境变异影响，已成为新品种特异性、一致性及
稳定性(即DUS测试)测试的重要手段。实际上，只有分子标记可解决目前育种材料遗传
基础日益狭窄、选育品种数目增多导致的品种差异趋同问题。
[0009] 分子标记指能反映
生物个体间或种群间基因组中某种差异特征的DNA
片段或
碱基，它直接反映了基因组DNA间的差异，因而，分子标记是基因
水平上的标记，是检测鉴定生物分子遗传的一种重要工具；主要包括RFLP(限制性片段长度多态性)、RAPD(随机扩增多态性DNA)、AFLP(扩增片段长度多态性)、简单序列重复标记SSR(简单重复序列或微卫星DNA)、SNP(单核苷酸多态性)和InDel(插入缺失片段长度多态性)等。目前，随着基因分型技术的发展，SSR、SNP和InDel标记使用最为广泛，其他类型的标记已用得越来越少。
[0010] SSR简单序列重复标记(Simple sequence repeat，简称SSR标记，也叫微卫星序列重复)，通常是以1～5个核苷酸为重复单位组成的长达几十或几百个核苷酸的重复序列，长度较短，广泛分布在
染色体上。因重复单元的重复次数不同或重复程度的不完全相同，造成了SSR长度的高度变异性，由此产生SSR标记，虽然SSR标记在基因组上的
位置不尽相同，但其两端序列多是保守的非重复序列，因此可以用微卫星区域旁邻特定序列设计成对引物，通过PCR技术，经聚丙烯酰胺凝胶
电泳，即可显示SSR位点在不同个体间的多态性。
[0011] SSR标记特点：标记数量丰富，具有较多的等位变异，广泛分布于各条染色体上；是共显性标记，呈孟德尔遗传；技术重复性好，易于操作，结果可靠。
[0012] 在我国，多种作物的分子鉴定图谱已经成为品种保护国家标准，如2014年颁布的《
大麦品种鉴定技术规程SSR分子标记法》，作为贯彻落实2016年新《
种子法》的重要配套措施，建立不同作物品种DNA身份是至关重要的一项工作。
发明内容
[0013] 本发明的目的在于提供一种草莓杂交种的SSR分子指纹图谱的构建方法及应用。从
覆盖草莓全基因组的140对SSR引物中筛选出8对SSR引物序列，利用其建立草莓杂交种的SSR分子指纹图谱，具有高度特异性、稳定多态性、带型组合易于识别、显性好的特点，可以准确、快速鉴定草莓杂交种，并且，确立了‘申阳’草莓的微繁方法。
[0014] 为了达到上述目的，本发明提供的技术方案如下：
[0015] 草莓杂交种的SSR引物序列对，其特征在于，包括8对引物序列，每对引物序列由上游引物和下游引物组成，所述引物序列对的上、下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID No.1、2所示，SEQ ID No.3、4所示，SEQ ID No.5、6所示，SEQ ID No.7、8所示，SEQ ID No.9、10所示，SEQ ID No.11、12所示，SEQ ID No.13、14所示和SEQ ID No.15、16所示。
[0016] 所述的SSR引物序列对用于草莓杂交种的SSR分子指纹图谱构建及品种鉴定。
[0017] 本发明提供一种草莓杂交种的SSR分子指纹图谱的构建方法，包括以下步骤：
[0018] 1)提取草莓杂交种的DNA；
[0019] 2)PCR扩增
[0020] 以步骤1)提取的DNA为模板，利用所述草莓杂交种的SSR引物序列对中的至少3对引物序列进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；
[0021] 其中，PCR扩增时，所述的SSR引物序列中，上游引物的5’端添加了
荧光标记引物序列；
[0022] 3)电泳分析
[0023] 将PCR扩增产物进行毛细管电泳，利用荧光
信号反映出扩增产物的长度信息，根据扩增产物的长度信息数据得到草莓杂交种的SSR特异分子指纹图谱。
[0024] 进一步，步骤2)中进行PCR扩增时，PCR反应体系中，上游引物的终浓度为0.1～0.15μM，下游引物的终浓度为0.2～0.25μM，模板DNA的终浓度为20～25ng/μl，荧
光标记引物的终浓度为4～4.5μM；PCR反应体系中，PCR程序为：94～105℃变性3min，95℃30sec，55～
63℃30sec，72℃30sec，5个循环；95℃30sec，50～58℃30sec，72℃30sec，30个循环；再72℃延伸5min，结束反应。
[0025] 优选地，步骤2)所述的荧光标记引物序列为M13引物序列，其核苷酸序列如SEQ ID No.17所示。
[0026] 本发明的8对SSR引物序列对可用于草莓杂交种‘申阳’及其近亲姐妹系、非近源品种和优系的SSR分子指纹图谱的建立和品种鉴定。
[0027] 优选的，所述草莓杂交种为‘申阳’，利用所述SSR引物序列对对‘申阳’草莓DNA进行PCR扩增，得到的分子指纹分别为：由SEQ ID No.1和2所示引物序列获得的扩增指纹由266bp、280bp和282bp三个条带组成；由SEQ ID No.3和4所示引物序列获得的扩增指纹由
228bp、230bp、234bp、238bp和240bp五个条带组成；由SEQ ID No.5和6所示引物序列获得的扩增指纹由134bp、145bp、148bp、156bp和164bp五个条带组成；由SEQ ID No.7和8所示引物序列获得的扩增指纹由229bp和236bp两个条带组成；由SEQ ID No.9和10所示引物序列获得的扩增指纹由220bp、227bp和231bp三个条带组成；由SEQ ID No.11和12所示引物序列获得的扩增指纹为175bp一条带；由SEQ ID No.13和14所示引物序列获得的扩增指纹由258bp和264bp两个条带组成；由SEQ ID No.15和16所示引物序列获得的扩增指纹由258bp、
262bp、268bp、和288bp四个条带组成。
[0028] 本发明的SSR引物序列对用于鉴定草莓杂交种‘申阳’时，利用所述SSR引物序列对对待测样品进行PCR扩增，对获得的扩增产物进行序列分析，与‘申阳’草莓的SSR分子指纹图谱进行对比，若待测样品的扩增产物具有与‘申阳’草莓的扩增产物一致的SSR分子指纹图谱，则为‘申阳’草莓；反之，则不是‘申阳’草莓。
[0029] 本发明通过对不同草莓品种及其杂交自交系总DNA进行覆盖全基因组140对SSR引物进行筛选，共获得14对显性强、重复性好的SSR多态性分子标记，进一步以‘申阳’及其近亲姐妹系、非近源品种和优系等草莓种质资源的基因组DNA为模板，PCR结合毛细管电泳，从前述14对多态性分子标记中筛选出‘申阳’特异性高、区分力强的8对SSR多态性分子标记，电泳分离得到‘申阳’的多态性分子标记指纹图谱，可用于草莓杂交种‘申阳’及其近亲姐妹系、非近源品种和优系的SSR特异分子指纹图谱的建立和品种鉴定，对草莓基因型做出明确的鉴定，对亲本来源不明确的草莓育种材料进行遗传分析，鉴定出其亲本谱系；应用该技术可以鉴定草莓杂交种‘申阳’的遗传特征指纹，应用于品种鉴定和种苗纯度检验。
[0030] 本发明还提供一种草莓杂交种的微繁方法，包括如下步骤：
[0031] 1)外植体消毒
[0032] 将草莓杂交种的匍匐茎用流水冲洗2小时以上，用
乙醇溶液浸泡消毒5～8s，用无菌水冲洗3～5次，然后用3～5％的
次氯酸钠溶液消毒5～7min，再以无菌水冲洗3～5次；
[0033] 2)诱导培养
[0034] 从消毒后的匍匐茎上剥离出生长点，将生长点接种于诱导培养基中进行诱导培养，先在遮光环境下培养1～2天，再进行光照培养2～5天，诱导芽萌发，培养
温度23～25℃，光照时间12～14h/d，光强30～50μmol/m2s，30～45天后，得到长度为0.5～1.0cm的无菌芽；
[0035] 其中，所述的诱导培养基包含：MS基本培养基，
蔗糖30～50g/L，BA 0.3～0.5mg/L，IBA 0.1～0.2mg/L；
[0036] 3)芽苗培养
[0037] 将萌发的无菌芽转接于芽苗培养基中进行芽苗培养，培养温度23～25℃，光照时间12～14h/d、光强30～50μmol/m2s，20～30天后获得长度为1.5～2.0cm的无菌芽丛；
[0038] 其中，所述芽苗培养基包含：MS基本培养基，蔗糖30～50g/L，BA 0.3～0.5mg/L，IBA 0.01～0.02mg/L；
[0039] 4)增殖培养
[0040] 将无菌芽丛切割后接种于增殖培养基中，培养温度23～25℃，光照时间12～14h/d、光强30～50μmol/m2s，每25～40d继代一次，增殖1～4代后更换增殖培养基，增殖5～7代后获得新生无菌芽丛；
[0041] 其中，进行第1～4代增殖时的增殖培养基包括：MS基本培养基，蔗糖30～50g/L，BA 0.3～0.5mg/L，IBA 0.01～0.02mg/L；进行第5～7代增殖时的增殖培养基包括：MS基本培养基，蔗糖30～50g/L，BA 0.3～0.5mg/L；
[0042] 5)生根培养
[0043] 待新生无菌芽丛生长至高度为4.0cm以上时，将其切成单芽，转接于生根培养基中2
进行生根培养，培养温度23～25℃，光照时间12～14h/d、光强30～50μmol/ms，培养20～30天，获得生根无菌
幼苗，根长3～5cm；
[0044] 6)炼苗、移栽
[0045] 洗去生根
无菌幼苗根部的培养基，种植于灭菌的栽培基质中，喷洒
杀菌剂，弱光炼苗10～14天，再
温室炼苗45～60天，得到组培苗，移栽于大田繁苗。
[0046] 进一步，步骤5)中的生根培养基包含：1/2MS培养基和IBA 0.01～0.02mg/L，步骤6)中的栽培基质中含10～15％蛭石、10～15％珍珠岩和70～80％
泥炭土。
[0047] 优选地，所述的草莓杂交种为‘申阳’。
[0048] 本发明在草莓杂交种‘申阳’的微繁方法中，以保持种质纯度和品种遗传性状稳定为首要目标，使用较低剂量的植物生长激素，降低体细胞变异风险；采用适宜的增殖培养激素配比和培养条件，杜绝玻璃化和愈伤组织形成，限制增殖系数和增殖继代的代数，有效控制保持品种遗传特性稳定，保持种质资源的优异特性。
[0049] 草莓新品种‘申阳’(上海市农作物品种审定委员会审定编号：沪农品认果树2014第010号；国家植物新品种权保护申请号：20150527.3)，遗传了母本‘久能早生’的风味品质和早果性特点、父本‘宝交早生’的抗病性和长势强的特性‘，申阳’表现出早果性，较草莓品种‘红颜’果实成熟期早7～10d，果实圆锥形、果形圆整、品质优异。
[0050] 本
发明人研究发现‘，申阳’草莓在组培微繁中有很好的适应性，与田间生长表现出的适应性强相吻合，对外源激素反应良好；在基本MS培养基中添加较低用量的植物生长激素上就能健康生长，整个增殖培养过程都没有出现玻璃化和愈伤组织情况，增殖系数控制较好，从增殖第3代到第7代(R3～R7)，增殖系数在2.3～3.2这一较理想的范围。
[0051] 试验发现，在增殖培养时，若在同时添加苄基腺嘌呤(BA)和吲哚丁酸(IBA)激素，对应浓度分别达到0.3和0.02mg/L时，从第3代增殖苗开始，会长出少量根，相同激素培养条件下，到第5代增殖苗时，会形成大量的根，而生根过程消耗了营养，限制了苗高和发叶，幼苗虽健康但较矮小‘，申阳’草莓在增殖培养中出现的异常生根现象，可能和该品种内源生长素合成较强有关，本发明在增殖第5代以后，去除了增殖培养基中的IBA，解决了‘申阳’草莓组培苗在增殖阶段生根过多的问题，控制增殖系数在不大于3.5，严格杜绝玻璃化和愈伤组织的生成，同时保持苗更健壮，获得了健康、整齐、高纯度的‘申阳’草莓原种苗。
[0052] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0053] 1)本发明的SSR序列引物对对‘申阳’草莓特异性高、区分力强、多态性好，用其进行PCR扩增，扩增产物经电泳分离得到‘申阳’草莓的多态性分子标记指纹图谱，可对草莓的基因型做出明确鉴定，对亲本来源不明确的草莓育种材料进行遗传分析，可以鉴定出其亲本谱系。
[0054] 2)利用本发明可以鉴定草莓杂交种‘申阳’及其近亲姐妹系、非近源品种和优系等的遗传特征指纹，应用于品种鉴定和种苗纯度检验中。
[0055] 3)本发明在草莓杂交种‘申阳’的微繁过程中，以保持种质纯度和品种遗传性状稳定为首要目标，使用较低剂量的植物生长激素，并且在增殖培养阶段及时更换增殖培养基中的激素种类及含量，降低体细胞变异风险，整个增殖培养过程都没有出现玻璃化和愈伤组织情况，增殖系数控制较好(不大于3.5)，从增殖第3代到第7代，增殖系数控制在2.3～3.2之间。
[0056] 4)本发明通过控制增殖培养基中的激素添加种类及含量，解决了‘申阳’草莓组培苗在增殖阶段易生根的问题，同时，幼苗更健壮，获得了健康、整齐、高纯度的‘申阳’草莓原种苗，给草莓产业健康发展提供了技术保证。
附图说明
[0057] 图1～图8为本发明
实施例1中利用SSR引物序列对46份样品的DNA进行PCR扩增产物组成和长度的散点图，各个散点分别代表特定长度的扩增片段。
[0058] 图9为对比实施例3中在增殖培养基中添加了BA和IBA后培养至R4阶段‘申阳’根部形态。
[0059] 图10为本发明实施例3中在增殖培养基中仅添加了浓度为0.3mg/L的BA后培养至R6阶段‘申阳’苗的形态。
[0060] 图11为本发明实施例3中在生根培养基上的‘申阳’无菌幼苗。
[0061] 图12为本发明实施例3中完成生根并洗净培养基准备移栽的‘申阳’生根无菌幼苗。
[0062] 图13为本发明实施例3中在温室中炼苗后的‘申阳’组培苗。
具体实施方式
[0063] 以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。
[0064] 实施例1
[0065] 本发明所述8对SSR引物序列的获得及构建‘申阳’草莓的SSR指纹图谱的具体过程如下：
[0066] 首先，从蔷薇科基因组
数据库网站(www.rosaceae.org)于全基因组范围、遵循平均分布原则选择SSR标记，共选择合成了140对SSR标记引物。
[0067] 之后，利用包括‘申阳’、‘久香’‘、红颜’、‘章姬’和‘甜查理’5个草莓种质的基因组DNA作为模板，PCR扩增后电泳确定了每对SSR标记引物扩增的最优PCR条件和扩增产物片段大小范围；根据140对SSR标记引物在5个草莓样品中的三次重复PCR扩增和电泳分析，剔除了无扩增或扩增带型过于复杂、扩增不稳定、或在5个不同来源草莓种质中带型无差异的那些引物，最后得到了14对SSR标记引物，这些引物扩增重复性好、带型稳定易于识别、有不同程度区分能力。
[0068] 进一步，确定发掘‘申阳’草莓特异分子指纹图谱的筛选群体46份，包括‘申阳’1份‘、申阳’部分同源品种及优系12份、非同源草莓杂交品种及优系33份，并提取了这些草莓的基因组DNA，筛选群体草莓种质DNA样品编号及与’申阳’草莓的亲缘关系见表1。
[0069] 表1
[0070]
[0071]
[0072] 利用‘申阳’、相关近缘和远缘品种与优系共46份样品DNA，对上述筛选得到的14对SSR标记引物进行PCR扩增毛细管电泳，结合ABI 3730XL DNA序列分析仪分析，进一步剔除了带型组合相对复杂、区分能力冗余或区分能力较弱的占40％的SSR标记引物对，最后保留了8对SSR标记引物对，分别为：FSS48(由SEQ ID No.1和2组成)、FSS93(由SEQ ID No.3和4组成)、FSS123(由SEQ ID No.5和6组成)、FSS127(由SEQ ID No.7和8组成)、FSS139(由SEQ ID No.9和10组成)、FSS146(由SEQ ID No.11和12组成)、ARSFLP-12(由SEQ ID No.13和14组成)和ARSFLP-17(由SEQ ID No.15和16组成)，利用这些引物(带荧光标记FAM-M13或HEX-M13)的扩增产物经过毛细管电泳，获得扩增产物的片段大小数据，参见表2。
[0073] 表2
[0074]
[0075]
[0076] 在对未知样品进行
鉴别判定时，综合运用这8对核心SSR引物序列标记的引物进行扩增分析，可以使分子鉴定结果更准确可靠，以上8对引物在筛选群体(46份样品DNA)中PCR扩增产物的毛细管电泳经ABI遗传分析仪分析后，数据结果以散点图形式展示，图中散点分别代表不同大小的扩增条带(见图1～8)。
[0077] 从图1可以看出，草莓杂交种‘申阳’的FSS48扩增指纹由266bp、280bp和282bp三条带组成，区分力很高，而其它大多数样品均不同时具有这三条带；虽然除‘申阳’外，仅4份样品(23，25，34，43号)中可同时扩增出这三条带，但这些样品中又同时扩增出介于231～263bp的条带。
[0078] 从图2可以看出，草莓杂交种‘申阳’的FSS93扩增指纹也很独特，区分力强，该指纹由228bp、230bp、234bp、238bp和240bp不同长度5条带组成，而群体中绝大多数样品均含有小于228bp或大于240bp的条带，仅17号和25号样品扩增带型和‘申阳’相似，但这两个样品扩增指纹中分别缺少234bp和238bp条带。
[0079] 从图3可以看出，草莓杂交种‘申阳’的FSS123扩增指纹由134bp、145bp、148bp、156bp和164bp共5条不同长度条带组成，群体中没有其它样品能扩增指纹完全具有这5条带而不含有其它大小(比如139bp或166bp)条带，故而这一标记区分力很强。
[0080] 从图4可以看出，草莓杂交种‘申阳’的FSS127引物扩增指纹由229bp和236bp大小的2条带组成，很易识别且区分力强，因为群体中没有其它样品同时扩增出这二条带且不含有215bp、221bp或231bp带。
[0081] 从图5可以看出，草莓杂交种‘申阳’的FSS139扩增指纹由220bp、227bp和231bp三条带组成，群体中大多数样品中还扩增出含225bp条带‘，申阳’外其他样品均不同时具有且仅有220bp、227bp和231bp三条带。
[0082] 从图6可以看出，草莓杂交种‘申阳’的FSS146扩增产物仅有175bp一个条带，群体中多数样品具有181bp条带，仅有175bp这一指纹特征可以将‘申阳’和半数以上群体样品区分开来。
[0083] 从图7可以看出，草莓杂交种‘申阳’的ARSFLP-12引物扩增指纹产生258bp和264bp两条带，这一特征可以将‘申阳’和半数以上其它样品区分开来，其它多数样品含有253bp或261bp条带。
[0084] 从图8可以看出，草莓杂交种‘申阳’的ARSFLP-17引物扩增指纹由258bp、262bp、268bp和88bp四个条带组成，这一指纹特征可以区分绝大多数其它样品，群体中其它样品多数扩增指纹包含266bp和/或270bp条带，因此ARSFLP-17引物对‘申阳’的识别能力很好。
[0085] 运用这8对核心SSR标记引物中的3～8对就可以很好地将‘申阳’草莓从所分析的不同来源的草莓种质中鉴别出来，其中FSS48、FSS93和FSS127标记扩增的指纹谱型区分力最强，ARSFLP-17区分力也较高，而FSS123、FSS139、FSS146和ARSFLP-12的指纹谱型易于识别，结合其进行分析可提高区分力，得到的指纹图谱对‘申阳’草莓特异性高，易于识别，区分能力强，能稳定遗传。
[0086] 实施例2
[0087] 利用‘申阳’草莓的SSR特异分子指纹图谱对待测草莓样品进行分子鉴定，包括以下步骤：
[0088] 1)提取DNA
[0089] 对于待鉴定草莓群体，随机抽样后每5株混样，至少设置5个混样重复，以去离子水为负对照‘、申阳’草莓为正对照，设置3个重复，用CTAB法提取草莓基因组DNA，具体方法参照硕士论文《草莓抗炭疽病遗传图谱构建和抗性相关基因的克隆与表达分析》(李静.南京农业大学，2012)，DNA经比色结合电泳分析后，稀释至25ng/ul待用。
[0090] 2)PCR扩增
[0091] 以步骤1)提取的DNA为模板，利用3～8对SSR引物序列进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；其中，所述的3～8对SSR引物序列中的上游引物的5’端分别添加了M13引物序列及荧光标记，所述的M13引物序列为TGTAAAACGACGGCCAGT，所述的荧光标记为FAM或HEX，PCR反应体系参见表3：
[0092] 表3
[0093]母液(
试剂规格) 终浓度 20μl反应体系加入量
去离子水(ddH2O) 14.3μl
10倍Taq酶缓冲液(10×Taq Buffer) 1× 2.0μl
四种dNTP混合物(dNTP Mix，2.5mM) 1.25μM 0.5μl
Taq酶(rTaq,5U/μl) 1U 0.2μl
上游引物F(10μM) 0.1μM 0.1μl
下游引物R(10μM) 0.25μM 0.5μl
DNA模板(﹥25ng/μl) 50ng 2.0μl
M13引物(10μM) 4μM 0.4μl
[0094] 使用实施例1表2中的8对SSR引物序列对待鉴定样品DNA‘、申阳’的DNA，分别进行PCR扩增，以去离子水为负对照‘、申阳’草莓为正对照，对照样品重复3次，待鉴定样品重复5次，先按不同引物对分别准备PCR反应混合物，PCR反应混合物为表3中除DNA模板外所有成分，之后将反应混合物分装到96孔板内，然后补加对应量的DNA模板，用盖板封顶，置于PCR仪中。
[0095] PCR程序为：95℃变性3min，95℃30sec，55～63℃30sec，72℃30sec，5个循环；95℃30sec，50～58℃30sec，72℃30sec，30个循环；再72℃延伸5min，结束反应。
[0096] 3)电泳分析
[0097] 将PCR产物放入ABI 3730XL DNA序列分析仪，经毛细管电泳后进行序列分析，利用荧
光信号反映出扩增产物的长度信息，比较分析每样品3次重复数据的一致性，保留一致重复的带型，以散点代表特定长度扩增产物，指纹图谱以散点图形式展示，比较分析待测样品中是否含有与草莓杂交种‘申阳’一致的SSR指纹图谱。
[0098] 根据SSR标记引物扩增的电泳结果，比较分析待测样品中是否含有与正对照‘申阳’一致的指纹，如是则为‘申阳’草莓；反之，则不是‘申阳’草莓。优先分析FSS48、FSS93、FSS127和ARSFLP-17这4对区分能力最强的标记，根据判定需要再结合其余4对SSR标记引物扩增情况进行分析。
[0099] 实施例3
[0100] 一种草莓杂交种‘申阳’的微繁方法，包括如下步骤：
[0101] 1)外植体消毒
[0102] 将草莓杂交种‘申阳’的匍匐茎用流水冲洗2小时以上，用75％乙醇溶液浸泡消毒5s，用无菌水冲洗3次，然后用5％的次氯酸钠溶液消毒7min，再以无菌水冲洗5次；
[0103] 2)茎尖剥取和芽诱导
[0104] 从消毒后的匍匐茎上剥离出茎尖端的生长点，将生长点接种于诱导培养基中，培养温度23～25℃，在遮光环境下培养2天，之后进行光照培养5天，诱导芽萌发，光照时间12h/d、光强30～50μmol/m2s，30天后得到长度为0.5～1.0cm的无菌芽；所述的诱导培养基包括：MS基本培养基，蔗糖30g/L，BA 0.5mg/L，IBA 0.2mg/L；
[0105] 3)芽苗培养
[0106] 将萌发的无菌芽转接于芽苗培养基中进行芽苗培养，培养温度23～25℃，光照时间12h/d、光强30～50μmol/m2s，25天后获得长度为1.5～2.0cm的无菌芽丛；
[0107] 所述的芽苗培养基包括：MS基本培养基，蔗糖30g/L，BA 0.3mg/L，IBA 0.02mg/L；
[0108] 4)增殖培养
[0109] 将无菌芽丛切割成带有1～3个芽的芽丛，接种于增殖培养基中，培养温度23～25℃，光照时间12h/d、光强30～50μmol/m2s，每25～40d继代一次，增殖5～7代，增殖系数在1.2～3.2，获得新生无菌芽丛，参见图9-10，从图9中可以看出，增殖至第4代时生出大量根，从图10看出，增殖至第6代时，苗健壮且基本不再生根。
[0110] 其中，进行第1～4代增殖时的增殖培养基包括：MS基本培养基，蔗糖30g/L，BA 0.3～0.5mg/L，IBA 0.02mg/L；进行第5～7代增殖时的增殖培养基包括：MS基本培养基，蔗糖30g/L，BA 0.3mg/L；
[0111] 5)生根培养
[0112] 待新生无菌芽丛生长高度为4.0cm以上时，将其切成单芽，转接于生根培养基中进行生根培养，培养温度23～25℃，光照时间12h/d、光强30～50μmol/m2s，培养20～30天，获得单株无菌苗，参见图11，根长3～5cm；所述的生根培养基包括1/2MS培养基，蔗糖30g/L，IBA 0.02mg/L；
[0113] 6)炼苗、移栽
[0114] 将单株无菌苗根部的培养基洗净(参见图12)，种植于栽培基质中，喷洒0.1％甲基托布津杀菌剂，弱光保湿14天后放入温室正常养护，温室炼苗45～60天后，将得到的组培苗(参见图13)移栽于大田繁苗区，所述的栽培基质含15％蛭石、15％珍珠岩和70％泥炭土。
[0115] 本实施例的‘申阳’草莓在整个增殖过程中没有出现玻璃化和愈伤组织。从芽诱导、增殖和生根各阶段的培养基中所添加的植物生长激素情含量及生长表现情况参见表4。
[0116] 表4
[0117]
[0118]
[0119] 其中，接种数是指生长点的接种数，芽苗数是指培养1个月后获得的芽苗数。
[0120] 表4数据说明：芽萌发阶段增殖系数小于1是因剥取的茎尖有部分未萌发。从R2阶段培养的‘申阳’组培苗数量超过100株，后期均进行增殖转接；试验研究中仅考虑统计方便，这里只计算100株(25瓶)的增殖情况。实际应用中，从保障品种纯度出发，微繁增殖系数(≤3.5)和增殖代数控(≤7)制要适宜，不得盲目追求高增殖系数和无限次增加繁殖代数。特别地，培养条件(光照、温度、水分等)、继代代数、激素保存期限、激素批次等因素都会影响组培苗对激素的响应，应根据苗的实际生长情况进行适当调整，确保增殖系数适宜(≤
3.5)。另外，外源激素在组培苗内有一个逐步积累过程，若在相同培养基上增殖系数突然大幅度增高，建议及时转接到无激素培养基上培养1～2代。
