一种用于检测胃癌的引物组及检测方法
阅读：949发布：2023-03-11
专利汇可以提供一种用于检测胃癌的引物组及检测方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供用于检测胃癌的引物组及其检测方法，本发明的引物包括SEQ ID No.1‑‑SEQID No.18,可对EpCAM、HER2、EGFR、CEA、MUC1、CMET、CK18、CK19、CK20基因进行联合检测。通过PCR或 荧光 定量PCR的方法，可在短时间内灵敏检测出靶基因的表达及表达 水 平；采用优化的PCR条件，通过增加扩增反应的循环数，使观察结果更显著，进一步提高方法适用性；扩增产物具有特异性，确保PCR检测高准确度和灵敏度。实施本发明中用于胃癌检测的引物组，通过检测病人样本中靶基因的表达，可以简单、方便且准确地诊断胃癌。，下面是一种用于检测胃癌的引物组及检测方法专利的具体信息内容。
1.一种用于检测胃癌的引物组，其特征在于，所述引物组包含a～i 9对引物，所述引物a的正向引物如SEQ ID No.1所示，引物a的反向引物如SEQ ID No.2所示，引物b的正向引物如SEQ ID No.3所示，引物b的反向引物如SEQ ID No.4所示，引物c的正向引物如SEQ ID No.5所示，引物c的反向引物如SEQ ID No.6所示，引物d的正向引物如SEQ ID No.7所示，引物d的反向引物如SEQ ID No.8所示,引物e的正向引物如SEQ ID No.9所示，引物e的反向引物如SEQ ID No.10所示,引物f的正向引物如SEQ ID No.11所示，引物f的反向引物如SEQ ID No.12所示,引物g的正向引物如SEQ ID No.13所示，引物g的反向引物如SEQ ID No.14所示,引物h的正向引物如SEQ ID No.15所示，引物h的反向引物如SEQ ID No.16所示,引物i的正向引物如SEQ ID No.17所示，引物i的反向引物如SEQ ID No.18所示。
2.一种用于检测胃癌的PCR检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将权利要求1所述的9对引物分别加入到单个PCR反应管中，并均加入核酸提取物、反转录酶、RNA酶抑制剂、DNA聚合酶、dNTP；其中，PCR反应的每个循环的条件为94摄氏度、
30s；55摄氏度、30s；72摄氏度、10s；
(2)进行反转录和PCR反应，用琼脂糖凝胶电泳法进行检测。
3.一种用于检测胃癌的荧光定量PCR检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将权利要求1所述的9对引物分别加入到单个PCR反应管中，并均加入核酸提取物、反转录酶、RNA酶抑制剂、DNA聚合酶、dNTP；分别加入2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix，其中，PCR反应的每个循环的条件为95摄氏度、10s和60摄氏度、30s；40个循环；每管设立三个复孔；
(2)进行反转录和PCR反应，并实时检测荧光；
(3)根据荧光检测结果计算出的Ct值，判断是否有标志物靶基因表达于样品中。
一种用于检测胃癌的引物组及检测方法
技术领域
背景技术
[0002] 胃癌系起源于胃黏膜上皮的恶性肿瘤，是危害我国人民健康的重大疾病之一。我国幅员辽阔、人口众多，成人幽门螺杆菌(Helicobacterpylori，H.pylori)感染率高达40％～60％，属于胃癌高发国家，每年胃癌新发病例约40万例，死亡约35万，新发和死亡均占全世界胃癌病例的40％。我国胃癌地区分布广泛，以西北地区和东南沿海较为集中，多地散在典型高发区，地区差异明显；男性发病率和病死率约为女性的2倍；农村发病率较城市高出60％～70％，以40～60岁人群多见；患者病死率随年龄增长而增加.
[0003] 大部分早期胃癌内镜下即可获得根治性治疗，患者5年生存率超过90％。早期胃癌诊治可以大大节约医疗资源，但目前我国早期胃癌的诊治率低于10％，远远低于日本(70％)和韩国(50％)。我国在早期胃癌筛查方面，目前尚无简便、有效的诊断方法来进行全体人群普查；尚无法将内镜检查等诊断方法用于胃癌的普查，加上内镜检查是侵入性检查，很多无症状、低胃癌发病风险的患者难以接受。因此，只有针对胃癌高危人群进行筛查才可能是早期胃癌筛查的有效方法。
[0004] 近来，循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cells，CTCs)检测的出现给患者的检测带来了新的希望。CTCs是从肿瘤病灶脱离并移位至血液中的肿瘤细胞，是恶性肿瘤患者术后复发和远处转移的重要原因，也是导致肿瘤患者死亡的重要因素。与其他组织学标本如骨髓等相比，外周血标本容易获取，且对患者创伤小，是临床上常规检测较为理想的标本来源。CTCs检测有助于肿瘤的早期诊断、判断患者预后、评估抗肿瘤药物的疗效及制定个体化治疗方案。与传统的诊断方法相比，CTCs检测可更加敏感地发现疾病的变化，且对患者没有副作用。
[0005] CTC的检测通常通过抽取一定体积的血液进行。检测分为两类，包括不捕获(富集)直接检测和先捕获(富集)后检测，其中后者为主流的检测方法。先捕获(富集)后检测的方法也分为两类，即正选和负选。正选主要是通过CTC表面标志物或细胞的物理性质(大小、密度)进行捕获；前者是基于免疫磁球技术和微流控芯片技术，后者是基于过滤、离心的原理。负选则是通过白细胞表面标志物间接捕获CTC。然而基于先捕获(富集)后检测的方法有着明显的缺陷。它严重依赖于肿瘤细胞表面标记物的表达，因此无法捕获未表达表面肿瘤 标记物的CTC细胞。
[0006] 采用RT-PCR的方法检测CTC细胞的特异性基因是CTC细胞检测的另外一种方式。首先抽取一定体积的血液，通过密度梯度离心的方式富集CTCs，然后通过RT-PCR的方式检测特定基因的mRNA，以此判断CTCs是否存在，并通过检测CT值的变化给CTCs定量。这种方法检测CTCs费用低，敏感度高，而且容易自动化。
[0007] 目前RT-PCR方法检测胃癌CTCs的检测标准还没有建立。我们通过检测胃癌患者的CTCs特征基因，确定胃癌CTCs的检测方法和检测标准。这些检测方法和标准的建立有助于肿瘤患者的早期诊断、判断患者预后、评估抗肿瘤药物(包括NK和CAR-T免疫治疗)的疗效及制定个体化治疗方案。
[0008] 针对上述问题，本发明开发一种高灵敏的多基因联合检测的试剂盒，通过联合检测EpCAM、HER2、EGFR、CEA、MUC1、CMET、CK18、CK19、CK20 9个基因实现肿瘤的早期筛查或诊断。本发明设计运用靶向特异性引物组，大幅度提高检测的灵敏度。该检测方法的检出率可达到95％，同时具备了灵敏度高，特异性好，快速准确等优点。
发明内容
[0009] 本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种用于检测胃癌的引物组及检测方法。
[0010] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的,一种用于检测胃癌的引物组，包含：
[0011]
[0012]
[0013] 本发明的引物组可通过以下两种方法实现神经母细胞瘤的检测。
[0014] 方法1：PCR方法。
[0015] (1)将权利要求1所述的9对引物分别加入到单个PCR反应管中，并均加入核酸提取物、反转录酶、RNA酶抑制剂、DNA聚合酶、dNTP；其中，PCR反应的每个循环的条件为94摄氏度、30s；55摄氏度、30s；72摄氏度、10s；
[0016] (2)进行反转录和PCR反应，用琼脂糖凝胶电泳法进行检测。
[0017] 方法2：荧光定量PCR方法
[0018] (1)将权利要求1所述的9对引物分别加入到单个PCR反应管中，并均加入核酸提取物、反转录酶、RNA酶抑制剂、DNA聚合酶、dNTP；分别加入2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix，其中，PCR反应的每个循环的条件为95摄氏度、10s和60摄氏度、30s；40个循环；每管设立三个复孔；
[0019] (2)进行反转录和PCR反应，并实时检测荧光；
[0020] (3)根据荧光检测结果计算出的Ct值，判断是否有标志物靶基因表达于样品中。
[0021] 本发明的有益效果在于：本发明通过设计特异性PCR引物，开发出用于胃癌早期检测的多基因联合检测方法。此方法：(1)建立的PCR体系可对EpCAM、HER2、EGFR、CEA、MUC1、CMET、CK18、CK19、CK20基因进行联合检测；(2)通过同时对多个基因进行检测胃癌检出率可达到98％；(3)灵敏度高，低至1-5拷贝的基因表达水平均可检出；(4)特异性强，正常人或非胃癌病人样本不会产生非特异性信号；(5)检测速度快，操作简单，费用低廉。附图说明
[0022] 图1为实施例中健康人外周血样本检测阴性PCR图。
[0023] 图2为实施例中非胃癌患者外周血样本检测阴性PCR图。
[0024] 图3为实施例中非胃癌患者肿瘤组织样本检测阴性PCR图。
[0025] 图4为实施例中胃癌患者外周血检测阳性PCR图。
[0026] 图5为实施例中胃癌患者肿瘤组织检测阳性PCR图。
[0027] 图中，M.100bp marker；1.EpCAM；2.HER2；3.EGFR；4.CEA；5.MUC1；6.CMET；7.CK20；8.CK18；9.CK19；10.B2M。
具体实施方式
[0028] 本发明针对目前肿瘤中主要的驱动性突变基因，联合检测EpCAM、HER2、EGFR、CEA、MUC1、CMET、CK18、CK19、CK20 9个基因实现胃癌的早期筛查或诊断。针对目前检测方法灵敏度低，检测过程复杂繁琐，检测所需时间长，无法满足临床检测的实际需求。针对上述问题，设计出用于检测上述9个基因的一整套特异性引物组。
[0029] 根据上述9个基因的参考序列设计特异性扩增引物，其PCR产物长度最优是在180-200bp之间，退火温度不高于60度，GC含量在40-60％之间，符合一般引物设计软件的要求。通过采用实时荧光PCR反应检测体系，实现多个基因联合的高灵敏检测，其检测方法如下所述。
[0030] 本发明结合附图和实施例作进一步的说明。如未特别指明之处，可根据本领域技术人员所熟悉的《分子可隆实验指南》第三版(Cold Spring Harbor laboratory Press)、《细胞实验指南》(科学出版社，北京，中国，2001年)、《RNA实验技术手册》(科学出版社，北京，中国，2004年)、《免疫检测技术》(科学出版社，北京，中国，1991)等实验手册以及本文[0031] 所引用的参考文献中所列方法来实施。其中，所用的(带标记的)探针、引物可以委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
[0032] 下面结合实施例对本发明作进一步说明。
[0033] 实施例1:基因选择
[0034] 多项研究表明，单基因筛查敏感度约为20-30％，大部分用于肿瘤早期筛查的单个基因检测，其检测敏感度或特异度偏低，不能满足临床需要。采用多基因联合检测可以有效解决敏感度低的问题，提高肿瘤早期筛查和诊断的准确度。Kolostova K,Matkowski R等人(Kolostova K,Matkowski R,Gürlich R,et al.Detection and cultivation of circulating tumor cells in gastric cancer[J].Cytotechnology,2015,34(5):1-8.)同时检测EpCAM、HER2、MUC1基因，结果表明联合检测三个基因用于胃癌早期诊断的敏感度为54％，准确率达71.2％。为了提高早期肿瘤的检出率，提高肿瘤患者的治愈率，改善病人预后，我们对胃癌组织和正常组织的差异表达基因进行了筛选。我们通过大量比对实验发现EpCAM、HER2、EGFR、CEA、MUC1、CMET、CK20、CK18、CK19组成的基因组对胃癌具有较高的检出率，达到96％，相对于现有的检测技术，产生了意想不到的技术效果，具有显著的进步。
[0035] 实施例2:引物筛选
[0036] (1)设计引物a1～a3、b1～b3、c1～c3、d1～d3、e1～e3、f1～f3、g1～g3、h1～h3、i1～i3，具体为：利用生物信息学软件对靶基因A-I序列进行分析，利用序列分析软件设计特异性引物组，利用NCBI引物搜索软件检测各配对引物在人基因组中的特异性，分别设计出3对特异性扩增引物a1～a3、b1～b3、c1～c3、d1～d3、e1～e3、f1～f3、g1～g3、h1～h3、i1～i3；
[0037] 表1：PCR检测引物
[0038]
[0039]
[0040]
[0041] (2)外周血样品的处理
[0042] 本实施例的实验材料是收集某医院收治并经病理证实的胃癌患者外周血，清晨7点，空腹，经肘静脉采集新鲜血液，存放于抗凝管中，摇匀，常温下保存≤4hr。
[0046] 4.吸弃上清，取细胞沉淀，洗涤，即得到PBMC；
[0047] 5.取PBMC用于核酸提取，多余的PBMC用RNA保护剂重悬，保存于-20度。
[0048] (3)核酸的提取
[0049] 1.取不多于5×105的PBMC，加入250μL Buffer RLT Plus，吹打混匀；
[0050] 2.将裂解液转移至gDNA清除离心型柱中，8000×g(10,000rpm)离心30s。收集流穿液，弃离心柱；
[0051] 3.加入1倍体积的70％乙醇(350μL)至流穿液中，吹打混匀；
[0052] 4.将样品转移至RNeasyMinElute离心柱，盖紧盖子，8000×g(10,000rpm)离心15s，弃流穿液；
[0053] 5.在RNeasyMinElute离心柱中加入700μL Buffer RW1，盖紧盖子，8000×g(10,000rpm)离心15s，弃流穿液；
[0054] 6.在RNeasyMinElute离心柱中加入500μL Buffer RPE，盖紧盖子，8000×g(10,000rpm)离心15s，弃流穿液；
[0055] 7.将RNeasyMinElute离心柱置于新的2mL收集管中，打开盖子，全速离心5min，使乙醇挥发；
[0056] 8.将RNeasyMinElute离心柱置于新的1.5mL收集管中，加入20μLRNase-free H2O，盖紧盖子，全速离心1min洗脱RNA。
[0057] (4)模板cDNA的获得
[0058] 1.准确测得样品RNA浓度；
[0060]成分 体积
5×Mix 8μL
RNA 500ng
RNase-free H2O 至40μL
5×Mix 8μL
RNA 500ng
RNase-free H2O 至40μL
[0061] 轻柔混匀以上反应体系，并利用离心机短暂离心，55度20min，85度2min，获得模板cDNA；
[0062] (5)普通PCR扩增
[0063] 用Taq DNA聚合酶配置反应体系，，用引物为a-i和人内参基因(B2M)进行PCR扩增各样品，产物1％凝胶检测；
[0064] 扩增体系
[0065]成分 体积
2×Mix 10μL
cDNA 2μL
引物-F 0.8μL
引物-R 0.8μL
RNase-free H2O 6.4μL
2×Mix 10μL
cDNA 2μL
引物-F 0.8μL
引物-R 0.8μL
RNase-free H2O 6.4μL
[0066] PCR反应条件是95℃预变性3分钟，1个循环；95℃变性20秒，55℃退火20秒，72℃延伸10秒，35个循环；72℃延伸7分钟。
[0067] (6)荧光实时定量PCR扩增
[0068] 根据设计的特异引组a-i，通过荧光定量PCR进行扩增，体系如下：
[0069]
[0070]
[0071] 95℃预变性20s，1个循环；95℃10s，60℃30s，40个循环；每管设立三个复孔；
[0072] 根据步骤5和6的pcr结果，筛选出以下引物组，作为本发明用于检测胃癌的引物组。
[0073]
[0074] 实施例3：效果验证
[0075] 根据实施例2的筛选结果，采用下表所述的引物组对200个肿瘤样本进行检测。
[0076]
[0077] 其中，hTERT的正向引物为CTGAGCTGTACTTTGTCAAG，反向引物为AGACGTGGCTCTTGAAGGCC，MAGE1的正向引物为CTCTGAGTCCTTGCAGCTGG，反向引物为CCGCCCTCCATTGCAATCAT，CD90的正向引物为ATGAACCTGGCCATCAGCAT，反向引物为CTTCTTTGTCTCACGGGTCA。
[0078] 1～8号引物组的检出率如上表所示，从表中可以看出，引物组中，随着引物数量的增加，在一定程度上可以提高其检出率。进一步地，通过比较5～8号引物组可以发现，引物组内的组合对于检出率的高低有重要影响。同时在相同的检测基因数量情况下，5号引物组的检出率高于6～8号引物组。因此，我们优选5号引物组的基因组合用于胃癌的检测。
[0079] 进一步通过研究发现，5号引物组中，EPCAM是一种由GA-733-2基因编码的分子量为40kDa的跨膜糖蛋白，作为嗜同种的钙非依赖性的上皮细胞间粘附分子在上皮癌变过程中发挥着作用。CEA抗原决定基为糖蛋白，而肿瘤细胞的浸润和转移均与细胞膜糖蛋白的糖基化改变有关。CMET编码的蛋白属于酪氨酸激酶生长因子的受体家族,在体外细胞恶性转化的过程中可以出现基因扩增、重排和过度表达.EGFR二聚后可以激活它位于细胞内的激酶通路，包括Y992,Y1045,Y1068,Y1148 and Y1173等激活位点。这个自磷酸化可以引导下游的磷酸化，包括MAPK，Akt和JNK通路,诱导细胞增殖。MUC1是由muc1基因表达的一种高糖基化(糖化大于50％),又称附膜蛋白，是跨膜分子，它在上皮更新与分化，维持上皮完整性和癌的发生与转移等方面都起到重要的作用。由上可知，本发明并不是将9对引物进行简单叠加组合，9对引物相铺相成，在功能上彼此支持，使得检出率得到大幅度提升，取得了意想 不到的技术效果。综上所述，本发明中选择的基因涉及肿瘤的代谢、增殖、侵袭等方面，可较为全面的检测出胃癌的细胞生物学特征。
[0080] 实施例4：特异性分析
[0081] 根据实施例2的筛选结果，采用上表所述的引物组对正常人外周血样本、非胃癌病人的外周血和肿瘤组织样本、胃癌病人的外周血和组织样本进行检测。结果如图1-5所示，从图中可见所述的引物组在正常人外周血、非胃癌病人的外周血和肿瘤组织样本中均未或较弱检测到基因的表达，而在胃癌病人的外周血和组织样本中可检测到多个基因的强表达，说明本发明中所述引物组具有高度的特异性。
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 安全型核酸电泳荧光仪 | 2020-05-12 | 387 |
| 一种高光泽电泳涂料 | 2020-05-11 | 179 |
| 荧光检测型电泳装置 | 2020-05-12 | 734 |
| 一种低光泽消光电泳涂料的制备方法 | 2020-05-13 | 709 |
| 实时荧光电泳装置 | 2020-05-12 | 350 |
| 一种太阳能光伏光热露天游泳池系统 | 2020-05-12 | 900 |
| 一种发光泳镜 | 2020-05-13 | 4 |
| 可发光泳镜 | 2020-05-12 | 518 |
| 发光游泳镜 | 2020-05-12 | 445 |
| 发光泳镜 | 2020-05-11 | 529 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈