蛋白激酶构成了一个结构上相关的大的酶家族，其负责控制细胞内的 多种信号传导过程(Hardie，G.和Hanks，S.(1995)“The Protein Kinase Facts Book.I and II”，Academic Press，San Diego，CA)。激酶可以根据其 磷酸化的底物(例如蛋白质-酪氨酸、蛋白质-丝氨酸/苏氨酸、脂类等)而分 成不同的家族。已经鉴定出通常对应于各个激酶家族的序列基元(例如 Hanks，S.K.，Hunter，T.，FASEB J.，9：576-596(1995)；Knighton等人， Science，253：407-414(1991)；Hiles等人，Cell，70：419-429(1992)；Kunz等 人，Cell，73：585-596(1993)；Garcia-Bustos等人，EMBO J.，13：2352-2361 (1994))。
蛋白激酶可根据其调节机制来表征。这些机制包括例如自身磷酸化作 用、通过其它激酶的转磷酸化作用、蛋白质-蛋白质相互作用、蛋白质-脂 类相互作用和蛋白质-多核苷酸相互作用。单独的蛋白激酶可能会受到一个 以上机制的调节。
激酶通过将磷酸基团添加至靶蛋白来调节许多不同的细胞过程，包括 但不限于增殖、分化、细胞凋亡、运动性、转录、翻译和其它信号传导过 程。这些磷酸化事件起着可调节或调控靶蛋白生物功能的分子ON/OFF开 关的作用。靶蛋白响应各种细胞外信号(激素、神经递质、生长和分化因子 等)、细胞周期事件、环境或营养应激等而发生磷酸化作用。合适的蛋白激 酶在信号通路中起作用，以激活或灭活(直接地或间接地)例如代谢酶、调 节蛋白、受体、细胞骨架蛋白、离子通道或泵或转录因子。由于蛋白质磷 酸化作用的控制缺陷引起的不受控的信号传导已经涉及许多疾病，包括例 如炎症、癌、变态反应/哮喘、免疫系统的疾病和病症、中枢神经系统的疾 病和病症以及血管生成。
细胞周期蛋白依赖性激酶
真核细胞分裂的过程可被广义地分成称为G1、S、G2和M的一系列 连续的时相。已经证实，通过细胞周期不同时相的正确进程关键依赖于被 称为细胞周期蛋白依赖性激酶(cdks)的一族蛋白质和多组称为细胞周期蛋 白的其同源蛋白伙伴的空间和时间上的调控。Cdks是cdc2(也被称为cdk1) 同源丝氨酸-苏氨酸激酶蛋白质，其在序列依赖性背景的多种多肽的磷酸化 作用中能够利用ATP作为底物。细胞周期蛋白是以包含大约100个氨基酸 的同源区为特征的一族蛋白质，该同源区被称为“细胞周期蛋白盒”，其 用于结合特异性cdk伙伴蛋白质和定义对其的选择性。
各种cdks和细胞周期蛋白在整个细胞周期的表达水平、降解速率和活 化水平的调节导致一系列cdk/细胞周期蛋白复合物的循环形成，其中cdks 具有酶活性。这些复合物的形成经由离散的细胞周期关卡控制传代，由此 使细胞分裂的过程能够继续。未能满足给定细胞周期关卡的必要的生物化 学标准，即未能形成所需的cdk/细胞周期蛋白复合物，可导致细胞周期受 阻和/或细胞凋亡。如癌症中所显示的异常的细胞增殖常可归因于正确的细 胞周期控制的丧失。因此，抑制cdk酶活性提供了一种使异常分裂细胞的 分裂受阻和/或被杀死的手段。cdks和cdk复合物的多样性以及它们在介导 细胞周期中的决定性角色，提供了基于所定义的生物化学理论来选择的广 谱的潜在治疗靶标。
从细胞周期的G1期到S期的进程主要由cdk2、cdk3、cdk4和cdk6 通过与D和E型细胞周期蛋白成员结合而调节。D型细胞周期蛋白似乎有 助于使得能够通过G1限制点，而cdk2/细胞周期蛋白E复合物是从G1到 S期转换的关键。随后通过S期和进入G2的进程被认为需要cdk2/细胞周 期蛋白A复合物。有丝分裂和触发它的G2到M期的转换，两者均受到 cdk1及A和B型细胞周期蛋白复合物的调节。
在G1期间，视网膜母细胞瘤蛋白(Rb)和相关的口袋蛋白如p130是cdk (2、4和6)/细胞周期蛋白复合物的底物。通过G1的进程部分通过Rb和 p130被cdk(4/6)/细胞周期蛋白-D复合物的超磷酸化、从而失活而被促进。 Rb和p130的超磷酸化造成转录因子如E2F的释放，并因此导致通过G1 和进入S期的进程所必需的基因如细胞周期蛋白E的基因的表达。细胞周 期蛋白E的表达促进cdk2/细胞周期蛋白E复合物的形成，其通过Rb的 进一步磷酸化作用而放大或维持E2F水平。cdk2/细胞周期蛋白E复合物 也磷酸化其它DNA复制所需的蛋白质，如NPAT，其已经涉及组蛋白生 物合成。G1的进程和G1/S的转换也经由汇入cdk2/细胞周期蛋白E途径 的有丝分裂原刺激的Myc途径的调节。Cdk2还经由p21水平的p53调节 与p53介导的DNA损伤应答途径相联。p21为cdk2/细胞周期蛋白E的蛋 白抑制剂，因此能够阻断或延迟G1/S转换。cdk2/细胞周期蛋白E复合物 因此可代表来自Rb、Myc和p53途径的生物化学刺激在一定程度上被整 合的点。因此，Cdk2和/或cdk2/细胞周期蛋白E复合物代表了设计用于 阻遏异常分裂细胞的细胞周期或恢复对其控制的治疗的良好靶点。
cdk3在细胞周期中的确切角色并不清楚。目前为止还没有同源细胞周 期蛋白伙伴被鉴定，但是cdk3的显性负调节形式延迟G1期细胞，因此提 示cdk3具有调节G1/S转换的作用。
虽然大多数cdks参与细胞周期的调节，但有证据表明某些cdk家族成 员参与了其它生物化学过程。以cdk5为例，它是神经元正确发育所必需的， 而且也参与了几种神经元蛋白质如Tau、NUDE-1、突触蛋白1、DARPP32 和Munc18/Syntaxin1A复合物的磷酸化作用。神经元cdk5通常通过与 p35/p39蛋白质结合而活化。然而，Cdk5活性可通过结合p25即p35的截 短形式而去调节。p35到p25的转化和随后cdk5活性的去调节可由局部缺 血、兴奋性中毒和β-淀粉样肽诱发。因而，p25已经牵涉到神经变性疾病 如阿尔茨海默病的发病机制，因此作为针对这些疾病的治疗的靶点受到关 注。
Cdk7是具有cdc2 CAK活性并结合至细胞周期蛋白H的核蛋白。Cdk7 已被鉴定为TFIIH转录复合物的成分，其具有RNA聚合酶II的C-末端结 构域(CTD)活性。这与经由Tat介导的生物化学途径的HIV-1转录的调节 有关。Cdk8结合细胞周期蛋白C并已经参与RNA聚合酶II的CTD的磷 酸化作用。类似地，cdk9/细胞周期蛋白-T1复合物(P-TEFb复合物)已经参 与RNA聚合酶II的延伸控制。HIV-1基因组通过病毒反式激活蛋白Tat 经由其与细胞周期蛋白T1的相互作用的转录活化也需要PTEF-b。因此， cdk7、cdk8、cdk9和P-TEFb复合物是抗病毒治疗的潜在靶点。
在分子水平上，cdk/细胞周期蛋白复合物活性的介导需要一系列刺激 性和抑制性磷酸化或去磷酸化事件。Cdk磷酸化作用由一组cdk活化激酶 (CAK)和/或激酶如weel、Myt1和Mik1来完成。去磷酸化作用由磷酸酶 如cdc25(a & c)、pp2a或KAP来完成。
Cdk/细胞周期蛋白复合物的活性可进一步由两族内源性细胞蛋白质性 抑制剂调节：Kip/Cip家族或INK家族。INK蛋白特异性地结合cdk4和 cdk6。P16ink4(也被称为MTS1)是潜在的肿瘤抑制基因，其在大量原发癌 症中发生突变或缺失。Kip/Cip家族包含蛋白质如p21Cip1，Waf1、p27Kip1和 p57kip2。如先前所讨论，p21被p53诱导且能够灭活cdk2/细胞周期蛋白(E/A) 和cdk4/细胞周期蛋白(D1/D2/D3)复合物。在乳腺癌、结肠癌和前列腺癌中 已经观察到非典型的低水平p27表达。相反，细胞周期蛋白E在实体瘤中 的过表达已经显示与患者预后不良相关。细胞周期蛋白D1的过表达已经 与食道癌、乳腺癌、鳞状细胞癌和非小细胞肺癌相关。
上文已概述了Cdks及其相关蛋白质在增殖细胞中协调和驱动细胞周 期的关键性角色。还描述了一些其中cdks起关键作用的生化途径。因此， 开发采用靶向cdks类或特定cdks的治疗法来治疗增殖疾病如癌症的单一 疗法可能是高度需要的。还可以考虑将cdk抑制剂用于治疗其它病症、尤 其如病毒感染、自身免疫疾病和神经变性疾病。当与现存的或新的治疗剂 组合治疗时，靶向cdk的治疗在前述疾病的治疗中也可提供临床益处。以 靶向cdk的抗癌治疗可能潜在地具有优于多种现有抗肿瘤剂的优点，因为 它们不与DNA直接作用，因此应该降低继发肿瘤发展的危险。
糖原合酶激酶
糖原合酶激酶-3(GSK3)是一种丝氨酸-苏氨酸激酶，在人类中以两种遍 在表达的同种型存在(GSK3α & βGSK3β)。GSK3已经牵涉于在胚胎发育、 蛋白质合成、细胞增殖、细胞分化、微管动力学、细胞运动性和细胞凋亡 种具有作用。就此GSK3已经涉及于疾病状态的进程，如糖尿病、癌症、 阿尔茨海默病、中风、癫痫、运动神经元疾病和/或头部损伤。就种系发育 而言，GSK3与细胞周期蛋白依赖性激酶(CDKs)最密切相关。
被GSK3识别的肽底物共有序列为(Ser/Thr)-X-X-X-(pSer/pThr)，其 中X为任意氨基酸(在(n+1)、(n+2)、(n+3)位)，pSer和pThr分别是磷酸- 丝氨酸和磷酸-苏氨酸(n+4)。GSK3在(n)位磷酸化第一个丝氨酸或苏氨酸。 在(n+4)位的磷酸-丝氨酸或磷酸-苏氨酸显示是启动GSK3以得到最大底物 转换所必需的。GSK3α在Ser21或GSK3β在Ser9的磷酸化引起GSK3 的抑制。诱变和肽竞争研究已经获得GSK3磷酸化的N末端通过自动抑制 机制能够与磷酸-肽底物(S/TXXXpS/pT)竞争的模型。也有资料提出GSK3α 和GSKβ可以分别由酪氨酸279和216的磷酸化进行精细地调节。这些残 基向Phe的突变引起体内激酶活性的降低。GSK3β的X射线晶体结构有 助于揭示GSK3激活和调节的所有方面。
GSK3形成哺乳动物胰岛素应答途径的一部分且能够磷酸化、由此灭 活糖原合酶。由此，通过抑制GSK3而增量调节糖原合酶活性并由此增量 调节糖原合成已被视为对抗II型或非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)的可 能手段，该病症是其中机体组织变得对胰岛素刺激有耐受性的病症。肝、 脂肪或肌肉组织中的细胞胰岛素应答被结合于细胞外胰岛素受体的胰岛素 触发。这造成胰岛素受体底物(IRS)蛋白质的磷酸化和随后向质膜的募集。 IRS蛋白质的进一步磷酸化启动了磷酸肌醇-3激酶(PI3K)向质膜的募集， 在那里其能够释放第二信使磷酸肌醇3，4，5-三磷酸。这促进3-磷酸肌醇依 赖性蛋白质激酶1(PDK1)和蛋白激酶B(PKB或Akt)在膜上的共定位，在 那里PDK1激活PKB。PKB分别通过磷酸化Ser9或ser2l来磷酸化并由 此抑制GSK3α和/或GSKβ。GSK3的抑制接着触发糖原合酶活性的上调。 能够抑制GSK3的治疗剂因此能够诱发类似于在胰岛素刺激中观察到的那 些细胞应答。GSK3的另一体内底物是真核细胞蛋白质合成引发因子 2B(eIF2B)。eIF2B通过磷酸化而失活，因此能够抑制蛋白质生物合成。因 此，GSK3的抑制、例如通过“哺乳动物雷帕霉素靶”蛋白(mTOR)的失活， 可上调蛋白质生物合成。最后，有一些通过促分裂原活化蛋白激酶(MAPK) 路径、通过激酶如促分裂原活化蛋白激酶活化的蛋白激酶1(MAPKAP-K1 或RSK)磷酸化GSK3而调节GSK3活性的证据。这些资料提示：GSK3 活性可受到促有丝分裂、胰岛素和/或氨基酸刺激的调控。
另外已经显示：GSK3β是脊椎动物Wnt信号途径中的重要成分。已 经证实这条生物化学途径对于正常胚胎发育很重要且调节正常组织中的细 胞增殖。GSK3响应于Wnt刺激而被抑制。这可导致GSK3底物如Axin、 腺瘤性结肠息肉病(APC)的基因产物和β-连环蛋白的去磷酸化。Wnt途径 的异常调节已经与许多癌症有关。APC和/或β-连环蛋白中的突变常见于 结肠直肠癌和其它肿瘤中。β-连环蛋白也已显示在细胞粘着中的重要性。 因此，GSK3也可在一定程度上调节细胞粘着过程。除了已描述的生化途 径外，也有资料显示GSK3通过细胞周期蛋白-D1的磷酸化参与细胞分裂 的调节、参与转录因子如c-Jun、CCAAT/增强子结合蛋白α(C/EBPα)、 c-Myc和/或其它底物如激活T细胞核因子(NFATc)、热休克因子-1(HSF-1) 和c-AMP应答元件结合蛋白(CREB)的磷酸化。GSK3还显示在调节细胞 凋亡中起作用，虽然是组织特异性的。GSK3经由促细胞凋亡机理在调节 细胞凋亡中的作用可能与其中可发生神经元细胞凋亡的医学病症密切相 关。这些病症的例子是头部损伤、中风、癫痫、阿尔茨海默病和运动神经 元疾病、进行性核上性麻痹、皮质基底节变性(corticobasal degeration)和 皮克氏病(Pick’s disease)。在体外已经证实GSK3能够超磷酸化微管相关 蛋白Tau。Tau的超磷酸化破坏了它与微管的正常结合，而且可导致细胞 内Tau微丝的形成。据信这些微丝的不断蓄积可最终导致神经元功能障碍 和变性。因此，通过抑制GSK3来抑制Tau的磷酸化可提供限制和/或预 防神经变性效应的手段。
弥漫性大B-细胞淋巴瘤(DLBCL)
细胞周期进程是由细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK) 和作为细胞周期负调控剂的CDK抑制剂(CDKi)的联合作用来调控的。 p27KIP1是细胞周期调控中关键的CDKi，其降解是G1/S转换所必需的。 尽管在增殖性淋巴细胞中缺乏p27KIP1的表达，但已经报道了一些侵袭性 B细胞淋巴瘤显示出反常的p27KIP1染色。在此类型的淋巴瘤中发现了异 常高的p27KIP1表达。这些发现的临床相关性分析显示，在单变量及多变 量分析中，在此类型肿瘤中高水平的p27KIP1表达是不良预后的指标。这 些结果显示弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)中有异常的p27KIP1表达， 具有不良的临床意义，提示通过与其它细胞周期调节蛋白的相互作用可导 致该异常p27KIP1蛋白质失去功能。(Br.J.Cancer.1999年7月； 80(9)：1427-34.“p27KIP1在弥漫性大B细胞淋巴瘤中异常表达并与不良临 床结果有关”，Saez A、Sanchez E、Sanchez-Beato M、Cruz MA、Chacon I、Munoz E、Camacho FI、Martinez-Montero JC、Mollejo M、Garcia JF、 Piris MA，Department of Pathology，Virgen de la Salud Hospital，Toledo， 西班牙)。
慢性淋巴细胞白血病
B-细胞慢性淋巴细胞白血病(CLL)是西半球最常见的白血病，且每年 约有10,000个新病例被诊断(Parker SL、Tong T、Bolden S、Wingo PA： Cancer statistics，1997.Ca.Cancer.J.Clin.47：5，(1997))。相对于其它形式 的白血病，CLL的总预后良好，即使是最晚期的患者也有3年的存活中位 值。
与先前使用的以烷化剂为基础的治疗相比，加入氟达拉滨作为症状性 CLL患者的起始治疗可导致更高比例的完全响应(27％对3％)和无进展的 存活期(33对17个月)。虽然在治疗后达到临床上的完全响应是改进CLL 存活率的最初步骤，但多数患者并未达到完全缓解或对氟达拉滨没有反应。 再者，所有用氟达拉滨治疗的CLL患者最后都复发，使其只能用作单纯舒 缓性的单一药剂(Rai KR、Peterson B、Elias L、Shepherd L、Hines J、 Nelson D、Cheson B、Kolitz J、Schiffer CA：氟达拉滨和苯丁酸氮芥对于 先前未治疗慢性淋巴细胞白血病患者的随机比较.A CALGB SWOG、 CTG/NCI-C和ECOG组间研究，Blood88：141a，1996(摘要552，增补1)。 因此，如果想实现该疾病治疗的进一步改进，必需鉴定具有新作用机制、 补充氟达拉滨的细胞毒性和去除由固有CLL耐药性因子诱发的耐药性的 新药剂。
关于CLL患者对治疗反应差和不良存活率的最广泛研究的标准预测 因子是异常的p53功能，其以点突变或染色体17p13缺失为特征。的确， 事实上对烷化剂或嘌呤类似物的治疗没有反应已在那些具有异常p53功能 的CLL患者的多个单一机构的病例系列中被证明。引入有能力克服与CLL 的p53突变有关的抗药性的治疗剂，将可能成为该病治疗的重要进步。
细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂夫拉平度(Flavopiridol)和CYC202在 体外可诱发来自B细胞慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)的恶性细胞的凋亡。
夫拉平度暴露造成胱天蛋白酶3活性刺激和p27(kip1)的胱天蛋白酶- 依赖性分解，p27是细胞周期负调控剂，其在B-CLL中过表达。(Blood.1998 年11月15日；92(10)：3804-16“夫拉平度经由活化胱天蛋白酶-3而诱导慢 性淋巴细胞白血病细胞调亡，无bcl-2调控和依赖于功能性p53的证据”， Byrd JC、Shinn C、Waselenko JK、Fuchs EJ、Lehman TA、Nguyen PL、 Flinn IW、Diehl LF、Sausville E、Grever MR)。
来自Du Pont的WO 02/34721公开了作为细胞周期蛋白依赖性激酶抑 制剂的茚并[1，2-c]吡唑-4-酮。
来自Bristol Myers Squibb的WO 01/81348描述了5-硫代-、亚磺酰基 -和磺酰基吡唑并[3，4-b]-吡啶作为细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂的用途。
同样来自Bristol Myers Squibb的WO 00/62778公开了一类蛋白酪氨 酸激酶抑制剂。
来自Cyclacel的WO 01/72745A1描述了2-取代的4-杂芳基-嘧啶及其 制备、包含它们的药物组合物和它们作为细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK) 抑制剂的用途以及其由此在治疗增殖性疾病如癌症、白血病、银屑病等中 的用途。
来自Agouron的WO 99/21845描述了用于抑制细胞周期蛋白依赖性激 酶(CDK)如CDK1、CDK2、CDK4和CDK6的4-氨基噻唑衍生物。该发 明还涉及包含该化合物的药物组合物的治疗或预防用途，和通过施用有效 量的该化合物来治疗恶性疾病和其它疾病的方法。
来自Agouron的WO 01/53274公开了作为CDK激酶抑制剂的一类化 合物，其可包含连接到含N杂环基团的被酰胺取代的苯环。
WO 01/98290(Pharmacia & Upjohn)公开了一类作为蛋白激酶抑制剂 的3-氨基羰基-2-甲酰胺基-噻吩衍生物。
来自Agouron的WO 01/53268和WO 01/02369公开了通过抑制蛋白 激酶如细胞周期蛋白依赖性激酶或酪氨酸激酶来调节或抑制细胞增殖的化 合物。Agouron的化合物具有直接地或经由CH＝CH或CH＝N基团连接至 吲唑环3-位的芳基或杂芳基环。
WO 00/39108和WO 02/00651(两者皆属于Du Pont Pharmaceuticals) 描述了杂环化合物，它是胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶、尤其是Xa因子和凝 血酶的抑制剂。据称该化合物可用作抗凝血剂或用于预防血栓栓塞症。
US 2002/0091116(Zhu等人)、WO 01/19798和WO 01/64642各自公开 了作为Xa因子抑制剂的不同组杂环化合物。公开和例举了一些1-取代的 吡唑甲酰胺类化合物。
US 6,127,382、WO 01/70668、WO 00/68191、WO 97/48672、WO 97/19052和WO 97/19062(均属于Allergan)各自公开了用于治疗包括癌症 在内的各种过度增殖疾病的具有类视黄醇活性的化合物。
WO 02/070510(Bayer)描述了一类用于治疗心血管疾病的氨基-二羧酸 化合物。虽然一般性地提及了吡唑类，但在此份文件中没有吡唑的特定实 施例。
WO 97/03071(Knoll AG)公开了一类用于治疗中枢神经系统病症的杂 环基-甲酰胺衍生物。一般性地提及了吡唑作为杂环基的例子，但是没有公 开或例举具体的吡唑化合物。
WO 97/40017(Novo Nordisk)描述了作为蛋白酪氨酸磷酸酶调节剂的 化合物。
WO 03/020217(Univ.Connecticut)公开了一类用于治疗神经系统病症 的作为大麻素受体调节剂的吡唑3-甲酰胺。其中描述了(第15页)该化合物 可被用于癌症化疗中，但并不清楚该化合物作为抗癌剂是否有效或其是否 为了其它目的而施用。
WO 01/58869(Bristol Myers Squibb)公开了可尤其用于治疗多种疾病 的大麻素受体调节剂。主要用途为治疗呼吸疾病，尽管提及了癌症的治疗。
WO 01/02385(Aventis Crop Science)公开了作为杀真菌剂的1-(喹啉 -4-基)-1H-吡唑衍生物。公开了作为合成中间体的1-未取代的吡唑。
WO 2004/039795(Fujisawa)公开了作为载脂蛋白B分泌抑制剂的包含 1-取代的吡唑基团的酰胺。据称该化合物可用于治疗高血脂等病症。
WO 2004/000318(Cellular Genomics)公开了作为激酶调节剂的各种 氨基-取代的单环类。示例性化合物中没有吡唑类。
WO 2005/012256(Astex Technology Limited)公开了作为细胞周期蛋 白依赖性激酶(CDK激酶)和糖原合酶激酶-3(GSK3)抑制剂的化合物 4-(2，6-二氯-苯甲酰氨基)-1H-吡唑-3-甲酸哌啶-4-基酰胺及其类似物。
化合物4-(2，6-二氯-苯甲酰氨基)-1H-吡唑-3-甲酸(1-甲磺酰基-哌啶-4- 基)-酰胺在我们早先的国际专利申请PCT/GB2006/000193(其内容通过引 用并入本文)中被公开作为细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK激酶)和糖原合 酶激酶-3(GSK3)抑制剂。PCT/GB2006/000193的实施例1中描述了此化 合物的制备，并且实施例1中的最终步骤涉及通过减压下蒸发溶剂从乙酸 乙酯溶液中分离化合物。由此方法生成的4-(2，6-二氯-苯甲酰氨基)-1H-吡 唑-3-甲酸(1-甲磺酰基-哌啶-4-基)-酰胺被认为是无定形的。
发明概述
结晶形式
第一方面，本发明提供基本呈结晶形式的4-(2，6-二氯-苯甲酰氨基)-1H- 吡唑-3-甲酸(1-甲磺酰基-哌啶-4-基)-酰胺。
化合物4-(2，6-二氯-苯甲酰氨基)-1H-吡唑-3-甲酸(1-甲磺酰基-哌啶-4- 基)-酰胺具有式(I)：

或其互变异构形式。本申请中，式(I)化合物可以以其化学名被提及，或者 为了方便，以“该化合物”、“式(I)化合物”或“本发明的化合物”提及。 这些别名中的每一个都是指上文式(I)显示的化合物，并具有化学名4-(2，6- 二氯-苯甲酰氨基)-1H-吡唑-3-甲酸(1-甲磺酰基-哌啶-4-基)-酰胺。
尽管式(I)化合物可与吡唑环中的碱性氮原子形成盐，但是提到基本呈 结晶形式的化合物是指游离碱。
在上下文许可的情况下提到化合物4-(2，6-二氯-苯甲酰氨基)-1H-吡唑 -3-甲酸(1-甲磺酰基-哌啶-4-基)-酰胺，包括其范围之内的所有溶剂合物、互 变异构体和同位素。
式(I)化合物可以多种不同的几何异构形式和互变异构形式存在，并且 提到式(I)化合物就包括所有这些形式。为了避免疑义，化合物可以以几种 几何异构形式或互变异构形式中的一种存在，并仅特别描述或显示一种， 然而式(I)包含所有其它形式。
例如，式(I)化合物中，吡唑环可以以下文的A和B两种互变异构形式 存在。为简单起见，通式(I)表示为形式A，但是认为该式包含两种互变异 构形式。

本发明的化合物还包括具有一个或多个同位素取代的化合物，并且提 到具体元素就包括在其范围之内的该元素的所有同位素。例如，提到氢就 包括其范围之内的1H、2H(D)和3H(T)。类似地，提到碳和氧分别包括其 范围之内的12C、13C和14C以及16O和18O。
同位素可以是放射性的或非-放射性的。在本发明的一个实施方式中， 化合物不包含放射性同位素。这样的化合物优选用于治疗用途。然而，另 一个实施方式中，化合物可包含一个或多个同位素。包含这类放射性同位 素的化合物可用于诊断情况。
根据本发明的第一方面，化合物基本上是结晶性的；即其50％至100％ 是结晶性的。
更具体而言，化合物可以至少55％是结晶性的，或者至少60％是结晶 性的，或者至少65％是结晶性的，或者至少70％是结晶性的，或者至少 75％是结晶性的，或者至少80％是结晶性的，或者至少85％是结晶性的， 或者至少90％是结晶性的，或者至少95％是结晶性的，或者至少98％是 结晶性的，或者至少99％是结晶性的，或者至少99.5％是结晶性的，或者 至少99.9％是结晶性的，例如100％是结晶性的。
本发明化合物的结晶形式可以是溶剂化的(例如水合的)或非溶剂化的 (例如无水的)。
如本文使用的术语“无水的”不排除化合物上或化合物中存在一些水 的可能性(例如化合物的结晶)。例如，在化合物的表面可以有一些水存在(例 如化合物晶体)，或者在化合物主体内有少量(例如晶体)。通常，无水形式 每分子化合物含有少于0.4分子的水，并且更优选地每分子化合物含有少 于0.1分子的水，例如0分子的水。
一个实施方式中，所述化合物是无水的。
另一个实施方式中，所述化合物是溶剂化的，例如水合的。如果盐是 水合的，它们可含有例如至多3分子的结晶水，更通常地是至多2分子水， 例如1分子水或2分子水。非化学计量的水合物也可以形成，其中存在的 水分子数少于1或者另外是非整数。例如，少于1分子的水存在时，每分 子化合物可以有例如0.4或0.5或0.6或0.7或0.8或0.9分子的水存在。
其它溶剂合物包括醇化物如乙醇化物或异丙醇化物。
本文所述的结晶形式、其晶体和其晶体结构形成本发明的另外方面。
晶体及其晶体结构可使用许多技术来表征，包括单晶X-射线衍射晶体 学、X-射线粉末衍射(XRPD)、差示扫描量热法(DSC)和红外线光谱学例如 傅里叶变换红外光谱学(FTIR)。在改变湿度条件下的晶体行为可通过重量 法蒸汽吸附研究来分析，也可以通过XRPD分析。
化合物晶体结构的测定可通过X-射线衍射晶体学进行，其可根据常规 方法进行，如本文和Fundamentals of Crystallography，C.Giacovazzo、H. L.Monaco、D.Viterbo、F.Scordari、G.Gilli、G.Zanotti和M.Catti， (International Union of Crystallography/Oxford University Press，1992 ISBN 0-19-855578-4(p/b)，0-19-85579-2(h/b))中所述的那些方法。此技术涉 及单晶X-射线衍射的分析和解析。
基本呈结晶形式的4-(2，6-二氯-苯甲酰氨基)-1H-吡唑-3-甲酸(1-甲磺酰 基-哌啶-4-基)-酰胺中，一种单晶形式可占优势，尽管其它结晶形式可以以 少量和优选可忽略的量存在。
优选的实施方式中，本发明提供基本呈结晶形式的化合物4-(2，6-二氯- 苯甲酰氨基)-1H-吡唑-3-甲酸(1-甲磺酰基-哌啶-4-基)-酰胺，其含有化合物 的脱水物的单晶形式，和不超过5重量％的化合物的任何其它结晶形式。
优选地，单晶形式伴有低于4％或低于3％或低于2％的其它结晶形式， 并且特别地含有低于或等于约1重量％的其它结晶形式。更优选地，单晶 形式伴有低于0.9％，或低于0.8％，或低于0.7％，或低于0.6％，或低于 0.5％，或低于0.4％，或低于0.3％，或低于0.2％，或低于0.1％，或低于 0.05％，或低于0.01重量％的其它结晶形式，例如0重量％的其它结晶形 式。
结晶形式的4-(2，6-二氯-苯甲酰氨基)-1H-吡唑-3-甲酸(1-甲磺酰基-哌 啶-4-基)-酰胺可通过以下方法制备：使用PCT/GB2006/000193中描述的方 法或本文所述的方法合成化合物，然后使化合物进行一步或多步重结晶步 骤。
本文使用的术语“重结晶”不需要化合物在重结晶过程之间是结晶形 式。相反，尽管用于重结晶过程的起始原料可以是结晶性的或部分结晶性 的，但是其在重结晶之前可以备选地是无定形形式。
4-(2，6-二氯-苯甲酰氨基)-1H-吡唑-3-甲酸(1-甲磺酰基-哌啶-4-基)-酰胺 的重结晶可通过技术人员公知的方法进行。众所周知，良好的重结晶溶剂 在升高的温度应溶解适量的待纯化物质，但是在较低温度时仅溶解少量物 质。其在低温应易于溶解杂质或者根本不溶解。最后，溶剂应易于从纯化 的产物中除去。这通常意味着其具有相对较低的沸点，并且本领域技术人 员将了解具体物质的重结晶溶剂，或者如果没有可使用的信息，他们将试 验几种溶剂直至找到适宜的溶剂或溶剂混合物。为了得到良好收率的纯化 物质，使用最少量的热溶剂以溶解所有不纯物质。事实上，通常使用较需 要量多3-5％的溶剂，以便溶液是不饱和的。如果不纯化合物含有在溶剂不 溶的杂质，那么它可通过过滤、然后使溶液结晶除去。另外，如果不纯化 合含有痕量的不是化合物本身的有色物质，则它们可通过加入少量脱色碳 至热溶液中、将其过滤然后使其结晶除去。
结晶可在冷却溶液时自然发生。然而，如果不自然地发生，则结晶可 通过冷却溶液至室温以下或通过加入纯物质单晶(晶种)诱发。重结晶也可 通过使用反溶剂进行和/或优化收率。在这种情况下，将化合物在升高的温 度下溶解于适宜的溶剂中，过滤，然后加入需要的化合物在其中具有低溶 解度的另外的溶剂以帮助结晶。然后，通常使用真空过滤将晶体分离，洗 涤，然后干燥，例如，在烘箱中或通过干燥进行。
用于结晶的方法的其它实例包括从蒸汽结晶，其包括蒸发步骤，例如 在密封的试管中或气流中，以及从熔化结晶(“结晶技术手册”第二版，由 A.Mersmann编辑，2001)。
本发明的一个实施方式中，结晶形式的4-(2，6-二氯-苯甲酰氨基)-1H- 吡唑-3-甲酸(1-甲磺酰基-哌啶-4-基)-酰胺通过使用N，N-二甲基乙酰胺、丙 酮和水的混合物将化合物重结晶而制备。
例如，4-(2，6-二氯-苯甲酰氨基)-1H-吡唑-3-甲酸(1-甲磺酰基-哌啶-4- 基)-酰胺可通过包括以下步骤的方法重结晶：
(a)将化合物溶解于N，N-二甲基乙酰胺和丙酮的混合物(例如体积比1.5:2) 中，伴加热(例如至至多约50℃的温度，例如40至50℃)；
(b)任选在需要时通过过滤澄清溶液；
(c)加水，同时维持或增加加热(例如至60至80℃的温度)；
(d)冷却溶液，或者使溶液冷却，以使结晶发生；和
(e)分离化合物的结晶形式，例如通过过滤。
使用N，N-二甲基乙酰胺/丙酮/水溶剂体系制备的4-(2，6-二氯-苯甲酰氨 基)-1H-吡唑-3-甲酸(1-甲磺酰基-哌啶-4-基)-酰胺晶体已通过X-射线衍射晶 体学表征。
表1给出了4-(2，6-二氯-苯甲酰氨基)-1H-吡唑-3-甲酸(1-甲磺酰基-哌啶 -4-基)-酰胺晶体在结晶学信息文件(CIF)格式中的坐标数据(参见Hall、 Allen和Brown，Acta Cryst.(1991).A47，655-685； http://www.iucr.ac.uk/iucr-top/cif/home.html)。本领域其他技术人员可使用 或者优选另外的文件格式如PDB文件格式(例如与EBI大分子结构数据库 (Hinxton，UK)一致的格式)。然而，很显然，使用不同文件格式来给出或处 理表格的坐标在本发明的范围之内。化合物的晶体结构在图1和图2中阐 明，X-射线衍射研究产生的结构热椭圆体表征由图1提供，堆积图由图2 提供。
由X-射线衍射晶体学研究，已经发现本发明化合物的晶体结构属于单 斜晶系空间群如C2/c(#15)，晶格参数a＝9.15，b＝31.32，c＝7.93，β＝113.3°，α ＝γ＝90°。
相应地，另一个实施方式中，本发明提供结晶形式的4-(2，6-二氯-苯甲 酰氨基)-1H-吡唑-3-甲酸(1-甲磺酰基-哌啶-4-基)-酰胺，其：
(a)具有如图1和图2所示的晶体结构；和/或
(b)具有由本文表1坐标所定义的晶体结构；和/或
(c)具有晶格参数a＝9.15，b＝31.32，c＝7.93，β＝113.3°，α＝γ＝90°；和/ 或
(d)具有属于单斜晶系空间群如C2/c(#15)的晶体结构。
或者，或另外，本发明结晶化合物的晶体结构可通过X-射线粉末衍射 (XRPD)的固态技术分析。XRPD可根据常规方法进行，如本文所述(参见实 施例)和“X-射线粉末衍射介绍”，Ron Jenkins和Robert L.Snyder(John Wiley & Sons，New York，1996)的那些方法。XRPD衍射图中存在的确定峰 (与随机背景噪音相对)表明该化合物具有一定程度的结晶性。
化合物的X-射线粉末图形以X-射线衍射光谱中的衍射角(2θ)和晶面间 距(d)参数表征。这些由布拉格氏方程式表述，nλ＝2d Sinθ，(其中n＝1；λ＝ 所使用的阴极的波长；d＝晶面间距；和θ＝衍射角)。本文中，由于数据的特 征性，晶面间距、衍射角和所有图形对于X-射线粉末衍射中晶体的鉴别是 重要的。相对强度不应被严格解释，由于其可根据晶体生长方向、粒子大 小和测定条件变化。另外，衍射角通常表示符合2θ±0.2°范围内的角。峰表 示主峰，且包括在非以上所述那些衍射角处不大于中级(medium)的峰。
使用N，N-二甲基乙酰胺/丙酮/水溶剂体系制备的化合物4-(2，6-二氯-苯 甲酰氨基)-1H-吡唑-3-甲酸(1-甲磺酰基-哌啶-4-基)-酰胺的结晶形式已经通 过XRPD表征，并具有基本如图3所示的X-射线粉末衍射图形。
粉末X-射线衍射图形从衍射角(2θ)、晶面间距(d)和相对强度方面表示。
相应地，另一个实施方式中，本发明提供基本呈结晶形式的4-(2，6-二 氯-苯甲酰氨基)-1H-吡唑-3-甲酸(1-甲磺酰基-哌啶-4-基)-酰胺，其具有以存 在表A中所示的衍射角(2θ)处的主峰和晶面间距(d)为特征的X-射线粉末衍 射图形。
表A

X-射线粉末衍射图形优选进一步以存在表B中所示的衍射角(2θ)处的 另外的峰和晶面间距(d)为特征。
表B

本发明进一步提供基本呈结晶形式的4-(2，6-二氯-苯甲酰氨基)-1H-吡 唑-3-甲酸(1-甲磺酰基-哌啶-4-基)-酰胺，其在与图3中所示的X-射线粉末 衍射图形相同的衍射角处显示峰。优选地，所述峰具有与图3中的峰相同 的相对强度。
优选的实施方式中，本发明提供基本呈结晶形式的4-(2，6-二氯-苯甲酰 氨基)-1H-吡唑-3-甲酸(1-甲磺酰基-哌啶-4-基)-酰胺，其具有基本如图3所 示的X-射线粉末衍射图形。
本发明化合物的结晶形式还可以通过差示扫描量热法(DSC)表征。
使用N，N-二甲基乙酰胺/丙酮/水溶剂体系制备的4-(2，6-二氯-苯甲酰氨 基)-1H-吡唑-3-甲酸(1-甲磺酰基-哌啶-4-基)-酰胺的结晶形式已经通过DSC 分析，并显示在293-296℃处有吸热峰，例如294.5-295℃，表明晶格的热 诱导熔化。在主要的熔化吸热之前没有明显的显著跃迁，因此表示本发明 化合物的结晶形式是无水的。DSC扫描显示在图4中。
相应地，另一方面，本发明提供4-(2，6-二氯-苯甲酰氨基)-1H-吡唑-3- 甲酸(1-甲磺酰基-哌啶-4-基)-酰胺的结晶形式，其是无水的，且当进行DSC 时在293-296℃处显示吸热峰，例如294.5-295℃。
本发明化合物的新结晶形式可进一步通过红外光谱、例如FTIR表征。
当使用UATR方法分析时，使用N，N-二甲基乙酰胺/丙酮/水溶剂体系 制备的化合物的结晶形式的红外光谱包括3362、3019、2843、1677、1577、 1547、1533、1326、1150、926、781、667cm-1处的特征峰。
不希望受任何理论的束缚，认为红外峰可如下归属至盐的结构组分：
峰：                            归属：
3361.92cm-1                     N-H
3018.97cm-1                     芳族C-H
2842.99cm-1                     脂族C-H
1676.72cm-1                     酰胺C＝O
1577.31，1546.92，1532.94cm-1   酰胺
1325.63cm-1                     芳族C-N
1149.91cm-1                     
925.73cm-1                      C-H芳族
780.75，666.88cm-1              芳族C-H
相应地，另外的实施方式中，本发明提供基本呈结晶形式的4-(2，6-二 氯-苯甲酰氨基)-1H-吡唑-3-甲酸(1-甲磺酰基-哌啶-4-基)-酰胺，当使用通用 衰减全反射(UATR)方法分析时，呈现红外光谱，其含有位于3362、3019、 2843、1677、1577、1547、1533、1326、1150、926、781、667cm-1处的特 征峰。
如上文段落显然可知，本发明化合物的新结晶形式可以通过许多不同 的物理化学参数来表征。因此，优选的实施方式中，本发明提供结晶形式 的4-(2，6-二氯-苯甲酰氨基)-1H-吡唑-3-甲酸(1-甲磺酰基-哌啶-4-基)-酰胺， 其通过任何一种或多种(任何组合)或者所有以下参数表征，即结晶形式：
(a)具有图1和2中所示的晶体结构；和/或
(b)具有由本文表1中的坐标所定义的晶体结构；和/或
(c)具有晶格参数a＝9.15，b＝31.32，c＝7.93，β＝113.3°，α＝γ＝90°；和/ 或
(d)具有属于单斜晶系空间群如C2/c(#15)的晶体结构；和/或
(e)具有X-射线粉末衍射图形，其特征是存在表A和任选表B中所述的衍 射角(2θ)处的主峰和晶面间距(d)；和/或
(f)在与图3所示的X-射线粉末衍射图形相同的衍射角处呈现峰，并且任 选其中所述峰具有与图3中的峰相同的相对强度；和/或
(g)具有基本如图3所示的X-射线粉末衍射图形；和/或
(h)是无水的，并且当进行DSC时在293-296℃处显示吸热峰，例如 294.5-295℃；和/或
(i)当使用通用衰减全反射(UATR)方法分析时，显示红外光谱，其含有位 于3362、3019、2843、1677、1577、1547、1533、1326、1150、926、781、 667cm-1处的特征峰。
制备4-(2，6-二氯-苯甲酰氨基)-1H-吡唑-3-甲酸(1-甲磺酰基-哌啶-4-基)-酰胺 的方法
我们的早先申请PCT/GB2006/00的实施例1中，公开了4-(2，6-二氯- 苯甲酰氨基)-1H-吡唑-3-甲酸(1-甲磺酰基-哌啶-4-基)-酰胺可通过以下步骤 序列制备，包括：
(i)使4-(2，6-二氯-苯甲酰氨基)-1H-吡唑-3-甲酸与4-氨基-1-叔丁氧基羰基- 哌啶在1-乙基-3-(3’-二甲氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)和1-羟基苯并三唑 (HOBt)存在下、在二甲基甲酰胺(DMF)中反应，得到4-(2，6-二氯-苯甲酰氨 基)-1H-吡唑-3-甲酸哌啶-4-基酰胺的N-boc保护形式；
(ii)通过用盐酸处理除去boc保护基团；和
(iii)使4-(2，6-二氯-苯甲酰氨基)-1H-吡唑-3-甲酸哌啶-4-基酰胺盐酸盐在乙 腈中、在二异丙基乙胺存在下与甲磺酰氯反应。
现已发现，不同于在步骤(iii)中使用叔胺作为碱，甲磺酰化步骤可使用 金属碳酸盐或碳酸氢盐作为碱进行。
相应地，另一方面，本发明提供制备4-(2，6-二氯-苯甲酰氨基)-1H-吡唑 -3-甲酸(1-甲磺酰基-哌啶-4-基)-酰胺的方法，该方法包括使式(II)化合物：

与甲基磺酰氯在极性溶剂中、在选自碱金属碳酸盐和碳酸氢盐的碱存在下 反应；此后分离并任选重结晶由此形成的4-(2，6-二氯-苯甲酰氨基)-1H-吡 唑-3-甲酸(1-甲磺酰基-哌啶-4-基)-酰胺。
所述碱任选是碱金属碳酸氢盐如碳酸氢钠。
极性溶剂可以是水或水和有机溶剂的混合物，优选的极性溶剂如乙酸 乙酯。
与甲磺酰氯的反应可以在0℃至不超过约30℃、更通常约12℃至不 超过约28℃、例如15℃至25℃的温度进行。
最初，式(II)化合物可以作为甲磺酸盐存在于反应混合物中，其可通过 脱保护N-叔丁氧基羰基(boc)保护的化合物(III)而形成。

为了在终产物中最小化或避免存在明显量的boc-保护的中间体(III)， 式(II)化合物可用甲磺酸处理，并加热至50℃或更高的温度(例如80℃或 更高，或90℃或更高，例如95℃至105℃)，随后冷却，与甲磺酰氯反应。
相应地，另一方面，本发明提供制备4-(2，6-二氯-苯甲酰氨基)-1H-吡唑 -3-甲酸(1-甲磺酰基-哌啶-4-基)-酰胺的方法，此方法包括：
(a)使式(III)化合物与甲磺酸在极性溶剂(例如二噁烷)中反应，以除去boc 基团，得到式(II)化合物的甲磺酸盐，

(b)分离此式(II)化合物的甲磺酸盐；
(c)用甲磺酸在极性溶剂(例如水性溶剂如水)中处理式(II)化合物的甲磺酸 盐，以将剩余的痕量化合物(III)转化为化合物(II)；和
(d)使步骤(c)的产物与甲磺酰氯在极性溶剂中、在选自碱金属碳酸盐和碳酸 氢盐的碱存在下反应；此后分离并任选重结晶由此形成的4-(2，6-二氯-苯甲 酰氨基)-1H-吡唑-3-甲酸(1-甲磺酰基-哌啶-4-基)-酰胺。
式(III)化合物可根据我们早先的申请PCT/GB2004/003179(WO 2005/012256)的实施例237中描述的方法或我们早先的申请 PCT/GB2006/000193的实施例1中描述的方法以及如本文实施例中描述的 方法制备。
PCT/GB2006/000193的实施例1中，化合物(III)通过使4-(2，6-二氯- 苯甲酰氨基)-1H-吡唑-3-甲酸与4-氨基-1-叔丁氧基羰基-哌啶在1-乙基 -3-(3’-二甲氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)和1-羟基苯并三唑(HOBt)存在下、在 二甲基甲酰胺(DMF)中反应而形成。
现已发现，不同于使用EDC和HOBt以活化羧酸并促进酰胺键的形 成，可以使4-氨基-1-叔丁氧基羰基-哌啶与4-(2，6-二氯-苯甲酰氨基)-1H-吡 唑-3-甲酸的酰氯反应。
相应地，另一方面，本发明提供制备4-(2，6-二氯-苯甲酰氨基)-1H-吡唑 -3-甲酸(1-甲磺酰基-哌啶-4-基)-酰胺的方法，该方法包括：
(ia)使式(IV)酰氯化合物与式(V)化合物：

在极性溶剂中、在碱(例如非干扰碱如叔胺-例如三乙胺)存在下反应，得到 式(III)化合物：

(a)使式(III)化合物与甲磺酸在极性溶剂(例如二噁烷)中反应，除去boc基 团，得到式(II)化合物的甲磺酸盐，

(b)分离此式(II)化合物的甲磺酸盐；
(c)用甲磺酸在极性溶剂(例如水性溶剂如水)中处理式(II)化合物的甲磺酸 盐，将剩余的痕量化合物(III)转化为化合物(II)；和
(d)使步骤(c)的产物与甲磺酰氯在极性溶剂中、在选自碱金属碳酸盐和碳酸 氢盐的碱存在下反应；此后分离并任选重结晶因此形成的4-(2，6-二氯-苯甲 酰氨基)-1H-吡唑-3-甲酸(1-甲磺酰基-哌啶-4-基)-酰胺。
酰氯(IV)可根据技术人员公知的方法制备，例如通过用亚硫酰氯处理 羧酸，或者通过与草酰氯在催化量的二甲基甲酰胺存在下反应，或者通过 酸的钾盐与草酰氯反应。当使用亚硫酰氯产生酰氯时，与羧酸的反应通常 伴随加热至超过50℃的温度、例如80至100℃、在惰性溶剂如甲苯存在 下进行。
用于制备式(I)化合物的示例性合成路线显示于方案1中。

方案1
另一方面，本发明提供制备4-(2，6-二氯-苯甲酰氨基)-1H-吡唑-3-甲酸 (1-甲磺酰基-哌啶-4-基)-酰胺的方法，此方法包括使式(VI)化合物与2，6- 二氯苯甲酸或其活化衍生物如2，6-二氯苯甲酰氯反应。

与酰氯的反应通常在碱存在下进行，例如非干扰碱如叔胺(例如三乙 胺)。反应通常在溶剂存在下进行，例如卤代溶剂如二氯甲烷，或芳香烃溶 剂如甲苯，或极性非质子溶剂如二噁烷，任选伴轻度加热，例如加热至至 多约60℃的温度，例如至多约45℃。
式(VI)化合物与2，6-二氯苯甲酸反应时，酰胺键形成可通过使用通常用 于形成肽键类型的酰胺偶联试剂进行。这类试剂的实例包括1，3-二环己基 碳二亚胺(DCC)(Sheehan等人，J.Amer.Chem Soc.1955，77，1067)、1-乙基 -3-(3’-二甲氨基丙基)-碳二亚胺(在本文表示为EDC或EDAC，而在本领域 也称为EDCI和WSCDI)(Sheehan等人，J.Org.Chem.，1961，26，2525)、基 于脲鎓的偶联剂如O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基脲鎓六氟磷 酸盐(HATU)和基于鏻的偶联剂如1-苯并-三唑氧基三-(吡咯烷子基)鏻六氟 磷酸盐(PyBOP)(Castro等人，Tetrahedron Letters，1990，31，205)。基于碳 二亚胺的偶联剂方便地与1-羟基-7-氮杂苯并三唑(HOAt)(L.A.Carpino，J. Amer.Chem.Soc.，1993，115，4397)或1-羟基苯并三唑(HOBt)(Konig等人， Chem.Ber.，103，708，2024-2034)联合使用。优选的偶联试剂包括EDC (EDAC)和DCC与HOAt或HOBt联合。
偶联反应通常在非水、非质子溶剂中进行，如乙腈、二噁烷、二甲基 亚砜、二氯甲烷、二甲基甲酰胺或N-甲基吡咯烷，或者在任选与一种或多 种易混合的共溶剂一起的水性溶剂中。反应可在室温或适当升高的温度进 行。反应可在非干扰碱存在下进行，例如叔胺如三乙胺或N，N-二异丙基乙 胺。
通过涉及式(VI)中间体的方法制备式(I)化合物的合成路线在方案2中 说明。

方案2
方案2中，将4-硝基吡唑甲酸(VII)与保护的哌啶胺(VIII)、使用标准 方法偶联，例如通过形成酰氯，然后与胺(VIII)反应，或者通过使用上文所 述类型的酰胺偶联剂，得到酰胺(IX)。通过使用保护基团PG，保护哌啶环 氮以免在反应期间被酸(VII)酰化。
胺-保护基团PG可以是任何已知用于在上述方法中的使用的条件下保 护胺基团的保护基团。保护基团的实例及保护和脱保护官能团的方法可见 于“有机合成中的保护基”(T.Green和P.Wuts；第三版；John Wiley和 Sons，1999)。因此，例如，哌啶环氮可被保护为酰胺(NCO-R)或氨基甲酸 酯(NCO-OR)，例如为：甲基酰胺(NCO-CH3)；苄氧基酰胺(NCO-OCH2C6H5， -NH-Cbz)；叔丁氧基酰胺(-NCO-OC(CH3)3，N-Boc)；2-联苯基-2-丙氧基酰 胺(NCO-OC(CH3)2C6H4C6H5，N-Bpoc)；9-芴甲氧基酰胺(N-Fmoc)、6-硝基 藜芦基氧基酰胺(N-Nvoc)、2-三甲基硅烷基乙氧基酰胺(N-Teoc)、2，2，2-三 氯乙氧基酰胺(N-Troc)、烯丙氧基酰胺(N-Alloc)，或者2-(苯基磺酰基)乙氧 基酰胺(-N-Psec)。胺的其它保护基团包括甲苯磺酰基(甲苯磺酰基)和甲磺 酰基(甲磺酰基)基团和苄基基团如对-甲氧苄基(PMB)基团。优选的胺保护 基团是氨基甲酸酯(NCO-OR)，例如苄氧基酰胺(NCO-OCH2C6H5， -NH-Cbz)或叔丁氧基酰胺(-NCO-OC(CH3)3，N-boc)；烯丙氧基酰胺 (N-Alloc)或对-甲氧苄基(PMB)基团。特别优选的保护基团PG是叔丁氧基 羰基(boc)。
下一步骤中，将保护基团PG从酰胺(IX)除去，对boc基团而言使用 酸性条件如用氯化氢或盐酸在极性溶剂如二噁烷或乙酸乙酯中处理，得到 哌啶化合物(X)。
除去保护基团PG后，使用甲磺酰氯在非干扰碱如叔胺(例如三乙胺) 存在下将哌啶环氮原子甲磺酰化，得到硝基-化合物(XI)。甲磺酰化反应通 常在极性非质子溶剂(如乙腈或二噁烷或二氯甲烷或其混合物)中、在适度 的温度例如室温或伴温和加热例如至多约40至50℃进行。
然后，式(XI)化合物中的硝基基团可通过使用氢在催化剂如披钯碳存 在下催化氢化而还原为氨基基团，得到氨基化合物(VI)，然后使其在上述 条件下与2，6-二氯苯甲酸或2，6-二氯苯甲酰氯反应，得到式(I)化合物。
制备式(I)化合物的另外的方法包括使式(XII)的羧酸：

或其活化的衍生物如酰氯(即上述化合物(IV)，与式(XIII)化合物反应：

反应可在上文所述的酰胺偶联条件下进行，例如使用EDC和HOBt作为 酰胺偶联试剂在极性溶剂如DMF中、在非干扰碱如三乙胺存在下进行。
化合物(XIII)及其盐酸盐可商购获得，或者化合物(XIII)可通过下文方 案3中所示的反应序列制备。

方案3
方案3中，使4-哌啶酮一水合物与甲磺酰氯在非干扰碱如三乙胺存在 下、在极性溶剂如DMF中反应，通常伴加热至非极端温度，例如40至50℃。
步骤2中，使用苄胺在三乙酰氧基硼氢化钠存在下对甲磺酰基哌啶酮 中的羰基基团进行还原氨基化。然后，苄基基团可通过公知的方法除去， 例如在Pd/C催化剂存在下氢化，得到所需化合物(XIII)。
新药物制剂
本发明的化合物具有良好的口服生物利用度，但此口服生物利用度可 通过其配制方法提高。
本发明提供改进的药物制剂，其快速分解以释放微细固溶体形式的本 发明化合物，其中其被容易地吸收。
相应地，另一方面，本发明提供固体药物组合物，其包含以下的压制 混合物：
(a)4-(2，6-二氯-苯甲酰氨基)-1H-吡唑-3-甲酸(1-甲磺酰基-哌啶-4-基)-酰胺 在聚乙烯吡咯烷酮中的固体分散体；
(b)固体稀释剂；和
(c)崩解剂；和任选地
(d)一种或多种另外的药学上可接受的赋形剂。
固体药物组合物通常以片剂或胶囊剂形式呈现。
一个实施方式中，固体药物组合物为片剂形式。
另一个实施方式中，固体药物组合物为包衣或未包衣的片剂形式。
另一个实施方式中，固体药物组合物为胶囊形式。
另一个实施方式中，固体药物组合物为胶囊形式，其可以是硬明胶或 HPMC胶囊或软明胶胶囊，特别地其是硬明胶胶囊。
固体分散体(a)含有分散在聚乙烯吡咯烷酮(PVP)中的4-(2，6-二氯-苯甲 酰氨基)-1H-吡唑-3-甲酸(1-甲磺酰基-哌啶-4-基)-酰胺。分散可采取固溶体 的形式，或者可以由作为微细固体分散在PVP环境基质中的本发明化合物 组成。
可用一定分子量范围内的PVP，且用于本发明制剂的具体等级的PVP 具有的分子量为44,000-54,000。
固体分散体通常含有本发明的化合物和PVP，其重量比为约1:1至约 1:6，更通常为1:2至1:4，例如1:3的比例。
固体分散体可如下制备：将本发明化合物和PVP溶解于普通溶剂(例 如选自以下的溶剂：氯仿、二氯甲烷、甲醇和乙醇及其混合物(例如比例为 1:1的二氯甲烷/乙醇))中，然后除去溶剂，例如在旋转蒸发仪中或通过喷雾 干燥，尤其是通过喷雾干燥得到的溶液。
经喷雾干燥的固体分散体本身通常具有非常低的密度，且固体稀释剂 有助于增加组合物的密度，使其易于压制。固体稀释剂通常是药理学上惰 性的固体物质，选自糖类或糖醇类，例如乳糖、蔗糖、山梨醇或甘露醇； 和非糖衍生的稀释剂如碳酸钠、磷酸钙、碳酸钙，和纤维素或其衍生物如 甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素，和淀粉类如玉米淀粉。一 种另外的纤维素或纤维素衍生物是如下文所讨论的微晶纤维素。
具体的稀释剂是乳糖和磷酸钙。特别地，稀释剂是磷酸氢钙。
崩解剂是与水接触时快速膨胀以便引起药物组合物快速崩解并释放本 发明化合物的物质。
具体的崩解剂是那些本领域称为“超级崩解剂”的崩解剂，并且包括 交联羧甲基纤维素(交联羧甲纤维素，也称为交联羧甲基纤维素钠)、交联 聚乙烯吡咯烷酮(交联PVP或交聚维酮)和羟基乙酸淀粉钠。优选的超级崩 解剂的实例是交联羧甲纤维素和羟基乙酸淀粉钠。
可包括在本发明药物组合物中的其它药学上可接受的赋形剂(d)的实 例包括微晶纤维素，其可同时用作稀释剂和辅助崩解剂。硅化的微晶纤维 素(其含有约1-3％二氧化硅，通常约2％二氧化硅)也可用于提高组合物的 流动性，并由此改善组合物可被压制的容易度。
可包括在压制混合物中的另一种药学上可接受的赋形剂(d)是碱金属 碳酸氢盐如碳酸氢钠。碳酸氢盐在胃中与酸反应，释放二氧化碳，从而促 进药物组合物更快速的崩解。
可包括在本发明药物组合物中的其他药学上可接受的赋形剂(d)的另 一种实例包括润滑剂，如硬脂酸镁(例如0.1-2％)或硬脂酰富马酸钠(例如 0.1-5％)，可将其加入以帮助压制和封装过程。
成分(a)至(d)的一种具体混合物是以下混合物，其中：
·成分(a)是4-(2，6-二氯-苯甲酰氨基)-1H-吡唑-3-甲酸(1-甲磺酰基-哌啶 -4-基)-酰胺在PVP中的经喷雾干燥的固体分散体，其比例为1:3；
·成分(b)是磷酸钙；
·成分(c)是交联羧甲纤维素；和
·成分(d)是硅化的微晶纤维素。
特别地，成分(a)至(d)的混合物是以下混合物，其中：
·成分(a)是4-(2，6-二氯-苯甲酰氨基)-1H-吡唑-3-甲酸(1-甲磺酰基-哌啶 -4-基)-酰胺在PVP中的经喷雾干燥的固体分散体，其比例为1:3；
·成分(b)是磷酸氢钙；
·成分(c)是交联羧甲基纤维素钠；和
·成分(d)是硅化的微晶纤维素。
将成分(a)至(c)和任选(d)的混合物压制，然后处理，得到最终剂型。因 此，例如，其可被压制，得到压制的固体物块(例如以带状物或小丸的形式)， 然后研磨，形成所需粒子大小的颗粒。然后，颗粒可被填装入胶囊中，或 成形并压制形成片剂。
成分(a)至(c)和任选(d)的混合物可通过技术人员公知的各种方法压制。 例如，它们可使用滚筒碾压机压制以形成带状物，然后其可被打碎和研磨 以形成颗粒。或者，它们可使用压片机压制成为预压片(slug)，其可被打碎 和研磨以形成颗粒。
一个实施方式中，本发明提供胶囊形式的药物组合物，其含有如本文 定义的成分(a)至(c)和任选(d)的经研磨压制的混合物。
另一个实施方式中，本发明提供片剂形式的药物组合物，其含有如本 文定义的成分(a)至(c)和任选(d)的经压制的混合物。
本发明的一方面是固体药物组合物，其包含以下的压制混合物：
(a)4-(2，6-二氯-苯甲酰氨基)-1H-吡唑-3-甲酸(1-甲磺酰基-哌啶-4-基)-酰胺 在聚乙烯吡咯烷酮中的固体分散体；
(b)固体稀释剂；和
(c)崩解剂；和任选
(d)一种或多种另外的药学上可接受的赋形剂。
药物组合物中的固体分散体(a)通常构成10-70％w/w的组合物的总重 量。例如，固体分散体可构成20-60％w/w，或25-55％，或30-50％，或 25-40％w/w的组合物。
组合物中含有的赋形剂(b)的量可以是5-95％，尤其是10-70％w/w，特 别是20-60％或30-40％，例如33-36％。化合物/PVP和赋形剂(b)的比例通 常为5:1至1:5，尤其是2:1或1:1的重量比。
组合物中含有的赋形剂(c)的量可以是1-30％w/w，尤其是5-25％，例 如10-25％如12-20％。化合物/PVP和赋形剂(c)的比例通常是5:1至1:5， 尤其是3:1或2:1的重量比。
当存在时，组合物中含有的赋形剂(d)的量可以是0.1-20％，尤其是 1-20％w/w，特别是5-15％，例如11或12％。化合物/PVP和(d)的比例通 常是5:1至1:5，尤其是3:1或2:1的重量比。
相应地，另一方面，本发明提供固体药物组合物，其包含以下的压制 混合物：
(a)10-70％w/w的4-(2，6-二氯-苯甲酰氨基)-1H-吡唑-3-甲酸(1-甲磺酰基-哌 啶-4-基)-酰胺在聚乙烯吡咯烷酮中的固体分散体；
(b)10-70％w/w的固体稀释剂；和
(c)1-20％w/w的崩解剂；和任选
(d)1-30％w/w的一种或多种另外的药学上可接受的赋形剂。
应当理解，对于各组合物，各个成分(a)、(b)、(c)和(d)的重量百分比 的和将总计达到100％。
一个实施方式中，稀释剂(b)(例如磷酸二钙)包含30-40重量％的药物 组合物总重量。
一个实施方式中，药物组合物包含10-30％崩解剂(c)，尤其是所述崩 解剂是交联羧甲基纤维素钠时。另一个实施方式中，药物组合物包含 10-20％、例如12％交联羧甲基纤维素钠掺入组合物中，并另外包含5-20％ wt、例如10％wt交联羧甲基纤维素钠与经掺合的组合物混合。
一个实施方式中，药物组合物包含10-20％一种或多种另外的药学上可 接受的赋形剂。一个实施方式中，另外的药学上可接受的赋形剂是10-20％ 硅化微晶纤维素。
一个实施方式中，(a)和赋形剂(b)的比例为约1:1。另一个实施方式中， 当存在时，赋形剂(c)和(d)的比例为约1:1。在一个具体的实施方式中，组 合物中所有成分((a):(b):(c):(d))的比例为约3-4:3-4:1-2:1-2，例如 3.9:3.6:1.2:1.2。
生物活性
式(I)化合物，即4-(2，6-二氯-苯甲酰氨基)-1H-吡唑-3-甲酸(1-甲磺酰基- 哌啶-4-基)-酰胺，是细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂。例如，式(I)化合物 是选自CDK1、CDK2、CDK3、CDK4、CDK5、CDK6和CDK9且更具 体地选自CDK1、CDK2、CDK3、CDK4、CDK5和CDK9的细胞周期蛋 白依赖性激酶的抑制剂。
式(I)化合物也对糖原合酶激酶-3(GSK-3)具有活性。
由于它们在调节或抑制CDK和糖原合酶激酶中的活性，式(I)化合物 将可用于提供在异常分裂细胞中阻遏细胞周期或恢复对细胞周期控制的手 段。因此，将证明此化合物可用于治疗或预防增殖性障碍如癌症。本发明 的化合物还将可用于治疗如以下的病症：病毒感染、II型或非胰岛素依赖 型糖尿病、自身免疫性疾病、头部损伤、中风、癫痫、神经变性疾病如阿 尔茨海默病、运动神经元疾病、进行性核上麻痹、皮质基底节变性和皮克 氏病，例如自身免疫性疾病和神经变性疾病。
本发明化合物在其中有用的疾病状态和病症亚组由病毒感染、自身免 疫性疾病和神经变性疾病组成。
CDK在调控细胞周期、细胞凋亡、转录、分化和CNS功能中发挥作 用。因此，CDK抑制剂可用于治疗其中存在增殖、细胞凋亡或分化障碍的 疾病如癌症。特别是RB+ve肿瘤可对CDK抑制剂特别敏感。RB-ve肿瘤 也可对CDK抑制剂敏感。
可被抑制的癌症的实例包括但不限于：癌，例如膀胱癌、乳腺癌、结 肠癌(例如结肠直肠癌如结肠腺癌和结肠腺瘤)、肾癌、表皮癌、肝癌、肺 癌、例如腺癌、小细胞肺癌和非小细胞肺癌、食道癌、胆囊癌、卵巢癌、 胰腺癌例如外分泌胰腺癌(exocrine pancreatic carcinoma)、胃癌、宫颈癌、 甲状腺癌、前列腺癌或皮肤癌，例如鳞状细胞癌；淋巴谱系(lymphoid lineage)的造血系统肿瘤，例如白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细 胞白血病、B-细胞淋巴瘤(如弥散性大B细胞淋巴瘤)、T-细胞淋巴瘤、霍 奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、毛细胞淋巴瘤(hairy cell lymphoma)或伯基 特淋巴瘤；骨髓谱系的(myeloid lineage)造血系统肿瘤，例如急性和慢性髓 性白血病、骨髓发育不良综合征或早幼粒细胞白血病；甲状腺滤泡状癌； 间质起源的肿瘤，例如纤维肉瘤或横纹肌肉瘤；中枢或外周神经系统的肿 瘤，例如星形细胞瘤、成神经细胞瘤、神经胶质瘤或神经鞘瘤；黑素瘤； 精原细胞瘤；畸胎癌；骨肉瘤；着色性干皮样病；角化棘皮瘤；甲状腺滤 泡状癌；或卡波西肉瘤。
癌症可以是对任何一种或多种选自CDK1、CDK2、CDK3、CDK4、 CDK5和CDK6的细胞周期蛋白依赖性激酶、例如一种或多种选自CDK1、 CDK2、CDK4和CDK5的CDK激酶、例如CDK和/或CDK2的抑制敏 感的癌症。
可以利用下文实施例中给出的细胞生长测定法或标题为“诊断方法” 的部分中给出的方法来确定一种特定的癌症是否是对细胞周期蛋白依赖性 激酶的抑制敏感的癌症。
还已知CDK在细胞凋亡、增殖、分化和转录中发挥作用，因此CDK 抑制剂还可用于治疗癌症以外的下列疾病：病毒感染，例如疱疹病毒、痘 病毒、Epstein-Barr病毒、Sandbis病毒、腺病毒、HIV、HPV、HCV和 HCMV；在HIV-感染个体中预防AIDS发生；慢性炎性疾病，例如系统性 红斑狼疮、自身免疫介导的肾小球肾炎、类风湿性关节炎、银屑病、炎症 性肠病和自身免疫性糖尿病；心血管疾病，例如心脏肥大、再狭窄、动脉 粥样硬化；神经变性疾病，例如阿尔茨海默病、AIDS相关性痴呆、帕金 森病、肌萎缩性侧索硬化、色素性视网膜炎、脊髓性肌萎缩和小脑变性； 肾小球肾炎；骨髓增生异常综合征、与心肌梗死有关的缺血性损伤、中风 和再灌注损伤、心律失常、动脉粥样硬化、毒素-诱发的或与酒精有关的肝 病、血液学疾病，例如慢性贫血和再生障碍性贫血；肌肉骨骼系统的变性 疾病，例如骨质疏松和关节炎、阿司匹林敏感性鼻窦炎、囊性纤维化、多 发性硬化、肾脏疾病和癌症疼痛。
还已经发现一些细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂可与其它抗癌剂组合 使用。例如，细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂夫拉平度已经与其它抗癌剂 一起用于组合治疗。
因此，在本发明的用于治疗包括异常细胞生长的疾病或病症的药物组 合物、用途或方法中，包括异常细胞生长的疾病或病症在一个实施方式中 是癌症。
一组癌症包括人乳腺癌(例如原发性乳腺癌、淋巴结阴性(node-negtice) 乳腺癌、乳腺浸润性导管腺癌、非子宫内膜样(non-endometrioid)乳腺癌； 和套细胞淋巴瘤。另外，其它癌症是结肠直肠癌和子宫内膜癌。
癌症的另一个亚组包括淋巴谱系的造血系统肿瘤，例如白血病、慢性 淋巴细胞白血病、套细胞淋巴瘤和B-细胞淋巴瘤(如弥漫性大B细胞淋巴 瘤)。
一种具体的癌症是慢性淋巴细胞白血病。
另一种具体的癌症是套细胞淋巴瘤。
另一种具体的癌症是弥漫性大B细胞淋巴瘤。
癌症的另一个亚组包括乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、前列腺癌、食道癌、 鳞状细胞癌和非小细胞肺癌。
可以用下文实施例中给出的测定法来测量本发明化合物作为细胞周期 蛋白依赖性激酶和糖原合酶激酶-3的抑制剂的活性，并且给出化合物所表 现出的活性水平可以用IC50值来定义。
本发明化合物的优点
化合物4-(2，6-二氯-苯甲酰氨基)-1H-吡唑-3-甲酸(1-甲磺酰基-哌啶-4- 基)-酰胺具有超过现有技术化合物的优点。
本发明的化合物具有适于口服暴露的理化性质。
本发明的化合物在HCT-116细胞中具有的转录IC50高于增殖IC50； 因此，例如，转录IC50较增殖IC50高～100-倍。这是有益的，因为化合物 可被更好的耐受，因此使其可以以较高水平、较长期的给药。
特别地，相对于现有技术化合物，式(I)化合物显示改善的口服生物利 用度。口服生物领用度可被定义为通过口服途径给药时化合物的血浆暴露 与通过静脉途径(i.v.)给药时化合物的血浆暴露的比例(F)，以百分数表述。
口服生物利用度(F值)大于30％、更优选大于40％的化合物是特别有 利的，因为它们可以口服施用而不是或也可以通过胃肠外施用。化合物 4-(2，6-二氯-苯甲酰氨基)-1H-吡唑-3-甲酸(1-甲磺酰基-哌啶-4-基)-酰胺当通 过口服途径对小鼠施用时，具有30-100％的生物利用度，尤其是40-50％ 的生物利用度。
化合物4-(2，6-二氯-苯甲酰氨基)-1H-吡唑-3-甲酸(1-甲磺酰基-哌啶-4- 基)-酰胺具有更高的体外激酶(CDK2)抑制活性，更有效的抗癌细胞系增殖 的效应。另外，该化合物对GSK3β具有较低的活性，对CDK2较GSK3β 更有选择性。因此，化合物的作用通过CDK抑制经细胞周期效应来支配， 不因GSK3β对例如胰岛素敏感度、生长因子作用的抑制的附加结果而变 复杂。因此，化合物具有更纯粹的细胞周期抑制特征和较少的经由GSK3β 的附加效应的副作用。化合物4-(2，6-二氯-苯甲酰氨基)-1H-吡唑-3-甲酸(1- 甲磺酰基-哌啶-4-基)-酰胺与其2，6-二氟苯甲酰氨基类似物的生物学性质比 较在下文实施例12中阐述。
可以用下文实施例中阐述的测定法来测量本发明化合物作为细胞周期 蛋白依赖性激酶和糖原合酶激酶-3抑制剂的活性，所表现出的活性水平可 以用IC50值来定义。
因此，例如，本发明的化合物将可用于减少或降低癌症的发生率。
相应地，本发明尤其还提供了：
·如本文所定义的基本呈结晶形式的4-(2，6-二氯-苯甲酰氨基)-1H-吡唑 -3-甲酸(1-甲磺酰基-哌啶-4-基)-酰胺，其用于预防或治疗由细胞周期 蛋白依赖性激酶或糖原合酶激酶-3(优选细胞周期蛋白依赖性激酶)介 导的疾病状态或病症。
·如本文所定义的基本呈结晶形式的4-(2，6-二氯-苯甲酰氨基)-1H-吡唑 -3-甲酸(1-甲磺酰基-哌啶-4-基)-酰胺，其用于抑制哺乳动物中的肿瘤 生长。
·如本文所定义的基本呈结晶形式的4-(2，6-二氯-苯甲酰氨基)-1H-吡唑 -3-甲酸(1-甲磺酰基-哌啶-4-基)-酰胺，其用于抑制肿瘤细胞(例如哺乳 动物中)的生长。
·用于预防或治疗由细胞周期蛋白依赖性激酶或糖原合酶激酶-3(优选 细胞周期蛋白依赖性激酶)介导的疾病状态或病症的方法，该方法包 括对有需要的对象施用如本文所定义的基本呈结晶形式的4-(2，6-二 氯-苯甲酰氨基)-1H-吡唑-3-甲酸(1-甲磺酰基-哌啶-4-基)-酰胺。
·抑制哺乳动物(例如人)中的肿瘤生长的方法，该方法包括对哺乳动物 (例如人)施用有效抑制肿瘤生长量的如本文所定义的基本呈结晶形式 的4-(2，6-二氯-苯甲酰氨基)-1H-吡唑-3-甲酸(1-甲磺酰基-哌啶-4-基)- 酰胺。
·抑制肿瘤细胞(例如存在于哺乳动物如人中的肿瘤细胞)生长的方法， 该方法包括使所述肿瘤细胞与有效抑制肿瘤细胞生长量的如本文所 定义的基本呈结晶形式的4-(2，6-二氯-苯甲酰氨基)-1H-吡唑-3-甲酸 (1-甲磺酰基-哌啶-4-基)-酰胺接触。
·用于减少或降低由细胞周期蛋白依赖性激酶或糖原合酶激酶-3(优选 细胞周期蛋白依赖性激酶)介导的疾病状态或病症的发病率的方法， 该方法包括对有需要的对象施用如本文所定义的基本呈结晶形式的 4-(2，6-二氯-苯甲酰氨基)-1H-吡唑-3-甲酸(1-甲磺酰基-哌啶-4-基)-酰 胺。
·用于在哺乳动物中治疗包含异常细胞生长或由其引起的疾病或病症 的方法，该方法包括对所述哺乳动物施用有效抑制异常细胞生长量的 如本文所定义的基本呈结晶形式的4-(2，6-二氯-苯甲酰氨基)-1H-吡唑 -3-甲酸(1-甲磺酰基-哌啶-4-基)-酰胺。
·用于在哺乳动物中减少或降低包含异常细胞生长或由其引起的疾病 或病症的发病率的方法，该方法包括对所述哺乳动物施用有效抑制异 常细胞生长量的如本文所定义的基本呈结晶形式的4-(2，6-二氯-苯甲 酰氨基)-1H-吡唑-3-甲酸(1-甲磺酰基-哌啶-4-基)-酰胺。
·用于在哺乳动物中治疗包含异常细胞生长或由其引起的疾病或病症 的方法，该方法包括对所述哺乳动物施用有效抑制cdk激酶(如cdk1 或cdk2)或糖原合酶激酶-3活性量的如本文所定义的基本呈结晶形式 的4-(2，6-二氯-苯甲酰氨基)-1H-吡唑-3-甲酸(1-甲磺酰基-哌啶-4-基)- 酰胺。
·用于在哺乳动物中减少或降低包含异常细胞生长或由其引起的疾病 或病症的发病率的方法，该方法包括对所述哺乳动物施用有效抑制 cdk激酶(如cdk1或cdk2)或糖原合酶激酶-3活性量的如本文所定义 的基本呈结晶形式的4-(2，6-二氯-苯甲酰氨基)-1H-吡唑-3-甲酸(1-甲 磺酰基-哌啶-4-基)-酰胺。
·抑制细胞周期蛋白依赖性激酶或糖原合酶激酶-3的方法，该方法包括 使所述激酶与如本文所定义的基本呈结晶形式的4-(2，6-二氯-苯甲酰 氨基)-1H-吡唑-3-甲酸(1-甲磺酰基-哌啶-4-基)-酰胺接触。
·通过抑制细胞周期蛋白依赖性激酶或糖原合酶激酶-3(优选细胞周期 蛋白依赖性激酶)的活性调节细胞过程(例如细胞分裂)的方法，其使用 如本文所定义的基本呈结晶形式的4-(2，6-二氯-苯甲酰氨基)-1H-吡唑 -3-甲酸(1-甲磺酰基-哌啶-4-基)-酰胺。
·如本文所定义的基本呈结晶形式的4-(2，6-二氯-苯甲酰氨基)-1H-吡唑 -3-甲酸(1-甲磺酰基-哌啶-4-基)-酰胺，其用于预防或治疗本文所述的 疾病状态。
·如本文所定义的基本呈结晶形式的4-(2，6-二氯-苯甲酰氨基)-1H-吡唑 -3-甲酸(1-甲磺酰基-哌啶-4-基)-酰胺在制备药物中的用途，其中所述 药物用于本文所定义的任何一种或多种用途。
·药物组合物，包含如本文所定义的基本呈结晶形式的4-(2，6-二氯-苯 甲酰氨基)-1H-吡唑-3-甲酸(1-甲磺酰基-哌啶-4-基)-酰胺和药学上可 接受的载体。
·如本文所定义的基本呈结晶形式的4-(2，6-二氯-苯甲酰氨基)-1H-吡唑 -3-甲酸(1-甲磺酰基-哌啶-4-基)-酰胺，其用于药物中。
·如本文所定义的基本呈结晶形式的4-(2，6-二氯-苯甲酰氨基)-1H-吡唑 -3-甲酸(1-甲磺酰基-哌啶-4-基)-酰胺，其用于上文阐述的和本文其它 地方描述的任何一种用途和方法。
·用于诊断和治疗由细胞周期蛋白依赖性激酶介导的疾病状态或病症 的方法，该方法包括(i)筛选患者以确定该患者正在患有或可能患有的 疾病或病症是否是对用具有抗细胞周期蛋白依赖性激酶活性的化合 物的治疗敏感的疾病或病症；和(ii)在因此显示患者的疾病或病症是 敏感的情况下，然后对患者施用如本文所定义的基本呈结晶形式的 4-(2，6-二氯-苯甲酰氨基)-1H-吡唑-3-甲酸(1-甲磺酰基-哌啶-4-基)-酰 胺。
·如本文所定义的基本呈结晶形式的4-(2，6-二氯-苯甲酰氨基)-1H-吡唑 -3-甲酸(1-甲磺酰基-哌啶-4-基)-酰胺在制备药物中的用途，所述药物 用于在已经被筛选并且已经被确定患有疾病或病症或者存在罹患疾 病或病症风险的患者中治疗或预防疾病状态或病症，所述疾病或病症 对用具有抗细胞周期蛋白依赖性激酶活性的化合物的治疗敏感。
本申请中，除非上下文另外指出，提及的式(I)化合物包括本文所定义 的式(I)的所有亚组，并且术语“亚组”包括本文所定义的所有优选项、实 施方式、实例和具体化合物。除非上下文另外要求，任何提及的本文的式 (I)还将用于提及式(I)之内的任何亚组化合物以及其任何优选项和实例。
如本文使用的用于细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)和糖原合酶激酶 (GSK，例如GSK-3)活性的术语“调节”旨在定义激酶生物学活性水平的 变化。因此，调节包括实现相关激酶活性增加或降低的生理学变化。在后 者的情况下，可以将调节描述为“抑制”。调节可以直接或间接发生，可 以由任何机理且在任何生理学水平上介导，包括例如在基因表达(包括例如 转录、翻译和/或翻译后修饰)水平上、在编码直接或间接作用于细胞周期 蛋白依赖性激酶(CDK)和/或糖原合酶激酶-3(GSK-3)活性水平的调控元素 的基因的表达水平上或在酶(例如细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)和/或糖 原合酶激酶-3(GSK-3))活性水平上介导(例如由变构机理、竞争抑制、活性 位点灭活、反馈抑制通路干扰等介导)。因此，调节可以表示细胞周期蛋白 依赖性激酶(CDK)和/或糖原合酶激酶-3(GSK-3)的升高的/或抑制的表达或 者超-或低-表达，包括基因扩增(即多基因拷贝)，和/或转录作用引起的增 加或减少的表达，以及突变引起的细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)和/或糖 原合酶激酶-3(GSK-3)的高-(或低-)活性和(灭活)活化(包括(灭活)活化)。术 语“调节的”和“调节”应做相应解释。
如本文使用的术语“介导的”、例如与本文所述的细胞周期蛋白依赖 性激酶(CDK)和/或糖原合酶激酶-3(GSK-3)结合使用(和用于例如各种生理 学过程、疾病、状态、病症、治疗、处理或干预)的该术语旨在起限制性作 用，以便使用该术语的各种过程、疾病、状态、病症、处理和干预是其中 细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)和/或糖原合酶激酶-3(GSK-3)发挥生物学 作用的那些。在该术语用于疾病、状态或病症的情况下，细胞周期蛋白依 赖性激酶(CDK)和/或糖原合酶激酶-3(GSK-3)所发挥的生物学作用可以是 直接或间接的，且对于疾病、状态或病症的症状表现(或其病因学或进展) 而言可以是必要的和/或充分的。因此，细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)和 /或糖原合酶激酶-3(GSK-3)活性(且特别是异常水平的细胞周期蛋白依赖性 激酶(CDK)和/或糖原合酶激酶-3(GSK-3)活性，例如细胞周期蛋白依赖性 激酶(CDK)和/或糖原合酶激酶-3(GSK-3)超表达)无需必需是疾病、状态或 病症的近端原因：而是认为CDK-和/或GSK-(例如GSK-3-)介导的疾病、 状态或病症包括其中仅部分涉及CDK和/或GSK-3的具有多因素病因和复 合进展的那些疾病、状态或病症。在该术语用于治疗、预防或干预的情况 下(例如在本发明的“CDK-介导的治疗”和“GSK-3-介导的预防”中)， CDK和/或GSK-3所发挥的作用可以是直接或间接的，且对于治疗、预防 或干预的结果而言可以是必要的和/或充分的。因此，如本文所述的由细胞 周期蛋白依赖性激酶(CDK)和/或糖原合酶激酶-3(GSK-3)介导的疾病状态 或病症包括作为对任何具体癌症药物或治疗产生耐受的结果出现的疾病状 态或病症(尤其包括对一种或多种本文所述的辅助化合物耐受)。
药物制剂
虽然如本文所定义的基本呈晶体的4-(2，6-二氯-苯甲酰氨基)-1H-吡唑 -3-甲酸(1-甲磺酰基-哌啶-4-基)-酰胺或者通过发明的新方法制备的4-(2，6- 二氯-苯甲酰氨基)-1H-吡唑-3-甲酸(1-甲磺酰基-哌啶-4-基)-酰胺可能单独 施用，但是优选以药物组合物(例如制剂)的形式呈现化合物。
药物组合物的具体实例在上文标题为“新药物制剂”的章节中描述。 然而，更概括而言，化合物4-(2，6-二氯-苯甲酰氨基)-1H-吡唑-3-甲酸(1-甲 磺酰基-哌啶-4-基)-酰胺可以与一种或多种药学上可接受的载体、辅剂、赋 形剂、稀释剂、填充剂、缓冲剂、稳定剂、防腐剂、润滑剂或本领域技术 人员熟知的其它物质一起配制在药物组合物中。该组合物还可包含其它治 疗或预防性活性剂，例如减少或减轻一些与化疗有关的副作用的活性剂。 这类活性剂的具体实例包括止吐剂和预防或减少与化疗相关的中性白细胞 减少的持续时间和预防起因于血红细胞或白细胞水平降低的并发症的活性 剂，例如促红细胞生成素(EPO)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF) 和粒细胞集落刺激因子(G-CSF)。
因此，本发明进一步提供了如上所定义的药物组合物和制备药物组合 物的方法，其包括将本发明的化合物例如基本呈结晶形式的化合物4-(2，6- 二氯-苯甲酰氨基)-1H-吡唑-3-甲酸(1-甲磺酰基-哌啶-4-基)-酰胺与本文所 述的一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂、缓冲剂、辅剂、稳定剂或 其它物质相混合。
如本文所用的术语“药学上可接受的”涉及在合理医学判断范围内适 合用于与对象(例如人)的组织接触而不产生过度的毒性、刺激、变态反应 或其它问题或并发症、具有合理的益处/风险比的化合物、物质、组合物和 /或剂型。每种载体、赋形剂等还必须在与制剂中的其它成分相容的意义上 是“可接受的”。
相应地，另一方面，本发明提供基本呈结晶形式的化合物4-(2，6-二氯- 苯甲酰氨基)-1H-吡唑-3-甲酸(1-甲磺酰基-哌啶-4-基)-酰胺，其为药物组合 物形式，即固体或半固体剂型。
药物组合物可以是任何适于口服、胃肠外、局部、鼻内、眼、耳、直 肠、阴道内或透皮施用的形式。在组合物用于胃肠外施用的情况下，它们 可被配制用于静脉内、肌内、腹膜内、皮下施用或通过注射、输注或其它 递送手段直接递送至靶器官或组织。递送可通过快速浓注、短期输注或长 期输注来实现，且可经由被动递送或通过利用合适的输注泵来实现。
适合于胃肠外施用的药物制剂包括水性和非水性无菌注射液，其可含 有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、共溶剂、表面活性剂、有机溶剂混合物、 环糊精络合剂、乳化剂(用于形成和稳定乳剂)、用于形成脂质体的脂质体 成分、用于形成聚合凝胶的可凝胶化聚合物、冷冻干燥保护剂和尤其是用 于稳定可溶形式的活性成分并使制剂与预期接受者的血液等张的活性剂组 合。用于胃肠外施用的药物制剂也可采用水性和非水性无菌混悬液的形式， 其可包括助悬剂和增稠剂(R.G.Strickly，“口服和注射制剂中的增溶赋形 剂”，Pharmaceutical Research，Vol 21(2)2004，201-230)。
如果药物的pKa与制剂的pH值差距足够大，则可通过调整pH使可电离 的药物分子溶解达到所需浓度。对于静脉内和肌内施用，可接受的范围为 pH2-12，但是对于皮下施用，可接受的范围为pH2.7-9.0。溶液pH通过药 物的盐形式、强酸/碱如盐酸或氢氧化钠或通过缓冲溶液控制，所述溶液包 括但不限于由甘氨酸、柠檬酸盐、乙酸盐、马来酸盐、琥珀酸盐、组氨酸、 磷酸盐、三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)或碳酸盐形成的缓冲溶液。
在注射制剂中常使用水性溶液和水溶性有机溶剂/表面活性剂(即共溶 剂)的组合。用在注射制剂中的水溶性有机溶剂和表面活性剂包括但不限于 丙二醇、乙醇、聚乙二醇300、聚乙二醇400、甘油、二甲基乙酰胺(DMA)、 N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP；Pharmasolve)、二甲亚砜(DMSO)、Solutol HS 15、Cremophor EL、Cremophor RH 60和聚山梨酯80。这类制剂通常可 以但不总是在注射之前被稀释。
丙二醇、PEG 300、乙醇、Cremophor EL、Cremophor RH 60和聚山 梨酯80是用在可商购获得的注射制剂中的完全可与水混溶的有机溶剂和表 面活性剂，且可以彼此组合使用。所得有机制剂通常在静脉内快速浓注或静 脉内输注前稀释至少2倍。
或者，可通过与环糊精的分子络合而达到增加的水溶性。
脂质体是由外层的脂类双层膜和内层的水性核心组成的且具有 <100μm的总直径的封闭球形小泡。根据疏水性程度，如果药物被封入或 嵌入脂质体内，适度疏水性的药物可被脂质体溶解。疏水性药物也可被脂 质体溶解，如果药物分子变成脂类双层膜的一部分，在此情况下，疏水性 药物被溶解在脂类双层的脂类部分中。通常的脂质体制剂含有水及 -5-20mg/ml的磷脂、等张剂(isotonicifier)、pH5-8缓冲液，并任选含有胆 固醇。
制剂可以存在于单位剂量或多剂量容器例如密封的安瓿、小瓶和预装 注射器中，并且可以储存于冷冻干燥(冻干)条件下，只需在使用前即刻加 入无菌液体载体例如注射用水。
药物制剂可通过冷冻干燥本发明的化合物来制备。冷冻干燥指的是冷 冻干燥组合物的操作方法。因此，冻干和冷冻干燥在本文中用作同义词。 通常的方法是将化合物溶解并将所得制剂澄清、无菌过滤并在无菌条件下 转入适于冷冻干燥的容器(例如小瓶)中。在小瓶的情况下，它们被冻干塞 部分地塞住。可将制剂冷却到冰冻并在标准条件下进行冷冻干燥，然后密 封加盖以形成稳定的干燥的亲液制剂。组合物通常具有低的残余水含量， 例如基于亲液物的重量小于5重量％，例如小于1重量％。
冷冻干燥制剂可含有其它赋形剂，例如增稠剂、分散剂、缓冲剂、抗 氧化剂、防腐剂和张力调节剂。通常的缓冲剂包括磷酸盐、乙酸盐、柠檬 酸盐和甘氨酸。抗氧化剂的实例包括抗坏血酸、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、 单硫代甘油、硫脲、丁基化羟基甲苯、丁基化羟基苯甲醚和乙二胺四乙酸 盐。防腐剂可包括苯甲酸和其盐、山梨酸和其盐、对-羟基苯甲酸的烷基酯、 苯酚、氯丁醇、苄醇、乙基汞硫代水杨酸钠、苯扎氯铵和氯化十六烷基吡 啶鎓。如果必要，前述缓冲剂以及葡萄糖和氯化钠可用于张力调节。
填充剂一般用于冷冻干燥技术中以帮助加工和/或提供冷冻干燥块的 体积和/或机械完整性。填充剂意指自由溶于水的固体颗粒状的稀释剂，当 与化合物或其盐一起冷冻干燥时，其提供物理上稳定的冷冻干燥块、更优 的冷冻干燥方法和迅速且完全的重构。填充剂也可用于使溶液等张。
水溶性填充剂可以是任何通常用于冷冻干燥的药学上可接受的惰性固 体物质。这类填充剂包括例如糖类如葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、海藻糖和乳 糖；多元醇类如山梨醇或甘露醇；氨基酸类如甘氨酸；聚合物类如聚乙烯 吡咯烷；和多糖类如葡聚糖。
填充剂的重量与活性化合物的重量比通常为约1至约5，例如约1至 约3，例如约1至2。
或者，它们可以以可被浓缩且密封于合适小瓶中的溶液形式被提供。 剂型的灭菌可通过过滤或通过小瓶和其内容物在配制过程的适当阶段的高 压灭菌。所提供的制剂可能在递送前需要进一步稀释或制备，例如稀释成 合适的无菌输注包。
即时的注射溶液和混悬液可由无菌粉末、颗粒和片剂制备。
适合于口服施用的药物剂型是优选的，这类剂型包括片剂(如包衣或未 包衣)、胶囊(如硬或软壳)、小胶囊、丸剂、锭剂、糖浆剂、溶液剂、散剂、 颗粒剂、酏剂和混悬剂、舌下片、糯米纸囊剂或贴剂如口腔贴剂。
含有本发明化合物的药物组合物可根据已知技术配制，参见例如 “Remington’s药学科学”，Mack出版公司，Easton，PA，USA。
因此，片剂组合物可含有单位剂量的活性化合物以及惰性稀释剂或载 体如糖或糖醇，例如乳糖、蔗糖、山梨醇或甘露醇；和/或非糖衍生的稀释 剂如碳酸钠、磷酸钙、碳酸钙，或纤维素或其衍生物如微晶纤维素(MCC)、 甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素，和淀粉类如玉米淀粉。片 剂也可含有这类标准成分如粘合剂和制粒剂如聚乙烯吡咯烷酮、崩解剂(例 如可膨胀的交联聚合物如交联羧甲基纤维素)、润滑剂(例如硬脂酸盐)、防 腐剂(例如对羟基苯甲酸酯类)、抗氧化剂(例如BHT)、缓冲剂(例如磷酸盐 或柠檬酸盐缓冲剂)和泡腾剂如柠檬酸盐/碳酸氢盐混合物。这类赋形剂是 已知的，无需在此详细讨论。
胶囊剂可以是各种硬明胶或软明胶形式且可含有固体、半固体或液体 形式的活性组分。明胶胶囊可由动物明胶或其合成的或植物衍生的等价物 形成。
固体剂型(例如片剂、胶囊剂等)可以被包衣或不包衣，但通常具有包 衣，例如保护性薄膜包衣(例如聚合物、蜡或漆膜)或控制释放的包衣。包 衣(例如EudragitTM型聚合物)可被设计用于在胃肠道内的所需位置释放活 性组分。因此，可对包衣进行选择以便在胃肠道内某pH条件下降解，从 而选择性地在胃中或在回肠或十二指肠中释放化合物。
代替包衣或除了包衣之外，药物可存在于固体基质中，该固体基质包 含控制释放剂，例如可以适于在胃肠道内以控制的方式释放化合物的延迟 释放剂，或药物可存在于聚合物包衣中，例如聚甲基丙烯酸酯聚合物包衣， 包含控制释放剂，例如可以适于在胃肠道内于不同的酸性或碱性条件下选 择性地释放化合物的延迟释放剂。或者，基质材料或阻滞释放包衣可以采 用溶蚀性聚合物(例如马来酸酐聚合物)的形式，当剂型通过胃肠道时其基 本上被连续溶蚀。作为另一种替代选择，可以将活性化合物配制在提供渗 透控制化合物释放的递送系统中。渗透释放和其它延迟释放或持续释放制 剂可根据本领域技术人员公知的方法制备。
药物组合物包含约1％至约95％，优选约20％至约90％的活性成分。 根据本发明的药物组合物可以是例如单位剂量的形式，如安瓿、小瓶、栓 剂、糖衣丸、片剂或胶囊的形式。
口服施用的药物组合物可如下获得：合并活性成分与固体载体，如果 需要制粒所得混合物，如果需要或必要，在添加适当的赋形剂后，处理混 合物为片剂、糖衣丸核芯或胶囊。它们还可能被掺入塑形载体(plastics carriers)中以使得活性成分扩散或以测定量释放。
本发明的化合物还可被配制为固体分散体。固体分散体是两种或多种 固体的均匀的非常精细的分散相。固溶体(分子分散系)，一种类型的固体 分散体，在制药技术中的应用是公知的(参见Chiou和Riegelman，J.Pharm. Sci.，60，1281-1300(1971))，并可用于增加水溶性差的药物的溶出率和提高 生物利用度。
药物的固体分散体通常通过熔化或溶剂蒸发方法产生。对于熔化处理， 将自然状态下通常是半固体和蜡状的物质(赋形剂)加热，以引起药物物质 的熔化和溶解，随后通过冷却至非常低的温度硬化。然后，可将固体分散 体粉碎、过筛、与赋形剂混合并装入硬明胶胶囊中或压制成片剂。或者， 使用表面活性或自乳化的载体使固体分散体以熔化物直接装入硬明胶胶囊 中。或者，使用蜡或低熔点聚合物使固体分散体以熔化物直接装入硬明胶 胶囊中。当溶出物冷却至室温时，在胶囊内形成固体填料。
固溶体还可通过在水性溶液或药学上可接受的有机溶剂中溶解药物和 所需赋形剂，随后使用药学上可接受的方法如喷雾干燥除去溶剂而制成。 如果需要，得到的固体可以是粒子大小的，任选与赋形剂混合物并制成片 剂或填装入胶囊中。
用于产生这类固体分散体或固溶体的特别适宜的聚合辅剂是聚乙烯吡 咯烷酮(PVP)。
药物组合物可包含基本呈无定形的固溶体，所述固溶体包含：
(a)式(I)化合物，例如实施例1的化合物；和
(b)选自下组的聚合物：
聚乙烯吡咯烷酮(聚维酮)、交联聚乙烯吡咯烷酮(交聚维酮)、羟丙基甲基纤 维素、羟丙基纤维素、聚环氧乙烷、明胶、交联聚丙烯酸(卡波姆)、羧甲 基纤维素、交联羧甲基纤维素(交联羧甲纤维素)、甲基纤维素、甲基丙烯 酸共聚物、甲基丙烯酸酯共聚物，和水溶性盐如甲基丙烯酸酸和甲基丙烯 酸酯共聚物的钠盐和铵盐、醋酸纤维素邻苯二甲酸酯、羟丙基甲基纤维素 邻苯二甲酸酯和藻酸丙二醇酯；
其中所述化合物与所述聚合物的比例为约1:1至约1:6，例如1:3的比例， 由氯仿或二氯甲烷之一和甲醇或乙醇之一的混合物喷雾干燥，优选1:1比 例的二氯甲烷/乙醇。
另一个实施方式中，药物组合物可包含基本呈无定形的固溶体，所述 固溶体包含：
(a)式(I)化合物，例如实施例1的化合物；和
(b)选自下组的聚合物：
聚乙烯吡咯烷酮(聚维酮)、羟丙基甲基纤维素、羟丙基纤维素、聚乙二醇、 聚环氧乙烷、明胶、交联聚丙烯酸(卡波姆)、羧甲基纤维素、甲基纤维素、 甲基丙烯酸共聚物、甲基丙烯酸酯共聚物，和水溶性盐如甲基丙烯酸和甲 基丙烯酸酯共聚物的钠盐和铵盐、醋酞纤维素邻苯二甲酸酯、羟丙基甲基 纤维素邻苯二甲酸酯和藻酸丙二醇酯；
其中所述化合物与所述聚合物的比例为约1:1至约1:6，例如1:3的比例， 由氯仿或二氯甲烷之一和甲醇或乙醇之一的混合物喷雾干燥，优选1:1比 例的二氯甲烷/乙醇。
本发明还提供包含上文所述固溶体的固体剂量形式。固体剂量形式包 括片剂、胶囊剂和咀嚼片。已知的赋形剂可与固溶体掺合以提供所需剂量 形式。例如，胶囊可包含与(a)崩解剂和润滑剂或(b)崩解剂、润滑剂和表面 活性剂掺合的固溶体。另外，胶囊剂也可含有填充剂，如例如乳糖或微晶 纤维素。片剂可含有与至少一种崩解剂、润滑剂、表面活性剂和助流剂掺 合的固溶体。咀嚼片可含有与填充剂、润滑剂和如果需要另外的甜味剂(如 人造甜味剂)和适当的调味剂掺合的固溶体。
药物制剂可以以“患者包”的形式呈递给患者，其含有在单一包装、 通常为泡罩包装中的整个疗程。与其中药剂师从大批量供应中分出患者的 药物供应的传统处方相比，患者包具有优点，因为患者总能使用包含在患 者包中的药品说明书，而在患者处方中通常没有该说明书。已经证明药品 说明书可改善患者对医师指示的依从性。
用于局部使用和鼻递送的组合物包括软膏剂、乳膏剂、喷雾剂、贴剂、 凝胶剂、液体滴剂和植入剂(inserts)(例如眼内植入剂)。这类组合物可依照 已知方法配制。
用于胃肠外施用的组合物通常以无菌水性或油性溶液或精细混悬液的 形式提供，或者可以以研细的无菌粉末形式提供以临时用无菌注射用水进 行重构。
用于直肠或阴道内施用的制剂的实例包括阴道栓和栓剂，其可以例如 由含有活性化合物的成形的可塑性或蜡状物质形成。
用于吸入施用的组合物可以采用可吸入粉末组合物或液体或粉末喷雾 剂的形式，且可以使用粉末吸入装置或气雾剂给药装置以标准形式施用。 这类装置是公知的。为了通过吸入施用，粉末制剂通常包含活性化合物以 及惰性固体粉末状稀释剂如乳糖。
本发明的化合物一般以单位剂量形式提供，这样以来，其通常含有足 够的化合物以提供所需水平的生物学活性。例如，制剂可含有1纳克至2 克活性成分，例如1纳克至2毫克的活性成分。在此范围内，具体的化合 物亚范围是0.1毫克至2克活性成分(更通常是10毫克至1克，例如50毫 克至500毫克)，或1微克至20毫克(例如1微克至10毫克，例如0.1毫克 至2毫克活性成分)。
对于口服组合物，单位剂量形式可包含1毫克至2克，更通常为10 毫克至1克，例如50毫克至1克，例如100毫克至1克活性化合物。
活性化合物将以足够达到所需治疗效果的量施用于需要其的患者(例 如人或动物患者)。
治疗方法
本发明的化合物将可用于预防或治疗由细胞周期蛋白依赖性激酶和糖 原合酶激酶-3介导的一系列疾病状态或病症。这类疾病状态或病症的实例 如上所述。
一般将化合物施用于需要这类施用的对象，例如人或动物患者，优选 人。
通常以治疗或预防有效的且一般无毒的量施用化合物。然而，在某些 情况(例如在威胁生命的疾病的情况)中，施用本发明化合物的益处可能比 任何毒性效应或副作用的缺点更重要，在该情况中，可以考虑需要施用与 一定程度毒性有关量的化合物。
可长期施用化合物以维持有益的治疗效果或者可仅短期施用。或者， 可以以连续方式或以提供持续间歇给药的方式(例如脉冲方式)施用化合 物。
式(I)化合物的通常日剂量可以为100皮克至100毫克/千克体重，更通 常是5纳克至25毫克/千克体重，更通常是10纳克至15毫克/千克体重(例 如10纳克至10毫克，更通常是1微克/千克至20毫克/千克，例如1微克 至10毫克/千克)，但是如需要，也可以施用更高或更低的剂量。式(I)化合 物可在每日基础或在重复基础上施用，例如每2或3或4或5或6或7或 10或14或21或28天施用一次。
本发明的化合物可在以下剂量范围内口服施用，例如1至1500mg、2 至800mg或5至500mg，例如2至200mg或10至1000mg，剂量的具体 实例包括10、20、50和80mg。化合物可每天施用一次或一次以上。可连 续施用化合物(即每天服用，在治疗方案期间不中断)。或者，可间歇性施 用化合物，即在整个治疗方案期间，连续服用给定的时期如一周，然后中 断一段时间如一周，然后连续服用另一个周期如一周等。包括间歇施用的 治疗方案的实例包括以下方案：其中施用以一周施用、一周停止为周期； 或者两周施用，一周停止；或者三周施用，一周停止；或者两周施用，两 周停止；或者四周施用，两周停止；或者一周施用，三周停止-持续一个 或多个周期，例如2、3、4、5、6、7、8、9或10或更多个周期。
然而，最终，施用的化合物的量和使用的组合物的类型将与所治疗的 疾病或生理状况的性质相称，并且将由医生来决定。
本文所定义的式(I)化合物和亚组可作为单一治疗剂被施用，或者它们 可与一种或多种其它化合物以组合治疗方式施用以用于治疗特定疾病状态 例如肿瘤性疾病如上文所定义的癌症。其它可与本发明化合物一起(无论是 同时还是以不同的时间间隔)施用或使用的治疗剂或疗法的实例包括但不 限制于拓扑异构酶抑制剂、烷化剂、抗代谢剂、DNA结合剂、微管抑制剂 (微管蛋白靶向剂)、单克隆抗体和信号转导抑制剂，具体的实例有顺铂、 环磷酰胺、多柔比星、伊立替康、氟达拉滨、5FU、紫杉烷类、丝裂霉素 C和放射疗法。
本文所定义的化合物可作为单一治疗剂被施用，或者它们可与一种或 多种其它化合物以组合治疗方式施用以用于治疗特定疾病状态例如肿瘤性 疾病如上文所定义的癌症。其它可与式(I)化合物一起(无论是同时还是以不 同的时间间隔)施用的治疗剂或治疗的实例包括但不限于：
·拓扑异构酶I抑制剂
·抗代谢剂
·微管蛋白靶向剂
·DNA结合剂和拓扑异构酶II抑制剂
·烷化剂
·单克隆抗体
·抗激素剂
·信号转导抑制剂
·蛋白酶体抑制剂
·DNA转甲基酶
·细胞因子和类视黄醇
·染色质靶向治疗
·放射疗法，和
·其它治疗剂或预防剂；例如减少或减轻与化疗相关的一些副作用的活 性剂。这类活性剂的具体实例是止吐药和预防或减少化疗相关性中性 粒细胞减少症的持续时间以及预防起因于红细胞或白细胞水平降低 的并发症的活性剂，例如促红细胞生成素(EPO)、粒细胞巨噬细胞- 集落刺激因子(GM-CSF)和粒细胞集落刺激因子(G-CSF)。还包括抑 制骨吸收的活性剂，如双磷酸类活性剂，例如唑来膦酸、帕米膦酸和 伊班膦酸，抑制炎症应答的活性剂(如地塞米松、泼尼松和泼尼松龙)， 以及用于减少肢端肥大症患者中生长激素和IGF-I的血液水平的活 性剂，如脑激素生长抑素(somatostatin)的合成形式，其包括醋酸奥曲 肽，它是具有模拟天然激素生长抑素的药理学性质的长效辛肽。进一 步包括诸如亚叶酸的活性剂，其用作减少叶酸或甲酰四氢叶酸本身水 平的药物的解毒剂，以及诸如醋酸甲地孕酮的活性剂，其可用于治疗 包括水肿和血栓栓塞发作(thromoembolic episodes)的副作用。
对于CDK抑制剂与其它治疗组合的情况，两种或更多种治疗可以以 各个不同的给药方案和通过不同的途径给予。
在式(I)化合物以与一、二、三、四或更多种(优选一或二种，更优选一 种)其它治疗剂的组合疗法施用的情况下，化合物可同时或相继施用。当相 继施用时，它们可以以近距离的时间间隔(例如历经5-10分钟的时间)或以 更长的时间间隔(例如间隔1、2、3、4或更多小时，或者如果需要间隔更 长时间)施用，精确的剂量方案与治疗剂的性质相称。
本发明的化合物也可与非化疗治疗如放射疗法、光动力疗法、基因疗 法；手术和控制饮食一起施用。
对于与另一种化疗剂的组合治疗使用，可将式(I)化合物和一、二、三、 四或更多种其它治疗剂例如一起配制成含有二、三、四或更多种治疗剂的 剂型。在替代方案中，各治疗剂可被分开配制并且以药盒的形式一起提供， 所述药盒任选地具有它们的使用说明书。
本领域技术人员通过他或她的普通常识可了解所用的给药方案和组合 治疗。
诊断方法
在施用式(I)化合物之前，可筛选患者以确定该患者正在患有或可能将 罹患的疾病或病症是否是对使用具有抗细胞周期蛋白依赖性激酶活性的化 合物的治疗敏感的疾病或病症。
例如，可分析取自患者的生物样本以确定该患者正在患有或可能将罹 患的病症或疾病如癌症是否是以导致CDK过度活化或导致正常CDK活性 通路增敏的基因异常或蛋白质表达异常为特征的疾病或病症。导致CDK2 信号活化或增敏的这类异常的实例包括细胞周期蛋白E上调(Harwell RM、Mull BB、Porter DC、Keyomarsi K.；J Biol Chem.2004年3月26 日；279(13)：12695-705)或p21或p27缺失，或存在CDC4变体(Rajagopalan H、Jallepalli PV、Rago C、Velculescu VE、Kinzler KW、Vogelstein B、 Lengauer C.；Nature.2004年3月4日；428(6978)：77-81)。具有CDC4突变 或细胞周期蛋白E上调特别是过表达或者p21或p27缺失的肿瘤对CDK 抑制剂特别敏感。术语上调包括表达升高或过表达，包括基因扩增(即多基 因拷贝)和转录效应导致的表达增加，以及高活性和活化、包括突变导致的 活化。
因此，可对患者进行诊断测试，以检测细胞周期蛋白E上调或者p21 或p27缺失或者存在CDC4变体的特征性标记。术语诊断包括筛选。对于 标记，我们包括基因标记，包括例如测定DNA组成以鉴定CDC4的突变。 术语标记还包括体现细胞周期蛋白E上调特点的标记，包括酶活性、酶水 平、酶状态(例如是否磷酸化)和前述蛋白质的mRNA水平。具有细胞周期 蛋白E上调或p21或p27缺失的肿瘤可能对CDK抑制剂特别敏感。可在 治疗之前优先对肿瘤进行细胞周期蛋白E上调或者p21或p27的缺失的筛 选。因此，可对患者进行诊断性测试以检测细胞周期蛋白E上调或p21或 p27缺失的特征性标记。
诊断测试通常用选自肿瘤活检样品、血液样品(分离和富集脱落的肿瘤 细胞)、粪便活检、痰、染色体分析、胸膜液、腹膜液或尿的生物样本进行。
Rajagopalan等人已发现(Nature.2004年3月4日；428(6978)：77-81)， 在人结肠直肠癌和子宫内膜癌中CDC4(也称为Fbw7或Archipelago)存在 突变(Spruck等人，Cancer Res.2002年8月15日；62(16)：4535-9)。携带 CDC4突变的个体的鉴定意味着该患者特别适于用CDK抑制剂治疗。可 在治疗之前优先针对CDC4变体的存在对肿瘤进行筛选。筛选方法通常涉 及直接测序、寡核苷酸微阵列分析或突变体特异性抗体。
鉴定和分析蛋白质的突变和上调的方法是本领域技术人员公知的。筛 选方法包括但不限制于标准方法如逆转录酶多聚酶链式反应(RT-PCR)或 原位杂交。
在RT-PCR筛选中，肿瘤中的mRNA水平通过产生mRNA的cDNA 拷贝、继而用PCR扩增cDNA来评价。PCR扩增的方法、引物的选择和 扩增条件是本领域技术人员已知的。核酸操作和PCR根据标准方法进行， 例如Ausubel，F.M.等人，eds.Current Protocols in Molecular Biology，2004， John Wiley & Sons Inc.，或Innis，M.A.等人，eds.PCR Protocols：a guide to methods and applications，1990，Academic Press，San Diego中所述。涉及 核酸技术的反应和操作在Sambrook等人，2001，第3版，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press中 也有描述。或者，可使用可商购获得的RT-PCR试剂盒(例如Roche Molecular Biochemicals)，或美国专利4,666,828、4,683,202、4,801,531、 5,192,659、5,272,057、5,882,864和6,218,529中所述的方法，并引入本文 作为参考。
评价mRNA表达的原位杂交技术的一个实例是荧光原位杂交(FISH) (参见Angerer，1987 Meth.Enzymol.，152：649)。
通常，原位杂交包括下列主要步骤：(1)固定待分析的组织；(2)对样品 进行预杂交处理以增加目标核酸的可接近性和减少非特异性结合；(3)将核 酸混合物与生物结构或组织中的核酸杂交；(4)进行杂交后洗涤以除去杂交 中未结合的核酸片段，和(5)检测杂交的核酸片段。在这类应用中使用的探 针通常是标记的，例如用放射性同位素或荧光报道分子进行标记。优选的 探针应足够长，例如约50、100或200个核苷酸到约1000或更多个核苷酸， 以使得能在严格条件下与目标核酸进行特异性杂交。进行FISH的标准方 法在Ausubel，F.M.等人，eds.Current Protocols in Molecular Biology，2004， John Wiley & Sons Inc和Fluorescence In Situ Hybridization：Technical Overviewby John M.S.Bartlett in Molecular Diagnosis of Cancer， Methods and Protocols，第2版；ISBN：1-59259-760-2；2004年3月，pps. 077-088；Series：Methods in Molecular Medicine中有描述。
或者，可通过肿瘤样品的免疫组织化学、使用微量滴定板的固相免疫 分析、蛋白质印迹法、二维SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、ELISA、流式细胞 术和本领域用于检测特异性蛋白质的其他已知方法分析由mRNA表达的 蛋白质产物。检测方法包括使用位点特异性抗体。本领域技术人员应了解 所有这类已知的用于检测细胞周期蛋白E上调或p21或p27缺失或CDC4 变体的技术均可适用于本情况。
因此，所有这些技术也可用于鉴定特别适合用本发明化合物治疗的肿 瘤。
具有CDC4突变或细胞周期蛋白E上调、特别是过表达或p21或p27 缺失的肿瘤可能对CDK抑制剂特别敏感。优先在治疗前针对细胞周期蛋 白E上调、特别是过表达(Harwell RM、Mull BB、Porter DC、Keyomarsi K.；J Biol Chem.2004年3月26日；279(13)：12695-705)或p21或p27缺失 或CDC4变体对肿瘤进行筛选(Rajagopalan H、Jallepalli PV、Rago C、 Velculescu VE、Kinzler KW、Vogelstein B、Lengauer C.；Nature.2004年 3月4日；428(6978)：77-81)。
可用本文概述的诊断测试选择患有套细胞淋巴瘤(MCL)的患者以用本 发明化合物进行治疗。MCL是非霍奇金淋巴瘤的一种特殊的临床病理学实 体，其特征在于具有CD5和CD20共表达的小到中等大小的淋巴细胞增殖、 侵袭性的和不可治愈的临床病程和频繁的t(11；14)(q13；q32)易位。在套细 胞淋巴瘤(MCL)中发现的细胞周期蛋白D1mRNA的过表达是重要的诊断 标记。Yatabe等人(Blood.2000年4月1日；95(7)：2253-61)提议应包括细 胞周期蛋白D1-阳性作为MCL的标准之一，并提议应以该新标准为基础 探究这种不可治愈疾病的创新疗法。Jones等人(J Mol Diagn.2004年5月； 6(2)：84-9)开发了用于细胞周期蛋白D1(CCND1)表达的实时、定量逆转录 PCR分析以帮助诊断套细胞淋巴瘤(MCL)。Howe等人(Clin Chem.2004 年1月；50(1)：80-7)使用实时定量RT-PCR评估细胞周期蛋白D1 mRNA的 表达，发现CD19 mRNA标化的细胞周期蛋白D1 mRNA的定量RT-PCR 可用于在血液、骨髓和组织中诊断MCL。或者，可使用上文概述的诊断测 试选择患有乳腺癌的患者以用CDK抑制剂进行治疗。肿瘤细胞通常过表 达细胞周期蛋白E并且已显示细胞周期蛋白E在乳腺癌中过表达(Harwell 等人，Cancer Res，2000，60，481-489)。因此，乳腺癌尤其可以用本文所提供 的CDK抑制剂进行治疗。
附图简述
图1是由单晶X-射线衍射研究确定的4-(2，6-二氯-苯甲酰氨基)-1H-吡 唑-3-甲酸(1-甲磺酰基-哌啶-4-基)-酰胺的三维结构描述。
图2是通过X-射线衍射研究产生的4-(2，6-二氯-苯甲酰氨基)-1H-吡唑 -3-甲酸(1-甲磺酰基-哌啶-4-基)-酰胺的结构图示。
图3是4-(2，6-二氯-苯甲酰氨基)-1H-吡唑-3-甲酸(1-甲磺酰基-哌啶-4- 基)-酰胺的X-射线粉末衍射图。
图4是结晶形式的4-(2，6-二氯-苯甲酰氨基)-1H-吡唑-3-甲酸(1-甲磺酰 基-哌啶-4-基)-酰胺的DSC扫描图。
图5是通过热重分析获得的结晶形式的4-(2，6-二氯-苯甲酰氨基)-1H- 吡唑-3-甲酸(1-甲磺酰基-哌啶-4-基)-酰胺的重量减轻曲线。
图6是结晶形式的4-(2，6-二氯-苯甲酰氨基)-1H-吡唑-3-甲酸(1-甲磺酰 基-哌啶-4-基)-酰胺的蒸汽吸附/解吸附曲线。
图7是几个包含4-(2，6-二氯-苯甲酰氨基)-1H-吡唑-3-甲酸(1-甲磺酰基- 哌啶-4-基)-酰胺和PVP的固体分散体的制剂的溶解度-时间曲线，其中(1) 表示不含其它赋形剂的PVP和式(I)化合物的未包封固体分散体；(2)表示 紧密填装入0号胶囊中的固体分散体(1)；和(3)表示配制的样品。
实施例
现参照在下列实施例中所描述的具体实施方式阐述而非限制本发明。
实施例1
4-(2，6-二氯-苯甲酰氨基)-1H-吡唑-3-甲酸(1-甲磺酰基-哌啶-4-基)-酰胺及其 晶体的合成
化合物4-(2，6-二氯-苯甲酰氨基)-1H-吡唑-3-甲酸(1-甲磺酰基-哌啶-4- 基)-酰胺可通过上文方案1中阐述的合成序列制备，并更详细地描述如下。
阶段1：4-硝基-1H-吡唑-3-甲酸甲酯的制备

将4-硝基-1H-吡唑-3-甲酸(1.350Kg，8.59Mol，1.0wt)和甲醇(10.80L， 8.0vol)装入配有机械搅拌器、冷凝器和温度计的法兰烧瓶(flange flask)中。 将混悬液在氮下冷却至0至5℃，在此温度加入亚硫酰氯(0.702L，9.62Mol， 0.52vol)。混合物历经16至24小时温热至15至25℃。由1H NMR分析 (d6-DMSO)确定反应完成。混合物于35至45℃真空下浓缩，将甲苯(2.70L， 2.0vol)加入残余物中，于35至45℃真空下除去。使用甲苯(2.70L，2.0vol)重 复两次甲苯共沸，得到4-硝基-1H-吡唑-3-甲酸甲酯[1.467Kg，99.8％th， 108.7％w/w，1H NMR(d6-DMSO)与结构相符，无夹带的溶剂]，为灰白色 固体。
阶段2：4-氨基-1H-吡唑-3-甲酸甲酯的制备

将4-硝基-1H-吡唑-3-甲酸甲酯(1.467Kg，8.57Mol，1.0wt)和乙醇 (14.70L，10.0vol)的混悬液加热至30至35℃，并在此温度维持直至发生完 全溶解。将10％披钯碳(10％ Pd/C湿糊，0.205Kg，0.14wt)在氮下加入单独 的烧瓶中，进行真空/氮清洗循环(x3)。将4-硝基-1H-吡唑-3-甲酸甲酯的乙 醇溶液加入催化剂中，并重复真空/氮清洗循环(x3)。进行真空/氢清洗循环 (x3)，将反应置于氢气氛下。将反应混合物于28至30℃搅拌直至1H NMR 分析(d6-DMSO)确认完成。将混合物在氮下过滤，于35至45℃真空下浓 缩，得到4-氨基-1H-吡唑-3-甲酸甲酯[1.184Kg，97.9％th，80.7％w/w，1H NMR(d6-DMSO)与结构相符，校正0.27％w/w夹带的乙醇]，为灰白色固 体。
阶段3：4-(2，6-二氯苯甲酰氨基)-1H-吡唑-3-甲酸甲酯的制备

将三乙胺(1.42L，10.20Mol，1.2vol)于15至25℃、在氮下加入4-氨基 -1H-吡唑-3-甲酸甲酯(1.184Kg，8.39Mol，1.0wt)的1，4-二噁烷(10.66L，9.0vol) 溶液中。于15至25℃加入2，6-二氯苯甲酰氯(1.33L，9.28Mol，1.12vol)，随 后用1，4-二噁烷(1.18L，1.0vol)系列漂洗(line rinse)，将反应混合物于15至 25℃搅拌14至24小时。通过1H NMR分析1确定反应完成。将反应混合 物过滤，用1，4-二噁烷(2x 1.18L，2x 1.0vol)洗涤滤饼，合并的滤液无需进一 步分离进入阶段4。
阶段4：4-(2，6-二氯苯甲酰氨基)-1H-吡唑-3-甲酸的制备

将4-(2，6-二氯苯甲酰氨基)-1H-吡唑-3-甲酸甲酯(1.308Kg，4.16Mol， 1.0wt)的1，4-二噁烷(6.47L，5.0vol)溶液于35至45℃一次性加入2M氢氧 化钠水溶液(7.19L，14.38Mol，5.5vol)中。将反应混合物冷却至15至25℃， 历经14至24小时。通过TLC分析2确定反应完成。于45至50℃真空下 浓缩反应混合物。将得到的油状残余物用水(11.77L，9.0vol)稀释，于15至 30℃用浓盐酸水溶液酸化至pH1。经过滤收集沉淀物，用水(5.88L，4.5vol) 洗涤，在滤器上吸干，用加入的庚烷(5.88L，4.5vol)替换洗涤。将滤饼加入 到20L旋转蒸发烧瓶中，与甲苯(2 x 5.23L，2 x 4.0vol)共沸干燥，得到4-(2，6- 二氯苯甲酰氨基)-1H-吡唑-3-甲酸[1.207Kg，96.6％th，92.3％w/w，1H NMR (d6-DMSO)与结构相符，98.31％的HPLC面积]，为黄色固体。
阶段5：4-{[4-(2，6-二氯苯甲酰氨基)-1H-吡唑-3-羰基]氨基}-哌啶-1-甲酸叔- 丁酯的制备

将亚硫酰氯(0.25L，3.43Mol，0.3vol)在氮下于16至25℃加入搅拌的 4-(2，6-二氯苯甲酰氨基)-1H-吡唑-3-甲酸(0.806Kg，2.69Mol，1.0wt)的甲苯 (8.00L，10.0vol)混悬液中。然后，将内容物加热至80至100℃，在此温度 搅拌16至24小时。通过1H NMR分析确定反应完成。将反应混合物冷却 至40至50℃，于45至50℃真空下浓缩至干燥，将残余物于45至50℃ 真空下与甲苯(3 x 1.60L，3 x 2.0vol)共沸干燥，得到白色固体。将固体转移至 合适的容器中，加入四氢呋喃(4.00L，5.0vol)，将内容物在氮下搅拌，于16 至25℃加入三乙胺(0.42L，3.01Mol，0.512vol)。然后，将4-氨基哌啶-1-甲 酸叔-丁酯(0.569Kg，2.84Mol，0.704wt)的四氢呋喃(4.00L，5.0vol)溶液于16 至30℃加入反应烧瓶中，将反应混合物加热至45至50℃，在此温度下搅 拌2至16小时。通过1H NMR分析确定反应完成。将反应混合物冷却至 16至25℃，用水(4.00L，5.0vol)和混合的庚烷(0.40L，0.5vol)淬灭。将内容 物搅拌至多10分钟，分离各层，用四氢呋喃：混合的庚烷[(9:1)，3 x 4.00L，3 x 5.0vol]萃取水相。合并的有机相用水(1.81L，2.5vol)洗涤，于40至45℃真 空下浓缩。将残余物与甲苯(3 x 4.00L，3 x 5.0vol)共沸干燥，得到粗制 4-{[4-(2，6-二氯苯甲酰氨基)-1H-吡唑-3-羰基]氨基}-哌啶-1-甲酸叔-丁酯 (1.257Kg，97.1％th，156.0％w/w，校正0.90％w/w夹带的溶剂)。通过这种 方法制备几批化合物，将各批合并用于纯化。
将粗制4-{[4-(2，6-二氯苯甲酰氨基)-1H-吡唑-3-羰基]氨基}-哌啶-1-甲酸 叔-丁酯(5.22Mol，1.0wt)、甲苯(12.00L，4.87vol)和甲醇(0.30L，0.13vol)于16 至25℃在氮下搅拌3至18小时。经过滤分离固体，滤饼用甲苯(2 x 1.60L， 2 x 0.7vol)洗涤，于40至50℃真空下干燥，得到4-{[4-(2，6-二氯苯甲酰氨 基)-1H-吡唑-3-羰基]氨基}-哌啶-1-甲酸叔-丁酯[2.242Kg，86.6％th， 139.2％w/w，1H NMR(d6-DMSO)一致，99.41％的HPLC面积]，为灰白色 固体。
阶段6：4-(2，6-二氯苯甲酰氨基)-1H-吡唑-3-甲酸哌啶-4-基酰胺甲磺酸盐的 制备

将4-{[4-(2，6-二氯苯甲酰氨基)-1H-吡唑-3-羰基]氨基}-哌啶-1-甲酸叔- 丁酯(0.561Kg，1.16Mol，1.0wt)和1，4-二噁烷(14.00L，26.0vol)在氮下搅拌并 加热至80至90℃。于80至90℃历经30至60分钟加入甲磺酸(0.30L， 4.62Mol，0.54vol)，将内容物加热至95至105℃，在此温度下维持1至24 小时。通过1H NMR分析确定反应完成。将反应混合物冷却至20至30℃， 将得到的沉淀物经过滤收集。滤饼用丙-2-醇(2 x 1.10L，2 x 2.0vol)洗涤，在 滤器上吸干3至24小时，得到4-(2，6-二氯苯甲酰氨基)-1H-吡唑-3-甲酸哌 啶-4-基酰胺甲磺酸盐[0.558Kg，100.2％th，99.4％w/w，1H NMR(d6-DMSO) 与结构相符，98.13％的HPLC面积]，为灰白色固体。
阶段7：4-(2，6-二氯苯甲酰氨基)-1H-吡唑-3-甲酸(1-甲磺酰基-哌啶-4-基)- 酰胺的制备

将甲磺酸(0.055L，0.85Mol，0.1vol)于15至40℃加入搅拌的4-(2，6-二 氯苯甲酰氨基)-1H-吡唑-3-甲酸哌啶-4-基酰胺甲磺酸盐(0.562Kg，1.17Mol， 1.0wt)的水(5.60L，10.0vol)混悬液中。将反应混合物加热至95至105℃， 于此温度下搅拌80至100分钟。通过HPLC分析确定反应完成。将混合 物冷却至15至20℃，于15至25℃加入碳酸氢钠(1.224Kg，14.57Mol，2.18 wt)，随后加入乙酸乙酯(4.20L，7.5vol)，根据需要将温度调至15至25℃。 于15至25℃历经120至180分钟分五等份加入甲基磺酰氯(0.455L， 5.88Mol，0.81vol)，将反应混合物搅拌另外30至45分钟。通过HPLC分 析确定反应完成。于35至45℃真空下除去乙酸乙酯，将得到的浆液过滤， 滤饼用水(0.56L，1.0vol)洗涤，转移至适当大小的烧瓶中。加入水(2.81L， 5.0vol)，将混合物于15至25℃搅拌30至40分钟，然后过滤，滤饼用水 (0.56L，1.0vol)洗涤，在垫上吸干1至24小时。将收集的固体于40至50℃ 真空下干燥，得到粗制4-(2，6-二氯苯甲酰氨基)-1H-吡唑-3-甲酸(1-甲磺酰 基-哌啶-4-基)-酰胺[0.490Kg，90.7％th，87.2％w/w，1H NMR(d6-DMSO)与 结构相符，98.05％的HPLC面积]，为灰白色固体。
阶段8：4-(2，6-二氯苯甲酰氨基)-1H-吡唑-3-甲酸(1-甲磺酰基-哌啶-4-基)- 酰胺的重结晶

将粗制4-(2，6-二氯苯甲酰氨基)-1H-吡唑-3-甲酸(1-甲磺酰基-哌啶-4- 基)-酰胺(5.506Kg，11.96Mol，1.0wt)、N，N-二甲基乙酰胺(8.00L，1.5vol)和丙 酮(11.00L，2.0vol)在氮下搅拌，加热至40至50℃。将得到的溶液通过玻璃 微纤维纸过滤澄清，将滤液加热至60至80℃。于60至80℃加入水(10.50L， 2.0vol)，以便在整个过程维持回流。将混合物冷却至15至25℃，在此温 度下陈化14至24小时，结晶的固体经过滤分离，滤饼用水(6.00L，1.0vol) 洗涤，转移至适当的容器中。加入水(11.00L，2.0vol)，将混合物于15至25℃ 搅拌30至40分钟，然后过滤。滤饼用水(6.00L，1.0vol)洗涤，在滤器上吸 干至少30分钟。将固体于40至50℃真空下干燥，得到4-(2，6-二氯苯甲 酰氨基)-1H-吡唑-3-甲酸(1-甲磺酰基-哌啶-4-基)-酰胺[4.530Kg，82.3％th， 82.3％w/w，1H NMR(d6-DMSO)与结构相符，99.29％的HPLC面积]，为白 色固体。
实施例2
4-(2，6-二氯-苯甲酰氨基)-1H-吡唑-3-甲酸(1-甲磺酰基-哌啶-4-基)-酰胺的备 选合成
步骤1：4-[(4-硝基-1H-吡唑-3-羰基)-氨基]-哌啶-1-甲酸叔-丁酯的合成

将4-硝基吡唑-3-甲酸(20.0g，127.4mmol)悬浮于CH2Cl2/DMF(99:1， 400mL)中，用草酰氯(11.6mL，134mmol)谨慎地处理，然后室温搅拌16h。 将反应混合物蒸发，然后与甲苯(x3)再蒸发，得到黄色固体。将得到的酰 氯悬浮于二噁烷(400mL)中，用三乙胺(26.4mL，190mmol)处理，随后用4- 氨基-1-BOC-哌啶(25.0g，125mmol)处理，室温搅拌6h。将反应混合物过滤， 将收集的固体在水(500mL)中搅拌，然后再过滤。将收集的固体在真空中 干燥，与甲苯共沸，得到标题化合物(37.6g)。
步骤2：4-硝基-1H-吡唑-3-甲酸哌啶-4-基酰胺的合成

将4-[(4-硝基-1H-吡唑-3-羰基)-氨基]-哌啶-1-甲酸叔-丁酯(20.0g， 59.0mmol)悬浮于二噁烷-CH2Cl2(1:1，400mL)中，用4M HCl的二噁烷 (100mL)溶液处理。将混合物室温搅拌16h，将形成的固体经过滤收集，在 真空中干燥，得到标题化合物，为白色固体(13.8g)。
步骤3：4-硝基-1H-吡唑-3-甲酸(1-甲磺酰基-哌啶-4-基)-酰胺的合成

向4-硝基-1H-吡唑-3-甲酸哌啶-4-基酰胺(13.7g，50.0mmol)的二噁烷- 乙腈(1:1，250mL)混悬液中加入三乙胺(17.4mL，125mmol)，随后加入甲磺 酰氯(4.26mL，55.0mmol)。将混合物于45℃搅拌5h，然后在真空中浓缩。 向残余物加入水(500mL)，将混合物搅拌20分钟，固体经过滤收集，在真 空中干燥，与甲苯共沸(x3)，得到标题化合物，为灰白色固体(12.8g)。
步骤4：4-氨基-1H-吡唑-3-甲酸(1-甲磺酰基-哌啶-4-基)-酰胺的合成

将4-硝基-1H-吡唑-3-甲酸(1-甲磺酰基-哌啶-4-基)-酰胺(5.0g)溶解于 DMF(30mL)中，用10％披钯碳(0.5g)处理，然后于室温和45psi氢化，直 至反应完成。反应混合物通过硅藻土过滤，在真空中浓缩。将残余物用水 (200mL)研磨，得到的固体经过滤收集，在真空中干燥，与甲苯共沸(x3)， 得到主产物标题化合物(3.5g)。
步骤5：4-(2，6-二氯-苯甲酰氨基)-1H-吡唑-3-甲酸(1-甲磺酰基-哌啶-4-基)- 酰胺的合成

向4-氨基-1H-吡唑-3-甲酸(1-甲磺酰基-哌啶-4-基)-酰胺(3.4g，～10mmol) 和三乙胺(1.53mL，11mmol)在二噁烷(50mL)中的混合物中于45℃缓慢加 入2，6-二氯苯甲酰氯(1.4mL，10mmol)。将混合物于45℃加热2h，倾倒入 水(250mL)中，然后用EtOAc(2 x 200mL)萃取。将合并的有机提取物在真 空中浓缩，经硅胶柱色谱法纯化，用P.E-EtOAc(1:0-0:1)洗脱。将含产物 的馏分在真空中浓缩，将残余物置于2M NaOH水溶液-MeOH(1:1，50mL) 中，环境温度搅拌2h。在真空中除去MeOH，混合物用EtOAc萃取。有 机部分用盐水洗涤，经MgSO4干燥，在真空中浓缩。残余物通过热浆液用 EtOH纯化，得到标题化合物，为灰白色固体(2.52g)。
实施例3
通过X-射线衍射确定4-(2，6-二氯苯甲酰氨基)-1H-吡唑-3-甲酸(1-甲磺酰基- 哌啶-4-基)-酰胺的晶体结构
晶体通过蒸发如实施例2中所述制备的化合物4-(2，6-二氯苯甲酰氨 基)-1H-吡唑-3-甲酸(1-甲磺酰基-哌啶-4-基)-酰胺的CHCl3溶液获得。
用于衍射试验的晶体是无色、不规则形状的，尺寸为0.15 x 015 x 0.04mm3。使用CuKα放射(λ＝1.5418)、从Rigaku旋转阳极RU3HR、Osmic 蓝共焦光学镜(Osmic blue confocal optics)、AFC9 1/4 χ测角计和Rigaku Jupiter CCD检测器在104K处收集晶体学数据。以2θ＝15°三次ω扫描和 2θ＝90°四次扫描收集图像，检测器至晶体的距离为67mm。数据收集通过 CrystalClear软件控制，通过Dtrek处理和标度图像。由于高吸收系数 (μ＝4.04mm-1)，必须利用4级傅里叶吸收校正法进行校正数据。发现晶体属 于单斜晶系空间群C2/c(#15)，晶格参数为a＝9.15，b＝31.32，c＝7.93， β＝113.3°，α＝γ＝90°。采用一个短的室温扫描检查晶格参数和对称性。发 现对称性与104K时的对称性相同，且晶格参数相似(室温a＝9.19，b＝31.31， c＝8.09，β＝115.2°)。晶胞尺寸a、b和c具有5％的偏差(s.u.，标准不确定度)。
使用在SHELXS-97中执行的直接方法来解析晶体结构。在通过 SHELXS-97进行的263个晶体学参数的精修中使用15.67-0.84 (2.82<θ<66.54)分辨范围内的总计2682个单一反射的强度数据。最后的统 计参数为：wR2＝0.1749(所有数据)，RF＝0.0663(I>2σ(I)的数据)，拟合度 S＝1.035。
在不对称单元中仅发现一分子游离碱。不对称单元的元素组成为 C17H19Cl2N5O4S，计算的晶体密度为1.47mg/m3。在几何学基础上产生氢 原子，但与杂原子结合的氢原子的位置通过检查Fo-Fc差值图来确定。氢 原子的位置和热参数根据相应的非氢原子而定。借助各向异性热学因素构 造非氢原子的热运动模型(参见图1)。
晶体结构包含一个分子内(N6-H...O14 2.812)和一个分子间氢键(参见 图2)。分子通过分子间H-键N1-H...O22 2.845一起连接形成链。不同链 的二氯苯基部分堆积在一起形成紧凑的3D堆积。
X-射线衍射研究产生的结构的热椭圆体表象提供于图1中，堆积图在 图2中。
组成4-(2，6-二氯苯甲酰氨基)-1H-吡唑-3-甲酸(1-甲磺酰基-哌啶-4-基)- 酰胺游离碱结构的原子的坐标在下表1中以cif格式给出。
表1
空间群：C2/c(#15)
晶胞，在104K，a、b和c具有5％s.u.：
a＝9.150
b＝31.320
c＝7.930
α＝γ＝90.00
β＝113.30
loop_
_atom_site_label
_atom_site_type_symbol
_atom_site_fract_x
_atom_site_fract_y
_atom_site_fract_z
_atom_site_U_iso_or_equiv
_atom_site_adp_type
_atom_site_occupancy
_atom_site_symmetry_multiplicity
_atom_site_calc_flag
_atom_site_refinement_flags
_atom_site_disorder_assembly
_atom_site_disorder_group
C11 C1 1.55055(16) 0.20997(4) 1.6202(2) 0.0376(4) Uani 1 1 d...
C12 C1 0.97743(17) 0.20548(4) 1.6837(3) 0.0447(5) Uani 1 1 d...
S1 S 0.57041(12) 0.07771(3) 0.25572(15) 0.0212(3) Uani 1 1 d...
O7 O 1.3597(5) 0.14890(12) 1.8380(5) 0.0376(10) Uani 1 1 d...
O14 O 1.0227(4) 0.12633(10) 1.1610(5) 0.0266(8) Uani 1 1 d...
O22 O 0.4600(4) 0.04232(10) 0.1911(5) 0.0285(9) Uani 1 1 d...
O23 O 0.6695(4) 0.08741(13) 0.1578(5) 0.0282(9) Uani 1 1 d...
N1 N 1.2370(5) 0.02604(12) 1.5929(6) 0.0215(9) Uani 1 1 d...
H1 H 1.2665 0.0019 1.6538 0.026 Uiso 1 1 calc...
N2 N 1.1481(5) 0.02788(12) 1.4095(6) 0.0241(10) Uani 1 1 d...
N6 N 1.2053(5) 0.13987(12) 1.5365(6) 0.0226(9) Uani 1 1 d...
H6 H 1.1513 0.1533 1.4330 0.027 Uiso 1 1 calc...
N15 N 0.9606(5) 0.05870(11) 1.0508(6) 0.0192(9) Uani 1 1 d...
H15 H 0.9804 0.0313 1.0720 0.023 Uiso 1 1 calc...
N19 N 0.6881(4) 0.06785(12) 0.4705(5) 0.0185(9) Uani 1 1 d...
C3 C 1.1279(5) 0.06988(14) 1.3718(7) 0.0196(10) Uani 1 1 d...
C4 C 1.2051(5) 0.09437(14) 1.5332(7) 0.0210(10) Uani 1 1 d...
C5 C 1.2765(6) 0.06537(16) 1.6738(8) 0.0240(11) Uani 1 1 d...
H5 H 1.3393 0.0714 1.7992 0.029 Uiso 1 1 calc...
C7 C 1.2811(6) 0.16340(14) 1.6846(7) 0.0243(11) Uani 1 1 d...
C8 C 1.2638(7) 0.21135(14) 1.6550(8) 0.0239(11) Uani 1 1 d...
C9 C 1.3834(6) 0.23627(16) 1.6278(7) 0.0260(11) Uani 1 1 d...
C10 C 1.3723(7) 0.27967(18) 1.6094(8) 0.0331(13) Uani 1 1 d...
H10 H 1.4564 0.2955 1.5978 0.040 Uiso 1 1 calc...
C11 C 1.2352(7) 0.30098(16) 1.6076(8) 0.0333(14) Uani 1 1 d...
H11 H 1.2266 0.3311 1.5928 0.040 Uiso 1 1 calc...
C12 C 1.1136(7) 0.27794(18) 1.6273(8) 0.0354(14) Uani 1 1 d...
H12 H 1.0207 0.29211.6242 0.043 Uiso 1 1 calc...
C13 C 1.1291(6) 0.23383(16) 1.6518(8) 0.0321(14) Uani 1 1 d...
C14 C 1.0327(5) 0.08684(14) 1.1863(7) 0.0218(11) Uani 1 1 d...
C16 C 0.8492(5) 0.07270(14) 0.8678(7) 0.0184(10) Uani 1 1 d...
H16 H 0.7916 0.0985 0.8838 0.022 Uiso 1 1 calc...
C17 C 0.9342(5) 0.08479(14) 0.7426(7) 0.0211(11) Uani 1 1 d...
H17A H 0.9903 0.0595 0.7223 0.025 Uiso 1 1 calc...
H17B H 1.0142 0.1073 0.8019 0.025 Uiso 1 1 calc...
C18 C 0.8119(5) 0.10120(15) 0.5567(7) 0.0225(10) Uani 1 1 d...
H18A H 0.7612 0.1276 0.5760 0.027 Uiso 1 1 calc...
H18B H 0.8665 0.1080 0.4743 0.027 Uiso 1 1 calc...
C20 C 0.6048(5) 0.05454(15) 0.5920(7) 0.0242(11) Uani 1 1 d...
H20A H 0.5265 0.0319 0.5305 0.029 Uiso 1 1 calc...
H20B H 0.5466 0.0792 0.6132 0.029 Uiso 1 1 calc...
C21 C 0.7264(6) 0.03785(14) 0.7776(7) 0.0234(11) Uani 1 1 d...
H21A H 0.6712 0.0302 0.8584 0.028 Uiso 1 1 calc...
H21B H 0.7798 0.0120 0.7578 0.028 Uiso 1 1 calc...
C24 C 0.4560(6) 0.12321(16) 0.2544(8) 0.0279(12 )Uani 1 1 d...
H24A H 0.5263 0.1479 0.2999 0.042 Uiso 1 1 calc...
H24B H 0.3984 0.1181 0.3338 0.042 Uiso 1 1 calc...
H24C H 0.3796 0.1288 0.1288 0.042 Uiso 1 1 calc...
实施例3
4-(2，6-二氯苯甲酰氨基)-1H-吡唑-3-甲酸(1-甲磺酰基-哌啶-4-基)-酰胺晶体 的X-射线粉末衍射(XRPD)研究
使用实施例1步骤8中所述的重结晶方法制备4-(2，6-二氯苯甲酰氨 基)-1H-吡唑-3-甲酸(1-甲磺酰基-哌啶-4-基)-酰胺晶体。
X-射线粉末衍射(XRPD)数据收集的晶体样品通过大理石研钵逐渐研 磨，装载于晶体学毛细管(来自Hampton Research，石英或玻璃型号10， 直径0.4或0.7mm)中。使用CuKα放射(λ＝1.5418)、从Rigaku旋转阳极 RU3HR、Osmic蓝共焦光学镜、1/4χ测角计和Rigaku HTC图像平板检测 器在室温收集衍射图形。旋转轴的同时收集2D图像，检测器至晶体的 距离为250mm。数据收集由CrystalClear软件控制，且通过Datasqueeze 将2D图像转化为1D图(2θ对强度)(在方位角0<χ<360°、以0.01°或0.02° 步在2θ范围3-30°内，对强度求均值)。内部程序AstexXRPD用于1D XRPD 图形(图3)的处理和目测。
表2.主峰的2θ、d-间距和相对强度

实施例4
4-(2，6-二氯苯甲酰氨基)-1H-吡唑-3-甲酸(1-甲磺酰基-哌啶-4-基)-酰胺的物 理化学研究
对通过实施例1步骤8的重结晶方法制备的4-(2，6-二氯苯甲酰氨 基)-1H-吡唑-3-甲酸(1-甲磺酰基-哌啶-4-基)-酰胺晶体进行差示扫描量热法 研究和热重分析。
差示扫描量热法研究
将约1-3mg样品(精确称重)置于铝DSC平锅中，使用铝盖盖上以确保 密闭。然后将样品置于配有液氮冷却装置的Pyris Diamond DSC (Perkin-Elmer)中，使其在25℃平衡，直至见到稳定的热流反应。流速为 20mL/min的干燥氦吹扫气用于产生惰性气氛，防止样品在加热期间氧化。 然后将样品从25-400℃以扫描速度200℃/min扫描，相对温度测量得到 的热流响应(mW)。实验分析之前，将仪器用铟参比标准校准温度和热流。
化合物的DSC扫描显示于图4中。
热重分析
将约5mg样品(精密称重)置于铂TGA平锅中，装载入TGA7比重分 析仪中。然后将研究样品以10℃/min速率加热(从环境温度至300℃)，监 测所得重量的变化。流速20mL/min的干燥氮吹扫气用于产生惰性气氛， 防止样品在加热期间氧化。分析之前，仪器用100mg参比标准校准重量， 用Alumel参比标准校准温度(使用居里点转换温度)。
化合物的重量减少曲线显示于图5中。
结果和结论
由得到的DSC热分析图，可见单个确定、协同的吸热跃迁开始于约 294.5-295℃，表明热诱发晶格熔化。主要熔化吸热之前，无明显的跃迁出 现，表明几乎没有/没有来自样品的化学吸收的(结合的)挥发物的损失(作为 脱水/去溶剂化的结果)以及不存在可检测的无定形内容物。这种缺少水合 或溶剂化的状态使用TGA(图5)证实，其显示至150℃质量损失约0.2％。 这表明该药物存在形式为单独无水晶态，没有可检测的多晶形杂质或多晶 形转化发生。
TGA曲线(图5)显示在约288℃时的明显事件，其在主熔化跃迁之前 开始发生，表明熔化之前和熔化期间样品的小程度热诱发的部分降解。此 降解过程在温度超过300℃时加速。
实施例5
4-(2，6-二氯苯甲酰氨基)-1H-吡唑-3-甲酸(1-甲磺酰基-哌啶-4-基)-酰胺的蒸 汽吸附/解吸附分析
对通过实施例1步骤8的重结晶方法制备的4-(2，6-二氯苯甲酰氨 基)-1H-吡唑-3-甲酸(1-甲磺酰基-哌啶-4-基)-酰胺晶体进行蒸汽吸附/解吸附 分析，以便检测该样品形成水合状态的倾向。
将约20mg样品置于丝网蒸汽吸附天平托盘中，装载入‘IgaSorp’蒸汽 吸附天平(Hiden Analytical Instruments)中，保持25+/-0.1℃。然后，通 过维持0％湿度环境(使用质流控制仪)将样品干燥，直至记录到无进一步的 重量改变。随后，从0-90％相对湿度(％RH)以10％RH增量使样品受到 递增性处理，在每一步骤维持样品直至达到平衡(99.5％的步骤完成)。
一旦达到平衡，仪器之内的％RH变换至下一步骤，重复平衡操作。 完成吸附周期后，将样品使用同样操作干燥。然后监测吸附/解吸附周期期 间的重量变化，使得可以测定样品的吸湿性能。
化合物的蒸汽吸附/解吸附曲线显示于图6中。
样品最初的干燥期间(在0％RH)，可见重量减少约0.01％，对应于除 去分析之前颗粒上存在的松弛结合的物理吸附的或未结合的表面吸附的 水。随后，逐步增加相对湿度至90％RH导致对应的小增幅的重量增加， 90％RH平衡时，总计增加0.24％。在不同湿度储存时这些小程度的质量 吸收是单层水简单表面吸附至颗粒表面的结果，没有真实的晶体水合物明 显形成。这表明就吸湿性而言，此化合物是物理上稳定的，在升高的湿度 条件下储存时不转化为水合状态。
生物活性
实施例6
测量活化CDK2/细胞周期蛋白A激酶抑制活性测定法(IC50)
利用下列方案测定本发明化合物的激酶抑制活性。
将活化CDK2/细胞周期蛋白A(Brown等人，Nat.Cell Biol.，1，438-443， 1999；Lowe，E.D.，等人，Biochemistry，41，15625-15634，2002)在2.5X浓度 测定缓冲液(50mM MOPS pH7.2、62.5mM β-甘油磷酸、12.5mM EDTA、 37.5mM MgCl2、112.5mM ATP、2.5mM DTT、2.5mM正钒酸钠、0.25mg/ml 牛血清白蛋白)中稀释至125pM，取10μl与10μl组蛋白底物混合物(60μl 牛组蛋白H1(Upstate Biotechnology，5mg/ml)、940μl H2O、35μCi γ33P-ATP) 混合，与供试化合物在DMSO(至多2.5％)中的5μl各种稀释液一起加入到 96孔板中。使反应进行2至4小时，然后用过量正磷酸(5μl，2％)终止。 在Millipore MAPH滤板上从磷酸化组蛋白H1中分离未掺入组蛋白H1的 γ33P-ATP。将MAPH平板的各孔用0.5％正磷酸湿润，然后将各孔的反应 产物用Millipore真空过滤单元过滤。在过滤之后，残余物用200μl0.5％正 磷酸洗涤两次。一旦滤器已经干燥，加入20μl Microscint 20闪烁剂，然后 在Packard Topcount上计数30秒。
计算CDK2活性的％抑制并绘图，以便测定抑制50％CDK2活性所需 要的供试化合物浓度(IC50)。
实施例7
测量活化CDK1/细胞周期蛋白B激酶抑制活性测定法(IC50)
CDK1/细胞周期蛋白B测定法等同于上述CDK2/细胞周期蛋白A，除 了使用CDK1/细胞周期蛋白B(Upstate Discovery)和将酶稀释至6.25nM 外。
在CDK2或CDK1测定法中，本发明化合物具有的IC50值小于1μM。
实施例8
GSK3-B激酶抑制活性测定法
将GSK3-β(Upstate Discovery)在25mM MOPS，pH7.00、25mg/ml BSA、0.0025％Brij-35、1.25％甘油、0.5mM EDTA、25mM MgCl2、0.025％ β-巯基乙醇、37.5mM ATP中稀释至7.5nM，取10μl与10μl底物混合物混 合。GSK3-β的底物混合物是12.5μM磷酸-糖原合酶肽-2(Upstate Discovery) 的1ml水溶液，含有35μCi γ33P-ATP。将酶和底物与5μl供试化合物在 DMSO中的各种稀释液(至多2.5％)一起加入到96孔板中。使反应进行3 小时(GSK3-β)，然后用过量正磷酸(5μl，2％)终止。过滤操作方法同上文 活化CDK2/细胞周期蛋白A测定法。
实施例9
抗增殖活性
通过测量化合物抑制多种细胞系的细胞生长的能力测定本发明化合物 的抗增殖活性。利用Alamar Blue测定法(Nociari，M.M、Shalev，A.、Benias， P.、Russo，C.Journal of Immunological Methods 1998，213，157-167)测量对 细胞生长的抑制作用。该方法基于活细胞还原刃天青为其荧光产物试卤灵 的能力。对于每一增殖测定，将细胞接种在96孔板上，使其恢复16小时， 然后加入抑制剂化合物达另外72小时。在孵育期结束时，加入10％(v/v) Alamar Blue，孵育另外6小时，然后在535nM激发/590nM发射下测定荧 光产物。在非增殖细胞测定的情况下，使细胞在汇合下维持96小时，然后 加入抑制剂化合物达另外72小时。如上借助Alamar Blue测定法测定活细 胞数。各细胞系均从ECACC(欧洲动物细胞保藏中心)得到。
特别地，针对得自人结肠癌的HCT-116细胞系(ECACC参考号： 91091005)测定本发明化合物，发现具有的IC50值少于1μM。
实施例10
口服生物利用度的测定
式(I)化合物的口服生物利用度可如下测定。
以以下剂量水平和剂量形式，将供试化合物溶液静脉内(I.V.)和口服施 用于balb/c小鼠；
·1mg/kg IV，在10％DMSO/90％(2-羟丙基)-β-环糊精(25％w/v)中配 制；和
·5mg/kg PO，在10％ DMSO/20％水/70％PEG200中配制。
在给药后的不同时间点，将血样采集至肝素化试管中，收集血浆成分 用于分析。蛋白沉淀后通过LC-MS/MS进行分析，通过与供试化合物的标 准校准线对照将样品定量。曲线下面积(AUC)由血浆水平-时间曲线通过标 准方法计算。口服生物利用度百分数由下列方程计算：
AUCpo  x  剂量IV  x  100
AUCiv     剂量PO
按照该方案，发现当口服途径对小鼠施用时，化合物4-(2，6-二氯-苯甲 酰氨基)-1H-吡唑-3-甲酸(1-甲磺酰基-哌啶-4-基)-酰胺具有40-50％的生物 利用度。
实施例11
异种移植研究
化合物4-(2，6-二氯-苯甲酰氨基)-1H-吡唑-3-甲酸(1-甲磺酰基-哌啶-4- 基)-酰胺在移植有人肿瘤细胞衍生细胞系的裸小鼠中具有抗肿瘤作用。当 以引起肿瘤生物标记抑制的剂量口服给药时，使用该化合物的治疗在这类 皮下植入的异种移植物中引起肿瘤生长抑制。这些生物标记包括细胞周期 蛋白依赖性激酶底物磷酸化的抑制，例如视网膜母细胞瘤蛋白。当以一系 列包括长期给药数周的不同方案给药时，此化合物是有效的。
实施例12
对照实施例
将含有2，6-二氯苯基基团的本发明化合物4-(2，6-二氯-苯甲酰氨 基)-1H-吡唑-3-甲酸(1-甲磺酰基-哌啶-4-基)-酰胺的生物活性与其2，6二氟 苯基类似物的生物活性比较。在我们早先的申请PCT/GB2004/003179(公开 号WO 2005/012256)的实施例131中描述的2，6-二氟苯基类似物具有以下 结构：

更具体而言，就它们的抗CDK2激酶和GSK3β激酶活性以及其抑制 HCT-116人结肠癌细胞增殖的能力而言，对化合物进行比较。激酶抑制活 性和HCT-116抑制活性使用上文阐述的测定方法测定，结果显示于下表。
  现有技术化合物 (PCT/GB2004/003179的 实施例131) 本发明的化合物 CDK2 IC50 0.0022μM 43％@0.0003μM GSK3β IC50 0.014μM 0.22μM HCT-116细胞增殖IC50 0.74μM 0.11μM
由于以下原因，本发明化合物具有超过其二氟-类似物的优点：
·当与其二氟-类似物相比时，本发明化合物具有6-7-倍更有效的抗人结 肠癌HCT-116细胞系增殖效应。
·与其二氟-类似物相比较，本发明化合物具有更高的体外激酶(CDK2) 抑制活性。
·对GSK3β，本发明化合物(0.22μM)具有较其二氟-类似物(0.014μM)较 低的活性。
·与其二氟-类似物(～6-倍)相比较，本发明化合物对CDK抑制相比 GSK3β的选择性更高(>200-倍)。
药物制剂
实施例13
(i)片剂
含有式(I)化合物的片剂组合物如下制备：混合50mg化合物与197mg 作为稀释剂的乳糖(BP)以及3mg作为润滑剂的硬脂酸镁，用已知方法压制 成片剂。
(ii)胶囊剂
胶囊剂如下制备：混合100mg式(I)化合物与100mg乳糖，将所得混 合物装入标准不透明硬明胶胶囊内。
(iii)注射制剂I
通过注射施用的胃肠外组合物可如下制备：将式(I)化合物(例如盐形式) 溶解在含有10％丙二醇的水中，得到1.5重量％的活性化合物浓度。然后 通过过滤将溶液灭菌，装入安瓿内，密封。
(iv)注射制剂II
用于注射的胃肠外组合物如下制备：将式(I)化合物(例如盐形式) (2mg/ml)和甘露醇(50mg/ml)溶解在水中，将溶液无菌过滤，装入可密封的 1mL小瓶或安瓿内。
(v)注射制剂III
用于通过注射或输注静脉内递送的制剂可如下制备：将式(I)化合物(例 如盐形式)以20mg/ml溶解在水中。然后将小瓶密封并高压灭菌。
(vi)注射制剂IV
用于通过注射或输注静脉内递送的制剂可如下制备：将式(I)化合物(例 如盐形式)以20mg/ml溶解在含有缓冲剂的水(例如0.2M乙酸盐pH4.6)中。 然后将小瓶密封并高压灭菌。
(vii)皮下注射制剂
用于皮下施用的组合物如下制备：混合式(I)化合物与药用级玉米油， 产生5mg/ml的浓度。将组合物灭菌并装进适当容器内。
(viii)冷冻干燥制剂
将配制的式(I)化合物的等分试样放入50mL小瓶中并冷冻干燥。在冷 冻干燥期间，在(-45℃)使用一步冷冻方案冷冻该组合物。将温度升到-10℃ 以退火，然后降低至-45℃冷冻，随后于+25℃初次干燥约3400分钟，继 之以二次干燥，温度步增至50℃。在初步和二次干燥期间，压力设置在80 毫托。
(ix)固溶体制剂
将实施例1的化合物和PVP溶解于二氯甲烷/乙醇(1:1)中，浓度为5 至50％(例如16或20％)，使用下表中设置的相应条件将溶液喷雾干燥。 表中给出的数据包括实施例1化合物的浓度、喷雾干燥器的入口和出口温 度、喷雾干燥固体的总收率、喷雾干燥固体中的实施例1化合物的浓度(测 定法)和构成喷雾干燥固体的颗粒的粒子大小分布(P.S.D.)。
  批次 溶液浓度 w/vol 入口温度 出口温度 ％收率 测定 (mg/g) PSD(范围)(μm) BR1A 16％ 140℃ 80℃ 87.00 246.41 4.46-52.76 BR1B 16％ 180℃ 80℃ 97.00 246.65 14.83-91.70 BR2A 20％ 160℃ 80℃ 99.40 239.60 15.86-85.01 BR3A 20％ 180℃ 100℃ 79.50 246.64 15.09-91.84
实施例1化合物和PVP的固溶体可直接填装入硬明胶或HPMC(羟丙 基甲基纤维素)胶囊中，或者与药学上可接受的赋形剂如填充剂、助流剂或 分散剂混合。胶囊可含有实施例1的化合物，其量为2mg至200mg，例如 10、20和80mg。或者，胶囊可含有40mg实施例1的化合物。
实施例14
包含4-(2，6-二氯-苯甲酰氨基)-1H-吡唑-3-甲酸(1-甲磺酰基-哌啶-4-基)-酰胺 在聚乙烯吡咯烷酮(PVP)中的固体分散体的药物制剂
本实施例描述含有4-(2，6-二氯-苯甲酰氨基)-1H-吡唑-3-甲酸(1-甲磺酰 基-哌啶-4-基)-酰胺和K30级聚乙烯吡咯烷酮(Kollidon K30，得自BASF Chem Trade GmbH of Burgbernheim，德国)的喷雾干燥固体分散体的颗粒 组合物的制备。PVP的分子量为44,000-54,000。
固体分散体如下制备：将4-(2，6-二氯-苯甲酰氨基)-1H-吡唑-3-甲酸(1- 甲磺酰基-哌啶-4-基)-酰胺溶解于1:1(v/v)乙醇和二氯甲烷的混合物中，得 到化合物的浓度为50mg/mL，然后加入PVP K30使化合物/PVP的比例为 1:3。
然后，在Niro Mobile Minor 2000喷雾干燥器中将溶解物喷雾干燥。 将从喷雾干燥器收集的粉末在真空下干燥。
喷雾干燥条件如下：
喷口内径(ID)：                 1mm
管道ID：                       3mm
入口温度：                     180℃
排气温度：                     85℃
雾化压力：                     1.0bar
处理气流：                     3.2mbar(83kg/h的氮)
处理气体：                     氮
溶液干重(化合物+PVP)：         1980g
流速：                         123g/min
收率：                         84.85％
干燥后喷雾干燥固体分散体的粒子大小分布使用激光衍射仪测量，得 到如下的D10、D50和D90数值：
D10/μM 17.53
D50/μM 49.08
D90/μM 93.26
以下实施例中，4-(2，6-二氯-苯甲酰氨基)-1H-吡唑-3-甲酸(1-甲磺酰基- 哌啶-4-基)-酰胺在PVP中的固体分散体表示为“式(I)化合物/PVP”。
将以下物质在高剪切混合器中混合30秒：
磷酸二钙(EmcompressTM)          32.8g
硅化微晶纤维素(ProSolv HD90TM)  10.9g
式(I)化合物/PVP                 35.2g
交联羧甲基纤维素钠(Ac-Di-SolTM) 11.1g
然后，使用Freund滚筒碾压机压制粉末混合物。需要以下设置以产 生带状物：
送料速度：60rpm
滚筒速度：2rpm
滚筒压力：180kgf/cm2
将经压制粉末的带状物过710μm的筛子，将得到的颗粒收集于适当的 容器中。将一等份的颗粒物料(9.0g)与另一等份的Ac-Di-Sol(1.0g)混合。测 定可装入0号胶囊的颗粒物料的量(倾置填装(flush-filled)和紧密填塞)。结 果概述如下。

崩解试验
对于速释口服制剂，希望剂型的崩解和活性成分的释放发生在15分钟 内。因此，对所述胶囊剂使用标准片剂/胶囊崩解仪(欧洲药典第4版)进行 崩解试验。蒸馏水用作崩解介质。崩解介质的体积为800mL，温度维持在 37℃(+/-1℃)。制剂的分散/溶出行为评价仅通过观察进行。崩解时间显示 于下表中。
  每胶囊式(I)化合物的量(mg) 崩解时间(分钟) 24.8(倾置填装) 37.9(紧密填塞) 4 5
溶出度试验
将胶囊剂的溶出速率与以下物质的溶出速率比较：(1)不含其它赋形剂 的PVP和式(I)化合物的未包封固体分散体，和(2)紧密填塞于0号胶囊中 的固体分散体(1)，以及(3)配制的样品。
溶出度试验使用如欧洲药典第4版中所述的浆式仪器进行。
溶出研究的结果显示于图7中。
结果显示：未包封固体分散体的溶出度较胶囊样品的溶出度快。紧密 填塞的封囊样品中，PVP可能与颗粒结合在一起，因此延缓式(I)化合物的 释放。有趣的是，配制的样品显示较未配制的封囊样品快得多的化合物释 放曲线，这表明制剂中高比例的崩解剂在对抗PVP的结合能力中是有效 的。
实施例15
制备4-(2，6-二氯-苯甲酰氨基)-1H-吡唑-3-甲酸(1-甲磺酰基-哌啶-4-基)-酰胺 的方法
步骤1-向4-哌啶酮一水合物盐酸盐(0.50g，3.25mmol)的DMF(10mL) 溶液中加入三乙胺(2.44mL，17.6mmol)，将混合物于45℃加热1h。向混合 物中加入甲磺酰氯(0.75mL，9.75mmol)，将混合物于45℃加热18h。将得 到的混合物过滤，滤液在真空中浓缩。将残余物置于EtOAc中，用水洗涤， 有机部分经MgSO4干燥，在真空中浓缩，得到1-甲磺酰基-哌啶-4-酮，为 淡黄色固体(369mg)。
步骤2-向1-甲磺酰基-哌啶-4-酮(130mg，0.73mmol)的DCM(3mL)溶 液中加入冰醋酸(32μl，0.55mmol)、苄胺(108μl，0.99mmol)和NaBH(OAc)3 (232mg，1.09mmol)。将反应混合物在环境温度搅拌18h。将2M NaOH水 溶液(3mL)加入混合物中，分离各层。有机部分经MgSO4干燥，在真空中 浓缩，得到4-苄氧基-1-甲磺酰基-哌啶(160mg)，为黄色固体。
步骤3-转化4-苄氧基-1-甲磺酰基-哌啶以产生1-甲磺酰基-哌啶-4-基 胺可如下完成：将4-苄氧基-1-甲磺酰基-哌啶溶解于适当的溶剂中，在Pd/C 存在下经历氢气氛。
步骤4：

将4-(2，6-二氯-苯甲酰氨基)-1H-吡唑-3-甲酸(3.6g)、1-甲磺酰基-哌啶-4- 基胺三氟乙酸盐(3.53g；1.15当量)、EDC(2.87g；1.25当量)、HOBt(2.02g； 1.25当量)和三乙胺(3.5mL；2.1当量)在DMF(50ml)中的混合物在室温搅拌 20h，然后在真空中浓缩。将残余物用饱和NaHCO3(250mL)研磨，过滤收 集固体，用水洗涤并吸干。经EtOAc热浆液和EtOAc/P.E.(1:1，然后1:0) 洗脱色谱法纯化，得到2.8g(51％)(4-(2，6-二氯-苯甲酰氨基)-1H-吡唑-3-甲 酸(1-甲磺酰基-哌啶-4-基)-酰胺，为白色固体。
实施例17
实施例14的配制产物通过将化合物1在PVP中的固体分散体(化合物 1:PVP的比例为1:3)用药学上可接受的赋形剂干法制粒来制备。将此配制 的产物材料填装入0号胶囊壳中，得到相当于10和40mg化合物1的剂量。 将这些胶囊放置于稳定性的两种不同储存条件下，25℃/60％相对湿度(RH) 和40℃/75％相对湿度。以下数据表明：配制的胶囊在这些储存条件下具有 良好的物理和化学稳定性，和一致的崩解特性。
10mg配制胶囊在泡罩条中储存的稳定性数据概述
  T(℃)/RH 周 外观 鉴别 测定 总杂质 含水量 崩解 0 0 含有白色粉末的 白色胶囊 +ve 97.3％ 0.61％ 4.3％ 3分钟 40秒 25/60 6 含有白色粉末的 白色胶囊 +ve 96.3％ 0.70％ 4.4％ 2分钟 55秒 25/60 12 含有白色粉末的 白色胶囊 +ve 96.3％ 0.76％ 4.4％ 1分钟 57秒 25/60 26 含有白色粉末的 白色胶囊 +ve 98.1％ 1.01％ 4.8％ 2分钟 51秒 25/60 39 含有白色粉末的 白色胶囊 +ve 98.7％ 0.67％ 4.7％ 2分钟 48秒 40/75 6 含有白色粉末的 白色胶囊 +ve 96.2％ 0.69％ 5.5％ 3分钟 24秒 40/75 12 含有白色粉末的 +ve 98.8％ 0.78％ 6.1％ 1分钟
  白色胶囊 57秒 40/75 26 含有白色粉末的 白色胶囊 +ve 98.6％ 0.97％ 7.3％ 3分钟 02秒
40mg配制胶囊在泡罩条中储存的稳定性数据概述
  T(℃)/RH 周 外观 鉴别 测定 总杂质 含水量 崩解 0 0 含有白色粉末的 白色胶囊 +ve 97.9％ 0.63％ 4.8％ 3分钟 24秒 25/60 6 含有白色粉末的 白色胶囊 +ve 98.7％ 0.67％ 2.3％ 1分钟 55秒 25/60 12 含有白色粉末的 白色胶囊 +ve 98.6％ 0.75％ 2.6％ 1分钟 53秒 25/60 26 含有白色粉末的 白色胶囊 +ve 100.4％ 1.04％ 3.3％ 2分钟 54秒 25/60 39 含有白色粉末的 白色胶囊 +ve 99.5％ 0.66％ 2.0％ 3分钟 15秒 40/75 6 含有白色粉末的 白色胶囊 +ve 98.5％ 0.68％ 3.0％ 2分钟 12秒 40/75 12 含有白色粉末的 白色胶囊 +ve 98.9％ 0.80％ 10.4％ 1分钟 22秒 40/75 26 含有白色粉末的 白色胶囊 +ve 98.5％ 1.05％ 6.4％ 3分钟 09秒
等价方式
提供上述实施例的目的在于阐述本发明，不应将其解释为对本发明范 围强加任何限制。显然，可以在不背离本发明基本原理的情况下对上文所 述和实施例中所例举的本发明的具体实施方案进行各种修改和变化。所有 这类修改和变化都为本申请所涵盖。