技术领域
[0001] 本
发明涉及激素股骨头缺血坏死研究领域，特别涉及自噬基因Beclin-1在家兔激素股骨头缺血坏死中的表达方法。
背景技术
[0002] 股骨头缺血性坏死(osteonecrosis of the femoral head,ONFH)是由于各种原因导致的股骨头血液供应障碍或者细胞变性，进一步恶化发生股骨头的塌陷、结构改变以及关节功能障碍的一种
疾病。ONFH通常分为两大类,即创伤性股骨头坏死和非创伤性股骨头坏死，其中非创伤性股骨头坏死以激素性股骨头缺血性坏死(Steroid-induced
avascular necrosis of femoral head，SANFH)为主。自1957年首次报道以来,该病日益增多，病程较长,病因复杂,容易致残。相关研究显示，激素性股骨头坏死临床
治疗极其困难,且效果差,因此又有“不死的癌症”之称。激素导致SANFH具有复杂的
生物学过程。因此，探明SANFH的发病机制，仍然是该领域研究的重要内容。我们的前期研究结果表明，激素对股骨头节段血管中PDGF与VEGF的超强抑制而引起的血供中断与SANFH存在关联性，诸多促血管生长因子及差异表达基因的调控在SANFH中发挥着重要作用。
[0003] 近期研究认为，细胞的死亡方式包括程序性细胞死亡和细胞坏死。其中凋亡和自噬为程序性细胞死亡两大主要分型。自噬是体内重要代谢途径，激素与缺血缺
氧状态是引起的自噬重要诱因，而激素本身又可以引起细胞缺血缺氧。自噬调控的失调与多种疾病有关，如衰老，
炎症性疾病，自身免疫病，
肿瘤等。自噬型细胞死亡已成为近期医学领域研究疾病发生发展过程的热
门课题。
[0004] 而在SANFH的发生过程中，股骨头局部发生缺血缺氧改变时骨细胞、成骨细胞会发生怎样的病理变化？其中的骨细胞、成骨细胞的死亡方式是什么？而又有哪些因素可以促进或抑制上述变化的发生，仍然存在诸多疑问。SANFH发生过程中，是否也存在过度的自噬型细胞死亡？在可能导致的骨细胞、成骨细胞自噬型细胞死亡的过程中是否存在Beclin1基因表达增强？3-MA在调控上述病理变化过程中是否也能扮演同样类似的
角色？上述所有这些疑点都将成为本次课题研究的重要内容。
[0005] 应用肾上腺皮质激素引起的SANFH(Steroid-induced avascular necrosis of femoral head，激素性股骨头缺血坏死)具有复杂的生物学过程，其发病机制仍不清楚。自噬型细胞死亡已成为近年来医学领域研究组织器官衰老、死亡、损伤等发病机制的重要研究方向。我们的前期研究结果表明：激素对股骨头节段血管中PDGF与VEGF的抑制而引起的缺血缺氧状态及其众多差异表达基因的调控与SANFH发生存在关联性。推测由激素导致
SANFH发生过程中极有可能存在细胞自噬型死亡这一生物学特性。
[0006] 如果我们能够通过实验证实在SANFH模型中，存在骨细胞、成骨细胞过度的自噬型细胞死亡，并存在骨细胞、成骨细胞Beclin1基因表达增强。同时，通过3-MA干预、抑制Beclin1蛋白活性，进一步减少骨细胞、成骨细胞自噬发生，进而抑制骨细胞、成骨细胞自噬型细胞死亡，则能进一步证实Beclin1基因表达增强在SANFH中对骨细胞、成骨细胞自噬型细胞死亡所起的作用以及3-MA在逆转SANFH中扮演的重要角色，从而有助于为探明SANFH的发病机理及防治开辟新的思路。
发明内容
[0007] 为解决上述
现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供自噬基因Beclin-1在家兔激素股骨头缺血坏死中的表达方法，通过对家兔直接大剂量注射糖皮质激素，诱导出典型的激素性股骨头缺血坏死的动物模型，在此
基础上对股骨头进行组织形态学、超微结构等观察；并运用RT-PCR、Western Blot、免疫
荧光染色等方法进行综合分析。得出以下结论：SANFH与骨细胞及成骨细胞的自噬型细胞死亡关系密切，骨细胞、成骨细胞中Beclin1基因表达增强可能在骨细胞、成骨细胞自噬型细胞死亡中起着某种重要的作用，3-MA对于SANFH中自噬型细胞死亡可能起到抑制作用，有助于为SANFH病理学机制的进一步研究奠定基础，从而为SANFH的防治提供了一种新的思路或方法。
[0008] 为达到上述目的，本发明的技术方案为：
[0009] 自噬基因Beclin-1在家兔激素股骨头缺血坏死中的表达方法，包括如下步骤：
[0010] 步骤一、造模：取5月龄日本大
耳白兔36只，体重2.5-3.5kg，标准饮食，单笼饲养；随机分成3组；对照组：单纯肌肉注射生理盐
水，2ml/只/次，共4次，间隔一周；SANFH组:肌肉注射甲基强的松龙，4mg/kg，共4次，间隔一周；3-MA治疗组：肌肉注射甲基强的松龙，4mg/kg，共4次，间隔一周，并于注射甲基强的松龙后随即肌肉注射3-MA 2ul/只，共4次，间隔一周；分别将每组实验动物于一周、二周、三周、四周处死，每次处死3只；
[0011] 步骤二、标本制作，造模一周、二周、三周、四周后采用耳缘静脉注射空气的方法分别处死实验动物，每次处死3只，相对无菌条件下取出实验动物双侧后肢的股骨头；取一侧股骨头分为三部分进行
显微镜观察；另一侧股骨头于-80℃冷冻保存，用于进一步检测Beclin1 mRNA与蛋白表达；
[0012] 步骤三、光镜下组织形态学观察
[0013] 取
石蜡包埋组织
块，制成厚4um切片，HE染色，之后将实验切片在光镜下观察，计算空缺骨陷窝百分比；正常空缺骨陷窝率为8％-12％，同等制片条件下股骨头软骨下空缺骨陷窝率超过此数目即提示坏死；
[0014] 步骤四、透射电镜观察自噬体
[0015] 包括：(1)固定脱
钙；(2)在20℃的条件下对透射电镜标本进行梯度酒精脱水；(3)渗透；(4)包埋聚合；(5)利用Leica EM UC6超薄切片机制作超薄切片，经染色等处理后在FEI TECNAI SPIRIT透射电镜下进行标本的观察、分析并摄片；
[0016] 步骤五、RT-PCR检测细胞内Beclin1 mRNA水平
[0017] 包括如下步骤：
[0018] (1)组织mRNA的抽提；
[0019] (2)引物设计；
[0020] GC含量接近45-55％，上下游引物GC含量要保持接近的原则设计引物；选择长度为18-27bp之间，5'端GC含量较多，3'端AT含量较多的引物；以公式Tm＝4*(G+C)+2*(A+T)-5计算T m值 ，T m接 近7 2℃ ；最 终得 到B ec li n1的 上 游引 物序 列为 5’-
ATCCTGGACCGTGTCACCATCCAGG-3’，下游引物序列为5’-GTTGAGCTGAGTGTCCAGCTGG-3’，目的
片段为363bp；β-Actin的上游引物序列为5’-ACTCGTCATACTCCTGCT-3’，下游引物序列为5’-GAAACTACCTTCAACTCC-3’，目的片段132bp；
[0021] (3)逆转录cDNA；
[0022] 1)取模板RNA及解冻
试剂，涡旋混匀，离心后收集残留于管壁的液体，置于
冰上。
[0023] 2)配制引物溶液：EP管3000rpm离心5分钟。每管加50μl RNase-Free ddH2O，生成储存液，浓度为100μM。取新RNase-Free离心管，取5μl储存液，45μl RNase-Free ddH2O，配制引物工作液，浓度为10μM。
[0024] 3)按下表所述DNA去除体系配制
混合液，完全混匀。简短离心，并置于42℃，孵育3min。然后置于冰上放置。
[0025]
[0026] 4)按表2的反转录反应体系配制混合液。
[0027]
[0028] 5)将反转录反应中的Mix，加入gDNA去除的反应液中，混匀。
[0029] 6)42℃，孵育15min。
[0030] 7)95℃，孵育3min后置于冰上，得到cDNA用于后续实验，或者低温保存。
[0031] (4)mRNA的荧光定量PCR
[0032] 1)室温融化引物、cDNA及解冻试剂，轻轻混匀，离心后收集残留于管壁的液体。cDNA模板稀释10倍使用。
[0033] 2)按下表配制反应体系
[0034]
[0035]
[0036] 3)将配制好的反应体系移入八连管，每管反应总体积为20μl，短暂离心收集残留在管壁的液体。将八连管放入PCR仪，按下表设置反应程序。
[0037]
[0038] 4)数据用仪器ABI 7500 Fast荧光定量PCR仪原机
软件进行分析
[0039] 步骤六、Western Blot鉴定蛋白表达量
[0040] 1.2.5.1组织总蛋白的提取
[0041] 将实验标本置于研钵中，放入少量液氮，
研磨，待组织变软，再加液氮，再研磨，反复三次。取20mg研磨组织，放入200ul预冷的组织蛋白抽提试剂，冰上孵育20分钟。4℃10,000×g离心15分钟。收集上清，进行下一步的实验。
[0042] 1.2.5.2细胞总蛋白浓度测定
[0043] 1)各稀释梯度的BSA蛋白标准液的制备。
[0044]
[0045] 2)BCA蛋白定量的工作液的制备：工作液由50份的BCA(A反应液)与1份4％
硫酸铜(B反应液)组成。实验有标准品18个孔，样品8个孔，每孔需配置BCA工作液200ul，需量取A反应液5200ul，B反应液104ul，将溶液混合，现配现用。
[0046] 3)在96孔板中依次加入10ulBSA蛋白标准液，标准孔重复两次。在样品孔中加入1ul待测蛋白样品和9ulPBS，将待测样品稀释。
[0047] 4)每孔加入200ul配制好的BCA工作液。混匀30s，在37℃孵育30min，其后冷却至室温。酶标仪检测570nm吸光值时各孔的吸光度。比照已知BSA量制作的标准曲线为y＝0.0007x+0.0373，R2＝0.9963。
[0048] 5)参照标准曲线，根据各样品蛋白的校正吸光值，读出各样品的蛋白浓度，通过体积和稀释度计算原来样品蛋白量。
[0049] 1.2.5.3 SDS-PAGE
电泳[0050]
[0051] 1)配制10％分离胶，用移液器将配制好的分离胶缓慢加入装配好的玻璃板中，液面高度距玻璃板的顶端3cm，液面上加一层双蒸水，放置20min至分离胶完全
凝固后，见分离胶与双蒸水之间有一折射线。
[0052] 2)制备5％浓缩胶，
滤纸吸去分离胶表面的双蒸水，用移液器将配制好的浓缩胶加入玻璃板至顶端，小心插入梳子，注意不产生气泡，放置20min至浓缩胶完全凝固。
[0053] 3)电泳槽中加入电泳缓冲液，垂直拔出梳子，据蛋白定量结果计算每孔加入等量蛋白，将蛋白样本和蛋白上样缓冲液按4:1混合，95℃煮沸5min，取出后置于冰上。
[0054] 4)将分子量蛋白标准3-MA marker和准备好的蛋白样本依次加入到各个上样孔内。
[0055] 5)连接电泳仪，80V
电压电泳1小时至使溴酚蓝染料接近分离胶顶端，然后调至160V电压电泳1.5-2小时至溴酚蓝接近分离胶底部即停。
[0057] 1)取出分离胶，
切除多余部分，量取目的蛋白所在的胶面大小，据胶面大小切取一张比分离胶稍大的NC膜，6张大小与凝胶相当的滤纸，与分离胶胶一起浸泡于转膜缓冲液中。NC膜需浸泡于双蒸水中10min后也转移转膜缓冲液中。
[0058] 2)在承有转膜液的托盘中打开转膜夹，在转膜夹的黑面上依次放置海绵垫、三张滤纸、分离胶、NC膜、三张滤纸、海绵垫，尽量使各层之间没有气泡，然后盖紧转膜夹，放入转膜槽中。
[0059] 3)倒入转膜液，连接电泳仪，1353-MA转膜1.5小时。
[0061] 1)取出NC膜，紧贴胶面的膜面为蛋白面，将膜的蛋白面朝上，在承有封闭液的玻璃皿中室温缓慢震摇封闭1h。
[0062] 2)根据目的蛋白大小，参考标准蛋白3-MArker估计目的蛋白
位置，将NC膜剪开，蛋白面向离心管中心分别放在承有稀释后一抗的10ml离心管中4℃翻转摇匀机过夜。一抗稀释比例为：Beclin1(1:1000)，内参β-Actin(1:1000)。
[0063] 3)将膜从一抗孵育管中取出，在承有TBST的玻璃皿中室温缓慢震摇洗涤3次，每次10min，洗涤时膜的蛋白面朝上。
[0064] 4)避光稀释荧光二抗，稀释比例为1:10000，将蛋白膜的蛋白面向离心管中心转移入承有稀释后二抗的10ml离心管，室温避光翻转摇匀1h。
[0065] 5)将膜从二抗中取出，在TBST中缓慢震摇洗涤2次，每次10min。在TBS中缓慢震摇洗涤10min，洗涤时膜的蛋白面朝上。
[0066] 6)将膜取出后放入ODESSY荧光红外扫描系统中检测目的蛋白的表达情况。
[0067] 步骤七、免疫荧光检测GFP-Beclin1蛋白表达
[0068] 1)修块：取出甲
醛固定的股骨头组织，修为厚约3mm，长宽约1cm组织块，流水冲洗24h
[0069] 2)脱水：60％
乙醇60分→75％乙醇60分→80％乙醇40分→85％乙醇30分→90％乙醇30分→95％乙醇Ⅰ 30分→95％乙醇Ⅱ 30分→100％乙醇Ⅰ 30分→100％乙醇Ⅱ 30分
[0070] 3)透明：二
甲苯Ⅰ 15分→二甲苯Ⅱ 20分
[0071] 4)包埋：60℃，蜡缸Ⅰ 60分→蜡缸Ⅱ 60分，包埋后常温保存蜡块，切片时预冷30分[0072] 5)切片：石蜡切片厚度为4um，42℃水温展片，50℃烤片机烤30分，60℃温箱过夜，保存。注：所用
载玻片经过APES(3-
氨丙基三乙氧
硅烷)挂胶处理
[0073] 6)烤片：60℃温箱2h以上
[0074] 7)脱蜡：二甲苯Ⅰ、Ⅱ各10分钟
[0075] 8)水化：100％乙醇Ⅰ 10分→100％乙醇Ⅱ 10分→95％乙醇Ⅰ 5分→95％乙醇Ⅱ 5分→80％乙醇5分
[0076] 9)PBS摇床洗5分*3次
[0077] 10)
抗原修复：
微波炉热修复法，将切片置
柠檬酸抗原修复液内(pH6.0)，
微波炉热修复(95℃～98℃10min)，室温冷却，0.01mol/LPBS浸洗5min*3次。
[0078] 11)一抗：Beclin1一抗稀释200倍，滴加于切片上，将组织完全盖住，湿盒37℃温育1h。
[0079] 12)PBS摇床洗5分*5次
[0080] 13)二抗：避光稀释二抗200倍，滴加稀释后的二抗，将组织完全盖住，湿盒37℃温育1h。
[0081] 14)PBS摇床洗5分*5次
[0082] 15)DAPI染核：DAPI稀释500倍后，滴加，完全盖住组织为宜，湿盒常温10分钟，PBS摇床洗5分*5次。
[0083] 16)封片：40％的甘油封片
[0084] 17)使用荧光显微镜观察并采集相关图片。
[0085] 步骤八、统计处理
[0086] 用spssl3.0统计软件进行结果统计；mean士SD描述，两组之间比较进行t检验，四组间比较进行方差分析，统计结果用以P<0.05有差异，具有显著性统计学意义。
[0087] 进一步的、所述步骤二中，一侧股骨头分为三部分进行显微镜观察；具体为①第一部分置于10％甲醛溶液固定，供光镜进行观察；②第二部分置于5﹪戊二醛溶液,供透射电镜进行观察；③第三部分置于10％甲醛溶液固定，供免疫荧光进行观察。
[0088] 进一步的、步骤三中，HE染色的具体步骤为：A、二甲苯Ⅰ 5min；B、二甲苯Ⅱ 5min；C、95％乙醇Ⅰ 3min；D、95％乙醇Ⅱ 3min；E、80％乙醇1min；F、蒸馏水1min；G、苏木精液染色
10min；H、流水稍洗去苏木精液3s；I、1％
盐酸乙醇3s；J、稍水洗30s；K、促蓝液返蓝30s；L、流水冲洗15min；M、蒸馏水过洗2s；N、0.5％曙红液染色3min；O、蒸馏水稍洗2s；P、80％乙醇稍洗2s；Q、95％乙醇Ⅰ 5min；R、95％乙醇Ⅱ 5min；S、无水乙醇5min；T、无水乙醇5min；U、二甲苯Ⅰ 5min；V、二甲苯Ⅱ 5min；W、二甲苯Ⅲ 5min；X、中性树胶封固。
[0089] 进一步的、所述步骤四、透射电镜观察自噬体的具体操作为：
[0090] (1)固定脱钙：首先将股骨头标本进一步切割成大小2mm3的组织标本块，并将其放置于5％戊二醛中在4℃的
冰箱中固定24小时；然后再将骨标本置于2.5％戊二醛-5.5％EDTA-Na2混合固定并脱钙24小时到72小时，期间行间断性摇荡，直到达到大头针可以扎透为止；用PBS液充分冲洗标本2次，每次10分钟；弃除废液，在4℃的环境中将骨标本于1％锇酸的四氧化锇固定液中固定2小时；
[0091] (2)在20℃的条件下对透射电镜标本进行梯度酒精脱水：在30％酒精中15分钟——50％酒精中15分钟——70％酒精中4小时——在80％酒精中15分钟——95％的酒精中15分钟——在无水乙醇中15分钟——在无水乙醇中15分钟；
[0092] (3)渗透：环氧丙烷15分钟；环氧丙烷与EPON812于室温下进行等比例混合2小时；环氧丙烷与EPON812于室温下1：2混合4小时；在37℃下纯EPON812，4小时；
[0093] (4)包埋聚合：配置A液-EPON812(1ml)+DDSA(1.6ml)，充分搅拌约2小时；B液-EPON812(10ml)+MNA(9ml)，充分搅拌约2小时；将A液与B液充分混合1小时之后滴加0.345ml DMP-30并于1小时后进行包埋；样品包埋后置入
烤箱进行聚合：经过37℃16小时——45℃12小时——60℃14小时，聚合变硬后取出样品并用温水去除胶囊壳，最后将包埋块清理干净以备切片；
[0094] (5)利用Leica EM UC6超薄切片机制作超薄切片，经染色等处理后在FEITECNAI SPIRIT透射电镜下进行标本的观察、分析并摄片。
[0095] 进一步的、所述步骤五中，组织mRNA的抽提具体步骤为：
[0096] 1)将50mg保存骨组织加入1mlTRNzol，使用仪将其处理；
[0097] 2)将匀浆样品于15-30℃静置5min，使其核酸蛋白复合物完全分离；
[0098] 3)4℃12,000rpm离心10min，取上清；
[0099] 4)将其加入0.2ml氯仿，盖好盖，
旋涡混合15sec，室温静置3min；
[0100] 5)4℃12,000rpm离心15min，样品分为三层，将上层样品移至新离心管；
[0101] 6)加入相同体积的异丙醇，使其混匀，室温静置20-30min；
[0102] 7)4℃12,000rpm离心10min，去上清，离心后RNA在管侧和管底形成胶状沉淀；
[0103] 8)加入1ml75％乙醇(RNase-Free ddH2O配置)洗涤沉淀。4℃5,000rpm离心3min，弃上清；
[0104] 9)室温晾干，加入50ul RNase-Free ddH2O，反复吹打、混匀，使RNA充分溶解。
[0105] 相对于现有技术，本发明的有益效果为：
[0106] 本发明自噬基因Beclin-1在家兔激素股骨头缺血坏死中的表达方法方法利用HE染色计数空缺骨陷窝,透射电镜检测骨细胞、成骨细胞自噬型细胞死亡情况，RT-PCR、
western blotting检测Beclin1的mRNA与蛋白表达,免疫荧光检测GFP-Beclin1蛋白表达；
并通过给实验组动物注射3-MA(3-Methyladenine,3-甲基腺嘌呤)来调控这一生物学过程,进一步探讨SANFH的发病机制。结果RT-PCR:SANFH组的Beclin1 mRNA呈高表达,3-MA治疗组中骨细胞的Beclin1 mRNA表达量较SANFH组均降低。Western Blot:第一周、第二周SANFH组中Beclin1蛋白高表达,3-MA治疗组中Beclin1蛋白表达明显下降。免疫荧光染色:SANFH组中骨细胞、成骨细胞的GFP-Beclin1融合蛋白表达均较对照组升高，给予3-MA后可以部分减弱GFP-Beclin1融合蛋白表达。结论骨细胞及成骨细胞的自噬型细胞死亡可能与SANFH关系密切。Beclin1基因表达增强很可能在骨细胞、成骨细胞自噬型细胞死亡中起着某种重要的作用；3-MA对于SANFH中自噬型细胞死亡可能起到抑制作用。通过3-MA可能抑制或降低其活性(抑制Beclin1基因表达)，进而抑制或降低骨细胞、成骨细胞自噬型细胞死亡的发生，则有助于为SANFH病理学机制的进一步研究奠定基础，从而为SANFH的防治提供新的思路或方法。
附图说明
[0107] 图1为光镜下观察空缺骨陷窝，其中，图1a为SANFH组光镜下观察空缺骨陷窝，图1b为3-MA治疗组光镜下观察空缺骨陷窝；
[0108] 图2为透射电镜下对自噬的观察图，
[0109] 其中，注※ 胞膜出现发泡、内陷 自噬溶酶体 自噬体 细胞核；
[0110] 图3为不同时间段各组骨细胞中Beclin1的mRNA表达情况图；
[0111] 图4为骨细胞中Beclin1蛋白的表达图；
[0112] 图5为家兔股骨头骨细胞中Beclin1蛋白灰度值比值图；
[0113] 图6为实验第一周GFP-Beclin1融合蛋白表达(绿色)与DAPI(蓝色)merge图；
[0114] 图7为实验第二周GFP-Beclin1融合蛋白表达(绿色)与DAPI(蓝色)merge图；
[0115] 图8为实验第三周GFP-Beclin1融合蛋白表达(绿色)与DAPI(蓝色)merge图；
[0116] 图9为实验第四周GFP-Beclin1融合蛋白表达(绿色)与DAPI(蓝色)merge图；
[0117] 图10为家兔股骨头骨细胞、成骨细胞中GFP-Beclin1融合蛋白表达积分光
密度值图。
具体实施方式
[0118] 下面结合附图和具体实施方式对本发明技术方案做进一步详细描述：
[0119] 实验例：
[0120] 1.材料与方法
[0121] 1.1材料
[0122] 1.1.1造模：5月龄日本大耳白兔36只，体重2.5-3.5kg，标准饮食，单笼饲养。随机分成3组。对照组：单纯肌肉注射生理盐水，2ml/只/次，共4次，间隔一周；SANFH组:肌肉注射甲基强的松龙，4mg/kg，共4次，间隔一周；3-MA治疗组：肌肉注射甲基强的松龙，4mg/kg，共4次，间隔一周，并于注射甲基强的松龙后随即肌肉注射3-MA2ul/只，共4次，间隔一周。分别将每组实验动物于一周、二周、三周、四周处死，每次处死3只。
[0123] 1.1.2主要试剂
[0124]
[0125]
[0126] 1.1.3主要溶液配制
[0127] 1)0.1M
磷酸盐缓冲液(PBS)配制：
[0128]
[0129] 置于10000mL蒸馏水内，使其PH值在7.2-7.4。
[0130] 2)0.01M柠檬酸配制：
[0131] 柠檬酸三钠 6g
[0132] 柠檬酸 0.8g
[0133] 置于2000mL蒸馏水内，使其PH值为6.0左右。
[0134] 3)4％甲醛溶液配制：
[0135] 40％甲醛 50mL
[0136] PBS 450mL
[0137] 混合均匀后为4％甲醛溶液500mL(或叫10％福尔
马林溶液)
[0138] 4)Western Blot中液体的配制
[0139]
[0140]
[0141] 1.1.4主要仪器
[0142]
[0143]
[0144] 1.2方法
[0145] 1.2.1标本的制作
[0146] 造模一周、二周、三周、四周后采用耳缘静脉注射空气的方法分别处死实验动物，每次处死3只，相对无菌条件下取出实验动物双侧后肢的股骨头。左侧股骨头分为三部分：①第一部分置于10％甲醛溶液固定，供光镜进行观察。②第二部分置于5﹪戊二醛溶液,供透射电镜进行观察。③第三部分置于10％甲醛溶液固定，供免疫荧光进行观察。右侧股骨头于-80℃冷冻保存，用于进一步检测Beclin1 mRNA与蛋白表达。
[0147] 1.2.2光镜下组织形态学观察
[0148] 取石蜡包埋组织块，制成厚4um切片，HE染色：A、二甲苯Ⅰ 5min；B、二甲苯Ⅱ 5min；C、95％乙醇Ⅰ 3min；D、95％乙醇Ⅱ 3min；E、80％乙醇1min；F、蒸馏水1min；G、苏木精液染色
10min；H、流水稍洗去苏木精液3s；I、1％盐酸乙醇3s；J、稍水洗30s；K、促蓝液返蓝30s；L、流水冲洗15min；M、蒸馏水过洗2s；N、0.5％曙红液染色3min；O、蒸馏水稍洗2s；P、80％乙醇稍洗2s；Q、95％乙醇Ⅰ 5min；R、95％乙醇Ⅱ 5min；S、无水乙醇5min；T、无水乙醇5min；U、二甲苯Ⅰ 5min；V、二甲苯Ⅱ 5min；W、二甲苯Ⅲ 5min；X、中性树胶封固。将实验切片在光镜下观察，计算空缺骨陷窝百分比。正常空缺骨陷窝率为8％-12％，同等制片条件下股骨头软骨下空缺骨陷窝率超过此数目即提示坏死。
[0149] 1.2.3透射电镜观察自噬体
[0150] (1)固定脱钙：首先将股骨头标本进一步切割成大小约2mm3的组织标本块，并将其放置于5％戊二醛中在4℃的冰箱中固定24小时；然后再将骨标本置于2.5％戊二醛-5.5％EDTA-Na2混合固定并脱钙24小时到72小时，期间行间断性摇荡，直到达到大头针可以扎透为止；用PBS液充分冲洗标本2次，每次10分钟；弃除废液，在4℃的环境中将骨标本于四氧化锇固定液(1％锇酸)中固定2小时。
[0151] (2)在20℃的条件下对透射电镜标本进行梯度酒精脱水：在30％酒精中15分钟——50％酒精中15分钟——70％酒精中4小时——在80％酒精中15分钟——95％的酒精中15分钟——在无水乙醇中15分钟——在无水乙醇中15分钟。
[0152] (3)渗透：环氧丙烷15分钟；环氧丙烷与EPON812于室温下进行等比例混合2小时；环氧丙烷与EPON812于室温下1：2混合4小时；在37℃下纯EPON8124小时。
[0153] (4)包埋聚合：配置A液-EPON812(1ml)+DDSA(1.6ml)，充分搅拌约2小时；B液-EPON812(10ml)+MNA(9ml)，充分搅拌约2小时。将A液与B液充分混合1小时之后滴加
0.345mlDMP-30并于1小时后进行包埋；样品包埋后置入烤箱进行聚合：经过37℃16小
时——45℃12小时——60℃14小时，聚合变硬后取出样品并用温水去除胶囊壳，最后将包埋块清理干净以备切片。
[0154] (5)利用Leica EM UC6超薄切片机制作超薄切片，经染色等处理后在FEITECNAI SPIRIT透射电镜下进行标本的观察、分析并摄片。
[0155] 1.2.4 RT-PCR检测细胞内Beclin1 mRNA水平
[0156] 1.2.4.1组织mRNA的抽提
[0157] 1)将50mg保存骨组织加入1mlTRNzol，使用仪将其处理。
[0158] 2)将匀浆样品于15-30℃静置5min，使其核酸蛋白复合物完全分离。
[0159] 3)4℃12,000rpm离心10min，取上清。
[0160] 4)将其加入0.2ml氯仿，盖好盖，旋涡混合15sec，室温静置3min。
[0161] 5)4℃12,000rpm离心15min，样品分为三层，将上层样品移至新离心管。
[0162] 6)加入相同体积的异丙醇，使其混匀，室温静置20-30min。
[0163] 7)4℃12,000rpm离心10min，去上清，离心后RNA在管侧和管底形成胶状沉淀。
[0164] 8)加入1ml75％乙醇(RNase-Free ddH2O配置)洗涤沉淀。4℃5,000rpm离心3min，弃上清。
[0165] 9)室温晾干，加入50ul RNase-Free ddH2O，反复吹打、混匀，使RNA充分溶解。
[0166] 1.2.4.2引物设计
[0167] GC含量接近45-55％，上下游引物GC含量要保持接近的原则设计引物。选择长度为18-27bp之间，5'端GC含量较多，3'端AT含量较多的引物。以公式Tm＝4*(G+C)+2*(A+T)-5计算T m值 ，T m接 近7 2℃ 。最 终得 到B ec li n1的 上 游引 物序 列为 5’-
ATCCTGGACCGTGTCACCATCCAGG-3’，下游引物序列为5’-GTTGAGCTGAGTGTCCAGCTGG-3’，目的片段为363bp。β-Actin的上游引物序列为5’-ACTCGTCATACTCCTGCT-3’，下游引物序列为5’-GAAACTACCTTCAACTCC-3’，目的片段132bp。
[0168] 1.2.4.3逆转录cDNA
[0169] 1)取模板RNA及解冻试剂，涡旋混匀，离心后收集残留于管壁的液体，置于冰上。
[0170] 2)配制引物溶液：EP管3000rpm离心5分钟。每管加50μl RNase-Free ddH2O，生成储存液，浓度为100μM。取新RNase-Free离心管，取5μl储存液，45μl RNase-Free ddH2O，配制引物工作液，浓度为10μM。
[0171] 3)按下表所述DNA去除体系配制混合液，完全混匀。简短离心，并置于42℃，孵育3min。然后置于冰上放置。
[0172]
[0173] 4)按表2的反转录反应体系配制混合液。
[0174]
[0175] 5)将反转录反应中的Mix，加入gDNA去除的反应液中，混匀。
[0176] 6)42℃，孵育15min。
[0177] 7)95℃，孵育3min后置于冰上，得到cDNA用于后续实验，或者低温保存。
[0178] 1.2.4.4mRNA的荧光定量PCR
[0179] 1)室温融化引物、cDNA及解冻试剂，轻轻混匀，离心后收集残留于管壁的液体。cDNA模板稀释10倍使用。
[0180] 2)按下表配制反应体系
[0181]
[0182]
[0183] 3)将配制好的反应体系移入八连管，每管反应总体积为20μl，短暂离心收集残留在管壁的液体。将八连管放入PCR仪，按下表设置反应程序。
[0184]
[0185] 4)数据用仪器ABI 7500 Fast荧光定量PCR仪原机软件进行分析
[0186] 1.2.5 Western Blot鉴定蛋白表达量
[0187] 1.2.5.1组织总蛋白的提取
[0188] 将实验标本置于研钵中，放入少量液氮，研磨，待组织变软，再加液氮，再研磨，反复三次。取20mg研磨组织，放入200ul预冷的组织蛋白抽提试剂，冰上孵育20分钟。4℃10,000×g离心15分钟。收集上清，进行下一步的实验。
[0189] 1.2.5.2细胞总蛋白浓度测定
[0190] 1)各稀释梯度的BSA蛋白标准液的制备。
[0191]
[0192] 2)BCA蛋白定量的工作液的制备：工作液由50份的BCA(A反应液)与1份4％硫酸铜(B反应液)组成。实验有标准品18个孔，样品8个孔，每孔需配置BCA工作液200ul，需量取A反应液5200ul，B反应液104ul，将溶液混合，现配现用。
[0193] 3)在96孔板中依次加入10ulBSA蛋白标准液，标准孔重复两次。在样品孔中加入1ul待测蛋白样品和9ulPBS，将待测样品稀释。
[0194] 4)每孔加入200ul配制好的BCA工作液。混匀30s，在37℃孵育30min，其后冷却至室温。酶标仪检测570nm吸光值时各孔的吸光度。比照已知BSA量制作的标准曲线为y＝0.0007x+0.0373，R2＝0.9963。
[0195] 5)参照标准曲线，根据各样品蛋白的校正吸光值，读出各样品的蛋白浓度，通过体积和稀释度计算原来样品蛋白量。
[0196] 1.2.5.3 SDS-PAGE电泳
[0197]
[0198] 1)配制10％分离胶，用移液器将配制好的分离胶缓慢加入装配好的玻璃板中，液面高度距玻璃板的顶端3cm，液面上加一层双蒸水，放置20min至分离胶完全凝固后，见分离胶与双蒸水之间有一折射线。
[0199] 2)制备5％浓缩胶，滤纸吸去分离胶表面的双蒸水，用移液器将配制好的浓缩胶加入玻璃板至顶端，小心插入梳子，注意不产生气泡，放置20min至浓缩胶完全凝固。
[0200] 3)电泳槽中加入电泳缓冲液，垂直拔出梳子，据蛋白定量结果计算每孔加入等量蛋白，将蛋白样本和蛋白上样缓冲液按4:1混合，95℃煮沸5min，取出后置于冰上。
[0201] 4)将分子量蛋白标准3-MA marker和准备好的蛋白样本依次加入到各个上样孔内。
[0202] 5)连接电泳仪，80V电压电泳1小时至使溴酚蓝染料接近分离胶顶端，然后调至160V电压电泳1.5-2小时至溴酚蓝接近分离胶底部即停。
[0203] 1.2.5.4蛋白质转膜
[0204] 1)取出分离胶，切除多余部分，量取目的蛋白所在的胶面大小，据胶面大小切取一张比分离胶稍大的NC膜，6张大小与凝胶相当的滤纸，与分离胶胶一起浸泡于转膜缓冲液中。NC膜需浸泡于双蒸水中10min后也转移转膜缓冲液中。
[0205] 2)在承有转膜液的托盘中打开转膜夹，在转膜夹的黑面上依次放置海绵垫、三张滤纸、分离胶、NC膜、三张滤纸、海绵垫，尽量使各层之间没有气泡，然后盖紧转膜夹，放入转膜槽中。
[0206] 3)倒入转膜液，连接电泳仪，1353-MA转膜1.5小时。
[0207] 1.2.5.5膜的封闭和抗体孵育
[0208] 1)取出NC膜，紧贴胶面的膜面为蛋白面，将膜的蛋白面朝上，在承有封闭液的玻璃皿中室温缓慢震摇封闭1h。
[0209] 2)根据目的蛋白大小，参考标准蛋白3-MArker估计目的蛋白位置，将NC膜剪开，蛋白面向离心管中心分别放在承有稀释后一抗的10ml离心管中4℃翻转摇匀机过夜。一抗稀释比例为：Beclin1(1:1000)，内参β-Actin(1:1000)。
[0210] 3)将膜从一抗孵育管中取出，在承有TBST的玻璃皿中室温缓慢震摇洗涤3次，每次10min，洗涤时膜的蛋白面朝上。
[0211] 4)避光稀释荧光二抗，稀释比例为1:10000，将蛋白膜的蛋白面向离心管中心转移入承有稀释后二抗的10ml离心管，室温避光翻转摇匀1h。
[0212] 5)将膜从二抗中取出，在TBST中缓慢震摇洗涤2次，每次10min。在TBS中缓慢震摇洗涤10min，洗涤时膜的蛋白面朝上。
[0213] 6)将膜取出后放入ODESSY荧光红外扫描系统中检测目的蛋白的表达情况。
[0214] 1.2.6免疫荧光
[0215] 1)修块：取出甲醛固定的股骨头组织，修为厚约3mm，长宽约1cm组织块，流水冲洗24h
[0216] 2)脱水：60％乙醇60分→75％乙醇60分→80％乙醇40分→85％乙醇30分→90％乙醇30分→95％乙醇Ⅰ 30分→95％乙醇Ⅱ 30分→100％乙醇Ⅰ 30分→100％乙醇Ⅱ 30分
[0217] 3)透明：二甲苯Ⅰ 15分→二甲苯Ⅱ 20分
[0218] 4)包埋：60℃，蜡缸Ⅰ 60分→蜡缸Ⅱ 60分，包埋后常温保存蜡块，切片时预冷30分[0219] 5)切片：石蜡切片厚度为4um，42℃水温展片，50℃烤片机烤30分，60℃温箱过夜，保存。注：所用载玻片经过APES(3-氨丙基三乙氧硅烷)挂胶处理
[0220] 6)烤片：60℃温箱2h以上
[0221] 7)脱蜡：二甲苯Ⅰ、Ⅱ各10分钟
[0222] 8)水化：100％乙醇Ⅰ 10分→100％乙醇Ⅱ 10分→95％乙醇Ⅰ 5分→95％乙醇Ⅱ 5分→80％乙醇5分
[0223] 9)PBS摇床洗5分*3次
[0224] 10)抗原修复：微波炉热修复法，将切片置柠檬酸抗原修复液内(pH6.0)，微波炉热修复(95℃～98℃10min)，室温冷却，0.01mol/LPBS浸洗5min*3次。
[0225] 11)一抗：Beclin1一抗稀释200倍，滴加于切片上，将组织完全盖住，湿盒37℃温育1h。
[0226] 12)PBS摇床洗5分*5次
[0227] 13)二抗：避光稀释二抗200倍，滴加稀释后的二抗，将组织完全盖住，湿盒37℃温育1h。
[0228] 14)PBS摇床洗5分*5次
[0229] 15)DAPI染核：DAPI稀释500倍后，滴加，完全盖住组织为宜，湿盒常温10分钟，PBS摇床洗5分*5次。
[0230] 16)封片：40％的甘油封片
[0231] 17)使用荧光显微镜观察并采集相关图片。
[0232] 1.3统计处理
[0233] 用spssl3.0统计软件进行结果统计。mean±SD描述，两组之间比较进行t检验，四组间比较进行方差分析，统计结果用以P<0.05有差异，具有显著性统计学意义。
[0234] 2.结果
[0235] 2.1光镜下组织形态学观察
[0236] 对照组各周标本观察结果均未见明显空缺骨陷窝出现；SANFH组、3-MA治疗组两组中各周标本观察结果均可见不同程度的空缺骨陷窝出现，且百分比均大于正常空缺骨陷窝标准，即出现了激素性股骨头缺血坏死。如第二周SANFH组：空缺骨陷窝明显增加(图1a)。第二周3-MA治疗组：空缺骨陷窝增加，较SANFH组减少(图1b)。
[0237] 2.2透射电镜观察
[0238] 通过透射电镜我们在SANFH组和3-MA治疗组骨组织病理标本中可观察到：部分骨细胞出现核固缩现象(可同时存在凋亡)，细胞内有肿胀的细胞器，胞膜出现发泡、内陷，早期自噬发生时胞浆及核质发暗，晚期时部分自噬体内出现灰白色；有包绕胞浆趋势的双层或多层膜样结构；可见包绕
破碎、降解成分的
单层膜结构(图2)。
[0239] 2.3荧光定量PCR检测组织中Beclin1 mRNA表达。
[0240] 荧光定量PCR检测骨细胞中Beclin1的mRNA表达情况。以β-Actin作为内参，由以下公式求出ΔΔCT＝(CT靶基因-CTβ-Actin)实验组-(CT靶基因-CTβ-Actin)对照组，应用双ΔΔCT分析法计算出RQ＝2-ΔΔCT(见图3)，结果示：在实验的前三周，激素诱导股骨头坏死组兔子股骨头内骨细胞中Beclin1 mRNA均明显高于对照组，尤其是第一周，SANFH组骨细胞内Beclin1 mRNA表达量是对照组的16倍。且随着用药时间的延长，SANFH组骨细胞内Beclin1 mRNA表达量逐渐下降，而对照组骨细胞内Beclin1 mRNA表达量略有升高，至第四周SANFH组骨细胞内Beclin1 mRNA表达量低于对照组。给予3-MA治疗后骨细胞内Beclin1 mRNA表达量较SANFH组均降低。采用单因素方差分析不同时间段三组骨细胞Beclin1的mRNA表达均有统计学差异(p<0.05,见表2-1)，进一步采用LSD-t检验进行两组之间比较，仅第一周对照组与3-MA治疗组差异无统计学意义，第三周对照组与SANFH组差异无统计学意义，其余各组间差异均有统计学意义(p<0.05)。
[0241] 表2-1不同时间段各组骨细胞中Beclin1的mRNA表达统计分析
[0242]
[0243] *P<0.05
[0244] 2.4 Western Blot鉴定骨细胞中Beclin1蛋白表达量
[0245] 提取兔股骨头组织中的蛋白，进行Western Blot免疫印迹法蛋白分析实验，以内参(β-actin)为参照物，对细胞蛋白表达进行蛋白定量(见图4)。分别测量内参蛋白和Beclin1蛋白条带的灰度值，各组内参蛋白表达无统计学差异(F＝0.619，P＝0.975，且LSD-t检验进行两两对比，各组间内参蛋白表达均无统计学差异)。计算灰度值比值＝灰度
值Beclin1/灰度值β-actin(见图5)，进行单因素方差分析(见表2-2)，结果显示实验第一周、第二周三组骨细胞中Beclin1蛋白表达有统计学差异(P<0.05)，第三周、第四周三组骨细胞中Beclin1蛋白表达无统计学差异(P>0.05)。进一步进行LSD-t检验，结果显示第一周对照组与SANFH组Beclin1蛋白表达有统计学差异(P＝0.033，P<0.05)，SANFH组Beclin1蛋白表达明显增多，SANFH组与3-MA治疗组Beclin1蛋白表达也有统计学差异(P＝0.007，P<0.05)，经
3-MA治疗的兔子股骨头Beclin1蛋白表达明显下降，且接近对照组(P＝0.267，P>0.05)。同样，在实验第二周也表现相同的趋势，SANFH组Beclin1蛋白表达明显增多(P＝0.035，P<
0.05)，经3-MA治疗的兔子股骨头Beclin1蛋白表达明显下降(P＝0.024，P<0.05)，且接近对照组(P＝0.790，P>0.05)。而在实验的第三周、第四周，三组间Beclin1蛋白表达均无统计学差异(P>0.05)。
[0246] 表2-2骨细胞中Beclin1蛋白表达的统计分析
[0247]
[0248] *P<0.05
[0249] 2.5免疫荧光染色检测骨细胞、成骨细胞中GFP-Beclin1融合蛋白
[0250] 用带有荧光色素标记的抗体处理股骨头
组织切片，荧光抗原与骨细胞、成骨细胞内的GFP-Beclin1融合蛋白特异性结合，在荧光显微镜下使GFP-Beclin1融合蛋白呈现出绿色荧光。DAPI(4,6-diamidino-2-phenylindole，4,6二脒基-2-苯吲哚)能与双链DNA特异性结合，结合后呈现蓝色荧光。将两种荧光图重叠，可以观察细胞内GFP-Beclin1融合蛋白表达情况(见图6至图9)。分别测量免疫荧光的积分光密度值(见表2-3，图10)，结果显示不同时间段内SANFH组骨细胞内GFP-Beclin1融合蛋白表达均较对照组升高，细胞内可见绿色强荧光，与周围组织反差鲜明。给予3-MA治疗可以部分减弱GFP-Beclin1融合蛋白表达，骨细胞、成骨细胞内也可见绿色强荧光，但较SANFH组荧光强度弱，数量少。
[0251] 表2-3家兔股骨头骨细胞、成骨细胞中GFP-Beclin1融合蛋白表达积分光密度值
[0252]
[0253] 3.讨论
[0254] 股骨头缺血性坏死已成为一个世界难题，好发年龄为20—50岁。它通常是由于各种原因引起股骨头血供中断或受损,进一步导致股骨头结构发生变化,晚期常常伴有股骨头塌陷,从而引起患者髋关节
疼痛及功能活动受限。而SANFH占股骨头坏死很大比例，因此研究SANFH的发病机制,有助于该病的诊断及治疗。研究发现该病发病机制可能同时受多因子调控。最为普遍接受的三个导致头坏死的机制是：机械血管中断，血栓性血管内闭塞以及血管外压缩。当然目前发病机制的学说有多种：如脂类代谢紊乱、二次碰撞、氧自由基代谢异常、细胞凋亡、局部血管内凝血等学说。因此探讨SANFH的发生、发展机制至关重要。
[0255] 近年，随着分子生物学的发展，研究者更多倾向于关注基因表达与调控在疾病中的作用，而程序性细胞死亡(凋亡型与自噬型)理论亦逐渐受到重视，业已成为研究组织器官衰老、损伤等发病机制的重要研究方向。然而，当程序性细胞死亡调控发生改变时便可引起疾病的发生。已有学者开始对骨细胞、成骨细胞凋亡型程序性细胞死亡在SANFH中的作用进行了初步探讨，对其发病机制有了新的认识。但对于自噬型程序性细胞死亡在SANFH中的作用至今未见公开研究报道。
[0256] 自噬是细胞对缺血缺氧等条件的一种应激反应，而在SANFH的发生过程中，主要原因之一即是股骨头局部发生缺血缺氧的改变,从而引起骨细胞、成骨细胞发生的一系列病理变化。因此我们推断激素性股骨头坏死与自噬存在着某种密切关联。
[0257] 研究结果表明，Beclin1是
哺乳动物参与自噬的特异性基因，主要是通过与Ⅲ型磷脂酰肌醇3磷酸激酶(ClassⅢ PI3K)形成
复合体来调节其他自噬相关基因(Autopha gy Associated Gene,ATG)编码蛋白，同时
定位自噬前体结构来调控自噬。Idikio研究发现，肝癌与
前列腺癌组织中Beclin1基因mRNA表达水平明显增高，Beclin-1与癌细胞的存活及治疗反应密切相关，并可能因其可调控细胞自噬而成为
癌症治疗的靶点。多项证据表明
Beclin-1可能是自噬的“守门人”。Yue等研究发现，Beclin1基因的表达降低，活性降低，实验中将大鼠的Beclin1基因敲除,自噬体的形成明显缺失，因此认为Beclin1是自噬所必须的。Du等认为血管再生在心肌缺血及周围性
血管疾病中起着重要作用，而细胞自噬又与血管再生存在关联性，通过研究发现，应用3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA)对细胞自噬进行抑制的同时，血管再生亦受到抑制，从而通过调节细胞自噬可以治疗心血管疾病。
[0258] 本实验研究结果显示：RT-PCR检测组织中Beclin1 mRNA表达在前三周，尤其是第一周中，SANFH组Beclin1 mRNA表达量为对照组的16倍，表明Beclin1 mRNA表达确实在SANFH组呈高表达，可能存在自噬型细胞死亡。而在第四周中SANFH组骨细胞内Beclin1
mRNA表达量低于对照组，也可以理解，可能此时股骨头基本已完全坏死。3-MA组中骨细胞内Beclin1 mRNA表达量较SANFH组均降低，采用单因素方差分析检验不同时间段三组骨细胞中Beclin1的mRNA表达均有统计学差异，表明3-MA对于SANFH中自噬型细胞死亡可能起到抑制作用。
[0259] Western Blot鉴定骨细胞中Beclin1蛋白表达量结果显示，实验第一周、第二周SANFH组中Beclin1蛋白高表达。经3-MA治疗的兔子股骨头Beclin1蛋白表达明显下降，且接近对照组。第三周、第四周无两者均无统计学差异。从蛋白水平证实，SANFH组中可能存在自噬性细胞死亡，3-MA可能对于SANFH中自噬型细胞死亡起到一定的抑制作用。
[0260] 免疫荧光染色检测骨细胞、成骨细胞中GFP-Beclin1融合蛋白，并测量免疫荧光的积分光密度值，结果显示不同时间段内SANFH组骨细胞、成骨细胞内GFP-Beclin1融合蛋白表达均较对照组升高，SANFH组中可能存在自噬性细胞死亡。而给予3-MA治疗后可以部分减弱GFP-Beclin1融合蛋白表达，表明3-MA对于SANFH中自噬型细胞死亡可能起到抑制作用。
[0261] 4、结论与展望
[0262] 本实验通过对家兔直接大剂量注射糖皮质激素，诱导出典型的激素性股骨头缺血坏死的动物模型，在此基础上对股骨头进行组织形态学、超微结构等观察；并运用RT-PCR、Western Blot、免疫荧光染色等方法进行综合分析。得出以下结论：SANFH与骨细胞及成骨细胞的自噬型细胞死亡关系密切，骨细胞、成骨细胞中Beclin1基因表达增强可能在骨细胞、成骨细胞自噬型细胞死亡中起着某种重要的作用，3-MA对于SANFH中自噬型细胞死亡可能起到抑制作用，有助于为SANFH病理学机制的进一步研究奠定基础，从而为SANFH的防治提供了一种新的思路或方法。但本实验不足之处是在体实验研究，是否受本体以及其它因素的影响，下一步的离体实验(细胞培养)将成为我们研究的重点。
[0263] 以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以
权利要求书所限定的保护范围为准。
