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一种测定类凝血酶活性的方法

阅读：5发布：2020-08-11

专利汇可以提供一种测定类凝血酶活性的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及一种蛇毒类凝血酶的测定方法，采用酶动力学测定法，使用可控温紫外分光光度计，经过考察孵育时间、酶浓度、线性范围以及该方法的精密度与酶促反应动力学常数，最终确立了蛇毒类凝血酶活力的测定方法。本发明克服了传统检测方法中存在的检测所用血浆或纤维蛋白原等原料性能差异大、操作人员主观影响大，以及只能专人负责测定等不利因素，具有步骤简单、不需做标准曲线、试验数据清晰明了，测定结果准确可靠的优点，适用于各种来源的类凝血酶原液和制剂的活性测定、活性定义，以及质量标准控制，包括天然及重组类凝血酶。，下面是一种测定类凝血酶活性的方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种测定类凝血酶活性的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
（1）用去离子水配制浓度为1-2mM的生色底物水溶液，所述生色底物为S2238、S2288、S2251、S2366、S2403或S2765；
（2）用20-150mmol/L pH7.0-8.0的Tris盐酸缓冲液或20-150mmol/L pH7.0-8.0的磷酸盐缓冲液稀释待测类凝血酶样品，得到样品浓度为18nmol/L-100nmol/L的稀释液；
（3）吸取步骤（2）制得的待测类凝血酶样品稀释液置于比色皿中，加入50μl的步骤（1）制得的生色底物水溶液，然后补充所述Tris盐酸缓冲液或磷酸盐缓冲液至终体积为
1mL，混匀，使得待测类凝血酶样品的终浓度为1-25nmol/L，于37℃静置2-25分钟，然后在波长405nm处检测吸光度0-20分钟，每30秒读数一次；
（4）利用公式1计算所述待测类凝血酶样品的活力（U）：
公式1：
式中：U—活力单位，即产物生成速度（nmol/min）；△A—样品在反应时间中A405吸光度的变化值；V—反应体积（L）；1—光程（cm）；t—反应时间（min）；ξ—摩尔吸光系数，为
10500（L/mol·cm）。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述生色底物为S2238；所述水溶液的浓度为2mM。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述Tris盐酸缓冲液为
20-100mmol/L的pH7.0-8.0Tris盐酸缓冲液，优选为20-100mmol/L的pH7.2-8.0Tris盐酸缓冲液，更优选为50mmol/L的pH7.4Tris盐酸缓冲液；所述磷酸盐缓冲液为20-100mmol/L的pH7.0-8.0磷酸盐缓冲液，优选为20-100mmol/L的pH7.2-8.0磷酸盐缓冲液，更优选为
50mmol/L的pH7.4磷酸盐缓冲液。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，待测类凝血酶样品的终浓度为1-28nmol/L，优选为1-17nmol/L。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，在37℃下静置时间为5分钟；检测时间为10分钟。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其特征在于，所述类凝血酶为蛇毒类凝血酶，包括白眉蝮蛇来源的降纤酶、矛头蝮蛇来源的巴曲酶、尖吻蝮蛇来源的血凝酶等，重组以及重组突变的蛇毒类凝血酶。
7.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其特征在于，所述类凝血酶为重组定点突变巴曲酶或天然巴曲酶，其中所述重组定点突变巴曲酶的氨基酸序列相对于天然巴曲酶氨基酸序列的第45位的Arg突变为Lys。

说明书全文

一种测定类凝血酶活性的方法

技术领域

[0001] 本发明属于医学检测技术领域，具体而言，本发明涉及一种测定类凝血酶活性的方法。

背景技术

[0002] 自1936年奥地利学者Von Klobusitzky首次从巴西矛头蝮蛇（Bothropsatrox）毒液中分离得到一种丝氨酸蛋白水解酶（类凝血酶），即巴曲酶，至今已发现30多种蛇毒中含有类凝血酶组分，并有20多种先后得到分离和纯化。

[0003] 我国目前临床上应用的蛇毒制剂大部分为类凝血酶，在临床上有两方面的用途。

[0004] 一种为降纤作用，即巴曲克栓酶，如东菱迪芙，其作用是分解纤维蛋白原，抑制血栓形成；诱发组织型纤维蛋白溶解酶原激活剂（t-PA）的释放，减弱纤维蛋白溶解酶原激活剂的抑制因子的活性，促使纤维蛋白溶解；增加血液流动性，防止血栓形成。主要用于缺血性脑血管病、急性心肌梗塞、突发性耳聋、急性脑梗塞、不稳定心绞痛等，其疗效确切，不良反应轻微。

[0005] 另一种为止血作用，即巴曲止血酶，如立止血、巴曲亭、邦亭、速乐涓等，可用于多种原因引起的出血，特别是应用于传统止血药无效的出血病人，疗效确切，未发现明显的不良反应。

[0006] 迄今为止，巴曲酶活性测定主要有两种方法：其中血浆凝固法最常用，根据血浆凝固的时间判定巴曲酶的效价。另外一种方法是纤维蛋白原凝集法，根据纤维蛋白凝块生成的快慢判断巴曲酶的效价。但这两种方法，无论血浆还是纤维蛋白原都来源复杂，不同厂家差异较大，即使是同一厂家的产品，不同批次间差异也较大，并且二者的存放时间长短也会影响活性测定，更何况是以目测判断结果，受检测者主观干扰较大。

[0007] 合肥兆科药业有限公司申请了巴曲酶活性测定方法，以降纤酶为标准品，测得巴曲酶也以降纤酶活力Bu为巴曲止血酶活力单位，测定方法采用传统的酶固定时间测定法，这类方法不仅耗时长，而且很难保证反应为零级反应（反应速度直接与被测酶活力成正比，而与底物浓度无关），因此其线性、灵敏度、准确度较差。随着实验分析技术的发展，酶固定时间测定法已逐步被酶动力学测定法所取代。

[0008] 鉴于上述方法的局限性，寻找一种科学、高效、客观、经济的、精准、批间差异小的活性测定方法成为巴曲酶等类凝血酶产品的应用研究的关键。

发明内容

[0009] 本发明建立了一种类凝血酶、例如蛇毒类凝血酶的酶动力学测定方法。该法又称速率法，即用紫外分光光度计监测酶促反应体系的初速度，间接计算样品中被测酶活力。在酶促反应中，真正能代表酶催化活性的只有酶促反应初速度。因此该法不仅准确，线性范围大大提高、不需做标准曲线，节省试验步骤及时间。

[0010] 具体而言，本发明的检测方法包括以下步骤：

[0011] 本发明提供一种测定类凝血酶活性的方法，该方法包括以下步骤：

[0012] （1）用去离子水配制浓度为1-2mM的生色底物水溶液，所述生色底物为S2238、S2288、S2251、S2366、S2403或S2765；

[0013] （2）用20-150mmol/L pH7.0-8.0的Tris盐酸缓冲液或磷酸盐缓冲液稀释待测类凝血酶样品，得到样品浓度为18nmol/L-100nmol/L的稀释液；

[0014] （3）吸取步骤（2）制得的待测类凝血酶样品稀释液置于比色皿中，加入50μl的步骤（1）制得的生色底物水溶液，然后补充所述Tris盐酸缓冲液或磷酸盐缓冲液至终体积为1mL，混匀，使得待测类凝血酶样品的终浓度为1-25nmol/L，于37℃静置2-25分钟，然后在波长405nm处检测吸光度0-20分钟，每30秒读数一次；

[0015] （4）利用公式1计算所述待测类凝血酶样品的活力（U）：

[0016] 公式1：

[0017] 式中：U—活力单位，即产物生成速度（nmol/min）；△A—样品在反应时间中A405吸光度的变化值；V—反应体积（L）；1—光程（cm）；t—反应时间（min）；ξ—摩尔吸光系数，10500（L/mol·cm）。

[0018] 具体而言，优选地，步骤（1）中，所述生色底物为S2238；所述水溶液的浓度为2mmol/L。

[0019] 优选地，步骤（2）中，所述缓冲液为浓度为20-100mmol/L pH7.0-8.0Tris盐酸缓冲液或者浓度为20-100mmol/L pH7.0-8.0磷酸盐缓冲液；优选浓度为20-100mmol/L pH7.2-8.0Tris盐酸缓冲液或者浓度为20-100mmol/L pH7.2-8.0磷酸盐缓冲液，更优选浓度为50mmol/L pH7.4Tris盐酸缓冲液或50mmol/L pH7.4磷酸盐缓冲液。

[0020] 优选地，步骤（3）中，待测类凝血酶样品在1mL反应体系中的终浓度为1-28nmol/L，优选为1-17nmol/L。

[0021] 优选地，步骤（4）中，在37℃下静置时间为5分钟；检测时间为10分钟。

[0022] 本发明将类凝血酶的活力单位定义为：在37℃，pH7.4的条件下，类凝血酶与发色底物预孵一定时间后，每分钟能水解底物产生1nmol的对硝基苯胺（PNA），定义为一个酶活力单位，以U表示。

[0023] 本发明检测方法所应用的类凝血酶为从各类蛇毒提取或通过重组DNA技术得到的类凝血酶，优选蛇毒类凝血酶，例如白眉蝮蛇来源的降纤酶、矛头蝮蛇来源的巴曲酶、尖吻蝮蛇来源的血凝酶、重组类及突变类的蛇毒类凝血酶等。

[0024] 根据本发明的具体实施方案，所述类凝血酶为重组定点突变巴曲酶，其中所述重组定点突变巴曲酶的氨基酸序列相对于天然巴曲酶氨基酸序列的第45位的Arg突变为Lys（参见中国专利ZL200710011566.4）。

[0025] 本发明的酶与底物的生色反应无终止剂，故本发明人确定采用酶动力学测定法来动态检测类凝血酶的活力。本领域已知，酶活力通常是指酶催化一定化学反应的能力，测定酶活力或活性实际上就是测定酶促反应的速度。因此为了能够准确测定，需要尽量创造干扰因素较少且酶促反应速度保持恒定的测定环境。

[0026] 为了满足干扰因素较少且酶促反应速度保持恒定的测定条件，本发明人在生色底物的选择、待测类凝血酶样品的稀释液和浓度、测定条件（包括是否需要预处理、反应时间、反应的线性范围等）、可测定的类凝血酶种类等方面进行了大量筛选，从而建立了类凝血酶活性的测定方法。

[0027] 具体而言，本发明人发现，可以采用S2238、S2288、S2251、S2366、S2403、S2765作为底物，测定类凝血酶样品在一定时间内水解其而产生产物即对硝基苯胺的速度。特别是当利用S2238作为底物时，测得的酶的相对活性较高；对于缓冲液，对不同类凝血酶的适用缓冲系统pH及浓度范围进行了筛选，确定了利用Tris-HCl缓冲液或磷酸盐缓冲液作为待测样品的稀释液，并基于此，进一步确定了缓冲液的pH值和浓度、样品的稀释浓度以及并采用该缓冲液建立反应体系；与现有技术相比，确定了本发明的检测反应需静置一定时间、例如5分钟，避免了反应溶液由室温到37℃的温差对反应速度产生影响，也避免了反应体系刚混合完造成的局部反应，容易得到线性反应曲线；此外，确定了呈线性的酶促反应时间。

[0028] 本发明的检测方法可用于通过各类蛇毒提取或通过重组DNA技术得到的类凝血酶，如白眉蝮蛇来源的降纤酶、矛头蝮蛇来源的巴曲酶等蛇毒类凝血酶。本发明的检测方法还可应用于生产止血药或抗血栓药的天然和重组类凝血酶活性单位的定义和含量的测定。此外，还适用于各种来源的蛇毒类凝血酶（各种天然及重组类凝血酶的）原液和制剂活性的质量标准控制（活性测定和定量）。

[0029] 此外，目前本领域常用血浆凝集法来测定类凝血酶的活性。血浆凝集法需要采集人血浆，利用类凝血酶对该人血浆的凝集情况来判断酶的活性。该方法较为复杂，人为操作要求高，并且难以标准化。与该方法相比，本发明的检测方法使用可控温紫外分光光度计，减少了人为误差；并且，试剂来源简单统一，操作过程简单，便于控制，精密度很好，故完全可替代血浆凝集法。通过对不同来源的蛇毒类凝血酶（重组或天然蛇毒提取的）活性测定，证明本方法可应用于同类产品或蛋白活性单位的准确测定，避免了活性测定试验所使用的试剂厂家、批号不同及实验者不同对测定结果的影响，更加科学、准确、可靠。附图说明

[0030] 以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

[0031] 图1显示了本发明实施例1中预孵时间的选择。

[0032] 图2显示了本发明实施例2中不同底物测定结果。

[0033] 图3显示了本发明实施例3中酶浓度的线性及范围的选择。

[0034] 图4显示了本发明实施例5中不同浓度的底物与吸收值的关系。

[0035] 图5显示了本发明实施例5中米氏方程作图。

具体实施方式

[0036] 以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

[0037] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。

[0038] 实施例1本发明测定方法中静置时间和反应时间的选择

[0039] 本实施例采用重组定点突变巴曲酶（ZL200710011566.4）作为待测类凝血酶样品，对其活性测定方法中的静置时间和反应时间进行了筛选。

[0040] 用去离子水配制2mmol/L的S-2238（chromogenix，意大利）底物水溶液。随机选取诺康生物技术责任有限公司生产留样的批号为20100101的重组定点突变巴曲酶作为测试样品，并将该样品用50mmol/L Tris-HCl pH7.4稀释至100nmol/L。

[0041] 在1mL比色皿中加入60μL重组定点突变巴曲酶稀释液，890μL50mmol/L Tris-HCl，50μL2mmol/L S2238水溶液，混匀。将比色皿放入37℃紫外分光光度计（thermo，evolution220，美国）中，立即在405nm波长下测定吸收值，每30秒测定一次，共100分钟。

[0042] 实验结果以反应时间（s）为横坐标，以相应的吸收值A405为纵坐标作图，见图1，在开始的反应过程中，由于温差、酶与底物混合不完全等因素，产生直线的线性关系较差，为避免此误差，选择静置时间2-25分钟，优选5分钟后，再进行检测。

[0043] 静置5分钟后，线性拟合发现反应时间在0-20分钟，线性关系良好，R2＞0.999，选择检测时间优选为10分钟。

[0044] 根据本发明对类凝血酶活性单位的定义，将本实施例中重组定点突变巴曲酶活力单位定义为：在37℃，pH7.4的条件下，重组定点突变巴曲酶与发色底物静置5分钟后，每分钟能水解底物S2238产生1nmol的对硝基苯胺（PNA），定义为一个酶活力单位，以U表示。

[0045] 酶活力计算：在上述条件下，重组定点突变巴曲酶与S2238反应释放的黄色的PNA在405nm处产生吸收值，并与时间呈线性关系，求出单位时间内吸光度变化值，代入公式1中计算生成PNA的量即重组定点突变巴曲酶的活力。

[0046] 实施例2本发明测定方法中底物的选择

[0047] 本实施例采用重组定点突变巴曲酶（ZL200710011566.4）作为待测类凝血酶样品，对其活性测定方法中的底物进行了筛选。

[0048] 用去离子水配制2mmol/L的S2238、S2288、S2251、S2366、S2403、S2765底物水溶液。随机选取诺康生物技术责任有限公司生产留样的批号为20100101的重组定点突变巴曲酶作为测试样品，并将该样品用50mmol/L Tris-HCl pH7.4稀释至100nmol/L。

[0049] 在1mL比色皿中加入重组定点突变巴曲酶稀释液，加入50μL上述2mmol/L S2238、S2288、S2251、S2366、S2403、S2765底物水溶液，然后补充所述Tris-HCl至1mL，混匀，使该巴曲酶终浓度为1-17nmol/L，于37℃静置5分钟，然后在波长405nm处检测吸光度10分钟，每30秒读数一次。以酶活力最高为100%计算。结果见图2。

[0050] 结果发现，同一浓度重组定点突变巴曲酶稀释液以S2238为底物测定时，其相对活性较高。因此，本发明的测定方法中优选S2238为底物。

[0051] 实施例3本发明测定方法中待测酶样品终浓度线性范围的选择

[0052] 本实施例采用重组定点突变巴曲酶（ZL200710011566.4）作为待测类凝血酶样品，对其活性测定方法中的终浓度线性范围进行了筛选。

[0053] 随机选取诺康生物技术责任有限公司生产留样的批号为20100101的重组定点突变巴曲酶作为测试样品，用50mmol/L Tris-HCl pH7.4稀释至100nmol/L。分别加入不同体积的待测酶稀释液、Tris-HCl缓冲液和发色底物，得到1mL反应体系，如表1所示。

[0054] 表1不同组成的1mL反应体系

[0055]

[0056]

[0057] 将上述不同反应体系放入37℃紫外分光光度计中静置5分钟后，检测10分钟，每30秒检测一次。以重组定点突变巴曲酶终浓度（nM）为横坐标，以单位时间内吸收值变化为纵坐标，进行线性拟合，结果见图3。

[0058] 结果发现，重组定点突变巴曲酶终浓度范围1-28.1nmol/L，R>0.98，最优范围为1-16.8nmol/L时，线性关系良好，R>0.99，故其线性范围的浓度为1-16.8nmol/L。

[0059] 实施例4本发明测定方法中适用缓冲系统pH及浓度范围的选择

[0060] 本实施例采用多种不同类凝血酶待测类凝血酶样品，对其活性测定方法中的适用缓冲系统pH及浓度范围进行了筛选。

[0061] （一）适用缓冲系统pH的筛选

[0062] 随机选取诺康生物制药有限责任公司生产的重组定点突变巴曲酶、尖吻蝮蛇类凝血酶、矛头蝮蛇类凝血酶和茂基蝮蛇类凝血酶，用不同pH的50mmol/L Tris-HCl或50mmol/L磷酸盐配制成稀释液，吸取待测类凝血酶样品稀释液置于比色皿中，加入50μL2mmol/L S2238水溶液，然后补充所述Tris-HCl或磷酸盐缓冲液至终体积为1mL，混匀，使得待测类凝血酶样品的终浓度为1-25nmol/L，于37℃静置5分钟，然后在波长405nm处检测吸光度10分钟，每30秒读数一次。结果见下表2。

[0063] 表2测得的不同蛇种类凝血酶的反应体系线性范围

[0064]

[0065] 由表2可以看出，经本发明测定方法测得，重组定点突变巴曲酶的缓冲系统pH适用范围为7.0-8.0，白眉蝮蛇类凝血酶的缓冲系统适用pH范围为7.0-8.0，尖吻蝮蛇类凝血酶的缓冲系统适用pH范围为7.0-8.0，矛头蝮蛇类凝血酶的缓冲系统适用pH范围为7.2-8.0。

[0066] （二）适用缓冲液浓度的筛选

[0067] 取不同浓度的Tris-HCl缓冲液或磷酸盐缓冲液（如下表3中所示）稀释重组定点突变巴曲酶，然后吸取稀释液置于比色皿中，加入50μL2mmol/L S2238水溶液，补充相应的缓冲液至终体积为1mL，混匀，使得待测样品的终浓度为1-25nmol/L，于37℃静置5分钟，然后在波长405nm处检测吸光度10分钟，每30秒读数一次。结果见下表3。

[0068] 表3不同Tris缓冲液及磷酸盐缓冲液浓度下测得的重组定点突变巴曲酶活力[0069]

[0070] 由表3可以看出，经本发明的测定方法测得，重组定点突变巴曲酶的Tris-HCl缓冲液浓度适用范围为20-150mmol/L，优选为20-100mmol/L。

[0071] 采用相同方法，不同的是换用磷酸盐缓冲液，同样测得重组定点突变巴曲酶的磷酸盐缓冲液浓度适用范围为20-150mmol/L，优选为20-100mmol/L。

[0072] 实施例5本发明测定方法的酶动力学常数测定

[0073] 随机选取诺康生物技术责任有限公司生产留样的批号为20100101的重组定点突变巴曲酶，用50mmol/L pH7.4Tris-HCl缓冲液稀释至100nmol/L，取60μL加到比色皿中，再加入体积分别为20μL、30μL、40μL、50μL、60μL、70μL、80μL、120μL的S2238水溶液（浓度2mmol/L），然后加入相应体积的50mmol/L Tris-HCl至终反应体系1mL，混匀。

[0074] 将上述几组反应体系依次放入37℃紫外分光光度计中静置5分钟后，检测10分钟。以反应时间（s）为横坐标，以相应的吸收值A405为纵坐标，得到不同底物浓度下的不同线性曲线，见图4，求出单位时间内吸光度变化值，代入公式1中计算生成PNA的量即反应初速度。

[0075] 根据米氏方程公式2导出的公式3，以1/S为横坐标，以1/v为纵坐标，得到标准2
曲线方程为：Y=50476.01x+196.95，R=0.9953，来求取米氏常数km。图5中横轴截距为1/Vmax，斜率为km/Vmax，计算求得Km=256.28μmol/L，Vmax=0.005077μmol/min。

[0076] 公式2：

[0077] 公式3：

[0078] 式中ν-反应初速度（纳摩尔浓度变化/min）；Vm-最大反应速度（纳摩尔浓度变化/min）；[S]-底物浓度（mol/L）；Km-米氏常数（mol/L）。

[0079] 实施例6本发明测定方法对于活性测定的日内精密度

[0080] 本实施例采用重组定点突变巴曲酶（ZL200710011566.4）和天然巴曲酶作为待测类凝血酶样品，对本发明测定方法的日内精密度进行了验证。

[0081] 随机选取诺康生物技术责任有限公司生产留样的批号为20100101的重组定点突变巴曲酶和天然巴曲酶，用50mmol/L pH7.4Tris-HCl缓冲液稀释至100nmol/L，按三个不同体积分别加入1mL比色皿中，加入50μL2mmol/L S2238水溶液，补充相应的Tris盐酸缓冲液至终体积为1mL，混匀，于37℃静置5分钟，然后在波长405nm处检测吸光度10分钟，每30秒读数一次。反应体系见表4。在同一天内，人员、试验仪器不变的情况下，每一个浓度重复测定3次，计算每一浓度测定结果的均值和SD，计算每一浓度的变异系数CV值，评价日内精密度，结果见表5。

[0082] 表4重组定点突变巴曲酶和天然巴曲酶高中低三个浓度的反应体系

[0083]

[0084]

[0085] 表5本发明测定方法的日内精密度结果

[0086]

[0087] 由表5可以看出，日内精密度在1.3-4.8之间（CV限度<5%），精密度较好。

[0088] 实施例7本发明测定方法对于活性测定的日间精密度

[0089] 本实施例采用重组定点突变巴曲酶（ZL200710011566.4）和天然巴曲酶作为待测类凝血酶样品，对本发明测定方法的日间精密度进行了验证。

[0090] 随机选取诺康生物技术责任有限公司生产留样的批号为20100101的重组定点突变巴曲酶和天然巴曲酶，用50mmol/L pH7.4Tris-HCl缓冲液稀释至100nmol/L，按三个不同体积分别加入1mL比色皿中，加入50μL2mmol/L S2238水溶液，补充相应的Tris盐酸缓冲液至终体积为1mL，混匀，于37℃静置5分钟，然后在波长405nm处检测吸光度10分钟，每30秒读数一次。反应体系见表4。在不同日期内，人员、试验仪器不变的情况下，每一个浓度重复测定3次，计算每一浓度测定结果的均值和SD，计算每一浓度的CV值，评价日内精密度，结果见表6。

[0091] 由表6可以看出不同日期测量CV%小于5（CV限度<15%），日间精密度也较好。

[0092]

[0093] 实施例8本发明测定方法与血浆凝集法的测定活力比较

[0094] 取三批重组定点突变巴曲酶原液，批号分别为20100101、20100102、20100103，该三批原液样品反应体系均为50μL酶液（用50mmol/L pH7.4Tris-HCl稀释至100nmol/L），900μL50mmol/L pH7.4Tris-HCl和50μL2mmol/L发色底物S2238水溶液，将制备好的比色皿于37℃静置5分钟后，继续在37℃、波长405nm下每30秒读数一次，共10分钟。得到线性数值斜率代入公式1中计算活性单位，见表7。

[0095] 同样三批重组定点突变巴曲酶原液用血浆凝集法检测其活性，血浆凝集法测定方法具体实验方法为：取标准人血浆0.2mL，加入直径1cm的试管中，置37℃水浴中保温3分钟，加入37℃预热的样品溶液0.2mL，立即混匀计时，于40秒开始检查血浆凝固情况，记录初凝时间，同时测定3管，3管初凝时间误差应小于20秒。若初凝时间小于40秒，则适当稀释供试品溶液，记录60±20秒内凝固的供试品溶液浓度，在上述条件下，能使0.2mL标准人血浆在60秒凝固的酶量，定义为一个单位，检测结果见表7。

[0096] 表7采用本发明测定方法与血浆凝集法测定重组定点突变巴曲酶活力的比较结果

[0097]

[0098] 两种测定方法酶活力定义不同，重组定点突变巴曲酶生色底物法测定活力与血浆凝集法测定活力比例关系为3.4-3.7：1之间，比例关系比较一致。传统的血浆凝集法原料来源复杂，厂家和批间差异大，人为主观判断测定终点误差较大。而发色底物法试剂来源简单统一，操作过程简单，便于控制，精密度更好，因此完全可替代血浆凝集法。

[0099] 实施例9几种蛇毒类凝血酶经血浆凝集法和本发明测定方法的测定活力比较[0100] 将尖吻蝮蛇类凝血酶（诺康生物技术责任有限公司生产，留样批号：110629-1）、矛头蝮蛇类凝血酶（诺康生物技术责任有限公司生产，留样批号：111026）、白眉类凝血酶（诺康生物技术责任有限公司生产，留样批号：120229-2）用50mmol/L pH7.4Tris-HCl稀释至100nmol/L，取稀释液50μL，900μL50mmol/L pH7.4Tris-HCl和50μL2mmol/L发色底物S2238水溶液，将制备好的比色皿于37℃静置5分钟后，继续在37℃、波长405nm下每30秒读数一次，共10分钟。得到线性数值斜率代入公式1中计算活性单位，见表8。

[0101] 采用血浆凝集法测定的具体实验方法为：取标准人血浆0.2mL，加入直径1cm的试管中，置37℃水浴中保温3分钟，加入37℃预热的样品溶液0.2mL，立即混匀计时，于40秒开始检查血浆凝固情况，记录初凝时间，同时测定3管，3管初凝时间误差应小于20秒。若初凝时间小于40秒，则适当稀释供试品溶液，记录60±20秒内凝固的供试品溶液浓度，在上述条件下，能使0.2mL标准人血浆在60秒凝固的酶量，定义为一个单位，检测结果见表8。

[0102] 表8两种方法的测定活力比较

[0103]

[0104] 以上三种蛇毒类凝血酶的纯度均大于95%，测定方法不同，酶活力定义不同。实验可知，分别采用血浆凝集法和本发明的发色底物法对尖吻蝮蛇类凝血酶、矛头蝮蛇类凝血酶和白眉蝮蛇类凝血酶的酶活力进行测定，生色底物法测定活力与血浆凝集法测定活力之间的比例关系为3.3-3.6：1之间，这个结果与表7的结果相近，这说明，无论是重组蛇毒类凝血酶还是提取的不同蛇种蛇毒类凝血酶，均可用发色底物法来代替传统的血浆凝集法。

[0105] 此外，对于同一蛇种的蛇毒类凝血酶来说，经两种方法多次测定，发现这两种方法测得的活力比例关系基本一致。

[0106] 综上，采用酶动力学测定法，使用可控温紫外分光光度计，经过考察孵育时间、酶浓度、线性范围以及该方法的精密度与酶促反应动力学常数，最终确立了巴曲酶活力的测定方法。通过对不同来源的蛇毒类凝血酶（重组或天然蛇毒提取的）活性测定，表明本方法可应用于同类产品或蛋白活性单位的准确测定，避免了活性测定试验所使用的试剂厂家、批号不同及实验者不同对测定结果的影响，更加科学、准确、可靠。

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一种测定类凝血酶活性的方法

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