1.一种西洋参发状根诱导及植株再生研究方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)外植体处理：(I)西洋参种子萌发及处理：经过沙藏层积处理，已经裂口的种子，播种到栽培盘中，遮荫培养，待播种1～2周苗长出后，用0.1％升汞消毒6min，无菌水清洗
4～5次；将其叶片、带叶幼茎和茎段切成1.0cm的切段，接于MS固体培养基上预培养用作转化的起始材料；(II)西洋参一年、二年生根的处理：将西洋参一年、二年生根表面用清水清洗干净后，流水冲洗3～4h，用0.1％升汞消毒10min～20min后，无菌水洗5遍，切成
0.2cm厚的薄片放在MS固体培养基上待用；
(2)菌种保存、活化及培养：发根农杆菌的长期保存方法是将农杆菌菌种溶于甘油中，于-20℃条件下保存；短期保存的方法是将发根农杆菌接种于YEB固体培养基上培养，当长出菌斑后，于4℃冰箱中保存；无菌条件下，用接种针挑取保存的菌液，于YEB固体平板上划线，28℃置于黑暗条件下培养，直到长出明显的单菌落；然后挑取一个单菌落接种于50mL液体YEB培养基中，120r/min、28℃、暗条件下培养24h，此时YEB液体培养基由接种前的透明的红棕色变成浑浊的淡黄色，证明细菌已正常长出；取1mL已活化的菌液加入50mL的YEB液体培养基中，120r/min，28℃暗条件下培养，活化菌液达到生长对数期时，此时的菌液就可以作为感染用；
(3)西洋参发状根诱导条件的优化：
(3a)不同菌种对西洋参发状根诱导率的影响：选择发根农杆菌R1601、8196、A4、rolA四个菌种经平板活化培养后接入YEB液体培养基中，待其菌液生长浓度达到OD600=0.6时用于侵染用；2～3周苗龄的西洋参实生苗，选择生长良好幼嫩的，将其叶片、带叶幼茎和茎段切成1.0cm的切段，在无25±1℃摇床100～120r/min侵染10～30min，无菌条件下取出；
灭菌滤纸吸干材料表面菌液，接于MS培养基上，考察不同菌种对西洋参发状根诱导率的影响；
(3b)菌液浓度对西洋参发状根诱导率的影响：制备好的R1601菌液用YEB液稀释至OD600值为0.2、0.4、0.6、0.8和1.0，将西洋参实生苗外植体投入不同浓度的菌液中浸染
15～30min，25±1℃摇床100～120r/min，然后取出用无菌滤纸吸干表面的菌液，在共培养基上培养2d后，再转接到MS共培养培养基上，每隔7d换一次培养基；
(3c)AS与侵染时间对西洋参发状根诱导率的影响：挑取的单菌落接种于添加AS的
50mL YEB液体培养基中活化，AS浓度选为0、100μmol/L振荡培养，待其光密度值为0.6时将西洋参实生苗的组织段浸入，侵染时间选为10min、15min、20min、25min和30min：
(3d)不同外植体对西洋参发状根诱导率的影响：选择外植体为2～3周苗龄西洋参实生苗的叶片、茎段、叶柄和西洋参愈伤组织、一年、二年生西洋参根，选择菌种为发根农杆菌R1601，考察西洋参外植体的选择对发状根诱导率的影响；其中叶片、茎段、叶柄为叶盘法，浸染时间为15～30min，西洋参愈伤组织、西洋参一年、二年生根为滴加法；
(3e)NAA浓度对西洋参发状根诱导率的影响：在预培养的MS基本培养基中添加一定量的NAA有益于发状根的诱导；以2～3周西洋参实生苗的叶柄为材料，MS基本培养基中添加NAA的浓度选择分为0mg/L、2mg/L、4mg/L、6mg/L，比较发状根诱导率以考察NAA最适浓度；
(3f)预培养时间对西洋参发状根诱导率的影响：选择MS+NAA2.0mg/L固体培养基为预培养基质，选择2～3周西洋参实生苗的茎段为材料，预培养时间选为0h、12h、24h、48h、
72h、96h，以考察预培养时间对西洋参发状根诱导率；
(3g)NAA浓度对西洋参发状根诱导率的影响：以2～3周西洋参实生苗的叶柄为材料，MS基本培养基中添加NAA的浓度选择分为0mg/L、2mg/L、4mg/L、6mg/L，比较发状根诱导率以考察NAA最适浓度；
(3h)共培养时间对西洋参发状根诱导率的影响：选择共培养时间为12h、24h、36h、
48h，共培养培养基选为MS；以2～3周西洋参实生苗的茎段为材料，预培养培养基为MS+NAA2.0mg/L时间为48h，菌种为R1601，以考察基质与共培养时间对西洋参发状根诱导率的影响；
(3i)头孢霉素(Cef)浓度对抑菌和西洋参发状根诱导率的影响：头孢霉素(Cef)的浓度选择为200mg/L、300mg/L、400mg/L、500mg/L、600mg/L，除菌基质选择为MS基本固体培养基；综合比较抑菌效果、污染率、获得发根数三项指标，考察头孢霉素(Cef)的最优浓度；
(4)西洋参发状根的获得与鉴定：
(4a)西洋参发根的获得：
①外植体预培养：西洋参实生苗消毒后，将其叶片切成1.0cm×1.0cm的小块，叶柄、和茎段切成1.0cm长的段，西洋参一年、二年生根流水冲洗去表面浮土，经升汞消毒后蒸馏水
3～5遍冲洗干净，视材料厚度切成0.2～0.5cm薄片，将以上所有材料接MS+NAA2mg/L培养基中黑暗条件下培养48h用于侵染；
②侵染与共培养：在超净无菌工作台上，将预培养的外植体材料，转移到装有准备好菌液的三角瓶中，封口后放在120r/min，黑暗条件下的摇床上感染10～30min，感染后的外植体用无菌滤纸吸干材料表面菌液，接种到MS固体培养基中，于黑暗、25℃条件下共培养
48h；
③除菌培养：将共培养后的感染外植体材料用无菌水冲洗三遍，无菌滤纸吸干外植体材料表面的无菌水，将其转接到含有头孢霉素(Cef)500mg/L的MS固体培养基上培养，于黑暗、25℃条件下除菌培养；
(4b)西洋参愈伤与一年、二年生根发状根的诱导：用微量移液枪吸取活化的发根农杆菌菌株8μL滴到已接到MS固体培养基的西洋参愈伤组织切面与西洋参根切片上；操作过程中避免菌液滴到MS固体培养基上，把滴加菌液的材料放在25℃，黑暗条件下的培养箱中培养；15d后除去褐化死亡的材料，将其余的材料转移到新鲜的MS固体培养基上继续培养；
(4c)PCR分子检测：通过PCR方法对Ri质粒TL-DNA的rolC基因检测将进一步提供分子生物学的依据，具体过程如下：
①引物设计及合成：设计引物1和引物2：
引物1：5′-GATATATGCCAAATTTACACTAG-3′；
引物2：5′-GTTAACAAAGTAGGAAACAGG-3′；
利用以上两个引物通过PCR扩增到T-DNA上rolC基因片段，预期长度是564bp；
②CTAB法提取西洋参发状根总DNA；③提取发根农杆菌的Ri质粒；
④PCR循环参数：
⑤PCR反应体系：
超纯水定容至25μl：
⑥琼脂糖凝胶电泳，拍照；
(5)西洋参发状根液体培养生长量与总皂苷含量的测定：发状根液体培养采用MS液体培养基为基本培养基(3％蔗糖，pH值5.8～6.0)，将12条生长旺盛的约2cm的发状根根尖接入装有30mL MS液体培养基中，温度为24±1℃，摇床转速100r/min，每隔3d取样，测定发状根干重及总皂苷的含量，测定一个月；所有数据为3瓶的平均值，重复两次；
采用标准曲线法对发状根中总皂苷的测定：标准曲线的绘制步骤为：①取Rg10.020g溶于甲醇中，定容为2mg/mL；②取Rg1对照品溶液30、60、90、120、150μL；③分别置于5支试管中(10mL，具塞)，甲醇定容为150μL，以相应试剂作对照；④将试管置于冰水浴中加
5％香草醛醇溶液和72％硫酸摇匀，60℃恒温水浴20min；⑤冰水浴15min后在755B分光光
2
度仪544nm处检测，以人参为标准品比色测定，根据标准曲线Y=503.29X+4.456，R=0.9924求得样品皂苷含量(％)；
发状根中总皂苷的测定取液体培养的新鲜发状根，蒸馏水冲洗后，用滤纸吸干发状根表面的水分，称量发状根鲜重；然后于真空干燥箱中80℃下干燥至恒重，称量，将干燥后的发状根粉碎，放入三角瓶中，加入一定量的浓度为40％的乙醇溶剂，并将三角瓶口用封口膜密封；置于超声发生器中进行分离提取，提取时间15min，超声频率为28KHz，提取两次；
在冰水浴中加5％香草醛醇溶液和72％H2SO4染色，60℃恒温水浴10min，冰水浴15min，于
544nm处测吸光度；
(6)西洋参发状根再生体系的建立及条件优化：
(6a)西洋参发状根愈伤组织的诱导：以西洋参发状根为外植体，接到添加不同浓度，不同组合的2，4-D、BA、KT等生长调节剂的MS培养基上，其中蔗糖浓度为30g/L，琼脂含量为6.5g/L，pH值是6.0(灭菌前)，培养基的灭菌压力为0.1MP持续15～20min，放到不同光照条件下，光照周期为12h/d，温度为24±1℃，两周后统计愈伤组织发生率(发生愈伤组织的外植体数/外植体总数)分析不同生长调节剂与光照条件对愈伤组织诱导的影响，筛选最佳调节物质及浓度和光照条件；
(6b)西洋参发状根胚状体的发生：不同激素组合、浓度与光照对胚状体发生和生长的影响分别取不同浓度及组合的2，4-D、KT、BA对培养物进行处理，分析各激素对胚状体发生和生长的影响，筛选出胚状体发生及生长的最优培养基配方；取黑暗、光照条件下培养，观察光照条件对培养物的影响；光照由日光灯提供(约1200Lx)，光周期为12h/d。
2.根据权利要求1所述的西洋参发状根诱导及植株再生研究方法，其特征在于：所述步骤(4c)中的CTAB法提取西洋参发状根总DNA的具体过程如下：
(1)取280mg经继代培养的西洋参发状根加入10％PVP在液氮中充分研磨至粉末状(约30s～1min)；
(2)用药匙小心转移至1.5ml的离心管中，加入65℃预热的660μ12×CTAB的提取缓冲液，65℃水浴45min，每隔5～10min轻轻振荡一次；
(3)加入200μL冰浴过的Solution I，涡旋振荡使细胞均匀分布，室温下放置10min；
(4)加入400μL新鲜配置好的Solution II，轻轻颠倒混匀，冰浴5min；
(5)加入300μL Solution III，反复颠倒数次，使溶液在粘稠的菌体裂解物中分散均匀，然后置冰上5min；
(6)12000r/min离心10min，小心吸取上清液加入1.5mL离心管中；
(7)加入等体积的饱和酚、氯仿，通过剧烈振荡混合有机相和水相，12000r/min离心
5min；
(8)取出离心管冷却至室温，加入等体积的氯仿：异戊醇(24：1)，混匀，12000rpm，离心
10min；
(9)用一只剪去前头的枪头，小心将上清液转移到一只新的1.5ml离心管中，并加入两倍体积的-20℃预冷的无水乙醇，即见到丝状沉淀，-20℃下放置30min，12000rpm，离心
5min，得到淡黄色沉淀；
(10)倾去上清液，并用吸水纸吸净残余溶液，加入300μl超纯水重新溶解，再加入-20℃预冷的无水乙醇600μl，沉淀过夜；
(11)12000rpm，离心10min，得到白色的胶状沉淀，倾去上清液，并用吸水纸吸净残余溶液，加入70％乙醇800μl洗涤沉淀2～3次；
(12)吸净残余溶液，置超净工作台吹干(约需10～15min)；
(13)加入40～60μl超纯水，溶解沉淀，加入3μl Rnase，室温放置30min后，-20℃下保存。
3.根据权利要求1所述的西洋参发状根诱导及植株再生研究方法，其特征在于：所述步骤(4c)中的提取发根农杆菌的Ri质粒的具体过程如下：
(1)挑取R1601单菌落于10ml YEB培养基中，28℃，120rpm，过夜培养；
(2)吸取8ml培养好的菌液，加入10ml离心管中，4000rpm，离心5min，倾去培养液，加入2ml预冷的STE，重新悬浮细胞，分别吸取1ml菌悬液，加入1.5ml离心管中，12000rpm离心2min，倾去培养液，获得适量的菌体细胞；
(3)加入200μl冰浴过的Solution I，涡旋振荡使细胞均匀分布，室温下放置10min；
(4)加入400μl新鲜配置好的Solution II，轻轻颠倒混匀，冰浴5min；
(5)加入300μl Solution III，反复颠倒数次，使溶液在粘稠的菌体裂解物中分散均匀，然后置冰上5min；
(6)12000rpm离心10min，小心吸取上清液加入1.5ml离心管中；
(7)加入等体积的饱和酚、氯仿，通过剧烈振荡混合有机相和水相，12000rpm离心
5min；
(8)小心吸取上清液加入新的1.5ml离心管中，用等体积的氯仿重新抽提一次；
(9)小心吸取上清液加入新的1.5ml离心管中，加入2倍体积的无水乙醇，1/10体积的3mol/LNaAc，冰浴30min，12000rpm，离心10min，倾去上清液，倒置在吸水纸上，使溶液流尽；
(10)加入1ml70％乙醇洗涤两次，12000rpm离心5min，收集沉淀；
(11)倾去洗涤液，倒置于吸水纸上吸干残余的溶液，在超净工作台上吹干；
(12)加入50μl TE重悬，备用。
4.根据权利要求1所述的西洋参发状根诱导及植株再生研究方法，其特征在于：所述步骤(4c)中的琼脂糖凝胶电泳具体过程如下：
(1)用胶带封住电泳槽胶模边缘形成一个模具；
(2)配制足够的电泳缓冲液(1×TBE)用以装满电泳槽和配制凝胶；
(3)准确称取一定量的琼脂粉加到盛有一定量电泳缓冲液的三角瓶中在微波炉中加热至融化，然后小心加入溴乙锭，浓度为0.5μg/ml，轻轻旋转至混匀凝胶溶液；
(4)在模具上加一个合适的梳子形成加样孔，然后倒入适量温热的琼脂糖溶液，室温
30min以后，去掉封边胶带，将凝胶放入电泳槽，使电泳缓冲液没过凝胶约1mm；
(5)混合PCR扩增产物样品和0.2倍体积的上样缓冲液；
(6)用移液枪和一次性枪头将样品混合液缓慢加入浸没凝胶的加样孔内，分子质量标准品加在样品的左侧；
(7)盖上电泳槽盖，接好电极插头，DNA有阴极开始向阳极端泳动，给予1～5V/cm的电压，很快就能观察到溴酚蓝从加样孔进入胶体内；
(8)当DNA样品或二甲苯氰FF和溴酚蓝在凝胶中迁移了足够的距离时，关上电源，拔出电极插头和打开电泳槽盖，把凝胶置于凝胶成像系统下拍照。