喷雾干燥保存生物活性材料
阅读：311发布：2021-07-19
专利汇可以提供喷雾干燥保存生物活性材料专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供用粉状微粒基质保存 生物 活性材料 的方法和组合物。该方法对制剂提供了高压气体喷雾和/或接近超临界喷雾，随后在经调节的气流中干燥以形成包含生物活性材料的稳定的粉状微粒。，下面是喷雾干燥保存生物活性材料专利的具体信息内容。
1.一种制备包含生物活性材料的粉状微粒的方法，该方法包括：
制备包含生物活性材料和多羟基化合物的悬浮液和溶液；
制成溶液或悬浮液与高压气体或近超临界液体的混合物；
降低混合物的压力，从而形成小滴的气态悬浮体；和
用干燥气体与小滴的气态悬浮体交换把小滴干燥成粉状微粒。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于生物活性材料是选自蛋白质、肽、 核酸、细菌、细胞、抗体、酶、血清、疫苗、脂质体和病毒。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于病毒是选自流感病毒、副流感病毒、 呼吸道合胞病毒、单纯疱疹病毒、SARS病毒、冠状病毒家族成员、巨细胞病毒、 人类肺炎后病毒和Epstein-Bar病毒。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于多羟基化合物选自海藻糖、蔗糖、 山梨糖、松三糖、甘油、果糖、甘露糖、麦芽糖、乳糖、阿拉伯糖、木糖、核糖、 鼠李糖、palactose、葡萄糖、甘露醇、木糖醇、赤藻醇、苏糖醇、山梨糖醇和蜜 三糖。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于悬浮液或溶液还包含聚合物。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于聚合物选自淀粉、淀粉衍生物、聚 乙烯吡咯烷酮(PVP)、羧甲基淀粉、羟乙基淀粉(HES)、右旋糖酐、人类血清白蛋 白(HSA)和明胶。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于悬浮液或溶液还包含表面活性剂。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于表面活性剂包括聚乙二醇脱水山梨 糖醇单月桂酯、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯、或聚乙二醇和聚丙二醇的嵌段 共聚物。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于悬浮液或溶液还包含氨基酸。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于氨基酸包括精氨酸、赖氨酸、甲硫 氨酸、组氨酸、或谷氨酸。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于气体或近超临界液体选自氮、氧、 氦、二氧化碳、六氟化硫、氯氟烃、氟碳化合物、一氧化二氮、氙、丙烷、正戊 烷、乙醇、氮和水。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于近超临界液体的压力范围约为流体 临界压力的90％至110％。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于高压气体或近超临界液体包括压力 约1200psi。
14.如权利要求11所述的方法，其特征在于气体或近超临界液体包括温度范围 约在0℃到60℃。
15.如权利要求1所述的方法，其特征在于近超临界流体包含选自甲醇、乙醇、 异丙醇和丙酮的调节剂。
16.如权利要求1所述的方法，其特征在于制成混合物包含使溶剂或悬浮液与 高压气体或近超临界液体流动经过混合室。
17.如权利要求16所述的方法，其特征在于混合室包含在流动混合物中产生旋 涡或湍流的通道结构。
18.如权利要求1所述的方法，其特征在于降低压力包含混合物流过毛细管限 流器。
19.如权利要求18所述的方法，其特征在于毛细管限流器包含范围约为50um 到1000um的内径。
20.如权利要求19所述的方法，其特征在于内径是约100um。
21.如权利要求1所述的方法，还包括使悬浮液或溶液以约0.5ml/分钟到约 30ml/分钟的流速流动。
22.如权利要求1所述的方法，其特征在于小滴范围的平均大小约为5um到 50um。
23.如权利要求22所述的方法，还包括通过调节近超临界流体的压力，调节悬 浮液或溶液的压力，调节悬浮液或溶液的流动速度，调节喷嘴管道内径，调节干 燥气体的温度，调节微粒形成室内的压力，或改变悬浮液或溶液的成分的浓度来 调节小滴的平均大小。
24.如权利要求1所述的方法，其特征在于干燥包括粉状微粒悬浮在流化床中。
25.如权利要求1所述的方法，还包括把抗衡离子注入干燥室或干燥微粒室。
26.如权利要求1所述的方法，其特征在于干燥气体是温度范围约在35℃到90 ℃的氮气。
27.如权利要求1所述的方法，还包括再循环干燥气体。
28.如权利要求1所述的方法，其特征在于粉状微粒平均大小范围约为1um 到150um。
29.如权利要求1所述的方法，其特征在于粉状微粒的水分含量少于约重量5％。
30.如权利要求1所述的方法，其特征在于生物活性材料在储藏在约25℃保持 稳定至少约九个月或储藏在约4℃保持稳定至少约1年。
31.如权利要求1所述的方法，其特征在于生物活性材料包括在粉状微粒中保 留至少约一半原生存力的活病毒、活细菌，或活细胞。
32.如权利要求1所述的方法，还包含收集粉状微粒。
33.如权利要求32所述的方法，其特征在于收集包括用气流传送粉状微粒到第 二干燥室中。
34.如权利要求33所述的方法，其特征在于第二干燥室包括旋风旋涡室。
35.如权利要求32所述的方法，其特征在于收集包括粉状微粒按大小分离。
36.如权利要求35所述的方法，其特征在于分离包括粉状微粒的差别沉降。
37.如权利要求32所述的方法，其特征在于总的加工效率不少于约70％。
38.如权利要求1所述的方法，还包括用保护性涂层包覆粉状微粒。
39.如权利要求1所述的方法，还包括将粉状微粒重构成包含生物活性材料浓 度超过该悬浮液和溶液的重构的悬浮液或溶液。
40.如权利要求1所述的方法，还包括通过肌肉内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、 关节内、滑液内、鞘内、口服、体表、吸入鼻内，或肺部施用途径对哺乳动物施 用粉状微粒。
41.一种制备包含生物活性材料的粉状微粒的设备，该设备包含：
第一室，其包含生物活性材料和多羟基化合物的悬浮液或溶液；
第二室，其包含高压气体和/或近超临界液体；
混合室，其通过第一管道与第一室进行流体传送，通过第二管道与第二室进行 流体传送；
毛细管限流器，其在混合室和微粒形成容器之间提供受限的流体传送；和，
干燥气流；
由此使悬浮液或溶液与高压气体或近超临界流体在混合室内混合并喷到微粒 形成容器中，从而用干燥气体干燥形成小滴的细雾，制备包含生物活性材料的粉 状微粒。
42.如权利要求41所述的设备，其特征在于生物活性材料是选自蛋白质、肽、 核酸、细菌、细胞、抗体、酶、血清、疫苗、脂质体和病毒。
43.如权利要求41所述的设备，其特征在于多羟基化合物选自海藻糖、蔗糖、 山梨糖、松三糖、甘油、果糖、甘露糖、麦芽糖、乳糖、阿拉伯糖、木糖、核糖、 鼠李糖、palactose、葡萄糖、甘露醇、木糖醇、赤藻醇、苏糖醇、山梨糖醇和蜜 三糖。
44.如权利要求41所述的设备，其特征在于悬浮液或溶液还包含聚合物。
45.如权利要求44所述的设备，其特征在于聚合物选自淀粉、淀粉衍生物、聚 乙烯吡咯烷酮(PVP)、羧甲基淀粉、羟乙基淀粉(HES)、右旋糖酐、人类血清白蛋 白(HSA)和明胶。
46.如权利要求41所述的设备，其特征在于悬浮液或溶液还包含表面活性剂。
47.如权利要求46所述的设备，其特征在于表面活性剂包括聚乙二醇脱水梨糖 醇单月桂酸酯、聚氧乙烯单油酸脱水山梨糖醇酯、或聚乙二醇和聚丙二醇的嵌段 共聚物。
48.如权利要求41所述的设备，其特征在于悬浮液或溶液还包含一种或多种氨 基酸。
49.如权利要求41所述的设备，其特征在于超临界流体选自二氧化碳、六氟化 硫、氯氟烃、氟碳化合物、一氧化二氮、氙、丙烷、正戊烷、乙醇、氮和水。
50.如权利要求41所述的设备，还包含连接到第一室和混合室之间的第一管道 的第一流量控制设备。
51.如权利要求41所述的设备，还包含连接到第二室和混合室之间的第二管道 的第二流量控制设备。
52.如权利要求41所述的设备，其特征在于混合室包含内径超过毛细管限流器 内径的管道。
53.如权利要求52所述的设备，其特征在于从第一管道或第二管道到混合室的 进口包含与混合室轴小于90度的角度。
54.如权利要求41所述的设备，其特征在于毛细管限流器包含的内径范围约o 50um到1000um与第二室。
55.如权利要求54所述的设备，其特征在于内径范围约为50um到500um。
56.如权利要求55所述的设备，其特征在于内径是约100um。
57.如权利要求41所述的设备，其特征在于干燥气体的温度和湿度是受控的。
58.如权利要求41所述的设备，其特征在于微粒形成容器包括包含干燥气流的 第二干燥室，或与包含干燥气流的第二干燥室有流体接触。
59.如权利要求58所述的设备，其特征在于干燥气体是氮。
60.如权利要求58所述的设备，其特征在于干燥气体包含低于粉状微粒的玻璃 转化温度的温度。
61.如权利要求58所述的设备，还包含冷凝器或干燥器，由此在干燥气体再循 环到第二干燥室以前，从干燥气体中除去水分。
62.如权利要求58所述的设备，其特征在于第二干燥室还包含微粒收集容器或 与微粒收集容器有流体接触，在其中微粒被收集或干燥。
63.如权利要求58所述的设备，其特征在于第二干燥室还包含旋风旋涡室。
64.如权利要求58所述的设备，其特征在于第二干燥室还包含粉状微粒流化 床。
65.如权利要求64所述的设备，还包含保护性涂覆材料的喷雾，由此用保护性 涂层包覆粉状微粒。
66.如权利要求58所述的设备，其特征在于粉状微粒在第二干燥室内按大小分 离。
67.如权利要求66所述的设备，其特征在于按大小分离包括差异沉降、表面冲 击或过滤。
68.如权利要求41所述的设备，其特征在于粉状微粒的平均大小范围约为1um 到150um。
69.如权利要求41所述的设备，还包含离子发生器，由此中和静电电荷。
70.一种用来与近超临界液体组成混合物形成有改善稳定性喷雾干燥粉状微粒 的悬浮液或溶液，该悬浮液或溶液包含生物活性材料、多羟基化合物、聚合物和 表面活性剂。
71.如权利要求70所述的悬浮液或溶液，其特征在于生物活性材料是选自蛋白 质、肽、核酸、细菌、细胞、抗体、酶、血清、疫苗、脂质体和病毒。
72.如权利要求70所述的悬浮液或溶液，其特征在于生物活性材料的量的范围 约为悬浮液或溶液的0.05重量％到1重量％。
73.如权利要求71所述的悬浮液或溶液，其特征在于病毒是选自流感病毒、副 流感病毒、呼吸道合胞病毒、单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、SARS病毒、冠状病毒 家族成员、人类肺炎后病毒和Epstein-Bar病毒。
74.如权利要求73所述的悬浮液或溶液，其特征在于病毒是在悬浮液或溶液中 效价约为101TCID50到约1012TCID50的活病毒。
75.如权利要求70所述的悬浮液或溶液，其特征在于多羟基化合物选自海藻 糖、蔗糖、山梨糖、松三糖、甘油、果糖、甘露糖、麦芽糖、乳糖、阿拉伯糖、 木糖、核糖、鼠李糖、palactose、葡萄糖、甘露醇、木糖醇、赤藻醇、苏糖醇、 山梨糖醇和蜜三糖。
76.如权利要求75所述的悬浮液或溶液，其特征在于多羟基化合物的量的范围 从悬浮液或溶液的1重量％到约40重量％。
77.如权利要求75所述的悬浮液或溶液，其特征在于多羟基化合物是悬浮液或 溶液的约10重量％的蔗糖。
78.如权利要求70所述的悬浮液或溶液，其特征在于聚合物选自淀粉、氧化淀 粉、羧甲基淀粉、羟乙基淀粉(HES)、水解明胶、聚乙烯吡咯烷酮、不水解明胶、 卵白蛋白、胶原蛋白、硫酸软骨素、唾液酸化多糖、肌动蛋白、肌球蛋白、微管、 动力蛋白、呋喃甲基腺嘌呤和人类血清白蛋白。
79.如权利要求75所述的悬浮液或溶液，还包含一种或多种氨基酸。
80.如权利要求78所述的悬浮液或溶液，其特征在于聚合物分子量范围约为 100Kda到300Kda。
81.如权利要求78所述的悬浮液或溶液，其特征在于聚合物的浓度范围约为悬 浮液或溶液的0.5重量％到约10重量％。
82.如权利要求81所述的悬浮液或溶液，其特征在于聚合物包括浓度约5重量 ％的HES。
83.如权利要求70所述的悬浮液或溶液，其特征在于表面活性剂是非离子表面 活性剂，选自烷基苯基烷氧化物、醇烷氧化物、脂肪胺烷氧化物、聚氧乙烯甘油 脂肪酸酯、蓖麻油烷氧化物、脂肪酸烷氧化物、脂肪酸酰胺烷氧化物、脂肪酸聚 二乙醇酰胺、羊毛脂乙氧基化物、脂肪酸聚二醇酯、异十三烷醇、脂肪酸酰胺、 甲基纤维素、脂肪酸酯、硅油、烷基聚苷、甘油脂肪酸酯、聚乙二醇、聚丙二醇、 聚乙二醇/聚丙二醇嵌段共聚物、聚乙二醇脱水山梨糖醇烷基醚、聚丙烯乙二醇烷 基醚、聚乙烯乙二醇/聚丙烯乙二醇醚阻滞共聚物、聚乙烯乙二醇单月桂酸酯、和 聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯。
84.如权利要求70所述的悬浮液或溶液，其特征在于表面活性剂是离子表面活 性剂，选自烷基芳基磺酸盐、苯基磺酸盐、烷基硫酸盐、烷基磺酸盐、烷基醚硫 酸盐、烷芳基醚硫酸盐、烷基聚二醇醚磷酸盐、聚芳基苯基醚磷酸盐、烷基磺基 琥珀酸盐、烯烃磺酸盐、链烷烃蜡磺酸盐、石油磺酸盐、氨基乙磺酸盐、肌氨酸 盐、脂肪酸、烷基萘磺酸、萘磺酸、木素磺酸、磺化萘与甲醛的缩合物、磺化萘 与甲醛和苯酚的缩合物、木质素-亚硫酸盐废液、烷基磷酸盐、季铵化合物、胺氧 化物和甜菜碱。
85.如权利要求70所述的悬浮液或溶液，其特征在于表面活性剂的量的范围约 为0.001重量％到5重量％。
86.如权利要求85所述的悬浮液或溶液，其特征在于表面活性剂的量的范围约 为0.01重量％到1重量％。
87.如权利要求70所述的悬浮液或溶液，还包含约pH 3到约pH 8的缓冲剂。
88.如权利要求87所述的悬浮液或溶液，其特征在于缓冲剂包括磷酸盐、氨基 酸、碳酸盐、硼酸盐、醋酸盐、组氨酸、氨基乙酸或柠檬酸盐。
89.如权利要求87所述的悬浮液或溶液，其特征在于缓冲剂的浓度范围约为2 mM到500mM.
90.如权利要求70所述的悬浮液或溶液，还包含载体、赋形剂或稳定剂。
91.如权利要求70所述的悬浮液或溶液，其特征在于生物活性材料包括流感病 毒，多羟基化合物包括蔗糖，聚合物包括HES，表面活性剂包括聚乙二醇和聚丙 乙二醇的嵌段共聚物。
92.一种制造制品，其包含装有通过喷雾干燥近超临界气体与生物活性材料、 多羟基化合物、聚合物和表面活性剂的悬浮液或溶液组成的混合物制备的干燥粉 状微粒的容器。
93.一种成套装备，它包含按照干燥微粒组合物的制备方法制备粉状微粒的设 备元件，其特征在于该方法包括：
制备包含生物活性材料和多羟基化合物的悬浮液和溶液；
制成溶液或悬浮液与高压气体或近超临界流体制成混合物；
降低混合物的压力，从而形成小滴的气态悬浮液；和
用干燥气体与小滴的气态悬浮液交换把小滴干燥成粉状微粒。
发明领域
本发明涉及储存保存生物材料的领域。本发明具体涉及，如以喷雾干燥的粉状 微粒基质保存生物活性分子。
发明背景
生物材料，如蛋白质、肽、核酸、细菌、细胞、抗体、酶、血清、疫苗、脂质 体和病毒，在保存在介质或其他液体溶液中时通常是不稳定的。例如，封装的病 毒如活的从卵尿囊液中制备的流感病毒在冷藏温度，即约4℃，在储存少于2至3 周时释放一个log的效价，该效价由组织培养感染量(TCID50)定义。在室温条件 下(约25℃)和较热的温度如37℃，该病毒可分别在几天到几小时内释放该效价。 冷冻干燥法，其中水性制剂被冷冻随后通过升华干燥，常被用于稳定这些生物材 料。喷雾干燥是另一个常用于从生物材料中除水用于储存的方法。替代的保护分 子，如碳水化合物，在水分除去后可以增加稳定性，防止化学降解、变性和微生 物污染物的生长。
在冷冻干燥(冷冻干燥)处理，生物材料常与保护制剂混合成溶液或悬浮液， 冷冻，和通过升华脱水，并第二次干燥。冷冻的低温和升华干燥可延缓降解反应 的动力学但是它们也会降低保护制剂穿透某些生物材料的能力。而且，涉及冷冻 干燥的低温和表面积对体积的低比率会需要长的干燥时间。
冷冻干燥和第二次干燥处理会使得蛋白质或细胞，例如，产生明显的化学和物 理变化。该变化可由于盐的浓度、沉淀/结晶、剪切应力、极端pH、经冷冻干燥 的残余水分导致蛋白质活性的损失。冷冻干燥会使冰结晶刺穿细胞和无法保护内 部隔间。
通过研磨或冻干块或喷雾干燥制成粉状微粒对生物医药工业保存生物活性材 料是十分重要的和感兴趣的。这种细微粒不仅可以对生物材料如蛋白质、非蛋白 质生物分子(包括例如DNA，RNA，脂质和碳水化合物)提供适宜的储存形式，而 且可以被基本上脱水以长期储存，并在储存后可以将其再湿润以施用生物材料用 于其预定的用途。而且，该干燥细微粒可以在控制的直径范围生产并可以干燥的 气雾粉剂，例如，通过鼻内途径施用，其中患者的鼻粘膜可对生物材料再湿润和 溶解。使用该包含生物材料的细和微细微粒的许多其他应用可用于药物、生物制 剂和特别是活病毒疫苗领域中。因此，开发形成包含生物活性材料的细微粒的方 法是有利的。
喷雾干燥是长期使用的熟知的方法，如在食品加工工业中制备粉末。例如，液 体产品，如牛奶，是通过喷嘴喷到热气流中来制备粉末的。在喷雾中增加的暴露 表面积，结合干燥气体的高温，可从液体产品中快速移除水。但是，该处理条件 常不适合敏感的生物材料，因为在高温中失去水合水可产生剪切应力、热应力、 氧化应力和构象改变。其中一些问题用药物喷雾干燥方法解决，如Wilson的美国 专利5,902,844，“喷雾干燥含氨基酸基材料的药物制剂”(Spray Drying of Pharmaceutical Formulations Containing Amino Acid-Based Materials)。 在该专利中，肽与水溶性聚合物的溶液被喷到干燥气流中形成药物组合物。聚合 物的存在可通过涂覆肽抵抗化学影响和通过替代在干燥中失去的水合水来保护肽 免受降解。但是，某些敏感的肽和其他生物材料，如核酸、细菌、细胞、抗体、 酶、血清、疫苗、脂质体和病毒仍然会被Wilson等所述的处理中的热量、剪切应 力和脱水所损害。
较大和较复杂的生物制剂，如活病毒和细菌疫苗，被完全认为是最不稳定的产 品。例如，封装的病毒如活的从卵尿囊液中制备的流感病毒在冷藏温度，即约4 ℃，在储存少于2至3周时释放一个log的效价，该效价由组织培养感染量(TCID50) 定义。在室温条件下(约25℃)，该病毒可在几天内释放该效价。
仍然需要保存敏感的生物材料，如储存的蛋白质和活病毒，特别是在冷冻以上 温度下保存的方法。需要适合具体生物材料敏感性的使用快速低温干燥处理制备 干燥粉状微粒的方法。而且，喷雾干燥处理不需要暴露于有机助溶剂，这可减少 敏感生物结构的变性。可以在储存中保护该生物制剂的组合物可在医药和科学研 究中通提供益处。在看了下文的描述后，本发明的这些特性和其他特性将会显而 易见。
发明概述
本发明包括在储存时保存生物活性材料的方法、设备和组合物。本发明提供， 如用高压气体和/或近超临界流体的混合物喷雾，和可对敏感生物活性材料可减少 剪切应力和温度应力形成细干燥粉状微粒的条件下喷雾干燥。
本发明的方法通常包括，如把悬浮液或溶液中的生物活性材料与高压气体或喷 雾近超临界气体混合以在比普通喷雾或雾化技术更低温度和更低剪切应力的条件 下形成细微粒。喷雾中细小滴可以例如更快地，而且在比普通技术更低的温度下 干燥。本发明的方法可提供，如能产生超细的小滴大小，导致小滴表面积与体积 比率增加，使单位给定热量输入下的蒸发效率增高。本发明中制备粉状微粒的方 法可包括，例如，制备生物活性材料和多羟基化合物的水性悬浮液和溶液，制成 溶液或悬浮液与加压气体或近超临界流体的混合物，通过对该混合物减压来喷雾 超精细小滴，和通过喷雾气体与干燥气体之间的交换，如通过喷雾到喷雾干燥设 备的干燥室中，把小滴干燥成粉状微粒。
用于本发明方法中的混合物和喷雾的悬浮液或溶液中的生物活性材料可以是， 如蛋白质、肽、核酸、细菌、细胞、抗体、酶、血清、疫苗、脂质体、病毒和/ 或类似物。用于本发明方法的生物活性材料悬浮液的病毒可包括，如流感病毒、 副流感病毒、呼吸道合胞病毒、单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、SARS病毒、冠状病 毒家族成员、人类肺炎后病毒和Epstein-Bar病毒。
用于本发明方法中的混合和喷雾的悬浮液或溶液中多羟基化合物可以是，如海 藻糖、蔗糖、山梨糖、松三糖、甘油、果糖、甘露糖、麦芽糖、乳糖、阿拉伯糖、 木糖、核糖、鼠李糖、palactose、葡萄糖、甘露醇、木糖醇、赤藻醇、苏糖醇、 山梨糖醇和蜜三糖。悬浮液或溶液也可包含，如聚合物，如淀粉、淀粉衍生物、 羧甲基淀粉、羟乙基淀粉(HES)、右旋糖酐、人类血清白蛋白(HSA)和明胶，以提 供对微粒的生物活性材料和结构的保护。表面活性剂，例如，聚乙二醇脱水山梨 糖醇单月桂酸酯、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯、或聚乙二醇和聚丙二醇的嵌 段共聚物，可加到悬浮液或溶液中增加悬浮液或溶液成分的溶解性，和/或增加本 发明的粉状微粒的重构和稳定性。氨基酸添加剂如精氨酸、赖氨酸、氨基乙酸、 甲硫氨酸、谷氨酸、组氨酸等，可以是有用的稳定剂。
本发明的悬浮液或溶液可在喷雾前与加压气体或近超临界条件的气体混合。本 发明中的高压气体可以是，如氮、二氧化碳、氧气、丙烷、一氧化二氮、氦、氢 和/或类似物，压力范围约在为，每平方英寸100磅(psi)到15,000psi，或1000 psi。近超临界是指，如压力范围在流体的临界压力和/或温度的约90％到110％。 其中近超临界流体是二氧化碳，典型的压力可约为1200psi。本发明方法中近超 临界流体可以是，如二氧化碳，六氟化硫、氯氟烃、氟碳化合物、一氧化二氮、 氙、丙烷、正戊烷、乙醇、氮、水，和/或类似物。高压气体或近超临界流体在与 悬浮液或溶液混合前的温度范围常约为0℃到60℃。调节剂，如甲醇、乙醇、异 丙醇或丙酮可加入气体或近超临界流体中，以影响流体的物理特性和/或影响悬浮 液或溶液初次干燥。
高压气体或接近超临界气体在混合物中与溶液或悬浮液接触可提供，如某种溶 剂化或乳化作用效果。例如，气体的溶液，或液相的气体，在该气体以某种明显 程度溶解在悬浮液或溶液中时可在悬浮液或溶液中形成。任选地，如溶液或悬浮 液可在某种程度上溶解在液相近超临界气体中。在另一方面，如悬浮液或溶液可 在高压气体或近临界气体中乳化，或高压气体或近临界气体可在悬浮液或溶液中 乳化。对该溶剂化或乳化作用效果的控制可以通过调节混合物温度、在混合室中 的停留时间、溶液或悬浮液与高压气体或接近超临界气体的相对比例、流速、压 力、溶液或悬浮液成分、另外加入的溶剂等等来达到。
形成高压气体和/或近超临界流体与悬浮液或溶液的混合物可在，如有T接头 的喷嘴、混合室和/或毛细管限流器中进行。形成混合物需要使溶液或悬浮液与压 力气体或近超临界流体流动通过混合室。该混合室可有在流动混合物中产生旋涡 或湍流以增加混合效率的通道结构。混合物通过喷嘴并从毛细管限流器的喷雾出 口孔喷出可减少混合物的压力(膨胀)气体中形成小滴的悬浮液。该毛细管限流 器可有小于混合室的内径；该内径通常小于约1000um，范围约为50um到500um，或 约100um。
可调节各种参数以改变小滴的平均大小。小滴的大小可以通过调节近超临界流 体压力或高压气体的压力，调节悬浮液或溶液压力，调节悬浮液或溶液的流速， 选择喷嘴管道内径，调节干燥气体的温度，调节微粒形成容器内的压力，改变悬 浮液或溶液成分的浓度等等来影响。例如，悬浮液或溶液可以约0.5ml/min到约 30ml/min送到混合室以从100um内径喷嘴孔中喷雾；速度低形成较小小滴，速度 快形成较大小滴。在本发明方法中，形成的小滴的质量中值直径范围约在1um到 200um较佳。
在喷雾形成小滴后，初次和第二次干燥使小滴转化成微粒。初次干燥以减压开 始和液体-气体(溶液或悬浮液-高压气体或近超临界气体)混合物膨胀以形成小 滴的气态悬浮液。该气体和膨胀混合物的蒸发溶剂随后可与干燥气体，如温度范 围约在5℃到90℃的氮气交换。干燥可包括第二次干燥，其中残余水分在大体初 次除水后被进一步减少。干燥可以在旋风旋涡中或通过把粉状微粒悬浮在干燥气 体的上升气流中形成流化床来进行。为了减少静电积累和可能的微粒结块，可把 抗衡离子加入干燥室或干燥微粒中。干燥气体可以通过在热交换器和/或干燥器或 冷凝器中再调节而被再循环。在干燥结束时，粉剂微粒的平均大小(MMD)范围约为， 0.5um到200um，或1um到150um，或5um到20um，水分含量少于约10重量％，在 约25℃储存至少约9个月或在约4℃储存至少约2年生物活性材料保持稳定。在 处理后粉状微粒中活的病毒、活的细菌和活的细胞可保留原生存力的至少约一半， 或至少约10％。
微粒可用干燥气流传送到干燥室中，按大小分离、涂覆、收集等等。粉状微粒 可通过在用干燥气流将它们传送到第二干燥室中进行收集。第二干燥室可被配置 为旋风旋涡室使微粒与室的温热表面接触和延长微粒与干燥气体的接触时间。在 该室内微粒可按照大小分离，如通过差别沉降。微粒可用聚合物涂覆以形成保护 涂层。在回收前微粒可沉降到该室底部的收集容器中积聚。总的处理效率是50％， 70％，80％，90％或更多的生物活性材料物质和/或活性可回收。
回收的粉状微粒以微粒或重构的溶液或悬浮液施用。以本发明方法制备的细微 粒可重构成生物活性材料浓度超过原先处理悬浮液或溶液的悬浮液或溶液。例如， 干燥的粉状微粒可以起始进液体材料(溶液或悬浮液)浓度的2-30倍重构而不导 致明显的活性丧失或蛋白变性；100mg/ml溶液的重构时间可少于5分钟。粉状微 粒可以通过肌肉内、腹膜内、脑脊内、皮下、关节内、滑液内、鞘内、口服、体 表、吸入鼻内和/或肺部途径对哺乳动物施用。
本发明的方法可用本发明的设备进行。该设备有数个室可在混合物从喷嘴喷雾 到微粒形成容器之前容纳和混合悬浮液或溶液和加压气体或近超临界流体。在那 里形成的微粒可以在干燥气流中干燥和/或传送到第二干燥室内，该室被配置来进 一步干燥、涂覆、筛分、按大小分类和/或收集微粒。在设备的一个实例中，例如 第一室包含生物活性材料和多羟基化合物的悬浮液或溶液，第二室包含高压气体 和/或近超临界流体，混合室通过第一管道与第一室进行液体传送和通过第二管道 与第二室进行液体传送，毛细管限流器在混合室和微粒形成容器之间提供有限的 液体传送，在悬浮液或溶液与气体和/或近超临界流体在混合室内混合和喷到微粒 形成容器中时干燥气流流动以干燥小滴形成的细薄雾。其结果是包含生物活性材 料的稳定干燥细粉微粒的制剂。
第一室内的悬浮液或溶液可包括例如生物活性材料，多羟基化合物、聚合物和 表面活性剂。生物活性材料可包括，如蛋白质、肽、核酸、细菌、细胞、抗体、 酶、血清、疫苗、脂质体、病毒等等。多羟基化合物可以是，如海藻糖、蔗糖、 山梨糖、松三糖、甘油、果糖、甘露糖、麦芽糖、乳糖、阿拉伯糖、木糖、核糖、 鼠李糖、palactose、葡萄糖、甘露醇、木糖醇、赤藻醇、苏糖醇、山梨糖醇和蜜 三糖和/或类似物。聚合物可以是淀粉、淀粉衍生物、羧甲基淀粉、羟乙基淀粉 (HES)、右旋糖酐、人类血清白蛋白(HSA)、明胶和/或类似物。表面活性剂可以 是，如聚乙二醇脱水山梨糖醇单月桂酸酯(Tween 20)、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单 油酸酯(Tween 80)、和聚乙二醇和聚丙二醇的嵌段共聚物(Pluronic)和/或类似 物。氨基酸添加剂如精氨酸、赖氨酸、氨基乙酸、甲硫氨酸、谷氨酸、组氨酸等 可以是有用的稳定剂。
在设备中与悬浮液或溶液混合的气体和/或近超临界流体可以是，如氮、二氧 化碳、氧、丙烷、一氧化碳、荧烷(flaorahe)、一氧化二氮、氦、氢、六氟化硫、 氯氟烃、氟化碳化合物、一氧化二氮、氙、丙烷、正戊烷、乙醇、氮、和/或水。
该悬浮液或溶液，和重复高压气体和/或近超临界流体，可加到该设备的喷嘴 中形成混合物喷到该设备的微粒形成容器中。第一流量控制设备，如泵或阀，可 被连接到第一室和混合室之间的第一管道以控制悬浮液或溶液进入混合室的流 量。第二种流量控制设备，如泵或阀，可连接到第二室和混合室之间的第二管道 以控制气体和/或近超临界流体进入混合室的流量。从第一管道和/或第二管道到 该混合室的进口与混合室轴线之间的角度可小于90度。毛细管限流器可提供，如 对流动混合物的背压和从喷嘴喷出混合物的孔。毛细管限流器可有，如小于混合 室的内径；毛细管限流器的内径通常范围约为50um到1000um，50um到500um，或 100um。喷嘴可包括，如多个毛细管限流器。喷嘴可有多个进料通道的交会以调 节超过一种气体和/或超过一种液体进料的混合物。
混合物通过喷嘴喷出形成的细小滴薄雾可被干燥气体所干燥。微粒形成容器可 作为第二干燥室，或与第二干燥室进行流体接触，在第二干燥室中通过接触干燥 气体和/或室的表面，微粒可被传送和干燥。干燥气体可以是，如控制温度和/或 湿度的氮气。干燥气体(进入气体)可以处于，如低于粉状微粒玻璃转化温度的 温度。
微粒中残余水分在第二干燥室中可减少到稳定的水平。第二干燥室可配置成旋 风旋涡，粉状微粒的流化床，把保护涂覆材料喷到粉状微粒上的室，按大小分离 的设备，和/或微粒收集容器。干燥气体可通过微粒形成容器和/或第二干燥室在 冷凝器或干燥器除水后被再循环。在设备中按照大小分离微粒可以通过，如差别 沉降、表面冲击、或过滤，以产生平均大小(MMD)约为1um到150um范围，或约 10um的粉状微粒。设备中可包括离子发生器以中和静电电荷。
本发明包含组合物，如生物活性材料、多羟基化合物、聚合物添加剂、氨基酸 添加剂、和/或表面活化剂为的是的悬浮液或溶液，与高压气体和/或近超临界流 体形成混合物以制成稳定性改善的喷雾干燥粉状微粒。该悬浮液或溶液可包含其 他成分，如缓冲剂、载体、赋形剂和/或稳定剂。在一个实例中，该组合物是流感 病毒在蔗糖、HES、和聚乙二醇和聚丙二醇的嵌段共聚物(Pluronic)的水性溶液中 的悬浮液。
悬浮液或溶液制剂可包括生物活性材料如蛋白质、肽、核酸、细菌、细胞、抗 体、酶、血清、疫苗、脂质体、和病毒。生物活性材料的量的范围约为，如小于 悬浮液或溶液重量百的0.00001重量％到约30重量％或更多。在病毒生物活性 材料的情况下，病毒可以是，如流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、单纯 疱疹病毒、SARS病毒(严重急性呼吸道综合症)、冠状病毒家族成员、巨细胞病 毒、人类肺炎后病毒和Epstein-Bar病毒。悬浮液或溶液中活的病毒的效价范 围约为，如从103TCID50到1012TCID50/ml，或106TCID50/ml。干燥微粒中病毒 的量约为，如102TCID50/g，102TCID50/g，103TCID50/g，，104TCID50/g，105TCID50 /g，106TCID50/g，107TCID50/g，108TCID50/g，109TCID50/g，1010TCID50/g， 或1011TCID50/g。
本发明的悬浮液或溶液可包括任何非还原或还原多羟基化合物，如海藻糖、蔗 糖、山梨糖、松三糖、甘油、果糖、甘露糖、麦芽糖、乳糖、阿拉伯糖、木糖、 核糖、鼠李糖、palactose、葡萄糖、甘露醇、木糖醇、赤藻醇、苏糖醇、山梨糖 醇和蜜三糖。悬浮液或溶液中多羟基化合物的量，如范围约在1重量％到约40重 量％。在一个具体实例中，悬浮液或溶液中多羟基化合物是约10重量％的蔗糖。
本发明的悬浮液或溶液中可有聚合物。典型聚合物是亲水生物聚合物，如淀粉、 淀粉衍生物、羧甲基淀粉、羟乙基淀粉(HES)、右旋糖酐、人类血清白蛋白(HSA)、 明胶和/或类似物。聚合物的分子量的范围约在1kDa到300kDa常是较佳的。本 发明悬浮中液的聚合物浓度范围约在0.5重量％到10重量％。在一个实例中，悬 浮液或溶液包含浓度在约5重量％的HES。
本发明的悬浮液或溶液中可有表面活性剂，如以增加制剂成分的溶解性，有助 于细微粒的喷雾，稳定生物活性材料，和/或改善干燥微粒的重构时间。本发明的 悬浮液或溶液中可包括非离子表面活性剂，如烷基苯基烷氧化物、醇烷氧化物、 脂肪胺烷氧化物、聚氧乙烯甘油脂肪酸酯、蓖麻油烷氧化物、脂肪酸烷氧化物、 脂肪酸酰胺烷氧化物、脂肪酸聚二乙醇酰胺、羊毛脂乙氧基化物、脂肪酸聚二醇 酯、异十三烷醇、脂肪酸酰胺、甲基纤维素、脂肪酸酯、硅油、烷基聚苷、甘油 脂肪酸酯、聚乙二醇、聚丙二醇、聚乙二醇/聚丙二醇嵌段共聚物、聚乙二醇烷基 醚、聚丙二醇烷基醚、聚乙二醇/聚丙二醇醚嵌段共聚物、聚乙二醇脱水山梨糖醇 单月桂酸酯、和/或聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯。本发明的悬浮液或溶液可包 括离子表面活性剂，如烷基芳基磺酸盐、苯基磺酸盐、烷基硫酸盐、烷基磺酸盐、 烷基醚硫酸盐、烷基芳基醚硫酸盐、烷基聚二醇醚磷酸盐、聚芳基苯基醚磷酸盐、 烷基磺基琥珀酸盐、烯烃磺酸盐、链烷烃磺酸盐、石油磺酸盐、氨基乙磺酸盐、 肌氨酸盐、脂肪酸、烷基萘磺酸、萘磺酸、木素磺酸、磺化萘与甲醛的缩合物、 磺人萘与甲醛和苯酚的缩合物、木质素-亚硫酸盐废液、烷基磷酸盐、季铵化合物、 胺氧化物和甜菜碱。悬浮液或溶液中的表面活性剂的量的范围约为，如0.001重 量％到5重量％，或0.01重量％到1重量％。
本发明的悬浮液或溶液(液体进料)还可包含氨基酸稳定剂添加剂如赖氨酸、 精氨酸、氨基乙酸、甲硫氨酸、组氨酸等等。悬浮液或溶液可包括缓冲剂，如磷 酸盐、碳酸盐、硼酸盐、醋酸盐、组氨酸、氨基乙酸、柠檬酸盐、和/或类似物， 以提供pH如从约pH 3到pH 8。合适的话，缓冲剂的浓度范围约为2mM到50mM。
本发明包括，如包含可容纳通过喷雾干燥高压气体和/或近超临界气体与生物 活性材料、多羟基化合物、聚合物添加剂和表面活性剂的悬浮液或溶液的混合物 所制备的干燥粉状微粒的容器的制造制品。
定义
在详细描述本发明之前，要理解本发明并不限于具体的设备和生物系统，它当 然可以变化。也可以理解本文使用的术语只是用于描述具体的实例，而不是用来 限制。在本说明书和所附的权利要求书中，除非本文内容另外清楚地规定，单数 形式“a”，“an”和“the”包括复数有关事物。因此，例如，提到“一个表面” 包括两个或更多的表面的组合；提到“细菌”包括细菌的混合物等。
除非另外说明，本文使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域普通技术人 员通常所理解的含义是一致的。虽然与本文描述的方法和材料类似或等同的任何 方法和材料实际上可用于检验本发明，但是使用本文描述的材料和方法较佳。在 本发明的描述和权利要求中，下列术语按照下文的定义使用。
“环境”温度或条件是指在指定环境中的任何指定时间的温度或条件。通常， 室温是约22℃，环境大气压，和环境湿度容易测定，并按照年内时间、天气条件、 (海拔)高度等而变化。
“沸腾”指，如液体的温度超过沸腾温度时从液体到气体的快速相变。沸腾温 度，如本领域中熟练技术人员所熟知的，是液体的蒸汽压与施加的压力相等时的 温度。
“缓冲剂”是指通过其酸碱共轭成分的反应来阻止pH变化的缓冲溶液。缓冲 剂的pH通常选择成稳定选择的活性材料，并可被本领域技术人员确定的。通常， 缓冲剂的pH在生理pH范围内，虽然某些蛋白质可在较宽的pH范围内，例如酸性 pH保持稳定。因此，较佳的pH范围约为1到10，约3到8尤佳；约6.0到8.0 更佳；约7.0到7.4更加佳；在约7.0到7.2最佳。合适的缓冲剂包括pH 7.2的 磷酸盐缓冲剂和pH 7.0的柠檬酸盐缓冲剂。如本领域技术人员所知晓的，有大量 的合适缓冲剂可以使用。合适的缓冲剂包括，但不限于，氨基酸、磷酸钾、磷酸 钠、醋酸钠、组氨酸-HCl，柠檬酸钠、琥珀酸钠、碳酸氢铵和碳酸铵。通常，缓 冲剂使用的摩尔浓度约为1mM到2M，约2mM到约为1M较佳，和约10mM到0.5 M更佳，和25到50mM最佳。
“排气”是指液体溶液中气体在气体的分压大于施加的压力时释放。如水置于 一个大气压(约760乇)的氮气中，且水中氮的分压与气相压力平衡，如果气压降 低则氮可从水中鼓泡。这不是沸腾，并可经常在溶剂沸腾的压力以上的压力下发 生。例如，瓶装的弃碳酸气软饮料，CO2气体分压高，在除去瓶盖压力降低时会快 速冒泡
“可分散性”是指粉末合物可在气流中被分散(即悬浮)使得分散的微粒可被 呼吸或吸入到受试者的程度。因此，有20％可分散性的粉末指只有20％的粉末质可 被吸入装置悬浮以吸入肺中。
“干燥”在干燥粉末合物的场合指残余水分含量少于约10％。干燥粉末合物通 常被干燥到5％或更少的残余水分，或在约3％到0.1％之间。“干燥”在吸入微粒 场合指组合物有水分含量，使得微粒在吸入设备中可容易地分散形成气溶胶。
“赋形剂”通常是指在喷雾冷冻干燥处理和随后的过程中加入以增加治疗剂的 稳定性使得粉末品有长期物理稳定性和流动性的化合物或材料。合适的赋形剂可 以是，如在接触水后不增稠聚合的制剂，该制剂在患者吸入后基本无害和不与治 疗剂明显相互作用改变其生物活性。合适的赋形剂在下文中描述，包括但不限于， 蛋白质如人类和牛血清白蛋白，明胶，免疫球蛋白，碳水化合物包括单糖(半乳 糖、D-甘露糖、山梨糖等)，二糖(乳糖、海藻糖、蔗糖等)，环糊精，和多糖 (蜜三糖、麦芽糊精、右旋糖酐等)；氨基酸如谷氨酸一钠、氨基乙酸、丙胺酸、 精氨酸或组氨酸，及疏水氨基酸(色氨酸、酪氨酸、亮氨酸、苯基丙氨酸等)； 甲基胺如甜菜碱；赋形剂盐如硫酸镁；多羟基化合物如三羟基或更高的糖醇，如 甘油、赤藻醇、丙三醇、阿拉伯醇、木糖醇、山梨醇和甘露醇；丙二醇；聚乙二 醇；Pluronics；表面活性剂；和它们的组合。赋形剂可以是本发明中溶液或悬浮 液的多官能成分。
“玻璃”或“玻璃态”或“玻璃基质”指流动能力明显降低的液体，即，很高 粘度的液体，其中粘度范围在1010到1014帕斯卡-秒。它可以被认为是亚稳定无 定形体系，其中分子有振动运动但是有很慢(几乎测不出)的转动和平移分量。 作为亚稳定体系，它在储存在远低于玻璃转化温度的温度时可在长时间内稳定。 由于玻璃不处于热力学平衡状态，储存在玻璃转化温度和接近玻璃转化温度的玻 璃松弛到平衡并失去了高粘度。产生的似橡胶的或糖浆状，流动液体经常在化学 上和结构上不稳定。玻璃虽然可通过许多不同途径获得，但无论用任何途径获得， 看起来在物理上和结构上是一样的材料。用于获得本发明的玻璃基质的方法通常 是溶剂升华和/或蒸发技术。
“玻璃转化温度”以符号Tg表示，是指组合物从玻璃或类玻璃状态转变为糖 浆状或似橡胶的状态的温度。通常Tg是使用差示扫描热量法(DSC)确定和标准规 定把扫描通过该转变时组合物热容量(Cp)开始发生变化的温度作为玻璃转化温 度。Tg的定义长常常是任意的，目前尚无国际规定。Tg可被定义在转化的开始、 中点或结束；对本发明来说我们使用在DSC和DER上的Cp变化的开始。详见题为 “用液体和生物聚合物形成玻璃”(“Formation of Glasses from Liquids and Biopolymers”)的文献，C.A.Angell：Science，267，1924-1935(Mar.31，1995) 和题为“玻璃转化的差示扫描量热法分析”(“Differential Scanning Calorimetry Analysis of Glasses Transitions”)的文献，Jan P.Wolanczyk：Cryo-Letters， 10，73-76(1989)。详细的数学处理见“玻璃转化特性和牖态”(″Nature of the Glass Transition and the Glassy State”)，Gibbs和DiMarzio：Journal of Chemical Physics，28，NO.3，373-383(March，1958).这些文献在此引用作为参 考。
“渗透促进剂”是表面活性化合物，促进药物渗透通过粘膜或粘膜层，通常是 鼻内、直肠内和阴道内使用。
“药物上可接受”赋形剂(载体、添加剂)是那些可被合理地施用到哺乳动物 受试体以提供有效剂量的使用的活性成分。这些赋形剂是联邦药品管理局Federal Drug Administration(FDA)必须指明为“公认安全”(‘Generally Regarded as safe’(GRAS))的较佳。
“药物组合物”指形式上允许活性成分的生物活性是明确有效的制剂，且该制 剂不包含任何对组合物施用到的受试者有毒的另外成分。
“多羟基化合物”是有多个羟基团的物质，并包括糖(还原和非还原糖)，糖 醇和糖酸。本文中较佳的多羟基化合物的分子量少于约600kDa(如范围约为1 20到400kDa)。“还原糖”是包含可还原金属离子或与蛋白质中赖氨酸和其 他氨基基团共价反应的半缩醛基团的多羟基化合物。“非还原糖”是没有还原糖 的这些特性的糖。还原糖的例子有果糖、甘露糖、麦芽糖、乳糖、阿拉伯糖、木 糖、核糖、鼠李糖、半乳糖和葡萄糖。非还原糖包括蔗糖、海藻糖、山梨糖、松 三糖和蜜三糖。甘露醇、木糖醇、赤藻醇、苏糖醇、山梨糖醇和甘油是糖乙醇的 例子。至于糖酸，包括L-葡萄糖酸盐和它们的金属盐。
“粉末”指由细分散的固体微粒组成的组合物，这些固体微粒可相对自由流动 和能被容易地分散在吸入设备中和随后被患者吸入，所以该微粒适合通过上呼吸 道包括鼻粘膜在鼻内或肺部施用。
“推荐储存温度”对组合物来说是粉状药物组合物储存以在该组合物的保存期 限内保持药物产品稳定性保证其一般释放剂量的温度。该温度开始由组合物的制 造商确定并由负责批准组合物销售的政府机构批准(如，美国的食品药品管理局 Food and Drug Administration in U.S.)。该温度随每个被批准的药物产品而 变化，取决于产品中活性药物和其他材料的温度敏感性。推荐储存温度的变化约 为小于约0℃到40℃，但通常是环境温度，即约25℃。药物产品常常被储存 在推荐储存温度或低于推荐储存温度中。
如果在给定时间生物活性材料如酶的生物活性是该药物组合物制备时以结合 鉴定法确定的生物活性的约10％(在分析误差以内)以内，则生物活性材料在药 物组合物中“保留其生物活性”。对于蛋白质，如抗体，以分析技术如尺寸排阻 HPLC，FTIR，DSC，CD，ELISA获得的纯度与生物活性相关。对于活的病毒的情况， 在组合物的病毒效价在一个log的起始效价以内可认为生物活性被保留。用于确 定流感病毒效价的分析是荧光聚焦分析(Fluorescent Focus Assay)(FFA assay)。 由此分析获得的效价以每毫升荧光聚焦单位(Fluorescent Focus Unit per milliliter)(FFU/ml)表示。一个FFU/ml约等于一个每毫，则生物活性材料在药 物组合物中“保留其生物活性”升组织培养感染量(Tissue Culture Infectious Dose per ml)(TCID50/ml)。其他“生物活性”分析在下文中详细描述。
例如如果在给定时间化学稳定性使得如上所述，认为生物活性材料仍然保留其 生物活性，则生物活性材料在药物组合物中“保留其化学稳定性”。或者，化学稳 定性可定义为，例如，使用合适的分析技术获得的生物材料结构没有明显变化。 化学稳定性可以通过对生物活性材料的化学变化形式进行检测和量化来评价。化 学变化可涉及大小改变(例如蛋白质的剪除)，可用尺寸排阻色谱法，SDS-PAGE 和/或基体辅助激光解吸电离/飞行时间质谱法(MALDI/TOF MS)评价大小改变。其 他类型的化学变化包括如用离子交换色谱法评价的电荷改变(如，脱酰胺作用的 结果)。
如果例如对色彩和/或透明性的视觉检查，或用UV光散射或通过尺寸排阻色谱 法测量显示聚集、沉淀和/或变性没有明显增加，则生物活性材料在药物组合物中 “保留其物理稳定性”。
“稳定”制剂或组合物是储存时其中生物活性材料基本保留其物理稳定性和/ 或化学稳定性和/或生物活性的制剂或组合物。用于测定稳定性的各种分析技术是 本领域可得到的，和可见，如肽和蛋白质给药“(Peptide and Protein Drug Delivery)，247-301，Vincent Lee Ed.，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.， Pubs.(1991)和Jones，A.Adv.Drug Delivery Rev.10：29-90(1993)。稳定性 可在选择的温度在选定的一段时间测定。趋势分析在材料被实际储存于该段时间 之前可用于估计预计存放期。对于活的流感病毒，稳定性被定义为它释放1 log FFU/ml或1 log TCID50/ml所用的时间。该组合物在室温(～25℃)稳定至少3 个月和/或在约2-8℃下稳定至少1年较佳。而且，该组合物在冷冻(到，如-70 ℃)和融化后仍稳定较佳。
本文中使用的高压气体或近超临界干燥是指从混合有高压气体或近超临界流 体的悬浮液或溶液中除去溶剂，如水或有机制剂。高压或超临界干燥可包括，如 把包含活性成分的溶液或溶剂与加压气体或超临界流体混合形成液体和气体的混 合物，通过减压喷出悬浮液或溶液，膨胀，或使气-液混合物脱气以产生细小滴。 许多超临界流体，如超临界二氧化碳，可用于超临界干燥处理。
“近超临界流体”是指保持在临界点压力和或温度(°K)的10％或约10％以内 的流体。临界点是温度和压力的组合，其中如果温度(临界温度)增高或压力(临 界压力)降低，物质不能再以液体形式存在。临界温度是在该温度以上气体不能 被液化的温度，在给定压力下在该温度以上物质不能显示明显的气相和液相的的 温度。临界压力是指在临界温度下液化气体(蒸汽)所需的压力。例如，二氧化 碳的临界压力和温度分别是74大气压和31摄氏度。保持在其临界点以上的压力 和温度下的二氧化碳是在超临界条件或状态。其他物质的临界压力和温度如下所 示：
液体 Pc(bar) Tc(℃) 二氧化碳 74 31 氧化亚氮 72 36 六氟化硫 37 45 氙 58 16 乙烯 51 10 三氟氯甲烷 39 29 乙烷 48 32 三氟甲烷 47 26
在药学意义上，生物活性材料“治疗有效量”是指对病症的预防或治疗有效的 量，其中“病症”是任何可从生物活性材料的治疗中受益的疾病。这包括慢性和 急性的病症或疾病，包括那些使哺乳动物易患上述病症的病理条件。
“治疗”指治疗处理和预防或防止措施。那些需要治疗的包括已经有病症的和 要预防病症的。
“单位剂量”指包含本发明治疗有效量的组合物的容器。
附图的简要描述
图1A和1B显示从100微米熔凝二氧化硅喷嘴中使用近超临界CO2喷出的小滴 大小与离喷嘴尖端的距离的关系。
图2显示从100微米熔凝二氧化硅喷嘴中使用加压氮气喷出的小滴大小分离喷 嘴尖端的距离的关系。
图3显示代表喷出压力对微粒大小影响的柱形图。
图4显示包含B/Harbin活病毒疫苗的喷雾干燥制剂的干燥粉末粒度分布。
图5显示使用差示扫描热量计(DSC)获得的AVO 47制剂的玻璃转化温度。
图6显示典型喷雾干燥粉末的形态。
图7显示喷雾干燥粉末制剂AVO 47的X线衍射数据。衍射图显示AVO 47制剂 的玻璃无定形特性。
图8显示在AVO 47a制剂中喷雾干燥的活B/Harbin流感病毒的长期稳定性。
图9是典型的超临界CO2喷雾干燥系统的示意图。
详细描述
本发明的方法、设备和组合物可以提供高初始纯度和在干燥粉状微粒基质中生 物活性材料的长期储存。该方法提供，例如通过把生物活性材料制剂与高压气体 和/或近超临界气体在混合室内混合，然后从喷嘴喷出制成细雾，快速把小滴干燥 成微粒而无需高热量。溶剂可以从该雾小滴快速蒸发留下干燥微粒，该微粒可在 第二干燥室内被进一步脱水。本发明的制剂包括，如生物活性材料和可以被干燥 成稳定保护基质的多羟基化合物、聚合物、氨基酸和/或表面活性剂的悬浮液或溶 液。
制备粉状微粒的方法
本发明的方法包括，如生物活性材料悬浮液或溶液与近超临界流体和/或高压 气体的混合物，使该混合物膨胀以形成小滴的细雾(气态悬浮体)，在微粒形成 容器和/或第二干燥室内将小滴干燥成粉状微粒。使与近超临界气体的混合物的悬 浮液或溶液膨胀可以在低剪切应力和相对低温度的条件下产生很细的小滴。在膨 胀过程中水分快速除去和细微粒的大小可使在微粒形成容器和/或第二干燥室内 有相对适度的干燥条件。低剪切喷雾，低温初次干燥和/或适度的第二次干燥条件 可减少粉状微粒中生物活性材料的加工降解和增加储藏时微粒的稳定性。
本发明中制备粉状微粒的方法包括，如制备溶液或悬浮液，与高压气体和/或 近超临界流体组成混合物，喷雾到微粒形成室内进行初次干燥，微粒的第二次干 燥，干燥稳定粉状微粒的回收。水性悬浮液或溶液可包含，如生物活性材料、多 羟基化合物、聚合物、氨基酸和表面活性剂。近超临界流体可以是，如二氧化碳。 混合物可以在毛细管限流器喷嘴出口附近的混合室内形成。在喷雾中气体膨胀可 使悬浮液或溶液分裂成快速干燥的细小滴。第二次干燥可以通过微粒悬浮在温度/ 湿度控制气体的旋涡或流化床中进行。粉状微粒产品可通过按大小分类后的沉涤 来回收。
制备悬浮液或溶液
本发明的悬浮液或溶液(液体进料)可包括，如在水溶液中与多羟基化合物、 聚合物、氨基酸和/或缓冲剂配制的生物活性材料。各成分可以用适合成分的顺序 混合，这是本领域熟练技术人员所知晓的。例如，生物活性材料如病毒或细菌， 可以在与多羟基化合物溶液混合形成悬浮液前通过离心或过滤从生长介质中浓缩 和分离。抗体在与其他制剂成分溶解在溶液中之前可通过亲和色谱法提纯和浓缩。 用于喷雾的液体悬浮液或溶液可通过在水溶液中混合生物活性材料、多羟基化合 物和其他赋形剂来制备。某些生物活性材料，如肽和抗体，可容易地溶解在水溶 液中。其他生物活性材料，如细菌和脂质体，可作为悬浮液中的微粒。不论生物 活性材料是否形成溶液或悬浮液，常需要，如在把它们混合到喷雾制剂中时避免 剪切应力或温度的恶劣条件。某些制剂成分要求加热或强烈搅拌来制备溶液，可 以把它们分开来溶解，随后在冷却后慢慢地与生物活性材料混合。
本发明的生物活性材料可以是，例如工业制剂、分析制剂、疫苗、药物、治疗 剂等。本发明的生物活性材料包括，例如蛋白质、肽、核酸、细菌、细胞、抗体、 酶、血清、疫苗、脂质体、病毒，和/或类似物。生物活性材料可以是，如活细胞 和/或存活病毒。生物活性材料可以是，如用作疫苗或作为治疗剂的释放介质的非 活细胞或脂质体。本发明中存活的生物活性材料可以是，如活病毒，如流感病毒、 副流感病毒、呼吸道合胞病毒、单纯疱疹病毒、SARS病毒、冠状病毒家族成员、 巨细胞病毒、人类肺炎后病毒和Epstein-Bar病毒，和/或类似物。这些材料的 溶液或悬浮液液体制剂的制备步骤可随着每个材料的独特的敏感性而变化。
悬浮液或溶液中生物活性材料的浓度可有较大变化，取决于比活性、赋形剂浓 度、施用途径、和/或材料的预定用途。例如，生物活性材料是肽疫苗、活病毒或 细菌时，材料要求的浓度可以很低。例如，生物活性材料是吸入治疗施用的抗体， 或体表施用的脂质体时，要求的浓度可以较高。通常，本发明中溶液或悬浮液中 生物活性材料的适合浓度约为，如少于1pg/ml到150mg/ml，5mg/ml到80mg/ml， 或50mg/ml。
生物活性材料的悬浮液或溶液可包括，例如多羟基化合物中任何一种。在本发 明的方法中，多羟基化合物可提供，例如粘度增加剂以减少喷雾时剪切应力作用。 多羟基化合物可以对本发明的干燥粉状微粒提供保护屏障和化学组成。例如，多 羟基化合物如蔗糖，可在物理上围绕和保护生物活性材料以免暴露于损害性的光 线、氧气、水分和/或类似物。多羟基化合物可以，例如替代干燥中失去的水合水， 防止材料中生物分子的变性。虽然本发明不限于任何具体的多羟基化合物，悬浮 液或溶液和粉状微粒组合物可包括，例如蔗糖、海藻糖、山梨糖、松三糖、山梨 糖醇、水苏糖、蜜三糖、果糖、甘露糖、麦芽糖、乳糖、阿拉伯糖、木糖、核糖、 鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、甘露醇、木糖醇、赤藻醇、苏糖醇、山梨糖醇、甘油、 L-葡萄糖酸盐，和/或类似物。希望制剂有冻-融稳定性时，多羟基化合物较好在 冷冻温度(如，-20℃)不结晶，因为在冷冻温度结晶可使制剂中生物活性材料不 稳定。制剂中的多羟基化合物的用量可根据生物活性制剂的特性、其他赋形剂和 预定用途而变化。但是，悬浮液或溶液通常包括浓度在约1％到40％之间在约1到 20％较佳的非还原糖。在具体较佳实例中，悬浮液或溶液包含约10％的蔗糖。
聚合物可包含在本方法的悬浮液或溶液中，例如，以提供保护和结构上的益处。 与多羟基化合物一样，聚合物可提供，例如对生物活性材料的物理和化学保护。 聚合物的线型或支链束可提供，如增强对本发明微粒组合物的结构强度。聚合物 可用作外表面或本发明的粉状微粒的保护和/或延时释放涂层。许多聚合物是，如 在水中高度可溶的，所以它们不会明显阻碍粉状微粒的重构。许多聚合物如聚乙 烯吡咯烷酮、聚乙二醇、聚氨基酸如聚L-赖氨酸，可明显增加水溶液中的重构速 度。在本发明方法中的聚合物保护制剂可包括，例如淀粉和淀粉衍生物，如氧化 淀粉、羧甲基淀粉和羟乙基淀粉(HES)、水解明胶、不水解凝胶、卵白蛋白、胶原 蛋白、硫酸软骨素、唾液酸化多糖、肌动蛋白、肌球蛋白、微管、动力蛋白、呋 喃甲基腺嘌呤、人类血清白蛋白，和/或类似物。使用的HES的分子量是在约 100,000到300,000之间较佳，约200,000更佳。通常，HES的浓度约为0.5到 10％，约1到5％之间较佳。较佳制剂包含约5％HES。
本发明的悬浮液或溶液可包含，如与使用的具体生物活性材料相容的表面活性 剂。表面活性剂可增加其他制剂成分的溶解度以防止在较高浓度下的聚集和沉淀。 表面活性制剂可，例如降低悬浮液或溶液的表面张力，使生物活性材料在气液界 面不变性，和/或在喷雾中可形成更细的小滴。本发明的悬浮液或溶液包含非在约 0.001和5％之间，较好在约0.05和1％之间或约0.2％的非离子表面活性剂、离子 表面活性剂、或它们的组合。
缓冲剂可加到本方法的制剂中，例如以对本发明方法的制剂和本发明组合物提 供合适稳定的pH。本发明的典型缓冲剂包括，例如氨基酸、磷酸钾、磷酸钠、醋 酸钠、柠檬酸钠、组氨酸、氨基乙酸、琥珀酸钠、碳酸氢铵和/或碳酸铵。缓冲剂 可调节到合适的酸和盐形式以提供，例如约在pH 3到pH 10范围，约在pH 4到 pH 8范围的pH稳定性。对于许多组合物，接近中性的pH如pH 7.2是较佳的。
制剂中可包括其他赋形剂。例如，氨基酸如精氨酸和甲硫氨酸可以是制剂和组 合物的成分。氨基酸可以，例如作为两性离子阻碍带电荷基团在处理表面和储存 容器上，并防止生物活性材料的非特异性结合。氨基酸可通过清除氧化剂，清除 脱酰氨基剂，和稳定蛋白质构象来增加组合物的稳定性。在另一个实例中，甘油 可包含在本发明的制剂中，如作为粉状微粒组合物中的多羟基化合物和/或增塑 剂。EDTA包含在该组合物中，以减少制剂成分的聚集和/或清除可引发破坏性自 由化学反应的金属离子。
混合和喷雾
本发明的悬浮液或溶液，例如在通过毛细管限流器喷嘴出口喷雾形成小滴的细 雾之前在室中与高压气体或近超临界流体混合。不限于特定的理论，高压气体或 近超临界流体与悬浮液或溶液的混合可形成在压力下被流体饱和和/或包围的小 滴的乳液混合物。当混合物从喷嘴中释放时，压力迅速下降使得爆炸性膨胀和/ 或冒泡(排气)，将小滴分裂成为薄雾(小滴的气态悬浮体)。该薄雾可以比在 较低压力下(如，小于100psi)喷雾或不同近超临界流体的喷雾产生的更细。 该小滴在有关混合物减压的任何相变或绝热膨胀期间可经历低温。其剪切应力比 在足以产生相同的细小滴的压力下的液压喷雾(即，不用气体喷出液体)小。
悬浮液或溶液与近超临界流体和/或高压气体在混合室内混合，然后在微粒形 成室内喷雾膨胀。悬浮液或溶液可装在容器内(第一室)并通过管道混合室送到。 悬浮液或溶液可通过容器增压或用高压泵泵送被压入混合室。高压气体和/或近超 临界流体例如可来自压力容器(第二室)的管道被送到混合室。混合室可以例如 是在喷嘴结构内配置来在流动混合物中产生旋涡或湍流的膨胀管道。例如取决于 气体或流体，和悬浮液或溶液成分，生物活性材料可以在混合物中以微粒、乳液、 沉淀物、和/或溶质存在。
本发明的喷嘴可适用于形成需要的小滴细雾。喷嘴可有，如将混合物送入到毛 细管限流器喷孔的管道，该毛细管限流器喷孔的内径约在50um和1000um之间， 或约100um。在一个较佳实例中，混合物包含悬浮液或溶液在加压气体或近超临 界流体中的乳液，这样当压力快速下降时，液体快速转化为气体，分散乳液小滴。 压力释放可以快速到气体形成是爆炸性的，导致包含生物活性材料的细小滴形成。 更具体的是，发现超临界CO2辅助喷雾导致超细喷雾小滴的形成。已经发现小滴大 小随离喷嘴的距离而变化，如图1A和1B所示。不限于特定的理论，认为如图1B 所示，在低剪切应力下从喷嘴10喷出的混合物形成相对较大的混合物小滴11， 较大小滴在爆炸区域12膨胀和/或冒泡成为悬浮液或溶液小滴13的细雾。例如， 如图1A所示，距离在约0到2cm下，小滴的平均大小约400μm，它们在爆炸区 域，在距喷嘴孔只有3cm处可被分裂成小滴大小约10μm。该超细小滴产品也可以 通过高压常规气体在约1000psi或更高压力下产生(见图2)。
如本领域熟练技术人员所知晓的，参数控制如微粒大小、大小分布、微粒产品 的形状和形式会取决于实施本发明方法时使用的操作条件。变量包括超临界流体 的流速，溶液或悬浮液的流速，生物活性材料和赋形剂的浓度，喷嘴的直径和长 度，微粒上的表面电荷，和微粒形成室和第二干燥室内的相对湿度、温度和压力。 例如，如图3所示，微粒大小可随喷雾压力增加而减小。柱形图显示在高喷雾压 力30下，产生的微粒平均值小于约10um，总体大小范围相对窄。在中等喷雾压 力31微粒平均大小是约45um，在低喷雾压力32微粒大小是约200um，二者的总 体大小范围相对较宽。
高压气体/近超临界流体和/或悬浮液/溶液经过喷嘴的流速可被控制以获得需 要的微粒大小，大小分布，形状，和/或形式。流速可以通过调节管道中的各阀来 确定，该阀是针形阀较佳。流速也可通过改变用于高压气体/近超临界流体和/或 悬浮液/溶液的泵送条件来控制。在干燥成微粒前，本发明小滴通常产生的平均大 小范围约在1um到50um，或约5um。
近超临界流体通常在接近液体的临界压力被引入混合室。高压气体通常在超过 约1000psi的压力下被引入混合室。悬浮液或溶液通常在流速约在0.5ml/min 到50ml/min，或约3ml/min(对于100um的毛细管限流器)到30ml/min，和在 近超临界流体压力的压力下被引入混合室。高压气体或近超临界流体流速对悬浮 液或溶液流速的质量流量比(气体/液体)可在约0.1和100之间，在1和20之 间较佳，在1和10之间更佳，在大约5最佳。悬浮液或溶液的较高比例和较高流 速可增加小滴和干燥微粒的大小。本发明干燥粉状微粒可控制到平均直径，如小 于约200um，约从0.5um到150um，通常约从1um到15um；约从3um到10um 较佳；约从5um到10um最佳(见图4)。小滴大小(以质量中值直径-MMD测量) 可控制到从约1um到400um范围，约从1um到200um；约从5um到50um较佳； 约从3um到10um最佳。
适合喷雾本发明溶液或悬浮液的加压气体包括，例如，氮、二氧化碳、氧气、 丙烷、一氧化二氮、氦、氢，和/或类似物；压力范围约在100磅/平方英寸(psi) 到15,000psi。本领域已知的适合用作超临界流体的许多流体包括，如二氧化碳、 六氟化硫、氯氟烃、氟碳化合物、一氧化二氮、氙、丙烷、正戊烷、乙醇、氮、 水，其他本领域已知晓的流体和它们的混合物。超临界流体是二氧化碳或二氧化 碳与另一气体如三氟甲烷，和/或调节剂如乙醇的混合物较佳。在本发明方法中加 压气体和/或近超临界流体与悬浮液或溶液混合的温度可以是，如约从0℃到60 ℃。在典型的实例中，近超临界流体是压力约在1000psi的CO2。在较低的二氧 化碳压力下，如500，750和950，(在接近临界条件下)细微粒也可被分散。近 临界流体被定义(King，M.B.，和Bott，T.R.，eds.(1993)，用近临界溶液萃取 天然产物”(“Extraction of Nature Products using Near-Critical solvents，”) (Blackie Acad & Prof.，Glasgow)pp.1-33)为压力和/或温度维持在它们的临 界压力和/或温度(°K)的0.9和1.0之间的物质。
超临界流体可任选地包含一个或多个调节剂，例如，但不限于，甲醇、乙醇、 异丙醇、和/或丙酮。当使用时，调节剂占超临界流体体积的不超过20％较佳，1％ 到10％更佳。术语“调节剂”是本领域熟练技术人员所熟知的。调节剂(或助溶 剂)被描述为某种化学品，当它加到超临界流体中时，它改变超临界流体在临界 点或临界点附近的固有特性和依数特性。
小滴的初次干燥，例如可在气-液体混合物的膨胀中开始。初次干燥可以，例 如，把液体小滴转变成初次干燥的微粒。悬浮液或溶液的某些溶剂可溶解在近超 临界流体中，例如甚至在膨胀开始以前。当喷雾膨胀时，流体可转变到气体状态， 移除潜热并冷却该薄雾。爆炸性膨胀可以把混合小滴粉碎成更小的小滴。对小滴 中高压气体或超临界流体的排气可进一步使它们分裂成更细的小滴。细小滴周围 的气体和蒸气可以被流经微粒形成容器的干燥气流替代(即交换)。在接触干燥 气体时精细小滴中大量的溶剂可以被蒸发；这可以通过小滴的表面对体积的高比 率，干燥气体的较热温度，干燥气体的低相对湿度来加快。第二次干燥可发生在 微粒形成容器中和/或干燥气体携带细小滴和/或初次干燥的微粒到第二次干燥室 内进一步减少残余水分。
任选的是，小滴的细雾可喷到冷流体流中以冷冻小滴。冷流可以是，如气体(如 CO2)，或液体(液氮)，温度约在-60℃到-200℃。冷冻的小滴可被置于低压环 境(即压力低于大气压)以通过升华除冰形成如低密度，冻干的干燥粉状微粒。
第二次干燥
结构上稳定和初次干燥微粒的第二次干燥，如可进一步除去夹带的溶剂，残余 水分，和/或分子水合的水，以提供有明显较低水分含量的粉状微粒组合物，该组 合物如在室温中长期储存是稳定的。第二次干燥可涉及，如微粒悬浮在干燥气体 旋涡中，微粒悬浮液在干燥气体流化床中，和/或在强真空中对微粒施加较热温度 数小时到数日。在喷雾和初次干燥中快速干燥和形成的细微粒大小可降低本发明 方法中第二次干燥的温度和时间。
第二次干燥条件可用于，如进一步降低微粒中的水分含量。微粒可在第二干燥 室内收集并保持在低于干燥(＜1％水分)制剂的玻璃转化温度(见图5)的温度， 或约在5℃到90℃之间，或约在25℃到65℃之间，或约35℃。该室可保持减压， 第二次干燥可持续，如约2小时到约5天，或约4小时到约48小时，直至残余水 分被降到需要的水平。通过在该室中提供干燥气体的上升气流以产生粉状微粒的 流化床悬浮体可加速第二次干燥。低残余水分的微粒通常显示在长时间储存中有 更好的稳定性。第二次干燥可持续到粉状微粒的残余水分约在0.5％和10％之间， 或少于约5％。在很低的残余水分值，某些生物活性分子可由于失去水合的水分子 而变性。这种变性可以通过在处理悬浮液或溶液中提供可替换的氢结合分子，如 糖、多羟基化合物和/或聚合物来减轻。
由于本文中描述的设备和方法的效率增加，干燥可以在比常用方法相对低的温 度中完成。而且，已经发现在绝热膨胀中，混合物的温度下降，即产生的小滴周 围的净温度由于自身冷却而降低。微粒形成容器和微粒收集器中气体温度可保持 在或低于干燥粉状微粒的Tg或生物活性材料的变性温度，并一般在约90℃或低 于约90℃；约在25-80℃较佳；约在30-50℃，或约35℃更佳。干燥温度降低 可使干燥处理的活性损失最小并有助于增加保存在由该方法回收的干燥细微粒中 的生物活性。
干燥气体可被再循环和再调节以提供需要的干燥条件。干燥气体可以是基本惰 性气体，如氮气，以防止在干燥中生物活性材料的化学降解。气体可从微粒形成 容器和/或第二干燥室再循环，经过干燥器或冷凝器除去水分，经过热交换器来加 热或冷却气体来提供需要的干燥温度，并再循环，如回到微粒形成室。离子发生 器可把离子注入微粒流中以减少电荷累积和/或控制细微粒团聚成较大微粒的团 聚速度。
本发明的粉状微粒干燥时的大小，如可适合操作、重构和/或产品的施用要求。 例如，通过鼻内施用吸入释放的生物活性材料粉状微粒约在20um到150um，比深 肺部吸入释放的微粒大小约在0.1um到10um要大。缓慢重构产品的微粒大小可 比快速溶解的微粒要小。喷雾冷冻干燥微粒可有，例如较低密度，因为从小滴中 可除冰而留存固体支承的饼状结构不会破坏。由于它们较小的空气动力学半径， 该微粒可有，如对吸入施用在物理上较大的大小。在某些处理条件下，本发明的 粉状微粒可有中空的半球状(见图6)。冷冻干燥微粒，例如可比液体小滴干燥 的微粒大并仍然保留由于冷冻-干燥微粒的多孔特性的快速重构特性。本发明粉状 微粒平均物理直径，如约在0.1um到200um，约在1um到50um，或约在2um到 20um(见图4)。
在第二次干燥过程期间，如喷雾涂层或其他保护涂层可被施加于该微粒。例如， 聚合物溶液的薄雾可在旋涡或流化床被喷到干燥微粒的悬浮体中。
本发明的方法产生药物上可接受的，包含至少一种生物活性材料在无定形玻璃 样基质中的粉状微粒。组合物是几乎完全干燥较佳。某些水或其他水性溶剂可保 留在组合物中，但通常不超过约5重量％的残余水分保留。干燥温度范围可在小于 约90℃，约在25℃和约80℃之间，约在30℃和50℃之间，或约35℃。典型的第 二次干燥处理可包括，如把温度升至干燥温度约30℃到55℃，并保持约0.5天到 5天以形成有0.1％到约5％，或约3％残余水分的干燥粉状组合物。本文使用的“干 燥”，“干燥的”和“基本干燥的”包括有约0％到5％的水的组合物。使用Karl Fisher 法测定，粉状基质的水分含量约为0.1％到3％较佳。
得到的产品可以是无定形的固体(见x射线结晶图，图7)，其中玻璃样赋形 剂材料如蔗糖，呈无定形玻璃态并包围生物活性材料，因此基本上限制分子运动 并防止蛋白质伸展。不受任何特定理论限制，本方法已经被假定为通过无定形玻 璃对蛋白质或活性成分机械固定，或通过氢与蛋白质上极性和有电荷的基团结合， 即通过水替换，从而防止干燥引起的变性和抑制另外不希望有的反应或降解反应。 玻璃样基质稳定性理论已经提供了有用但简化的方法描述生物保存的一般现象。 但是，近年来文献中积累的数据已提示在许多情况，对于长期稳定，玻璃态既不 必要也不充分。很重要的是指出造成生物制剂稳定的机理可以是多因素的并且不 限于包围活性成分的粉状基质的无定形特性。借助于本文描述的方法中的稳定性 可涉及许多因素，包括但不限于生物材料的受热过程，蛋白质侧链的构象活动性 和柔性的减少和/或由于包覆产生的自由体积的减少，基质结构刚性的改善，赋形 剂与活性成分相分离的减少，通过选择最佳氢键合给体对水替代程度的改善。后 者是赋形剂对被稳定的蛋白质、核酸、碳水化合物、或脂质的表面的亲和性和亲 合力函数。一般来说，只要固体在玻璃转化温度以下的温度，赋形剂中保留的残 余水分相对低，包含脂质膜的易变化的蛋白质和/或生物活性材料可保持相对稳 定。
以微粒回收生物活性材料
回收本发明粉状微粒使之具有需要的活性和适合施用的预定途径的形式。本发 明粉状微粒可以从处理流中用物理方法回收，如通过在干燥后的沉降或过滤。由 于使用适度的处理条件，本发明方法可提供活性和稳定材料的高回收。本发明方 法可提供，如适合作为高浓度溶液，气雾剂，鼻内沉积微粒，或肺部沉积微粒施 用的微粒。
粉状微粒的物理回收可依赖于，如喷雾干燥设备保留或排出的材料的量，由于 微粒大小选择方法而带来的损失。例如，包含生物活性材料的处理材料可在探测 时损失，和在喷雾干燥设备的表面损失。溶液或微粒可在处理中损失，如当喷雾 小滴的聚集增加并脱离处理流时，或当尺寸过小的小滴干燥成小微粒，而被干燥 气体携带通过第二干燥室带到处理废气流中。本发明的处理产率(输入活性材料 通过处理的回收百分比)范围为，如超过约70％，或约80％到98％，或约90％。
需要的平均大小和大小范围的微粒可，如通过过滤、沉降、冲击吸收、和/或 其他本领域知晓的方法选择。微粒可通过有均一孔大小的一个或多个过滤器对其 筛选来对大小分类。大微粒可通过使它们从微粒悬浮液在液体或气体移动流中来 分离。大微粒也可通过惯性冲击贴到转弯流体流的外侧，而流体流带走较小或不 大致密的微粒。较小微粒可通过液体或气体流移动速度达到使较大微粒沉降而带 走较小微粒来分离。
生物活性材料的回收可受到，如在喷雾干燥过程中的物理损失、细胞破裂、变 性、积聚、破碎、氧化和/或类似情况的影响。该方法中回收的生物活性材料的活 性是物理回收乘回收材料的比活性的乘积。输入活性与回收活性之差有时被称为 “处理损失”。本发明的方法，如通过把更多的生物活性材料转化成符合处理要 求的粉状微粒而减少处理损失。本发明的方法如，通过提供减少剪切应力、减少 干燥时间、降低干燥温度，和/或增加稳定性的喷雾干燥技术，也提供比现有技术 提高的粉状微粒最终产品的比活性(活性生物活性材料/无活性生物活性材料)。 比活性(如，活性蛋白质或存活蛋白质占总病毒或总病毒微粒的比率)可在本发 明的微粒形成过程中保持相对恒定。生物活性制剂的比活性的变化可以，如小于 约2％，小于约10％，小于约30％，小于约50％。
生物活性材料的施用
如果合适，本发明的生物活性材料可施用于如哺乳动物。本发明的生物活性材 料可包括，如肽、多肽、蛋白质、病毒、细菌、抗体、细胞、脂质体，和/或类似 物。该材料可作为治疗剂、营养剂、疫苗、药物、预防剂，和/或类似物，可以如 通过胃肠道吸收、体表涂敷、吸入、和/或注射对患者施用提供益处。
生物活性材料可通过体表涂敷施用于患者。例如，粉状微粒可直接混入药膏、 载体软膏、加压液体、气体推进剂，和/或渗透剂中，涂敷于患者的皮肤。或者， 粉状微粒，如可在应用前与其他成分混合前在水性溶剂中重构。
本发明的生物活性材料可吸入施用。空气动力学直径小于10um的干燥粉状微 粒可被吸入到肺中用于肺部施用。任选地，空气动力学直径约20um，或更大的粉 状微粒可鼻内施用，或施用到上呼吸道，通过惯性冲击粉状微粒从气流中移到患 者的粘膜上。粉状微粒或者可重构成以水性薄雾吸入施用的悬浮液或溶液。
本发明的生物活性材料可注射施用。粉状微粒可使用如一般高压气体喷射直接 施用到患者的皮肤下。更常见的是，粉状微粒可与无菌水性缓冲剂重构用于通过 中空注射器针头注射。该注射可以是，如肌肉内、静脉内、皮下、鞘内、腹膜内 等适合形式。本发明的粉状微粒可重构成适合于剂量和处理要求的生物活性材料 浓度从小于约0.1ng/ml到从小于约1mg/ml到约500mg/ml，或从5mg/ml到约 400mg/ml的溶液或悬浮液。重构的粉状微粒可再被稀释，如用于多次接种，通过 IV注入施用等。
生物活性材料的合适剂量(“治疗有效的量”)会依赖于，例如待治疗的病症， 病症的严重性和疗程，生物活性材料施用是用于预防还是治疗目的，以前的治疗， 患者的临床病史和对生物活性材料的反应，使用的生物活性材料的类型，主治医 师的判断力。生物活性材料可以适当地一次或一系列治疗中施用给患者，并从诊 断起任何时间施用给患者。生物活性材料可以作为单独治疗施用或结合治疗所述 病症有用的的其他药物或治疗施用。
通常建议，生物活性材料施用的治疗有效量的范围约为一次或多次施用在 0.00001(如在活的减毒病毒疫苗的情况)到50mg/kg的患者体重，而不管一次或 多次施用，例如，每日施用一次，使用的蛋白质的通常范围约为小于0.01ng/kg 到20mg/kg，更好0.1mg/kg到15mg/kg。但是，其他剂量范围可以使用。该治 疗的过程可通过常用技术容易监控。
本发明也包括增加干燥生物活性材料储存在升高温度时的“储存期”或储存稳 定性的方法。增加的储存稳定性可以通过用加速老化试验重获生物活性来确定。 本发明方法产生的干燥微粒组合物可储存在任何合适的温度。该组合物储存在约0 ℃到约80℃较佳。该组合物储存在约20℃到约60℃更佳。该组合物储存在室温 最佳。
本发明的组合物
本发明的组合物包括，如用于本发明工艺方法的悬浮液和溶液的制剂，保存在 有多羟基化合物和/或其他赋形剂的基中的质生物活性材料的稳定粉状微粒产品。 该组合物可以是，如适合于用高压气体或用近超临界流体喷雾以形成有改善稳定 性的干燥微粒的悬浮液或溶液(液体进料)。生物活性材料的悬浮液或溶液可以 包含，如多羟基化合物、聚合物，和/或表面活性剂。
用于干燥粉状微粒喷雾的悬浮液或溶液
制备本发明的干燥粉状微粒组合物的制剂可包括，如生物活性材料、聚合物、 氨基酸、多羟基化合物、表面活性剂，和/或缓冲剂。该制剂可以按照本发明的方 法处理以提供用于生物活性材料储存和施用的稳定组合物。例如，本发明的组合 物可以是流感病毒与蔗糖、HES、和聚乙二醇和聚丙二醇的嵌段共聚物(Pluronic) 的水性悬浮液，用于用近超临界二氧化碳喷雾干燥。
本发明的生物活性材料包括，如在存活体系中有可测到的生物活性的材料，用 于分析的生物细胞和分子，用于医疗的生物细胞和分子，用于研究的生物细胞和 分子，和/或类似物。例如，本发明组合物的生物活性材料包括蛋白质、肽、核酸、 细菌、细胞、抗体、酶、血清、疫苗、脂质体、病毒，和/或类似物。
本发明粉状微粒中的生物活性材料可以是，如在粉状微粒干燥时有高纯度和活 性，原因是在制备时使用的剪切应力减低，干燥温度低，和干燥时间短。生物活 性材料在粉状微粒中稳定是由于起始过程的降解低和组合物赋形剂的保护作用。 组合物中生物活性材料可以以高浓度重构而不降解是由于微粒的表面与体积的高 比率及组合物赋形剂提供的溶解增强作用。
喷雾干燥形成的本发明粉状微粒溶液或悬浮液包含，如量的范围约为少于0.1 ng/ml到200mg/ml，少于0.5mg/ml到150mg/ml，10mg/ml到80mg/ml，或50mg/ml 的本发明生物活性材料。本发明干燥粉状微粒中的生物活性材料的量的范围一般 约为，如少于0.01重量％到80重量％，40重量％到60-重量％，或50重量％。 重构组合物中生物活性材料的浓度范围通常约为，如少于0.1ng/ml到500mg/ml， 少于0.5mg/ml到400mg/ml，或1mg/ml。
生物活性材料可包括有脂质膜的复合材料，如有生物活性的，存活的或非存活 的，细胞、病毒、和/或脂质体。例如生物活性材料可包括疫苗、病毒、脂质体、 细菌、血小板和细胞。病毒生物活性剂包括，如流感病毒、副流感病毒、呼吸道 合胞病毒、单纯疱疹病毒、SARS病毒、冠状病毒家族成员、巨细胞病毒、和/或 Epstein-Bar病毒，它们在本发明的悬浮液或溶液中的量的范围约为103 TCID50/ml到1012TCID50/ml，或106TCID50/ml。病毒生物活性材料在悬浮液或 溶液中的量通常约为，少于1重量％；少于0.001重量％更佳；和少于0.0001重量 ％最佳。本发明的干燥粉状微粒组合物可提供的病毒量约为，如101TCID50/g到 不超过1012TCID50/g。干燥粉状微粒组合物可提供的病毒量约为，如101TCID50/g， 102TCID50/g，103TCID50/g，104TCID50/g，105TCID50/g，106TCID50/g，107 TCID50/g，108TCID50/g，109TCID50/g，1010TCID50/g，或1011TCID50/g。
本发明的多羟基化合物可以包括，如各种糖、碳水化合物和醇。例如，多羟基 化合物可包括非还原糖，蔗糖、海藻糖、山梨糖、松三糖、和/或蜜三糖。多羟基 化合物可包括，如甘露糖、麦芽糖、乳糖、阿拉伯糖、木糖、核糖、鼠李糖、半 乳糖和葡萄糖、甘露醇、木糖醇、赤藻醇、苏糖醇、山梨糖醇、甘油、L-葡萄糖 酸盐，和/或类似物。希望制剂是冻-融稳定的，多羟基化合物是在冷冻温度(如， -20℃)不结晶的较佳，因为在冷冻温度下结晶会使制剂中的生物活性材料不稳定。 悬浮液或溶液中使用的多羟基化合物的量的变化取决于生物活性材料的特性、多 羟基化合物的类型和预定的用途。但是，通常，多羟基化合物的最终浓度约为1 -40重量％；约1-20重量％更佳。在较佳实例中，悬浮液或溶液包含约10％蔗糖。
本发明的聚合物可包括，如各种碳水化合物、多肽、线型和支链的亲水分子。 例如，制剂的聚合物可包括氧化淀粉、羧甲基淀粉和羟乙基淀粉(HES)、右旋糖酐、 非重组人类血清白蛋白(HSA)，以及不水解和水解明胶、明胶、卵白蛋白、胶原蛋 白、硫酸软骨素、唾液酸化多糖、肌动蛋白、肌球蛋白、微管、动力蛋白、呋喃 甲基腺嘌呤、藻酸盐，和/或类似物。这些添加剂并不必须单独稳定生物活性材料 抗失活；它们还帮助在初次干燥、冻干、第二次干燥，和/或随后以固体状态储存 期间防止喷雾干燥材料的物理破坏。使用的HES的分子量为约100,000-300,000 较佳；约200,000更佳。通常，HES的浓度可以约为悬浮液或溶液重量的0.5- 10％；约1-5％更佳。较佳的制剂包含约5％的HES。
用于制备本发明组合物的悬浮液或溶液可包括，如有助于制剂成分的溶解性和 稳定性的一种或多种表面活性剂。本发明制剂中的表面活性剂的浓度范围约为 0.001重量％-5重量％，或0.01重量％-1重量％。表面活性剂包括，如非离 子洗涤剂，如聚乙二醇脱水山梨糖醇单月桂酸酯(Tween 20)、聚氧乙烯脱水山梨 糖醇单油酸酯(Tween 80)、和聚乙二醇和聚丙二醇的嵌段共聚物(Pluronic)等等。
合适的非离子表面活性剂的例子是烷基苯基烷氧化物、醇烷氧化物、脂肪胺烷 氧化物、聚氧乙烯甘油脂肪酸酯、蓖麻油烷氧化物、脂肪酸烷氧化物、脂肪酸酰 胺烷氧化物、脂肪酸聚二乙醇酰胺、羊毛脂乙氧基化物、脂肪酸聚二醇酯、异十 三烷醇、脂肪酸酰胺、甲基纤维素、脂肪酸酯、硅油、烷基聚苷、甘油脂肪酸酯、 聚乙二醇、聚丙二醇、聚乙二醇/聚丙二醇嵌段共聚物、聚乙二醇烷基醚、聚丙二 醇烷基醚、聚乙二醇/聚丙二醇醚嵌段共聚物和它们的混合物，聚丙烯酸酯和丙烯 酸接枝共聚物。其他非离子表面活性剂本身是本领域熟练技术人员所熟知的和在 文献中已经被记述的。较佳的物质是聚乙二醇、聚丙二醇、聚乙二醇/聚丙二醇嵌 段共聚物、聚乙二醇烷基醚、聚丙二醇烷基醚、聚乙二醇/聚丙二醇醚嵌段共聚物 和它们的混合物。更佳的表面活性剂包括聚氧乙烯和聚氧丙烯的混合物的聚合物 如Pluronic F68(由BASF提供)。
合适的离子表面活性剂的例子是烷基芳基磺酸盐、苯基磺酸盐、烷基硫酸盐、 烷基磺酸盐、烷基醚硫酸盐、烷基芳基醚硫酸盐、烷基聚二醇醚磷酸盐、聚芳基 苯基醚磷酸盐、烷基磺基琥珀酸盐、烯烃磺酸盐、链烷烃磺酸盐、石油磺酸盐、 氨基乙磺酸盐、肌氨酸盐、脂肪酸、烷基萘磺酸、萘磺酸、木素磺酸、磺化萘与 甲醛的缩合物或磺化萘与甲醛和苯酚的空合物，和如果合适，尿素、木质素-亚硫 酸盐废液，包括它们的碱金属，碱土金属，铵和胺盐，烷基磷酸盐、季铵化合物、 胺氧化物和甜菜碱和它们的混合物。较佳的物质包括Pluronic F68或Pluronic F188，聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯(即，Tween 20，由Sigma提供)的更佳。
氨基酸赋形剂可以存在，如增加稳定性，控制pH，影响重构速度，作为填充 剂，清除氧化性分子等。合适的氨基酸例子是精氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、组氨 酸、氨基乙酸、谷氨酸，和/或类似物。
缓冲剂在用于制备干燥粉状组合物的制剂中可以存在，如控制pH，增加稳定 性，影响成分溶解性，提供施用时的舒适性等，制剂pH可控制在约pH 3到约pH 10，约pH 6到约pH 8，或约pH 7.2的范围。较佳的缓冲剂常常是通常被认为对 生物活性材料施用的具体途径是安全的成对酸和缓冲阴离子的盐形式。用于本发 明的制剂和组合物的典型缓冲剂包括，如氨基酸、磷酸钾、磷酸钠、醋酸钠、柠 檬酸钠、琥珀酸钠、碳酸氢铵、碳酸盐等。通常，缓冲剂使用的摩尔浓度约为1mM 到2M，2mM到约1M较佳，和10mM到0.5M更佳，和25到50mM最佳。
有流感病毒的悬浮液制剂的例子包括以下内容。流感病毒在具有10％蔗糖，5％ 羟乙基淀粉(Fesnius)，2mM甲硫氨酸，50mM KH2PO4缓冲剂(pH 7.2)，和 0.1％Pluronic F-68的水性悬浮液中。流感病毒在具有10％蔗糖，5％羟乙基淀粉， 75mM KH2PO4缓冲剂(pH 7.2)，2mM甲硫氨酸，和0.01％Pluronic F-68的水性 悬浮液中。流感病毒在具有5％蔗糖，2％海藻糖，0.2％Pluronic-F-68，10mM甲硫氨 酸，2％精氨酸，2mM EDTA，和50mM KH2PO4缓冲剂(pH 7.2)的水性悬浮液中。
在一个实例中，制剂包含上述确认的试剂(即，生物活性材料，多羟基化合物， 表面活性剂和明胶)并基本上没有一种或多种防腐剂，如苄醇、苯酚、间甲酚、 氯丁醇和benethonium chloride。在另一个实例中，制剂中可包括防腐剂，特别 当该制剂是多剂量制剂时。
一种或多种药物上可接受的载体、赋形剂、或稳定剂如Remington’s Pharmaceutical Science 16th Edition，Osol，A.Ed(1980)所描述的可包含在制 剂中，只要它们不对制剂所需的特性有不利影响。可接受的载体、赋形剂、或稳 定剂在使用的剂量和浓度对接受者是无毒的并包括：另外的缓冲剂；助溶剂；成 盐抗衡离子如钾和钠；抗氧化剂，如甲硫氨酸，N-乙酰半胱氨酸，或抗坏血酸； 螯合剂如EDTA或EGTA。氨基酸，如精氨酸和甲硫氨酸，可包含在制剂中。制剂 中存在的精氨酸的量的范围可约为0.1重量％到5重量％。制剂中存在的甲硫氨 酸的浓度范围可约为1mM到50mM或10mM。制剂中存在的甘油的浓度范围可约为 0.1重量％到5重量％，或1重量％。制剂中存在的EDTA的浓度范围可约为1mM 到10mM，或5mM。
本发明包括包含容器的制造制品，该容器容纳通过喷雾干燥加压气体或近超临 界气体与生物活性材料、多羟基化合物、聚合物添加剂和表面活性剂的悬浮液或 溶液组成的混合物制备的干燥粉状微粒。在本发明的一个实例中，提供了含有容 纳本发明药物制剂的容器的制造制品并任选地提供了使用说明。例如，合适的容 器包括瓶、小瓶、泡罩包装物和注射器。该容器可以由各种材料如玻璃或塑料制 成。容器的例子是3-20cc一次使用的玻璃小瓶。或者，对于多剂量制剂，容器 可以是3-100cc的玻璃小瓶。容器容纳制剂，在容器上的或与容器有关的标签可 指示使用说明。制造制品还可包含从商业上和使用者观点上需要的其他材料，包 括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针头、注射器和带有使用说明的包装插入物。
本文描述的粉状微粒是稳定的，即，它们保留了生物活性和并且化学和/或物 理上是稳定的。通过把粉状微粒在升高的温度(如，37℃)中进行老化测试并测 试它们的生物活性、化学和/或物理稳定性来测试粉状微粒稳定性。这些研究的结 果显示使用本发明方法在55℃干燥的这些微粒在25℃中至少九个月是稳定的(见 图8)。在35℃干燥的微粒在25℃中至少约13个月是稳定的，在4℃中2年或更 长时间是稳定的。甚至使用高浓度的生物活性材料时该粉状微粒也是稳定的。因 此，这些干燥微粒是有益的，因为它们可在室温或室温以上的温度中长时间运输 盐和储存。
本发明的设备
本发明的设备可包括，如容纳悬浮液或溶液的容器(第一室)；容纳高压气体 和/或近超临界流体的压力容器(第二室)；有控制从第一和第二室到混合室的流 量的控制阀的管道；有毛细管限流器的喷嘴，混合物可经该喷嘴喷到微粒形成容 器中；和对来自微粒形成容器的微粒提供初次和/或第二次干燥的干燥气流。第二 次微粒干燥可包括，如在真空中沉降到温暖的表面，冻干冷冻的微粒，悬浮在干 燥气体旋涡中，和/或悬浮在干燥气体流化床中。
例如，如图9所示，设备可包括如引导小滴薄雾进入喷雾干燥器的喷雾喷嘴。 在第一室30内的病毒悬浮液可用HPLC泵31通过第一管道32泵送到T交叉点并 泵入喷嘴34的混合室33。在第二室的加压气体或近超临界CO2流体可用能够提供 选择压力(如，约250-15000psi)的高压泵36经过第二管道37泵送到T交叉 点与混合室中的悬浮液混合。混合物可经过毛细管限流器38从混合室喷出以形成 细小滴的喷雾，该细小滴在微粒形成蒸气室39中干燥成微粒。由风扇40驱动的 干燥气体，可替代来自喷雾的气体和溶剂以提供对微粒的初次干燥，同时如携带 微粒到第二干燥室41。来自微粒形成室的初次干燥的微粒在沉降到微粒收集容器 42的前后可通过接触干燥气体经历第二次干燥。使喷嘴可适应与各种喷雾干燥器 一起操作并可改变比例以调节最高每小时数升的喷雾处理。设备的喷雾干燥器组 件可从，如由Buchi(Brinkmann Instruments)生产的实验室台式喷雾干燥器改 装。
设备的某些室和容器可有许多官能或可选择的功能以实施本发明的方法。例 如，在某些实例，微粒形成容器也可以作为第二干燥室，和/或微粒收集室。任选 地，第二干燥室可包含旋涡室，流化床室，微粒按分开室，聚合物涂覆室，和/ 或微粒收集室。
液体和气体
本发明的设备可有容纳和传送高压气体或近超临界流体，和悬浮液或溶液到混 合室的室和管道。喷雾小滴，如通过接触干燥气体，可经历初次和第二次干燥。
高压气体和/或近超临界流体可以是上文的方法部分和组合物部分所描述的， 如氮、二氧化碳、六氟化硫、氯氟烃、氟碳化合物、一氧化二氮、氙、丙烷、正 戊烷、乙醇、氮、水，和/或类似物。调节剂，如某些醇可溶解在超临界流体中以 调整溶剂，流体的临界点和/或膨胀特性。
悬浮液或溶液可包括生物活性材料和多羟基化合物。生物活性材料的例子包括 蛋白质、肽、核酸、细菌、细胞、抗体、酶、血清、疫苗、脂质体和病毒。设备 的悬浮液或溶液中多羟基化合物包括，如海藻糖、蔗糖、山梨糖、松三糖、甘油、 果糖、甘露糖、麦芽糖、乳糖、阿拉伯糖、木糖、核糖、鼠李糖、Palactose、葡 萄糖、甘露醇、木糖醇、赤藻醇、苏糖醇、山梨糖醇、和蜜三糖。
设备的悬浮液或溶液中可包括添加的赋形剂，如聚合物和表面活性剂。聚合物 可以是，如淀粉、淀粉衍生物、羧甲基淀粉、羟乙基淀粉(HES)、右旋糖酐、人类 血清白蛋白(HSA)、和/或明胶。表面活性剂可以是，如聚乙二醇脱水山梨糖醇单 月桂酸酯、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯、聚乙二醇和/或聚丙二醇的嵌段共聚 物。
设备硬件
本发明的设备可包括，如容纳悬浮液或溶液的第一室，容纳高压气体和/或近 超临界流体的第二室，有混合室的喷嘴和有出口孔的毛细管限流器，微粒形成室， 和第二干燥室。悬浮液或溶液可在压力下通过第一管道泵送入混合室与通过第二 管道泵送入混合室的近超临界流体混合。该混合物可从喷嘴以薄雾喷入微粒形成 室，在微粒形成室与干燥气流接触开始干燥。第二次干燥可通过接触温热的室壁 和/或在微粒形成容器和/或第二干燥室中与干燥气流接触来进行。
在较佳实例中，微粒形成容器和/或第二干燥室被置于环境控制室内。环境控 制室的受控湿度和温度可以是干燥气体的来源。从环境控制室进入微粒形成室内 的气体可与毛细管限流器射出的成为细雾的小滴混合。细雾在用干燥气流传送到 第二干燥室，如旋风旋涡室之前在微粒形成容器内可以被部分干燥(即，从小滴 干燥成微粒)。干燥气流可持续从气体出口回到环境控制室，在该室气体被再调 节。设备可进一步包括从气体和/或环境控制室内除去水分的干燥剂或冷凝器系 统。热交换器可用于控制再循环气体的温度和防止环境控制室内的温度过分增高。 通常，该室是通过从液氮储器引入液氮来冷却，液氮储器通过任选的温度控制器 来控制，该温度控制器可自动计量液氮以提供环境控制室内相对不变的温度。任 选地，环境控制室可通过致冷热交换器(蒸发器)来冷却。环境控制室通常可通 过用阀控或压力控制的压力控制口排空到环境室压力。喷雾干燥到降低水分控制 气体中可提供喷雾小滴与干燥室环境之间的大的水分差别。其作用是可减少初次 干燥状态的输入热要求。
第一和第二室可加压，和/或在管道中可使用泵，以将高压气体和/或近超临界 流体，和/或悬浮液或溶液传送到混合室。传送速度可使用本领域中通常使用的方 式来控制，如控制泵的速度或控制管道中的阀。泵可以是本领域知晓的任何类型， 如蠕动泵、旋转泵、隔膜泵、活塞泵等。阀可以是本领域知晓的可限制加压流体 流量的任何合适类型，包括，如球和阀座、隔膜、针。通常，第二容器是加压、 致冷和/或隔热以保持加压气体或流体处于接近临界条件。
混合室可为，如在管道流入口和毛细管限流器出口孔之间扩大的空间。管道通 常用来使加压气体和/或近超临界流体和悬浮液或溶液相互注入对方中，以增强混 合。管道可在T交叉点交汇，流体在此迎头相遇，或在交叉点处流体以小于180 度交汇，如第一管道和/或第二管道以与混合室中流体轴小于90度的角度引导流 体。流体可以不直接汇合，如有偏移，产生涡流、旋涡或湍流，由于这可以促进 更彻底的混合和产生更多单分散性的气-液乳液，这些是本领域熟练技术人员知晓 的。室的主体可有长的长径比以增加超临界流体与悬浮液或溶液之间的接触表面。 混合室可有通道结构，包括挡板、珠、通道、障碍物、缩颈，和/或类似物，以增 强高压气体和/或近超临界流体和悬浮液或溶液的混合。混合室可以是内径超过毛 细管限流器内径的管道。混合室可以是喷嘴的一部分，或设备的单独组件。
毛细管限流器可以是，如对流体流提供限制的管道以帮助在混合室中维持高压 或接近超临界的条件。毛细管限流器可以有，如高压气体/近超临界流体和悬浮液 或溶液的混合物可被喷出的出口孔。毛细管限流器内径和出口孔的大小可影响喷 雾中产生的小滴的大小；由较大出口喷雾通常形成较大的小滴(最终是微粒)。 通常，毛细管限流器的长度约为2英寸到6英寸，内径和/或出口直径约为50um 或更少，到1000um，50um到500um，或100um。
混合物从喷嘴喷出到微粒形成室，在该室混合物膨胀成气体和碎裂的流体进料 小滴。干燥气体可通入微粒形成室以替代小滴中的混合物气体(膨胀气体和蒸发 的溶剂)。干燥气体可接触小滴以从中蒸发另外的溶剂形成微粒。干燥气体可携 带小滴和/或微粒到其他室用于按本发明的方法处理。例如，初次干燥微粒可在微 粒形成室中悬浮于干燥气流中，或被带到分离室中进行第二次干燥、按大小、涂 覆、和/或收集。干燥气体可以是，如在粉状微粒的玻璃转化温度以下的温度的惰 性气体，如氮气。设备可包括控制干燥气体温度，如低于约90℃，约在25℃到80 ℃，约在30℃到50℃，或约35℃，的热交换器。在本发明方法中较佳的干燥气 体(进入气体)温度是低于65℃，或约在30℃和55℃之间，或约35℃。设备可 包括降低干燥气体的相对湿度、溶剂含量，的冷凝器或干燥器，所以气体可被再 循环或送入废气中而会危害环境。
微粒形成室或第二干燥容器可适合于设置旋风旋涡室。干燥气流携带的微粒可 以，如通过偏置口从一端进入长的圆柱或圆锥室。该气体可从室的入口末端到出 口末端的螺旋路径上旋转许多次。该路径在微粒持续失去残余水分的同时从气体 和室壁上接受温热的情况下可花费许多时间。
微粒形成容器或第二干燥容器可适合于设置流化床室。悬浮于干燥气流中的微 粒可被传送到圆柱形室的底部的进口，在那里它们可悬浮于干燥气体的上升气流 中。任选地，在来自底部的干燥气体将微粒悬浮在流化床中之前可在室底部收集 微粒。微粒在残余水分持续失去的同时，可以流化床形式保持悬浮相当长时间。 在流化床室可发生分离大小，小微粒在废气中从室顶部排出而损失，大微粒沉降 到底部。如通过喷出聚合物溶液薄雾到流化床中，在微粒上干燥为涂层，可将聚 合物涂层可包覆微粒。
微粒形成室，或第二干燥容器，可被适合于设置收集干燥粉状微粒的收集容器。 例如，在传送管道中流动的悬浮于气体的微粒可被引直径明显大于传送管道的的 室中。气体的速度在较大室内可减慢以使微粒落到室底而气体排入上部废气。微 粒可积聚在室底部的可移动容器中，在那里微粒可被加嘏以供使用、包装或储存。
本发明包括含有便于本发明方法实施的设备部件和加工材料的成套装备。本发 明的成套装备可以是含有本发明设备部件的容器，如加压气体或近超临界流体的 容器，悬浮液或溶液成分(如生物活性材料或多羟基化合物、聚合物、氨基酸、 表面活性剂、和/或缓冲剂的加工溶液)，喷嘴，收集容器，和/或类似物，以用 于实施本发明干燥微粒组合物的制备方法。该成套装备可以是基本上可消毒的， 如由可耐受高压灭菌器中的温度和湿度，耐受电离辐射，和/或耐受微波炉产生的 辐射的材料制成。本发明的成套装备可包括指导使用本发明的设备、设备部件、 和/或加工材料以制备生物活性材料的干燥微粒的说明材料。
实施例
下列实施例是提供说明，而不是对提出权利要求的本发明进行限制。
实施例1
用于流感悬浮液喷雾的制剂
下文所述制剂是按照本发明方法使用B/Harbin流感病毒或安慰剂制备的。PH 用氢氧化钠或氢氧化钾调节。用于喷雾干燥减毒流感病毒的有用制剂可包括，如 约10％到20％的海藻糖，约40％到约5％的蔗糖，约1％山梨糖醇，约5％到2％的HES， 约2％的卵白蛋白，约5％到2％明胶，约1％PVP，约2％到约0.01％Pluronic F68，约 0.03％Tween20，约10mM到2mM的甲硫氨酸，约5％到约0.5％的精氨酸，约23mM EDTA， 约0.5％到约0.05％的甘油，约10％到约1％谷氨酸盐，和/或约10mM N-乙酰半胱氨 酸。
多羟基化 合物 聚合物 添加剂 表面活性剂 其他 AV020 5％海藻糖 5％HES 0.01％ Pluronic F68 75mM，pH7.2KPO4缓冲剂， 2mM甲硫氨酸 AV021 5％海藻糖 5％HES 0.03％ Tween20 75mM，pH7.2KPO4缓冲剂， 2mM甲硫氨酸 AV022 5％海藻糖 5％HES 0.05％ Pluronic F68 75mM，pH7.2KPO4缓冲剂， 2mM甲硫氨酸 AV023a 10％蔗糖 5％HES 0.01％ Pluronic F68 75mM，pH7.2KPO4缓冲剂， 10mM N-乙酰半胱氨酸 AV023 10％蔗糖 5％HES 0.01％ Pluronic F68 75mM，pH7.2KPO4缓冲剂， 2mM甲硫氨酸，2mM EDTA，0.5％ 精氨酸 AV024 10％蔗糖 5％HES 0.01％ Pluronic F68 75mM，pH7.2KPO4缓冲剂， 2mM甲硫氨酸，1％PVP，0.5％ 精氨酸 AV025 5％蔗糖； 2％海藻糖 -- 0.05％ Pluronic F68 50mM，pH7.2KPO4缓冲剂， 2mM EDTA， 2％精氨酸 AV026 5％蔗糖； 2％海藻糖 2％HES 0.05％ Pluronic F68 50mM，pH7.2KPO4缓冲剂， 2mM EDTA， 2％精氨酸 AV027 5％蔗糖； 2％海藻糖 -- 0.05％ Pluronic F68 50mM，pH7.2KPO4缓冲剂， 10mM甲硫氨酸，2mM EDTA，2％ 精氨酸 AV028 5％蔗糖； 2％海藻糖 2％HES 0.05％ Pluronic F68 50mM，pH7.2KPO4缓冲剂， 10mM甲硫氨酸，2mM EDTA，2％ 精氨酸
AV029 5％蔗糖； 2％海藻糖 -- 0.05％ Pluronic F68 50mM，pH6.8KPO4缓冲剂， 10mM甲硫氨酸，2mM EDTA，2％ 精氨酸 AV030 5％蔗糖； 2％海藻糖 2％HES 0.05％ Pluronic F68 50mM，pH7.2KPO4缓冲剂， 10mM甲硫氨酸，2mM EDTA，2％ 精氨酸 AV031 2％海藻糖 2％HES 0.05％ Pluronic F68 50mM，pH7.2KPO4缓冲剂， 2mMEDTA，0.2％硫代硫酸钠， 2％精氨酸 AV032 5％蔗糖； 2％海藻糖 2％HES 0.05％ Pluronic F68 50mM，pH7.2KPO4缓冲剂， 10mM甲硫氨酸，2mM EDTA，2％ 精氨酸 AV033 5％蔗糖； 2％海藻糖 0.05％ Pluronic F68 50mM，pH7.2KPO4缓冲剂， 10mM甲硫氨酸，2mM EDTA，2％ 精氨酸 AV034 5％蔗糖； 2％海藻糖 2％HES 50mM，pH7.2KPO4缓冲剂， 10mM甲硫氨酸，2mM EDTA，2％ 精氨酸 AV035 10％蔗糖； 10％海藻 糖 100mM，pH7.2KPO4缓冲剂， 5mM TMAO， AV036 10％蔗糖； 10％海藻 糖 100mM，pH7.2KPO4缓冲剂， 5mM TMAO， 0.5％甘油 AV037 10％蔗糖； 10％海藻 糖 100mM，pH7.2KPO4缓冲剂， 5mM TMAO， 0.5％甘油
AV038 10％蔗糖； 10％海藻 糖 100mM，pH7.2KPO4缓冲剂， 10mM N-乙酰半胱氨酸，0.5％ 甘油 AV039 5％蔗糖； 2％海藻糖 2％卵白 蛋白 0.05％ Pluronic F68 50mM，pH7.2KPO4缓冲剂， 10mM甲硫氨酸，10mM N-乙酰 半胱氨酸，2mM EDTA，2％精氨 酸 AV040 5％蔗糖； 2％海藻糖 2％卵白 蛋白 0.05％ Pluronic F68 50mM，pH7.2KPO4缓冲剂， 10mM甲硫氨酸，2mM EDTA，2％ 精氨酸 AV041 5％蔗糖； 2％海藻糖 2％明胶 (K&K) 0.05％ Pluronic F68 50mM，pH7.2KPO4缓冲剂， 10mM甲硫氨酸，2mM EDTA，2％ 精氨酸 AV042 5％蔗糖； 2％海藻糖 0.05％ Pluronic F68 50mM，pH7.2KPO4缓冲剂， 10mM甲硫氨酸，5mM TMAO； AV043 5％蔗糖； 2％海藻糖 2％ Pluronic F68 50mM，pH7.2KPO4缓冲剂， 10mM甲硫氨酸，2mM EDTA，2％ 精氨酸 AV044 5％蔗糖； 2％海藻糖 0.05％ Pluronic F68 50mM，pH7.2KPO4缓冲剂， 2mM EDTA，2％精氨酸；1％L-谷 氨酸盐 AV045 5％蔗糖； 2％海藻糖 0.1％ Pluronic F68 100mM，pH7.2KPO4缓冲剂， 10mM N-乙酰半胱氨酸，2mM EDTA， 2％精氨酸 AV046 5％蔗糖； 2％海藻糖 0.1％ Pluronic F68 100mM，pH7.2KPO4缓冲剂， 10mM N-乙酰半胱氨酸，5mM TMAO；2mM EDTA，2％精氨酸； 0.05％甘油
AV047 5％蔗糖； 2％海藻糖 0.2％ Pluronic F68 50mM，pH7.2KPO4缓冲剂， 10mM甲硫氨酸，2mM EDTA，2％ 精氨酸 AV048 5％蔗糖； 2％海藻糖 0.05％ Pluronic F68 50mM，pH7.2KPO4缓冲剂， 10mM甲硫氨酸，2mM EDTA，2％ 精氨酸 AV049 5％蔗糖； 2％海藻糖 0.05％ Pluronic F68 50mM，pH7.2KPO4缓冲剂， 10mM甲硫氨酸，2mM EDTA，2％ 精氨酸 AV050 5％蔗糖； 2％海藻糖 0.05％ Pluronic F68 50mM，pH7.2KPO4缓冲剂， 10mM甲硫氨酸，2mM EDTA，2％ 精氨酸 AV051 5％蔗糖； 2％海藻糖 0.05％ Pluronic F68 50mM，pH7.2KPO4缓冲剂， 10mM甲硫氨酸，2mM EDTA，2％ 精氨酸 AV052 5％蔗糖； 2％海藻糖 0.05％ Pluronic F68 50mM，pH7.2KPO4缓冲剂， 10mM甲硫氨酸，2mM EDTA，2％ 精氨酸 AV053 5％蔗糖； 2％海藻糖 50mM，pH7.2KPO4缓冲剂， 10mM甲硫氨酸，2mM EDTA，2％ 精氨酸 AV054 5％蔗糖； 2％海藻糖 2％HES 0.05％ Pluronic F68 50mM，pH7.2KPO4缓冲剂， 10mM甲硫氨酸，2mM EDTA，2％ 精氨酸 AV055 5％蔗糖； 2％海藻糖 0.05％ Pluronic F68 50mM，pH7.2KPO4缓冲剂， 10mM甲硫氨酸，2mM EDTA， AV056 5％蔗糖； 2％海藻糖 0.05％ Pluronic F68 50mM，pH7.2KPO4缓冲剂， 10mM甲硫氨酸，2％精氨酸
AV057 5％蔗糖； 2％海藻糖 50mM，pH7.2KPO4缓冲剂， 10mM甲硫氨酸，2mM EDTA，2％ 精氨酸 AV058 2％海藻糖 0.05％ Pluronic F68 50mM，pH7.2KPO4缓冲剂， 10mM甲硫氨酸，2mM EDTA，2％ 精氨酸 AV059 5％蔗糖； 0.05％ Pluronic F68 50mM，pH7.2KPO4缓冲剂， 10mM甲硫氨酸，2mM EDTA，2％ 精氨酸 AV060 5％蔗糖； 2％海藻糖 0.05％ Pluronic F68 50mM，pH7.2KPO4缓冲剂， 2mM EDTA， 2％精氨酸 AV061 5％蔗糖； 2％海藻糖 0.05％ Pluronic F68 50mM，pH7.2KPO4缓冲剂， 10mM甲硫氨酸，2mM EDTA，2％ 精氨酸 AV062 6％蔗糖； 1％山梨糖 醇 0.05％ Pluronic F68 50mM，pH7.2KPO4缓冲剂， 10mM甲硫氨酸，2mM EDTA，2％ 精氨酸 AV063 7％蔗糖； 0.05％ Pluronic F68 50mM，pH7.2KPO4缓冲剂， 10mM甲硫氨酸，2％精氨酸 AV064 6％蔗糖； 1％山梨糖 醇 0.05％ Pluronic F68 50mM，pH7.2KPO4缓冲剂， 10mM甲硫氨酸，2mM EDTA，2％ 精氨酸 AV065 10％蔗糖； 2％海藻糖 5％HES 0.2％ Pluronic F68 50mM，pH7.2KPO4缓冲剂， 10mM甲硫氨酸，2mM EDTA，2％ 精氨酸 AV066 5％蔗糖； 2％海藻糖 2％HES 50mM，pH7.2KPO4缓冲剂， 2％精氨酸
AV067 10％蔗糖； 2％HES 50mM，pH7.2KPO4缓冲剂， 5％精氨酸 AV068 10％蔗糖； 2％HES 50mM，pH7.2KPO4缓冲剂， 1mM ZnCl2； 5％精氨酸 AV070 40％蔗糖； 5％明胶 (K&K) 0.02％ Pluronic F68 25mM，pH7.2KPO4缓冲剂， 10mM甲硫氨酸； 10％L-谷氨酸盐 AV071 40％蔗糖； 5％明胶 (K&K) 0.02％ Pluronic F68 25mM，pH7.2KPO4缓冲剂， 10mM甲硫氨酸； AV047 W/HES 5％蔗糖； 2％海藻糖 2％HES 0.02％ Pluronic F68 50mM，pH7.2KPO4缓冲剂， 10mM甲硫氨酸，2mM EDTA；2％ 精氨酸 AV069 10％蔗糖； 2％HES 50mM，pH7.2KPO4缓冲剂， 1mM ZnCl2； 5％精氨酸 AV047- P 5％蔗糖； 2％海藻糖 0.02％ Pluronic F68 50mM，pH7.2柠檬酸盐缓冲 剂，10mM甲硫氨酸，2mM EDTA； 2％精氨酸 AV047 柠檬酸 盐 5％蔗糖； 2％海藻糖 0.02％ Pluronic F68 50mM，pH7.2柠檬酸盐缓冲 剂，10mM甲硫氨酸，2mM EDTA； 2％精氨酸
可以理解本文描述的实施例和实例只用于说明，本领域熟练技术人员可提出其 有关的各种改进和变化是包括在本申请的范围和所附的权利要求书的范围内的。
上述发明已被详细描述用于阐述和理解，本领域熟练技术人员通过阅读本文公 开内容可清楚知晓在不脱离本发明真正范围下可进行形式和细节上的各种改变。 例如，上述制剂、技术和设备可以各种组合使用。本申请引用的所有文献、专利、 专利申请，和/或其他文件被全文引入作为参考，就象每一份文献、专利、专利申 请，和/或其他文件被单独引入作为参考。
相关申请的交叉参考
本发明申请涉及由Vu Truong-Le在2002年4月11日提交的美国临时申请 60/372,192，“使用超临界流体喷雾干燥治疗剂的方法”(“Method of Spray-Drying Therapeutic Agents Using Supercritical Fluids”)，和由Vu Truong-Le在2003 年2月14日提交的美国临时申请60/447,683，“喷雾干燥保存生物活性材料” (“Preservation of Bioactive Materials by Spray Drying”)。在先申请的 全文公开内容被本文引用作为参考。
在冷冻干燥(冷冻干燥)处理，生物材料常与保护制剂混合成溶液或悬浮液， 冷冻，和通过升华脱水，并第二次干燥。冷冻的低温和升华干燥可延缓降解反应 的动力学但是它们也会降低保护制剂穿透某些生物材料的能力。而且，涉及冷冻 干燥的低温和表面积对体积的低比率会需要长的干燥时间。
冷冻干燥和第二次干燥处理会使得蛋白质或细胞，例如，产生明显的化学和物 理变化。该变化可由于盐的浓度、沉淀/结晶、剪切应力、极端pH、经冷冻干燥 的残余水分导致蛋白质活性的损失。冷冻干燥会使冰结晶刺穿细胞和无法保护内 部隔间。
通过研磨或冻干块或喷雾干燥制成粉状微粒对生物医药工业保存生物活性材 料是十分重要的和感兴趣的。这种细微粒不仅可以对生物材料如蛋白质、非蛋白 质生物分子(包括例如DNA，RNA，脂质和碳水化合物)提供适宜的储存形式，而 且可以被基本上脱水以长期储存，并在储存后可以将其再湿润以施用生物材料用 于其预定的用途。而且，该干燥细微粒可以在控制的直径范围生产并可以干燥的 气雾粉剂，例如，通过鼻内途径施用，其中患者的鼻粘膜可对生物材料再湿润和 溶解。使用该包含生物材料的细和微细微粒的许多其他应用可用于药物、生物制 剂和特别是活病毒疫苗领域中。因此，开发形成包含生物活性材料的细微粒的方 法是有利的。
喷雾干燥是长期使用的熟知的方法，如在食品加工工业中制备粉末。例如，液 体产品，如牛奶，是通过喷嘴喷到热气流中来制备粉末的。在喷雾中增加的暴露 表面积，结合干燥气体的高温，可从液体产品中快速移除水。但是，该处理条件 常不适合敏感的生物材料，因为在高温中失去水合水可产生剪切应力、热应力、 氧化应力和构象改变。其中一些问题用药物喷雾干燥方法解决，如Wilson的美国 专利5,902,844，“喷雾干燥含氨基酸基材料的药物制剂”(Spray Drying of Pharmaceutical Formulations Containing Amino Acid-Based Materials)。 在该专利中，肽与水溶性聚合物的溶液被喷到干燥气流中形成药物组合物。聚合 物的存在可通过涂覆肽抵抗化学影响和通过替代在干燥中失去的水合水来保护肽 免受降解。但是，某些敏感的肽和其他生物材料，如核酸、细菌、细胞、抗体、 酶、血清、疫苗、脂质体和病毒仍然会被Wilson等所述的处理中的热量、剪切应 力和脱水所损害。
较大和较复杂的生物制剂，如活病毒和细菌疫苗，被完全认为是最不稳定的产 品。例如，封装的病毒如活的从卵尿囊液中制备的流感病毒在冷藏温度，即约4 ℃，在储存少于2至3周时释放一个log的效价，该效价由组织培养感染量(TCID50) 定义。在室温条件下(约25℃)，该病毒可在几天内释放该效价。
仍然需要保存敏感的生物材料，如储存的蛋白质和活病毒，特别是在冷冻以上 温度下保存的方法。需要适合具体生物材料敏感性的使用快速低温干燥处理制备 干燥粉状微粒的方法。而且，喷雾干燥处理不需要暴露于有机助溶剂，这可减少 敏感生物结构的变性。可以在储存中保护该生物制剂的组合物可在医药和科学研 究中通提供益处。在看了下文的描述后，本发明的这些特性和其他特性将会显而 易见。
发明概述
本发明包括在储存时保存生物活性材料的方法、设备和组合物。本发明提供， 如用高压气体和/或近超临界流体的混合物喷雾，和可对敏感生物活性材料可减少 剪切应力和温度应力形成细干燥粉状微粒的条件下喷雾干燥。
本发明的方法通常包括，如把悬浮液或溶液中的生物活性材料与高压气体或喷 雾近超临界气体混合以在比普通喷雾或雾化技术更低温度和更低剪切应力的条件 下形成细微粒。喷雾中细小滴可以例如更快地，而且在比普通技术更低的温度下 干燥。本发明的方法可提供，如能产生超细的小滴大小，导致小滴表面积与体积 比率增加，使单位给定热量输入下的蒸发效率增高。本发明中制备粉状微粒的方 法可包括，例如，制备生物活性材料和多羟基化合物的水性悬浮液和溶液，制成 溶液或悬浮液与加压气体或近超临界流体的混合物，通过对该混合物减压来喷雾 超精细小滴，和通过喷雾气体与干燥气体之间的交换，如通过喷雾到喷雾干燥设 备的干燥室中，把小滴干燥成粉状微粒。
用于本发明方法中的混合物和喷雾的悬浮液或溶液中的生物活性材料可以是， 如蛋白质、肽、核酸、细菌、细胞、抗体、酶、血清、疫苗、脂质体、病毒和/ 或类似物。用于本发明方法的生物活性材料悬浮液的病毒可包括，如流感病毒、 副流感病毒、呼吸道合胞病毒、单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、SARS病毒、冠状病 毒家族成员、人类肺炎后病毒和Epstein-Bar病毒。
用于本发明方法中的混合和喷雾的悬浮液或溶液中多羟基化合物可以是，如海 藻糖、蔗糖、山梨糖、松三糖、甘油、果糖、甘露糖、麦芽糖、乳糖、阿拉伯糖、 木糖、核糖、鼠李糖、palactose、葡萄糖、甘露醇、木糖醇、赤藻醇、苏糖醇、 山梨糖醇和蜜三糖。悬浮液或溶液也可包含，如聚合物，如淀粉、淀粉衍生物、 羧甲基淀粉、羟乙基淀粉(HES)、右旋糖酐、人类血清白蛋白(HSA)和明胶，以提 供对微粒的生物活性材料和结构的保护。表面活性剂，例如，聚乙二醇脱水山梨 糖醇单月桂酸酯、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯、或聚乙二醇和聚丙二醇的嵌 段共聚物，可加到悬浮液或溶液中增加悬浮液或溶液成分的溶解性，和/或增加本 发明的粉状微粒的重构和稳定性。氨基酸添加剂如精氨酸、赖氨酸、氨基乙酸、 甲硫氨酸、谷氨酸、组氨酸等，可以是有用的稳定剂。
本发明的悬浮液或溶液可在喷雾前与加压气体或近超临界条件的气体混合。本 发明中的高压气体可以是，如氮、二氧化碳、氧气、丙烷、一氧化二氮、氦、氢 和/或类似物，压力范围约在为，每平方英寸100磅(psi)到15,000psi，或1000 psi。近超临界是指，如压力范围在流体的临界压力和/或温度的约90％到110％。 其中近超临界流体是二氧化碳，典型的压力可约为1200psi。本发明方法中近超 临界流体可以是，如二氧化碳，六氟化硫、氯氟烃、氟碳化合物、一氧化二氮、 氙、丙烷、正戊烷、乙醇、氮、水，和/或类似物。高压气体或近超临界流体在与 悬浮液或溶液混合前的温度范围常约为0℃到60℃。调节剂，如甲醇、乙醇、异 丙醇或丙酮可加入气体或近超临界流体中，以影响流体的物理特性和/或影响悬浮 液或溶液初次干燥。
高压气体或接近超临界气体在混合物中与溶液或悬浮液接触可提供，如某种溶 剂化或乳化作用效果。例如，气体的溶液，或液相的气体，在该气体以某种明显 程度溶解在悬浮液或溶液中时可在悬浮液或溶液中形成。任选地，如溶液或悬浮 液可在某种程度上溶解在液相近超临界气体中。在另一方面，如悬浮液或溶液可 在高压气体或近临界气体中乳化，或高压气体或近临界气体可在悬浮液或溶液中 乳化。对该溶剂化或乳化作用效果的控制可以通过调节混合物温度、在混合室中 的停留时间、溶液或悬浮液与高压气体或接近超临界气体的相对比例、流速、压 力、溶液或悬浮液成分、另外加入的溶剂等等来达到。
形成高压气体和/或近超临界流体与悬浮液或溶液的混合物可在，如有T接头 的喷嘴、混合室和/或毛细管限流器中进行。形成混合物需要使溶液或悬浮液与压 力气体或近超临界流体流动通过混合室。该混合室可有在流动混合物中产生旋涡 或湍流以增加混合效率的通道结构。混合物通过喷嘴并从毛细管限流器的喷雾出 口孔喷出可减少混合物的压力(膨胀)气体中形成小滴的悬浮液。该毛细管限流 器可有小于混合室的内径；该内径通常小于约1000um，范围约为50um到500um，或 约100um。
可调节各种参数以改变小滴的平均大小。小滴的大小可以通过调节近超临界流 体压力或高压气体的压力，调节悬浮液或溶液压力，调节悬浮液或溶液的流速， 选择喷嘴管道内径，调节干燥气体的温度，调节微粒形成容器内的压力，改变悬 浮液或溶液成分的浓度等等来影响。例如，悬浮液或溶液可以约0.5ml/min到约 30ml/min送到混合室以从100um内径喷嘴孔中喷雾；速度低形成较小小滴，速度 快形成较大小滴。在本发明方法中，形成的小滴的质量中值直径范围约在1um到 200um较佳。
在喷雾形成小滴后，初次和第二次干燥使小滴转化成微粒。初次干燥以减压开 始和液体-气体(溶液或悬浮液-高压气体或近超临界气体)混合物膨胀以形成小 滴的气态悬浮液。该气体和膨胀混合物的蒸发溶剂随后可与干燥气体，如温度范 围约在5℃到90℃的氮气交换。干燥可包括第二次干燥，其中残余水分在大体初 次除水后被进一步减少。干燥可以在旋风旋涡中或通过把粉状微粒悬浮在干燥气 体的上升气流中形成流化床来进行。为了减少静电积累和可能的微粒结块，可把 抗衡离子加入干燥室或干燥微粒中。干燥气体可以通过在热交换器和/或干燥器或 冷凝器中再调节而被再循环。在干燥结束时，粉剂微粒的平均大小(MMD)范围约为， 0.5um到200um，或1um到150um，或5um到20um，水分含量少于约10重量％，在 约25℃储存至少约9个月或在约4℃储存至少约2年生物活性材料保持稳定。在 处理后粉状微粒中活的病毒、活的细菌和活的细胞可保留原生存力的至少约一半， 或至少约10％。
微粒可用干燥气流传送到干燥室中，按大小分离、涂覆、收集等等。粉状微粒 可通过在用干燥气流将它们传送到第二干燥室中进行收集。第二干燥室可被配置 为旋风旋涡室使微粒与室的温热表面接触和延长微粒与干燥气体的接触时间。在 该室内微粒可按照大小分离，如通过差别沉降。微粒可用聚合物涂覆以形成保护 涂层。在回收前微粒可沉降到该室底部的收集容器中积聚。总的处理效率是50％， 70％，80％，90％或更多的生物活性材料物质和/或活性可回收。
回收的粉状微粒以微粒或重构的溶液或悬浮液施用。以本发明方法制备的细微 粒可重构成生物活性材料浓度超过原先处理悬浮液或溶液的悬浮液或溶液。例如， 干燥的粉状微粒可以起始进液体材料(溶液或悬浮液)浓度的2-30倍重构而不导 致明显的活性丧失或蛋白变性；100mg/ml溶液的重构时间可少于5分钟。粉状微 粒可以通过肌肉内、腹膜内、脑脊内、皮下、关节内、滑液内、鞘内、口服、体 表、吸入鼻内和/或肺部途径对哺乳动物施用。
本发明的方法可用本发明的设备进行。该设备有数个室可在混合物从喷嘴喷雾 到微粒形成容器之前容纳和混合悬浮液或溶液和加压气体或近超临界流体。在那 里形成的微粒可以在干燥气流中干燥和/或传送到第二干燥室内，该室被配置来进 一步干燥、涂覆、筛分、按大小分类和/或收集微粒。在设备的一个实例中，例如 第一室包含生物活性材料和多羟基化合物的悬浮液或溶液，第二室包含高压气体 和/或近超临界流体，混合室通过第一管道与第一室进行液体传送和通过第二管道 与第二室进行液体传送，毛细管限流器在混合室和微粒形成容器之间提供有限的 液体传送，在悬浮液或溶液与气体和/或近超临界流体在混合室内混合和喷到微粒 形成容器中时干燥气流流动以干燥小滴形成的细薄雾。其结果是包含生物活性材 料的稳定干燥细粉微粒的制剂。
第一室内的悬浮液或溶液可包括例如生物活性材料，多羟基化合物、聚合物和 表面活性剂。生物活性材料可包括，如蛋白质、肽、核酸、细菌、细胞、抗体、 酶、血清、疫苗、脂质体、病毒等等。多羟基化合物可以是，如海藻糖、蔗糖、 山梨糖、松三糖、甘油、果糖、甘露糖、麦芽糖、乳糖、阿拉伯糖、木糖、核糖、 鼠李糖、palactose、葡萄糖、甘露醇、木糖醇、赤藻醇、苏糖醇、山梨糖醇和蜜 三糖和/或类似物。聚合物可以是淀粉、淀粉衍生物、羧甲基淀粉、羟乙基淀粉 (HES)、右旋糖酐、人类血清白蛋白(HSA)、明胶和/或类似物。表面活性剂可以 是，如聚乙二醇脱水山梨糖醇单月桂酸酯(Tween 20)、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单 油酸酯(Tween 80)、和聚乙二醇和聚丙二醇的嵌段共聚物(Pluronic)和/或类似 物。氨基酸添加剂如精氨酸、赖氨酸、氨基乙酸、甲硫氨酸、谷氨酸、组氨酸等 可以是有用的稳定剂。
在设备中与悬浮液或溶液混合的气体和/或近超临界流体可以是，如氮、二氧 化碳、氧、丙烷、一氧化碳、荧烷(flaorahe)、一氧化二氮、氦、氢、六氟化硫、 氯氟烃、氟化碳化合物、一氧化二氮、氙、丙烷、正戊烷、乙醇、氮、和/或水。
该悬浮液或溶液，和重复高压气体和/或近超临界流体，可加到该设备的喷嘴 中形成混合物喷到该设备的微粒形成容器中。第一流量控制设备，如泵或阀，可 被连接到第一室和混合室之间的第一管道以控制悬浮液或溶液进入混合室的流 量。第二种流量控制设备，如泵或阀，可连接到第二室和混合室之间的第二管道 以控制气体和/或近超临界流体进入混合室的流量。从第一管道和/或第二管道到 该混合室的进口与混合室轴线之间的角度可小于90度。毛细管限流器可提供，如 对流动混合物的背压和从喷嘴喷出混合物的孔。毛细管限流器可有，如小于混合 室的内径；毛细管限流器的内径通常范围约为50um到1000um，50um到500um，或 100um。喷嘴可包括，如多个毛细管限流器。喷嘴可有多个进料通道的交会以调 节超过一种气体和/或超过一种液体进料的混合物。
混合物通过喷嘴喷出形成的细小滴薄雾可被干燥气体所干燥。微粒形成容器可 作为第二干燥室，或与第二干燥室进行流体接触，在第二干燥室中通过接触干燥 气体和/或室的表面，微粒可被传送和干燥。干燥气体可以是，如控制温度和/或 湿度的氮气。干燥气体(进入气体)可以处于，如低于粉状微粒玻璃转化温度的 温度。
微粒中残余水分在第二干燥室中可减少到稳定的水平。第二干燥室可配置成旋 风旋涡，粉状微粒的流化床，把保护涂覆材料喷到粉状微粒上的室，按大小分离 的设备，和/或微粒收集容器。干燥气体可通过微粒形成容器和/或第二干燥室在 冷凝器或干燥器除水后被再循环。在设备中按照大小分离微粒可以通过，如差别 沉降、表面冲击、或过滤，以产生平均大小(MMD)约为1um到150um范围，或约 10um的粉状微粒。设备中可包括离子发生器以中和静电电荷。
本发明包含组合物，如生物活性材料、多羟基化合物、聚合物添加剂、氨基酸 添加剂、和/或表面活化剂为的是的悬浮液或溶液，与高压气体和/或近超临界流 体形成混合物以制成稳定性改善的喷雾干燥粉状微粒。该悬浮液或溶液可包含其 他成分，如缓冲剂、载体、赋形剂和/或稳定剂。在一个实例中，该组合物是流感 病毒在蔗糖、HES、和聚乙二醇和聚丙二醇的嵌段共聚物(Pluronic)的水性溶液中 的悬浮液。
悬浮液或溶液制剂可包括生物活性材料如蛋白质、肽、核酸、细菌、细胞、抗 体、酶、血清、疫苗、脂质体、和病毒。生物活性材料的量的范围约为，如小于 悬浮液或溶液重量百的0.00001重量％到约30重量％或更多。在病毒生物活性 材料的情况下，病毒可以是，如流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、单纯 疱疹病毒、SARS病毒(严重急性呼吸道综合症)、冠状病毒家族成员、巨细胞病 毒、人类肺炎后病毒和Epstein-Bar病毒。悬浮液或溶液中活的病毒的效价范 围约为，如从103TCID50到1012TCID50/ml，或106TCID50/ml。干燥微粒中病毒 的量约为，如102TCID50/g，102TCID50/g，103TCID50/g，，104TCID50/g，105TCID50 /g，106TCID50/g，107TCID50/g，108TCID50/g，109TCID50/g，1010TCID50/g， 或1011TCID50/g。
本发明的悬浮液或溶液可包括任何非还原或还原多羟基化合物，如海藻糖、蔗 糖、山梨糖、松三糖、甘油、果糖、甘露糖、麦芽糖、乳糖、阿拉伯糖、木糖、 核糖、鼠李糖、palactose、葡萄糖、甘露醇、木糖醇、赤藻醇、苏糖醇、山梨糖 醇和蜜三糖。悬浮液或溶液中多羟基化合物的量，如范围约在1重量％到约40重 量％。在一个具体实例中，悬浮液或溶液中多羟基化合物是约10重量％的蔗糖。
本发明的悬浮液或溶液中可有聚合物。典型聚合物是亲水生物聚合物，如淀粉、 淀粉衍生物、羧甲基淀粉、羟乙基淀粉(HES)、右旋糖酐、人类血清白蛋白(HSA)、 明胶和/或类似物。聚合物的分子量的范围约在1kDa到300kDa常是较佳的。本 发明悬浮中液的聚合物浓度范围约在0.5重量％到10重量％。在一个实例中，悬 浮液或溶液包含浓度在约5重量％的HES。
本发明的悬浮液或溶液中可有表面活性剂，如以增加制剂成分的溶解性，有助 于细微粒的喷雾，稳定生物活性材料，和/或改善干燥微粒的重构时间。本发明的 悬浮液或溶液中可包括非离子表面活性剂，如烷基苯基烷氧化物、醇烷氧化物、 脂肪胺烷氧化物、聚氧乙烯甘油脂肪酸酯、蓖麻油烷氧化物、脂肪酸烷氧化物、 脂肪酸酰胺烷氧化物、脂肪酸聚二乙醇酰胺、羊毛脂乙氧基化物、脂肪酸聚二醇 酯、异十三烷醇、脂肪酸酰胺、甲基纤维素、脂肪酸酯、硅油、烷基聚苷、甘油 脂肪酸酯、聚乙二醇、聚丙二醇、聚乙二醇/聚丙二醇嵌段共聚物、聚乙二醇烷基 醚、聚丙二醇烷基醚、聚乙二醇/聚丙二醇醚嵌段共聚物、聚乙二醇脱水山梨糖醇 单月桂酸酯、和/或聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯。本发明的悬浮液或溶液可包 括离子表面活性剂，如烷基芳基磺酸盐、苯基磺酸盐、烷基硫酸盐、烷基磺酸盐、 烷基醚硫酸盐、烷基芳基醚硫酸盐、烷基聚二醇醚磷酸盐、聚芳基苯基醚磷酸盐、 烷基磺基琥珀酸盐、烯烃磺酸盐、链烷烃磺酸盐、石油磺酸盐、氨基乙磺酸盐、 肌氨酸盐、脂肪酸、烷基萘磺酸、萘磺酸、木素磺酸、磺化萘与甲醛的缩合物、 磺人萘与甲醛和苯酚的缩合物、木质素-亚硫酸盐废液、烷基磷酸盐、季铵化合物、 胺氧化物和甜菜碱。悬浮液或溶液中的表面活性剂的量的范围约为，如0.001重 量％到5重量％，或0.01重量％到1重量％。
本发明的悬浮液或溶液(液体进料)还可包含氨基酸稳定剂添加剂如赖氨酸、 精氨酸、氨基乙酸、甲硫氨酸、组氨酸等等。悬浮液或溶液可包括缓冲剂，如磷 酸盐、碳酸盐、硼酸盐、醋酸盐、组氨酸、氨基乙酸、柠檬酸盐、和/或类似物， 以提供pH如从约pH 3到pH 8。合适的话，缓冲剂的浓度范围约为2mM到50mM。
本发明包括，如包含可容纳通过喷雾干燥高压气体和/或近超临界气体与生物 活性材料、多羟基化合物、聚合物添加剂和表面活性剂的悬浮液或溶液的混合物 所制备的干燥粉状微粒的容器的制造制品。
定义
在详细描述本发明之前，要理解本发明并不限于具体的设备和生物系统，它当 然可以变化。也可以理解本文使用的术语只是用于描述具体的实例，而不是用来 限制。在本说明书和所附的权利要求书中，除非本文内容另外清楚地规定，单数 形式“a”，“an”和“the”包括复数有关事物。因此，例如，提到“一个表面” 包括两个或更多的表面的组合；提到“细菌”包括细菌的混合物等。
除非另外说明，本文使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域普通技术人 员通常所理解的含义是一致的。虽然与本文描述的方法和材料类似或等同的任何 方法和材料实际上可用于检验本发明，但是使用本文描述的材料和方法较佳。在 本发明的描述和权利要求中，下列术语按照下文的定义使用。
“环境”温度或条件是指在指定环境中的任何指定时间的温度或条件。通常， 室温是约22℃，环境大气压，和环境湿度容易测定，并按照年内时间、天气条件、 (海拔)高度等而变化。
“沸腾”指，如液体的温度超过沸腾温度时从液体到气体的快速相变。沸腾温 度，如本领域中熟练技术人员所熟知的，是液体的蒸汽压与施加的压力相等时的 温度。
“缓冲剂”是指通过其酸碱共轭成分的反应来阻止pH变化的缓冲溶液。缓冲 剂的pH通常选择成稳定选择的活性材料，并可被本领域技术人员确定的。通常， 缓冲剂的pH在生理pH范围内，虽然某些蛋白质可在较宽的pH范围内，例如酸性 pH保持稳定。因此，较佳的pH范围约为1到10，约3到8尤佳；约6.0到8.0 更佳；约7.0到7.4更加佳；在约7.0到7.2最佳。合适的缓冲剂包括pH 7.2的 磷酸盐缓冲剂和pH 7.0的柠檬酸盐缓冲剂。如本领域技术人员所知晓的，有大量 的合适缓冲剂可以使用。合适的缓冲剂包括，但不限于，氨基酸、磷酸钾、磷酸 钠、醋酸钠、组氨酸-HCl，柠檬酸钠、琥珀酸钠、碳酸氢铵和碳酸铵。通常，缓 冲剂使用的摩尔浓度约为1mM到2M，约2mM到约为1M较佳，和约10mM到0.5 M更佳，和25到50mM最佳。
“排气”是指液体溶液中气体在气体的分压大于施加的压力时释放。如水置于 一个大气压(约760乇)的氮气中，且水中氮的分压与气相压力平衡，如果气压降 低则氮可从水中鼓泡。这不是沸腾，并可经常在溶剂沸腾的压力以上的压力下发 生。例如，瓶装的弃碳酸气软饮料，CO2气体分压高，在除去瓶盖压力降低时会快 速冒泡
“可分散性”是指粉末合物可在气流中被分散(即悬浮)使得分散的微粒可被 呼吸或吸入到受试者的程度。因此，有20％可分散性的粉末指只有20％的粉末质可 被吸入装置悬浮以吸入肺中。
“干燥”在干燥粉末合物的场合指残余水分含量少于约10％。干燥粉末合物通 常被干燥到5％或更少的残余水分，或在约3％到0.1％之间。“干燥”在吸入微粒 场合指组合物有水分含量，使得微粒在吸入设备中可容易地分散形成气溶胶。
“赋形剂”通常是指在喷雾冷冻干燥处理和随后的过程中加入以增加治疗剂的 稳定性使得粉末品有长期物理稳定性和流动性的化合物或材料。合适的赋形剂可 以是，如在接触水后不增稠聚合的制剂，该制剂在患者吸入后基本无害和不与治 疗剂明显相互作用改变其生物活性。合适的赋形剂在下文中描述，包括但不限于， 蛋白质如人类和牛血清白蛋白，明胶，免疫球蛋白，碳水化合物包括单糖(半乳 糖、D-甘露糖、山梨糖等)，二糖(乳糖、海藻糖、蔗糖等)，环糊精，和多糖 (蜜三糖、麦芽糊精、右旋糖酐等)；氨基酸如谷氨酸一钠、氨基乙酸、丙胺酸、 精氨酸或组氨酸，及疏水氨基酸(色氨酸、酪氨酸、亮氨酸、苯基丙氨酸等)； 甲基胺如甜菜碱；赋形剂盐如硫酸镁；多羟基化合物如三羟基或更高的糖醇，如 甘油、赤藻醇、丙三醇、阿拉伯醇、木糖醇、山梨醇和甘露醇；丙二醇；聚乙二 醇；Pluronics；表面活性剂；和它们的组合。赋形剂可以是本发明中溶液或悬浮 液的多官能成分。
“玻璃”或“玻璃态”或“玻璃基质”指流动能力明显降低的液体，即，很高 粘度的液体，其中粘度范围在1010到1014帕斯卡-秒。它可以被认为是亚稳定无 定形体系，其中分子有振动运动但是有很慢(几乎测不出)的转动和平移分量。 作为亚稳定体系，它在储存在远低于玻璃转化温度的温度时可在长时间内稳定。 由于玻璃不处于热力学平衡状态，储存在玻璃转化温度和接近玻璃转化温度的玻 璃松弛到平衡并失去了高粘度。产生的似橡胶的或糖浆状，流动液体经常在化学 上和结构上不稳定。玻璃虽然可通过许多不同途径获得，但无论用任何途径获得， 看起来在物理上和结构上是一样的材料。用于获得本发明的玻璃基质的方法通常 是溶剂升华和/或蒸发技术。
“玻璃转化温度”以符号Tg表示，是指组合物从玻璃或类玻璃状态转变为糖 浆状或似橡胶的状态的温度。通常Tg是使用差示扫描热量法(DSC)确定和标准规 定把扫描通过该转变时组合物热容量(Cp)开始发生变化的温度作为玻璃转化温 度。Tg的定义长常常是任意的，目前尚无国际规定。Tg可被定义在转化的开始、 中点或结束；对本发明来说我们使用在DSC和DER上的Cp变化的开始。详见题为 “用液体和生物聚合物形成玻璃”(“Formation of Glasses from Liquids and Biopolymers”)的文献，C.A.Angell：Science，267，1924-1935(Mar.31，1995) 和题为“玻璃转化的差示扫描量热法分析”(“Differential Scanning Calorimetry Analysis of Glasses Transitions”)的文献，Jan P.Wolanczyk：Cryo-Letters， 10，73-76(1989)。详细的数学处理见“玻璃转化特性和牖态”(″Nature of the Glass Transition and the Glassy State”)，Gibbs和DiMarzio：Journal of Chemical Physics，28，NO.3，373-383(March，1958).这些文献在此引用作为参 考。
“渗透促进剂”是表面活性化合物，促进药物渗透通过粘膜或粘膜层，通常是 鼻内、直肠内和阴道内使用。
“药物上可接受”赋形剂(载体、添加剂)是那些可被合理地施用到哺乳动物 受试体以提供有效剂量的使用的活性成分。这些赋形剂是联邦药品管理局Federal Drug Administration(FDA)必须指明为“公认安全”(‘Generally Regarded as safe’(GRAS))的较佳。
“药物组合物”指形式上允许活性成分的生物活性是明确有效的制剂，且该制 剂不包含任何对组合物施用到的受试者有毒的另外成分。
“多羟基化合物”是有多个羟基团的物质，并包括糖(还原和非还原糖)，糖 醇和糖酸。本文中较佳的多羟基化合物的分子量少于约600kDa(如范围约为1 20到400kDa)。“还原糖”是包含可还原金属离子或与蛋白质中赖氨酸和其 他氨基基团共价反应的半缩醛基团的多羟基化合物。“非还原糖”是没有还原糖 的这些特性的糖。还原糖的例子有果糖、甘露糖、麦芽糖、乳糖、阿拉伯糖、木 糖、核糖、鼠李糖、半乳糖和葡萄糖。非还原糖包括蔗糖、海藻糖、山梨糖、松 三糖和蜜三糖。甘露醇、木糖醇、赤藻醇、苏糖醇、山梨糖醇和甘油是糖乙醇的 例子。至于糖酸，包括L-葡萄糖酸盐和它们的金属盐。
“粉末”指由细分散的固体微粒组成的组合物，这些固体微粒可相对自由流动 和能被容易地分散在吸入设备中和随后被患者吸入，所以该微粒适合通过上呼吸 道包括鼻粘膜在鼻内或肺部施用。
“推荐储存温度”对组合物来说是粉状药物组合物储存以在该组合物的保存期 限内保持药物产品稳定性保证其一般释放剂量的温度。该温度开始由组合物的制 造商确定并由负责批准组合物销售的政府机构批准(如，美国的食品药品管理局 Food and Drug Administration in U.S.)。该温度随每个被批准的药物产品而 变化，取决于产品中活性药物和其他材料的温度敏感性。推荐储存温度的变化约 为小于约0℃到40℃，但通常是环境温度，即约25℃。药物产品常常被储存 在推荐储存温度或低于推荐储存温度中。
如果在给定时间生物活性材料如酶的生物活性是该药物组合物制备时以结合 鉴定法确定的生物活性的约10％(在分析误差以内)以内，则生物活性材料在药 物组合物中“保留其生物活性”。对于蛋白质，如抗体，以分析技术如尺寸排阻 HPLC，FTIR，DSC，CD，ELISA获得的纯度与生物活性相关。对于活的病毒的情况， 在组合物的病毒效价在一个log的起始效价以内可认为生物活性被保留。用于确 定流感病毒效价的分析是荧光聚焦分析(Fluorescent Focus Assay)(FFA assay)。 由此分析获得的效价以每毫升荧光聚焦单位(Fluorescent Focus Unit per milliliter)(FFU/ml)表示。一个FFU/ml约等于一个每毫，则生物活性材料在药 物组合物中“保留其生物活性”升组织培养感染量(Tissue Culture Infectious Dose per ml)(TCID50/ml)。其他“生物活性”分析在下文中详细描述。
例如如果在给定时间化学稳定性使得如上所述，认为生物活性材料仍然保留其 生物活性，则生物活性材料在药物组合物中“保留其化学稳定性”。或者，化学稳 定性可定义为，例如，使用合适的分析技术获得的生物材料结构没有明显变化。 化学稳定性可以通过对生物活性材料的化学变化形式进行检测和量化来评价。化 学变化可涉及大小改变(例如蛋白质的剪除)，可用尺寸排阻色谱法，SDS-PAGE 和/或基体辅助激光解吸电离/飞行时间质谱法(MALDI/TOF MS)评价大小改变。其 他类型的化学变化包括如用离子交换色谱法评价的电荷改变(如，脱酰胺作用的 结果)。
如果例如对色彩和/或透明性的视觉检查，或用UV光散射或通过尺寸排阻色谱 法测量显示聚集、沉淀和/或变性没有明显增加，则生物活性材料在药物组合物中 “保留其物理稳定性”。
“稳定”制剂或组合物是储存时其中生物活性材料基本保留其物理稳定性和/ 或化学稳定性和/或生物活性的制剂或组合物。用于测定稳定性的各种分析技术是 本领域可得到的，和可见，如肽和蛋白质给药“(Peptide and Protein Drug Delivery)，247-301，Vincent Lee Ed.，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.， Pubs.(1991)和Jones，A.Adv.Drug Delivery Rev.10：29-90(1993)。稳定性 可在选择的温度在选定的一段时间测定。趋势分析在材料被实际储存于该段时间 之前可用于估计预计存放期。对于活的流感病毒，稳定性被定义为它释放1 log FFU/ml或1 log TCID50/ml所用的时间。该组合物在室温(～25℃)稳定至少3 个月和/或在约2-8℃下稳定至少1年较佳。而且，该组合物在冷冻(到，如-70 ℃)和融化后仍稳定较佳。
本文中使用的高压气体或近超临界干燥是指从混合有高压气体或近超临界流 体的悬浮液或溶液中除去溶剂，如水或有机制剂。高压或超临界干燥可包括，如 把包含活性成分的溶液或溶剂与加压气体或超临界流体混合形成液体和气体的混 合物，通过减压喷出悬浮液或溶液，膨胀，或使气-液混合物脱气以产生细小滴。 许多超临界流体，如超临界二氧化碳，可用于超临界干燥处理。
“近超临界流体”是指保持在临界点压力和或温度(°K)的10％或约10％以内 的流体。临界点是温度和压力的组合，其中如果温度(临界温度)增高或压力(临 界压力)降低，物质不能再以液体形式存在。临界温度是在该温度以上气体不能 被液化的温度，在给定压力下在该温度以上物质不能显示明显的气相和液相的的 温度。临界压力是指在临界温度下液化气体(蒸汽)所需的压力。例如，二氧化 碳的临界压力和温度分别是74大气压和31摄氏度。保持在其临界点以上的压力 和温度下的二氧化碳是在超临界条件或状态。其他物质的临界压力和温度如下所 示：
液体 Pc(bar) Tc(℃) 二氧化碳 74 31 氧化亚氮 72 36 六氟化硫 37 45 氙 58 16 乙烯 51 10 三氟氯甲烷 39 29 乙烷 48 32 三氟甲烷 47 26
在药学意义上，生物活性材料“治疗有效量”是指对病症的预防或治疗有效的 量，其中“病症”是任何可从生物活性材料的治疗中受益的疾病。这包括慢性和 急性的病症或疾病，包括那些使哺乳动物易患上述病症的病理条件。
“治疗”指治疗处理和预防或防止措施。那些需要治疗的包括已经有病症的和 要预防病症的。
“单位剂量”指包含本发明治疗有效量的组合物的容器。
附图的简要描述
图1A和1B显示从100微米熔凝二氧化硅喷嘴中使用近超临界CO2喷出的小滴 大小与离喷嘴尖端的距离的关系。
图2显示从100微米熔凝二氧化硅喷嘴中使用加压氮气喷出的小滴大小分离喷 嘴尖端的距离的关系。
图3显示代表喷出压力对微粒大小影响的柱形图。
图4显示包含B/Harbin活病毒疫苗的喷雾干燥制剂的干燥粉末粒度分布。
图5显示使用差示扫描热量计(DSC)获得的AVO 47制剂的玻璃转化温度。
图6显示典型喷雾干燥粉末的形态。
图7显示喷雾干燥粉末制剂AVO 47的X线衍射数据。衍射图显示AVO 47制剂 的玻璃无定形特性。
图8显示在AVO 47a制剂中喷雾干燥的活B/Harbin流感病毒的长期稳定性。
图9是典型的超临界CO2喷雾干燥系统的示意图。
详细描述
本发明的方法、设备和组合物可以提供高初始纯度和在干燥粉状微粒基质中生 物活性材料的长期储存。该方法提供，例如通过把生物活性材料制剂与高压气体 和/或近超临界气体在混合室内混合，然后从喷嘴喷出制成细雾，快速把小滴干燥 成微粒而无需高热量。溶剂可以从该雾小滴快速蒸发留下干燥微粒，该微粒可在 第二干燥室内被进一步脱水。本发明的制剂包括，如生物活性材料和可以被干燥 成稳定保护基质的多羟基化合物、聚合物、氨基酸和/或表面活性剂的悬浮液或溶 液。
制备粉状微粒的方法
本发明的方法包括，如生物活性材料悬浮液或溶液与近超临界流体和/或高压 气体的混合物，使该混合物膨胀以形成小滴的细雾(气态悬浮体)，在微粒形成 容器和/或第二干燥室内将小滴干燥成粉状微粒。使与近超临界气体的混合物的悬 浮液或溶液膨胀可以在低剪切应力和相对低温度的条件下产生很细的小滴。在膨 胀过程中水分快速除去和细微粒的大小可使在微粒形成容器和/或第二干燥室内 有相对适度的干燥条件。低剪切喷雾，低温初次干燥和/或适度的第二次干燥条件 可减少粉状微粒中生物活性材料的加工降解和增加储藏时微粒的稳定性。
本发明中制备粉状微粒的方法包括，如制备溶液或悬浮液，与高压气体和/或 近超临界流体组成混合物，喷雾到微粒形成室内进行初次干燥，微粒的第二次干 燥，干燥稳定粉状微粒的回收。水性悬浮液或溶液可包含，如生物活性材料、多 羟基化合物、聚合物、氨基酸和表面活性剂。近超临界流体可以是，如二氧化碳。 混合物可以在毛细管限流器喷嘴出口附近的混合室内形成。在喷雾中气体膨胀可 使悬浮液或溶液分裂成快速干燥的细小滴。第二次干燥可以通过微粒悬浮在温度/ 湿度控制气体的旋涡或流化床中进行。粉状微粒产品可通过按大小分类后的沉涤 来回收。
制备悬浮液或溶液
本发明的悬浮液或溶液(液体进料)可包括，如在水溶液中与多羟基化合物、 聚合物、氨基酸和/或缓冲剂配制的生物活性材料。各成分可以用适合成分的顺序 混合，这是本领域熟练技术人员所知晓的。例如，生物活性材料如病毒或细菌， 可以在与多羟基化合物溶液混合形成悬浮液前通过离心或过滤从生长介质中浓缩 和分离。抗体在与其他制剂成分溶解在溶液中之前可通过亲和色谱法提纯和浓缩。 用于喷雾的液体悬浮液或溶液可通过在水溶液中混合生物活性材料、多羟基化合 物和其他赋形剂来制备。某些生物活性材料，如肽和抗体，可容易地溶解在水溶 液中。其他生物活性材料，如细菌和脂质体，可作为悬浮液中的微粒。不论生物 活性材料是否形成溶液或悬浮液，常需要，如在把它们混合到喷雾制剂中时避免 剪切应力或温度的恶劣条件。某些制剂成分要求加热或强烈搅拌来制备溶液，可 以把它们分开来溶解，随后在冷却后慢慢地与生物活性材料混合。
本发明的生物活性材料可以是，例如工业制剂、分析制剂、疫苗、药物、治疗 剂等。本发明的生物活性材料包括，例如蛋白质、肽、核酸、细菌、细胞、抗体、 酶、血清、疫苗、脂质体、病毒，和/或类似物。生物活性材料可以是，如活细胞 和/或存活病毒。生物活性材料可以是，如用作疫苗或作为治疗剂的释放介质的非 活细胞或脂质体。本发明中存活的生物活性材料可以是，如活病毒，如流感病毒、 副流感病毒、呼吸道合胞病毒、单纯疱疹病毒、SARS病毒、冠状病毒家族成员、 巨细胞病毒、人类肺炎后病毒和Epstein-Bar病毒，和/或类似物。这些材料的 溶液或悬浮液液体制剂的制备步骤可随着每个材料的独特的敏感性而变化。
悬浮液或溶液中生物活性材料的浓度可有较大变化，取决于比活性、赋形剂浓 度、施用途径、和/或材料的预定用途。例如，生物活性材料是肽疫苗、活病毒或 细菌时，材料要求的浓度可以很低。例如，生物活性材料是吸入治疗施用的抗体， 或体表施用的脂质体时，要求的浓度可以较高。通常，本发明中溶液或悬浮液中 生物活性材料的适合浓度约为，如少于1pg/ml到150mg/ml，5mg/ml到80mg/ml， 或50mg/ml。
生物活性材料的悬浮液或溶液可包括，例如多羟基化合物中任何一种。在本发 明的方法中，多羟基化合物可提供，例如粘度增加剂以减少喷雾时剪切应力作用。 多羟基化合物可以对本发明的干燥粉状微粒提供保护屏障和化学组成。例如，多 羟基化合物如蔗糖，可在物理上围绕和保护生物活性材料以免暴露于损害性的光 线、氧气、水分和/或类似物。多羟基化合物可以，例如替代干燥中失去的水合水， 防止材料中生物分子的变性。虽然本发明不限于任何具体的多羟基化合物，悬浮 液或溶液和粉状微粒组合物可包括，例如蔗糖、海藻糖、山梨糖、松三糖、山梨 糖醇、水苏糖、蜜三糖、果糖、甘露糖、麦芽糖、乳糖、阿拉伯糖、木糖、核糖、 鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、甘露醇、木糖醇、赤藻醇、苏糖醇、山梨糖醇、甘油、 L-葡萄糖酸盐，和/或类似物。希望制剂有冻-融稳定性时，多羟基化合物较好在 冷冻温度(如，-20℃)不结晶，因为在冷冻温度结晶可使制剂中生物活性材料不 稳定。制剂中的多羟基化合物的用量可根据生物活性制剂的特性、其他赋形剂和 预定用途而变化。但是，悬浮液或溶液通常包括浓度在约1％到40％之间在约1到 20％较佳的非还原糖。在具体较佳实例中，悬浮液或溶液包含约10％的蔗糖。
聚合物可包含在本方法的悬浮液或溶液中，例如，以提供保护和结构上的益处。 与多羟基化合物一样，聚合物可提供，例如对生物活性材料的物理和化学保护。 聚合物的线型或支链束可提供，如增强对本发明微粒组合物的结构强度。聚合物 可用作外表面或本发明的粉状微粒的保护和/或延时释放涂层。许多聚合物是，如 在水中高度可溶的，所以它们不会明显阻碍粉状微粒的重构。许多聚合物如聚乙 烯吡咯烷酮、聚乙二醇、聚氨基酸如聚L-赖氨酸，可明显增加水溶液中的重构速 度。在本发明方法中的聚合物保护制剂可包括，例如淀粉和淀粉衍生物，如氧化 淀粉、羧甲基淀粉和羟乙基淀粉(HES)、水解明胶、不水解凝胶、卵白蛋白、胶原 蛋白、硫酸软骨素、唾液酸化多糖、肌动蛋白、肌球蛋白、微管、动力蛋白、呋 喃甲基腺嘌呤、人类血清白蛋白，和/或类似物。使用的HES的分子量是在约 100,000到300,000之间较佳，约200,000更佳。通常，HES的浓度约为0.5到 10％，约1到5％之间较佳。较佳制剂包含约5％HES。
本发明的悬浮液或溶液可包含，如与使用的具体生物活性材料相容的表面活性 剂。表面活性剂可增加其他制剂成分的溶解度以防止在较高浓度下的聚集和沉淀。 表面活性制剂可，例如降低悬浮液或溶液的表面张力，使生物活性材料在气液界 面不变性，和/或在喷雾中可形成更细的小滴。本发明的悬浮液或溶液包含非在约 0.001和5％之间，较好在约0.05和1％之间或约0.2％的非离子表面活性剂、离子 表面活性剂、或它们的组合。
缓冲剂可加到本方法的制剂中，例如以对本发明方法的制剂和本发明组合物提 供合适稳定的pH。本发明的典型缓冲剂包括，例如氨基酸、磷酸钾、磷酸钠、醋 酸钠、柠檬酸钠、组氨酸、氨基乙酸、琥珀酸钠、碳酸氢铵和/或碳酸铵。缓冲剂 可调节到合适的酸和盐形式以提供，例如约在pH 3到pH 10范围，约在pH 4到 pH 8范围的pH稳定性。对于许多组合物，接近中性的pH如pH 7.2是较佳的。
制剂中可包括其他赋形剂。例如，氨基酸如精氨酸和甲硫氨酸可以是制剂和组 合物的成分。氨基酸可以，例如作为两性离子阻碍带电荷基团在处理表面和储存 容器上，并防止生物活性材料的非特异性结合。氨基酸可通过清除氧化剂，清除 脱酰氨基剂，和稳定蛋白质构象来增加组合物的稳定性。在另一个实例中，甘油 可包含在本发明的制剂中，如作为粉状微粒组合物中的多羟基化合物和/或增塑 剂。EDTA包含在该组合物中，以减少制剂成分的聚集和/或清除可引发破坏性自 由化学反应的金属离子。
混合和喷雾
本发明的悬浮液或溶液，例如在通过毛细管限流器喷嘴出口喷雾形成小滴的细 雾之前在室中与高压气体或近超临界流体混合。不限于特定的理论，高压气体或 近超临界流体与悬浮液或溶液的混合可形成在压力下被流体饱和和/或包围的小 滴的乳液混合物。当混合物从喷嘴中释放时，压力迅速下降使得爆炸性膨胀和/ 或冒泡(排气)，将小滴分裂成为薄雾(小滴的气态悬浮体)。该薄雾可以比在 较低压力下(如，小于100psi)喷雾或不同近超临界流体的喷雾产生的更细。 该小滴在有关混合物减压的任何相变或绝热膨胀期间可经历低温。其剪切应力比 在足以产生相同的细小滴的压力下的液压喷雾(即，不用气体喷出液体)小。
悬浮液或溶液与近超临界流体和/或高压气体在混合室内混合，然后在微粒形 成室内喷雾膨胀。悬浮液或溶液可装在容器内(第一室)并通过管道混合室送到。 悬浮液或溶液可通过容器增压或用高压泵泵送被压入混合室。高压气体和/或近超 临界流体例如可来自压力容器(第二室)的管道被送到混合室。混合室可以例如 是在喷嘴结构内配置来在流动混合物中产生旋涡或湍流的膨胀管道。例如取决于 气体或流体，和悬浮液或溶液成分，生物活性材料可以在混合物中以微粒、乳液、 沉淀物、和/或溶质存在。
本发明的喷嘴可适用于形成需要的小滴细雾。喷嘴可有，如将混合物送入到毛 细管限流器喷孔的管道，该毛细管限流器喷孔的内径约在50um和1000um之间， 或约100um。在一个较佳实例中，混合物包含悬浮液或溶液在加压气体或近超临 界流体中的乳液，这样当压力快速下降时，液体快速转化为气体，分散乳液小滴。 压力释放可以快速到气体形成是爆炸性的，导致包含生物活性材料的细小滴形成。 更具体的是，发现超临界CO2辅助喷雾导致超细喷雾小滴的形成。已经发现小滴大 小随离喷嘴的距离而变化，如图1A和1B所示。不限于特定的理论，认为如图1B 所示，在低剪切应力下从喷嘴10喷出的混合物形成相对较大的混合物小滴11， 较大小滴在爆炸区域12膨胀和/或冒泡成为悬浮液或溶液小滴13的细雾。例如， 如图1A所示，距离在约0到2cm下，小滴的平均大小约400μm，它们在爆炸区 域，在距喷嘴孔只有3cm处可被分裂成小滴大小约10μm。该超细小滴产品也可以 通过高压常规气体在约1000psi或更高压力下产生(见图2)。
如本领域熟练技术人员所知晓的，参数控制如微粒大小、大小分布、微粒产品 的形状和形式会取决于实施本发明方法时使用的操作条件。变量包括超临界流体 的流速，溶液或悬浮液的流速，生物活性材料和赋形剂的浓度，喷嘴的直径和长 度，微粒上的表面电荷，和微粒形成室和第二干燥室内的相对湿度、温度和压力。 例如，如图3所示，微粒大小可随喷雾压力增加而减小。柱形图显示在高喷雾压 力30下，产生的微粒平均值小于约10um，总体大小范围相对窄。在中等喷雾压 力31微粒平均大小是约45um，在低喷雾压力32微粒大小是约200um，二者的总 体大小范围相对较宽。
高压气体/近超临界流体和/或悬浮液/溶液经过喷嘴的流速可被控制以获得需 要的微粒大小，大小分布，形状，和/或形式。流速可以通过调节管道中的各阀来 确定，该阀是针形阀较佳。流速也可通过改变用于高压气体/近超临界流体和/或 悬浮液/溶液的泵送条件来控制。在干燥成微粒前，本发明小滴通常产生的平均大 小范围约在1um到50um，或约5um。
近超临界流体通常在接近液体的临界压力被引入混合室。高压气体通常在超过 约1000psi的压力下被引入混合室。悬浮液或溶液通常在流速约在0.5ml/min 到50ml/min，或约3ml/min(对于100um的毛细管限流器)到30ml/min，和在 近超临界流体压力的压力下被引入混合室。高压气体或近超临界流体流速对悬浮 液或溶液流速的质量流量比(气体/液体)可在约0.1和100之间，在1和20之 间较佳，在1和10之间更佳，在大约5最佳。悬浮液或溶液的较高比例和较高流 速可增加小滴和干燥微粒的大小。本发明干燥粉状微粒可控制到平均直径，如小 于约200um，约从0.5um到150um，通常约从1um到15um；约从3um到10um 较佳；约从5um到10um最佳(见图4)。小滴大小(以质量中值直径-MMD测量) 可控制到从约1um到400um范围，约从1um到200um；约从5um到50um较佳； 约从3um到10um最佳。
适合喷雾本发明溶液或悬浮液的加压气体包括，例如，氮、二氧化碳、氧气、 丙烷、一氧化二氮、氦、氢，和/或类似物；压力范围约在100磅/平方英寸(psi) 到15,000psi。本领域已知的适合用作超临界流体的许多流体包括，如二氧化碳、 六氟化硫、氯氟烃、氟碳化合物、一氧化二氮、氙、丙烷、正戊烷、乙醇、氮、 水，其他本领域已知晓的流体和它们的混合物。超临界流体是二氧化碳或二氧化 碳与另一气体如三氟甲烷，和/或调节剂如乙醇的混合物较佳。在本发明方法中加 压气体和/或近超临界流体与悬浮液或溶液混合的温度可以是，如约从0℃到60 ℃。在典型的实例中，近超临界流体是压力约在1000psi的CO2。在较低的二氧 化碳压力下，如500，750和950，(在接近临界条件下)细微粒也可被分散。近 临界流体被定义(King，M.B.，和Bott，T.R.，eds.(1993)，用近临界溶液萃取 天然产物”(“Extraction of Nature Products using Near-Critical solvents，”) (Blackie Acad & Prof.，Glasgow)pp.1-33)为压力和/或温度维持在它们的临 界压力和/或温度(°K)的0.9和1.0之间的物质。
超临界流体可任选地包含一个或多个调节剂，例如，但不限于，甲醇、乙醇、 异丙醇、和/或丙酮。当使用时，调节剂占超临界流体体积的不超过20％较佳，1％ 到10％更佳。术语“调节剂”是本领域熟练技术人员所熟知的。调节剂(或助溶 剂)被描述为某种化学品，当它加到超临界流体中时，它改变超临界流体在临界 点或临界点附近的固有特性和依数特性。
小滴的初次干燥，例如可在气-液体混合物的膨胀中开始。初次干燥可以，例 如，把液体小滴转变成初次干燥的微粒。悬浮液或溶液的某些溶剂可溶解在近超 临界流体中，例如甚至在膨胀开始以前。当喷雾膨胀时，流体可转变到气体状态， 移除潜热并冷却该薄雾。爆炸性膨胀可以把混合小滴粉碎成更小的小滴。对小滴 中高压气体或超临界流体的排气可进一步使它们分裂成更细的小滴。细小滴周围 的气体和蒸气可以被流经微粒形成容器的干燥气流替代(即交换)。在接触干燥 气体时精细小滴中大量的溶剂可以被蒸发；这可以通过小滴的表面对体积的高比 率，干燥气体的较热温度，干燥气体的低相对湿度来加快。第二次干燥可发生在 微粒形成容器中和/或干燥气体携带细小滴和/或初次干燥的微粒到第二次干燥室 内进一步减少残余水分。
任选的是，小滴的细雾可喷到冷流体流中以冷冻小滴。冷流可以是，如气体(如 CO2)，或液体(液氮)，温度约在-60℃到-200℃。冷冻的小滴可被置于低压环 境(即压力低于大气压)以通过升华除冰形成如低密度，冻干的干燥粉状微粒。
第二次干燥
结构上稳定和初次干燥微粒的第二次干燥，如可进一步除去夹带的溶剂，残余 水分，和/或分子水合的水，以提供有明显较低水分含量的粉状微粒组合物，该组 合物如在室温中长期储存是稳定的。第二次干燥可涉及，如微粒悬浮在干燥气体 旋涡中，微粒悬浮液在干燥气体流化床中，和/或在强真空中对微粒施加较热温度 数小时到数日。在喷雾和初次干燥中快速干燥和形成的细微粒大小可降低本发明 方法中第二次干燥的温度和时间。
第二次干燥条件可用于，如进一步降低微粒中的水分含量。微粒可在第二干燥 室内收集并保持在低于干燥(＜1％水分)制剂的玻璃转化温度(见图5)的温度， 或约在5℃到90℃之间，或约在25℃到65℃之间，或约35℃。该室可保持减压， 第二次干燥可持续，如约2小时到约5天，或约4小时到约48小时，直至残余水 分被降到需要的水平。通过在该室中提供干燥气体的上升气流以产生粉状微粒的 流化床悬浮体可加速第二次干燥。低残余水分的微粒通常显示在长时间储存中有 更好的稳定性。第二次干燥可持续到粉状微粒的残余水分约在0.5％和10％之间， 或少于约5％。在很低的残余水分值，某些生物活性分子可由于失去水合的水分子 而变性。这种变性可以通过在处理悬浮液或溶液中提供可替换的氢结合分子，如 糖、多羟基化合物和/或聚合物来减轻。
由于本文中描述的设备和方法的效率增加，干燥可以在比常用方法相对低的温 度中完成。而且，已经发现在绝热膨胀中，混合物的温度下降，即产生的小滴周 围的净温度由于自身冷却而降低。微粒形成容器和微粒收集器中气体温度可保持 在或低于干燥粉状微粒的Tg或生物活性材料的变性温度，并一般在约90℃或低 于约90℃；约在25-80℃较佳；约在30-50℃，或约35℃更佳。干燥温度降低 可使干燥处理的活性损失最小并有助于增加保存在由该方法回收的干燥细微粒中 的生物活性。
干燥气体可被再循环和再调节以提供需要的干燥条件。干燥气体可以是基本惰 性气体，如氮气，以防止在干燥中生物活性材料的化学降解。气体可从微粒形成 容器和/或第二干燥室再循环，经过干燥器或冷凝器除去水分，经过热交换器来加 热或冷却气体来提供需要的干燥温度，并再循环，如回到微粒形成室。离子发生 器可把离子注入微粒流中以减少电荷累积和/或控制细微粒团聚成较大微粒的团 聚速度。
本发明的粉状微粒干燥时的大小，如可适合操作、重构和/或产品的施用要求。 例如，通过鼻内施用吸入释放的生物活性材料粉状微粒约在20um到150um，比深 肺部吸入释放的微粒大小约在0.1um到10um要大。缓慢重构产品的微粒大小可 比快速溶解的微粒要小。喷雾冷冻干燥微粒可有，例如较低密度，因为从小滴中 可除冰而留存固体支承的饼状结构不会破坏。由于它们较小的空气动力学半径， 该微粒可有，如对吸入施用在物理上较大的大小。在某些处理条件下，本发明的 粉状微粒可有中空的半球状(见图6)。冷冻干燥微粒，例如可比液体小滴干燥 的微粒大并仍然保留由于冷冻-干燥微粒的多孔特性的快速重构特性。本发明粉状 微粒平均物理直径，如约在0.1um到200um，约在1um到50um，或约在2um到 20um(见图4)。
在第二次干燥过程期间，如喷雾涂层或其他保护涂层可被施加于该微粒。例如， 聚合物溶液的薄雾可在旋涡或流化床被喷到干燥微粒的悬浮体中。
本发明的方法产生药物上可接受的，包含至少一种生物活性材料在无定形玻璃 样基质中的粉状微粒。组合物是几乎完全干燥较佳。某些水或其他水性溶剂可保 留在组合物中，但通常不超过约5重量％的残余水分保留。干燥温度范围可在小于 约90℃，约在25℃和约80℃之间，约在30℃和50℃之间，或约35℃。典型的第 二次干燥处理可包括，如把温度升至干燥温度约30℃到55℃，并保持约0.5天到 5天以形成有0.1％到约5％，或约3％残余水分的干燥粉状组合物。本文使用的“干 燥”，“干燥的”和“基本干燥的”包括有约0％到5％的水的组合物。使用Karl Fisher 法测定，粉状基质的水分含量约为0.1％到3％较佳。
得到的产品可以是无定形的固体(见x射线结晶图，图7)，其中玻璃样赋形 剂材料如蔗糖，呈无定形玻璃态并包围生物活性材料，因此基本上限制分子运动 并防止蛋白质伸展。不受任何特定理论限制，本方法已经被假定为通过无定形玻 璃对蛋白质或活性成分机械固定，或通过氢与蛋白质上极性和有电荷的基团结合， 即通过水替换，从而防止干燥引起的变性和抑制另外不希望有的反应或降解反应。 玻璃样基质稳定性理论已经提供了有用但简化的方法描述生物保存的一般现象。 但是，近年来文献中积累的数据已提示在许多情况，对于长期稳定，玻璃态既不 必要也不充分。很重要的是指出造成生物制剂稳定的机理可以是多因素的并且不 限于包围活性成分的粉状基质的无定形特性。借助于本文描述的方法中的稳定性 可涉及许多因素，包括但不限于生物材料的受热过程，蛋白质侧链的构象活动性 和柔性的减少和/或由于包覆产生的自由体积的减少，基质结构刚性的改善，赋形 剂与活性成分相分离的减少，通过选择最佳氢键合给体对水替代程度的改善。后 者是赋形剂对被稳定的蛋白质、核酸、碳水化合物、或脂质的表面的亲和性和亲 合力函数。一般来说，只要固体在玻璃转化温度以下的温度，赋形剂中保留的残 余水分相对低，包含脂质膜的易变化的蛋白质和/或生物活性材料可保持相对稳 定。
以微粒回收生物活性材料
回收本发明粉状微粒使之具有需要的活性和适合施用的预定途径的形式。本发 明粉状微粒可以从处理流中用物理方法回收，如通过在干燥后的沉降或过滤。由 于使用适度的处理条件，本发明方法可提供活性和稳定材料的高回收。本发明方 法可提供，如适合作为高浓度溶液，气雾剂，鼻内沉积微粒，或肺部沉积微粒施 用的微粒。
粉状微粒的物理回收可依赖于，如喷雾干燥设备保留或排出的材料的量，由于 微粒大小选择方法而带来的损失。例如，包含生物活性材料的处理材料可在探测 时损失，和在喷雾干燥设备的表面损失。溶液或微粒可在处理中损失，如当喷雾 小滴的聚集增加并脱离处理流时，或当尺寸过小的小滴干燥成小微粒，而被干燥 气体携带通过第二干燥室带到处理废气流中。本发明的处理产率(输入活性材料 通过处理的回收百分比)范围为，如超过约70％，或约80％到98％，或约90％。
需要的平均大小和大小范围的微粒可，如通过过滤、沉降、冲击吸收、和/或 其他本领域知晓的方法选择。微粒可通过有均一孔大小的一个或多个过滤器对其 筛选来对大小分类。大微粒可通过使它们从微粒悬浮液在液体或气体移动流中来 分离。大微粒也可通过惯性冲击贴到转弯流体流的外侧，而流体流带走较小或不 大致密的微粒。较小微粒可通过液体或气体流移动速度达到使较大微粒沉降而带 走较小微粒来分离。
生物活性材料的回收可受到，如在喷雾干燥过程中的物理损失、细胞破裂、变 性、积聚、破碎、氧化和/或类似情况的影响。该方法中回收的生物活性材料的活 性是物理回收乘回收材料的比活性的乘积。输入活性与回收活性之差有时被称为 “处理损失”。本发明的方法，如通过把更多的生物活性材料转化成符合处理要 求的粉状微粒而减少处理损失。本发明的方法如，通过提供减少剪切应力、减少 干燥时间、降低干燥温度，和/或增加稳定性的喷雾干燥技术，也提供比现有技术 提高的粉状微粒最终产品的比活性(活性生物活性材料/无活性生物活性材料)。 比活性(如，活性蛋白质或存活蛋白质占总病毒或总病毒微粒的比率)可在本发 明的微粒形成过程中保持相对恒定。生物活性制剂的比活性的变化可以，如小于 约2％，小于约10％，小于约30％，小于约50％。
生物活性材料的施用
如果合适，本发明的生物活性材料可施用于如哺乳动物。本发明的生物活性材 料可包括，如肽、多肽、蛋白质、病毒、细菌、抗体、细胞、脂质体，和/或类似 物。该材料可作为治疗剂、营养剂、疫苗、药物、预防剂，和/或类似物，可以如 通过胃肠道吸收、体表涂敷、吸入、和/或注射对患者施用提供益处。
生物活性材料可通过体表涂敷施用于患者。例如，粉状微粒可直接混入药膏、 载体软膏、加压液体、气体推进剂，和/或渗透剂中，涂敷于患者的皮肤。或者， 粉状微粒，如可在应用前与其他成分混合前在水性溶剂中重构。
本发明的生物活性材料可吸入施用。空气动力学直径小于10um的干燥粉状微 粒可被吸入到肺中用于肺部施用。任选地，空气动力学直径约20um，或更大的粉 状微粒可鼻内施用，或施用到上呼吸道，通过惯性冲击粉状微粒从气流中移到患 者的粘膜上。粉状微粒或者可重构成以水性薄雾吸入施用的悬浮液或溶液。
本发明的生物活性材料可注射施用。粉状微粒可使用如一般高压气体喷射直接 施用到患者的皮肤下。更常见的是，粉状微粒可与无菌水性缓冲剂重构用于通过 中空注射器针头注射。该注射可以是，如肌肉内、静脉内、皮下、鞘内、腹膜内 等适合形式。本发明的粉状微粒可重构成适合于剂量和处理要求的生物活性材料 浓度从小于约0.1ng/ml到从小于约1mg/ml到约500mg/ml，或从5mg/ml到约 400mg/ml的溶液或悬浮液。重构的粉状微粒可再被稀释，如用于多次接种，通过 IV注入施用等。
生物活性材料的合适剂量(“治疗有效的量”)会依赖于，例如待治疗的病症， 病症的严重性和疗程，生物活性材料施用是用于预防还是治疗目的，以前的治疗， 患者的临床病史和对生物活性材料的反应，使用的生物活性材料的类型，主治医 师的判断力。生物活性材料可以适当地一次或一系列治疗中施用给患者，并从诊 断起任何时间施用给患者。生物活性材料可以作为单独治疗施用或结合治疗所述 病症有用的的其他药物或治疗施用。
通常建议，生物活性材料施用的治疗有效量的范围约为一次或多次施用在 0.00001(如在活的减毒病毒疫苗的情况)到50mg/kg的患者体重，而不管一次或 多次施用，例如，每日施用一次，使用的蛋白质的通常范围约为小于0.01ng/kg 到20mg/kg，更好0.1mg/kg到15mg/kg。但是，其他剂量范围可以使用。该治 疗的过程可通过常用技术容易监控。
本发明也包括增加干燥生物活性材料储存在升高温度时的“储存期”或储存稳 定性的方法。增加的储存稳定性可以通过用加速老化试验重获生物活性来确定。 本发明方法产生的干燥微粒组合物可储存在任何合适的温度。该组合物储存在约0 ℃到约80℃较佳。该组合物储存在约20℃到约60℃更佳。该组合物储存在室温 最佳。
本发明的组合物
本发明的组合物包括，如用于本发明工艺方法的悬浮液和溶液的制剂，保存在 有多羟基化合物和/或其他赋形剂的基中的质生物活性材料的稳定粉状微粒产品。 该组合物可以是，如适合于用高压气体或用近超临界流体喷雾以形成有改善稳定 性的干燥微粒的悬浮液或溶液(液体进料)。生物活性材料的悬浮液或溶液可以 包含，如多羟基化合物、聚合物，和/或表面活性剂。
用于干燥粉状微粒喷雾的悬浮液或溶液
制备本发明的干燥粉状微粒组合物的制剂可包括，如生物活性材料、聚合物、 氨基酸、多羟基化合物、表面活性剂，和/或缓冲剂。该制剂可以按照本发明的方 法处理以提供用于生物活性材料储存和施用的稳定组合物。例如，本发明的组合 物可以是流感病毒与蔗糖、HES、和聚乙二醇和聚丙二醇的嵌段共聚物(Pluronic) 的水性悬浮液，用于用近超临界二氧化碳喷雾干燥。
本发明的生物活性材料包括，如在存活体系中有可测到的生物活性的材料，用 于分析的生物细胞和分子，用于医疗的生物细胞和分子，用于研究的生物细胞和 分子，和/或类似物。例如，本发明组合物的生物活性材料包括蛋白质、肽、核酸、 细菌、细胞、抗体、酶、血清、疫苗、脂质体、病毒，和/或类似物。
本发明粉状微粒中的生物活性材料可以是，如在粉状微粒干燥时有高纯度和活 性，原因是在制备时使用的剪切应力减低，干燥温度低，和干燥时间短。生物活 性材料在粉状微粒中稳定是由于起始过程的降解低和组合物赋形剂的保护作用。 组合物中生物活性材料可以以高浓度重构而不降解是由于微粒的表面与体积的高 比率及组合物赋形剂提供的溶解增强作用。
喷雾干燥形成的本发明粉状微粒溶液或悬浮液包含，如量的范围约为少于0.1 ng/ml到200mg/ml，少于0.5mg/ml到150mg/ml，10mg/ml到80mg/ml，或50mg/ml 的本发明生物活性材料。本发明干燥粉状微粒中的生物活性材料的量的范围一般 约为，如少于0.01重量％到80重量％，40重量％到60-重量％，或50重量％。 重构组合物中生物活性材料的浓度范围通常约为，如少于0.1ng/ml到500mg/ml， 少于0.5mg/ml到400mg/ml，或1mg/ml。
生物活性材料可包括有脂质膜的复合材料，如有生物活性的，存活的或非存活 的，细胞、病毒、和/或脂质体。例如生物活性材料可包括疫苗、病毒、脂质体、 细菌、血小板和细胞。病毒生物活性剂包括，如流感病毒、副流感病毒、呼吸道 合胞病毒、单纯疱疹病毒、SARS病毒、冠状病毒家族成员、巨细胞病毒、和/或 Epstein-Bar病毒，它们在本发明的悬浮液或溶液中的量的范围约为103 TCID50/ml到1012TCID50/ml，或106TCID50/ml。病毒生物活性材料在悬浮液或 溶液中的量通常约为，少于1重量％；少于0.001重量％更佳；和少于0.0001重量 ％最佳。本发明的干燥粉状微粒组合物可提供的病毒量约为，如101TCID50/g到 不超过1012TCID50/g。干燥粉状微粒组合物可提供的病毒量约为，如101TCID50/g， 102TCID50/g，103TCID50/g，104TCID50/g，105TCID50/g，106TCID50/g，107 TCID50/g，108TCID50/g，109TCID50/g，1010TCID50/g，或1011TCID50/g。
本发明的多羟基化合物可以包括，如各种糖、碳水化合物和醇。例如，多羟基 化合物可包括非还原糖，蔗糖、海藻糖、山梨糖、松三糖、和/或蜜三糖。多羟基 化合物可包括，如甘露糖、麦芽糖、乳糖、阿拉伯糖、木糖、核糖、鼠李糖、半 乳糖和葡萄糖、甘露醇、木糖醇、赤藻醇、苏糖醇、山梨糖醇、甘油、L-葡萄糖 酸盐，和/或类似物。希望制剂是冻-融稳定的，多羟基化合物是在冷冻温度(如， -20℃)不结晶的较佳，因为在冷冻温度下结晶会使制剂中的生物活性材料不稳定。 悬浮液或溶液中使用的多羟基化合物的量的变化取决于生物活性材料的特性、多 羟基化合物的类型和预定的用途。但是，通常，多羟基化合物的最终浓度约为1 -40重量％；约1-20重量％更佳。在较佳实例中，悬浮液或溶液包含约10％蔗糖。
本发明的聚合物可包括，如各种碳水化合物、多肽、线型和支链的亲水分子。 例如，制剂的聚合物可包括氧化淀粉、羧甲基淀粉和羟乙基淀粉(HES)、右旋糖酐、 非重组人类血清白蛋白(HSA)，以及不水解和水解明胶、明胶、卵白蛋白、胶原蛋 白、硫酸软骨素、唾液酸化多糖、肌动蛋白、肌球蛋白、微管、动力蛋白、呋喃 甲基腺嘌呤、藻酸盐，和/或类似物。这些添加剂并不必须单独稳定生物活性材料 抗失活；它们还帮助在初次干燥、冻干、第二次干燥，和/或随后以固体状态储存 期间防止喷雾干燥材料的物理破坏。使用的HES的分子量为约100,000-300,000 较佳；约200,000更佳。通常，HES的浓度可以约为悬浮液或溶液重量的0.5- 10％；约1-5％更佳。较佳的制剂包含约5％的HES。
用于制备本发明组合物的悬浮液或溶液可包括，如有助于制剂成分的溶解性和 稳定性的一种或多种表面活性剂。本发明制剂中的表面活性剂的浓度范围约为 0.001重量％-5重量％，或0.01重量％-1重量％。表面活性剂包括，如非离 子洗涤剂，如聚乙二醇脱水山梨糖醇单月桂酸酯(Tween 20)、聚氧乙烯脱水山梨 糖醇单油酸酯(Tween 80)、和聚乙二醇和聚丙二醇的嵌段共聚物(Pluronic)等等。
合适的非离子表面活性剂的例子是烷基苯基烷氧化物、醇烷氧化物、脂肪胺烷 氧化物、聚氧乙烯甘油脂肪酸酯、蓖麻油烷氧化物、脂肪酸烷氧化物、脂肪酸酰 胺烷氧化物、脂肪酸聚二乙醇酰胺、羊毛脂乙氧基化物、脂肪酸聚二醇酯、异十 三烷醇、脂肪酸酰胺、甲基纤维素、脂肪酸酯、硅油、烷基聚苷、甘油脂肪酸酯、 聚乙二醇、聚丙二醇、聚乙二醇/聚丙二醇嵌段共聚物、聚乙二醇烷基醚、聚丙二 醇烷基醚、聚乙二醇/聚丙二醇醚嵌段共聚物和它们的混合物，聚丙烯酸酯和丙烯 酸接枝共聚物。其他非离子表面活性剂本身是本领域熟练技术人员所熟知的和在 文献中已经被记述的。较佳的物质是聚乙二醇、聚丙二醇、聚乙二醇/聚丙二醇嵌 段共聚物、聚乙二醇烷基醚、聚丙二醇烷基醚、聚乙二醇/聚丙二醇醚嵌段共聚物 和它们的混合物。更佳的表面活性剂包括聚氧乙烯和聚氧丙烯的混合物的聚合物 如Pluronic F68(由BASF提供)。
合适的离子表面活性剂的例子是烷基芳基磺酸盐、苯基磺酸盐、烷基硫酸盐、 烷基磺酸盐、烷基醚硫酸盐、烷基芳基醚硫酸盐、烷基聚二醇醚磷酸盐、聚芳基 苯基醚磷酸盐、烷基磺基琥珀酸盐、烯烃磺酸盐、链烷烃磺酸盐、石油磺酸盐、 氨基乙磺酸盐、肌氨酸盐、脂肪酸、烷基萘磺酸、萘磺酸、木素磺酸、磺化萘与 甲醛的缩合物或磺化萘与甲醛和苯酚的空合物，和如果合适，尿素、木质素-亚硫 酸盐废液，包括它们的碱金属，碱土金属，铵和胺盐，烷基磷酸盐、季铵化合物、 胺氧化物和甜菜碱和它们的混合物。较佳的物质包括Pluronic F68或Pluronic F188，聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯(即，Tween 20，由Sigma提供)的更佳。
氨基酸赋形剂可以存在，如增加稳定性，控制pH，影响重构速度，作为填充 剂，清除氧化性分子等。合适的氨基酸例子是精氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、组氨 酸、氨基乙酸、谷氨酸，和/或类似物。
缓冲剂在用于制备干燥粉状组合物的制剂中可以存在，如控制pH，增加稳定 性，影响成分溶解性，提供施用时的舒适性等，制剂pH可控制在约pH 3到约pH 10，约pH 6到约pH 8，或约pH 7.2的范围。较佳的缓冲剂常常是通常被认为对 生物活性材料施用的具体途径是安全的成对酸和缓冲阴离子的盐形式。用于本发 明的制剂和组合物的典型缓冲剂包括，如氨基酸、磷酸钾、磷酸钠、醋酸钠、柠 檬酸钠、琥珀酸钠、碳酸氢铵、碳酸盐等。通常，缓冲剂使用的摩尔浓度约为1mM 到2M，2mM到约1M较佳，和10mM到0.5M更佳，和25到50mM最佳。
有流感病毒的悬浮液制剂的例子包括以下内容。流感病毒在具有10％蔗糖，5％ 羟乙基淀粉(Fesnius)，2mM甲硫氨酸，50mM KH2PO4缓冲剂(pH 7.2)，和 0.1％Pluronic F-68的水性悬浮液中。流感病毒在具有10％蔗糖，5％羟乙基淀粉， 75mM KH2PO4缓冲剂(pH 7.2)，2mM甲硫氨酸，和0.01％Pluronic F-68的水性 悬浮液中。流感病毒在具有5％蔗糖，2％海藻糖，0.2％Pluronic-F-68，10mM甲硫氨 酸，2％精氨酸，2mM EDTA，和50mM KH2PO4缓冲剂(pH 7.2)的水性悬浮液中。
在一个实例中，制剂包含上述确认的试剂(即，生物活性材料，多羟基化合物， 表面活性剂和明胶)并基本上没有一种或多种防腐剂，如苄醇、苯酚、间甲酚、 氯丁醇和benethonium chloride。在另一个实例中，制剂中可包括防腐剂，特别 当该制剂是多剂量制剂时。
一种或多种药物上可接受的载体、赋形剂、或稳定剂如Remington’s Pharmaceutical Science 16th Edition，Osol，A.Ed(1980)所描述的可包含在制 剂中，只要它们不对制剂所需的特性有不利影响。可接受的载体、赋形剂、或稳 定剂在使用的剂量和浓度对接受者是无毒的并包括：另外的缓冲剂；助溶剂；成 盐抗衡离子如钾和钠；抗氧化剂，如甲硫氨酸，N-乙酰半胱氨酸，或抗坏血酸； 螯合剂如EDTA或EGTA。氨基酸，如精氨酸和甲硫氨酸，可包含在制剂中。制剂 中存在的精氨酸的量的范围可约为0.1重量％到5重量％。制剂中存在的甲硫氨 酸的浓度范围可约为1mM到50mM或10mM。制剂中存在的甘油的浓度范围可约为 0.1重量％到5重量％，或1重量％。制剂中存在的EDTA的浓度范围可约为1mM 到10mM，或5mM。
本发明包括包含容器的制造制品，该容器容纳通过喷雾干燥加压气体或近超临 界气体与生物活性材料、多羟基化合物、聚合物添加剂和表面活性剂的悬浮液或 溶液组成的混合物制备的干燥粉状微粒。在本发明的一个实例中，提供了含有容 纳本发明药物制剂的容器的制造制品并任选地提供了使用说明。例如，合适的容 器包括瓶、小瓶、泡罩包装物和注射器。该容器可以由各种材料如玻璃或塑料制 成。容器的例子是3-20cc一次使用的玻璃小瓶。或者，对于多剂量制剂，容器 可以是3-100cc的玻璃小瓶。容器容纳制剂，在容器上的或与容器有关的标签可 指示使用说明。制造制品还可包含从商业上和使用者观点上需要的其他材料，包 括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针头、注射器和带有使用说明的包装插入物。
本文描述的粉状微粒是稳定的，即，它们保留了生物活性和并且化学和/或物 理上是稳定的。通过把粉状微粒在升高的温度(如，37℃)中进行老化测试并测 试它们的生物活性、化学和/或物理稳定性来测试粉状微粒稳定性。这些研究的结 果显示使用本发明方法在55℃干燥的这些微粒在25℃中至少九个月是稳定的(见 图8)。在35℃干燥的微粒在25℃中至少约13个月是稳定的，在4℃中2年或更 长时间是稳定的。甚至使用高浓度的生物活性材料时该粉状微粒也是稳定的。因 此，这些干燥微粒是有益的，因为它们可在室温或室温以上的温度中长时间运输 盐和储存。
本发明的设备
本发明的设备可包括，如容纳悬浮液或溶液的容器(第一室)；容纳高压气体 和/或近超临界流体的压力容器(第二室)；有控制从第一和第二室到混合室的流 量的控制阀的管道；有毛细管限流器的喷嘴，混合物可经该喷嘴喷到微粒形成容 器中；和对来自微粒形成容器的微粒提供初次和/或第二次干燥的干燥气流。第二 次微粒干燥可包括，如在真空中沉降到温暖的表面，冻干冷冻的微粒，悬浮在干 燥气体旋涡中，和/或悬浮在干燥气体流化床中。
例如，如图9所示，设备可包括如引导小滴薄雾进入喷雾干燥器的喷雾喷嘴。 在第一室30内的病毒悬浮液可用HPLC泵31通过第一管道32泵送到T交叉点并 泵入喷嘴34的混合室33。在第二室的加压气体或近超临界CO2流体可用能够提供 选择压力(如，约250-15000psi)的高压泵36经过第二管道37泵送到T交叉 点与混合室中的悬浮液混合。混合物可经过毛细管限流器38从混合室喷出以形成 细小滴的喷雾，该细小滴在微粒形成蒸气室39中干燥成微粒。由风扇40驱动的 干燥气体，可替代来自喷雾的气体和溶剂以提供对微粒的初次干燥，同时如携带 微粒到第二干燥室41。来自微粒形成室的初次干燥的微粒在沉降到微粒收集容器 42的前后可通过接触干燥气体经历第二次干燥。使喷嘴可适应与各种喷雾干燥器 一起操作并可改变比例以调节最高每小时数升的喷雾处理。设备的喷雾干燥器组 件可从，如由Buchi(Brinkmann Instruments)生产的实验室台式喷雾干燥器改 装。
设备的某些室和容器可有许多官能或可选择的功能以实施本发明的方法。例 如，在某些实例，微粒形成容器也可以作为第二干燥室，和/或微粒收集室。任选 地，第二干燥室可包含旋涡室，流化床室，微粒按分开室，聚合物涂覆室，和/ 或微粒收集室。
液体和气体
本发明的设备可有容纳和传送高压气体或近超临界流体，和悬浮液或溶液到混 合室的室和管道。喷雾小滴，如通过接触干燥气体，可经历初次和第二次干燥。
高压气体和/或近超临界流体可以是上文的方法部分和组合物部分所描述的， 如氮、二氧化碳、六氟化硫、氯氟烃、氟碳化合物、一氧化二氮、氙、丙烷、正 戊烷、乙醇、氮、水，和/或类似物。调节剂，如某些醇可溶解在超临界流体中以 调整溶剂，流体的临界点和/或膨胀特性。
悬浮液或溶液可包括生物活性材料和多羟基化合物。生物活性材料的例子包括 蛋白质、肽、核酸、细菌、细胞、抗体、酶、血清、疫苗、脂质体和病毒。设备 的悬浮液或溶液中多羟基化合物包括，如海藻糖、蔗糖、山梨糖、松三糖、甘油、 果糖、甘露糖、麦芽糖、乳糖、阿拉伯糖、木糖、核糖、鼠李糖、Palactose、葡 萄糖、甘露醇、木糖醇、赤藻醇、苏糖醇、山梨糖醇、和蜜三糖。
设备的悬浮液或溶液中可包括添加的赋形剂，如聚合物和表面活性剂。聚合物 可以是，如淀粉、淀粉衍生物、羧甲基淀粉、羟乙基淀粉(HES)、右旋糖酐、人类 血清白蛋白(HSA)、和/或明胶。表面活性剂可以是，如聚乙二醇脱水山梨糖醇单 月桂酸酯、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯、聚乙二醇和/或聚丙二醇的嵌段共聚 物。
设备硬件
本发明的设备可包括，如容纳悬浮液或溶液的第一室，容纳高压气体和/或近 超临界流体的第二室，有混合室的喷嘴和有出口孔的毛细管限流器，微粒形成室， 和第二干燥室。悬浮液或溶液可在压力下通过第一管道泵送入混合室与通过第二 管道泵送入混合室的近超临界流体混合。该混合物可从喷嘴以薄雾喷入微粒形成 室，在微粒形成室与干燥气流接触开始干燥。第二次干燥可通过接触温热的室壁 和/或在微粒形成容器和/或第二干燥室中与干燥气流接触来进行。
在较佳实例中，微粒形成容器和/或第二干燥室被置于环境控制室内。环境控 制室的受控湿度和温度可以是干燥气体的来源。从环境控制室进入微粒形成室内 的气体可与毛细管限流器射出的成为细雾的小滴混合。细雾在用干燥气流传送到 第二干燥室，如旋风旋涡室之前在微粒形成容器内可以被部分干燥(即，从小滴 干燥成微粒)。干燥气流可持续从气体出口回到环境控制室，在该室气体被再调 节。设备可进一步包括从气体和/或环境控制室内除去水分的干燥剂或冷凝器系 统。热交换器可用于控制再循环气体的温度和防止环境控制室内的温度过分增高。 通常，该室是通过从液氮储器引入液氮来冷却，液氮储器通过任选的温度控制器 来控制，该温度控制器可自动计量液氮以提供环境控制室内相对不变的温度。任 选地，环境控制室可通过致冷热交换器(蒸发器)来冷却。环境控制室通常可通 过用阀控或压力控制的压力控制口排空到环境室压力。喷雾干燥到降低水分控制 气体中可提供喷雾小滴与干燥室环境之间的大的水分差别。其作用是可减少初次 干燥状态的输入热要求。
第一和第二室可加压，和/或在管道中可使用泵，以将高压气体和/或近超临界 流体，和/或悬浮液或溶液传送到混合室。传送速度可使用本领域中通常使用的方 式来控制，如控制泵的速度或控制管道中的阀。泵可以是本领域知晓的任何类型， 如蠕动泵、旋转泵、隔膜泵、活塞泵等。阀可以是本领域知晓的可限制加压流体 流量的任何合适类型，包括，如球和阀座、隔膜、针。通常，第二容器是加压、 致冷和/或隔热以保持加压气体或流体处于接近临界条件。
混合室可为，如在管道流入口和毛细管限流器出口孔之间扩大的空间。管道通 常用来使加压气体和/或近超临界流体和悬浮液或溶液相互注入对方中，以增强混 合。管道可在T交叉点交汇，流体在此迎头相遇，或在交叉点处流体以小于180 度交汇，如第一管道和/或第二管道以与混合室中流体轴小于90度的角度引导流 体。流体可以不直接汇合，如有偏移，产生涡流、旋涡或湍流，由于这可以促进 更彻底的混合和产生更多单分散性的气-液乳液，这些是本领域熟练技术人员知晓 的。室的主体可有长的长径比以增加超临界流体与悬浮液或溶液之间的接触表面。 混合室可有通道结构，包括挡板、珠、通道、障碍物、缩颈，和/或类似物，以增 强高压气体和/或近超临界流体和悬浮液或溶液的混合。混合室可以是内径超过毛 细管限流器内径的管道。混合室可以是喷嘴的一部分，或设备的单独组件。
毛细管限流器可以是，如对流体流提供限制的管道以帮助在混合室中维持高压 或接近超临界的条件。毛细管限流器可以有，如高压气体/近超临界流体和悬浮液 或溶液的混合物可被喷出的出口孔。毛细管限流器内径和出口孔的大小可影响喷 雾中产生的小滴的大小；由较大出口喷雾通常形成较大的小滴(最终是微粒)。 通常，毛细管限流器的长度约为2英寸到6英寸，内径和/或出口直径约为50um 或更少，到1000um，50um到500um，或100um。
混合物从喷嘴喷出到微粒形成室，在该室混合物膨胀成气体和碎裂的流体进料 小滴。干燥气体可通入微粒形成室以替代小滴中的混合物气体(膨胀气体和蒸发 的溶剂)。干燥气体可接触小滴以从中蒸发另外的溶剂形成微粒。干燥气体可携 带小滴和/或微粒到其他室用于按本发明的方法处理。例如，初次干燥微粒可在微 粒形成室中悬浮于干燥气流中，或被带到分离室中进行第二次干燥、按大小、涂 覆、和/或收集。干燥气体可以是，如在粉状微粒的玻璃转化温度以下的温度的惰 性气体，如氮气。设备可包括控制干燥气体温度，如低于约90℃，约在25℃到80 ℃，约在30℃到50℃，或约35℃，的热交换器。在本发明方法中较佳的干燥气 体(进入气体)温度是低于65℃，或约在30℃和55℃之间，或约35℃。设备可 包括降低干燥气体的相对湿度、溶剂含量，的冷凝器或干燥器，所以气体可被再 循环或送入废气中而会危害环境。
微粒形成室或第二干燥容器可适合于设置旋风旋涡室。干燥气流携带的微粒可 以，如通过偏置口从一端进入长的圆柱或圆锥室。该气体可从室的入口末端到出 口末端的螺旋路径上旋转许多次。该路径在微粒持续失去残余水分的同时从气体 和室壁上接受温热的情况下可花费许多时间。
微粒形成容器或第二干燥容器可适合于设置流化床室。悬浮于干燥气流中的微 粒可被传送到圆柱形室的底部的进口，在那里它们可悬浮于干燥气体的上升气流 中。任选地，在来自底部的干燥气体将微粒悬浮在流化床中之前可在室底部收集 微粒。微粒在残余水分持续失去的同时，可以流化床形式保持悬浮相当长时间。 在流化床室可发生分离大小，小微粒在废气中从室顶部排出而损失，大微粒沉降 到底部。如通过喷出聚合物溶液薄雾到流化床中，在微粒上干燥为涂层，可将聚 合物涂层可包覆微粒。
微粒形成室，或第二干燥容器，可被适合于设置收集干燥粉状微粒的收集容器。 例如，在传送管道中流动的悬浮于气体的微粒可被引直径明显大于传送管道的的 室中。气体的速度在较大室内可减慢以使微粒落到室底而气体排入上部废气。微 粒可积聚在室底部的可移动容器中，在那里微粒可被加嘏以供使用、包装或储存。
本发明包括含有便于本发明方法实施的设备部件和加工材料的成套装备。本发 明的成套装备可以是含有本发明设备部件的容器，如加压气体或近超临界流体的 容器，悬浮液或溶液成分(如生物活性材料或多羟基化合物、聚合物、氨基酸、 表面活性剂、和/或缓冲剂的加工溶液)，喷嘴，收集容器，和/或类似物，以用 于实施本发明干燥微粒组合物的制备方法。该成套装备可以是基本上可消毒的， 如由可耐受高压灭菌器中的温度和湿度，耐受电离辐射，和/或耐受微波炉产生的 辐射的材料制成。本发明的成套装备可包括指导使用本发明的设备、设备部件、 和/或加工材料以制备生物活性材料的干燥微粒的说明材料。
实施例
下列实施例是提供说明，而不是对提出权利要求的本发明进行限制。
实施例1
用于流感悬浮液喷雾的制剂
下文所述制剂是按照本发明方法使用B/Harbin流感病毒或安慰剂制备的。PH 用氢氧化钠或氢氧化钾调节。用于喷雾干燥减毒流感病毒的有用制剂可包括，如 约10％到20％的海藻糖，约40％到约5％的蔗糖，约1％山梨糖醇，约5％到2％的HES， 约2％的卵白蛋白，约5％到2％明胶，约1％PVP，约2％到约0.01％Pluronic F68，约 0.03％Tween20，约10mM到2mM的甲硫氨酸，约5％到约0.5％的精氨酸，约23mM EDTA， 约0.5％到约0.05％的甘油，约10％到约1％谷氨酸盐，和/或约10mM N-乙酰半胱氨 酸。
多羟基化 合物 聚合物 添加剂 表面活性剂 其他 AV020 5％海藻糖 5％HES 0.01％ Pluronic F68 75mM，pH7.2KPO4缓冲剂， 2mM甲硫氨酸 AV021 5％海藻糖 5％HES 0.03％ Tween20 75mM，pH7.2KPO4缓冲剂， 2mM甲硫氨酸 AV022 5％海藻糖 5％HES 0.05％ Pluronic F68 75mM，pH7.2KPO4缓冲剂， 2mM甲硫氨酸 AV023a 10％蔗糖 5％HES 0.01％ Pluronic F68 75mM，pH7.2KPO4缓冲剂， 10mM N-乙酰半胱氨酸 AV023 10％蔗糖 5％HES 0.01％ Pluronic F68 75mM，pH7.2KPO4缓冲剂， 2mM甲硫氨酸，2mM EDTA，0.5％ 精氨酸 AV024 10％蔗糖 5％HES 0.01％ Pluronic F68 75mM，pH7.2KPO4缓冲剂， 2mM甲硫氨酸，1％PVP，0.5％ 精氨酸 AV025 5％蔗糖； 2％海藻糖 -- 0.05％ Pluronic F68 50mM，pH7.2KPO4缓冲剂， 2mM EDTA， 2％精氨酸 AV026 5％蔗糖； 2％海藻糖 2％HES 0.05％ Pluronic F68 50mM，pH7.2KPO4缓冲剂， 2mM EDTA， 2％精氨酸 AV027 5％蔗糖； 2％海藻糖 -- 0.05％ Pluronic F68 50mM，pH7.2KPO4缓冲剂， 10mM甲硫氨酸，2mM EDTA，2％ 精氨酸 AV028 5％蔗糖； 2％海藻糖 2％HES 0.05％ Pluronic F68 50mM，pH7.2KPO4缓冲剂， 10mM甲硫氨酸，2mM EDTA，2％ 精氨酸
AV029 5％蔗糖； 2％海藻糖 -- 0.05％ Pluronic F68 50mM，pH6.8KPO4缓冲剂， 10mM甲硫氨酸，2mM EDTA，2％ 精氨酸 AV030 5％蔗糖； 2％海藻糖 2％HES 0.05％ Pluronic F68 50mM，pH7.2KPO4缓冲剂， 10mM甲硫氨酸，2mM EDTA，2％ 精氨酸 AV031 2％海藻糖 2％HES 0.05％ Pluronic F68 50mM，pH7.2KPO4缓冲剂， 2mMEDTA，0.2％硫代硫酸钠， 2％精氨酸 AV032 5％蔗糖； 2％海藻糖 2％HES 0.05％ Pluronic F68 50mM，pH7.2KPO4缓冲剂， 10mM甲硫氨酸，2mM EDTA，2％ 精氨酸 AV033 5％蔗糖； 2％海藻糖 0.05％ Pluronic F68 50mM，pH7.2KPO4缓冲剂， 10mM甲硫氨酸，2mM EDTA，2％ 精氨酸 AV034 5％蔗糖； 2％海藻糖 2％HES 50mM，pH7.2KPO4缓冲剂， 10mM甲硫氨酸，2mM EDTA，2％ 精氨酸 AV035 10％蔗糖； 10％海藻 糖 100mM，pH7.2KPO4缓冲剂， 5mM TMAO， AV036 10％蔗糖； 10％海藻 糖 100mM，pH7.2KPO4缓冲剂， 5mM TMAO， 0.5％甘油 AV037 10％蔗糖； 10％海藻 糖 100mM，pH7.2KPO4缓冲剂， 5mM TMAO， 0.5％甘油
AV038 10％蔗糖； 10％海藻 糖 100mM，pH7.2KPO4缓冲剂， 10mM N-乙酰半胱氨酸，0.5％ 甘油 AV039 5％蔗糖； 2％海藻糖 2％卵白 蛋白 0.05％ Pluronic F68 50mM，pH7.2KPO4缓冲剂， 10mM甲硫氨酸，10mM N-乙酰 半胱氨酸，2mM EDTA，2％精氨 酸 AV040 5％蔗糖； 2％海藻糖 2％卵白 蛋白 0.05％ Pluronic F68 50mM，pH7.2KPO4缓冲剂， 10mM甲硫氨酸，2mM EDTA，2％ 精氨酸 AV041 5％蔗糖； 2％海藻糖 2％明胶 (K&K) 0.05％ Pluronic F68 50mM，pH7.2KPO4缓冲剂， 10mM甲硫氨酸，2mM EDTA，2％ 精氨酸 AV042 5％蔗糖； 2％海藻糖 0.05％ Pluronic F68 50mM，pH7.2KPO4缓冲剂， 10mM甲硫氨酸，5mM TMAO； AV043 5％蔗糖； 2％海藻糖 2％ Pluronic F68 50mM，pH7.2KPO4缓冲剂， 10mM甲硫氨酸，2mM EDTA，2％ 精氨酸 AV044 5％蔗糖； 2％海藻糖 0.05％ Pluronic F68 50mM，pH7.2KPO4缓冲剂， 2mM EDTA，2％精氨酸；1％L-谷 氨酸盐 AV045 5％蔗糖； 2％海藻糖 0.1％ Pluronic F68 100mM，pH7.2KPO4缓冲剂， 10mM N-乙酰半胱氨酸，2mM EDTA， 2％精氨酸 AV046 5％蔗糖； 2％海藻糖 0.1％ Pluronic F68 100mM，pH7.2KPO4缓冲剂， 10mM N-乙酰半胱氨酸，5mM TMAO；2mM EDTA，2％精氨酸； 0.05％甘油
AV047 5％蔗糖； 2％海藻糖 0.2％ Pluronic F68 50mM，pH7.2KPO4缓冲剂， 10mM甲硫氨酸，2mM EDTA，2％ 精氨酸 AV048 5％蔗糖； 2％海藻糖 0.05％ Pluronic F68 50mM，pH7.2KPO4缓冲剂， 10mM甲硫氨酸，2mM EDTA，2％ 精氨酸 AV049 5％蔗糖； 2％海藻糖 0.05％ Pluronic F68 50mM，pH7.2KPO4缓冲剂， 10mM甲硫氨酸，2mM EDTA，2％ 精氨酸 AV050 5％蔗糖； 2％海藻糖 0.05％ Pluronic F68 50mM，pH7.2KPO4缓冲剂， 10mM甲硫氨酸，2mM EDTA，2％ 精氨酸 AV051 5％蔗糖； 2％海藻糖 0.05％ Pluronic F68 50mM，pH7.2KPO4缓冲剂， 10mM甲硫氨酸，2mM EDTA，2％ 精氨酸 AV052 5％蔗糖； 2％海藻糖 0.05％ Pluronic F68 50mM，pH7.2KPO4缓冲剂， 10mM甲硫氨酸，2mM EDTA，2％ 精氨酸 AV053 5％蔗糖； 2％海藻糖 50mM，pH7.2KPO4缓冲剂， 10mM甲硫氨酸，2mM EDTA，2％ 精氨酸 AV054 5％蔗糖； 2％海藻糖 2％HES 0.05％ Pluronic F68 50mM，pH7.2KPO4缓冲剂， 10mM甲硫氨酸，2mM EDTA，2％ 精氨酸 AV055 5％蔗糖； 2％海藻糖 0.05％ Pluronic F68 50mM，pH7.2KPO4缓冲剂， 10mM甲硫氨酸，2mM EDTA， AV056 5％蔗糖； 2％海藻糖 0.05％ Pluronic F68 50mM，pH7.2KPO4缓冲剂， 10mM甲硫氨酸，2％精氨酸
AV057 5％蔗糖； 2％海藻糖 50mM，pH7.2KPO4缓冲剂， 10mM甲硫氨酸，2mM EDTA，2％ 精氨酸 AV058 2％海藻糖 0.05％ Pluronic F68 50mM，pH7.2KPO4缓冲剂， 10mM甲硫氨酸，2mM EDTA，2％ 精氨酸 AV059 5％蔗糖； 0.05％ Pluronic F68 50mM，pH7.2KPO4缓冲剂， 10mM甲硫氨酸，2mM EDTA，2％ 精氨酸 AV060 5％蔗糖； 2％海藻糖 0.05％ Pluronic F68 50mM，pH7.2KPO4缓冲剂， 2mM EDTA， 2％精氨酸 AV061 5％蔗糖； 2％海藻糖 0.05％ Pluronic F68 50mM，pH7.2KPO4缓冲剂， 10mM甲硫氨酸，2mM EDTA，2％ 精氨酸 AV062 6％蔗糖； 1％山梨糖 醇 0.05％ Pluronic F68 50mM，pH7.2KPO4缓冲剂， 10mM甲硫氨酸，2mM EDTA，2％ 精氨酸 AV063 7％蔗糖； 0.05％ Pluronic F68 50mM，pH7.2KPO4缓冲剂， 10mM甲硫氨酸，2％精氨酸 AV064 6％蔗糖； 1％山梨糖 醇 0.05％ Pluronic F68 50mM，pH7.2KPO4缓冲剂， 10mM甲硫氨酸，2mM EDTA，2％ 精氨酸 AV065 10％蔗糖； 2％海藻糖 5％HES 0.2％ Pluronic F68 50mM，pH7.2KPO4缓冲剂， 10mM甲硫氨酸，2mM EDTA，2％ 精氨酸 AV066 5％蔗糖； 2％海藻糖 2％HES 50mM，pH7.2KPO4缓冲剂， 2％精氨酸
AV067 10％蔗糖； 2％HES 50mM，pH7.2KPO4缓冲剂， 5％精氨酸 AV068 10％蔗糖； 2％HES 50mM，pH7.2KPO4缓冲剂， 1mM ZnCl2； 5％精氨酸 AV070 40％蔗糖； 5％明胶 (K&K) 0.02％ Pluronic F68 25mM，pH7.2KPO4缓冲剂， 10mM甲硫氨酸； 10％L-谷氨酸盐 AV071 40％蔗糖； 5％明胶 (K&K) 0.02％ Pluronic F68 25mM，pH7.2KPO4缓冲剂， 10mM甲硫氨酸； AV047 W/HES 5％蔗糖； 2％海藻糖 2％HES 0.02％ Pluronic F68 50mM，pH7.2KPO4缓冲剂， 10mM甲硫氨酸，2mM EDTA；2％ 精氨酸 AV069 10％蔗糖； 2％HES 50mM，pH7.2KPO4缓冲剂， 1mM ZnCl2； 5％精氨酸 AV047- P 5％蔗糖； 2％海藻糖 0.02％ Pluronic F68 50mM，pH7.2柠檬酸盐缓冲 剂，10mM甲硫氨酸，2mM EDTA； 2％精氨酸 AV047 柠檬酸 盐 5％蔗糖； 2％海藻糖 0.02％ Pluronic F68 50mM，pH7.2柠檬酸盐缓冲 剂，10mM甲硫氨酸，2mM EDTA； 2％精氨酸
可以理解本文描述的实施例和实例只用于说明，本领域熟练技术人员可提出其 有关的各种改进和变化是包括在本申请的范围和所附的权利要求书的范围内的。
上述发明已被详细描述用于阐述和理解，本领域熟练技术人员通过阅读本文公 开内容可清楚知晓在不脱离本发明真正范围下可进行形式和细节上的各种改变。 例如，上述制剂、技术和设备可以各种组合使用。本申请引用的所有文献、专利、 专利申请，和/或其他文件被全文引入作为参考，就象每一份文献、专利、专利申 请，和/或其他文件被单独引入作为参考。
相关申请的交叉参考
本发明申请涉及由Vu Truong-Le在2002年4月11日提交的美国临时申请 60/372,192，“使用超临界流体喷雾干燥治疗剂的方法”(“Method of Spray-Drying Therapeutic Agents Using Supercritical Fluids”)，和由Vu Truong-Le在2003 年2月14日提交的美国临时申请60/447,683，“喷雾干燥保存生物活性材料” (“Preservation of Bioactive Materials by Spray Drying”)。在先申请的 全文公开内容被本文引用作为参考。
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