一种鹅血抗氧化小分子酶解物纳米脂质体的制备方法
阅读：74发布：2023-03-10
专利汇可以提供一种鹅血抗氧化小分子酶解物纳米脂质体的制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种鹅血抗 氧 化小分子酶解物纳米脂质体的制备方法，属鹅血副产物深加工技术领域。本发明以鹅血为原料，分离鹅血血红蛋白，然后利用 碱 性蛋白酶，通过工艺优化降解大分子 蛋白质 ，富集具有抗氧化活性的多肽以及 氨 基酸，同时通过逐级分离得到小于1KD的小分子活性物质，然后利用磷脂、胆固醇和吐温80包埋小分子活性物质制得到纳米脂质体。该脂质体可以有效地防止外界环境对鹅血抗氧化小分子酶解物的破坏，提高其 稳定性 ，同时提高了鹅血蛋白的消化吸收率，并使其活性成分在胃肠环境分步缓慢释放，充分发挥其生理功能。本发明降低了鹅血直接排放对环境产生的污染问题，使鹅血得到高附加值利用，并可进行工业化生产。，下面是一种鹅血抗氧化小分子酶解物纳米脂质体的制备方法专利的具体信息内容。
1.一种鹅血抗氧化小分子酶解物纳米脂质体的制备方法；其特征在于：它包括如下步骤：
1）鹅血血红蛋白分离：
将新鲜鹅血进行离心分离，并用5倍体积的生理盐水洗涤下层分离物并收集，在收集的下层分离物中加入蒸馏水，定容至原鹅血体积；
将分离处理液进行超声细胞破碎，释放出细胞内的蛋白质，超声功率为250w，时间为12min；
离心过滤：将超声破碎后的混合液进行离心分离然后过滤得到鹅血红蛋白；
2）酶解处理：
将前处理得到的鹅血血红蛋白用蒸馏水调整浓度至6%，pH值为10.0，然后在50℃下预热5min，然后添加6000U/g的碱性蛋白酶，在50℃条件下避光酶解5.0h，转速90r/min），之后
100℃灭酶10分钟，离心取上清液即为鹅血酶解液；
3）超滤分离：
将鹅血酶解液依次通过10KD, 3KD，1KD的超滤离心分离，离心条件为5000g/30min，收集最终组分得到鹅血抗氧化小分子酶解物备用，同时分析其抗氧化能力；
4）纳米脂质体的制备：
取磷脂1g，胆固醇0.125g，加乙醚30ml溶解，得到有机相；鹅血抗氧化小分子酶解物
1.5 mL加8.5mL PBS水得到内水相；将内水相与有机相混合均匀， 超声冰浴处理5min，功率为400w；
将超声处理后的混合液快速倒入旋转蒸发仪样品室进行蒸发浓缩，水浴温度为35℃，真空度为0.005MPa, 待旋转蒸发仪壁上形成一层膜后，将吐温80 0.5g与外水相20ml混合 加到旋转蒸发仪样品室，将真空度提高到0.01MPa旋转溶解，待旋转蒸发仪样品室壁上的膜都溶于PBS时收集溶液；
均质处理：将收集到的溶液均质处理2次，均质压力为30 MPa，时间10 s；得到的即为鹅血抗氧化小分子酶解物纳米脂质体。
一种鹅血抗氧化小分子酶解物纳米脂质体的制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种鹅血抗氧化小分子酶解物纳米脂质体的制备方法，属鹅血副产物深加工技术领域。
背景技术
[0002] 鹅血是一种高蛋白质资源，蛋白质含量高达19%，其中血红蛋白含量约为12.99 g/100 mL占全血蛋白的2/3。而血红蛋白含有高活性SOD，以及水禽所特有的重量缺失型免疫球蛋白IgY(△Fc)，这些物质能清除体内自由基、增强机体免疫功能。以鹅血制备抗氧化水解物，既可合理利用鹅血蛋白质资源，又降低了直接排放对环境的污染。利用鹅血作为原料制备抗氧化多肽，可有效提高鹅血水解物中抗氧化物的含量，增加抗氧化效果。但由于鹅血抗氧化小分子酶解物本身性质不稳定，见光、氧气容易分解，而且酶解产生抗氧化肽的同时也产生了疏水性多肽，有着令人难以忍受的苦味。抗氧化肽直接口服还要面临着在消化道最初阶段被分解的问题。
发明内容
[0003] 本发明的目的在于：提供一种可有效提高鹅加工副产物的利用价值以及附加值；解决现有鹅血利用率低和环境污染的问题，进而提高了鹅血蛋白的附加值、消化吸收率以及功能特性的鹅血抗氧化小分子酶解物纳米脂质体的制备方法。
[0004] 本发明的技术方案是：一种鹅血抗氧化小分子酶解物纳米脂质体的制备方法，其特征在于：它包括如下步骤：
1）鹅血血红蛋白的分离：
将新鲜鹅血进行离心分离（3500r/min，15min），并用5倍体积的生理盐水（0.9%）洗涤下层分离物并收集，在收集的下层分离物中加入蒸馏水，定容至原鹅血体积。
1）鹅血血红蛋白的分离：
将新鲜鹅血进行离心分离（3500r/min，15min），并用5倍体积的生理盐水（0.9%）洗涤下层分离物并收集，在收集的下层分离物中加入蒸馏水，定容至原鹅血体积。
[0005] 将分离处理液进行超声细胞破碎，以释放出细胞内的蛋白质，超声功率为250w，时间为12min。
[0006] 离心过滤。将超声破碎后的混合液进行离心分离（3500r/min，10min）然后过滤得到鹅血红蛋白。
[0007] 2）酶解处理：将前处理得到的鹅血红蛋白用蒸馏水调整浓度至6%，pH值为10.0，然后在50℃下预热
5min，然后添加6000U/g的碱性蛋白酶，在50℃条件下避光酶解5.0h（转速90r/min），之后
100℃灭酶10分钟，离心（3000r/min，10min）取上清液即为鹅血酶解液。
5min，然后添加6000U/g的碱性蛋白酶，在50℃条件下避光酶解5.0h（转速90r/min），之后
100℃灭酶10分钟，离心（3000r/min，10min）取上清液即为鹅血酶解液。
[0009] 4）纳米脂质体的制备： 取磷脂1g，胆固醇0.125g，加乙醚30ml溶解，得到有机相。鹅血抗氧化小分子酶解物1.5 mL加8.5mL PBS水得到内水相。将内水相与有机相混合均匀， 超声冰浴处理5min，功率为400w。
[0010] 将超声处理后的混合液快速倒入旋转蒸发仪样品室进行蒸发浓缩，水浴温度为35℃，真空度为0.005MPa, 待旋转蒸发仪壁上形成一层膜后，将吐温80 0.5g与外水相20ml混合 加到旋转蒸发仪样品室，将真空度提高到0.01MPa旋转溶解，待旋转蒸发仪样品室壁上的膜都溶于PBS时收集溶液。
[0011] 均质处理。将收集到的溶液均质处理2次，均质压力为30 MPa，时间10 s。得到的即为鹅血抗氧化小分子酶解物纳米脂质体。
[0013] 新鲜鹅血：当地鹅市场定点采集。碱性蛋白酶、大豆卵磷脂、胆固醇、吐温80、无水乙醚、磷酸缓冲溶液。实验用水为蒸馏水。
[0015] C、准备实验设备表一
D、鹅血抗氧化小分子酶解物脂质体的加工流程
原料→分离血红蛋白→酶解→超滤分级→脂质体制备→均质
鹅血血红蛋白的分离：
将新鲜鹅血进行离心分离（3500r/min，15min），并用5倍体积的生理盐水（0.9%）洗涤下层分离物并收集，在收集的下层分离物中加入蒸馏水，定容至原鹅血体积。
D、鹅血抗氧化小分子酶解物脂质体的加工流程
原料→分离血红蛋白→酶解→超滤分级→脂质体制备→均质
鹅血血红蛋白的分离：
将新鲜鹅血进行离心分离（3500r/min，15min），并用5倍体积的生理盐水（0.9%）洗涤下层分离物并收集，在收集的下层分离物中加入蒸馏水，定容至原鹅血体积。
[0016] 将分离处理液进行超声细胞破碎，释放出细胞内的蛋白质，超声功率为250w，时间为12min。
[0017] 离心过滤。将超声破碎后的混合液进行离心分离（3500r/min，10min）然后过滤得到鹅血红蛋白。
[0018] 酶解将前处理得到的鹅血红蛋白用蒸馏水调整浓度至6%，pH值为10.0，然后在50℃下预热
5min，然后添加6000U/g的碱性蛋白酶，在50℃条件下避光酶解5.0h（转速90r/min），之后
100℃灭酶10分钟，离心（3000r/min，10min）取上清液即为鹅血酶解液。
5min，然后添加6000U/g的碱性蛋白酶，在50℃条件下避光酶解5.0h（转速90r/min），之后
100℃灭酶10分钟，离心（3000r/min，10min）取上清液即为鹅血酶解液。
[0019] 超滤分离：将鹅血酶解液依次通过10KD, 3KD，1KD的超滤离心分离，离心条件为5000g/30min，收集最终组分得到鹅血抗氧化小分子酶解物备用，同时分析其抗氧化能力。
[0020] 纳米脂质体的制备： 取磷脂1g，胆固醇0.125g，加乙醚30ml溶解，得到有机相。鹅血抗氧化小分子酶解物1.5 mL加8.5mL PBS水得到内水相。将内水相与有机相混合均匀， 超声冰浴处理5min，功率为400w。
[0021] 将超声处理后的混合液快速倒入旋转蒸发仪样品室进行蒸发浓缩，水浴温度为35℃，真空度为0.005MPa, 待旋转蒸发仪壁上形成一层膜后，将吐温80 0.5g与外水相20ml混合 加到旋转蒸发仪样品室，将真空度提高到0.01MPa旋转溶解，待旋转蒸发仪样品室壁上的膜都溶于PBS时收集溶液。
[0022] 均质处理。将收集到的溶液均质处理2次，均质压力为30 MPa，时间10 s。得到的即为鹅血抗氧化小分子酶解物纳米脂质体。
[0023] 纳米脂质体工艺的研究磷脂与胆固醇对脂质体基本特性的影响
取磷脂，胆固醇（比例为10:1、8:1、6:1、4:1、2:1），加乙醚30ml溶解，得到有机相。鹅血抗氧化小分子酶解物1.5 mL加8.5mL PBS水得到内水相。将内水相与有机相混合均匀， 超声冰浴处理5min，功率为400w。将超声处理后的混合液快速倒入旋转蒸发仪样品室进行蒸发浓缩，水浴温度为35℃，真空度为0.005MPa, 待旋转蒸发仪壁上形成一层膜后，将吐温80
0.5g与外水相20ml混合 加到旋转蒸发仪样品室，将真空度提高到0.01MPa旋转溶解，待旋转蒸发仪样品室壁上的膜都溶于PBS时收集溶液。将收集到的溶液均质处理2次，均质压力为30 MPa，时间10 s。得到的即为鹅血抗氧化小分子酶解物脂质体。
取磷脂，胆固醇（比例为10:1、8:1、6:1、4:1、2:1），加乙醚30ml溶解，得到有机相。鹅血抗氧化小分子酶解物1.5 mL加8.5mL PBS水得到内水相。将内水相与有机相混合均匀， 超声冰浴处理5min，功率为400w。将超声处理后的混合液快速倒入旋转蒸发仪样品室进行蒸发浓缩，水浴温度为35℃，真空度为0.005MPa, 待旋转蒸发仪壁上形成一层膜后，将吐温80
0.5g与外水相20ml混合 加到旋转蒸发仪样品室，将真空度提高到0.01MPa旋转溶解，待旋转蒸发仪样品室壁上的膜都溶于PBS时收集溶液。将收集到的溶液均质处理2次，均质压力为30 MPa，时间10 s。得到的即为鹅血抗氧化小分子酶解物脂质体。
[0024] 水化温度的对脂质体基本特性的影响取磷脂，胆固醇，加乙醚30ml溶解，得到有机相。鹅血抗氧化小分子酶解物1.5 mL加
8.5mL PBS水得到内水相。将内水相与有机相混合均匀，超声冰浴处理5min，功率为400w。将超声处理后的混合液快速倒入旋转蒸发仪样品室，（25℃、35℃、45℃、55℃）真空度
0.005MPa, 待旋转蒸发仪壁上形成一层膜后，将吐温80 0.5g与外水相20ml混合加到旋转蒸发仪样品室，将真空度提高到0.01MPa旋转溶解，待旋转蒸发仪样品室壁上的膜都溶于PBS时收集溶液。将收集到的溶液均质处理2次，均质压力为30 MPa，时间10 s。得到的即为鹅血抗氧化小分子酶解物脂质体。
8.5mL PBS水得到内水相。将内水相与有机相混合均匀，超声冰浴处理5min，功率为400w。将超声处理后的混合液快速倒入旋转蒸发仪样品室，（25℃、35℃、45℃、55℃）真空度
0.005MPa, 待旋转蒸发仪壁上形成一层膜后，将吐温80 0.5g与外水相20ml混合加到旋转蒸发仪样品室，将真空度提高到0.01MPa旋转溶解，待旋转蒸发仪样品室壁上的膜都溶于PBS时收集溶液。将收集到的溶液均质处理2次，均质压力为30 MPa，时间10 s。得到的即为鹅血抗氧化小分子酶解物脂质体。
[0025] 超声时间对脂质体基本特性的影响取磷脂，胆固醇，加乙醚30ml溶解，得到有机相。鹅血抗氧化小分子酶解物1.5 mL加
8.5mL PBS水得到内水相。将内水相与有机相混合均匀，超声冰浴处理（时间为1、3、5、7、9 min），功率为400w。将超声处理后的混合液快速倒入旋转蒸发仪样品室，35℃真空度
0.005MPa, 待旋转蒸发仪壁上形成一层膜后，将吐温80 0.5g与外水相20ml混合 加到旋转蒸发仪样品室，将真空度提高到0.01MPa旋转溶解，待旋转蒸发仪样品室壁上的膜都溶于PBS时收集溶液。将收集到的溶液均质处理2次，均质压力为30 MPa，时间10 s。得到的即为鹅血抗氧化小分子酶解物脂质体。
8.5mL PBS水得到内水相。将内水相与有机相混合均匀，超声冰浴处理（时间为1、3、5、7、9 min），功率为400w。将超声处理后的混合液快速倒入旋转蒸发仪样品室，35℃真空度
0.005MPa, 待旋转蒸发仪壁上形成一层膜后，将吐温80 0.5g与外水相20ml混合 加到旋转蒸发仪样品室，将真空度提高到0.01MPa旋转溶解，待旋转蒸发仪样品室壁上的膜都溶于PBS时收集溶液。将收集到的溶液均质处理2次，均质压力为30 MPa，时间10 s。得到的即为鹅血抗氧化小分子酶解物脂质体。
[0026] GBH添加量对脂质体基本特性的影响取磷脂，胆固醇，加乙醚30ml溶解，得到有机相。鹅血抗氧化小分子酶解物(0.5、1.0、
1.5 、2.0 mL) 加PBS水得到内水相10ml。将内水相与有机相混合均匀，超声冰浴处理5 min，功率为400w。将超声处理后的混合液快速倒入旋转蒸发仪样品室，35℃真空度
0.005MPa, 待旋转蒸发仪壁上形成一层膜后，将吐温80 0.5g与外水相20ml混合加到旋转蒸发仪样品室，将真空度提高到0.01MPa旋转溶解，待旋转蒸发仪样品室壁上的膜都溶于PBS时收集溶液。将收集到的溶液均质处理2次，均质压力为30 MPa，时间10 s。得到的即为鹅血抗氧化小分子酶解物脂质体。
1.5 、2.0 mL) 加PBS水得到内水相10ml。将内水相与有机相混合均匀，超声冰浴处理5 min，功率为400w。将超声处理后的混合液快速倒入旋转蒸发仪样品室，35℃真空度
0.005MPa, 待旋转蒸发仪壁上形成一层膜后，将吐温80 0.5g与外水相20ml混合加到旋转蒸发仪样品室，将真空度提高到0.01MPa旋转溶解，待旋转蒸发仪样品室壁上的膜都溶于PBS时收集溶液。将收集到的溶液均质处理2次，均质压力为30 MPa，时间10 s。得到的即为鹅血抗氧化小分子酶解物脂质体。
[0027] E、理化指标测定粒径和zeta电位的测量：方法参考
DPPH自由基清除能力的测量：方法参考Wu, R., Wu, C., Liu, D., Yang, X., Huang, J., Zhang, J., Liao, B., & He, H. (2017). Antioxidant and anti-freezing peptides from salmon collagen hydrolysate prepared by bacterial extracellular protease. Food Chemistry, 248, 346.
总还原力的测定：方法参考Wang, Y., Chen, H., Wang, J., & Xing, L. (2014). Preparation of active corn peptides from zein through double enzymes immobilized with calcium alginate–chitosan beads. Process Biochemistry, 49(10), 1682-1690.
包封率的测量：方法参考Bai, C., Peng, H., Xiong, H., Liu, Y., Zhao, L., & Xiao, X. (2011). Carboxymethylchitosan-coated proliposomes containing coix seed oil: Characterisation, stability and in vitro release evaluation. Food Chemistry, 129(4), 1695-1702.
F、结果与分析
表2水解液中小分子物质的种类和含量
从表2可以看出，鹅血酶解液被检测出含有丰富的氨基酸。亮氨酸，苯丙氨酸，异亮氨酸，缬氨酸等疏水性氨基酸在鹅血酶解液中具有较高的含量。疏水性氨基酸已经被证明能够从而延缓或阻断脂质过氧化反应，保护脂质体系和膜质的完整，起到抗氧化作用。酸性氨基酸如谷氨酸和天冬氨酸在鹅血酶解液中的含量也不低，已经有研究证明酸性氨基酸其侧链羧基具有供氢作用，可以赘合金属离子以钝化其氧化作用，从而减弱自由基链反应，达到抗氧化效果。
DPPH自由基清除能力的测量：方法参考Wu, R., Wu, C., Liu, D., Yang, X., Huang, J., Zhang, J., Liao, B., & He, H. (2017). Antioxidant and anti-freezing peptides from salmon collagen hydrolysate prepared by bacterial extracellular protease. Food Chemistry, 248, 346.
总还原力的测定：方法参考Wang, Y., Chen, H., Wang, J., & Xing, L. (2014). Preparation of active corn peptides from zein through double enzymes immobilized with calcium alginate–chitosan beads. Process Biochemistry, 49(10), 1682-1690.
包封率的测量：方法参考Bai, C., Peng, H., Xiong, H., Liu, Y., Zhao, L., & Xiao, X. (2011). Carboxymethylchitosan-coated proliposomes containing coix seed oil: Characterisation, stability and in vitro release evaluation. Food Chemistry, 129(4), 1695-1702.
F、结果与分析
表2水解液中小分子物质的种类和含量
从表2可以看出，鹅血酶解液被检测出含有丰富的氨基酸。亮氨酸，苯丙氨酸，异亮氨酸，缬氨酸等疏水性氨基酸在鹅血酶解液中具有较高的含量。疏水性氨基酸已经被证明能够从而延缓或阻断脂质过氧化反应，保护脂质体系和膜质的完整，起到抗氧化作用。酸性氨基酸如谷氨酸和天冬氨酸在鹅血酶解液中的含量也不低，已经有研究证明酸性氨基酸其侧链羧基具有供氢作用，可以赘合金属离子以钝化其氧化作用，从而减弱自由基链反应，达到抗氧化效果。
[0029] 最佳抗氧化活性酶解液分子量的选择超滤结果如图1所示，分子量＜1KD 的酶解液总还原力和DPPH自由基清除能力最高，可以认为＜1KD的酶液液（GBH）组分抗氧化能力最强。将GBH通过RP-HPLC分离得到5个不同的组分（图3），其中第二个组分的抗氧化活性最高（图2），将第二个组分通过质谱，小分子片段均在500D以下（图四）。可以认为本实验分离得到的GBH是有效的鹅血抗氧化小分子酶解物。
[0030] 磷脂与胆固醇比例对脂质体基本特征的影响不同磷脂与胆固醇比例制备脂质体粒径和电位如图2所示。在磷脂与胆固醇比例8:1和
10:1时粒径最小，在6:1和8:1时，脂质体电位最近接±30 mV。在4:1和8:1时，脂质体包封率较高（图3）。这是因为当胆固醇加入磷脂膜中时，会减少了磷脂脂肪链的自由移动，使磷脂分子结合更为紧密，增加脂质体的稳定性。当胆固醇的比例继续增加时会导致脂质体包封率的下降。胆固醇能够增加膜的流动性，然而膜的流动性过大，则会破坏脂质体的双分子层结构，而导致被包封的GBH被泄露出来，降低了包封率。综合粒径和电位对脂质体的影响，在磷脂与胆固醇比例8:1时，综合指标较好。
10:1时粒径最小，在6:1和8:1时，脂质体电位最近接±30 mV。在4:1和8:1时，脂质体包封率较高（图3）。这是因为当胆固醇加入磷脂膜中时，会减少了磷脂脂肪链的自由移动，使磷脂分子结合更为紧密，增加脂质体的稳定性。当胆固醇的比例继续增加时会导致脂质体包封率的下降。胆固醇能够增加膜的流动性，然而膜的流动性过大，则会破坏脂质体的双分子层结构，而导致被包封的GBH被泄露出来，降低了包封率。综合粒径和电位对脂质体的影响，在磷脂与胆固醇比例8:1时，综合指标较好。
[0031] 水化温度对脂质体基本特征的影响不同水化温度制备的脂质体粒径和电位如图4所示，在35℃制备的脂质体粒径最小，电位最接近±30 mV。包封率载55℃时，包封率最高（图5）。但是温度较高时，会导致磷脂加速氧化和脂解，降低体系中磷脂的有效含量。综合考虑脂质体性质和芯材的利用率，选择水化温度为35℃即可。
[0032] 超声时间对脂质体基本特征的影响不同超声时间制备的脂质体粒径和电位如图6所示，在超声时间为5min时，粒径最小，超声时间为5min和7min时电位最接近±30 mV。在超声时间为1min和5min时，包封率较大（图7）。超声时间较短时，会导致脂质体粒径过大，性质不稳定。超声时间过长时，会使体系的温度升高，从而导致磷脂的氧化和脂解，降低体系中磷脂的有效含量。
[0033] GBH添加量对脂质体基本特征的影响不同GBH添加量制备的脂质体粒径和电位如图8所示，在GBH添加量为1.5mL时，粒径最小，电位最接近±30 mV，包封率最大（图9）。在GBH载量较高时，使得脂质体囊泡对GBH捕捉更加容易，因而GBH被包封几率增大。但是，一定量的磷脂制备的脂质体数量有限，因而脂质体的包封能力也是有限的。随着GBH载量的继续增加，会导致脂质体的包封率的下降。在GBH添加量为1.5mL时，粒径最小，电位最接近±30 mV，性质较稳定。
[0034] G、产品检测指标结果与分析鹅血抗氧化小分子酶解物脂质体的基本特征
表3 电位粒径
如表3所示，当GBH掺入脂质体中时，脂质体粒径从106.5变为93..33nm。 TEM图像（图
10）中脂质体具有球形结构，粒径大小接近通过Zetasizer Nano ZS系统测量的平均大小（表3）。鹅血抗氧化小分子酶解物脂质体的zeta电位为-31.7mV（表3）。由于磷脂分子的负电荷，脂质胶囊具有负表面电荷。具有接近±30mV的zeta电位值的纳米颗粒在溶液中具有良好的胶体稳定性。与鹅血抗氧化小分子酶解物和对照相比，鹅血抗氧化小分子酶解物脂质体显示出非常接近-30mV的ζ-电位，因此表明稳定性增加。 鹅血抗氧化小分子酶解物脂质体在此条件下的包封率为70.99％（表3）。
表3 电位粒径
如表3所示，当GBH掺入脂质体中时，脂质体粒径从106.5变为93..33nm。 TEM图像（图
10）中脂质体具有球形结构，粒径大小接近通过Zetasizer Nano ZS系统测量的平均大小（表3）。鹅血抗氧化小分子酶解物脂质体的zeta电位为-31.7mV（表3）。由于磷脂分子的负电荷，脂质胶囊具有负表面电荷。具有接近±30mV的zeta电位值的纳米颗粒在溶液中具有良好的胶体稳定性。与鹅血抗氧化小分子酶解物和对照相比，鹅血抗氧化小分子酶解物脂质体显示出非常接近-30mV的ζ-电位，因此表明稳定性增加。 鹅血抗氧化小分子酶解物脂质体在此条件下的包封率为70.99％（表3）。
[0035] 鹅血抗氧化小分子酶解物与纳米脂质体抗氧化活性的比较包封前后抗氧化能力如图11所示，鹅血抗氧化小分子酶解物纳米脂质体保留了鹅血抗氧化小分子酶解物93.98%的DPPH自由基清除能力，鹅血抗氧化小分子酶解物纳米脂质体的总还原力与GBH差异不显著，可以认为GBH脂质体保留GBH的大部分抗氧化能力。
[0036] 鹅血抗氧化小分子酶解物纳米脂质体在模拟胃肠液中的缓释性能GBH脂质体在模拟胃液中GBH保留率如表4所示，在胃液（SGF）消化过程中，由于胃蛋白酶直接作用于GBH，使GBH在120min内几乎完全降解(保留率为11.46%)，而GBH脂质体的保留率在前5min内显著降低。这是因为部分脂质体膜结构被破坏，导致释放的GBH被胃蛋白酶分解，从而降低了GBH脂质体的保留率。从表4可以得出，脂质体在SGF中表现出了缓慢释放GBH的行为。
[0037] 在模拟肠液（SIF）中，GBH在消化 240min后保留率从92.74%下降到37.71%(表2)，说明GBH可被胰蛋白酶水解为寡肽，并直接被小肠细胞吸收。从表4可以看出，GBH脂质体在SIF中孵育240min后，其保留率从89.3%降低到40.1%。GBH脂质体在SIF中的降解率明显高于在SGF中的降解率。脂质体可能是通过胃存活下来，然后在小肠释放大部分GBH，并被小肠吸收。当GBH被脂质体包埋时能减被胃蛋白酶的分解，大部分GBH在肠液中释放，被小肠吸收，从而提高了生物活性和生物利用度。
[0038] 鹅血水解物你纳米脂质体在模拟胃液中的抗氧化性能模拟胃肠消化抗氧化能力的变化如表5所示。在前5分钟SGF中，GBH被胃蛋白酶水解为游离氨基酸后DPPH自由基清除的能力显著下降。在15min时，GBH的清除DPPH自由基的能力增强, 而GBH脂质体清除DPPH自由基的能力明显下降。在30min～120min时，GBH脂质体的DPPH清除自由基的能力无明显变化。对照组与GBH脂质体在SGF(前120分钟)中清除DPPH自由基的能力有类似的增加趋势。然而，GBH脂质体清除DPPH自由基的能力继续增强，而对照组则明显下降(从120min开始)。脂质体膜的结构被破坏，GBH脂质体中的部分GBH被释放。因此，脂质体可以保护部分被包裹的GBH在SGF过程中不被消化。
[0039] 在SIF中，GBH、GBH脂质体和对照的DPPH自由基清除能力也较低(表5)。GBH在5min后逐渐恢复正常，随后GBH被胰蛋白酶迅速水解，导致DPPH自由基清除能力显著下降。GBH的DPPH自由基清除能力在SIF孵育60min内消失，这主要是由于胰蛋白酶水解GBH形成寡肽和游离氨基酸而无抗氧化能力所致。在SIF中，GBH脂质体对DPPH自由基的清除能力在孵育15min后下降到7.08%(表5)，对照组也有类似的下降趋势，表明胰酶的存在破坏了脂质体的磷脂双层膜结构。GBH脂质体清除DPPH自由基的能力从120min开始上升，而对照组则继续下降。这主要是由于胰脂肪酶的存在破坏了脂质双层在SIF中的完整性，导致GBH泄漏，使GBH脂质体清除DPPH自由基的能力在相同孵育时间(60～240min)高于对照组。说明在脂质体膜破坏后对DPPH自由基的清除能力中起主要作用的是被释放的GBH。脂质体包埋可减缓GBH体外消化降解速率。因此，脂质体能在消化过程中包裹GBH，提高GBH的生物利用度，因而被认为是一种有效的载体。
[0040] 表4鹅血抗氧化水解小分子肽脂质体在模拟胃液中的保留率表5鹅血水解物脂质体在模拟胃液中的抗氧化能力变化
本发明与现有技术相比的有益效果在于：
本发明是以以鹅血为原料，分离鹅血血红蛋白，然后利用碱性蛋白酶，通过工艺优化降解大分子蛋白质，富集具有抗氧化活性的多肽以及氨基酸，同时通过逐级分离得到小于1KD的小分子活性物质，然后利用磷脂、胆固醇和吐温80包埋小分子活性物质，制备得到粒径为
100 nm左右的纳米脂质体。本发明制得的鹅血抗氧化小分子酶解物纳米脂质体，提高了鹅血蛋白的附加值、消化吸收率以及功能特性，该产品富含具有抗氧化活性的氨基酸和小肽以及磷脂，同时有效保留了产品的抗氧化活性，以及在胃、肠环境中的控制性释放和生理功效。该工艺提高了鹅血的附加值，提升了鹅产业链的价值。解决了现有技术对鹅血利用率低以及环境污染的问题。
附图说明
本发明与现有技术相比的有益效果在于：
本发明是以以鹅血为原料，分离鹅血血红蛋白，然后利用碱性蛋白酶，通过工艺优化降解大分子蛋白质，富集具有抗氧化活性的多肽以及氨基酸，同时通过逐级分离得到小于1KD的小分子活性物质，然后利用磷脂、胆固醇和吐温80包埋小分子活性物质，制备得到粒径为
100 nm左右的纳米脂质体。本发明制得的鹅血抗氧化小分子酶解物纳米脂质体，提高了鹅血蛋白的附加值、消化吸收率以及功能特性，该产品富含具有抗氧化活性的氨基酸和小肽以及磷脂，同时有效保留了产品的抗氧化活性，以及在胃、肠环境中的控制性释放和生理功效。该工艺提高了鹅血的附加值，提升了鹅产业链的价值。解决了现有技术对鹅血利用率低以及环境污染的问题。
附图说明
[0041] 图1为最佳抗氧化活性酶解液分子量的选择柱形图；图2 为小于1KD抗氧化活性酶解液经反相制备液相分离柱形图；
图3 小于1KD抗氧化活性酶解液经反相制备液相分离图谱；
图4通过反相制备液相分离得到抗氧化酶解液的质谱图；
图5 不同磷脂与胆固醇比例制备脂质体粒径和电位K线图；
图6 不同磷脂与胆固醇比例包封率K线图；
图7 为水化温度制备脂质体粒径和电位K线图；
图8 为水化温度制备脂质的包封率K线图；
图9 不同超声时间制备的脂质体粒径和电位K线图；
图10 不同超声时间制备的脂质体包封率K线图；
图11 不同鹅血抗氧化小分子酶解物添加量制备的脂质体粒径和电位K线图；
图12 不同鹅血抗氧化小分子酶解物添加量制备的脂质体的包封率K线图；
图13 脂质体电镜图；
图14 包封前后抗氧化能力柱形图。
图3 小于1KD抗氧化活性酶解液经反相制备液相分离图谱；
图4通过反相制备液相分离得到抗氧化酶解液的质谱图；
图5 不同磷脂与胆固醇比例制备脂质体粒径和电位K线图；
图6 不同磷脂与胆固醇比例包封率K线图；
图7 为水化温度制备脂质体粒径和电位K线图；
图8 为水化温度制备脂质的包封率K线图；
图9 不同超声时间制备的脂质体粒径和电位K线图；
图10 不同超声时间制备的脂质体包封率K线图；
图11 不同鹅血抗氧化小分子酶解物添加量制备的脂质体粒径和电位K线图；
图12 不同鹅血抗氧化小分子酶解物添加量制备的脂质体的包封率K线图；
图13 脂质体电镜图；
图14 包封前后抗氧化能力柱形图。
具体实施方式
[0042] 将新鲜鹅血进行离心分离（3500r/min，15min），并用5倍体积的生理盐水（0.9%）洗涤下层分离液并收集，在收集的下层分离物中加入蒸馏水，定容至原鹅血体积。
[0043] 将收集分离处理液进行超声细胞破碎，释放出细胞内的蛋白质，超声功率为250w，时间为12min。将超声破碎后的混合液进行离心分离（3500r/min，10min）然后过滤得到鹅血红蛋白。
[0044] 将前处理得到的鹅血红蛋白用蒸馏水调整浓度至6%，pH值为10.0，然后在50℃下预热5min，然后添加6000U/g的碱性蛋白酶，在50℃条件下避光酶解5.0h（转速90r/min），之后100℃灭酶10分钟，离心（3000r/min，10min）取上清液即为鹅血酶解液。将鹅血酶解液依次通过10KD, 3KD，1KD的超滤离心分离，离心条件为5000g/30min，收集最终组分得到鹅血抗氧化小分子酶解物，备用，同时分析其抗氧化能力。
[0045] 取磷脂1g，胆固醇0.125g，加乙醚30ml溶解，得到有机相。鹅血抗氧化小分子酶解物1.5 mL加8.5mL PBS水得到内水相。将内水相与有机相混合均匀，超声冰浴处理5 min，功率为400 w。
[0046] 将超声处理后的混合液快速倒入旋转蒸发仪样品室进行蒸发浓缩，水浴温度为35 ℃，真空度为0.005 MPa, 待旋转蒸发仪壁上形成一层膜后，将吐温80 0.5g与外水相20ml混合加到旋转蒸发仪样品室，将真空度提高到0.01 MPa旋转溶解，待旋转蒸发仪样品室壁上的膜都溶于PBS时收集溶液。
[0047] 将收集到的溶液均质处理2次，均质压力为30 MPa，时间10 s。得到的即为鹅血抗氧化小分子酶解物纳米脂质体。
[0048] 本发明以鹅血为原料，分离鹅血血红蛋白，然后利用碱性蛋白酶，通过工艺优化降解大分子蛋白质，富集具有抗氧化活性的多肽以及氨基酸，同时通过逐级分离得到小于1KD的小分子活性物质，然后利用磷脂、胆固醇和吐温80包埋小分子活性物质，制备得到粒径为100 nm左右的纳米脂质体。通过分析，发现该脂质体可以有效地防止外界环境对鹅血抗氧化小分子酶解物的破坏，提高其稳定性，同时提高了鹅血蛋白的消化吸收率，并使其活性成分在胃肠环境分步缓慢释放，充分发挥其生理功能。该加工方法降低了鹅血直接排放对环境产生的污染问题，使鹅血得到高附加值利用，并可进行工业化生产。
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