海洋中药木榄叶提取物及其制备方法和抗胰腺癌应用
阅读：670发布：2023-03-05
专利汇可以提供海洋中药木榄叶提取物及其制备方法和抗胰腺癌应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了海洋中药木榄叶提取物在制备 治疗 胰腺癌药物方面中应用。结果发现，木榄叶 乙醇 提取物、石油醚提取物、乙酸乙酯提取物对胰腺癌细胞SW1990增殖均有明显抑制作用，其中，木榄叶乙酸乙酯部位抑制胰腺癌SW1990增殖作用最明显，而且其可显著抑制胰腺癌SW1990的迁移和侵袭，其抑制增殖作用与时间及浓度呈正相关，提示木榄叶乙酸乙酯部位提取物具有确切的抗胰腺癌SW1990作用。本发明研究阐明了木榄叶抗 肿瘤 活性部位抗胰腺癌的作用及分子机制，为充分开发木榄叶资源的药用价值提供科学依据，为中药治疗胰腺癌开辟了新途径，为木榄抗癌临床应用提供了参考。，下面是海洋中药木榄叶提取物及其制备方法和抗胰腺癌应用专利的具体信息内容。
1.海洋中药木榄叶提取物在制备治疗胰腺癌药物方面中应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述治疗胰腺癌药物为抑制胰腺癌细胞增殖、迁移、侵袭的药物或诱导胰腺癌细胞凋亡的药物。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述胰腺癌细胞为人胰腺癌细胞SW1990。
4.用于制备治疗胰腺癌药物的海洋中药木榄叶提取物。
5.根据权利要求1所述的提取物，其特征在于：所述提取物为木榄叶乙醇提取物、石油醚提取物、乙酸乙酯提取物。
6.权利要求4所述提取物的制备方法，其特征在于：干燥木榄叶粉碎成粗粉备用；量取
25倍量95％乙醇倒入木榄叶粗粉中，密封冷浸7天后，收集冷浸液，过滤，滤液用旋转蒸发仪浓缩成粘稠液，倒入蒸发皿置于水浴锅上挥尽乙醇，得到木榄叶乙醇提取物的浸膏。
7.权利要求6所述提取物的制备方法，其特征在于：取木榄叶乙醇提取物的浸膏，倒入分液漏斗，量筒量取1倍量石油醚溶剂加入分液漏斗，上下颠倒混匀，静止，收集萃取液；多次萃取，直至加入的石油醚溶液振荡静置后不变色；合并萃取液，用旋转蒸发仪浓缩成粘稠液，倒入蒸发皿置于水浴锅上挥发石油醚，得到木榄叶石油醚提取物浸膏。
8.权利要求7所述提取物的制备方法，其特征在于：往分液漏斗中的浸膏加入1倍量乙酸乙酯溶剂，上下颠倒混匀，静止，收集萃取液；多次萃取，直至加入的乙酸乙酯溶液振荡静置不变色；合并萃取液，用旋转蒸发仪浓缩成粘稠液，倒入蒸发皿置于水浴锅上挥发乙酸乙酯，得到木榄叶乙酸乙酯提取物浸膏。
海洋中药木榄叶提取物及其制备方法和抗胰腺癌应用
技术领域
背景技术
[0002] 胰腺癌是一种恶性化程度非常高的消化系肿瘤，世界各国的胰腺癌发病率趋势飞速，据不完全统计，五年的存活率不超过5％。胰腺癌的发生、发展与遗传背景、环境因素、基础疾病及生活习惯息息相关。目前认为吸烟、肥胖、糖尿病、慢性胰腺炎及胰腺癌家族病史均与胰腺癌的发病有关。
[0003] 现代临床对胰腺癌治疗方法有：传统放疗和化疗、外科手术、分子靶向药物。其中以外科手术是治疗胰腺癌最有效的方式，但由于胰腺癌病情的隐匿性，80％患者初次诊断时已属晚期，丧失了手术治疗的机会，且对放化疗不敏感，生物治疗目前疗效尚不确切。中医药在胰腺癌的综合治疗中发挥独特优势，并展现出一定的发展前景。因此发挥中药多方面、多靶点调整人体阴阳平衡、驱邪补正的独特优点，寻求安全有效的抗胰腺癌中药是治疗胰腺癌的重要研究方向。
[0004] 木榄Bruguiera gymnorhiza(L.)Savigny为红树科木榄属植物，木榄叶是木榄干燥的叶子。木榄在中国分布广泛，其主要分布于广西、广东、福建和台湾等沿海地带。据记载，木榄味苦，性凉，归胆经。功效主治是解毒截疟，具有治疗腹泻、疟疾、高血压、糖尿病和便秘以及抗癌等功效。国内外学者从木榄中分离得到黄酮、二硫化合物、萜类、脂肪酸、甾醇、鞣质、木质素与芳香类等大量化学成分。现代药理研究表明木榄具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗菌、抗病毒和抗糖尿病等多种活性。文献报道，木榄叶的氯仿提取物、乙酸乙酯提取物和甲醇提取物，皆显示出对肝细胞HepG2有选择性的细胞毒性，木榄叶己烷提取物对MCF-7乳腺癌细胞的选择性毒性作用。尽管如此，未见木榄叶提取物用于治疗胰腺癌的报道。
发明内容
[0005] 本发明要解决的技术问题是提供一种海洋中药木榄叶提取物及其制备方法和抗胰腺癌应用，为充分开发木榄叶资源的药用价值提供科学依据，为中药胰腺癌治疗开辟新途径。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
[0007] 海洋中药木榄叶提取物在制备治疗胰腺癌药物方面中应用。
[0008] 治疗胰腺癌药物为抑制胰腺癌细胞增殖、迁移、侵袭的药物或诱导胰腺癌细胞凋亡的药物。
[0009] 胰腺癌细胞为人胰腺癌细胞SW1990。
[0010] 用于制备治疗胰腺癌药物的海洋中药木榄叶提取物。
[0011] 提取物为木榄叶乙醇提取物、石油醚提取物、乙酸乙酯提取物。
[0012] 上述乙醇提取物的制备方法，干燥木榄叶粉碎成粗粉备用；量取25倍量95％乙醇倒入木榄叶粗粉中，密封冷浸7天后，收集冷浸液，过滤，滤液用旋转蒸发仪浓缩成粘稠液，倒入蒸发皿置于水浴锅上挥尽乙醇，得到木榄叶乙醇提取物的浸膏。
[0013] 上述石油醚提取物的制备方法，取木榄叶乙醇提取物的浸膏，倒入分液漏斗，量筒量取1倍量石油醚溶剂加入分液漏斗，上下颠倒混匀，静止，收集萃取液；多次萃取，直至加入的石油醚溶液振荡静置后不变色；合并萃取液，用旋转蒸发仪浓缩成粘稠液，倒入蒸发皿置于水浴锅上挥发石油醚，得到木榄叶石油醚提取物浸膏。
[0014] 上述乙酸乙酯提取物的制备方法，往分液漏斗中的浸膏加入1倍量乙酸乙酯溶剂，上下颠倒混匀，静止，收集萃取液；多次萃取，直至加入的乙酸乙酯溶液振荡静置不变色；合并萃取液，用旋转蒸发仪浓缩成粘稠液，倒入蒸发皿置于水浴锅上挥发乙酸乙酯，得到木榄叶乙酸乙酯提取物浸膏。
[0015] 发明人采用MTS法筛选木榄叶乙醇提取物及其3个溶剂萃取部位对肿瘤细胞的体外抑制作用，筛选木榄叶抗肿瘤活性部位。结果发现，木榄叶乙醇提取物、石油醚提取物、乙酸乙酯提取物对胰腺癌细胞SW1990增殖均有明显抑制作用，其中，木榄叶乙酸乙酯部位抑制胰腺癌SW1990增殖作用最明显，而且其可显著抑制胰腺癌SW1990的迁移和侵袭，其抑制增殖作用与时间及浓度呈正相关，提示木榄叶乙酸乙酯部位提取物具有确切的抗胰腺癌SW1990作用。同时，细胞凋亡影响试验表明，木榄叶乙酸乙酯部位提取物抑制胰腺癌SW1990的作用可能与其上调Caspase-3、Bax、Bc1-2蛋白表达，下调Bc1-2/Bax蛋白比值密切相关。本发明研究阐明了木榄叶抗肿瘤活性部位抗胰腺癌的作用及分子机制，为充分开发木榄叶资源的药用价值提供科学依据，为中药胰腺癌治疗开辟了新途径，为木榄抗癌临床应用提供了参考。
附图说明
附图说明
[0016] 图1是不同浓度木榄叶乙酸乙酯部位对SW1990细胞平板克隆形成的抑制作用结果图，图中：a对照组，b 10μg/ml，c 20μg/ml。
[0018] 图3是不同浓度木榄叶乙酸乙酯部位对Caspase-3、Bc1-2、Bax基因蛋白表达影响结果图，图中：1空白对照组，2药物组25μg/ml，3药物组50μg/ml，4药物组100μg/ml，5药物组150μg/ml。
具体实施方式
[0019] 一、木榄叶提取物对人胰腺癌细胞SW1990增殖的影响
[0020] 1、材料
[0021] 1.1药材：
[0022] 木榄叶，批号20160710，采自防城港北仑河口红树林保护区。经广西中医药大学李永华教授鉴定，木榄叶为红树科植物木榄Bruguiera gymnorrhiza(L.)Savigny.的干燥叶子。
[0023] 1.2细胞株
[0024] 人胰腺癌细胞株：SW1990。
[0025] 1.3试剂
[0026] L15不完全培养基，购自江苏凯基生物技术股份有限公司(批号：20171026)、0.25％含EDTA胰酶，购自美国Gibco公司(批号：1895789)；胎牛血清，购自美国Gibco公司(批号1660517)；紫杉醇(PTX)：购自美国Invitrogen公司(货号：sp8020)；细胞增殖检测试剂盒(MTS)：购自美国promega公司(批号：0000219902)；
[0027] 1.4实验药物
[0028] 乙醇提取物的制备——准确称取干燥木榄叶1000.0g，粉碎机粉碎成粗粉备用；量筒量取25倍量95％乙醇倒入木榄叶粗粉中，密封冷浸7天后，收集冷浸液，过滤，滤液用旋转蒸发仪浓缩成粘稠液，倒入蒸发皿置于水浴锅上挥尽乙醇，得到木榄叶乙醇提取物的浸膏。
[0029] 石油醚部位的制备——取1/2的木榄叶乙醇提取物的浸膏，倒入分液漏斗，量筒量取1倍量石油醚溶剂加入分液漏斗，上下颠倒混匀，静止，石油醚溶剂由澄清变为有色溶液，收集萃取液；多次萃取，直至加入的石油醚溶液振荡静置后不变色；合并萃取液，用旋转蒸发仪浓缩成粘稠液，倒入蒸发皿置于水浴锅上挥发石油醚，得到木榄叶石油醚部位浸膏。
[0030] 乙酸乙酯部位的制备——石油醚萃取完成后，往分液漏斗中剩余的1/2木榄叶乙醇提取物的浸膏加入1倍量乙酸乙酯溶剂，上下颠倒混匀，静止，乙酸乙酯溶剂由澄清变为有色溶液，收集萃取液；多次萃取，直至加入的乙酸乙酯溶液振荡静置不变色；合并萃取液，用旋转蒸发仪浓缩成粘稠液，倒入蒸发皿置于水浴锅上挥发乙酸乙酯，得到木榄叶乙酸乙酯部位浸膏。
[0031] 2.方法
[0032] 2.1木榄叶不同提取物对人胰腺癌细胞株SW1990增殖的影响
[0033] (1)取对数生长期肿瘤细胞，吸弃原培养基，PBS清洗细胞2次，加入含EDTA的0.25％胰酶，将培养瓶放入培养箱中消化3min左右。用含10％胎牛血清的完全培养基终止消化，离心3min，1000转/min，吸弃上层原培养基，加入5ml完全培养基重悬、计数，将细胞的密度调整为4×104个/ml，在96孔板中每孔加入100μl细胞悬液，即细胞的密度是4000个/孔，接种60个孔。96孔板的外围36个加入相同体积PBS，防止细胞培养基蒸发。接种好的96孔板放入5％CO2，37℃培养箱中常规培养24h。
[0034] (2)配置木榄叶乙醇提取物及石油醚、乙酸乙酯储备液：分析天平称取0.2002g浸膏放入5ml离心管，加入2ml的DMSO配成100mg/ml的储备液，由于提取物不易溶解，需置于超声仪超声加速溶解，溶解后用0.22μm微孔滤膜过滤2次，分装于EP管，保存于-20℃。
[0035] (3)24h后，细胞培养贴壁后，吸弃原培养基，按照分组，加入用完全培养基稀释至不同浓度的木榄叶乙醇提取物、石油醚提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物(31.25、62.5、125、250、500μg/ml)，空白组加入等体积的含最高浓度DMSO的完全培养基，另设一个仅含培养基而无细胞的孔作为空白孔。继续培养24、48、72h。
[0036] (4)分别在培养24、48、72h后，每孔加入20μl的Cell Titer 96Aqueous One Solution Reagent，避光放入5％CO2，37℃培养箱中孵育2h，酶标仪上在490nm处读取吸光度值。
[0037] (5)利用吸光值计算细胞半数抑制率IC50值，公式为lgIC50＝Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)。2.2木榄叶乙酸乙酯部位对胰腺癌SW1990细胞克隆能力的影响
[0038] (1)取对数生长期的胰腺癌SW1990细胞，用含EDTA的0.25％胰酶常规消化，重悬于含10％胎牛血清的完全培养基中备用；
[0039] (2)细胞计数，反复吹打，尽量使细胞吹散成单个，调整细胞浓度为200个/ml，于6孔板中每孔接种2ml，培养过夜；并轻轻十字转动，使细胞在孔内分散均匀。置入5％CO2，37℃培养箱培养；
[0040] (3)24h后，弃掉原培养基，加入含不同浓度的木榄叶乙酸乙酯提取物的L15完全培养基，实验组设5个药物浓度，浓度分别为10、20、30、40、50μg/ml，另设一个空白组(L15完全培养液)；
[0041] (4)每隔2-3天在倒置显微镜下观察，当在6孔板底部出现肉眼可见的克隆时，可终止培养。
[0042] (5)取出六孔板，吸弃原培养液，用PBS轻柔清洗两次，室温下4％的多聚甲醛固定20min，弃掉多聚甲醛。结晶紫染色液染色18min，吸弃结晶紫，用PBS洗去染色液，自然风干，用扫描仪扫描；
[0043] (6)统计时，在倒置显微镜下，将大于10个细胞的细胞群作为一个克隆数，计算克隆率，公式：形成的克隆数目/每个孔内接种细胞数×100％。本实验重复三次，用SPSS17.0检验统计分析，与空白组相比，P＜0.01，差异有显著性。
[0044] 3.结果
[0045] 木榄叶4种浸膏对胰腺癌细胞SW1990的IC50值中，木榄叶乙酸乙酯部位的IC50值最小，其24、48、72h的IC50值分别为88.76、52.67、84.17μg/ml。木榄叶乙酸乙酯部位是4种浸膏中最有效的化学部位。
[0046] 如表1和图1上所示，木榄叶乙酸乙酯部位对胰腺癌细胞的克隆形成率具有明显抑制作用。空白对照组，药物组10μg/ml与药物组20μg/ml对胰腺SW1990细胞的克隆形成率分别为72％，40％，20％，各药物组与空白对照组相比较均具有统计学差异(P＜0.01)，并且克隆形成率与给药浓度呈现负相关。并且实验组设置的5个药物浓度，当浓度大于20μg/ml时，在六孔板中无法观察到细胞，说明药物浓度一定时，有很强的抑制细胞克隆作用。
[0047] 表1不同浓度木榄叶乙酸乙酯部位对SW1990细胞平板克隆形成的抑制作用[0048]
[0049] 二、木榄叶乙酸乙酯部位对胰腺癌细胞SW1990的迁移和侵袭的影响
[0050] 1.材料
[0051] 1.1细胞株：SW1990
[0052] 1.2试剂：结晶紫染色液，购自中国碧云天生物公司(批号：C0121)；4％多聚甲醛，购自美国sigma公司(批号：1711976)，Matrigel胶，购自美国BD公司；L15不完全培养基，购自江苏凯基生物技术股份有限公司(批号：20171026)；0.25％含EDTA胰酶，购自美国Gibco公司(批号：1895789)；胎牛血清，购自美国Gibco公司(批号：1660517)；紫杉醇(PTX)：购自美国Invitrogen公司(货号：sp8020)。
[0053] 2.方法
[0054] 2.1观察木榄叶乙酸乙酯部位对胰腺癌细胞迁移的影响
[0055] (1)实验操作前准备好marker笔和直尺，放入超净台中紫外灯照射30min灭菌；
[0056] (2)在6孔板背后用直尺辅助，用marker笔均匀划横线，每条横线大约相隔0.5-1.0cm。保证六孔板的每个培养孔至少穿过3条线；
[0057] (3)取对数生长期的SW1990细胞，常规0.25％胰酶消化、离心后含10％胎牛血清L15完全培养基重悬细胞并计数，以密度5×105个/每孔接种于六孔板，每孔中加入2ml，每组设置2个复孔；
[0058] (4)细胞贴壁，汇合度达到95％以上，用10μl枪头比对着直尺，并保持枪头垂直于培养板背后的横线划痕，每个孔划痕时都应给予相同力度和速度，尽量画出相同宽度划痕；(5)弃掉原培养基，用PBS溶液清洗3次，去除划痕时壁上脱落的细胞。弃掉PBS加入不含胎牛血清的L15培养基。给药组浓度分别为150、100、50、25μg/ml，空白组为L15不完全培养基；
[0061] 2.2木榄叶乙酸乙酯部位对胰腺癌SW1990细胞侵袭能力的影响
[0062] (1)取对数生长期的胰腺癌SW1990细胞，用含EDTA的0.25％胰酶常规消化，离心后重悬，以7×105个/孔接种于6孔板，共接种三块6孔板，培养过夜。
[0063] (2)24h后，弃掉原培养基，加入含木榄叶乙酸乙酯部位的L15完全培养基，设四个药物浓度，浓度分别为150，100，50，25μg/ml，另设一个空白组(L15完全培养液)，培养24h；
[0064] (3)这一步操作在冰上进行。Matrigel基质胶放在冰上融化，将L15培养基按比例1∶4稀释Matrigel胶，小室上室内均匀涂50μl稀释过的Martrigel胶，置于细胞培养箱37℃中30min使其凝固；
[0065] (4)取上述六孔板的细胞，0.25％胰酶消化后离心、用不含有胎牛血清的L15培养液重悬，调整浓度为5×104/ml，在每个Transwell上室中加500μl细胞悬液，每组2个复孔。下室中加入750μl含20％胎牛血清的L15培养基。操作室上下室之间不能留有气泡，若残留气泡，用细针头刺破。将孔板置于5％C02，37℃培养箱中培养；
[0066] (5)常规培养22h后，取出培养孔的小室，吸弃上室和下室的培养基，用PBS轻柔上室2次，加入4％的多聚甲醛室温固定20min，弃掉多聚甲醛。结晶紫染色液避光18min，弃掉结晶紫，再用自来水轻轻泡洗残留的结晶紫染液，直至水变得澄清，用湿润的棉签擦掉上室未迁移过膜的细胞；
[0067] (6)倒置显微镜(×100)下观察，拍照，每个小室随机选取5个视野拍摄。运用image J计算穿过小室的细胞数。应用软件Image-Pro Plus Version6.0统计分析，与空白组相比，P＜0.05，差异有显著性。
[0068] 3.结果
[0069] 如表2可知，药物干预24h后，细胞迁移距离随着给药浓度增加而逐渐减少，具有量效关系。当给药浓度为50、100、150μg/ml时，其迁移率分别为34.35％、18.00％与6.75％，细胞向中间迁移的距离明显小于对照组(P＜0.05)。
[0070] 由表3及图2可知，在24h木榄叶乙酸乙酯部位给药浓度为30μg/ml、60μg/ml时，穿过小室的胰腺癌SW1990细胞数分别为75.67个与58.61个与空白组穿过86.39个相比明显减少(P＜0.05)，这表明木榄叶乙酸乙酯部位可抑制胰腺癌SW1990的侵袭。
[0071] 表2不同浓度木榄叶乙酸乙酯部位对SW1990细胞迁移能力的影响
[0072]
[0073] 表3不同浓度木榄叶乙酸乙酯部位对SW1990细胞侵袭能力的影响(x±s)[0074]
[0075] 三、木榄叶乙酸乙酯部位对胰腺癌SW1990细胞的凋亡周期影响
[0076] 1.材料
[0077] 1.1细胞株：人胰腺癌细胞SW1990
[0078] 1.2试剂：凋亡试剂盒(Pharmingen FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit l)，购自美国RayBiotech公司；：L15不完全培养基，购自江苏凯基生物技术股份有限公司(批号：20171026)、0.25％不含EDTA胰酶，购自美国Gibco公司(批号：1895789)；胎牛血清，购自美国Gibco公司(批号1660517)；紫杉醇(PTX)：购自美国Invitrogen公司(货号：sp8020)。
[0079] 2.方法
[0080] (1)取对数生长期的胰腺癌SW1990细胞，用0.25％胰酶常规消化，离心后重悬，以7×105个/孔接种于6cm培养皿，共接种8个培养皿，培养过夜。
[0081] (2)24h后，弃掉原培养基，加入含木榄叶乙酸乙酯提取物的L15完全培养基，设4个药物浓度，浓度分别为150，100，50，25μg/ml，另设一个空白组(L15完全培养液)，药物干预24h；
[0083] (4)根据分组，依次取出同组培养皿，收集上清于15ml离心管，预冷的PBS清洗一次，弃掉PBS，加入不含EDTA的0.5％胰酶于培养皿，后放回培养箱中消化5min，含10％胎牛血清的L15完全培养基终止消化，吹打收集消化的细胞，将其于上述上清液混匀，离心，1000rpm/3min，弃上清。
[0084] (5)用配好的1×缓冲盐溶液重悬各组细胞，计数，将其密度为1×106个/ml，分别从各组中取100μl细胞悬液至新的流式管；
[0085] (6)每个流式管加入BD凋亡试剂盒中AV试剂5μl，避光孵育5min，再加入5μl的PI染液，室温避光孵10min；
[0087] 3.结果
[0088] 通过AV/PI染色检测木榄叶乙酸乙酯部位对胰腺癌SW1990细胞凋亡的影响，表4-6结果显示药物高剂量组(150μg/ml)在24、48、72h的细胞凋亡率分别是2.85％、5.39％、10.34％。随着时间的推移，木榄叶乙酸乙酯部位诱导胰腺癌SW1990细胞凋亡率越高。药物各浓度组凋亡的顺序为150μg/ml＞100μg/ml＞50μg/ml＞25μg/ml，细胞凋亡率和给药浓度成正比。药物高剂量组在72h的凋亡率最高为10.34％，与空白对照组相比，P＜0.05，统计学有差异。数据说明木榄叶乙酸乙酯部位对胰腺癌SW1990细胞有凋亡作用，且与浓度、时间成比。
[0089] 表4木榄叶乙酸乙酯部位作用24小时后对SW1990细胞的调亡影响
[0090]
[0091] 表5木榄叶乙酸乙酯部位作用48h后对SW1990细胞的调亡影响
[0092]
[0093] 表6木榄叶乙酸乙酯部位对SW1990细胞72小时调亡影响
[0094]
[0095] 四、木榄叶乙酸乙酯部位对胰腺癌细胞SW1990的凋亡蛋白Caspase-3、Bc1-2、Bax表达的影响
[0096] 1.材料
[0097] 1.1细胞株：SW1990
[0098] 1.2试剂
[0099] RIPA裂解缓冲液；BCA蛋白定量试剂盒，购自美国Tremor Fisher公司(批号：23227)、过硫酸铵(APS)，购自江苏物技术股份有限公司(批号：KG750425)；
[0100] TEMED，购自北京索莱宝科技有限公司(批号：78090)、5×变性浓缩胶缓冲液，购自杭州弗德生物科技有限公司(批号：20161220)、10×SDS-PAGE电泳液，购自中国北京普利莱基因技术有限公司(批号：122517171221)；
[0101] 10×蛋白半干法转膜缓冲液，购自北京索莱宝科技有限公司(批号：20170907)、彩色预染蛋白质分子量，购自江苏凯基生物技术股份有限公司(批号：20171002)；WB封闭液，购自上海碧云天生物科技有限公司(批号：111417171130)；WB一抗稀释，购自上海碧云天生物科技有限公司(批号：122517171221)；WB二抗稀释，购自上海碧云天生物科技有限公司(批号：111417171130)；膜再生液；ECL化学发光检测试剂盒，购自中国碧云天生物技术有限公司(批号：081417170904)；
[0103] 鼠抗人Bc1-2克隆抗体，购自美国abcam公司(批号：ab692)；
[0104] 鼠抗人Bax克隆抗体，购自美国abcam公司(批号：ab77566)；
[0105] 鼠抗人Caspase-3克隆抗体，购自美国Novus公司(批号：NB100-56708)；
[0106] 兔抗人β-catenin克隆抗体，购自美国Cell Signaling Technology公司(批号：4970S)。
[0107] 2.方法
[0108] Western blot法和免疫细胞化学(ICC)检测不同浓度木榄叶乙酸乙酯提取物对Caspase-3、Bc1-2、Bax基因蛋白表达的影响。
[0109] 3.结果
[0110] 如表7和图3所示，Western blot方法检测结果显示木榄叶乙酸乙酯提取物上调胰腺癌SW1990细胞的Caspase-3、Bax、Bc1-2蛋白表达，下调Bc1-2/Bax的比值。
[0111] 如表8-10所示，免疫细胞化学(ICC)检测表明，Caspase-3和Bax促凋亡蛋白的荧光强度和药物浓度成正比，这与western blot中的Caspase-3蛋白的表达一致。Bax抗凋亡蛋白的荧光强度也随着药物浓度的递增变强，这结果与western blot的结果也一致。说明了木榄叶乙酸乙酯部位对胰腺癌SW1990凋亡作用是通过上调Caspase-3、Bc1-2、Bax基因蛋白的表达，下调Bcl/Bax的实现的。
[0112] 表7不同浓度木榄叶乙酸乙酯部位对caspase-3、bcl-2、bax基因蛋白的表达影响[0113]
[0114] 表8不同浓度木榄叶乙酸乙酯提取物对Caspase-3基因蛋白的表达影响(x±s)[0115]
[0116] 表9不同浓度木榄叶乙酸乙酯提取物对Bc1-2基因蛋白的表达影响
[0117]
[0118] 表10不同浓度木榄叶乙酸乙酯部位对Bax基因蛋白的表达影响
[0119]
[0120] 结论：
[0121] 1.木榄叶乙醇提取物、石油醚提取物、乙酸乙酯提取物对胰腺癌细胞SW1990增殖均有明显抑制作用；且木榄叶乙酸乙酯部位抑制胰腺癌SW1990增殖作用最明显，采用单细胞克隆也证明木榄叶乙酸乙酯部位对胰腺癌SW1990增殖具有明显抑制作用。
[0122] 2.木榄叶乙酸乙酯部位提取物可显著抑制胰腺癌SW1990的迁移和侵袭，其抑制增殖作用与时间及浓度呈正相关，提示木榄叶乙酸乙酯部位提取物具有确切的抗胰腺癌SW1990作用。
[0123] 3.木榄叶乙酸乙酯部位提取物抑制胰腺癌SW1990的作用可能与其上调Caspase-3、Bax、Bc1-2蛋白表达，下调Bc1-2/Bax蛋白比值密切相关。
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