硫化氢的化学传感剂
阅读：158发布：2021-06-20
专利汇可以提供硫化氢的化学传感剂专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了 硫化氢 的选择性化学传感剂。所述化学传感剂可在温和条件下快速起作用，在化学上稳定以供长期贮存，在接近生理学条件下能灵敏检测，在生理学相关的硫化氢浓度范围内展现线性浓度- 信号 关系以便于定量，展现由血液中的其它阴离子引起的极少干扰或无干扰，并且在 水 性溶液和 血浆 中起作用。，下面是硫化氢的化学传感剂专利的具体信息内容。
1.一种检测样品中的硫化氢的方法，所述方法包含使所述样品与化学传感剂接触，所述化学传感剂包含荧光团和可以与硫化氢反应的官能团。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述化学传感剂是由下式定义：
F-X-Y-RFG
其中
RFG表示反应性官能团；
Y不存在，或表示活化基团；
X不存在，或表示间隔基团；并且
F为荧光团。
3.根据权利要求2所述的方法，其中RFG为叠氮基。
4.根据权利要求2到3中任一权利要求所述的方法，其中Y为磺酰基或羰基。
5.根据权利要求2到4中任一权利要求所述的方法，其中所述间隔基团不存在。
6.根据权利要求1到5中任一权利要求所述的方法，其中所述荧光团是选自由以下各物组成的群组：呫吨、呫吨衍生物、花青、花青衍生物、萘、萘衍生物、香豆素、香豆素衍生物、噁二唑衍生物、芘、芘衍生物、噁嗪衍生物、吖啶、吖啶衍生物、芳基次甲基衍生物、四吡咯衍生物、芴和芴衍生物。
7.根据权利要求1到6中任一权利要求所述的方法，其中所述荧光团为萘或萘衍生物。
8.根据权利要求1到7中任一权利要求所述的方法，其中所述化学传感剂是由式I定义
式I
其中
R1和R2独立地为氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基，或者取代或未取代的杂芳基；或
R1和R2连同其所连接的氮原子一起形成4到8元杂环。
9.根据权利要求8所述的方法，其中R1和R2都是烷基。
10.根据权利要求8所述的方法，其中R1为苯基并且R2为氢。
11.根据权利要求8所述的方法，其中所述化学传感剂是由以下结构之一定义
12.根据权利要求1到7中任一权利要求所述的方法，其中所述化学传感剂是由式II定义
式II
其中
Y不存在，或表示活化基团；
R3为氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的芳烷基、取代或未取代的杂环基，或者取代或未取代的杂芳基；
R4-R8在每次出现时独立地为氢；取代或未取代的烷基；取代或未取代的芳基；取代或未取代的芳烷基；取代或未取代的杂环基；或者取代或未取代的杂芳基；卤素；羟基；羰基，例如羧基、烷氧羰基、甲酰基或酰基；硫羰基，例如硫酯基、硫乙酸酯基或硫甲酸酯基；烷氧基；磷酰基；磷酸酯基；膦酸酯基；亚膦酸酯基；氨基；酰胺基；脒基；亚胺基；氰基；硝基；
氢硫基；烷硫基；硫酸酯基；磺酸酯基；氨磺酰基；磺酰胺基；磺酰基；硅烷基；或三氟甲基。
13.根据权利要求12所述的方法，其中Y不存在，R3为C1-C12取代或未取代的烷基，并且R4-R8为氢。
14.根据权利要求1到13中任一权利要求所述的方法，其中所述样品为水性溶液。
15.根据权利要求1到14中任一权利要求所述的方法，其中所述样品为生物样品。
16.根据权利要求1到15中任一权利要求所述的方法，其中所述样品为体液。
17.根据权利要求1到16中任一权利要求所述的方法，另外包含测量所述化学传感剂的荧光。
18.根据权利要求1到17中任一权利要求所述的方法，其中所述化学传感剂的所述反应性官能团被所述硫化氢还原。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述反应性官能团的还原引起所述化学传感剂的最大发射波长的变化、所述化学传感剂的荧光量子产率的变化、所述化学传感剂的发射光谱的形状的变化、所述化学传感剂的荧光寿命的变化和以上的组合。
20.根据权利要求1到19中任一权利要求所述的方法，其中所述化学传感剂在不加入任何额外试剂的情况下与所述硫化氢反应。
21.根据权利要求1到20中任一权利要求所述的方法，其中针对硫化氢的检测极限小于100μM。
22.根据权利要求1到21中任一权利要求所述的方法，其中在所述最大发射波长下所测量，所述化学传感剂的荧光强度在与所述硫化氢接触后不到十分钟即达到平衡。
23.根据权利要求1到22中任一权利要求所述的方法，其中所述化学传感剂被固定于固体载体上。
24.一种由下式表示的化学传感剂，
其中F为荧光团。
25.根据权利要求24所述的化学传感剂，其中所述荧光团是选自由以下各物组成的群组：呫吨、呫吨衍生物、花青、花青衍生物、萘、萘衍生物、香豆素、香豆素衍生物、噁二唑衍生物、芘、芘衍生物、噁嗪衍生物、吖啶、吖啶衍生物、芳基次甲基衍生物、四吡咯衍生物、芴和芴衍生物。
26.根据权利要求24到25中任一权利要求所述的化学传感剂，其中所述化学传感剂是由式I定义
式I
其中
R1和R2独立地为氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基，或者取代或未取代的杂芳基；或
R1和R2连同其所连接的氮原子一起形成4到8元杂环。
27.根据权利要求24所述的化学传感剂，其中R1和R2都是烷基。
28.一种由式II定义的化学传感剂，
式II
其中
Y不存在，或表示活化基团；
R3为氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的芳烷基、取代或未取代的杂环基，或者取代或未取代的杂芳基；
R4-R8在每次出现时独立地为氢；取代或未取代的烷基；取代或未取代的芳基；取代或未取代的芳烷基；取代或未取代的杂环基；或者取代或未取代的杂芳基；卤素；羟基；羰基，例如羧基、烷氧羰基、甲酰基或酰基；硫羰基，例如硫酯基、硫乙酸酯基或硫甲酸酯基；烷氧基；磷酰基；磷酸酯基；膦酸酯基；亚膦酸酯基；氨基；酰胺基；脒基；亚胺基；氰基；硝基；
氢硫基；烷硫基；硫酸酯基；磺酸酯基；氨磺酰基；磺酰胺基；磺酰基；硅烷基；或三氟甲基。
29.根据权利要求28所述的化学传感剂，其中Y不存在，R3为C1-C12取代或未取代的烷基，并且R4-R8为氢。
30.根据权利要求24到29中任一权利要求所述的化学传感剂，其中所述化学传感剂是由以下结构之一定义
硫化氢的化学传感剂
技术领域
[0001] 本发明大体上涉及化学传感剂领域，更具体来说涉及用于检测硫化氢的方法和组合物。
背景技术
[0002] 传统上，硫化氢（H2S）因其难闻的气味而众所周知，并且被认为是一种有毒气体。然而，最新研究已表明，H2S是一种内源产生的气态信号传导化合物（气体递质（gasotransmitter）），它的重要性与其它两种已知的内源性气体递质，即氧化氮（NO）（E.库洛塔,D.E.科什兰德,《科学》1992,258,1862-1865（E.Culotta,D.E.Koshland,Science1992,258,1862-1865））和一氧化碳（CO）（T.森田,M.A.佩瑞拉,M.E.李,S.寇姆班纳斯,《美国国家科学院汇刊》1995,92,1475-1479（T.Morita,M.A.Perrella,M.E.Lee,S.Kourembanas,P.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1995,92,1475-1479））不相上下。研究已表明，H2S通过充当K-ATP通道开放剂（W.M.赵,J.张,Y.J.陆,R.王,《欧洲分子生物学杂志》2001,20,6008-6016（W.M.Zhao,J.Zhang,Y.J.Lu,R.Wang,EMBOJ.2001,20,6008-6016））而在心血管系统中起到调节作用（D.J.乐费,《美国国家科学院汇刊》2007,104,17907-17908（D.J.Lefer,P.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2007,104,17907-17908））。H2S 在 中 枢 神 经 系统（K.亚 伯,H.木 村,《神 经 科 学 杂 志》1996,16,1066-1071（K.Abe,H.Kimura,J.Neurosci.1996,16,1066-1071）；D.博宁,S.H.史奈德,《神经科学年评》2003,26,105-131（D.Boehning,S.H.Snyder,Annu.Rev.Neurosci.2003,26,105-131）；H.木村,《分子神经生物学》2002,26,13-19（H.Kimura,Mol.Neurobiol.2002,26,13-19））、呼吸系统、胃肠系统和内分泌系统（A.马爹利等人,《医药研究评论》2011（A.Martelli,et al.,Med.Res.Rev.2011））中也起到调节剂的作用。这些发现表明，H2S展现了NO的许多有益作用，同时不产生有毒活性氧物质（reactive oxygen species，ROS）。事实上，H2S充当ROS的抗氧化剂或清除剂。因此，对于了解硫化氢的生理学和病理学功能的兴趣在持续增加（A.马爹利等人,《医药研究评论》2011；P.K.摩尔,M.巴蒂亚,S.穆哈拉,《药物科学趋势》2003,24,609-611（P.K.Moore,M.Bhatia,S.Moochhala,Trends Pharmacol.Sci.2003,24,609-611）；R. 王 ,《实验生物学联合会会刊》2002,16,1792-1798（R.Wang,FASEB J.2002,16,1792-1798））。
[0003] 对于H2S在生物系统中的作用的研究进展因缺乏允许快速并精确检测H2S的传3+
感器和试剂而显著受限。分析硫化物的标准方法是基于在Fe 和盐酸存在下硫化物与N,N-二甲基对苯二胺之间的反应的比色分析（W.雷,P.K.达斯古普塔,《分析化学学报》
1989,226,165-170（W.Lei,P.K.Dasgupta,Anal.Chim.Acta1989,226,165-170）；M.N. 休斯,MN.森特略斯,K.P.摩尔,《自由基生物学与医学》2009,47,1346-1353（M.N.Hughes,M.N.Centelles,K.P.Moore,Free Radical Bio.Med.2009,47,1346-1353））。如下所示，所述反应产生亚甲基蓝，这是一种在670nm下具有特征性最大吸收的常见染料。
感器和试剂而显著受限。分析硫化物的标准方法是基于在Fe 和盐酸存在下硫化物与N,N-二甲基对苯二胺之间的反应的比色分析（W.雷,P.K.达斯古普塔,《分析化学学报》
1989,226,165-170（W.Lei,P.K.Dasgupta,Anal.Chim.Acta1989,226,165-170）；M.N. 休斯,MN.森特略斯,K.P.摩尔,《自由基生物学与医学》2009,47,1346-1353（M.N.Hughes,M.N.Centelles,K.P.Moore,Free Radical Bio.Med.2009,47,1346-1353））。如下所示，所述反应产生亚甲基蓝，这是一种在670nm下具有特征性最大吸收的常见染料。
[0004]
[0005] 实际上，所述比色分析涉及将乙酸锌、N,N-二甲基对苯二胺二盐酸盐的7.2M HCl溶液和FeCl3的1.2M HCl溶液加入含有未知量的硫化物的水溶液样品中。培育10到30分钟后，将三氯乙酸加入反应混合物中。然后将样品离心，并且使用分光光度计测量上清液中亚甲基蓝的吸收。通过对上清液的吸光度与标准校准曲线进行比较来测定样品中硫化物的量。
[0006] 这种H2S检测方法虽然适用于一些应用，但具有许多固有缺点。首先，此分析需要较长反应时间（10-30分钟）、有毒试剂和相对苛刻的反应条件。另外，在670nm下的吸收与H2S浓度之间的关系因亚甲基蓝在溶液中倾向于形成二聚物和三聚物而不是线性关系（M.N.休斯,M.N.森特略斯,K.P.摩尔,《自由基生物学与医学》2009,47,1346-1353）。
[0007] 另一种比色分析是由马第尼斯-马尼斯（Martinez-Manez）和同事所开发（D.希门尼斯,R.马第尼斯-马尼斯,F.山克隆,J.V.罗斯-里斯,A.本尼托,J.索托,《美国 化 学 会 志》2003,125,9000-9001（D.Jimenez,R.Martinez-Manez,F.Sancenon,J.V.Ros-Lis,A.Benito,J.Soto,J.Am.Chem.Soc.2003,125,9000-9001））。这种分析是基于吡喃鎓（pyrylium）-硫代吡喃鎓（thiopyrylium）转化。在加入硫化物的水/乙腈（1:1）溶液并进一步用H2SO4处理后，含有苯胺-吡喃鎓主链的染料转化为含有苯胺-硫代吡喃鎓主链的染料。这一转化伴有从洋红色到蓝色的极大颜色变化。
[0008] 这种分析虽然简单易行，但其检测极限仅为约200μM。对于许多应用来说，需要较低的检测极限。举例来说，H2S的生理学浓度通常是在约10-100μM范围内（J.C.萨伐格,D.H.古尔德,《色谱学杂志：生物医学应用》1990,526,540-545（J.C.Savage,D.H.Gould,J.Chromatogr.Biomed.1990,526,540-545）；L.R.古德温等人,《分析毒物学杂志》1989,13,105-109（L.R.Goodwin,et al,J Anal.Toxicol.1989,13,105-109））。因此，这种探针的效用受到限制。
[0009] 也已经报道了用于检测H2S的灵敏电化学方法。然而，这些分析需要尖端的仪器装备和较长平衡时间，大大限制了其应用潜力（M.N.休斯,M.N.森特略斯,K.P.摩尔,《自由基生物学与医学》2009,47,1346-1353）。举例来说，已知H2S的分解代谢很快，使得H2S浓度在体内连续波动。因此，需要相当多平衡时间的分析无法用作生物传感器来测量H2S水平。
[0010] 因此，需要开发快速并选择性检测生物系统中的硫化物的新颖方法。因此，本发明的目的在于，提供用于检测和定量水性溶液中的H2S的改良的化学传感剂。
[0011] 本发明的目的还在于，提供以较低的检测极限和/或缩短的平衡时间检测和定量H2S的化学传感剂。
[0012] 本发明的目的还在于，提供用于检测和定量H2S的化学传感剂，除所述化学传感剂外，不需要额外试剂来与H2S反应和/或使其稳定。
[0013] 本发明的另一目的在于，提供检测生物系统中的硫化物的方法。
发明内容
[0014] 提供用于检测和/或定量H2S的化学传感剂。所述化学传感剂含有一个或一个以上共价连接于荧光团的反应性官能团。这些反应性官能团可以是在H2S存在下发生化学反应的任何部分。反应性官能团与荧光团共价连接以使得反应性官能团与H2S的反应引起荧光团光物理性质的一种或一种以上利用光谱法可观察的变化。利用光谱法可观察的变化的实例包括吸收波长的变化、发射波长的变化、荧光寿命的变化和荧光量子产率的变化。荧光量子产率的变化可以包括在分析物暴露后荧光强度降低（称为“淬灭”）或在分析物暴露后荧光强度增加。在优选实施例中，利用光谱法可观察的变化是化学传感剂的荧光变化。
[0015] 在某些实施例中，化学传感剂被设计成在生理学条件下与H2S快速反应，在化学上稳定以供长期贮存，在生理学相关的H2S浓度范围内展现线性浓度-信号关系，展现由血液中的其它阴离子产生的极少干扰或无干扰，在水性溶液（包括血液和血浆）中起作用，和其组合。在一些实施例中，化学传感剂与H2S在水性溶液中在额外试剂不存在下反应。
[0016] 在一些实施例中，化学传感剂对于H2S具有足够低的检测极限从而可被用于生物传感应用中。在优选实施例中，荧光分析的检测极限小于100μM，更优选小于50μM，更优选小于25μM，更优选小于10μM。
[0017] 在一些实施例中，化学传感剂在暴露于H2S后具有较短的平衡时间。在优选实施例中，在最大发射波长下所测量，化学传感剂的荧光强度在与H2S接触后不到十分钟，更优选在与H2S接触后不到六分钟，最优选在与H2S接触后不到三分钟达到平衡。
[0018] 在一些实施例中，在化学传感剂暴露于H2S之前，检测不到化学传感剂或可微弱地检测到化学传感剂；然而，在暴露于H2S后，化学传感剂形成一种可以容易地通过所属领域中已知的一种或一种以上分析技术测量的可检测物质。在某些实施例中，在化学传感剂暴露于H2S之前，化学传感剂不具有荧光或具有微弱荧光；然而，在暴露于H2S后，化学传感剂形成一种可以容易地测量或观察的荧光物质。在特定实施例中，在化学传感剂暴露于H2S之前化学传感剂的量子产率小于0.05，更优选在化学传感剂暴露于H2S之前量子产率小于0.01，更优选在化学传感剂暴露于H2S之前量子产率小于0.005；然而，在暴露于H2S后，化学传感剂形成一种可以容易地测量或观察的荧光物质。
[0019] 在一些实施例中，化学传感剂由下式表示：
[0020] F-X-Y-RFG
[0021] 其中
[0022] RFG表示H2S反应性官能团；
[0023] Y不存在，或表示活化基团；
[0024] X不存在，或表示间隔基团；并且
[0025] F为荧光团。
[0026] 所述反应性官能团可以是在暴露于H2S后起反应的任何化学部分。在某些实施例中，反应性官能团是在暴露于H2S后被还原的化学部分。在优选实施例中，反应性官能团是可以被硫化物还原形成胺的叠氮基。
[0027] 所述荧光团可以是小分子或大分子。在一些实施例中，荧光团是含有一个或一个以上芳香环的有机或有机金属小分子。在特定实施例中，荧光团为呫吨或呫吨衍生物、花青或花青衍生物、萘或萘衍生物、香豆素或香豆素衍生物、噁二唑衍生物、芘或芘衍生物、噁嗪衍生物、吖啶衍生物、芳基次甲基（arylmethine）衍生物、四吡咯衍生物，或者芴或芴衍生物。在一些实施例中，荧光团为萘或萘衍生物，例如丹酰或丹酰衍生物或者萘二甲酰亚胺或萘二甲酰亚胺衍生物。
[0028] 化学传感剂可任选地含有连接反应性官能团和荧光团的活化基团。当存在时，活化基团用来影响反应性官能团与H2S的反应速率。通过提高或降低反应性官能团与H2S的反应速率，可以制备出具有特定传感应用所需的反应速率的化学传感剂。
[0029] 在一些实施例中，官能团的反应（例如还原）速率可能太慢而对于想要的体内或体外应用不实用。因此，可以通过引入提高反应性官能团与H2S的反应速率的活化基团来提高还原速率。在某些实施例中，活化基团为吸电子基团，例如羰基、亚砜基或磺酰基。
[0030] 化学传感剂可以另外在荧光团与活化基团（如果存在）和反应性官能团之间含有间隔基团。当存在时，间隔基团不应显著不利地影响反应性官能团的反应速率和/或反应产物被检测或测量的能力。
[0031] 在特定实施例中，活化基团为磺酰基，间隔基团不存在，并且反应性官能团为叠氮基。在这些实施例中，化学传感剂由下式表示：
[0032]
[0033] 其中
[0034] F为如上文所描述的荧光团。
[0035] 在某些实施例中，化学传感剂是由式I定义
[0036]
[0037] 式I
[0038] 其中
[0039] R1和R2独立地为氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基，或者取代或未取代的杂芳基；或
[0040] R1和R2连同其所连接的氮原子一起形成4到8元杂环。
[0041] 在某些实施例中，R1和R2都是甲基。在其它实施例中，R1为苯基并且R2为氢。
[0042] 在某些实施例中，化学传感剂为以下所示化合物之一。
[0043]
[0044] 在某些实施例中，化学传感剂是由式II定义
[0045]
[0046] 式II
[0047] 其中
[0048] Y不存在，或表示活化基团；
[0049] R3为氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的芳烷基、取代或未取代的杂环基，或者取代或未取代的杂芳基；
[0050] R4-R8在每次出现时独立地为氢；取代或未取代的烷基；取代或未取代的芳基；取代或未取代的芳烷基；取代或未取代的杂环基；或者取代或未取代的杂芳基；卤素；羟基；羰基，例如羧基、烷氧羰基、甲酰基或酰基；硫羰基，例如硫酯基、硫乙酸酯基或硫甲酸酯基；
烷氧基；磷酰基；磷酸酯基；膦酸酯基；亚膦酸酯基；氨基；酰胺基；脒基；亚胺基；氰基；硝基；氢硫基；烷硫基；硫酸酯基；磺酸酯基；氨磺酰基；磺酰胺基；磺酰基；硅烷基；或三氟甲基。
烷氧基；磷酰基；磷酸酯基；膦酸酯基；亚膦酸酯基；氨基；酰胺基；脒基；亚胺基；氰基；硝基；氢硫基；烷硫基；硫酸酯基；磺酸酯基；氨磺酰基；磺酰胺基；磺酰基；硅烷基；或三氟甲基。
[0051] 在某些实施例中，Y不存在，R3为C1-C12取代或未取代的烷基，并且R4-R8为氢。
[0052] 在一个特定实施例中，化学传感剂是由以下所示结构定义。
[0054] 图1是显示化学传感剂DNS-Az(2)对硫化物的相对荧光反应的柱状图。图1绘制了在不同溶剂系统（从左到右为去离子水、20-100mM磷酸钠缓冲液（pH7.5）、含0.5%吐温-20（Tween-20）的20mM磷酸钠缓冲液（pH7.5）、乙腈:水（1:1）、水:磷酸钠缓冲液（1:1）和乙腈）中所测量的单独DNS-Az（2，空心柱，100μM，λEx=340nm，λEm=517nm）和加入10μM Na2S后（实心柱，λEx=340nm，λEm=517nm）的荧光强度（任意单位）。
[0055] 图2是显示单独DNS-Az（2，100μM于含有0.5%吐温-20的20mM磷酸钠缓冲液中，λEx=340nm）和加入各种阴离子（Na2S（25μM）、NaCl（1mM）、NaBr（1mM）、NaI（1mM）、NaF（1mM）、NaOH（1mM）、NaOAc（1mM）、NaCN（1mM）、NaN3（1mM）、NaNO2（1mM）、Na2CO3（1mM）、NaHSO3（100μM）、Na2SO4（1mM）、Na2S2O3（1mM）、Na2S2O4（100μM）、Na2S2O5（100μM）、Na2HPO3（1mM）和柠檬酸钠（1mM））后的荧光强度（任意单位）与发射波长（nm）的函数关系的图。在Na2S（25μM）加入DNS-Az后所获得的荧光光谱以虚线显示。所有其它荧光光谱是以实心灰线展示。
[0056] 图3是显示市售小牛血清（×）中的DNS-Az（200μM，Na2S0-100μM）（λEx=340nm，λEm=535nm）和缓冲液/吐温（●）中的DNS-Az（100μM，Na2S0-100μM）（λEx=340nm，λEm=535nm）的荧光强度（任意单位）与Na2S浓度（μM）的函数关系的图。使用96孔盘和微量盘读取器收集数据，一式三份。使用在市售小牛血清（y=74057x+356179；R2=0.9959）和在缓冲液/吐温（y=36044x+13763；R2=0.9996）中所获得的荧光数据绘制最佳拟合线。
[0057] 图4A是显示在加入硫化物（30μM Na2S）后小牛血清中的DNS-Az（2，100μM）的荧光强度（任意单位）与发射波长（nm）的函数关系的图。在加入Na2S之前和在加入Na2S后的一段3分钟时间内收集发射光谱。将在加入Na2S后的不同时间间隔收集的发射光谱重叠，显示在加入Na2S后荧光强度随时间增加。图4B是显示在493nm下DNS-Az（2，100μM）的荧光强度（任意单位）与反应时间（秒）的函数关系的图。
[0058] 图5是显示DNS-Az（2，实线）和DNS-NH2（3，虚线）（两者都是在乙腈中，100μM）的UV吸收光谱（绘制了吸光度与波长（nm）的函数关系）的图。
[0059] 图6A是显示在加入硫化物（30μM Na2S）后20mM磷酸盐缓冲液:乙腈（1:1）中的DNS-Az（2，100μM）的荧光强度（任意单位）与发射波长（nm）的函数关系的图。在加入Na2S之前及在加入Na2S后10、30、60、90、120、150和180秒收集发射光谱。将在Na2S加入DNS-Az中后的不同时间间隔收集的发射光谱重叠，显示在加入Na2S后荧光强度随时间增加。图6B是显示在528nm下DNS-Az（2，100μM）的荧光强度（任意单位）与反应时间（秒）的函数关系的图。
[0060] 图7A是显示在加入硫化物（30μM Na2S）后20mM磷酸盐缓冲液/0.05%吐温-20中的DNS-Az（2，100μM）的荧光强度（任意单位）与发射波长（nm）的函数关系的图。在加入Na2S之前及在加入Na2S后10、30、60、90、120、150、180、210、240、270、360和600秒收集发射光谱。将在Na2S加入DNS-Az中后的不同时间间隔收集的发射光谱重叠，显示在加入Na2S后荧光强度随时间增加。图7B是显示在517nm下DNS-Az（2，100μM）的荧光强度（任意单位）与反应时间（秒）的函数关系的图。
[0061] 图8是在加入不同量的Na2S（0-50μM）后在528nm下磷酸盐缓冲液:乙腈（1:1）中的30μM DNS-Az(2)的荧光强度（任意单位）的图。
[0062] 图9A是显示20mM磷酸盐缓冲液/0.5%吐温中的DNS-Az(2)（25μM）的荧光强度（任意单位）与发射波长（nm）的函数关系的图。在UV照射之前及在340nm下UV照射30秒、1分钟、2分钟、5分钟、10分钟和20分钟后收集发射光谱。图9B是显示在457nm下DNS-Az(2)（25μM于20mM磷酸盐缓冲液/0.5%吐温中）的荧光强度（任意单位）与在340nm下UV照射时间（分钟）的函数关系的点阵图。
[0063] 图10是显示在Na2S（×，25μM）、苯甲基硫醇（+，BzSH，50μM）、苯硫酚（▲，PhSH，50μM）和半胱氨酸（●，50μM）存在下20mM磷酸盐缓冲液/0.5%吐温-20中的DNS-Az(2)（100μM）在517nm下的荧光强度（任意单位）与时间的函数关系的图。
[0064] 图11是显示在Na2S（×，30μM）、苯甲基硫醇（+，BzSH，50μM）、苯硫酚（▲，PhSH，50μM）和半胱氨酸（●，50μM）存在下20mM磷酸盐缓冲液/乙腈1:1中的DNS-Az(2)（100μM）在528nm下的荧光强度（任意单位）与时间的函数关系的图。
[0065] 图12是显示在Na2S（×，30μM）、赖氨酸（▲，50mM）和甘氨酸（●，50mM）存在下20mM磷酸盐缓冲液/0.5%吐温-20中的DNS-Az(2)（100μM）在517nm下的荧光强度（任意单位）与时间的函数关系的图。
[0066] 图13是显示在各种溶剂（水、缓冲液、缓冲液/吐温、乙腈/水、乙腈/缓冲液、乙腈、BSA和牛血清）中的DNS-NH2（5μM）的荧光强度（任意单位）与发射波长（nm）的函数关系的图。发射波长和荧光强度都具有溶剂依赖性。
具体实施方式
[0067] I.定义
[0068] “叠氮基”与“叠氮化物”在本文中可互换使用，并且是指具有以下所示化学式的官能团。
[0069]
[0070] 如本文中所使用，“化学传感剂”是指响应于分析物的存在而展现利用光谱法可观察的变化的化合物。利用光谱法可观察的变化的实例包括吸收波长的变化、发射波长的变化、荧光寿命的变化和荧光量子产率的变化。荧光量子产率的变化可以包括在分析物暴露后荧光强度降低（称为“淬灭”）或在分析物暴露后荧光强度增加。在优选实施例中，利用光谱法可观察的变化是化学传感剂的荧光变化，例如化学传感剂的发射波长、荧光寿命和/或量子产率的变化。
[0071] 如本文中所使用，“吸电子基团”是指倾向于从分子中的相邻原子吸引价电子的有机官能团（即，官能团相对于相邻原子是电负性的）。有机官能团的相对吸电子能力可以由基团的哈梅特常数（Hammett constant）（σ）估计。参见例如马奇,“高等有机化学”,第th5版,2001,威利在线出版平台,纽约（March,"Advanced Organic Chemistry,"5 Edition,2001,Wiley-Interscience Publication,New York）。吸电子基团的哈梅特常数值一般是正数。示范性吸电子基团包括硝基、酰基、甲酰基、磺酰基、三氟甲基和氰基。
[0072] 如本文中所使用，“荧光团”是指具有发荧光能力的分子或部分，一般是聚芳香烃或杂环。发荧光能力或“荧光”一般被理解为从一种三阶段过程而来：（i）激发，其中荧光团吸收光子，形成电子激发态，其中荧光团相对于荧光团的正常电子态具有较大能量；（ii）激发态寿命（即荧光寿命），在此期间荧光团保持电子激发态，而且在此期间激发态的能量部分耗散；和（iii）发射，其中发射较低能量的光子。因此，荧光团吸收的光的波长（“激发波长”或“λEx”）与其发射的光的波长（“发射波长”或“λEm”）不同。
[0073] 如本文中所使用，“量子产率”是对荧光过程的效率的度量，并且定义为荧光团发射的光子数目与荧光团吸收的光子数目的比率。可以使用所属领域中已知的标准方法测量荧光团的荧光量子产率。参见例如拉克维兹,J.R.“荧光光谱学原理”,第2版,普莱南nd出版社,纽约,1999（Lakowicz,J.R."Principles of Fluorescence Spectroscopy",2 Ed.,Plenum Press,New York,1999）。
[0074] 如本文中所使用，“荧光分析”是指通过观察和/或测量化学传感剂对分析物的荧光反应来鉴别、检测和/或定量分析物的化学分析法。
[0075] 如本文中所使用，“荧光分析仪”是指可以分析和/或定量样品所发射的荧光的任何机器、仪器或装置。荧光分析仪的实例包括荧光计、荧光显微镜和流式细胞仪。
[0076] 如本文中所使用，“小分子”是指分子量小于约2000amu、更优选小于约1500amu、最优选小于约1000amu的分子。
[0077] 如本文中所使用，“大分子”是指通常具有较高的相对分子量的较大分子，例如聚合物、多糖、蛋白质、肽或核酸。大分子可以天然存在（即生物分子）或可以合成或半合成地制备。在某些实施例中，大分子的分子量大于约1000amu，更优选大于约1500amu，最优选大于约2000amu。
[0078] 如本文中所使用，“反应性官能团”是指在暴露于H2S后发生化学反应的化学部分。
[0079] 如本文中所使用，“平衡时间”是指从混合分析物与化学传感剂的时间点到关于化学传感剂所被测量的利用光谱法可观察的变化实质上不再变化的时间点的时间段。
[0081] 如本文中所使用，“样品”是指可以含有所关注分析物的固体、液体或气体，并且用化学传感剂查询以用于确定所关注分析物的存在、不存在、浓度或其组合的目的。在一些实施例中，收集固体、液体或气体以用于分析物检测目的。在优选实施例中，所述分析物为H2S。
[0082] 如本文中所使用，“衍生物”是指具有与母化合物相同的结合核心（即离域π电子系统），但与母化合物因一种或某些组分差异而不同的化合物。所述衍生物可以与母化合物例如在结合核心上存在的一个或一个以上取代基方面不同，所述取代基可以包括一个或一个以上原子、官能团或亚结构。一般来说，可以设想至少在理论上由母化合物通过一些化学或物理方法形成衍生物。举例来说，萘衍生物包括具有附于萘核心的一个或一个以上取代基的萘化合物。
[0083] 如本文中所使用，术语“烷基”是指饱和脂肪族基团，包括直链烷基、分支链烷基、环烷基（脂环族基团）、烷基取代的环烷基和环烷基取代的烷基。在优选实施例中，直链或分支链烷基在其主链中具有30个或更少碳原子（例如对于直链为C1-C30，对于分支链为C3-C30），并且更优选具有20个或更少碳原子。同样，优选环烷基在其环结构中具有3-10个碳原子，并且更优选在环结构中具有5、6或7个碳。如整个说明书、实例和权利要求书中所使用，术语“烷基”（或“低碳数烷基”）打算包括“未取代的烷基”和“取代的烷基”两者，其中后者是指具有一个或一个以上取代基置换了烃主链的一个或一个以上碳上的氢的烷基部分。所述取代基包括（但不限于）卤素、羟基、羰基（例如羧基、烷氧羰基、甲酰基或酰基）、硫羰基（例如硫酯、硫乙酸酯或硫甲酸酯）、烷氧基、磷酰基、磷酸酯、膦酸酯、亚膦酸酯、氨基、酰胺基、脒、亚胺、氰基、硝基、叠氮基、氢硫基、烷硫基、硫酸酯、磺酸酯、氨磺酰基、磺酰胺基、磺酰基、杂环基、芳烷基，或者芳香族或杂芳香族部分。
[0084] 除非另外说明碳的数目，否则如本文中所使用，“低碳数烷基”的意思是如上文所定义但在主链结构中具有一到十个、更优选一到六个碳原子的烷基。同样，“低碳数烯基”和“低碳数炔基”具有类似链长度。在整个申请案中，优选烷基为低碳数烷基。在优选实施例中，本文中称为烷基的取代基为低碳数烷基。
[0085] 所属领域的技术人员应了解，适当时，在烃链上取代的部分自身可以被取代。举例来说，取代的烷基的取代基可以包括卤素、羟基、硝基、硫醇、氨基、叠氮基、亚氨基、酰胺基、磷酰基（包括膦酸酯和亚膦酸酯）、磺酰基（包括硫酸酯、磺酰胺基、氨磺酰基和磺酸酯）和硅烷基，以及醚、烷硫基、羰基（包括酮、醛、羧酸酯和酯）、-CF3、-CN等。环烷基可以按相同方式进行取代。
[0086] 术语“烯基”和“炔基”是指长度和可能的取代与上述烷基类似，但分别含有至少一个双键或三键的不饱和脂肪族基团。
[0087] 如本文中所使用，“芳基”是指5、6和7元芳香环。所述环可以是碳环、杂环、稠合碳环、稠合杂环、双碳环或双杂环的环系统，任选地被卤素、烷基-、烯基-和炔基-取代。广义上，如本文中所使用，“Ar”包括可以包括零到四个杂原子的5、6和7元单环芳香族基团，例如苯、吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、噁唑、噻唑、三唑、吡唑、吡啶、吡嗪、哒嗪和嘧啶等。在环结构中具有杂原子的那些芳基也可以称为“杂芳基”、“芳基杂环”或“杂芳香族基”。芳香环可以在一个或一个以上环位置处被如上文所描述的取代基取代，例如卤素、叠氮基、烷基、芳烷基、烯基、炔基、环烷基、羟基、烷氧基、氨基、硝基、氢硫基、亚氨基、酰胺基、膦酸酯、亚膦酸酯、羰基、羧基、硅烷基、醚、烷硫基、磺酰基、磺酰胺基、酮、醛、酯、杂环基、芳香族或杂芳香族部分、--CF3、--CN等。术语“Ar”还包括具有两个或两个环的多环环系统，其中两个或两个以上碳为两个邻接环（这些环为“稠合环”）所共有，其中至少一个环为芳香族的，例如其它环可以是环烷基、环烯基、环炔基、芳基和/或杂环。杂环的实例包括（但不限于）苯并咪唑基、苯并呋喃基、苯并硫代呋喃基、苯并噻吩基、苯并噁唑基、苯并噁唑啉基、苯并噻唑基、苯并三唑基、苯并四唑基、苯并异噁唑基、苯并异噻唑基、苯并咪唑啉基、咔唑基、4aH咔唑基、咔啉基、色满基、色烯基、噌啉基、十氢喹啉基、2H,6H-1,5,2-二噻嗪基、二氢呋喃并[2,3b]四氢呋喃、呋喃基、呋咱基（furazanyl）、咪唑烷基、咪唑啉基、咪唑基、1H-吲唑基、吲哚烯基（indolenyl）、吲哚啉基、吲哚嗪基、吲哚基、3H-吲哚基、靛红酰基（isatinoyl）、异苯并呋喃基、异色满基、异吲唑基、异吲哚啉基、异吲哚基、异喹啉基、异噻唑基、异噁唑基、亚甲基二氧基苯基、吗啉基、萘啶基、八氢异喹啉基、噁二唑基、1,2,3-噁二唑基、1,2,4-噁二唑基、1,2,5-噁二唑基、1,3,4-噁二唑基、噁唑烷基、噁唑基、羟吲哚基、嘧啶基、菲啶基、菲咯啉基（phenanthrolinyl）、吩嗪基、吩噻嗪基、吩噁噻基（phenoxathinyl）、吩噁嗪基（phenoxazinyl）、酞嗪基、哌嗪基、哌啶基、哌啶酮基、4-哌啶酮基、胡椒基（piperonyl）、蝶啶基（pteridinyl）、嘌呤基、吡喃基、吡嗪基、吡唑烷基、吡唑啉基、吡唑基、哒嗪基、吡啶并噁唑、吡啶并咪唑、吡啶并噻唑、吡啶基（pyridinyl）、吡啶基（pyridyl）、嘧啶基、吡咯烷基、吡咯啉基、2H-吡咯基、吡咯基、喹唑啉基、喹啉基、4H-喹嗪基、喹喔啉基、奎宁环基（quinuclidinyl）、四氢呋喃基、四氢异喹啉基、四氢喹啉基、四唑基、6H-1,2,5-噻二嗪基、1,2,3-噻二唑基、1,2,4-噻二唑基、1,2,5-噻二唑基、1,3,4-噻二唑基、噻蒽基（thianthrenyl）、噻唑基、噻吩基（thienyl）、噻吩并噻唑基、噻吩并噁唑基、噻吩并咪唑基、噻吩基（thiophenyl）和呫吨基（xanthenyl）。
[0088] 如本文中所使用，“烷基芳基”是指被芳基（例如芳香族或杂芳香族基团）取代的烷基。
[0089] 如本文中所使用，“杂环（heterocycle）”或“杂环的（heterocyclic）”是指通过单环或双环的环碳或氮连接的环状基团，所述环含有3-10个环原子并且优选5-6个环原子，所述环原子由碳和一到四个杂原子组成，所述杂原子各选自由非过氧化物氧、硫和N(Y)组成的群组，其中Y不存在或为H、O、(C1-4)烷基、苯基或苯甲基，并且所述环任选地含有一个或一个以上双键或三键，并且任选地被一个或一个以上取代基取代。术语“杂环”也涵盖取代和未取代的杂芳基环。杂环的实例包括（但不限于）苯并咪唑基、苯并呋喃基、苯并硫代呋喃基、苯并噻吩基、苯并噁唑基、苯并噁唑啉基、苯并噻唑基、苯并三唑基、苯并四唑基、苯并异噁唑基、苯并异噻唑基、苯并咪唑啉基、咔唑基、4aH-咔唑基、咔啉基、色满基、色烯基、噌啉基、十氢喹啉基、2H,6H-1,5,2-二噻嗪基、二氢呋喃并[2,3-b]四氢呋喃、呋喃基、呋咱基、咪唑烷基、咪唑啉基、咪唑基、1H-吲唑基、吲哚烯基、吲哚啉基、吲嗪基、吲哚基、3H-吲哚基、靛红酰基、异苯并呋喃基、异色满基、异吲唑基、异吲哚啉基、异吲哚基、异喹啉基、异噻唑基、异噁唑基、亚甲基二氧基苯基、吗啉基、萘啶基、八氢异喹啉基、噁二唑基、1,2,3-噁二唑基、1,2,4-噁二唑基、1,2,5-噁二唑基、1,3,4-噁二唑基、噁唑烷基、噁唑基、羟吲哚基、嘧啶基、菲啶基、菲咯啉基、吩嗪基、吩噻嗪基、吩噁噻基、吩噁嗪基、酞嗪基、哌嗪基、哌啶基、哌啶酮基、4-哌啶酮基、胡椒基、蝶啶基、嘌呤基、吡喃基、吡嗪基、吡唑烷基、吡唑啉基、吡唑基、哒嗪基、吡啶并噁唑、吡啶并咪唑、吡啶并噻唑、吡啶基（pyridinyl）、吡啶基（pyridyl）、嘧啶基、吡咯烷基、吡咯啉基、2H-吡咯基、吡咯基、喹唑啉基、喹啉基、4H-喹嗪基、喹喔啉基、奎宁环基、四氢呋喃基、四氢异喹啉基、四氢喹啉基、四唑基、6H-1,2,5-噻二嗪基、1,2,3-噻二唑基、1,2,4-噻二唑基、1,2,5-噻二唑基、1,3,4-噻二唑基、噻蒽基、噻唑基、噻吩基、噻吩并噻唑基、噻吩并噁唑基、噻吩并咪唑基、噻吩基和呫吨基。
[0090] 如本文中所使用，“杂芳基”是指含有五或六个环原子的单环芳香环，所述环原子由碳和1、2、3或4个杂原子组成，所述杂原子各选自由非过氧化物氧、硫和N(Y)组成的群组，其中Y不存在或为H、O、(C1-C8)烷基、苯基或苯甲基。杂芳基的非限制性实例包括呋喃基、咪唑基、三唑基、三嗪基、噁唑基、异噁唑基、噻唑基、异噻唑基、吡唑基、吡咯基、吡嗪基、四唑基、吡啶基（或其N-氧化物）、噻吩基、嘧啶基（或其N-氧化物）、吲哚基、异喹啉基（或其N-氧化物）、喹啉基（或其N-氧化物）等。术语“杂芳基”可包括由其衍生的具有约八到十个环原子的邻位稠合的双环杂环基团，尤其是苯并衍生物或通过与亚丙基、三亚甲基或四亚甲基双自由基稠合所衍生的基团。杂芳基的实例可以是呋喃基、咪唑基、三唑基、三嗪基、噁唑基、异噁唑基、噻唑基、异噻唑基、吡唑基、吡咯基、吡嗪基、四唑基、吡啶基（或其N-氧化物）、噻吩基、嘧啶基（或其N-氧化物）、吲哚基、异喹啉基（或其N-氧化物）、喹啉基（或其N-氧化物）等。
[0091] 如本文中所使用，“取代的”是指本文所述化合物的所有可允许的取代基。在最广泛意义上，所述可允许的取代基包括有机化合物的非环状和环状、分支和未分支、碳环和杂环、芳香族和非芳香族取代基。在某些实施例中，“取代”的基团含有介于1与5个之间、更优选介于1与4个之间、最优选介于1与3个之间的取代基。
[0092] 说明性取代基包括（但不限于）卤素、羟基，或含有许多碳原子、优选1-14个碳原子的任何其它有机基团，并且在直链、分支链或环状结构形式中任选地包括一个或一个以上杂原子，例如氧、硫或氮基团。代表性取代基包括烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、苯基、取代的苯基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、卤基、羟基、烷氧基、取代的烷氧基、苯氧基、取代的苯氧基、芳氧基、取代的芳氧基、烷硫基、取代的烷硫基、苯硫基、取代的苯硫基、芳硫基、取代的芳硫基、氰基、异氰基、取代的异氰基、羰基、取代的羰基、羧基、取代的羧基、氨基、取代的氨基、酰胺基、取代的酰胺基、磺酰基、取代的磺酰基、磺酸、磷酰基、取代的磷酰基、膦酰基、取代的膦酰基、聚芳基、取代的聚芳基、C3-C20环基、取代的C3-C20环基、杂环基、取代的杂环基、氨基酸、肽和多肽基团。
[0093] 杂原子（例如氮）可具有氢取代基和/或本文所描述的有机化合物的任何可允许的取代基，所述取代基满足杂原子的价数。应了解，“取代”或“取代的”包括隐含的限制条件：所述取代是根据取代的原子和取代基的允许的价数进行，并且所述取代产生稳定化合物，即不会自发地经历例如通过重排、环化、消除等进行的转化。
[0094] 如本文中所使用，术语“硝基”的意思是-NO2并且术语“磺酰基”的意思是-SO2-。
[0095] II.化学传感剂
[0096] 提供了用于检测和定量H2S的化学传感剂。在H2S存在下，化学传感剂展现出可用于检测和/或定量H2S的一种或一种以上利用光谱法可观察的变化。利用光谱法可观察的变化的实例包括吸收波长的变化、发射波长的变化、荧光寿命的变化和荧光量子产率的变化。荧光量子产率的变化可以包括在分析物暴露后荧光强度降低（称为“淬灭”）或在分析物暴露后荧光强度增加。在优选实施例中，利用光谱法可观察的变化是化学传感剂的荧光变化。
[0097] 化学传感剂含有一个或一个以上连接于荧光团的反应性官能团。所述反应性官能团可以是在H2S存在下发生化学反应的任何部分。反应性官能团与荧光团共价连接以使得反应性官能团与H2S的反应引起荧光团光物理性质的一种或一种以上利用光谱法可观察的变化。
[0098] 在一些实施例中，在化学传感剂暴露于H2S之前，检测不到化学传感剂或可微弱地检测到化学传感剂。在这些情况下，在暴露于H2S后，化学传感剂形成一种可以容易地通过所属领域中已知的一种或一种以上分析技术测量的可检测物质。在优选实施例中，化学传感剂的荧光量子产率在暴露于H2S后增加。在特定实施例中，在化学传感剂暴露于H2S之前，化学传感剂不具有荧光或具有微弱荧光；然而，在暴露于H2S后，化学传感剂形成一种可以容易地通过所属领域中已知的一种或一种以上分析技术测量的荧光物质。
[0099] 在其它实施例中，在暴露于H2S之前，可利用光谱法检测化学传感剂。在这些情况下，化学传感剂暴露于H2S优选引起化学传感剂荧光的一种或一种以上变化。所述变化可以包括化学传感剂在暴露于H2S后量子产率降低（即淬灭）、化学传感剂对H2S的最大发射波长的移位、化学传感剂对H2S的发射光谱形状的变化、化学传感剂在暴露于H2S后荧光寿命的变化，和以上的组合。通过观察和/或测量荧光的这一种或一种以上变化，可以检测并定量H2S。
[0100] 在一些实施例中，化学传感剂是由下式表示：
[0101] F-X-Y-RFG
[0102] 其中
[0103] RFG表示反应性官能团；
[0104] Y不存在，或表示活化基团；
[0105] X不存在，或表示间隔基团；并且
[0106] F为荧光团。
[0107] 在特定实施例中，活化基团为磺酰基，间隔基团不存在，并且反应性官能团为叠氮基。在这些实施例中，化学传感剂是由下式表示：
[0108]
[0109] 其中F为荧光团。
[0110] 在某些实施例中，化学传感剂是由式I定义
[0111]
[0112] 式I
[0113] 其中
[0114] R1和R2独立地为氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基，或者取代或未取代的杂芳基；或
[0115] R1和R2连同其所连接的氮原子一起形成4到8元杂环。
[0116] 在某些实施例中，R1和R2都是甲基。在其它实施例中，R1为苯基并且R2为氢。
[0117] 在某些实施例中，化学传感剂为以下所示化合物之一。
[0118]
[0119] 在某些实施例中，化学传感剂是由式II定义
[0120]
[0121] 式II
[0122] 其中
[0123] Y不存在，或表示活化基团；
[0124] R3为氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的芳烷基、取代或未取代的杂环基，或者取代或未取代的杂芳基；
[0125] R4-R8在每次出现时独立地为氢；取代或未取代的烷基；取代或未取代的芳基；取代或未取代的芳烷基；取代或未取代的杂环基；或者取代或未取代的杂芳基；卤素；羟基；羰基，例如羧基、烷氧羰基、甲酰基或酰基；硫羰基，例如硫酯基、硫乙酸酯基或硫甲酸酯基；
烷氧基；磷酰基；磷酸酯基；膦酸酯基；亚膦酸酯；氨基；酰胺基；脒基；亚胺基；氰基；硝基；氢硫基；烷硫基；硫酸酯基；磺酸酯基；氨磺酰基；磺酰胺基；磺酰基；硅烷基；或三氟甲基。
烷氧基；磷酰基；磷酸酯基；膦酸酯基；亚膦酸酯；氨基；酰胺基；脒基；亚胺基；氰基；硝基；氢硫基；烷硫基；硫酸酯基；磺酸酯基；氨磺酰基；磺酰胺基；磺酰基；硅烷基；或三氟甲基。
[0126] 在某些实施例中，Y不存在，R3为C1-C12取代或未取代的烷基，并且R4-R8为氢。
[0127] 在一个特定实施例中，化学传感剂是由以下所示结构定义。
[0128]
[0129] A.荧光团
[0130] 用于检测和定量H2S的化学传感剂含有荧光团。所述荧光团具有光物理性质，这些性质根据在荧光团核心上的取代基的身份和化学性质而改变。因此，荧光团光谱性质的变化伴随着所连接的反应性官能团与H2S的反应而发生。
[0131] 选择的荧光团具有有助于观察和/或分析荧光团的光谱性质的光物理性质。举例来说，在某些实施例中，荧光团具有一有助于观察和测量化学传感剂的荧光的荧光量子产率。在一些情况下，在水性溶液中荧光团的量子产率为至少0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50、0.55、0.60、0.65、0.70、0.75、0.80、0.85或0.90。
[0132] 在一些情况下，化学传感剂被设计用于在生物样品中进行传感。在生物样品中，来自细胞、组织和生物流体的本底荧光（称为自发荧光）会使化学传感剂的荧光分析变得复杂。在一些情况下，荧光团在实质上与生物样品的自发荧光重叠的光谱区域内不具有发射最大值。在某些实施例中，在水性溶液中荧光团的发射最大值大于430nm、440nm、450nm、460nm、470nm、480nm、490nm、500nm、510nm、520nm、530nm、540nm、550nm、560nm、570nm、
580nm、590nm、600nm、610nm、620nm、630nm、640nm、650nm、660nm、670nm、680nm、690nm 或
700nm。在某些实施例中，在水性溶液中荧光团的发射最大值介于430nm与700nm之间，更优选介于450nm与700nm之间，最优选介于480nm与700nm之间。在一些实施例中，在水性溶液中荧光团的发射最大值介于430nm与1200nm之间，更优选介于450nm与1200nm之间，最优选介于480nm与1200nm之间。
580nm、590nm、600nm、610nm、620nm、630nm、640nm、650nm、660nm、670nm、680nm、690nm 或
700nm。在某些实施例中，在水性溶液中荧光团的发射最大值介于430nm与700nm之间，更优选介于450nm与700nm之间，最优选介于480nm与700nm之间。在一些实施例中，在水性溶液中荧光团的发射最大值介于430nm与1200nm之间，更优选介于450nm与1200nm之间，最优选介于480nm与1200nm之间。
[0133] 在优选实施例中，选择的荧光团具有特定传感应用所需的光物理性质，包括荧光量子产率和发射最大值。在一些实施例中，荧光团具有高量子产率并且在长波长下发射。在一个特定实施例中，在水性溶液中荧光团的发射最大值大于450nm并且量子产率大于
0.10。
0.10。
[0134] 任何合适的荧光团都可以并入上述化学传感剂中。适用于化学传感剂中的荧光团通常含有延长的结合路径（例如交替的单键和双键），在所述路径内π电子离域。荧光团可以是芳香族的，意思是它含有一个或一个以上芳香环；或是非芳香族的（例如线性结构）。在优选实施例中，荧光团含有一个或一个以上芳香环。
[0135] 在一些实施例中，荧光团为有机或有机金属小分子。合适的小分子荧光团为所属领域已知的，并且包括（但不限于）呫吨和呫吨衍生物，例如荧光素或荧光素衍生物、若丹明（rhodamine）、俄勒冈绿（Oregon green）、伊红（eosin）、德克萨斯红（Texas red）和Cal Fluor染料；花青和花青衍生物，例如靛羰花青、氧杂羰花青、硫杂羰花青、部花青素和Quasar染料；萘衍生物，例如丹酰和普罗丹（prodan）衍生物，以及萘二甲酰亚胺和萘二甲酰亚胺衍生物；香豆素和其衍生物；噁二唑衍生物，例如吡啶基噁二唑、硝基苯并噁二唑和苯并噁二唑；芘衍生物，例如级联蓝（cascade blue）；噁嗪衍生物，例如尼罗红（Nile red）、尼罗蓝（Nile blue）、甲酚紫（cresyl violet）和噁嗪170；吖啶衍生物，例如原黄素（proflavin）、吖啶橙和吖啶黄；芳基次甲基衍生物，例如槐黄（auramine）、结晶紫和孔雀绿（malachite green）；四吡咯衍生物，例如卟吩、酞花青和胆红素；芴衍生物； 染料（购自伯腾公司（Biotium））； （购自英杰公司（Invitrogen））；（购自英杰公司）； （购自赛默科技公司（Thermo Scientific））； 和
购自西格玛奥尔德里奇公司（Sigma Aldrich）；及 （购自英特驰公
司（Interchim））。其它适合的荧光团包括拉克维兹,J.R.“荧光光谱学原理”,第2版,普莱南出版社,纽约,1999中所描述的荧光团。
购自西格玛奥尔德里奇公司（Sigma Aldrich）；及 （购自英特驰公
司（Interchim））。其它适合的荧光团包括拉克维兹,J.R.“荧光光谱学原理”,第2版,普莱南出版社,纽约,1999中所描述的荧光团。
[0136] 合适的荧光团还可以包括大分子，例如共轭聚合物。在一些实施例中，荧光团为含有一个或一个以上含有反应性官能团的侧链的共轭聚合物，例如聚(亚芳基乙炔)。
[0137] B.反应性官能团
[0138] 用于H2S的化学传感剂含有一个或一个以上反应性官能团。所述一个或一个以上反应性官能团可以在每次出现时独立地为任何化学部分并可与H2S反应后形成不同的化学部分基团。在某些实施例中，反应性官能团是在与硫化物接触后被还原的化学部分。合适的反应性官能团的实例包括叠氮基和取代或未取代的蒽醌。
[0139] 在优选实施例中，所述一个或一个以上反应性官能团为叠氮基。叠氮基可以容易地被硫化物还原形成胺（F.卡兹米,A.R.凯撒特,S.赛亚海,《磷、硫和硅》
2004,179,1813-1817（F.Kazemi,A.R.Kiasat,S.Sayyahi,Phosphorus,Sulfur,and
Silicon2004,179,1813-1817））。
2004,179,1813-1817（F.Kazemi,A.R.Kiasat,S.Sayyahi,Phosphorus,Sulfur,and
Silicon2004,179,1813-1817））。
[0140] C.活化基团
[0141] 化学传感剂可以任选地含有与反应性官能团共价连接的活化基团。在某些实施例中，所述活化基团与荧光团隔开。在其它实施例中，荧光团的一部分可以起到活化基团的作用。
[0142] 活化基团可用于提高或降低反应性官能团与H2S的反应速率。通过提高或降低反应性官能团与H2S的反应速率，可以制备出具有特定传感应用所需的反应速率的化学传感剂。如果反应性官能团与H2S的反应速率适合于想要的传感应用，那么化学传感剂不需要含有活化基团。
[0143] 在一些实施例中，官能团的反应（例如还原）速率可能太慢而对于想要的体内或体外应用不实用。因此，可以通过引入提高反应性官能团与H2S的反应速率的活化基团来提高还原速率。举例来说，吸电子基团、尤其强吸电子基团的存在可以例如通过改变反应性官能团的氧化还原电位来提高相邻叠氮基的还原速率。
[0144] 在某些实施例中，活化基团是提高所连接的反应性官能团与H2S的反应速率的吸电子基团。在某些实施例中，与无活化基团的相同化学传感剂相比，活化基团使含有反应性官能团的化学传感剂与H2S的反应速率提高至少两倍，更优选至少五倍，最优选至少十倍。
[0145] 在一些实施例中，化学传感剂被设计成在暴露于H2S后具有较短的平衡时间。在一些实施例中，在最大发射波长下所测量，化学传感剂的荧光强度在与H2S接触后不到十分钟、九分钟、八分钟、七分钟、六分钟、五分钟、四分钟、三分钟、两分钟、一分钟、45秒或30秒达到平衡。在某些实施例中，在最大发射波长下所测量，化学传感剂的荧光强度在与H2S接触后不到十分钟，更优选在与H2S接触后不到六分钟，最优选在与H2S接触后不到三分钟达到平衡。
[0146] 合适的吸电子基团包括羰基、亚砜基和磺酰基，以及含有一个或一个以上吸电子取代基（例如硝基、氰基、三氟甲基或其组合）的碳原子。在特定实施例中，活化基团为吸电子磺酰基或羰基。
[0147] 在其它实施例中，活化基团可以是降低反应性官能团与H2S的反应速率的供电子基团。
[0148] D.间隔基团
[0149] 化学传感剂可以任选地在荧光团与活化基团（如果存在）和反应性官能团之间含有间隔基团。
[0150] 当存在时，选择的间隔基团应不会显著不利地影响反应性官能团与硫化物的反应速率和/或利用光谱法检测或测量反应产物的能力。在某些实施例中，间隔基团与荧光团结合以便在活化基团（如果存在）与反应性官能团之间提供结合路径。
[0151] 合适的间隔基的实例包括芳基、杂芳基、烯基和炔基。
[0152] E.化学传感剂的合成
[0153] 可以使用所属领域中已知的合成方法制备化学传感剂。下文论述用于制备化学传感剂的代表性方法。用于合成指定化学传感剂的适当途径可以根据多种因素来选择，例如化学传感剂的结构，构成化学传感剂的荧光团、反应性官能团、间隔基和活化基团的身份和连接性，以及化学传感剂的整体结构，因为它关系到官能团的相容性、保护基策略和不稳定键的存在。
[0154] 除下文所论述的合成方法外，适用于制备本文所披露的化学传感剂的替代性反应和策略为所属领域已知的。参见例如马奇,“高等有机化学,”第5版,2001,威利在线出版平th台,纽约（March,"Advanced Organic Chemistry,"5 Edition,2001,Wiley-Interscience Publication,New York））。
[0155] 一般来说，通过使荧光团官能化以并入一个或一个以上反应性官能团、连接基团和/或活化基团来制备化学传感剂。各种荧光团在所属领域中可购得。可以通过共价修饰市售荧光团以并入反应性官能团（和任选的连接基团和/或活化基团）来制备化学传感剂。或者，可以使用所属领域中已知的方法合成荧光团，然后进行共价修饰以并入反应性官能团（和任选的连接基团和/或活化基团）。制备合适的荧光团的方法（包括上述方法）为所属领域所熟知。参见例如R.P.豪兰德,“共价荧光探针”,《生物聚合物的激发态》,R.F.斯坦纳编,普莱南出版社:纽约,1983（R.P.Haugland,"Covalent Fluorescent Probes",In Excited States of Biopolymers,R.F.Steiner,Ed.,Plenum Press:New York,1983）。
[0156] 含有叠氮基反应性官能团和磺酰基活化基团的化学传感剂（丹酰叠氮化物，DNS-Az，2）的示范性合成显示于方案1中。
[0157] 方案1：
[0158]
[0159] 含有一个或一个以上磺酰氯取代基的市售荧光团提供了合成含有叠氮基反应性官能团和磺酰基活化基团的化学传感剂的适宜起始点。举例来说，可以由市售丹磺酰氯(1)容易地通过在乙醇/水混合物中用叠氮化钠处理1来制备化学传感剂2。
[0160] 含有磺酰氯基团的各种荧光团都是购自供应商，包括奥克伍德制品公司（Oakwood Products,Inc）（南卡罗来纳州西哥伦比亚（West Columbia,SC））、西格玛奥尔德里奇公司（密苏里州圣路易斯（St.Louis,MO））。这些市售荧光团可用于制备含有叠氮基反应性官能团和磺酰基活化基团的化学传感剂。也可以使用标准合成技术制备含有磺酰氯基团的荧光团。举例来说，可以容易地通过用亚硫酰氯处理将含有磺酸基的荧光团转化为相应磺酰氯。
[0161] 含有连接于叠氮基反应性官能团的萘二甲酰亚胺荧光团的化学传感剂（6）的示范性合成显示于方案2中。市售4-溴-1,8-萘二甲酸酐（4）与正丁胺反应得到5。随后在水/二甲基甲酰胺混合物中与叠氮化钠反应，得到6。6相对地不具有荧光；然而，在1:1的磷酸盐缓冲液/乙腈中暴露于100μM H2S后，观察到荧光强度提高约100倍。
[0162] 方案2：
[0163]
[0164] 可以使用所属领域中已知的类似方法制备含有替代性反应性官能团、荧光团、连接基团和活化基团的化学传感剂。
[0165] III.使用方法
[0166] 化学传感剂可用于检测和/或定量H2S。可以通过观察和/或测量由H2S的存在所诱导的化学传感剂的利用光谱法可观察的变化来检测或定量H2S。这一变化可以是化学传感剂的吸光度（即颜色）变化、化学传感剂的荧光变化或其组合。
[0167] 在一些情况下，定性地观察化学传感剂的一种或一种以上利用光谱法可观察的变化以检测样品中H2S的存在。举例来说，可以通过肉眼观察化学传感剂的吸光度（即颜色）或化学传感剂的荧光（在用例如UV黑光灯照射下）以定性地评估样品中H2S的存在。在其它实施例中，将测量化学传感剂的一种或一种以上利用光谱法可观察的变化作为分析的一部分以定量样品中H2S的量。
[0168] 在某些实施例中，化学传感剂被用于荧光分析中以检测和/或定量硫化物。一般来说，使用上述化学传感剂进行的荧光分析涉及使样品与化学传感剂接触并且测量或观察化学传感剂的荧光。如上文所描述，H2S与化学传感剂反应，从而以一种或一种以上方式改变化学传感剂的荧光。化学传感剂光物理性质的基本上任何变化都可以用于确定H2S的存在，并任选地确定样品中H2S的浓度。
[0169] 化学传感剂可用于基于溶液的分析以检测和定量H2S。在一些实施例中，化学传感剂被用于检测或测量水性溶液中的H2S。
[0170] 化学传感剂可以通过共价或非共价相互作用固定于固体载体上，并且用于检测经过固定的化学传感剂的气流或液流中的H2S。合适的固体载体包括（但不限于）聚合物珠粒、聚合物膜、硅胶及编织物与非编织物。
[0171] 在优选实施例中，荧光分析的检测极限小于100μM，更优选小于50μM，更优选小于25μM，最优选小于10μM。
[0172] 化学传感剂可用于检测或定量自井、城市水源和天然水源取得的水样品中的H2S，例如以确保水质和安全性。化学传感剂可用于检测和/或定量液体流出和气体排放工业环境（包括造纸厂和纸浆厂、沥青拌合厂和污水处理厂）中的H2S。化学传感剂还可以用于检测和/或定量气态燃料流中的H2S。气态燃料流的实例包括沼气、裂缝气、气化生物质、气化煤/沥青、来自天然气井和油井的气体、来自沥青砂的气体、填埋气、合成气、火炬气及来自农业和畜牧业操作的气体。
[0173] 在其它实施例中，化学传感剂被用于荧光分析中以检测和/或定量生物样品中的H2S浓度。在某些实施例中，化学传感剂被用于体外生物分析中以检测或定量生物样品（例如血液或血浆）中的H2S。
[0174] A.仪器装备
[0175] 可以通过任何合适的荧光分析仪来检测化学传感剂的荧光。荧光分析仪通常含有用于激发荧光团的光源和用于检测发射光的传感器。另外，荧光分析仪可以任选地含有一个或一个以上衍射光栅、二向色镜和/或滤光片，用于控制激发光的波长和/或控制传感器所检测的光的波长。在一些实施例中，所述装置耦接于信号放大器和用于数据处理的计算机。合适的荧光分析仪的实例包括市售荧光计、光谱荧光计、流式细胞仪和荧光显微镜。
[0176] 或者，对于一些定性分析，可能不需要荧光分析仪。举例来说，在一些分析中，可以通过肉眼目测观察荧光来确定分析物的存在。
[0177] B.荧光分析的概况
[0178] 荧光分析涉及观察和/或测量化学传感剂的一种或一种以上荧光变化。所述变化可以呈数种形式中的一种或一种以上，包括发射光谱的变化、荧光强度（即荧光量子产率）的变化和荧光寿命的变化。这些变化可能是正方向或反方向的并且可能是一个量值范围，优选地可如下文所描述对其进行检测。
[0179] 可以使用光谱荧光计测量化学传感剂的发射光谱。所述光谱荧光计使用了具有特定波长（或波长间隔）的高强度光源来激发化学传感剂。然后光谱荧光计测量在不同波长范围下化学传感剂所发射的光的强度，称为发射光谱。由样品中的H2S引起的最大发射波长或发射光谱形状的变化可以用于确定样品中H2S的存在或浓度。
[0180] 在通过测量化学传感剂的最大发射波长的变化来检测或定量H2S的实施例中，化学传感剂将优选被设计成在暴露于H2S后展现最大发射波长的较大变化。在一些实施例中，在暴露于H2S后，化学传感剂的最大发射波长移位超过50nm，更优选超过75nm，最优选超过100nm。
[0181] 也可以用肉眼（例如使用手提式黑光）观察最大发射波长的变化，以定性地确定样品中H2S的存在。
[0182] 可以使用所属领域中已知的方法测量化学传感剂的荧光量子产率。参见例如拉克维兹,J.R.“荧光光谱学原理”,第2版,普莱南出版社,纽约,1999。一般说来，通过将经过校正的化学传感剂的发射光谱的积分面积与参考溶液的发射光谱的积分面积相比较来获得试剂的荧光量子产率。
[0183] 化学传感剂在暴露于H2S后荧光量子产率的变化可以用作检测样品中H2S的存在的基础，并且可以任选地用于确定样品中H2S的浓度。
[0184] 在一些实施例中，化学传感剂将优选被设计成在暴露于H2S后展现荧光量子产率的较大变化。在一些实施例中，化学传感剂暴露于H2S使得化学传感剂的荧光量子产率降低至少10%，更优选化学传感剂的荧光量子产率降低至少25%，更优选化学传感剂的荧光量子产率降低至少50%，更优选化学传感剂的荧光量子产率降低至少75%，最优选化学传感剂的荧光量子产率降低至少90%。在其它实施例中，化学传感剂暴露于H2S使得化学传感剂的荧光量子产率增加至少25%，更优选化学传感剂的荧光量子产率增加至少50%，更优选化学传感剂的荧光量子产率增加至少75%，更优选化学传感剂的荧光量子产率增加至少100%，更优选化学传感剂的荧光量子产率增加至少500%，最优选化学传感剂的荧光量子产率增加至少1000%。
[0185] 也可以使用所属领域中已知的方法测量化学传感剂的荧光寿命。在暴露于H2S后荧光寿命的变化也可以用于确定样品中H2S的存在或浓度。
[0186] C.体外和体内荧光分析
[0187] 在一种变化形式中，通过使生物样品与化学传感剂接触来检测和/或定量所述样品中的H2S。然后使用上述的一种装置（优选是光谱荧光计）测量溶液的荧光。任选地，可以将溶液的荧光与含有已知量的H2S（即分析物）的一组标准溶液相比较。与标准物的比较可以用于计算分析物（即配体）的浓度。
[0188] 在生物样品中，H2S的浓度会随时间而变化。化学传感剂也可以用作探针以监测生物样品中H2S的水平随时间的变化。
[0190] 在某些实施例中，使细胞（例如细菌或真核细胞）或组织与化学传感剂接触，并且使用荧光显微镜确定细胞或组织中H2S的存在或量。为了观察H2S和其它分析物的共定位，也可以使细胞或组织同时与用于其它分析物的传感器接触。化学传感剂可以用于检测和/或定量细胞间和细胞内H2S。
[0191] 实例
[0192] 实例1：用于水性溶液中的H2S的作为选择性并有效的荧光化学传感剂的丹酰叠氮化物（DNS-Az）
[0193] 丹酰是一种常见的荧光团，并且因其强荧光和长发射波长而众所周知。用于检测和定量H2S的化学传感剂被设计成通过将反应性官能团并入丹酰荧光团中来使用。出于初步研究目的，将叠氮基并入丹酰荧光团中以利用已知的H2S还原叠氮基的反应（F.卡兹米,A.R.凯撒特,S.赛亚海,《磷、硫和硅》2004,179,1813-1817）。
[0194] 一般来说，硫化物还原叠氮化物的速率太慢而无法提供H2S（尤其是生物样品中的H2S）的‘实时’或快速检测和定量。然而，通过将叠氮化物连接于活化基团（例如吸电子磺酰基），叠氮基以加速的速率还原为氨基。由于叠氮基-与氨基-的电负性差异以及叠氮基所加入的旋转自由度，故磺酰基叠氮化物还原为磺酰胺引发了所连接的丹酰荧光团的电性质变化。丹酰叠氮化物化学传感剂的合成和荧光反应在方案3（以下）中说明。
[0195] 方案3：
[0196]
[0197] 材料与方法
[0198] 所有试剂都购自奥尔德里奇公司（Aldrich）。在布鲁克公司（Bruker）的1 13
Avance400MHz NMR光谱计上，分别在400MHz和100MHz下记录 H NMR和 C NMR光谱。质谱分析是通过乔治亚州立大学（Georgia State University）的质谱设施（Mass Spectrometry Facilities）进行。HPLC是在惠普公司（Hewlett Packard）的1100系列HPLC（色谱柱：
安捷伦公司（Agilent）的Prep-C185μM，4.6×250mm）上进行。在岛津公司（Shimadzu）的PharmaSpec UV-1700型UV-可见光分光光度计上记录UV-Vis吸收光谱。在岛津公司的RF-5301PC荧光计上记录荧光光谱。
Avance400MHz NMR光谱计上，分别在400MHz和100MHz下记录 H NMR和 C NMR光谱。质谱分析是通过乔治亚州立大学（Georgia State University）的质谱设施（Mass Spectrometry Facilities）进行。HPLC是在惠普公司（Hewlett Packard）的1100系列HPLC（色谱柱：
安捷伦公司（Agilent）的Prep-C185μM，4.6×250mm）上进行。在岛津公司（Shimadzu）的PharmaSpec UV-1700型UV-可见光分光光度计上记录UV-Vis吸收光谱。在岛津公司的RF-5301PC荧光计上记录荧光光谱。
[0199] 丹酰叠氮化物（DNS-Az）的合成和表征：将丹酰氯（1，250mg，0.93mmol）于15mL乙醇（EtOH）中的悬浮液逐滴加入搅拌的叠氮化钠于7mL混合溶剂（H2O/EtOH，1:1）中的溶液中。然后在室温下搅拌反应混合物3小时。在真空中蒸发有机溶剂，并且用DCM萃取水性溶液。用盐水洗涤合并的有机层，然后经MgSO4干燥。蒸发溶剂，产生粗产物，通过快速色1
谱法纯化，产生呈淡黄色油状的丹酰叠氮化物（2，107mg，42%）。H NMR(DMSO-d6):8.68-8.6
6(d,J=8.4Hz,1H),8.40-8.38(m,1H),8.07-8.05(d,J=8.0Hz,1H),7.77-7.73(m,2H),7.75(
13
s,2H),7.36-7.34,(d,J=7.8Hz),2.86(s,6H)，C NMR(CDCl3):152.2,133.7,132.7,130.1,+
130.1,129.7,129.3,123.0,118.8,115.9,45.4，ESI-MS:m/z277.1(M+1)。
谱法纯化，产生呈淡黄色油状的丹酰叠氮化物（2，107mg，42%）。H NMR(DMSO-d6):8.68-8.6
6(d,J=8.4Hz,1H),8.40-8.38(m,1H),8.07-8.05(d,J=8.0Hz,1H),7.77-7.73(m,2H),7.75(
13
s,2H),7.36-7.34,(d,J=7.8Hz),2.86(s,6H)，C NMR(CDCl3):152.2,133.7,132.7,130.1,+
130.1,129.7,129.3,123.0,118.8,115.9,45.4，ESI-MS:m/z277.1(M+1)。
[0200] 丹酰胺（DNS-NH2）的合成和表征：将硫化钠（43mg，0.18mmol）于0.4mL H2O中的溶液加入搅拌的2于17mL乙腈中的溶液中。在室温下搅拌反应混合物2小时。然后在真空下蒸发溶剂。通过快速色谱法（DCM/MeOH50:1）纯化残余物，产生呈黄色固体状的纯DNS-NH21
（40mg，91%）。H NMR(DMSO-d6):8.44-8.42(d,J=8.4Hz,1H),8.30-8.28(d,J=8.8Hz,1H),8.1
13
3-8.11(m,1H),7.63-7.56(m,2H),7.59(s,2H),7.27-7.25,(d,J=8.4Hz),2.83(s,6H)，C NMR(DMSO-d6):151.8,140.2,129.5,129.4,129.2,128.0,126.8,124.0,120.0,115.5,45.5，[0201] ESI-MS:m/z251.1(M+1)+。
（40mg，91%）。H NMR(DMSO-d6):8.44-8.42(d,J=8.4Hz,1H),8.30-8.28(d,J=8.8Hz,1H),8.1
13
3-8.11(m,1H),7.63-7.56(m,2H),7.59(s,2H),7.27-7.25,(d,J=8.4Hz),2.83(s,6H)，C NMR(DMSO-d6):151.8,140.2,129.5,129.4,129.2,128.0,126.8,124.0,120.0,115.5,45.5，[0201] ESI-MS:m/z251.1(M+1)+。
[0202] 水性溶液中的H2S的检测：将DNS-Az溶解于乙腈或乙醇中以制备30.0mM的储备溶液。然后将10μL储备溶液加入1.0mL含有0-100μM H2S的样品溶液中。充分混合样品1-5分钟（取决于反应介质）并且使用荧光计（λEx=340nm）测量。然后将读数与标准曲线相比较以获得H2S的浓度。
[0203] 小鼠血液中的H2S的检测：将DNS-Az溶解于乙腈或乙醇中以制备50.0mM的储备溶液。从雄性C57BL6/J小鼠的下腔静脉抽取血液。将血液（100μL×4）加入含有DNS-Az（0.4μL，最终浓度200μM）的 管中。将Na2S外加到各样品中达到10、50和100μM的最终浓度。充分混合样品并进行离心。然后从各样品中转移50μL血清到96孔盘中。通过用ZnCl（2 于100μL血液中1μL，最终浓度1mM）捕获硫化物，随后进行离心并将DNS-Az加入血清中来获得零点。在微量盘读取器（激发灯滤光片360nm、发射滤光片528nm）上读取所述盘。
[0204] 结果
[0205] DNS-Az(2)自身不具有荧光。然而，在加入H2S后，DNS-Az溶液显示较强的荧光增强。荧光增强的量值具有溶剂依赖性。举例来说，当在20mM磷酸盐缓冲液（pH7.5）/ACN（1:1）中进行实验时，在加入25μM硫化物的情况下观察到150倍的荧光强度增强。为彻底了解溶剂作用，测试以下溶剂系统：乙腈、去离子水、20mM的磷酸钠缓冲液（pH7.5）、乙腈/水（1:1）、乙腈/磷酸盐缓冲液（1:1）和含0.5%吐温-20的20mM磷酸钠缓冲液（pH7.5）（图1）。在加入10μM H2S的情况下，在乙腈中观察到最强反应，并达最大130倍的荧光强度增加。产生最小荧光强度增加（约8倍）的溶剂系统是单独磷酸盐缓冲液或水。磷酸钠缓冲液的存在不会影响荧光强度（图1）。非常有趣的是，加入0.5%吐温-20（一种在生物学实验中作为缓冲液组分的常用添加剂）导致在加入硫化物后DNS-Az的荧光强度变化的量值显著增加。在所述混合溶剂中，加入25μM硫化物导致40倍的荧光增强。检测极限低至1μM，其中S/N为3:1。HPLC、MS和NMR分析证实了荧光增加是归因于丹酰胺(3)的形成。
[0206] 为研究这种化学传感剂对于硫化物的选择性，在缓冲液/吐温中检查在各种阴离子存在下DNS-Az(2)的荧光性质。从其它阴离子未观察到类似的反应（图2）。因为检测是根据硫化物还原性质，所以也测试了其它可能的还原性阴离子，例如碘离子、溴离子、氟离子、亚硫酸氢根和硫代硫酸根。总共筛选了18种阴离子，对于1mM（这一浓度是硫化物的40倍）的大部分阴离子未观察到明显反应。在所有阴离子中，只有NaHSO3、Na2S2O4和Na2S2O5导致一定程度的荧光强度增加。然而，荧光增加的程度远小于由硫化物引起的程度，即使当那些阴离子的浓度是硫化物浓度的4倍时也是（图2）。还测试了DNS-Az(2)对其它还原剂（例如苯硫酚、苯甲基硫醇和半胱氨酸）的响应。苯甲基硫醇是唯一显示出足够强的荧光响应（是关于硫化物所观察到的响应的约1/5，图10和11）以潜在地干扰硫化物检测和定量的还原剂。然而，这种干扰并不表示生物系统中的H2S的检测的实际问题，因为苯甲基硫醇的存在量极少。还发现DNS-Az抗拒由氨基攻击所引起的可能的置换反应。它在高达50mM的浓度下显示出对甘氨酸和赖氨酸的非常有限的反应（图12）。
[0207] 线性关系对于容易并精确地进行分析始终很重要。因此，进行硫化物浓度依赖性研究。DNS-Az(2)基本上定量地与硫化物反应，即使在水性溶液中也一样。在517nm下的荧光强度显示在缓冲液/吐温中相对于硫化物呈线性关系（图3）。当硫化物浓度高于DNS-Az(2)时，发现曲线达到平台期（参见图7B），这意味这一反应的化学计量是1:1。
[0208] 迄今为止，所有的选择性和线性研究都表明DNS-Az(2)可以用于确定生物样品中的硫化物浓度。作为最后的测试，在市售牛血清中评估DNS-Az(2)。在加入硫化物后，2的溶液也显示非常显著的荧光强度增加。荧光比在先前所研究的溶剂中强很多。举例来说，DNS-Az(2响应于牛血清中5μM的硫化物的荧光强度是在相同条件下在缓冲液吐温中的强度变化的约5倍（因为荧光极强，所以与其它溶剂相比，对于激发和发射使用较窄的缝隙宽度来记录牛血清的所有荧光光谱）。尽管牛血清显示出本底荧光（图4A，0秒），但与反应所产生的丹酰胺(3)的强荧光相比，它可以忽略（图4）。应注意，所述反应在牛血清中快速进行（在数秒内完成，图4B）。相比之下，有趣的是注意到，所述反应在缓冲液/吐温中最慢，用了约3分钟完成（图7A-7B）。
[0209] 在小牛血清中在1-100μM的硫化物浓度范围内也获得了优良的线性关系（图3）。标准曲线涵盖了所报道的内源性H2S水平的范围，从而表明这种探针非常适于检测生物样品中的硫化物。总体来讲，结果表明在血液中通常遇到的阴离子和还原剂不会在生物样品中硫化物的定量检测中造成问题。
[0210] 另外，与在缓冲液/乙腈（528nm）和缓冲液/吐温（517nm）中的情形相比，牛血清中的发射波长较短（493nm），这很可能是因为血清中存在的蛋白质的溶剂化显色现象，这会降低丹酰胺的基态的能量水平。作为对照组，还研究了在包括牛血清的各种溶剂中标准物丹酰胺(3)的荧光性质并发现实际上丹酰胺(3)取决于溶剂而展现不同的发射波长（图13）。所述结果与使用DNS-Az(2)的测试所发现的情形一致。
[0211] DNS-Az也被用于体外分析中以确定血液中的硫化物浓度。测定小鼠血液（C57BL6/J小鼠模型）中的硫化物浓度为31.9±9.4μM。这一值与先前关于使用亚甲基蓝比色法获得的小鼠血浆中的H2S浓度（34.1μM）所报道的值一致。李,L.等人,《实验生物学联合会会刊》19:1196-1198(2005)（Li,L.,et al.FASEB J.19:1196-1198(2005)）。这一原理论证（proof-of-principle）分析证明了本文所描述的用于检测和定量生物样品中的H2S的化学传感剂的功能性。
[0212] 总之，丹酰叠氮化物被证明是用于检测和定量水性溶液（包括市售牛血清）中的H2S的还原敏感性化学传感剂。已发现，在18种测试的阴离子和其它常见还原物质中，探针对于硫化物极具选择性，其检测极限在缓冲液/吐温中为1μM并且在牛血清中为5μM，并且S/N比为3:1。在牛血清中所获得的线性关系涵盖所报道的内源性H2S浓度范围。仅需要加入探测分子而无需任何其它试剂或另外的处理的测量法的简单性和简易性使得这种试剂极其易于使用。另外，生物系统中的硫化物水平经过严格调节并且其浓度会经历快速变化。DNS-Az(2)对硫化物的空前的快速响应使其可用于检测硫化物水平的短暂变化。探针DNS-Az(2)的结构简单，极易合成，稳定并且经得起长期贮存。
[0213] 除非另有定义，否则本文中所使用的所有技术和科学术语都具有与所披露的本发明所属领域的技术人员通常所了解相同的含义。
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