发明领域
[0001] 本发明涉及
荧光颗粒在
生物分析上的应用，特别是用于光学分子图象的荧光探针。
背景技术
[0002] 已经将染料掺入
二氧化
硅颗粒中(Ow，H.；Larson，D.R.；Srivastava，M.；Baird，B.A.；Webb，W.W.；Wiesner，U. ＂ Bright and Stable Core-ShellFluorescent Nanoparticles＂Nano Letters 2005，5，113-117/Verhaegh，N.A.M.；Blaaderen，A.v.＂Dispersions of Rhodamine-Labeled Silica Spheres：Synthesis，Characterization，and Fluorescence Confocal Scanning LaserMicroscopy＂Langmuir 1994，10，1427-1438./Imhof，A.；Megens，M.；Engelberts，J.J.；Lang，D.T.N.d.；Sprik，R.；Vos，W.L. ＂Spectroscopy ofFluorescein(FITC)Dyed Colloidal Silica Spheres＂J.Phys.Chem.B
1999，103，1408-1415.)。
[0003] 用IR染料承载的胶乳已知用于成像和摄影应用(US2002/0113854、US6,706,460)。用非IR染料承载的胶乳已知用于生物和诊断应用。
[0004] US2005/0244976涉及在具有荧光羰花青染料化合物的样品中检测阴离子蛋白的方法。该发明用于各种领域，包括免疫、诊断学、
蛋白质组学、分子生物学和荧光
基础的分析。用荧光羰花青染料化合物检测样品中的阴离子蛋白。该发明还描述了通过羰花青染料化合物产生的不连续荧光
信号同时检测样品中的阴离子和非离子蛋白的方法。
[0005] US6,964,844总体上涉及新染料的合成和标记以及对被被分析物进行检测或显影的方法，更具体地说涉及引入新
荧光染料的荧光胶乳颗粒及其应用，在某些方面，荧光
能量转移和分子内能量转移用于在免疫分析或在核酸分析中被分析物的检测。这些染料是
水溶性混杂酞菁衍生物，用于竞争性和非竞争性免疫分析。该发明公开并要求了核酸和分析以下内容：具有(1)带有至少一种所期望激发峰的供体亚单元；和(2)带有至少一种所期望发射峰的受体亚单元，其中所述衍生物能够从所述供体亚单元向所述受体亚单元传递分子内能量。这样的衍生物还可以包含
电子转移亚单元。轴配体可以与包含在
水溶性混杂酞菁衍生物中的金属共价连接。配体、配体类似物、多肽、蛋白和核酸能够连接至染料的轴配体以形成染料缀合物从而用于免疫分析和核酸分析。
[0006] US4,997,772涉及一种仅在核中含有可探测的示踪物质的核/壳
聚合物颗粒。它还涉及一种免疫反应的
试剂以及该试剂在分析元素和方法上的应用。水不溶性聚合的颗粒具有分布于第一聚合物的包含可探测的示踪物质的
内核，为此该示踪物质具有高
亲和性。此第一聚合物的玻璃转化
温度(Tg1)小于约100摄氏度。该颗粒还具有包含第二聚合物的
外壳，为此该示踪物质与所述第一聚合物相比具有实质上很小的亲和性。第二聚合物的玻璃转化温度(Tg2)大于或等于[Tg1-10摄氏度]。其还含有与免疫活性物种的游离
氨基或巯基反应或者可被与这些基团的反应激活的基团。这种物种可以共价连接到该颗粒以形成免疫活性试剂，该试剂可用于分析的元素和不同的分析法，该方法包括免疫学的方法，例如凝集分析。
[0007] US2004/0038318涉及一种成套试剂和在试验样品尤其是体液中实施同时分析多个同功酶的方法。该发明特别用于在颗粒或珠粒、基于多重化分析(based multiplexed assay)系统测量肌酸激酶同功酶。
[0008] US4,891,324涉及通过由包括配体和受体(例如具有颗粒的
抗原和
抗体)组成的特异性结合对成员的缀合物而确定被分析物来进行测定的方法。该发明的方法对生物学
流体(例如血清或尿)的异相免疫分析具有特别的应用。该方法通过使用包括具有颗粒的第一种特异性结合对成员的缀合物的组合物进行实施。发光剂被该颗粒的非水相可逆地相关联(associated)。在第一种特异性结合对成员不能与被分析物互补时，采用能结合至第一种特异性结合对成员的第二种特异性结合对成员。未结合的缀合物从结合至被分析物或结合至第二种特异性结合对成员的缀合物中分离。加入增强发光剂检测能
力的试剂以测量受到该试剂作用的发光剂的光发射。
[0009] WO2006/016166涉及适于药物材料的聚合材料。该发明公开了一种含有
丙烯酸烷氧基乙基酯
单体、含有伯胺、仲胺、叔胺或季胺基团的单体和含有酸基团单体的聚合物。该聚合物组合物形成了优选0.5至2.0um尺寸的
纤维，其不足以提供小于100nm尺寸的纳米颗粒，该纳米颗粒是胶态稳定的且能够承载用于诊断显象的非水溶性荧光染料。
[0010] US5,326,692涉及将聚合物材料引入多种荧光染料以控制
斯托克斯位移的增强。特别是，该发明描述了将微粒引入两种或多种一系列具有重叠激发和发射
光谱的荧光化合物，引起荧光微粒具有期望有效的斯托克斯位移。该新荧光微粒用于例如检测和分析生物分子，例如DNA和RNA，其需要非常高的灵敏度以及在细胞计数的流量和显微分析的技术。
该发明涉及将微粒引入两种或多种一系列具有重叠激发和发射光谱的荧光染料，使得从一系列第一染料的激发
波长有效地能量转移，通过一系列染料和在一系列最后的染料的发射波长作为
光信号的重发射进行转移，引起期望有效的斯托克斯位移，其是经过选择合适的染料而进行控制的。
[0011] 待解决的问题
[0012] 用于生理学成像的IR-发射的纳米颗粒聚集体(assemblies)遇到了很多问题。第一，该染料通常高度聚集且因此是不可发射的。第二，用于染料-纳米颗粒的聚集体荧光剂在水环境中通常无效。第三，在这种聚集体中使用的染料对光和氧气不稳定，且容易漂白，这造成了处理和管理困难。第四，这种管理通常是胶态不稳定的且是细胞毒性的。
[0013] 发明概述
[0014] 本发明涉及一种承载的胶乳颗粒，其含有由下式表示的混合物制成的胶乳材料：(X)m-(Y)n-(Z)o-(W)p，其中Y为至少一种具有至少两个烯键式不饱和化学官能团的单体；Z为至少一种具有平均分子量在300和10,000之间的聚乙二醇大分子单体；W为不同于X、Y或Z的烯基单体；且X为至少一种不溶于水的、含有烷氧基乙基的单体，m、n、o和p分别为每种单体的重量百分比。所述颗粒可用荧光染料承载。
[0015] 本发明的有益效果
[0016] 本发明包括许多优点，不是所有的这些优点被引入于单一的实施方案中。
[0017] 本发明承载的胶乳综合性质提供了优点，其使得它们很好地适用于特定的生物学应用。另外，其还提供了增强的荧光效应，它们是高度生物相容的，能够抵抗血清蛋白的粘附，且在宽范围的条件下仍保持良好的分散。
附图说明
[0018] 附图1显示了被兔蛋白斑点化的硝化
纤维素条纹的荧光图像(白和黑)，所述兔蛋白用在
实施例38中描述的承载的胶乳-抗兔抗体检测。
[0019] 附图2显示了尾部静脉注射之后10分钟时小鼠(瑞士裸鼠)的荧光图像，所述小鼠用100ml在
磷酸钠缓冲液中的1mg/ml LL1A承载的胶乳静脉注射，其用720ex/790em
过滤器在柯达MM4000影像工作站中曝光1分钟。
[0020] 发明详述
[0021] 本发明涉及非共价承载至重PEG化纳米胶乳颗粒的疏水的红外染料，当优选用于IR-活性聚集体时，其显示高度有效的荧光、低染料聚集和高光
稳定性，即不易受到漂白。这些聚集体还是非细胞毒性的且胶态非常稳定的，即降低聚集的倾向。本发明颗粒表现出增加了荧光的量子产率。为了本发明的目的，纳米胶乳是交联聚合物，其尺寸小于100nm，含有甲基丙烯酸烷氧基乙基酯或丙烯酸烷氧基乙基酯单体，并且是重PEG化的。
[0022] 用于生理学成像的IR-发射的纳米颗粒聚集体遇到了很多问题。第一，该染料通常高聚集且因此是不可发射的。第二，用于染料-纳米颗粒的聚集体荧光剂在水环境中通常无效。第三，在这种聚集体中使用的染料对光和氧气不稳定，且容易漂白，这造成了处理和管理困难。第四，这种聚集体通常是胶态不稳定的且是细胞毒性的。
[0023] 为了本发明的目的：
[0024] “PEG化的”指的是含有至少5重量％共价连接的聚(乙二醇)的纳米胶乳组合物。“PEG化”通常指的是从活化的PEG和相应的PEG-蛋白/肽开始获得PEG-蛋白/肽缀合物的反应。该反应还可以应用于PEG-
治疗剂、PEG-染料、PEG-生物配位体、PEG-(核
磁共振成像造影剂)、PEG-(X-射线造影剂)、PEG-抗体、PEG-(酶
抑制剂)、PEG-(
放射性同位素)、PEG-(
量子点)、PEG-低聚糖、PEG-多聚糖、PEG-
激素、PEG-右旋糖酐、PEG-低聚核苷酸、PEG-
碳水化物、PEG-神经传递介质、PEG-半抗原、PEG-类胡萝卜素。
[0025] “纳米胶乳”指的是其具有小于100nm流水动力直径的疏水聚合物颗粒。
[0026] “水分散的交联聚合颗粒”指的其为连续、交联的聚合物网络的聚合颗粒，通过此网络穿越键(through-bond)的途径其可在颗粒中的任何两个
原子间被示踪(不包括反离子)。该颗粒能够以分区状态存在于水中，从而使得每一单独的颗粒网络通过水连续相与每个其它颗粒分离。
[0027] “疏水性交联聚合物”指的是含有至少45重量％水不溶性单体的聚合物。该聚合物是连续的网状，通过此网络穿越键的途径其可在任何两个原子间被示踪(不包括反离子)。
[0028] “生物相容的”指的是组合物不能扰乱其侵入的生物系统的正常功能。生物相容的组合物通常要与血液相容，并且不另外在体内引起不利的反应。例如，为了生物相容，该材料必须不能有毒、产生免疫性或者形成血栓。
[0029] “胶态稳定”指的是颗粒能够存在于
磷酸盐缓冲的盐水(在pH7.4下，137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，2mM KH2PO4)的状态，在这种状态下每一个单独的颗粒通过没有形成聚集物的水连续相与每个其它颗粒分离(含有多个紧密
接触独立颗粒的实体)或者没有大量絮凝发生。
[0030] “承载”或“植入”指的是在染料和聚合颗粒之间非共价连接，以使得当胶乳以小于系统中染料总量10％，小于1％的浓度分散于水中时，其可以被萃取至水连续相之中。
[0031] 本发明的胶乳含有重复交联的烯键式不饱和单体。该胶乳可以具有5和100nm，优选8至50nm的体积平均
水动力学直径，其在磷酸盐缓冲盐水中(pH7.4下，137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，2mMKH2PO4)通过准弹性光散射测定。
[0032] 本发明的一种承载的胶乳颗粒含有如由下式表示的混合物制成的胶乳材料：
[0033] (X)m-(Y)n-(Z)o-(W)p
[0034] 式1
[0035] 其中X为至少一种水不溶性含有烷氧乙基的单体，Y为至少一种具有至少两个烯键式不饱和化学官能团的单体；Z为至少一种具有平均分子量在300和10,000之间的聚乙二醇大分子单体；W为不同于X、Y或Z的烯基单体。m、n、o和p分别为每种单体的重量百分比，其中m为介于40-90重量％，优选45-60重量％的范围，n为介于1-10重量％，优选2-6重量％的范围，o为介于20-60重量％，优选40-50重量％的范围，且p至多达10重量％。
[0036] 在式1中，X为下面式2描述的水不溶性含有烷氧乙基的单体。在式2中，R1是甲基或氢。R2是含有至多达10个碳原子的烷基或芳基。优选的X是甲基丙烯酸甲氧基乙基酯或丙烯酸烷氧基乙基酯。
[0037]
[0038] 式2
[0039] 在式1中，Y为水不溶性或水溶性的含有至少两个烯键式不饱和化学官能团的单体。这些官能团可以是乙烯基基团、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、烯丙基、乙烯基醚和乙烯基酯。Y单体包括但不必然限于芳族的二乙烯基化合物，例如二乙烯基苯、二乙烯基
萘或其衍生物；二亚乙基
羧酸酯和酰胺，例如二甲基丙烯酸乙二醇酯、二丙烯酸二乙二醇酯、二丙烯酸1，4-丁二醇酯、二甲基丙烯酸1，4-丁二醇酯、二丙烯酸1，3-丁二醇酯、二甲基丙烯酸1，3-丁二醇酯、二丙烯酸环己烷二甲醇酯、二甲基丙烯酸环己烷二甲醇酯、二丙烯酸二乙二醇酯、二甲基丙烯酸二乙二醇酯、二丙烯酸二丙二醇酯、二甲基丙烯酸二丙二醇酯、二丙烯酸乙二醇酯、二甲基丙烯酸乙二醇酯、二丙烯酸1，6-己二醇酯、二甲基丙烯酸1，6-己二醇酯、二丙烯酸新戊二醇酯、二甲基丙烯酸新戊二醇酯、二丙烯酸四甘醇酯、二甲基丙烯酸四甘醇酯、二丙烯酸三甘醇酯、二甲基丙烯酸三乙二醇酯、二丙烯酸三丙二醇酯、二甲基丙烯酸三丙二醇酯、三丙烯酸季戊四醇酯、三丙烯酸三羟甲基丙烷酯、三甲基丙烯酸三羟甲基丙烷酯、五丙烯酸二季戊四醇酯、四丙烯酸二三羟甲基丙烷酯和四丙烯酸季戊四醇酯；二乙烯基酯，例如
己二酸二乙烯基酯；其他二乙烯基化合物，例如乙烯硫醚或二乙烯基砜化合物的甲基丙烯酸烯丙酯、丙烯酸烯丙酯、环己烷二甲醇二乙烯基醚二烯丙基邻苯二
甲酸酯、
马来酸二烯丙酯；二烯
烃诸如丁二烯、异戊二烯和其混合物。
[0040] W单体基本上包括为以某种方式改进性质而加入的任何其他惰性单体。W是非化学性质上的
反应性单体，其可以以少量加入以赋予胶乳以期望的性质，例如水分散性、荷电性、更温和的染料载入或者使得胶乳更疏水。W单体为水溶性单体，例如丙烯酸2-磷酸乙基酯
钾盐、甲基丙烯酸3-磷酸丙基酯铵盐、乙烯基膦酸和其盐、乙烯基咔唑、乙烯咪唑、乙烯基吡咯烷
酮、乙烯吡啶、丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、马来酸和其盐、丙烯酸磺丙基酯和甲基丙烯酸磺丙基酯、丙烯酸和其盐、甲基丙烯酸和其盐、N-乙烯基吡咯烷酮，烷基膦酸酯、苯乙烯、丙烯酸和含胺类或铵基官能团的甲基丙酸烯单体的丙烯酸酯；烷基膦酸酯、苯乙烯、丙烯酸和含胺类或铵基官能团的甲基丙酸烯单体的甲基丙烯酸酯；苯乙烯磺酸和其盐、
烷基磺酸的丙烯酸和甲基丙烯酸酯、乙烯磺酸和其盐；乙烯吡啶、丙烯酸羟乙基酯、丙烯酸甘油酯、甲基丙烯酸酯、(甲基)丙烯酰胺和N-乙烯基吡咯烷酮。W可以由水不溶性单体替换，例如甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸异丁基酯、甲基丙烯酸2-乙基己基酯、甲基丙烯酸苄基酯、甲基丙烯酸环己酯、甲基丙烯酸缩水甘油酯、丙烯酸/丙烯酸酯，例如丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸异丁酯、丙烯酸2-乙基己基酯、甲基丙烯酸苄基酯、丙烯酸苯氧基乙基酯、丙烯酸环己基酯和丙烯酸缩水甘油酯，苯乙烯类，例如苯乙烯、a-甲基苯乙烯、乙基苯乙烯、3-和4-氯甲基苯乙烯、卤素取代的苯乙烯和烷基取代的苯乙烯，卤乙烯、亚乙烯基卤化物(vinylidene halides)、N-烷基化的丙烯酰胺和甲基丙烯酰胺；乙烯基酯，例如
醋酸乙烯酯和
苯甲酸乙烯酯；和烯丙醇及其醚类和酯；和不饱合酮类和
醛类，例如丙烯醛和甲基乙烯酮、异戊二烯、丁二烯和丙烯腈。
[0041] Z单体为具有在300和10,000之间分子量的聚乙二醇大分子单体，优选500至5000。优选地，该连接聚合物为在每个末端具有特定功能端基的聚乙二醇主链，这样所述聚乙二醇通过所述两个功能端基在两种物质之间起到连接基的作用。
[0042] 该聚乙二醇大分子单体含有在一个末端含有可自由基聚合的基团。该基团可以但是不必然限于甲基丙烯酸酯、丙烯酸酯、丙烯酰胺、甲基丙烯酰基酰胺、苯乙烯、烯丙基、乙烯基、马来酰亚胺和马来酸酯。优选地，该聚乙二醇大分子单体在其他末端另外含有反应性化学官能团，其可以作为其它化合单元的连接点，例如猝灭剂或抗体。这些反应性化学官能团可以当不限于醇、硫醇、羧酸类、伯胺或仲胺、乙烯基磺酰基、醛、环氧化物、酰肼、琥珀酰亚胺酯、马来酰亚胺、a-卤代羰基部分(例如碘代乙酰基)、异氰酸酯、异硫氰酸酯和氮杂环丙烷。优选地，这些官能团可以是羧酸、伯胺、马来酰亚胺、乙烯基磺酰基或仲胺。
[0043] 可用式3描述一端具有反应性聚合基团的一类聚乙二醇大分子单体。
[0044]
[0045] 式3
[0046] 在式3中，R1是氢或甲基，q为10-200，r为O-10，且RG是氢或反应性化学官能团，其可以是醇、硫醇、羧酸、伯胺或仲胺、乙烯基磺酰基、醛、环氧化物、酰肼、琥珀酰亚胺酯、马来酰亚胺、取代或未取代的醋酸酯或者取代的氨基甲酰基、取代的
硫酸酯、取代或未取代的a-卤代羰基部分(例如碘代乙酰基)、异氰酸酯、异硫氰酸酯和氮杂环丙烷。
[0047] 通常以两种方式利用该连接的聚合物。第一种，单连接的聚合物可以用于与一个其它有关的功能性化合物相连，从而生产具有两个不同期望功能的单一化合物。多连接聚合物还可以在一个末端与单独大颗粒或珠粒相连和在另一端与其它想要的化合物相连，从而生产大量有效荷载想要的功能性化合物的单一载体颗粒。
[0048] 连接聚合物可以以酰化和烷化方式使用，并且能够与含水和
有机溶剂体系相配伍，因此在与有用的基团反应中更有灵活性，并且期望的产品在水环境例如生理学的环境下更加稳定。连接聚合物至少具有两个反应性基团，一个是用于形成纳米凝胶和胶乳的丙烯酸酯，且通过迈克尔加成与硫醇反应，另外的反应性基团用于与对比物、染料、蛋白、氨基酸、多肽、抗体、生物配位体、治疗剂和酶抑制剂缀合。该连接聚合物可以是支链的或者非支链的。优选地，为了终产品制剂的治疗应用，连接聚合物将是药学上可接受的。
[0049] 在式3中的RG是氢或反应性化学官能团。反应性化学官能团使得承载的胶乳共价连接至生物分子，且该生物分子的
位置能够由荧光显像确定。该共价连接提供了一个对以下稳定的连接：处理、改变溶剂、pH和离子强度以及温度。在承载的胶乳颗粒和生物分子之间的稳定相关联对于确认荧光信号是非常重要的，被检测的荧光信号与生物分子的存在有关。如果承载的胶乳不是共价连接的并不能通过离子吸引或范德华力与生物分子相相关联，那么该染料将被孤立，且期望的生物分子信号将降低，错误信号可以自分离的承载的胶乳获得，从而使荧光图像不能显示生物分子的位置。该反应性化学官能团(RG)将使得在
有机溶剂(例如N，N-二甲基酰胺、二甲基亚砜、N-甲基吡咯烷酮)和非有机溶剂(例如水)中发生共价连接。
[0050] 反应性化学官能团(RG)允许使用连接子(linker)，该连接子被设计为在承载的胶乳上的反应性化学官能团(RG)与在生物分子上的连接基团之间形成共价键，其中生物分子为例如胺类、醇、源自氨基酸的羧酸、源自氨基酸的硫醇、肽、蛋白、细胞、RNA、DNA或其它已加入到生物分子中的连接子，以顾及在连接生物分子至其它材料的方法中和更大灵活性。这样的连接子包括但不限于杂-双官能或高-双官能连接子，例如双硫代琥珀酰辛二酸酯、3-[2-(氨乙基)二硫代]丙酸、p-叠氮苯甲酰基酰肼、双马来酰亚胺基己烷、N-琥珀酰亚胺-S-乙酰基硫代乙酸酯、N-硫代琥珀酰亚胺-4-叠氮苯基-1，3’-二硫代丙酸酯、琥珀酰亚胺4-[对马来酰亚胺苯基]丁酸酯、N-琥珀酰亚胺[4-碘代乙酰基]氨基苯甲酸酯、硫代琥珀酰亚胺-[全氟代叠氮苯甲酰氨基]乙基-1，3’-二硫代丙酸酯、琥珀酰亚胺3-[溴乙酰胺基]丙酸酯、硫代琥珀酰亚胺2-[7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酰胺基]乙基-1，3’-二硫代丙酸酯、3-(2-吡啶基二硫代)丙酰基酰肼)；N-e-马来酰亚胺基己酰氧基]琥珀酰亚胺酯、N-[4-(对叠氮水杨酰氨基)丁基]-3’-(2’-吡啶二硫代)丙酰胺、琥珀酰亚胺4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧酸酯、4-(4-N-马来酰亚胺苯基)丁酸酰肼
盐酸盐、辛二酸二琥珀酰亚胺酯、Lomant试剂、硫代琥珀酰亚胺[2-6-(生物素氨基)-2-(p-叠氮苯甲酰氨基)-己基氨基]-乙基-1，3’-二硫代丙酸酯、[β]-[三(羟甲基)膦基]丙酸(甜菜
碱)、(硫代琥珀酰亚胺[对马来酰亚胺苯基]丁酸盐)、双马来酰亚胺乙烷、双[b-(4-叠氮水杨酰基氨基)乙基]二硫化物、琥珀酰亚胺4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧基[6-氨基己酸酯]、N-[对马来酰亚胺苯基]异氰酸酯、间-马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基硫代琥珀酰亚胺酯、硫代琥珀酰亚胺4-N-马来酰亚胺甲基环己烷-1-羧酸酯、二[硫代琥珀酰亚胺]辛二酸酯、N-[g-马来酰亚胺丁酰氧基]硫代琥珀酰亚胺酯、N-琥珀酰亚胺4-戊酸酯(pentynoate)和N-琥珀酰亚胺4-叠氮丁酸酯。
[0051] 该反应性化学官能团还可用作螯
合金属的金属螯合基连接点，连接点，其中所述金属为例如放射性同位素(用于PET成像)和钆(用于MRI成像)。在一个实施方案中，金属螯合基为S-2-(4-异硫氰酸酯苄基)1，4，7，10-四氮杂十二烷-四乙酸或2-(4-异硫氰酸酯苄基)二乙三胺五乙酸。该金属螯合基团可以结合至放射性同位素或重金属。
[0052] 通过适当使用反应性化学官能团(RG)，该承载的胶乳可以共价连接至任何药物或生物分子，以此方式优化荧光信号且干扰生物分子的正常功能。羧酸连接基团可以转化为活性酯而形成共价键。N-羟基琥珀酰亚胺酯是活化羧酸基团的优选方法。羧酸连接基团还可以因形成与碳化二亚胺试剂(例如二环己基碳化二亚胺)的共价键而被活化。羟基连接基团可以通过形成氯甲酸酯(例如对-硝基苯基氯甲酸酯)共价键而被活化。胺连接基团可以通过使用碳化二亚胺活化剂与生物分子的羧酸官能团反应而形成的共价键而被活化，或者形成异氰酸酯(酯)或异硫氰酸酯(酯)或使用上述列举的胺反应性连接基团。该马来酰亚胺连接基团能够与硫醇基团反应，其中硫醇基团通常由生物分子的半胱氨酸残基或上述列举的硫醇连接基团获得。可以直接使用异氰酸酯(酯)或异硫氰酸酯(酯)与生物分子的胺基团反应。该三烷氧基甲硅烷可以用于与其它三烷氧基甲硅烷或硅氧化物改性的分子或颗粒反应。炔烃和叠氮酰基(azidoyl)可以用于形成通常用
铜(I)催化的稳定三唑连接，这样如果染料含有炔基，那么叠氮酰基连接基团就被置于生物分子上或反过来，其中叠氮酰基连接基团是在染料上的连接基团，且炔基基团加成至生物分子上。
[0053] 在这里使用的一种特别优选的水溶性连接聚合物是式4的聚乙二醇衍生物。该聚乙二醇(PEG)是亲水、生物相容且无毒的通式H(OCH2CH2)nOH的聚合物，其中n>4。
[0054] 式4
[0055]
[0056] 其中X＝CH3或H，Y＝O、NR或S，L是连接基或间隔基，FG为官能团，n为大于4并小于1000。更优选地，X＝CH3，Y＝O，L是烷基或芳基，并且FG为NH2或COOH，以及n在6至500之间或在10和200之间。更优选地，n＝16。
[0057] 可以通过连接至生物学上重要的材料、染料和用于检测的显影剂和
疾病和代谢活性研究的显影剂、治疗疾病的治疗剂、用于增稠的物质、药物和
化妆品而使用该连接聚合物。优选的用于连接连接聚合物的生物学重要材料包括当连接时可以极大改善效果的靶向剂、
诊断剂和治疗剂。
[0058] 靶向剂是具有有用的基团的化合物，其可以辨别并与特殊位点相关联，例如疾病位点，为了更多的效果该颗粒或缀合材料在这一位点被浓缩。此外特别感兴趣的是PEG-抗体。抗体，还被称为免疫球蛋白(Igs)是有助于分辨免疫系统外来物质例如细菌或病毒或任何带有抗原物质的蛋白，并且抗体有益于分辨并与特殊的生物靶点相相关联。生物配位体是与在细胞内或细胞上或与酶表达的受体位点相相关联的有用基团。生物配位体的实例是生长因子例如生物素和叶酸、特种蛋白和氨基酸肽序列或具有对酶活性位点强结合能力的分子或者有助于物质渗透或在想要的细胞上或细胞内的浓缩的分子。
[0059] 诊断剂是当用光、声、磁、电子和放射性能量源扫描物质而增强检测信号的物质。实例是染料，例如UV、可见或红外吸收的染料，尤其是荧光染料，例如吲哚羰花青和荧光素，MR显影剂例如钆和
铁离子复合物，以及X-射线显影剂例如聚碘代
芳香族化合物。承载的胶乳颗粒可以用螯合基团官能化，螯合基团例如二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)或1，4，7，
10-四-氮杂环十二烷-N，N′，N″，N″′-四乙酸(DOTA)。这些螯合基团可以螯合金属例如钆，用于磁共振和X-射线成像。四-和五-乙酸螯合基团使得承载的胶乳能用放射性同位素标记，用于放射性闪烁显像、单一的
光子发射和正发射层析
X射线摄影法。
[0060] 该被标记的组分可以在包括其它物质的组合物中。在其中发生标记反应的混合物可以是液体混合物，特别是水混合物。该检测步骤可以与混合物在液体或干的条件下(例如
显微镜载物片)发生。
[0061] “标记”指的是承载的胶乳或承载的胶乳缀合物与一种物质相连以助于该物质的识别。优选地，该物质通过光学检测方法识别。
[0062] “生物相容的”指的是组合物不能扰乱其侵入的生物系统的正常功能。生物相容的组合物通常要与血液相容，并且不另外在体内引起不利的反应。例如，为了生物相容，该材料必须不能有毒、产生免疫性或者形成血栓。
[0063] “
生物降解的”指的是该物质能够在生理学条件下在酶或
水解下降解为更小的可以通过正常途径排出体外的分子。
[0064] 术语“诊断剂”包括能够发挥显影剂的组分，且从而产生在宿主或试验样本中可检测的指示信号。该可检测的指示信号可以是γ-发射的、放射性的、发生回波的、荧光的或生理学的信号等等。
[0065] 在此处使用的术语“生物医用试剂”包括在治疗生理学疾病上有效的生物学活性物质、药物、酶、激素、甾族化合物、重组体产品等等。治疗剂的示例是抗生素、血栓溶解酶(例如尿激酶或链激酶)、胰岛素、生长激素、化疗剂例如阿霉素和抗病毒剂例如干扰素和阿昔洛韦。
[0066] 在一个优选的实施方案中，承载的胶乳与选择性标记靶向剂且任选检测的物质相关联。例如核酸检测通常包括用核酸探针探查被认为含有靶核酸的样本，该探针含有核酸序列，其特异性识别靶核酸序列，从而使核酸探针和靶核酸的结合产生杂交对。该核酸探针通常含有大于4碱基至好几万的碱基，即探查全部
染色体可以包括数百万的碱基。任意下述染料缀合物可以用于标记相应的靶向物质。
[0067] 承载的胶乳连接的组分或缀合物还称之为标记的组分，其可以是抗体、蛋白、肽、酶底物、激素、淋巴细胞活素、代谢产物、受体、抗原、半抗原、外源凝集素、毒素、碳水化物、糖、低聚糖、多糖、核酸、脱氧核酸、衍生的核酸、衍生的脱氧核酸、DNA
片段、核糖核酸片段、衍生的DNA片段、衍生的核糖核酸片段、天然药物、病毒颗粒、细菌颗粒、病毒组分、
酵母组分、血细胞、血细胞组分、生物细胞、非细胞的血液组分、细菌、细菌组分、自然的和合成脂囊泡、合成药物、毒药、环境污染物、聚合物、聚合物颗粒、玻璃颗粒、玻璃表面、塑料颗粒和塑料表面。
[0068] 各种承载的胶乳缀合物可以用本发明的承载的胶乳制备，包括抗体、甾类、维生素、药物、半抗原、代谢产物、毒素、环境污染物、氨基酸、肽、蛋白、核酸、核酸聚合物、碳水化物、脂类和聚合物的缀合物。在另外的实施方案中，缀合物是氨基酸、肽、蛋白、多糖、核苷酸、低聚核苷酸、核酸、半抗原、药、脂类、磷脂、脂蛋白、脂多糖、脂质体、亲油性聚合物、聚合物、聚合的微粒、生物细胞或病毒。在本发明的一个方面，缀合物用本发明的多种承载的胶乳标记，该承载的胶乳可以相同或不同。
[0069] 承载的胶乳用作用于探针的标记和用于免疫分析，且还用作用于体内显像和体内
肿瘤治疗的标记。当这样使用，可以把这些标记的胶乳连接到特定连接对的一个成员(“标记的结合伙伴(binding partner)”)或这样一个成员的类似物以形成承载的胶乳缀合物。
[0070] 这些承载的胶乳可用作用于体内的
显像剂。当用于显像剂时，这些承载的胶乳与特定连接对的一个成员缀合，以得到标记的缀合物/结合互补物(binding complement)。可将承载的胶乳缀合物引入至动物。如果特定连接对的其它成员存在，该承载的胶乳缀合物将结合至那里，并且可测定通过染料产生的信号和对其进行
定位鉴别。
[0071] 这些承载的胶乳还可以用于体内肿瘤治疗。例如包括使用另外的染料组分连接至作为
光敏剂的纳米粒表面的光动力学疗法。具有光敏化剂的承载的胶乳进一步与结合伙伴缀合，该结合伙伴对可以特异性识别且连接至肿瘤细胞部分。定位的三联体在通过光的激发后从连接的染料-承载的胶乳缀合物发射，引发化学反应和选择性伤害和/或破坏肿瘤细胞。
[0072] 靶被分析物
[0073] 在一个实施方案体中，采用一种承载的胶乳或承载的胶乳缀合物来探查样品溶液中存在或不存在靶被分析物。此处，“靶被分析物”或“被分析物”或其语法上的等同物指的是探测或评价结合伙伴(bindingpartners)的任何原子、分子、离子、分子离子、化合物或颗粒。如本领域所希望的那样，在本发明中可以使用大量的被分析物；基本上，可使用任何结合的生物活性剂或结合伙伴所寻找的靶被分析物(例如备选药物)。
[0074] 靶向材料可任选为以分子或分子的基团形式存在的生物的或合成的原料，包括但不限于抗体、氨基酸、蛋白、肽、多肽、酶、酶底物、激素、淋巴因子、
代谢物、抗原、半抗原、血凝素、抗生物素蛋白、抗生蛋白链菌素、毒素、毒药、环境污染物、碳水化合物、低聚糖、多糖、糖蛋白、糖脂类、核苷、寡核苷酸、核酸、核酸衍生物(包括脱氧核酸或核糖核酸)、DNA或RNA的片段和其衍生物(包括单股或多股片段)、天然和合成药物、受体、病毒颗粒、细菌颗粒、病毒组分、生物细胞、孢子、细胞组分(包括细胞膜和细胞器)、天然或合成的脂囊泡、聚合物膜、聚合物表面和颗粒以及玻璃和塑料表面和颗粒。靶被分析物通常以获自生物或环境体系的样品的组分或杂质形式存在。特别优选的被分析物为核酸和蛋白。
[0075] 在本发明的一个方面，缀合物为生物活性物质。靶向材料也任选为生物活性物质。生物活性物质是与衍生自生物体系的分子反应或结合的物质，无论这类分子是天然形成的或由体系的某种外部干扰而形成(例如，疾病、中毒、基因操纵)。通过举例说明，生物活性物质包括生物分子(例如生物源分子，包括但不限于聚合的生物分子，例如肽、蛋白、多糖、寡核苷酸、抗生物素蛋白、抗生蛋白链菌素、DNA和RNA，也包括非聚合生物分子，例如生物素、洋地黄毒苷和重均分子量通常低于1000的其它的半抗原)，显
微生物体，例如病毒和细菌，以及合成半抗原(例如激素、维生素或药物)。典型的靶补体或靶向材料或这两者为氨基酸、肽(包括多肽)，或蛋白(MW高于多肽)；或者是核苷、寡核苷酸(少于20碱基)，或核酸(例如分子量大于寡核苷酸的聚合物，包括RNA和单股或多股DNA和其片段和其片段衍生物)；或者是糖类或糖类衍生物，包括单糖、多糖、寡糖、糖脂类和糖蛋白；或者是半抗原(除了与一个更大载体分子缀合而不能引起免疫学反应的一种化合物)，半抗原任选与其它生物分子缀合；或显微有
机体，或显微有机体的组分。对于这类生物活性物质，可以用多种已知的方法来选择有用的与靶向材料的相应缀合互补物的对。
[0076] 当多于一种材料同时被靶向时，任选包括多种为靶互补物的缀合物(每种用于相应的靶向材料)。选择的靶互补物具有需要的特异性或对所要靶向材料的选择性。
[0077] 在一个实施方案中，靶被分析物是蛋白。正如本领域技术人员所觉察到的那样，对结合伙伴而言，使用本发明，可检测或评估缀合物的大量蛋白靶被分析物。适合的蛋白靶被分析物包括但不限于，(1)免疫球蛋白；(2)酶(和其它蛋白)；(3)激素和细胞活素类(其中许多都作为用于细胞受体的配体)；和(4)其它蛋白。在一个优选的实施方案中，靶被分析物为核酸。在一个优选的实施方案中，探针用于基因诊断中。例如，用此处公开的技术制备探针以检测靶序列，所述靶序列例如为用于非息肉病性克隆癌症的基因、BRCA1乳癌基因、一种与各种癌症相关的基因P53、能增加患阿尔茨海默病的
风险的Apo E4基因，容易用于病人症状发生前的筛选、囊肿性纤维化基因的突变或任何其他在该领域中所熟知的基因。
[0078] 在另一实施方案中，使用本发明的复合物进行毒菌和细菌检测。在这一实施方案中，探针被设计为从各种细菌和病毒中检测靶序列。例如，当前的血液筛检技术依靠于抗HIV抗体的检测。此处公开的方法可以直接筛检临床样品以检测HIV核酸序列，特别是高度转化的HIV序列。此外，其允许直接监测病人体内的循环病毒，这是一种改进的评估抗毒素治疗剂功效的方法。类似地，与白血病、HTLV-I和HTLV-II有关的病毒也可用这种方法检测。也可以检测细菌感染，例如
肺结核、衣原体病和其他性传播疾病。
[0079] 在另一实施方案中，发现本发明的核酸可用作筛检水或食物样品中毒性细菌的探针。例如，样品可经过细菌细胞溶解处理以释放其中的核酸，然后所设计探针用来识别菌株，包括但不限于病原株，例如沙
门氏菌、弯曲杆菌、弧菌霍乱菌、利什曼原虫，E大肠菌肠毒素株和美国退伍军人疾病细菌。
[0080] RME
[0081] 所描述的组合物可进一步含有包括识别特定靶细胞的靶向部分的生物学的、药学的或诊断的组分。通过与承载的胶乳相关联的靶向部分识别和结合细胞表面受体是所述组合物的一个特征。该特征对于理解细胞表面结合作用经常是细胞流的初始阶段，会导致一定范围的触发事件，特别是通过受体介导的细胞内吞作用是非常有利的。术语“受体介导的细胞内吞作用”(“RME”)通常形容一种机制，通过这种机制分布在细胞表面上的受体通过结合配体而被催化，结合受体的配体进入细胞内部。许多蛋白和经由受体介导的细胞内吞作用进入细胞的其它结构，包括胰岛素、表皮生长因子、生长激素、甲状腺激素、神经生长因子、降血
钙素、胰高血糖素和许多其他结构。
[0082] 受体介导的细胞内吞作用(以下称为“RME”)提供了一种将染料缀合物，其可能与其他生物学的、药学的或诊断的组分相组合传输至细胞内部的便捷机制。
[0083] 在RME中，通过分布在细胞表面上的受体结合配体可以引发细胞内的信号，其中包括细胞内吞作用的响应。因此，与靶向部分相关联的承载的胶乳形成的承载的胶乳缀合物可以在细胞表面上结合并且随后内陷和陷入细胞内部。在本发明组合物中，代表性的、可用作靶向剂的结构部分为例如，但不限于，选自：蛋白、肽、aptomers、有机小分子、毒素、diptheria毒素、假单胞菌毒素、霍乱毒素、蓖麻毒素、拌刀豆球蛋白A、劳斯(氏)肉瘤病毒、塞姆利基森林病毒、水泡性口膜炎病毒、腺病毒、转铁蛋白、低
密度脂蛋白、钴胺素传递蛋白、蛋黄蛋白、表皮生长因子、生长激素、促甲状腺激素、神经生长因子、降血钙素、胰高血糖素、促泌乳激素、促黄体激素、甲状腺激素、血小板源生长因子、干扰素、儿茶酚胺、肽、糖脂类、糖蛋白和多糖的组。也可用所述结构部分的同源体或片段。这些靶向部分可以与承载的胶乳相关联用作指引承载的胶乳缀合物到靶细胞，并随后陷入细胞。这里并不需要所有的部分都被用作靶向部分。已知的能与特定受体或其他结构反应的这些部分中较小的片段也可作为靶向部分。
[0084] 抗体或抗体片段代表一类普遍使用的靶向部分，这类靶向部分可用于增强承载的胶乳或承载的胶乳缀合物向细胞内的吸收。可通过本领域技术人员已知的那些技术中的任何方法制备抗体。参见，例如Harlow和Lane，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1988。可通过细胞培养技术制备抗体，其中包括单克隆抗体的增殖或经由抗体基因进入相配的细菌细胞或
哺乳动物细胞宿主的
转染以制备重组抗体。在一种技术中，最初将一种包含多肽的免疫原注入宽范围哺乳动物中的任何一种(例如，小鼠、大鼠、兔、
绵羊或山羊)。如果多肽与一种载体蛋白(例如
牛血清清蛋白或钥孔虫戚血兰素)相结合，会引起更强烈的免疫响应。该免疫原注入动物宿主，优选地，根据预订的时间表掺入一种或多种促升免疫剂，并将动物周期性
放血。随后多肽特有的多克隆抗体可从这种抗血清中纯化，例如采用将多肽连接到合适的固体载体上的亲和色谱法纯化。
[0085] 与抗原多肽有关的特有单克隆抗体可通过如下方法制备，例如，采用Kohler和Milstein的技术，“Derivation of specific antibody-producingtissue culture and tumor lines by cell fusion.＂Eur.J.Immunol.6：511-519，1976”，及其改良。
[0086] 单克隆抗体可从生长的杂种细胞群的上清液中分离。此外，可用各种方法提高产率，例如将杂种细胞系注入适合的
脊椎动物宿主的腹膜腔中，例如小鼠。随后单克隆抗体可从腹水或血液中收集。杂质可通过常规技术从抗体中去除，常规技术例如色谱、凝胶过滤、沉淀和萃取。在纯化工艺例如亲和色谱步骤中可使用多肽。
[0087] 大量“人源化”抗体分子含有一个获自非人类免疫球蛋白的抗原结合位，如已经描述在Winter等(1991)Nature 349：293-299；Lobuglio等(1989)Proc.Nat.Acad.Sci.USA86：4220-4224。这些“人源化”分子用以降低对啮齿动物反人类抗体分子的不希望发生的免疫学反应，这种反应限制了那些结构部分在人类患者中治疗应用的持续时间和效力。
[0088] 维生素和其它主要矿物和营养物可被用作靶向部分以增强承载的胶乳或承载的胶乳缀合物向细胞内的吸收。特别是，维生素配体可选自：叶酸、结合叶酸类似物的叶酸受体和其它叶酸配体-结合受体、生物素、结合生物素类似物的生物素受体和其它生物素配体-结合受体、核黄素，结合核黄素类似物的核黄素受体和其它核黄素配体-结合受体以及硫胺素，结合硫胺素类似物的硫胺素受体和其它硫胺素配体-结合受体。其它营养物质被认为能引发受体介导细胞内吞作用，因此还可根据目前公开的方法使用。该其它营养物质为肉毒碱、肌醇、硫辛酸、烟酸、泛酸、吡哆醛和维生素C以及脂溶性维生素A、D、E和K。此外，
现有技术中描述的任何“免疫脂质体”(具有连接至脂质体表面抗体的脂质体)适合与所述的承载的胶乳或承载的胶乳缀合物一起使用。
[0089] 因不是所有的天然细胞膜都拥有生物活性生物素或叶酸受体，在体外对特定的细胞系应用所述组合物，可首先改变或修饰细胞系以保证生物素或叶酸受体存在生物活性。因此，通过在缺乏生物素或叶酸的培养基上培养细胞系以促进生物素或叶酸受体的产生而增加在细胞膜上生物素或叶酸受体的数量，或通过向生物素或叶酸受体相对应的蛋白或脱辅基蛋白中插入外来基因以增加在细胞膜上生物素或叶酸受体的数量。
[0090] RME不是承载的胶乳或承载的胶乳缀合物进入细胞的唯一方法。其它进入的方法可在承载的胶乳或承载的胶乳缀合物上连接适合的实体，包括膜孔的有效利用。吞噬作用的和胞饮作用的机制也可提供有利的机制，通过这种机制承载的胶乳或承载的胶乳缀合物可陷入细胞内部。
[0091] 识别部分可进一步含有受到酶或电化学分裂的序列。因此识别部分可包括对分裂敏感的序列，其通过在细胞内存在各种位置的酶，例如蛋白酶或限制性内切酶(例如DNAse或RNAse)分裂序列。
[0092] 生物学应用
[0093] 水分散的承载的胶乳还可用于其它生物学应用，包括但不限于器官的
断层X光成像、器官功能的监测、
冠状动脉造影术、荧光
内窥镜检查法、探测、成像、药物转运效率的确定以及癌症的治疗、激光辅助引导手术、光声法
和声荧光法。
[0094] 本发明的组合物可配制为用于肠内或肠胃外
给药的诊断组合物。这些组合物包含有效量的染料和适合预期药物类型的常规药剂学载体和赋形剂。例如，注射用药物制剂有利的是含有本发明所述的消毒水溶液或染料悬浮液。注射用药物组合物可直接注射或与大量注射用组合物混合用于全身给药。这样的溶液可以包含药学上可接受的缓冲溶液和，任选的
电解质例如
氯化钠。
[0095] 如本领域熟知的那样，用于
肠内给药的制剂可以大范围变化。通常，这种制剂是含有有效量的染料水溶液或悬浮液的液体。这样的肠内给药制剂可任选含有缓冲溶液、
表面活性剂、触变剂等等。口服给药的组合物还可以包含芳香剂和能增强其感官
质量的其它组分。
[0096] 给予有效量的诊断组合物以达到所需的增强效力。根据使用的特定染料、作为成像程序的目标的器官或组织和所用成像器材等等，该剂量可以大范围变化。
[0097] 采用常规方法使用本发明的诊断组合物。该组合物施用于患者，典型的是温血动物，对全身或局部器官或组织成像，然后患者经历成像步骤。
[0098] 给药技术包括
肠胃外给药、静脉给药和直接灌输至任意期望靶组织，靶组织包括但不限于实体瘤或瘤形成的组织。可通过使用最终纯化步骤来实现纯化，其在一包含适合的药物组合物的媒介中分布承载的胶乳或承载的胶乳缀合物组合物。适合的药物组合物通常包括许多所需的承载的胶乳或承载的胶乳缀合物连同依照剂量信息采用的活性剂(基于逐个具体实例)。所述的颗粒与药学上可接受的稀释剂或赋形剂(例如无菌水溶液)混合以获得适合的最终浓度。这种制剂通常包括缓冲溶液例如磷酸盐缓冲液(PBS)，或其它添加剂例如药物赋形剂、稳定剂(例如BSA或HAS)，或盐类如氯化钠。
[0099] 对于肠胃外给药通常需要通过确保其无菌、非免疫原性和非致热原性，以进一步提供药学上可接受的组合物。该技术在本领域已知。此外，对人体给药，制备应符合FDA生物标准机构所要求的无菌、致热原性和常规安全以及纯净的标准。当所述的承载的胶乳或承载的胶乳缀合物被引入细胞培养物中的悬浮细胞时，其能够在适合的菌种生长培养基中与纳米颗粒共同培养细胞，例如Luria broth(LB)或者适合的细胞培养基。其它介绍的方法也可以，但更优选介绍的这种处理方法并且承载的胶乳载体的表面上不存在实体时也能实行。
[0100] 单色或多色检测体系中应用的前述承载的胶乳缀合物与包含靶向材料的样品结合使用。通常在承载的胶乳缀合物水悬浮液中培养样品。当使用单色检测系统时，水悬浮液含有实质上完全相同的承载的胶乳缀合物。当使用多色检测系统时，水悬浮液含有许多不同的可被检测的承载的胶乳缀合物。在每种情况下，承载的胶乳缀合物对特定的靶或靶组合是特异性的。
[0101] 在与承载的胶乳缀合物混合之前，通过一种能使样品中的靶向材料接近探针的方法制备样品。靶向材料在标记或检测前可能需要纯化或分离。例如，样品可包含纯化的核酸、蛋白或碳水化合物、单独的或在混合物中的核酸、蛋白或碳水化合物物种；样品可在溶解的细胞中含有核酸、蛋白或碳水化合物，其中溶解的细胞含有其它细胞组分；或者样品可在基本上完整的可渗透细胞中含有核酸、蛋白或碳水化合物。样品的制备取决于在样品中含有的靶向材料的方式。当样品中含有细胞核酸(例如染色体或细胞中负载质体基因，RNA或DNA病毒或支原体感染细胞，或细胞内的RNA)或蛋白时，除已经描述的变性和中和之外，样品的制备还包括溶解细胞或透化细胞。
[0102] 在用承载的胶乳缀合物标记样品后，任选采用常规方法从样品中去除未结合的承载的胶乳缀合物，例如水洗。
[0103] 检测
[0104] 为检测靶向材料，用使承载的胶乳缀合物发出荧光的设施照射样品。通常，使用发射承载的胶乳缀合物激发峰范围的激发能的
光源。可利用光照所产生的荧光、已与靶向材料形成络合物承载的胶乳缀合物来测定靶向材料的存在、位置或数量。
[0105] 可通过多种成像技术使承载的胶乳缀合物发出的荧光直观，包括寻常光或荧光显微镜和激光扫描共焦显微镜和CCD
照相机。共焦显微镜中的三维空间成像解析技术利用了显微镜的点分布函数(点光源成像)来在其合适的视
角内调整未聚焦的光。多重标记的靶向材料任选以空间、时间顺序、尺寸或利用可检测的不同
光谱特性(包括激发和发射极限、荧光强度或其组合)来解析。多重标记的靶向材料通常利用不同承载的胶乳缀合物对每种靶向材料的独特光谱特性进行解析。作为选择，承载的胶乳缀合物是相同的，但样品被标记并且顺序观测或者空间分离。如果不需要解析多重靶，像在大规模筛检那样(例如泛-病毒或细菌污染物筛检)，无需将含有多重靶补体的承载的胶乳缀合物分别应用于样品。
[0106] 治疗剂是有效增强或抑制细胞功能、血流量、生物扰动或生物吸收的材料。实例可以是用于治疗癌症、心脏病、遗传病、细菌和
病毒感染以及其它紊乱的药物。
[0107] 其它可用于缀合的材料为PEG-肽、PEG-蛋白、PEG-酶抑制剂、PEG-寡糖、PEG-多糖、PEG-激素、PEG-右旋糖酐、PEG-低聚核苷酸、PEG-糖类、PEG-神经传递介质、PEG-半抗原、PEG-类胡萝卜素。
[0108] PEG可以同这些材料的混合物共同起作用以提高效用。
[0109] 以下是优选连接聚合物的列表，但并不是本发明所述所有连接聚合物的详尽和完整列表：
[0110]
[0111]
[0112] 在一种使用方法中，多重连接聚合物连接于纳米凝胶上。例如，在水中制备想要的单体、连接聚合物和引发剂的第一混合物。第一混合物被加入到附加的引发剂的第二混合物中并反应，此后可添加附加的引发剂以产生纳米凝胶组合物。在另一优选的使用方法中，多重连接聚合物被连接于纳米胶乳上。在水中制备单体、连接聚合物、引发剂、表面活性剂和缓冲剂的混合物。将这一混合物加至引发剂、表面活性剂和缓冲剂的水溶液中并反应，以生产本发明的纳米胶乳颗粒。
[0113] 通常，可在任何合适的条件下通过将生物活性物质与活性的水溶性连接聚合物分子反应制得衍生物。通常，酰化反应的最佳反应条件取决于已知参数和所需结果的具体实例。例如，PEG:蛋白的比例越高，
聚乙二醇化的产物所占的百分比越高。可以选择通过酰基化和/或烷基化方法制备连接聚合物/多肽缀合物分子的混合物。此方法的优势在于可选择混合物中均聚物/多肽缀合物的比例。
[0114] 本发明所用的胶乳可通过任何本领域已知的用于制备平均直径在5到100nm的颗粒的方法制备。特别有用的方法包括乳液和微乳液聚合。这样的技术在“Suspension，Emulsion，and Dispersion Polymerization：aMethodological Survey”Colloid.Polym.Sci.vol.270，p.717-732，1992和Lovell，P.A.；El-Aaser，M.S.“Emulsion Polymerization and EmulsionPolymers”，Wiley：Chichester，1997中进行了综述。另一种方法涉及在分子内交联各个聚合物链以形成非常小的颗粒的方法。该方法描述在美国
专利US6,890,703中。
[0115] 本发明可用的染料是荧光、憎水染料，其在400-1000nm波长下发射荧光。这类染料包括但不必须限于oxonol、吡喃洋、squaric、croconic、rodizonic、聚氮杂吲达省(polyazaindacenes)或香豆素，闪烁染料(通常是噁唑和噁二唑)、芳基和杂芳基-取代的聚烯烃(C2-C8烯烃部分)、部花青、羰花青、酞菁、噁嗪、carbostyryl、卟啉染料和二吡咯亚甲基
硼双氟化物染料、氮杂-二吡咯亚甲基硼双氟化物染料和噁嗪染料。可商购的荧光染料如表1所列，通式结构如表2所示。优选的染料为羰花青，酞菁或氮杂-二吡咯亚甲基硼双氟化物。
[0116] 表1.可商购的荧光染料
[0117] 5-氨基-9-二乙基亚胺基苯并(a)吩噁嗪高氯酸盐
[0118] 7-氨基-4-甲基carbostyryl
[0119] 7-氨基-4-甲基香豆素
[0120] 7-氨基-4-三氟甲基香豆素
[0121] 3-(2’-苯并咪唑基)-7-N，N-二乙基氨基香豆素
[0122] 3-(2’-苯并咪唑基)-7-二乙基氨基香豆素
[0123] 2-(4-联苯基)-5-(4-叔丁基苯基)-1，3，4-噁二唑
[0124] 2-(4-联苯基)-5-苯基-1，3，4-噁二唑
[0125] 2-(4-联苯基)-6-苯基苯并噁唑-1，3
[0126] 2，5-二-(4-联苯基)-1，3，4-噁二唑
[0127] 2，5-二-(4-联苯基)-噁唑
[0128] 4，4″′-二-(2-丁基辛氧基)-对-四联苯
[0129] 对-二(邻-甲基苯乙烯基)-苯
[0130] 5，9-二氨基苯并(a)吩噁嗪高氯酸盐
[0131] 4-二氰基亚甲基-2-甲基-6-(对-二甲基氨基苯乙烯基)-4H-吡喃
[0132] 1，1’-二乙基-2，2’-羰花青碘化物
[0133] 1，1’-二乙基-4，4’-羰花青碘化物
[0134] 3，3’-二乙基-4，4’，5，5’-二苯并硫杂三羰花青碘化物
[0135] 1，1’-二乙基-4，4’-二羰花青碘化物
[0136] 1，1’-二乙基-2，2’-二羰花青碘化物
[0137] 3，3’-二乙基-9，11’-新亚戊基硫杂三羰花青碘化物
[0138] 1，3’-二乙基-4，2’-喹啉基氧杂羰花青碘化物
[0139] 1，3’-二乙基-4，2’-喹啉基硫杂羰花青碘化物
[0140] 3-二乙基氨基-7-二乙基亚胺基吩噁嗪高氯酸盐
[0141] 7-二乙基氨基-4-甲基香豆素
[0142] 7-二乙基氨基-4-三氟甲基香豆素
[0143] 7-二乙基氨基香豆素
[0144] 3，3’-二乙基氧杂二羰花青碘化物
[0145] 3，3’-二乙基硫杂羰花青碘化物
[0146] 3，3’-二乙基硫杂二羰花青碘化物
[0147] 3，3’-二乙基硫杂三羰花青碘化物
[0148] 4，6-二甲基-7-乙基氨基香豆素
[0149] 2，2″′-二甲基-对-四联苯
[0150] 2，2″-二甲基-对-三联苯
[0151] 7-二甲基氨基-1-甲基-4-甲氧基-8-氮杂喹诺酮-2
[0152] 7-二甲基氨基-4-甲基喹诺酮-2
[0153] 7-二甲基氨基-4-三氟甲基香豆素
[0154] 2-(4-(4-二甲基氨基苯基)-1，3-丁二烯基)-3-乙基苯并噻唑鎓高氯酸盐[0155] 2-(6-(对-二甲基氨基苯基)-2，4-新亚戊基-1，3，5-己三烯基)-3-甲基苯并噻唑鎓高氯酸盐
[0156] 2-(4-(对二甲基氨基苯基)-1，3-丁二烯基)-1，3，3-三甲基-3氢-吲哚鎓高氯酸盐
[0157] 3，3’-二甲基氧杂三羰花青碘化物
[0158] 2，5-二联苯呋喃
[0159] 2，5-二苯基噁唑
[0160] 4，4’-二苯基茋
[0161] 1-乙基-4-(4-(对-二甲基氨基苯基)-1，3-丁二烯基)-吡啶鎓高氯酸盐[0162] 1-乙基-2-(4-(对-二甲基氨基苯基)-1，3-丁二烯基)-吡啶鎓高氯酸盐[0163] 1-乙基-4-(4-(对-二甲基氨基苯基)-1，3-丁二烯基)-喹诺鎓高氯酸盐[0164] 3-乙基氨基-7-乙基亚胺基-2，8-二甲基吩噁嗪-5-鎓高氯酸盐
[0165] 9-乙基氨基-5-乙基氨基-10-甲基-5氢-苯并吩噁嗪高氯酸盐
[0166] 7-乙基氨基-6-甲基-4-三氟甲基香豆素
[0167] 7-乙基氨基-4-三氟甲基香豆素
[0168] 1，1’，3，3，3’，3’-六甲基-4，4’，5，5’-二苯并-2，2’-碘化三羰花青碘化物[0169] 1，1’，3，3，3’，3’-六甲基吲哚二羰花青碘化物
[0170] 1，1’，3，3，3’，3’-六甲基吲哚三羰花青碘化物
[0171] 2-甲基-5-叔丁基-对-四联苯
[0172] 3-(2’-N-甲基苯基亚胺基偶氮基)-7-N，N-二乙基氨基香豆素
[0173] 2-(1-萘基)-5-苯基茋
[0174] 2-2’-对-亚苯基(phenylen)-二(5-苯基噁唑)
[0175] 3，5，3″″′，5″″′-四-叔丁基-对-六联苯
[0176] 3，5，3″″′，5″″′-四-叔丁基-对-五联苯
[0177] 2，3，5，6-1H，4H-四氢-9-乙酰基quinolizino-<9，9a，1-gh>香豆素[0178] 2，3，5，6-1H，4H-四氢-9-羰基乙氧基quinolizino-<9，9a，1-gh>香豆素[0179] 2，3，5，6-1H，4H-四氢-8-甲基quinolizino-<9，9a，1-gh>香豆素
[0180] 2，3，5，6-1H，4H-四氢-9-(3-吡啶基)-quinolizino-<9，9a，1-gh>香豆素[0181] 2，3，5，6-1H，4H-四氢-8-三氟甲基quinolizino-<9，9a，1-gh>香豆素[0182] 2，3，5，6-1H，4H-四氢quinolizino-<9，9a，1-gh>香豆素
[0183] 3，3′，2″，3″′-四甲基-对-四联苯
[0184] 2，5，2″″，5″″-四甲基-对-五联苯
[0185] 对-三联苯
[0186] 对-四联苯
[0187] 尼罗红
[0188] 罗丹明700
[0189] 噁嗪750
[0190] 罗丹明800
[0191] IR125
[0192] IR144
[0193] IR140
[0194] IR132
[0195] IR26
[0196] IR5
[0197] 二苯基己三烯
[0198] 二苯基丁二烯
[0199] 四苯基丁二烯
[0200] 萘
[0201] 蒽
[0202] 苝
[0203]
[0204] 红荧烯
[0205] 六苯并苯
[0206] 菲
[0207] 芴
[0209] 八乙基卟啉铂
[0210] 表2荧光染料举例
[0211]
[0212]
[0213]
[0214] 与胶乳颗粒一同使用的荧光染料可溶于溶液且不溶于水。当染料被承载入水溶性胶乳颗粒时，可观测到的
荧光量子产率比染料在含水溶剂中时可观测到的量子产率大。
[0215] 产率产率荧光染料可通过各种已知方法承载至胶乳之中。例如，如US6,706,460、US4,368,258、US4,199,363和US6,964,844所述，可将染料在水-混溶有机溶剂的溶液与胶乳混合，然后通过
蒸发、用水稀释或
透析去除溶剂。如US5,594,047所述，染料在水-混溶有机溶剂的溶液可与水性胶乳混合，然后将混合物高速剪切搅拌。作为选择，可在制备胶乳时引入染料。这种方法在描述在Journal of Polymer Science Part A：Polymer Chemistry，Vol.33，p.2961-2968，1995和Colloid and PolymerScience，vol.282，p.119-126，2003中。
[0216] 承载的胶乳颗粒可用作成像探针应用于动物和其他生理学体系中。该颗粒可用作诊断显影元件或用于在其他生物体外/生物体内的生理学成像应用。优选地，颗粒以含水、生物相容的分散液提供。
[0217] 所述组合物可进一步包含生物学、药物学或诊断的组分，该组分包括识别特定靶细胞或其它靶生物分子的靶向部分。此处使用的“靶细胞”指的是健康细胞、疾病细胞、哺乳动物细胞或
植物细胞。“靶生物分子”包括但不限于蛋白、蛋白片段、核酸或任意实质上的代谢物。
[0218] 代表性的、非限制性可与本发明组合物一同使用的靶试剂的结构部分列表为选自：蛋白、肽、aptomers、有机小分子、毒素、diptheria毒素、假单胞菌毒素、霍乱毒素、蓖麻毒素、拌刀豆球蛋白A、劳斯(氏)肉瘤病毒、塞姆利基森林病毒、水泡性口膜炎病毒、腺病毒、转铁蛋白、低密度脂蛋白、钴胺素传递蛋白、蛋黄蛋白、表皮生长因子、生长激素、促甲状腺激素、神经生长因子、降血钙素、胰高血糖素、促泌乳激素、促黄体激素、甲状腺激素、血小板源生长因子、干扰素、儿茶酚胺、肽、糖脂类、糖蛋白和多糖。还可以使用这些结构部分的同系物或片段。这些靶向部分可与纳米微粒相相关联用于指引纳米颗粒结合所选的靶。这里并不需要所有的部分都被用作靶向部分。已知的能与特定受体或其他结构反应的这些部分中较小的片段也可作为靶向部分。
[0219] 抗体或抗体片段代表一类普遍使用的靶向部分，这类靶向部分可用于连接至纳米胶乳。可通过本领域技术人员已知的那些技术中的任何方法制备抗体。参见，例如Harlow和 Lane，Antibodies：A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1988。可通过细胞培养技术制备抗体，其中包括单克隆抗体的增殖或经由抗体基因进入合适的细菌细胞或哺乳动物细胞宿主的转染以制备抗体。在一种技术中，最初将一种包含多肽的免疫原注入宽范围哺乳动物中的任何一种(例如，小鼠、大鼠、兔、绵羊或山羊)。如果多肽与一种载体蛋白(例如牛血清清蛋白或钥孔虫戚血兰素)相结合，会引起更强烈的免疫响应。该免疫原注入动物宿主，优选地，根据预订的时间表掺入一种或多种促升免疫剂，并将动物周期性放血。随后对多肽特异性的多克隆抗原可从这种抗血清中纯化，例如采用将多肽连接到合适的固体载体上的亲和色谱法纯化。
[0220] 对抗原多肽特异性的单克隆抗体可通过如下方法制备，例如，采用Kohler和Milstein的技术，Eur.J.Immunol.6：511-519，1976”，及其改进。
[0221] 单克隆抗体可从生长的杂种细胞群的上清液中分离。此外，可用各种方法提高产率，例如将杂种细胞系注入适合的脊椎动物宿主的腹膜腔中，例如小鼠。随后单克隆抗体可从腹水或血液中收集。杂质可通过常规技术从抗体中去除，例如色谱、凝胶过滤、沉淀和萃取。在纯化工艺例如亲和色谱步骤中可使用多肽。
[0222] 大量“人源化”抗体分子含有一个获自非人类免疫球蛋白的抗原结合位，如已经描述在Winter等(1991)Nature 349：293-299；Lobuglio等(1989)Proc.Nat.Acad.Sci.USA86：4220-4224。这些“人源化”分子被设计用以降低对啮齿动物反人类抗体分子的不希望发生的免疫学反应，其限制了那些结构部分在人类患者中治疗应用的持续时间和效力。
[0223] 识别部分可进一步包括能通过
选定靶识别的肽或核酸的序列。肽和核酸可选自本领域已知的能结合到选定靶的序列，或者选自能结合到选定靶的组合肽或核酸库。
[0224] 维生素和其它主要矿物和营养物可被用作靶向部分以增强承载的胶乳或承载的胶乳颗粒向靶的结合。特别是，维生素配体可选自：叶酸、结合叶酸类似物的叶酸受体和其它叶酸受体-结合配体、生物素、结合生物素类似物的生物素受体和其它生物素受体-结合配体、核黄素，结合核黄素类似物的核黄素受体和其它核黄素受体-结合配体以及硫胺素，结合硫胺素类似物的硫胺素受体和其它硫胺素受体-结合配体。
[0225] 因不是所有的天然细胞膜都拥有生物活性生物素或叶酸受体，在体外对特定的细胞系应用所述组合物，可首先改变或修饰细胞系以保证生物素或叶酸受体存在生物活性。因此，通过在缺乏生物素或叶酸的培养基上培养细胞系以促进生物素或叶酸受体的产生而增加在细胞膜上生物素或叶酸的数量，或通过向生物素或叶酸受体相对应的蛋白或脱辅基蛋白中插入外来基因以增加在细胞膜上生物素或叶酸的数量。
[0226] 识别部分可进一步含有酶或电化学分裂的序列。因此识别部分可包括对分裂敏感的序列，其通过在细胞内存在各种位置的酶，例如蛋白酶或限制性内切酶(例如DNAse或RNAse)分裂该序列。
[0227] 对于细胞靶向来说，细胞表面识别序列不是必须的。因此，虽然细胞表面受体靶向部分能够对给定的细胞类型靶向，或者诱导纳米颗粒和细胞表面的相关联，但是纳米胶乳颗粒表面不需存在细胞表面受体靶向部分。
[0228] 为了将生物学的、药学的或诊断的组分组配成所述的纳米微粒载体，这些组分可以通过联接与纳米颗粒载体相关联。“相关联”指的是纳米颗粒负载该组分，例如在纳米颗粒表面负载。该组分可以以非共价形式溶解和引入颗粒中。优选的相关联这些组分的方法是通过在表面的胺官能团以共价键结合。
[0229] 通常，在想要的靶向部分和纳米胶乳微粒载体间形成联接的任何方法都是可用的。这包括配体以共价键、离子键或氢键直接或间接通过连接基团连接到外部分子上。通过靶向部分、生物学的、药学的或诊断的组分的共作连接形成的连接共价通常连接到纳米颗粒载体上，其中该连接是在配合物的各自组分上由酸、醛、羟基、氨基或肼撑基团之间形成了酰胺、酯或亚氨基键。优选的是本领域公认的不稳定共价连接例如亚氨基键和所谓“活性的”酯，其含有-COOCH、-O-O-或-COOCH连接基团。氢键结合，例如在核酸互补株间形成的氢键，还可用于形成连接。
[0230] 在本发明的一个优选实施方案中，靶向部分是以共价键连接于聚乙二醇大分子单体末端的活性基团上的。所用的共价键取决于聚乙二醇末端的活性基团。例如，如果活性基团是胺，它可与靶向部分上的活性羧酯衍生物反应(例如，N-羟基琥珀酰亚胺酯)以形成酰胺键。如果活性基团是乙烯基砜，其可与靶向部分上的伯胺反应以提供第二个氨键。
[0231] 提供以下实施例以对本发明进行举例说明。
[0232] 表3染料结构
[0233]
[0234]*
[0235] 获自GE医疗**
[0236] 获自GE医疗/Amersham生物科学
[0237] 染料1、染料5、染料8和染料10的通用合成步骤1
[0238] 向 3H- 吲 哚 鎓 盐 (2eqv.) 和 N-(5-( 苯 基 氨 基 )-2，4- 戊 二 烯 基pentadienylidene)-苯胺单盐酸盐(双苯胺)(1eqv.)的乙腈溶液中加入乙酸酐和三乙胺(1.5eqv.)。将该混合物加热至回流5～25分钟。所得的混合物随后冷却至室温，将其倒入水或醚中得到粗产物，该粗产物进一步通过硅胶色谱法或再结晶法或反相高效液相色谱法纯化。
[0239] 染料合成实施例1-染料1的制备
[0240] 采用2，3，3-三甲基-1-十八烷基-3H-吲哚鎓高氯酸盐(4.28g，10mmol)和双苯胺(1.4g，5mmol)置于40ml含有三乙胺(1.5g，15mmoles)的乙酸酐中，按上述通用步骤制备该染料。反应时间为5分钟。该反应冷却至25℃并在剧烈搅拌下倾倒入2升
冰水中。将水层分出，油层溶解在100mL80/20二氯甲烷-甲醇溶液中。用色谱法在硅胶柱中用80/20二氯甲烷-甲醇溶液洗脱该物质。用无水
硫酸镁干燥后将溶液蒸发得到纯染料(4g，32％产率)。在甲醇中的λmax＝747nm，
消光系数＝220,020。
[0241] 染料合成实施例2-染料5的制备
[0242] 采用2，3，3-三甲基-1-丁基-3H-吲哚鎓高氯酸盐(12g，38mmol)和双苯胺(5.4g，19mmol)置于100ml含有三乙胺(10.5g，57mmoles)的乙酸酐中，按上述通用步骤制备该染料。反应15分钟，冷却至25℃并在剧烈搅拌下倾倒入2000mL冰水中。将水层分出，油层用色谱法在硅胶柱中用90/10二氯甲烷-甲醇溶液洗脱该物质。用无水硫酸镁干燥后将溶液蒸发得到纯染料(8g，71％产率)。在甲醇中的λmax＝746nm，消光系数＝259,500。
[0243] 染料合成实施例3-染料8的制备
[0244] 采用1，2，3，3-四甲基-3H-吲哚鎓四溴化硼(5.22g，20mmol)和双苯胺(2.84g，10mmol)置于25ml含有乙酸酐(3ml)和三乙胺(5.6ml)的异丙醇中反应两小时，按上述通用步骤制备该染料。该反应冷却至25℃并在剧烈搅拌下倾倒入1升冰水中。过滤收集粗产
1
物并再用水洗。粗产物用从热
乙醇溶液中再结晶的方法纯化。获得3.4g纯产物。H NMR谱图与其结构相符。在甲醇中的λmax＝739nm，消光系数＝294,000。
[0245] 染料合成实施例4-染料10的制备
[0246] 采用2，3，3-三甲基-1-(4-硫代丁基)-3H-吲哚鎓内盐(2.3g，6.7mmol)和双苯胺(0.95g，3.3mol)置于20ml乙酸酐中，按上述通用步骤制备该染料。剧烈搅拌下加入三乙胺(2g，20mmol)并加热至回流反应5分钟。冷却该反应并用二乙醚稀释至300mL，搅拌10分钟。将乙醚从油层分出，并加入25mL纯乙醇。将混合物加热至回流然后加入1.5g(0.01mmol)的碘化钠。继续加热3分钟然后将混合物搅拌冷却至25℃。过滤出固体物质，并用纯乙醇洗涤并干燥。Wt＝2.4g(94％产率，85％纯度)。将产品用反相高效液相色谱纯化得到1g的所需染料(HPLC纯化的产率为39％，纯度为99％)。在甲醇中的λmax＝784nm，消光系数＝221,700。
[0247] 染料合成实施例5-染料2的制备
[0248] 应用文献中描述的合成方法合成染料2(例如Zhao，W.等Chem.Int.Ed.2005，44，1677中所述)。在甲醇中的λmax＝739nm，消光系数＝129945。
[0249] 染料合成实施例6-染料3的制备
[0250] 将异硬脂醇(1.8g，6.6mmol)与N，N-二甲基甲酰胺(50ml)混合，用氢化钠(50％的油混合物0.31g，6.6mmol)处理，在氮气氛围下搅拌2小时。加入酞菁二氯化物，反应加热至回流过夜。该反应物被分配在水层和乙酸乙酯层之间，将有机层用水洗三次。有机层1
用硫酸镁干燥、过滤并浓缩。所得残留物用色谱法硅胶纯化得到0.8g的产物。H NMR谱图与其结构相符。在
甲苯中的λmax＝672nm。
[0251] 染料合成实施例6-染料4的制备
[0252] 将3H-吲哚鎓、2，3，3-三甲基-1-十八烷基-高氯酸盐(2.14g，5mmol)、N-((2-氯-3-((苯基氨基)亚甲基)-1-环己烯-1-基)亚甲基)-苯胺单盐酸盐(0.9g，2.5mmol)和1-甲基-2-吡咯烷酮(30ml)的混合物60℃下加热过夜。将混合物冷却至室温并倒入水中。通过过滤、水洗和
真空干燥收集该染料以获得粗产物(1.8g)，该粗产物染料不需进一步的纯化而应用于下一步骤。
[0253] 在室温下向
苯酚(130mg，1.4mmol)的无水四氢呋喃溶液中加入氢化钠(60mg，1.4mmol，60％矿物油溶液)。将混合物搅拌30分钟，然后加入染料(0.8g，0.9mmol)，该混合物加热至60℃加热过夜。然后去除溶剂并用色谱法纯化残留物(硅胶柱；二氯甲烷和2％
1
的甲醇)以获得纯净的染料产物560mg)。在丙酮中的λmax＝771nm，质谱和HNMR谱图与其结构相符。
[0254] 染料合成实施例7-染料6的制备
[0255] 向装有3H-吲哚鎓、2，3，3-三甲基-1-十八烷基-，
对甲苯磺酸盐(PTS)(5.75g，12mmol)、N-(3-(苯基氨基)-2-亚丙烯基)-苯胺单盐酸盐(1.55g，6mmol)和乙腈(15ml)的圆底烧瓶中加入乙酸酐(1.3ml)和三乙胺(3.4ml)。该混合物加热至回流并加入另一部分的三乙胺(2.0ml)。该反应混合物回流两小时。混合物冷却至室温后，搅拌下加入水。通过过滤和空气干燥收集作为反离子的带有PTS的染料粗产物(6.2g)。
[0256] 染料的PTS反离子接下来用高氯酸盐交换。在染料(6.1g)的甲醇(55ml)溶液中加入高氯酸钠(1.3g)的甲醇溶液。混合物在室温下搅拌1小时，染料沉淀出来并过滤收集。染料用在甲醇溶液中再结晶的方法进一步纯化。得到3.2g染料6。在甲醇中的λmax5
＝682nm，消光系数＝2.33×10。
[0257] 染料合成实施例8-染料7的制备
[0258] 根据带有增加一个离子交换步骤的染料合成实施例7的方法合成该染料。使用3H-吲哚鎓、2，3，3-三甲基-1-丁基，对苯磺酸盐(10.76g，20mmol)、N-(3-(苯基氨基)-2-亚丙烯基)-苯胺，单盐酸盐(2.6g，10mmol)、乙腈(30ml)、乙酸酐(2.5ml)和三乙胺(6.5ml)进行该缩合步骤。得到10.2g粗产物，使用染料合成实施例7的方法离子交换成高氯酸盐。交换过程应用染料粗产物(10g，18.6mmol)、MeOH(70ml)和高氯酸钠(2.6g，21.2mmol)。获得8.2g染料的高氯酸盐。在甲醇(300ml)中将粗高氯酸盐粗染料与amberlite IRA-400(Cl)
树脂(40g)搅拌几小时。滤除树脂，然后用第二份树脂重复该过程。用旋转
蒸发器除去溶剂，染料在60℃下真空干燥过夜。获得的终产物染料7(4.7g)在5
甲醇中的λmax＝641nm，消光系数＝2.56×10。
[0259] 染料合成实施例9-染料11的制备
[0260] 根据Lou Kai-yan，Qian Xu-huong，Song Gong-hua，华中理工大学学报，28，(2)，212-5，2002.中所述的方法制备染料11。在甲醇中的λmax＝751nm，消光系数＝5
2.31×10。
[0261] 实施例10.端胺基聚乙二醇大分子单体的制备
[0262]
[0263] 将聚二甲基丙烯酸乙二醇酯(Aldrich，Mn＝875,335g)与100mL的甲醇混合并用半胱胺(Aldrich，5.8g)和二异丙基乙胺(Hunigs碱)处理，然后在室温下搅拌2天后用
旋转蒸发器浓缩。所得残留物用1L乙酸乙酯溶解并用10％盐酸水溶液萃取。收集水层并加入50％的氢氧化钠水溶液使其成碱性，然后用乙酸乙酯萃取。有机层用硫酸镁干燥并浓缩。所得残留物用无水二乙醚溶解并用气态氯化氢处理并保持稳定(stand)。将醚倒出留下深蓝色油。将其用新鲜的二乙醚冲洗，并将二乙醚倒出。用旋转蒸发器浓缩深蓝色油，得到37g所需产物的盐酸盐。
[0264] 1H-NMR(300MHZ，CDCl3)：D1.18(d，3H)，1.93(bs，3H)，2.04(bs，2H)，2.43-2.77(bm，7H)，3.6-3.7(vbs，-CH2CH2O-)，3.73(bt，2H)，3.29(bt，2H)，5.56(bs，1H)，6.12(bs，1H).[0265] 实施例11.包含甲基丙烯酸甲氧基乙基酯(45％w/w)、二乙烯基苯(4％)、乙基苯乙烯(1％)和聚乙二醇单甲基醚甲基丙烯酸酯(50％)的纳米胶乳1的制备
[0266] 将500ml的三颈烧瓶底部加上Ace#15玻璃线和一连串的适配器以使得其能连接1/16英寸型号的聚四氟乙烯管。该烧瓶(此后指代″header″烧瓶)配备了机械搅拌器、带针头
注射器氮气入口的
橡胶隔膜。Header烧瓶中装入甲基丙烯酸甲氧基乙基酯(5.63g)、二乙烯基苯(0.63g，含有余量为乙基苯乙烯异构体的纯度80％的异构体混合物)、聚乙二醇单甲醚甲基丙烯酸酯(6.25g，Mn＝1100)、氯化十六烷基吡啶鎓(0.31g)、2，2′-偶氮二(N，N′-二亚甲基异丁基脒)二盐酸盐(0.06g)、
碳酸氢钠(0.06g)和蒸馏水(159.13g)。向配备机械搅拌器、回流
冷凝器、氮气进口和橡胶隔膜(此后指代“反应器”)的
1L三颈圆底烧瓶中装入2，2′-偶氮二(N，N′-二亚甲基异丁基脒)二盐酸盐(0.06g)、碳酸氢钠(0.06g)和蒸馏水(159.13g)。header和反应器中的内容物都搅拌至均相，并通入氮气排气二十分钟。将反应烧瓶置于60℃自动控温的水浴中，然后在通气2小时的时间内用QG6实验室
泵模型(Fluid Metering Inc.Syossett，NY)向反应器中加入header内容物。该反应混合物在60℃下搅拌16小时。然后将反应混合物用3.5K尺寸截断膜在持续补充水的水浴中透析48小时。得到286.0g的2.64％固体的无色分散体。准弹性光散射(QELS)测得的体积平均直径为10.8nm，变异系数为0.25。采用Nanotrac Ultrafme粒子分析器(MicrotracInc.Montgomeryville，PA)在3％-5％的固体上进行QELS。
[0267] 实施例12.纳米胶乳2(纳米胶乳1的离子交换重复作业)的制备
[0268] 采用与实施例2相同的方法制备该纳米胶乳。在header中的内容物为：甲基丙烯酸甲氧基乙基酯(22.50g)、二乙烯基苯(2.50g，含有余量为乙基苯乙烯异构体的纯度80％的异构体混合物)、聚乙二醇单甲基醚甲基丙烯酸酯(22.50g，Mn＝1100)、2，2′-偶氮二(N，N′-二亚甲基异丁基脒)二盐酸盐(0.25g)、碳酸氢钠(0.25g)和蒸馏水(313.50g)。反应器中有蒸馏水(636.50g)、2，2′-偶氮二(N，N′-二亚甲基异丁基脒)二盐酸盐(0.25g)、碳酸氢钠(0.25g)。得到771g5.59％固体的澄清分散体。准弹性光散射的体积平均直径为10.4nm，变化系数为0.27。将200g的胶乳于3.5K的尺寸截断膜中透析48小时。
然后在约15cc Dowex50Wx4离子交换树脂中搅拌透析胶乳(转换成钠离子形式并用蒸馏水洗涤3次)以获得3.85％固含量的离子交换分散体。
[0269] 实施例13.纳米胶乳3的制备(纳米胶乳1制备过程的大规模重复作业)
[0270] 采用与实施例2相同的方法制备该纳米胶乳。在header中的内容物为：甲基丙烯酸甲氧基乙基酯(45.00g)、二乙烯基苯(5.00g，含有余量为乙基苯乙烯异构体的纯度80％的异构体混合物)、聚乙二醇单甲基醚甲基丙烯酸酯(50.00g，Mn＝1100)、2，2′-偶氮二(N，N′-二亚甲基异丁基脒)二盐酸盐(0.50g)、碳酸氢钠(0.50g)和蒸馏水(627.00g)。反应器中有蒸馏水(1273.00g)、2，2′-偶氮二(N，N′-二亚甲基异丁基脒)二盐酸盐(0.50g)、碳酸氢钠(0.50g)。用有30K尺寸截断螺旋缠绕弹筒的Amicon LP1透析过滤系统(Millipore Inc)对胶乳进行
超滤。蒸馏水冲洗8次后用约600ccDowex50Wx4离子交换树脂处理胶乳(转换成钠离子形式并用蒸馏水洗涤3次)以获得5.67％固体的离子交换分散体。准弹性光散射的体积平均直径为12.0nm，变异系数0.28。
[0271] 实施例14.含有甲基丙烯酸甲氧基乙基酯(45.00w/w)、二乙烯基苯(4％)乙基苯乙烯(1％)、聚乙二醇单甲基醚甲基丙烯酸酯(45％)和苯乙烯磺酸钠(5％)的纳米胶乳4的制备。
[0272] 采用与实施例2相同的方法制备该纳米胶乳。header中的内容物为：甲基丙烯酸甲氧基乙基酯(22.50g)、二乙烯基苯(2.50g，含有余量为乙基苯乙烯异构体的纯度80％的异构体混合物)、聚乙二醇单甲基醚甲基丙烯酸酯(22.50g，Mn＝1100)、过硫酸钠(0.50g)、碳酸氢钠(0.25g)和蒸馏水(313.50g)。反应器中有蒸馏水(636.50g)、偏亚硫酸氢钠(0.36g)、碳酸氢钠(0.50)。获得759g的4.94％固体的澄清分散体。准弹性光散射的体积平均直径为22.2nm，变异系数0.25。将200g的胶乳于3.5K的尺寸截断膜中透析48小时以获得292g的3.24％固体的分散体。
[0273] 实施例15.含有甲基丙烯酸甲氧基乙基酯(45.00w/w)、二乙烯基苯(4％)、乙基苯乙烯(1％)、聚乙二醇单甲基醚甲基丙烯酸酯(45％)和甲基丙烯酸(5％)的纳米胶乳5的制备。
[0274] 采用与实施例2相同的方法制备该纳米胶乳。header中的内容物为：甲基丙烯酸甲氧基乙基酯(112.50g)、二乙烯基苯(1.25g，含有余量为乙基苯乙烯异构体的纯度80％的异构体混合物)、聚乙二醇单甲基醚甲基丙烯酸酯(11.25g，Mn＝1100)、2，2′-偶氮二(N，N′-二亚甲基异丁基脒)二盐酸盐(0.13g)、氯化十六烷基吡啶鎓(0.63g)和蒸馏水(156.75g)。反应器中有蒸馏水(318.25g)、2，2′-偶氮二(N，N′-二亚甲基异丁基脒)二盐酸盐(0.13g)、氯化十六烷基吡啶鎓(1.88g)。将胶乳与200cc Dowex88离子交换树脂搅拌1小时(2次)，然后于3.5K的尺寸截断膜中透析48小时以获得含4.39％固体的澄清乳液。准弹性光散射的体积平均直径为10.98nm，变异系数0.29。
[0275] 实施例16.含有甲基丙烯酸甲氧基乙基酯(45.00w/w)、二乙烯基苯(4％)、乙基苯乙烯(1％)、实施例1的端氨基聚乙二醇大分子单体(50％)的纳米胶乳6的制备。
[0276] 采用与实施例2相同的方法制备该纳米胶乳。header中的内容物为：甲基丙烯酸甲氧基乙基酯(5.63g)、二乙烯基苯(0.63g，含有余量为乙基苯乙烯异构体的纯度80％的异构体混合物)、聚乙二醇单甲基醚甲基丙烯酸酯(6.25g，Mn＝1100)、2，2′-偶氮二(N，N′-二亚甲基异丁基脒)二盐酸盐(0.06g)、氯化十六烷基吡啶鎓(0.31g)、碳酸氢钠(0.06g)和蒸馏水(78.38g)。反应器中有蒸馏水(159.13g)、2，2′-偶氮二(N，N′-二亚甲基异丁基脒)二盐酸盐(0.06g)、碳酸氢钠(0.06g)、氯化十六烷基吡啶鎓(0.94g)。将胶乳用100cc Dowex88离子交换树脂处理2次，然后于14K的尺寸截断膜中透析48小时以获得含3.26％固体的澄清乳液312g。准弹性光散射的体积平均直径为20.89nm，变异系数0.24。
[0277] 实施例17.含有苯乙烯(70％w/w)、二乙烯基苯(4％)、乙基苯乙烯(1％)、聚乙二醇单甲基醚甲基丙烯酸酯(25％)的纳米胶乳7的制备。
[0278] 采用与实施例2相同的方法制备该纳米胶乳。header中的内容物为：苯乙烯(8.75g)、二乙烯基苯(0.63g，含有余量为乙基苯乙烯异构体的纯度80％的异构体混合物)、聚乙二醇单甲基醚甲基丙烯酸酯(3.13g，Mn＝1100)、2，2′-偶氮二(N，N′-二亚甲基异丁基脒)二盐酸盐(0.06g)、氯化十六烷基吡啶鎓(0.31g)和蒸馏水(78.38g)。反应器中有蒸馏水(159.13g)、2，2′-偶氮二(N，N′-二亚甲基异丁基脒)二盐酸盐(0.63g)和氯化十六烷基吡啶鎓(0.94g)。该胶乳于3.5K的尺寸截断膜中透析48小时以获得含3.38％固体的澄清乳液251g。准弹性光散射的体积平均直径为12.82nm，变异系数0.36。
[0279] 实施例18.含有苯乙烯(45％w/w)、二乙烯基苯(4％)、乙基苯乙烯(1％)、聚乙二醇单甲基醚甲基丙烯酸酯(50％)的纳米胶乳8的制备。
[0280] 采用与实施例2相同的方法制备该纳米胶乳。header中的内容物为：苯乙烯(11.25g)、二乙烯基苯(1.25g，含有余量为乙基苯乙烯异构体的纯度80％的异构体混合物)、聚乙二醇单甲基醚甲基丙烯酸酯(12.5g，Mn＝1100)、2，2′-偶氮二(N，N′-二亚甲基异丁基脒)二盐酸盐(0.13g)、氯化十六烷基吡啶鎓(0.31g)、碳酸氢钠(0.13)、蒸馏水(156.75g)。反应器中有蒸馏水(318.25g)、2，2′-偶氮二(N，N′-二亚甲基异丁基脒)二盐酸盐(0.13g)和氯化十六烷基吡啶鎓(0.94g)。该胶乳于3.5K的尺寸截断膜中透析48小时，并用250cc Dowex88离子交换树脂处理以获得含4.08％固体的澄清乳液561.23g。
准弹性光散射的体积平均直径为13.22nm，变异系数0.19。
[0281] 实施例19.含有甲基丙烯酸甲酯(45％w/w)、二乙烯基苯(4％)、乙基苯乙烯(1％)和聚乙二醇单甲基醚甲基丙烯酸酯(50％)的纳米胶乳9的制备。
[0282] 采用与实施例2相同的方法制备该纳米胶乳。header中的内容物为：甲基丙烯酸甲酯(11.25g)、二乙烯基苯(1.25g，含有余量为乙基苯乙烯异构体的纯度80％的异构体混合物)、聚乙二醇单甲基醚甲基丙烯酸酯(12.5g，Mn＝1100)、2，2′-偶氮二(N，N′-二亚甲基异丁基脒)二盐酸盐(0.13g)、氯化十六烷基吡啶鎓(0.31g)、碳酸氢钠(0.13)和蒸馏水(156.75g)。反应器中有蒸馏水(318.25g)、2，2′-偶氮二(N，N′-二亚甲基异丁基脒)二盐酸盐(0.13g)和氯化十六烷基吡啶鎓(0.94g)。该胶乳于3.5K的尺寸截断膜中透析48小时，并用250cc Dowex88离子交换树脂处理以获得含3.71％固体的澄清乳液610.25g。准弹性光散射的体积平均直径为13.30nm，变异系数0.18。
[0283] 实施例20.含有丙烯酸丁酯(45％w/w)、二乙烯基苯(4％)、乙基苯乙烯(1％)和聚乙二醇单甲基醚甲基丙烯酸酯(50％)的纳米胶乳10的制备。
[0284] 采用与实施例2相同的方法制备该纳米胶乳。header中的内容物为：丙烯酸丁酯(5.63g)、二乙烯基苯(0.63g，含有余量为乙基苯乙烯异构体的纯度80％的异构体混合物)、聚乙二醇单甲基醚甲基丙烯酸酯(6.25g，Mn＝1100)、2，2′-偶氮二(N，N′-二亚甲基异丁基脒)二盐酸盐(0.06g)、氯化十六烷基吡啶鎓(0.31g)、碳酸氢钠(0.13)和蒸馏水(78.38g)。反应器中有蒸馏水(159.13g)、2，2′-偶氮二(N，N′-二亚甲基异丁基脒)二盐酸盐(0.06g)、碳酸氢钠(0.06)和氯化十六烷基吡啶鎓(0.94g)。该胶乳于14K的尺寸截断膜中透析48小时以获得含4.32％固体的澄清乳液263g。准弹性光散射的体积平均直径为24.56nm，变异系数0.29。
[0285] 实施例21：承载染料1的纳米胶乳1
[0286] 在暗光环境下通过以下步骤制备0.2784％w/w的染料储备液：将0.0280g染料1溶解于足量的四氢呋喃中得到重量为24.5244g的最终溶液。将1.4365g部分染料溶液加至细颈瓶中，并用四氢呋喃稀释至最终重量为10.0g。将9.9960g胶乳1加入细颈瓶中并在
旋转蒸发仪中将溶液
汽提至约40-50体积％。用3-5ml蒸馏水洗两次进一步去除剩余的四氢呋喃，汽提1/4至1/3的挥发物。得到含有4.27％固体的承载的胶乳(LL-1A)9.4069g，-3每克固体胶乳含有3.94×10 mol染料。另外三个具有更高承载量的样品(LL-IB、1C、ID)选用下表的试剂量用同样的方法制备：
[0287] 表4：承载染料1的纳米胶乳1
[0288]承载的 染料溶液 纳米胶乳 最终重量 固体胶乳中 终产物
胶乳名称 (g) (g) (g) 染料浓度 固体％
(mol/L) (％w/w)
LL-1A 1.4365 9.9960 9.4069 3.94×10-3 4.27
LL-1B 1.9153 10.1257 7.0755 4.95×10-3 5.76
LL-1C 2.3942 10.0720 11.5965 6.49×10-3 3.50
LL-1D 2.8730 10.0135 10.4086 7.65×10-3 3.88
[0289] 实施例22：承载染料2的纳米胶乳1
[0290] 在暗光环境下通过以下步骤制备0.0919％w/w的染料储备液：将0.0138g染料2溶解于足量的四氢呋喃中得到重量为15.0239g的最终溶液。采用实施例12所述方法制备在棕色细颈瓶中从纳米胶乳1制备承载的胶乳LL-2A和2B。为了将胶乳浆转为磷酸缓冲盐水，向下面列举量的每一个样品中加入部分盐混合物(NaCl137份、KCl2.7份、Na2HPO410份、KH2PO42份)。
[0291] 表5：承载染料2的纳米胶乳1
[0292]承载 染料溶液 纳米胶乳 最终重量 缓冲盐 固体胶乳中 终产物
胶乳 (g) (g) (g) (g) 染料浓度 固体％
名称 (mol/L) (％w/w)
LL-2A 0.3076 10.0642 4.6215 0.0459 1.51×10-3 6.63
LL-2B 1.1953 10.0268 7.0755 0.0831 5.89×10-3 3.66
[0293] 实施例23：承载染料3的纳米胶乳4
[0294] 以实施例13所述方法和下表的试剂量从纳米胶乳4制备承载的胶乳LL-3A和3B。将0.0296g染料3溶解于足量的四氢呋喃中制备终溶液重量为29.8012g的染料储备液(0.0903％w/w)。
[0295] 表6：承载染料2的纳米胶乳4
[0296]承载 染料溶液 纳米胶乳 最终重量 缓冲盐 固体胶乳中 终产物
胶乳 (g) (g) (g) (g) 染料浓度 固体％
名称 (mol/L) (％w/w)
LL-3A 1.9627 10.0185 9.4467 0.0938 4.97×10-3 3.45％
-3
LL-3B 3.9254 10.0014 9.3620 0.0930 1.01×10 3.50％
[0297] 实施例24：承载染料1的纳米胶乳2
[0298] 以实施例13所述方法和下表的试剂量从纳米胶乳2制备承载的胶乳LL-4A、4B和4C。将0.0101g染料1溶解于足量的四氢呋喃中制备终溶液重量为25.1201g的染料储备液(0.0402％w/w)。
[0299] 表7：承载染料1的纳米胶乳2
[0300]承载 染料溶液 纳米胶乳 最终重量 缓冲盐 固体胶乳中 终产物
胶乳 (g) (g) (g) (g) 染料浓度 固体％
名称 (mol/L) (％w/w)
LL-4A 3.9146 10.0451 10.9030 0.1083 4.99×10-3 3.56％
LL-4B 5.2195 10.0267 10.5013 0.1043 5.00×10-3 3.69％
LL-4C 6.5243 10.0238 10.1695 0.1010 4.97×10-3 3.81％
[0301] 实施例25：承载染料6的纳米胶乳3
[0302] 以实施例13所述方法和下表的试剂量从纳米胶乳3制备承载的胶乳LL-5A。将0.0087g染料6溶解于足量的四氢呋喃中制备终溶液重量为24.3270g的染料储备液(0.0358％w/w)。
[0303] 表8：承载染料6的纳米胶乳3
[0304]承载 染料溶液 纳米胶乳 最终重量 缓冲盐 固体胶乳中 终产物
胶乳 (g) (g) (g) (g) 染料浓度 固体％
名称 (mol/L) (％w/w)
LL-5A 6.0514 10.0812 10.9062 0.1083 4.93×10-3 5.34％
[0305] 实施例26：承载染料7的纳米胶乳3
[0306] 以实施例13所述方法和下表的试剂量从纳米胶乳3制备承载的胶乳LL-6A。将0.0096g染料7溶解于足量的四氢呋喃中制备终溶液重量为24.9403g的染料储备液(0.0385％w/w)。
[0307] 表9：承载染料7的纳米胶乳3
[0308]承载 染料溶液 纳米胶乳 最终重量 缓冲盐 固体胶乳中 终产物
胶乳 (g) (g) (g) (g) 染料浓度 固体％
名称 (mol/L) (％w/w)
-3
LL-6A 4.5138 10.0472 10.6326 0.1056 4.99×10 5.46％
[0309] 实施例27：承载染料1的纳米胶乳6
[0310] 以实施例13所述方法和下表的试剂量从纳米胶乳6制备承载的胶乳LL-7A、7B和7C。将0.0197g染料1溶解于足量的四氢呋喃中制备终溶液重量为28.4269g的染料储备液(0.0693％w/w)。
[0311] 表10：承载染料1的纳米胶乳6
[0312]承载 染料溶液 纳米胶乳 最终重量 缓冲盐 固体胶乳中 终产物
胶乳 (g) (g) (g) (g) 染料浓度 固体％
名称 (mol/L) (％w/w)
LL-7A 1.9231 10.0733 10.1517 0.1008 4.96×10-3 3.25％
LL-7B 3.8463 10.0458 10.2093 0.1414 9.94×10-3 3.23％
LL-7C 5.7694 10.0434 10.2493 0.1018 1.48×10-2 323％
[0313] 实施例28：承载染料9的纳米胶乳6
[0314] 以实施例13所述方法和下表的试剂量从纳米胶乳6制备承载的胶乳LL-8A、8B和8C。将0.0096g染料9溶解于足量的四氢呋喃中制备终溶液重量为24.9403g的染料储备液(0.0385％w/w)。
[0315] 表11：承载染料9的纳米胶乳6
[0316]承载 染料溶液 纳米胶乳 最终重量 缓冲盐 固体胶乳中 终产物
胶乳 (g) (g) (g) (g) 染料浓度 固体％
名称 (mol/L) (％w/w)
LL-8A 2.7393 10.0427 10.8418 0.1077 5.02×10-3 5.35％
LL-8B 8.1328 10.0048 10.4790 0.1041 1.49×10-2 5.56％
[0317] 实施例29：承载染料4的纳米胶乳6
[0318] 以实施例13所述方法和下表的试剂量从纳米胶乳6制备承载的胶乳LL-9A和9B。将0.0200g染料4溶解于足量的四氢呋喃中制备终溶液重量为21.9372g的染料储备液(0.0912％w/w)。
[0319] 表12：承载染料4的纳米胶乳6
[0320]承载 染料溶液 纳米胶乳 最终重量 缓冲盐 固体胶乳中 终产物
胶乳 (g) (g) (g) (g) 染料浓度 固体％
名称 (mol/L) (％w/w)
LL-9A 3.0311 10.0935 10.2335 0.1016 4.98×10-3 5.71％
LL-9B 9.0000 10.0165 10.5145 0.1044 1.48×10-2 5.57％
[0321] 实施例30：承载染料5的纳米胶乳3
[0322] 以实施例13所述方法和下表的试剂量从纳米胶乳3制备承载的胶乳LL-11A。将0.0075g染料5溶解于足量的四氢呋喃中制备终溶液重量为30.0000g的的染料储备液(0.0250％w/w)。
[0323] 表13：承载染料5的纳米胶乳3
[0324]承载 染料溶液 纳米胶乳 最终重量 缓冲盐 固体胶乳中 终产物
胶乳 (g) (g) (g) (g) 染料浓度 固体％
名称 (mol/L) (％w/w)
-3
LL-10A 6.8762 10.0645 10.1517 0.1008 4.99×10 5.73％
[0325] 实施例31：承载染料1的纳米胶乳3
[0326] 以实施例13所述方法和下表的试剂量从纳米胶乳3制备承载的胶乳LL-12A。将0.0197g染料1溶解于足量的四氢呋喃中制备终溶液重量为28.4269g的染料储备液(0.0693％w/w)。
[0327] 表14：承载染料1的纳米胶乳3
[0328]承载 染料溶液 纳米胶乳 最终重量 缓冲盐 固体胶乳中 终产物
胶乳 (g) (g) (g) (g) 染料浓度 固体％
名称 (mol/L) (％w/w)
LL-11A 4.0788 10.3676 10.6559 0.1058 5.76×10-3 5.63％
[0329] 实施例32：连接承载的胶乳LL-7A至生物素靶向结构部分
[0330] 向1ml承载染料的胶乳样品LL-7A中加入5mlPBS缓冲液，随后加入5mgNHS-PEG-生物素(MW5000，Nektar)。避光搅拌反应混合物3小时。反应结束后，用YM-30(Millipore)过滤器过滤溶液，并用PBS缓冲液洗涤4次。包括没有承载染料的胶乳对比样品。
[0331] 进行如下的HABA/抗生物素蛋白替换结合分析以确定连接在染料承载纳米胶乳表面的生物素的量。方法如下：在1cm黑壁样品池中将HABA/抗生物素蛋白分析预混料(Pierce Biotechnology)溶解于800μLPBS缓冲液中。记录在500nm处的吸收度。然后将100μL连接了生物素的承载染料的纳米胶乳样品加入样品池中，15分钟后重新测定500nm处的吸光度。用容积校正后的吸收差异测定生物素连接的量。每毫克承载染料的纳米胶乳样品上连接约80μg生物素。
[0332] 对比实施例1：承载染料1的苯乙烯纳米胶乳7
[0333] 以实施例12所述方法和下表的试剂量从纳米胶乳7制备对比的承载的胶乳CLL-1A。将0.0795g染料1溶解于足量的四氢呋喃中制备溶液终重量为28.5549g的染料储备液(0.2784％w/w)。
[0334] 表15：承载染料1的苯乙烯纳米胶乳7
[0335]承载 染料溶液 纳米胶乳7 最终重量 固体胶乳中 终产物
胶乳 (g) (g) (g) 染料浓度 固体％
名称 (mol/L) (％w/w)
CLL-1A 0.4783 10.0571 12.8983 4.77×10-3 2.65％
[0336] 对比实施例2：承载染料1的苯乙烯纳米胶乳8
[0337] 以实施例13所述方法和下表的试剂量从纳米胶乳8制备对比的承载的胶乳CLL-2A。将0.0100g染料1溶解于足量的四氢呋喃中制备溶液终重量为28.5743g的染料储备液(0.0350％w/w)。
[0338] 表16：承载染料1的苯乙烯纳米胶乳8
[0339]承载 染料溶液 纳米胶乳 最终重量 缓冲盐 固体胶乳中 终产物
胶乳 (g) (g) (g) (g) 染料浓度 固体％
名称 (mol/L) (％w/w)
CLL-2A 4.7661 10.0018 10.6570 0.1058 4.98×10-3 3.84％
[0340] 对比实施例3：承载染料1的甲基丙烯酸甲酯纳米胶乳9
[0341] 以实施例13所述方法和下表的试剂量从纳米胶乳9制备对比的承载的胶乳CLL-3A。将0.0100g染料1溶解于足量的四氢呋喃中制备溶液终重量为28.5743g的染料储备液(0.0350％w/w)。
[0342] 表17：承载染料1的甲基丙烯酸甲酯纳米胶乳8
[0343]承载 染料溶液 纳米胶乳 最终重量 缓冲盐 固体胶乳中 终产物
胶乳 (g) (g) (g) (g) 染料浓度 固体％
名称 (mol/L) (％w/w)
CLL-3A 4.3785 10.0418 9.7027 0.0964 4.97×10-3 3.89％
[0344] 对比实施例4：承载染料1的丙烯酸丁酯纳米胶乳10
[0345] 以实施例13所述方法和下表的试剂量从纳米胶乳10制备对比的承载的胶乳CLL-4A。将0.0100g染料1溶解于足量的四氢呋喃中制备溶液终重量为28.5743g的染料储备液(0.0350％w/w)。
[0346] 表18：承载染料1的丙烯酸丁酯纳米胶乳10
[0347]承载 染料溶液 纳米胶乳 最终重量 缓冲盐 固体胶乳中 终产物
胶乳 (g) (g) (g) (g) 染料浓度 固体％
名称 (mol/L) (％w/w)
CLL-4A 5.0465 10.3420 9.8740 0.0981 4.79×10-3 4.54％
[0348] 对比实施例5：承载染料8的纳米胶乳3
[0349] 以实施例13所述方法和下表的试剂量从纳米胶乳3制备对比的承载的胶乳CLL-5A。将0.0075g染料8溶解于足量的四氢呋喃中制备溶液终重量为24.4668g的染料储备液(0.0307％w/w)。
[0350] 表19：承载染料8的纳米胶乳3
[0351]承载 染料溶液 纳米胶乳 最终重量 缓冲盐 固体胶乳中 终产物
胶乳 (g) (g) (g) (g) 染料浓度 固体％
名称 (mol/L) (％w/w)
CLL-5A 4.0794 10.0272 10.5456 0.1047 4.35×10-3 5.49％
[0352] 实施例24：荧光相对量子产率的测定
[0353] 荧光相对量子产率的测定详见HORIBA Jobin Yvon ApplicationNote，“A Guide to Recording Fluorescence Quantum Yields”(可从英国米德尔塞克斯郡Horiba Jobin Yvon获得)。
[0354] 用磷酸缓冲盐水(PBS，pH7.4)体积稀释染料承载的胶乳水分散液以获得一系列-7 -8染料浓度范围在10 -10 mol/L的溶液，这样在1cm径长范围内它们的吸收最大峰值不超过
0.1。一系列标准浓度(参比)染料由以下方法制备：首先在室温条件下将固体染料溶解在-7 -8
光谱级甲醇中，然后用PBS缓冲液稀释甲醇染料溶液以形成范围在10 -10 mol/L的染料浓度系列。最终染料溶液的甲醇含量通常小于1％。
[0355] 所有的稀释过程均在避光的条件下完成，且样品置于琥珀色圆底旋盖离心管中储藏使光分解最小化。所有的样品均在稀释后数小时内检测。
[0356] 将染料溶液置于5cm的带塞样品池中，使用Perkin Elmer Lambda900UV/VIS/NIR分光计测量吸收度。染料的吸收强度在特定的激发波长下检测，该激发波长用于溶剂-去除和基线-归零吸收谱的荧光测量。所测得的吸收值转化为用于RQY测定的相当于1cm径长样品池的值。
[0357] 1cm径长样品池染料溶液的荧光谱用SPEX fluorolog 16800.22m双分光计的光-角检测模式记录。设备的参数设置和用于本发明和参比染料的激发波长都是优选的，且对每个实验都是相同的。每个染料样品的基线-解析荧光谱对溶剂影响和仪器反应特征作为发射波长的函数进行校正，测量了积分荧光强度。
[0358] 将每个染料样品的积分荧光强度作为在想要激发波长测量的吸收度(1cm径长当量)的函数绘制出来。所得的F/A图与零截距呈线性，回归系数大于0.97。F/A图的斜率与染料的荧光量子产率呈正比。本发明染料的斜率然后归一化至用于参比染料染料的斜率值，以得到本发明染料的“归一化的RQY”公制值。该数据见表4。
[0359] 上表数据证明与亲水性染料结构类似物直接溶解在PBS缓冲液中相比，用疏水
近红外染料承载并分散在PBS缓冲液中的纳米胶乳颗粒的荧光量子产率获得了显著改进(实施例17、LL-6A对染料12，实施例18、LL-7A对染料11，实施例22、LL-11A对染料11)。
[0360] 上表数据还证明与溶于有机溶剂(如甲醇)中的同样疏水染料相比，用疏水近红外染料承载并分散在PBS缓冲液中的纳米胶乳颗粒的荧光量子产率获得了显著改进(实施例16、LL-5A对染料6和实施例17、LL-6A对染料7)。
[0361] 上表数据还证明与亲水性近红外荧光团、靛青绿相比，用不同结构的疏水近红外染料(碳菁、偶氮-氟硼二吡咯和酞青)承载并分散在PBS缓冲液中的纳米胶乳颗粒的荧光量子产率液获得了显著改进(实施例13、LL-2A对染料10，实施例14、LL-3A对染料10、实施例15、LL-4A对染料10，实施例19、LL-8A对染料10)。
[0362] 上表数据还证明用碳菁承载的纳米胶乳颗粒的荧光量子产率能通过增加二-N-烷基疏水部分尺寸得以改善(对比实施例5、染料8承载的CLL-5A对比染料1承载的LL-11A)。
[0363] 上表数据还证明甲基丙烯酸甲氧基乙基酯单体衍生的网格与苯乙烯(对比实施例1和2)、甲基丙烯酸甲酯(对比实施例3)或丙烯酸丁酯(对比实施例4)单体衍生的网格相比，用近红外亲水性染料承载的纳米胶乳颗粒的荧光量子产率得到显著改善。
[0364] 表20承载的胶乳的相对量子产率
[0365]本发明 承载染料的胶乳染料承载染料的 参比的染料溶液
实施例 胶乳名称 胶乳“归一化
RQY”
12 LL-1A 1 20 PBS中的染料10
LL-1B 1 20
LL-1C 1 19
LL-1D 1 19
13 LL-2A 2 16 PBS中的染料10
LL-2B 2 12
14 LL-3A 3 21 PBS中的染料10
LL-3B 3 18
15 LL-4A 1 22 PBS中的染料10
LL-4B 1 20
LL-4C 1 21
16 LL-5A 6 1.7 甲醇中的染料6
17 LL-6A 7 1.6 甲醇中的染料7
17 LL-6B 7 1.3 PBS中的染料12
18 LL-7A 1 22 PBS中的染料10
LL-7A 1 2.1 PBS中的染料11
LL-7B 1 19
LL-7C 1 13
19 LL-8A 9 16 PBS中的染料10
LL-8B 13
20 LL-9A 4 16 PBS中的染料10
LL-9B 11
21 LL-10A 5 20 PBS中的染料10
22 LL-11A 1 22 PBS中的染料10
LL-11B 1 2.1 PBS中的染料11
对比1 CLI-1A 1 0.6 LL-11A
对比2 CLI-2A 1 0.7 LL-11A
对比3 CLI-3A 1 0.8 LL-11A
对比4 CLI-4A 1 0.7 LL-11A
对比5 CLI-5A 8 0.5 LL-11A
[0366] 在实施例33中，通式中的R2是由甲基丙烯酸甲氧基乙基酯(R2＝用于纳米胶乳X和X1的甲基)、甲基丙烯酸乙氧基乙基酯(R2＝用于纳米胶乳X2的乙基)、甲基丙烯酸丁氧基乙基酯(R2＝用于纳米胶乳X3的丁基)、甲基丙烯酸苯氧基乙基酯(R2＝用于纳米胶乳X4的苯基)制备的各种聚合物。表格中显示不同的
纳米粒子具有类似的尺寸和聚合分散性。表中显示不同R2基团具有类似的荧光量子产率。
[0367] 实施例33.制备用于比较研究的甲基丙烯酸烷氧乙基酯胶乳的通用方法[0368] 用于研究的纳米胶乳X含有甲基丙烯酸烷氧乙基酯(45％w/w)、二乙烯基苯(4％)、乙基苯乙烯(1％)和实施例1中端氨基聚乙二醇大分子单体(氨基-PEGMA)(50％)。
[0369] 采用实施例2描述的相同方法制备纳米胶乳X1-X4。header中的内容物为：甲基丙烯酸烷氧基乙基酯(5.63g)、二乙烯基苯(0.63g，含有余量为乙基苯乙烯异构体的纯度80％的异构体混合物)、聚乙二醇单甲基醚甲基丙烯酸酯(6.25g，Mn＝1100)、2，2′-偶氮二(N，N′-二亚甲基异丁基脒)二盐酸盐(0.06g)、氯化十六烷基吡啶鎓(0.31g)、碳酸氢钠(0.06g)和蒸馏水(78.38g)。反应器中有蒸馏水(159.13g)、2，2′-偶氮二(N，N′-二亚甲基异丁基脒)二盐酸盐(0.06g)、碳酸氢钠(0.06g)、氯化十六烷基吡啶鎓(0.94g)。将胶乳用100cc Dowex88离子交换树脂处理2次，于14K的尺寸截断膜中透析48小时，用约
50cc Dowex50Wx4离子交换树脂处理(转变为钠盐形式并用蒸馏水洗涤3次)以获得澄清乳液。
[0370] 表21 R2对粒子尺寸(Dv)和聚合分散性(CV)的影响
[0371]纳米胶乳 烷氧基乙基单体 PEG单体 ％固体 Dv(nm) CV
X 甲基丙烯酸甲氧基 氨基 3.98 21.2 0.37
乙基酯 -PEGMA
45％ 50％
X1 甲基丙烯酸甲氧基 PEGMA 4.17 14.6 0.20
乙基酯 50％
45％
X2 甲基丙烯酸乙氧基 PEGMA 3.76 18.2 0.23
乙基酯 50％
45％
X3 甲基丙烯酸丁氧基 PEGMA 3.44 17.5 0.22
乙基酯 50％
45％
X4 甲基丙烯酸苯氧基 PEGMA 3.98 16.9 0.19
乙基酯 50％
45％
[0372] 实施例34承载染料1的甲基丙烯酸烷氧乙基酯胶乳
[0373] 在暗光环境下通过以下步骤制备0.0440％w/w的染料储备液：将0.0132g染料1溶解于足量的四氢呋喃中得到最终溶液重量为30.00g的染料储备液。采用实施例12所述方法和下表所列试剂量在棕色细颈瓶中从纳米胶乳X-X4制备承载的胶乳。为了将胶乳浆转为磷酸缓冲盐水，向下面列举量的每一个样品中加入部分盐混合物(NaCl137份、KCl2.7份、Na2HPO410份、KH2PO42份)。
[0374] 表22 不同R2基团的荧光染料承载的胶乳制剂
[0375]承载的 染料溶液 纳米胶乳 最终重量 缓冲盐 固体胶乳中 终产物
胶乳名 (g) (g) (g) (g) 染料浓度 固体％
称 (mol/L) (％w/w)
(R2)
-3
LL-X 2.950 10.22 10.23 0 4.89×10 3.18
(甲基)
LL-X1 3.881 10.017 10.20 0.101 4.98×10-3 4.11
(甲基)
LL-X2 3.418 10.089 9.27 0.094 4.83×10-3 4.11
(乙基)
LL-X3 3.200 10.060 9.45 0.094 4.96×10-3 3.68
(丁基)
LL-X4 3.793 10.756 10.27 0.106 4.75×10-3 4.03
(苯基)
[0376] 表23.R2基团对荧光量子产率的影响
[0377]本发明 染料承载的 胶乳染料 承载染料的胶 参考的染料溶液
实施例 胶乳名称 乳“归一化
RQY”
XX LL-X 1 22 PBS中的染料10
(甲基)
XX LL-X1 1 21 PBS中的染料10
(甲基)
XX LL-X2 1 22 PBS中的染料10
(乙基)
XX LL-X3 1 21 PBS中的染料10
(丁基)
XX LL-X4 1 21 PBS中的染料10
(苯基)
[0378] 实施例35：光稳定性评价
[0379] 取同等体积的在PBS缓冲液中的染料1承载的胶乳分散液和在PBS缓冲液中的染料11(都含0.45mmole/L染料)置于半透明Nalgene HDPE瓶中。用长顶
荧光灯(Dazor Manufacturing Corporation制造，配有2个Sylvania4100K，F15T8/CW15W荧光“冷白“
灯泡)在大约2kLux光强下连续照射约30小时。用Perkin Elmer Lambda900UV/VIS/NIR分光计在5cm长度的带塞样品池测定染料最大λ处的光吸收减少对时间的函数。
[0380] 在PBS缓冲液中的染料1承载的胶乳分散液LL-1A的染料光退色(吸光率损失)的一级速率常数2.8倍慢于在PBS缓冲液中的染料11的一级速率常数。
[0381] 实施例36避光稳定性评估
[0382] 取同等体积的在PBS缓冲液中的染料1承载的胶乳分散液LL-1A和在PBS缓冲液中的染料11(5cm长度的带塞样品池中的“零时“吸收值均为0.37)在室温下储存置于带塞Nalgene瓶中。按照一定间隔移去等分量并用Perkin Elmer Lambda 900UV/VIS/NIR分光计测定染料最大λ处光密度。
[0383] 测定在λ-max染料光谱吸收的减少对“黑暗储存”时间的函数。在PBS缓冲液中的染料1承载的胶乳分散液LL-1A的染料光退色(吸光率的损失)的一级速率常数1.7倍慢于在PBS缓冲液中的染料11的一级速率常数。
[0384] 实施例37.将承载的胶乳LL1A与山羊抗兔二级抗体缀合
[0385] A.连接子修饰的承载硫代-SMCC
[0386]
[0387] 1)取2.2ml LL1A胶乳溶液并加入1.1ml PBS缓冲液(7.4)。
[0388] 2)将7.3mg硫代-SMCC(Pierce Biotechnology)溶于73μl DMSO中，并加入上述胶乳溶液。
[0389] 3)在涡旋或搅拌的条件下反应1小时。
[0390] 4)将反应液倒入YM-30离心超滤管(Millipore)中，加入大量PBS缓冲液(约15ml)，然后离心超滤除去过量的连接子。离心过滤后，胶乳溶液应为约700μL。通常需要进行2-3次离心过滤。(由15ml开始且最后约700μl)。
[0391] B.二级抗体连接子修饰
[0392] 5)称取12mg DTT(二硫代苏糖醇)，将其溶于100uL含1mMEDTA(
乙二胺四乙酸)的PBS缓冲溶液，pH7.4。
[0393] 6)将1mg二级抗体(山羊抗兔)溶于500μl(浓度2mg/mL)含1mMEDTA的PBS缓冲溶液，pH7.4。
[0394] 7)向抗体溶液中加入5uL DTT溶液，搅拌反应1小时。
[0395] 8)用YM-30过滤器将过量的DTT从样品中过滤，用含1mM EDTA的PBS缓冲溶液，pH7.4洗三次。最后一次洗涤样品量小于1mL。
[0396] C.承载的胶乳-抗体缀合物的形成
[0397] 9)将功能化-连接子的承载的胶乳溶液与DTT修饰的抗体溶液混合，在超过4℃室温搅拌过夜。
[0398] 实施例38.用承载的胶乳-抗体缀合物检测蛋白的试验
[0399] 在一小
块硝化纤维上点上靶向兔蛋白，放置15min。所制备的载物片用5％blotto的PBS溶液处理30min并用新鲜的PBS溶液洗涤。
[0400] 用含有5％blotto乳液的10ml PBS缓冲液(pH7.4)稀释承载的胶乳-缀合的抗体(100μl通过步骤9制备的溶液)。将该稀释液与待测硝化纤维一起震荡30min，然后用新鲜的PBS缓冲液洗涤。将硝化纤维条带置于柯达成像工作站MM4000中，并暴露1分钟以记录荧光(720nm激发光40nm带通过过滤器/790发射光40nm带通过过滤器)。如图1所示，硝化纤维条带的亮斑显示了承载标记抗体缀合物与被斑点化兔蛋白的结合率水平非常低，因此容易检测到靶向蛋白的存在。
