技术领域
[0001] 本
发明属于
生物分析技术领域，特别涉及一种靶向近红外寿命可调晶格应变型量子点及其制备方法。
背景技术
[0002] 与传统的有机
荧光染料相比，量子点具有许多优异的
光谱性能，在生物学、医学领域显示出了广阔的应用前景，尤其是近年来发展起来的近红外荧光量子点，对组织具有强的穿透
力，特别适合于体内非侵入性
可视化成像。同时，较长的
荧光寿命可以与背景自发荧光寿命很好的分开，显著提高荧光寿命成像的
信噪比。但是，在复杂的细胞环境中，量子点靶向识别细胞还是具有一定的难度。
发明内容
[0003] 为解决上述问题，本发明提供了一种靶向近红外寿命可调晶格应变型量子点，所述靶向近红外寿命可调晶格应变型量子点含有可靶向识别癌细胞的穿膜肽，可以实现对癌细胞的靶向识别，同时，所述量子点在近红外区
覆盖范围广，且荧光寿命较长，适用于生物成像研究，尤其适用于活体成像研究。
[0004] 第一方面，本发明提供了一种靶向近红外寿命可调晶格应变型量子点，包括碲化镉/硫化镉量子点和用于识别癌细胞的穿膜肽，所述穿膜肽与所述碲化镉/硫化镉量子点通过配位作用连接，所述碲化镉/硫化镉量子点具有以碲化镉为
内核，以硫化镉为
外壳的
核壳结构，所述内核的尺寸为1.8nm-2.2nm，所述外壳的厚度为1.5nm-2.5nm。
[0005] 优选地，所述靶向近红外寿命可调晶格应变型量子点的发射
波长为620-750nm。
[0006] 优选地，所述靶向近红外寿命可调晶格应变型量子点的荧光寿命为30-160纳秒(ns)。
[0007] 优选地，所述硫化镉以晶格应变
外延式生长的方式包覆在所述碲化镉的表面形成所述核壳结构。
[0008] 所述硫化镉以晶格应变外延式生长的方式包覆在所述碲化镉的表面形成核壳结构，故形成的核壳结构为II型结构；对于II型碲化镉/硫化镉量子点(CdTe/CdS量子点)，随着硫化镉壳层厚度的增加，所述CdTe/CdS量子点出现荧光峰大幅度红移以及荧光寿命大幅度增加的现象。可以通过调节其壳层厚度来获得不同荧光寿命和不同发射波长的靶向近红外寿命可调晶格应变型量子点。
[0009] 优选地，所述靶向近红外寿命可调晶格应变型量子点的发射波长为670nm，寿命为63±3ns。
[0010] 优选地，所述靶向近红外寿命可调晶格应变型量子点的发射波长为700nm，寿命为102±2ns。
[0011] 优选地，所述靶向近红外寿命可调晶格应变型量子点的发射波长为742nm，寿命为136±1ns。
[0012] 优选地，所述穿膜肽还包括六组
氨酸标签，所述穿膜肽通过所述六组氨酸标签与所述碲化镉/硫化镉量子点连接。
[0013] 更优选地，所述穿膜肽通过所述六组氨酸标签与所述碲化镉/硫化镉量子点中的镉离子通过配位作用连接。
[0014] 优选地，所述穿膜肽为用于识别MCF-7人体
乳腺癌细胞的细胞穿膜肽CPP30。
[0015] 更 优 选 地 ，所 述 穿 膜 肽 C P P 3 0 的 氨 基 酸 序 列 为 ：PGfldtlvvlhrGPGGYRRTTPSYYRMYLR。其中，大写字母代表l-氨基酸；小写字母代表d-氨基酸。
[0016] 更优选地，所述穿膜肽CPP30与所述六组氨酸标签(用His6-tag表示)之间通过聚乙二醇(用PEG3表示)连接，聚乙二醇的聚合度为3。
[0017] 所述穿膜肽可用CPP30-PEG3-(His6-tag)表示。
[0018] 本发明第一方面提供的靶向近红外寿命可调晶格应变型量子点，包括穿膜肽，该量子点可靶向识别癌细胞，有助于后续的荧光成像。同时，所述靶向近红外寿命可调晶格应变型量子点的量子产率高，寿命较长，发射波长光谱较宽，抗
光漂白，具有良好的生物医学应用价值。
[0019] 第二方面，本发明提供了一种靶向近红外寿命可调晶格应变型量子点的制备方法，包括以下步骤：
[0020] 取粒径为1.8nm-2.2nm的碲化镉粉末溶于超纯
水作为反应基液，所述反应基液中碲化镉的
质量浓度为2g/L-3g/L，然后调节所述反应基液的pH值至10.5-11.5；
[0021] 将摩尔比为1:2的镉源和巯基化合物溶于超纯水中配制成混合溶液B，所述混合溶液B中镉离子的摩尔浓度为0.05mol/L-0.1mol/L，然后在搅拌条件下，将所述混合溶液B缓慢加入到上述的反应基液中，在70℃下搅拌加热反应6h，实现硫化镉在所述碲化镉上的包覆，得到混合溶液C；
[0022] 另取所述混合溶液B，将穿膜肽与所述混合溶液B混合形成混合溶液D；
[0023] 将所述混合溶液C加热至80℃，然后在搅拌条件下加入所述混合溶液D，反应
温度为80-100℃，反应时间为1-3h，所述硫化镉在所述碲化镉上继续包覆得到碲化镉/硫化镉量子点，所述穿膜肽与所述碲化镉/硫化镉量子点通过配位作用连接，制得靶向近红外寿命可调晶格应变型量子点，所述靶向近红外寿命可调晶格应变型量子点包括碲化镉/硫化镉量子点和用于识别癌细胞的穿膜肽，所述穿膜肽与所述碲化镉/硫化镉量子点通过配位作用连接，所述碲化镉/硫化镉量子点具有以碲化镉为内核，以硫化镉为外壳的核壳结构，所述内核的尺寸为1.8nm-2.2nm，所述外壳的厚度为1.5nm-2.5nm。
[0024] 本发明在所述混合溶液B缓慢加入到所述的反应基液时，硫化镉在所述碲化镉内核上进行包覆，得到一定厚度的硫化镉外壳，然后继续加入穿膜肽与所述混合溶液B混合形成混合溶液D，硫化镉外壳的厚度继续增加，通过调控反应温度和反应时间，使最终制得的碲化镉/硫化镉量子点外壳的厚度在1.5nm-2.5nm范围内进行变化。
[0025] 优选地，加入所述混合溶液D时，在搅拌条件下分三次在所述混合溶液C加入所述混合溶液D，每次加入的所述混合溶液D的体积均为2mL。
[0026] 优选地，所述混合溶液D中所述穿膜肽的体积为10μL。
[0027] 优选地，所述混合溶液D中，所述穿膜肽与所述混合溶液B中的巯基化合物的摩尔比为1:500。
[0028] 优选地，所述碲化镉粉末的制备方法为：
[0029] 将摩尔比为1:(1.6-2)的镉源和巯基化合物溶于超纯水中配制成混合溶液A，所述混合溶液A中镉离子的摩尔浓度为0.015mol/L-0.035mol/L，调节混合溶液A的pH值至10.5-11.5；然后在无
氧环境下，向所述混合溶液A中注入新制的碲氢化钠或碲氢化
钾溶液，在4-8℃反应16-24小时，经10000转/分高速离心、无水
乙醇洗涤数次，然后
真空干燥得到碲化镉粉末。
[0030] 更优选地，所述新制碲氢化钠或碲氢化钾溶液的制备方法为：将摩尔比为(3-6):1的
硼氢化钠或硼氢化钾和碲粉溶解于超纯水中，室温反应4-6.5小时，得到碲氢化钠或碲氢化钾溶液。
[0031] 优选地，反应结束后，将制得的反应液经10000转/分高速离心、无水乙醇洗涤数次，然后真空干燥后得到所述靶向近红外寿命可调晶格应变型量子点。
[0032] 优选地，所述镉源为卤化镉(CdX2，X＝Cl,Br,I)、
醋酸镉(Cd(CH3COO)2)、
硝酸镉(Cd(NO3)2)或
硫酸镉(CdSO4)。
[0033] 优选地，所述巯基化合物为巯基乙酸或巯基丙酸(MPA)。
[0034] 优选地，所述无氧环境包括真空状态或者保护性气体存在的环境；所述保护性气体包括氮气和惰性气体。
[0035] 优选地，所述的搅拌方式包括磁力搅拌和电动搅拌。
[0036] 优选地，所述搅拌速度为500-700r/min。
[0037] 所述超纯水是指将水中的导
电介质几乎全部去除，又将水中不离解的胶体物质、气体和有机物均去除至很低程度的水。
[0038] 优选地，所述靶向近红外寿命可调晶格应变型量子点的发射波长为620-750nm。
[0039] 优选地，所述靶向近红外寿命可调晶格应变型量子点的荧光寿命为30-160纳秒。
[0040] 优选地，所述硫化镉以晶格应变外延式生长的方式包覆在所述碲化镉表面形成核壳结构。
[0041] 优选地，所述靶向近红外寿命可调晶格应变型量子点的发射波长为670nm，寿命为63±3ns。
[0042] 优选地，所述靶向近红外寿命可调晶格应变型量子点的发射波长为700nm，寿命为102±2ns。
[0043] 优选地，所述靶向近红外寿命可调晶格应变型量子点的发射波长为742nm，寿命为136±1ns。
[0044] 本发明优选地，所述穿膜肽还包括六组氨酸标签，所述穿膜肽通过所述六组氨酸标签与所述碲化镉/硫化镉量子点连接。
[0045] 优选地，所述穿膜肽为用于识别MCF-7人体乳腺癌细胞的细胞穿膜肽CPP30。
[0046] 更优选地，所述穿膜肽的氨基酸序列为：PGfldtlvvlhrGPGGYRRTTPSYYRMYLR。其中，大写字母代表l-氨基酸；小写字母代表d-氨基酸。
[0047] 更优选地，所述穿膜肽CPP30与所述六组氨酸标签(用His6-tag表示)之间通过聚乙二醇(用PEG3表示)连接，聚乙二醇的聚合度为3。
[0048] 所述穿膜肽用CPP30-PEG3-(His6-tag)表示。
[0049] 第二方面提供的靶向近红外寿命可调晶格应变型量子点的制备方法，通过一步合成法可以直接制得靶向近红外寿命可调晶格应变型量子点，制备方法简单，实验可重复性强。制得的所述靶向近红外寿命可调晶格应变型量子点的量子产率高，寿命长且可调节，抗光漂白，具有良好的生物医学应用价值。
[0051] (1)本发明提供了一种靶向近红外寿命可调晶格应变型量子点，可靶向识别MCF-7人体乳腺癌细胞，有助于后续的荧光成像。同时，所述靶向近红外寿命可调晶格应变型量子点的量子产率高，寿命较长，发射波长光谱较宽，抗光漂白，具有良好的生物医学应用价值。
[0052] (2)本发明提供了一种靶向近红外寿命可调晶格应变型量子点的制备方法，通过一步合成法可以直接制得靶向近红外寿命可调晶格应变型量子点，制备方法简单，实验可重复性强。
附图说明
[0053] 图1为
实施例1靶向近红外寿命可调晶格应变型量子点的制备过程示意图；
[0054] 图2为实施例1制备的碲化镉的高
分辨率透射
电子显微镜(HRTEM)图和TEM图；
[0055] 图3为实施例1制备的碲化镉的粒径分布图；
[0056] 图4为实施例1制备的碲化镉的紫外可见吸收光谱和荧光发射光谱图；
[0057] 图5为实施例1制备的靶向近红外寿命可调晶格应变型量子点的高分辨率透射电子显微镜(HRTEM)图和TEM图；
[0058] 图6为实施例1制备的靶向近红外寿命可调晶格应变型量子点的粒径分布图；
[0059] 图7为实施例1-3制得的靶向近红外寿命可调晶格应变型量子点的紫外可见吸收光谱和发射光谱图；
[0060] 图8为实施例1-3制得的靶向近红外寿命可调晶格应变型量子点的荧光寿命衰减曲线图；
[0061] 图9为本发明实施例靶向近红外寿命可调晶格应变型量子点与MCF-7细胞和C6脑胶质瘤细胞共孵育后的明场显微镜图像和荧光寿命成像。
具体实施方式
[0062] 以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
[0063] 图1为实施例1靶向近红外寿命可调晶格应变型量子点的制备过程示意图；从图12+
中可看出，在碲化镉1中加入镉源(Cd )和巯基丙酸(MPA)，硫化镉在碲化镉上的进行包覆，得到一定厚度的CdTe/CdS量子点2，然后再加入修饰有PEG3-(His6-tag)的CPP303(用CPP30-PEG3-(His6-tag)表示)、镉源(Cd2+)和巯基丙酸(MPA)，硫化镉继续在碲化镉上的进行包覆，使硫化镉外壳越来越厚，直至外壳的厚度为1.5nm-2.5nm，制得靶向近红外寿命可调晶格应变型量子点4(用CPP30-LS-QDs表示)，同时穿膜肽与碲化镉/硫化镉量子点中镉离子进行配位作用，从而在碲化镉/硫化镉量子点连接上穿膜肽。
[0064] 实施例1
[0065] 一种靶向近红外寿命可调晶格应变型量子点的制备方法，具体包括以下步骤：
[0066] (1)制备碲化镉粉末
[0067] a、配制Cd2+浓度为0.1mol/L的CdCl2水溶液，浓度为0.2mol/L的3-巯基丙酸水溶液，备用；
[0068] b、新制NaHTe溶液：将摩尔比为4.5:1的NaBH4和Te粉溶解于超纯水中，室温反应5小时，得到NaHTe溶液；
[0069] c、CdTe的制备：取5mLCdCl2溶液，4.5mL 3-巯基丙
酸溶液定容至30mL制成混合溶液A，转移到50mL三口烧瓶中，用NaOH溶液调节pH为10.5，向三口烧瓶中通入氩气除氧1h，加入新制NaHTe溶液100μL，于4℃保存17小时。加入60mL无水乙醇，用10000r/min离心15min，重复离心、无水乙醇洗三次，真空干燥后得到CdTe粉末；
[0070] (2)制备靶向近红外寿命可调晶格应变型量子点
[0071] 取0.024g步骤(1)制备的CdTe粉末溶于10mL超纯水作为反应基液，加入到50ml三口烧瓶中，用NaOH溶液调节反应基液的pH为11；开启干式金属浴的磁力搅拌和加热按钮，加入步骤(1)制备的CdCl2溶液和3-巯基丙酸溶液以1:1的体积比均匀混合得到的混合溶液B，在70℃下搅拌加热反应6h，实现硫化镉在碲化镉上的包覆，得到混合溶液C；
[0072] 另取混合溶液B，将穿膜肽与混合溶液B混合形成混合溶液D；穿膜肽与3-巯基丙酸的摩尔比为500:1；
[0073] 将混合溶液C加热至80℃，然后在搅拌条件下分三次在混合溶液C加入混合溶液D，每次加入的混合溶液D的体积均为2mL，反应温度为100℃，反应时间为1h，硫化镉在碲化镉上继续包覆得到碲化镉/硫化镉量子点，穿膜肽与碲化镉/硫化镉量子点通过配位作用连接，最终制得靶向近红外寿命可调晶格应变型量子点。
[0074] 图2为实施例1制备的碲化镉的高分辨率透射电子显微镜(HRTEM)图(左图，图中标尺为5nm)和TEM图(右图，图中标尺为20nm)；图3为实施例1制备的碲化镉的粒径分布图；图4为实施例1制备的碲化镉的紫外可见吸收光谱和荧光发射光谱图。从图2-4可以看出，实施例1制备的碲化镉的粒径约为2nm，粒径分布均一。HRTEM照片中有明显的晶格条纹，说明CdTe结晶性良好。CdTe的最大吸收波长为420nm，发射波长为500nm。
[0075] 图5为实施例1制备的靶向近红外寿命可调晶格应变型量子点的高分辨率透射电子显微镜(HRTEM)图(左图，图中标尺为5nm)和TEM图(右图，图中标尺为50nm)；图6为实施例1制备的靶向近红外寿命可调晶格应变型量子点的粒径分布图。从图中可以看出实施例1制备的碲化镉/硫化镉量子点的粒径约为5nm，粒径分布均一。根据碲化镉内核的粒径约为
2nm，碲化镉/硫化镉量子点的粒径约为5nm，可以得知硫化镉外壳的厚度约为1.5nm。HRTEM照片中有明显的晶格条纹，说明碲化镉/硫化镉量子点结晶性良好。
[0076] 实施例2
[0077] 一种靶向近红外寿命可调晶格应变型量子点的制备方法，具体包括以下步骤：
[0078] 按照实施例1的步骤(1)制备碲化镉粉末；
[0079] 取0.024g步骤(1)制备的CdTe粉末溶于10mL超纯水作为反应基液，加入到50ml三口烧瓶中，用NaOH溶液调节反应基液的pH为11；开启干式金属浴的磁力搅拌和加热按钮，加入步骤(1)制备的CdCl2溶液和3-巯基丙酸溶液以1:1的体积比均匀混合得到的混合溶液B，在70℃下搅拌加热反应6h，实现硫化镉在碲化镉上的包覆，得到混合溶液C；
[0080] 另取混合溶液B，将穿膜肽与混合溶液B混合形成混合溶液D；穿膜肽与3-巯基丙酸的摩尔比为500:1；
[0081] 将混合溶液C加热至80℃，然后在搅拌条件下分三次在混合溶液C加入混合溶液D，每次加入的混合溶液D的体积均为2mL，硫化镉在碲化镉上继续包覆，反应温度为100℃，反应时间为2h；硫化镉在碲化镉上继续包覆得到碲化镉/硫化镉量子点，穿膜肽与碲化镉/硫化镉量子点通过配位作用连接，最终制得靶向近红外寿命可调晶格应变型量子点。
[0082] 通过高分辨率透射电子显微镜(HRTEM)观测本实施例制得的靶向近红外寿命可调晶格应变型量子点，得出CdTe内核的尺寸为2nm，硫化镉外壳的厚度为2nm。
[0083] 实施例3
[0084] 一种靶向近红外寿命可调晶格应变型量子点的制备方法，具体包括以下步骤：
[0085] 按照实施例1的步骤(1)制备碲化镉粉末；
[0086] 取0.024g步骤(1)制备的CdTe粉末溶于10mL超纯水作为反应基液，加入到50ml三口烧瓶中，用NaOH溶液调节反应基液的pH为11；开启干式金属浴的磁力搅拌和加热按钮，加入步骤(1)制备的CdCl2溶液和3-巯基丙酸溶液以1:1的体积比均匀混合得到的混合溶液B，在70℃下搅拌加热反应6h，实现硫化镉在碲化镉上的包覆，得到混合溶液C；
[0087] 另取混合溶液B，将穿膜肽与混合溶液B混合形成混合溶液D；穿膜肽与3-巯基丙酸的摩尔比为500:1；
[0088] 将混合溶液C加热至80℃，然后在搅拌条件下分三次在混合溶液C加入混合溶液D，每次加入的混合溶液D的体积均为2mL，反应温度为100℃，反应时间为3h。硫化镉在碲化镉上继续包覆得到碲化镉/硫化镉量子点，穿膜肽与碲化镉/硫化镉量子点通过配位作用连接，最终制得靶向近红外寿命可调晶格应变型量子点。
[0089] 通过高分辨率透射电子显微镜(HRTEM)观测本实施例制得的靶向近红外寿命可调晶格应变型量子点，得出CdTe内核的尺寸为2nm，硫化镉外壳的厚度为2.5nm。
[0090] 图7为实施例1-3制得的靶向近红外寿命可调晶格应变型量子点的紫外可见吸收光谱(左图)和荧光发射光谱图(右图)；图8为实施例1-3制得的靶向近红外寿命可调晶格应变型量子点的荧光寿命衰减曲线图。图7和图8中1代表实施例1制得的靶向近红外寿命可调晶格应变型量子点(该量子点用CPP30-LS-QDs-670表示)，2代表实施例2制得的靶向近红外寿命可调晶格应变型量子点(该量子点用CPP30-LS-QDs-700表示)，3代表实施例3代表的靶向近红外寿命可调晶格应变型量子点(该量子点用CPP30-LS-QDs-742表示)。
[0091] 图7中左图为实施例1-3制得的靶向近红外寿命可调晶格应变型量子点的紫外可见吸收光谱，通过紫外可见吸收光谱可以估算该量子点的粒径大小与透射电子显微镜结果相符合。右图为实施例1-3制得的靶向近红外寿命可调晶格应变型量子点的荧光发射光谱，从图7中可以看出，随着硫化镉外壳厚度的增加，靶向近红外寿命可调晶格应变型量子点荧光发射峰出现了明显的红移，如实施例1的靶向近红外寿命可调晶格应变型量子点硫化镉外壳的厚度为1.5nm时，荧光发射峰在670nm。当实施例2的靶向近红外寿命可调晶格应变型量子点硫化镉外壳的厚度为2nm时，荧光发射峰在700nm，如实施例3的靶向近红外寿命可调晶格应变型量子点硫化镉外壳的厚度为2.5nm时，荧光发射峰在742nm。
[0092] 采用荧光仪测试实施例1-3制得的靶向近红外量子点的荧光寿命衰减，结果如图8所示，根据图8中靶向近红外寿命可调晶格应变型量子点的荧光寿命衰减曲线，通过荧光仪自带
软件拟合得到的实施例1-3制得的靶向近红外寿命可调晶格应变型量子点CPP30-LS-QDs-670、CPP30-LS-QDs-700和CPP30-LS-QDs-742的荧光寿命依次为63±3ns、102±2ns和136±1ns，随着外壳厚度的增加，靶向近红外寿命可调晶格应变型量子点的荧光寿命也不断增加。
[0093] 当硫化镉外壳较薄时，带隙较宽，导带
位置较高，量子点属于Ⅰ型结构，随着壳厚增加，硫化镉带隙变窄，其导带位置下降，量子点逐渐过渡到II型结构，对于II型CdTe/CdS量子点，发光不仅有CdTe核区导带电子与
价带空穴间的直接复合，还有CdS壳层导带电子与CdTe核价带空穴界面处的间接复合，这会导致发光峰明显红移和荧光寿命的增加。
[0094] 将实施例1和实施例3制得的靶向近红外寿命可调晶格应变型量子点CPP30-LS-QDs-670和CPP30-LS-QDs-742混合并与MCF-7细胞和C6脑胶质瘤细胞共孵育，测试荧光寿命。图9为本发明量子点与MCF-7细胞和C6脑胶质瘤细胞共孵育后的明场显微镜图像(左图，图中标尺为20μm)和荧光寿命成像(右图)，从图9中可以看出，本实施例制得的靶向近红外寿命可调晶格应变型量子点可靶向识别MCF-7细胞(白色圆圈内)，在C6(灰色圆圈内)上的荧光寿命成像不明显。
[0095] 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明
专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干
变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附
权利要求为准。
