一种基于荧光相关谱的供体受体距离分布测量方法
专利汇可以提供一种基于荧光相关谱的供体受体距离分布测量方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种基于 荧光 相关谱的供体受体距离分布测量方法，通过激光共聚焦 显微镜 平台的荧光相关谱模 块 在不同激光功率下对供体和受体荧 光标 记的活细胞进行选择性供体激发，相关卡对供体通道和受体通道的 光子 数涨落 信号 采集形成自相关曲线，通过对受体自相关曲线的三线态分析可以计算 能量 转移速率和转移效率，利用最大熵 算法 还可从受体三线态自相关曲线中反演其三线态分布进而计算供受体距离分布，荧光相关谱分析本身就是稀溶液浓度测量的优秀技术，因此对 光谱 重叠项 积分项 作供体受体浓度比例修正后，本发明可以应用于供体受体非 配对 的荧光共振能量转移效率以及距离分布的测量，该方法测量方便，测量 精度 高。，下面是一种基于荧光相关谱的供体受体距离分布测量方法专利的具体信息内容。
1.一种基于荧光相关谱的供体受体距离分布测量方法，该方法包括如下步骤：
(1)在单个细胞中分别表达供体荧光蛋白和受体荧光蛋白以及在单个细胞中共同表达供体荧光蛋白和受体荧光蛋白，供体荧光蛋白下述简称为供体，受体荧光蛋白下述简称为受体；
(2)利用激光共聚焦扫描显微镜系统的荧光相关谱模块对所述单个细胞进行荧光相关Dd Aa(
谱测量，获得单独供体的自相关曲线G (τ)、单独受体的自相关曲线G τ)、供体受体同时Db Ab
存在的供体自相关曲线G (τ)以及供体受体同时存在的受体自相关曲线G (τ)；
Dd
(3)利用自相关函数对步骤(2)中获得单独供体的自相关曲线G (τ)进行拟合，计算供体在不同供体波长激光功率下平衡时三线态平均比例 和三线态弛豫时间 并分别对此供体波长激光功率的对数作图，同样地对单独受体的自相关曲线GAa(τ)进行拟合，获得受体在不同受体波长激光功率下平衡时三线态平均比例 和三线态弛豫时间 并分别对此受体波长激光功率的对数作图；
(4)针对步骤(3)中单独供体在不同激光功率下平衡时三线态平均比例 和三线态弛豫时间 两条曲线数据，进行联合的列文伯格-马夸尔特非线性最小二乘法拟合，拟合时参考已知的供体荧光寿命可确定供体荧光衰减速率
求得供体的系间窜越 供体的三线态衰减速率常数 以及供体的激发截面
(5)重复第(4)步骤，由已知的受体荧光寿命确定 由步骤(3)获得的单独受体的两条曲线数据受体平衡时三线态平均比重 和受体三线态弛豫时间 对同样的两条公式进行联合拟合，求得受体的系间窜越 受体的三线态衰减速率常数
(6)重复第(3)、(4)步骤，利用步骤(2)方案三获得的供体受体同时存在的受体自相Ab
关曲线G (τ)数据，获得受体在不同供体激光功率下的平衡时三线态平均比例 和三线态弛豫时间 考虑了荧光共振能量转移速率速率常数kFRET之后，对步骤(4)中出现的两条公式中针对受体的kexc参数进行修正；
(7)利用修正之后的公式求取荧光共振能量转移速率常数kET和能量转移效率E；
(8)任意选取上述步骤(2)不同激光功率的某一激光功率下的受体自相关曲线，用最大熵算法反演获得受体的三线态权值分布函数
(9)利用步骤(4)、步骤(5)中获得的供体和受体各自的系间窜越、三线态衰减速率常数以及激发截面 在确定供体激发的激光功率下模拟计算不同能量转移速率常数kET所对应的受体三线态的弛豫特征时间值 并用数值作图法表现能量转移速率常数kET对受体三线态的弛豫特征时间值 的函数关系及其反函数的导函数关系
(10)由步骤(7)获得的能量转移速率常数kET对受体三线态的弛豫特征时间值 的函数关系以及导函数关系 通过概率分布函数的自由变量之间的转换，将步骤(8)获得的三线态权值分布函数 变换到能量转移速率分布函数 最后变换到
供受体距离分布fr(r)，此时得到的是供体受体浓度在1:1情况下的距离分布情况。
2.根据权利要求1所述的基于荧光相关谱的供体受体距离分布测量方法，其特征在于：所述步骤(2)中对所述单个细胞进行荧光相关谱测量具体采用如下测量方法：测量时需要进行如下三组测量方案同时进行：方案一、在单独表达供体的单个细胞采用供体激发波长在不同功率下的激光激发供体，在供体通道进行荧光光子数计数而获得单独供体的自Dd
相关曲线G (τ)；方案二、在单独表达受体的单个细胞采用跟激发供体同样系列的激光功Aa
率激发受体，在受体通道进行荧光光子数计数而获得单独受体的自相关曲线G (τ)；方案三、在共同表达供体和受体的单个细胞采用跟同样系列的激光功率激发供体，在供体通道Db
获得供体受体同时存在的供体自相关曲线G (τ)以及在受体通道获得供体受体同时存在Ab
的受体自相关曲线G (τ)，这里τ是指相关时间，上标的大写字母D表示供体通道的供体荧光信号，上标的大写字母A表示受体通道的受体荧光信号，上标的小写字母d表示供体单独存在的样品，上标的小写字母a表示受体单独存在的样品，上标的小写字母b表示供体和受体同时存在的样品。
3.根据权利要求1所述的基于荧光相关谱的供体受体距离分布测量方法，其特征在于：所述步骤(4)中采用如下两个公式进行联合的列文伯格-马夸尔特非线性最小二乘法拟合：
4.根据权利要求1所述的基于荧光相关谱的供体受体距离分布测量方法，其特征在于：所述步骤(6)中，对步骤(4)中出现的两条公式中针对受体的kexc参数做如下修正：
式中上标D表示供体、A表示受体， 表示供体的第一激发态分布随。
5.根据权利要求1所述的基于荧光相关谱的供体受体距离分布测量方法，其特征在于：所述步骤(10)中，能量转移速率分布函数 的计算公式如下：
由能量转移速率分布函数 变换到供受体距离分布fr(r)的过程如下：
能量转移速率常数kET到供体受体距离之间有确定函数关系，由福斯特公式给出：
2
其中，QD为没有受体存在时的供体量子产率；k 为空间取向因子；n是溶液的折射率；NA为阿伏加德罗常数；r为供体受体间距离；τD为没有受体存在时的供体荧光寿命；
光谱重叠积分项定义为：
其中，fD(λ)为供体光谱；FD(λ)为供体光谱各点对整条供体光谱积分的修正；
εA(λ)为受体的消光系数，
由光谱重叠积分项可定义能量转移福斯特临界距离R0，R0的六次方计算公式如下：
能量转移速率常数kET对供体受体间距离r的函数关系表示为：
最后求取供受体距离分布fr(r)，fr(r)的计算公式如下：
此时得到的是供体受体浓度在1:1情况下的距离分布情况。
6.根据权利要求1至5任一项所述的基于荧光相关谱的供体受体距离分布测量方法，该方法还包括如下步骤：
Db
(11)从供体和受体同时存在的供体自相关曲线G (τ)和供体和受体同时存在的受体Ab D
自相关曲线G (τ)的扩散部分分别求出探测体积内的发光供体分子数N 和受体分子数A
N，并利用步骤(7)计算获得的能量转移效率E以及激光共聚焦扫描显微镜系统的探测体积Veff，计算供体分子浓度：
和计算受体分子浓度：
然后计算浓度比例系数因子：
，代入光谱重叠积分项来计算修正后
的能量转移福斯特临界距离R0，光谱重叠积分项的表达式如下：
其中，F′D(λ)为供体光谱各点对整条供体光谱积分CD/CA的修正，获得修正后的能量转移福斯特临界距离R′0，然后采用与上述步骤(10)、步骤(11)相同的步骤来计算供体受体浓度非1:1情况下的距离分布f′r(r)，f′r(r)的计算公式与步骤(11)中fr(r)的计算公式相同，在此情况下计算得到的是供体受体浓度非1:1的距离分布。
一种基于荧光相关谱的供体受体距离分布测量方法
技术领域
背景技术
发明内容
体同时存在的供体自相关曲线G (τ)以及供体受体同时存在的受体自相关曲线G (τ)；
线G (τ)；方案三、在共同表达供体和受体的单个细胞采用跟同样系列的激光功率激发供Db
体，在供体通道获得供体受体同时存在的供体自相关曲线G (τ)以及在受体通道获得供Ab
体受体同时存在的受体自相关曲线G (τ)，这里τ是指相关时间，上标的大写字母D表示供体通道的供体荧光信号，上标的大写字母A表示受体通道的受体荧光信号，上标的小写字母d表示供体单独存在的样品，上标的小写字母a表示受体单独存在的样品，上标的小写字母b表示供体和受体同时存在的样品。
数N，并利用步骤(7)计算获得的能量转移效率E以及激光共聚焦扫描显微镜系统的探测体积Veff，计算供体分子浓度：
具体实施方式
＝1/krad 和受体荧光寿命τflt ＝1/krad，可得到荧光共振能量转移速率常数kTran。这时可利用下式来计算能量转移效率：
边纵坐标是受体三线态相对比重 右边纵坐标是受体三线态特征时间τtri。图中圆圈数据表示受体三线态相对比重对激光功率对数值的函数关系；三角数据表示受体三线态特征时间对激光功率对数值的函数关系。
以及荧光共振能量转移速率常数kET＝126.8μs 。
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