一种脉冲时延估计的荧光寿命表征方法
阅读：367发布：2020-05-16
专利汇可以提供一种脉冲时延估计的荧光寿命表征方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且一种脉冲时延估计的 荧光 寿命表征方法，包括如下步骤：步骤一）：测量流式细胞仪中经激光照射细胞后得到时域连续的前向色散光脉冲 信号 和荧光脉冲信号；步骤二）：对时域连续脉冲信号采用改进的线性调频Z变换计算细化 频谱 ，沿螺旋曲线做等 角 度取样计算有限时宽Z变换，将时域信号变换到频域得到离散频域信号；步骤三）：将得到的频域相乘并补零，再利用相关峰内插 算法 提高互相关峰的 分辨率 ，使得峰点间隔达到极小，得到时域互相关函数；步骤四）：由时域互相关函数计算两信号时延，即可用于表征 荧光寿命 。，下面是一种脉冲时延估计的荧光寿命表征方法专利的具体信息内容。
一种脉冲时延估计的荧光寿命表征方法
技术领域
背景技术
[0002] 流式细胞仪对多色荧光信号进行检测是通过特定波长的激光去照射，激发出荧光强度信号，包括前向散射光、侧向散射光和各种荧光信号，并对其进行高速定量的分析，在生物化学、医学、工业检测和化学研究中都得到了越来越广泛的应用。荧光寿命作为荧光信号的本征参量，不易受外界因素的干扰，具有更好的稳定性和测量精度，其精确测量对于荧光检测和分析技术具有非常重要的意义。
[0003] 传统的荧光寿命测量方法主要有三大类：相调制法，使用连续光来激发样品来测定荧光寿命，激发光事先经过调制，所以样品发出的荧光也是调制光，依据调制强度和相位的变化就可以解析荧光寿命；时间单光子计数法，可以测到荧光寿命是10ps级的，方法是在一定波长下积累在“时间窗”范围内的荧光发射强度，然后逐点推进波长直到对目标波长扫描完毕，最后得到时间分辨发射光谱图；闪频技术法：即取样法。但这些方法大都需要结构复杂、造价昂贵的仪器，大大增加测量荧光寿命的成本及复杂程度。近年来，Cao等人提出在不改变流式细胞分析系统结构的情况下，采用高速ADC芯片对荧光信号进行采样并利用算法对荧光时延进行计算，这是一种利用数字信号处理方法对荧光信号时延进行分析的方法，但是，ADC的采样频率并不能无限增大，因而该方法计算结果的时域分辨能力受限。
发明内容
[0004] 本发明针对流式细胞仪提出来了一种脉冲时延估计的荧光寿命表征方法，在流式细胞仪中，当被荧光染料染色的单细胞通过流动室经整形后的激发光斑时，产生的前向散射光信号及荧光信号具有类高斯特性，荧光强度为单指数衰减，则荧光信号可表示为前向散射光信号与单指数衰减函数的卷积，对其进行频域变换，可得到两信号频域相移为e-jωτ，时域信号脉冲峰之间的时延即为荧光寿命。
[0006] 一种脉冲时延估计的荧光寿命表征方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一）：测量流式细胞仪中经激光照射细胞后得到时域连续的前向色散光脉冲信号和荧光脉冲信号；
步骤二）：对时域连续脉冲信号采用改进的线性调频Z变换计算细化频谱，沿螺旋曲线做等角度取样计算有限时宽Z变换，将时域信号变换到频域得到离散频域信号；
步骤三）：将得到的频域相乘并补零，再利用相关峰内插算法提高互相关峰的分辨率，使得峰点间隔达到极小，得到时域互相关函数；
步骤四）：由时域互相关函数计算两信号时延，即可用于表征荧光寿命。
步骤二）：对时域连续脉冲信号采用改进的线性调频Z变换计算细化频谱，沿螺旋曲线做等角度取样计算有限时宽Z变换，将时域信号变换到频域得到离散频域信号；
步骤三）：将得到的频域相乘并补零，再利用相关峰内插算法提高互相关峰的分辨率，使得峰点间隔达到极小，得到时域互相关函数；
步骤四）：由时域互相关函数计算两信号时延，即可用于表征荧光寿命。
[0007] 本发明提出的采用脉冲时延估计来表征荧光寿命，可以在不增加计算量的情况下较明显的提高频谱计算精度，计算细化频谱可以使相关波形更加光滑，精确计算相关函数的峰值，并且其分辨率不受采样长度的限制，抗非平稳性能力强，测量荧光寿命的相对误差有明显提高。附图说明
[0008] 图1：本发明方法流程图；图2：流式脉冲信号激发原理图；
图3：高斯曲线拟合前向散射光和荧光信号；
图4：两类荧光信号频域变换得到的频谱图；
图5：IFFT和FICP计算相关函数图；
图6：相关函数局部放大图；
图7：试剂1的荧光寿命统计分析结果；
图8：试剂2的荧光寿命统计分析结果。
图3：高斯曲线拟合前向散射光和荧光信号；
图4：两类荧光信号频域变换得到的频谱图；
图5：IFFT和FICP计算相关函数图；
图6：相关函数局部放大图；
图7：试剂1的荧光寿命统计分析结果；
图8：试剂2的荧光寿命统计分析结果。
[0009]
具体实施方式
[0010] 本发明提出了一种基于脉冲时延估计算法来表征荧光寿命的方法。如图1和图2所示，在流式细胞仪中，当被荧光染料染色的单细胞通过流动室经整形后的激发光斑时，产生的前向散射光信号及荧光信号具有类高斯特性，荧光强度为单指数衰减，则荧光信号可表示为前向散射光信号与单指数衰减函数的卷积，对其进行频域变换，可得到两信号频域相移为e-jωτ，时域信号脉冲峰之间的时延即为荧光寿命。为求得时延，本发明首先利用改进的线性调频Z变换(MCZT)算法计算细化频谱，沿螺旋曲线做等角度取样计算有限时宽Z变换，将时域信号变换到频域，并实现互相关谱的高分辨分析，对于任意长度的采样数据序列，MCZT变换可以通过补零点的方法转换成N1长的序列后直接进行处理，可以得到更有效的频谱信息，具有更高的频谱分辨率，从而避免频谱信息的丢失。其次，利用相关峰内插(FICP)算法，通过增加频谱的内插倍数提高互相关峰的分辨率，使得峰点间隔达到极小，时延估计的计算精度较高，提高时域互相关函数的解析精度。
[0011] 本发明方法中，利用脉冲时延估计表征荧光寿命主要步骤如下：第1步：测量得到时域连续荧光脉冲信号；
第2步：对时域脉冲信号进行MCZT变换，得到离散频域信号；
第3步：频域相乘并补零，进行FICP变换，得到时域互相关函数；
第4步：由时域互相关函数计算两信号时延。
第2步：对时域脉冲信号进行MCZT变换，得到离散频域信号；
第3步：频域相乘并补零，进行FICP变换，得到时域互相关函数；
第4步：由时域互相关函数计算两信号时延。
[0012] 本发明对哺乳动物细胞进行荧光染色，使用的荧光标记的抗体是CD3-FITC和CD 4-pc5，其荧光激发光源波长在400-500nm，发射光波长在525-670nm，细胞被荧光染料标记后获取前向散射光脉冲信号和荧光信号，分别对单个细胞激发出的信号进行MCZT频域变换和FICP时延估计。实验使用GalliosTM Flow Cytometer实验设备外接示波器进行测量，采样点为5000个，采样间隔为2ns，得到10组数据，使用MATLAB对采样点进行仿真并用高斯曲线拟合。本发明检测的效果可见于图4-图6，可见本发明使用的转化方法优于FFT-IFFT变换。
[0013] 利用发明的方法测定了两种试剂（图7和图8），采用脉冲时延估计来表征荧光寿命，可以在不增加计算量的情况下较明显的提高频谱计算精度，计算细化频谱可以使相关波形更加光滑，精确计算相关函数的峰值，并且其分辨率不受采样长度的限制，抗非平稳性能力强，测量荧光寿命的相对误差有明显提高。
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