本发明涉及对包含闭合膜结构的样品的表面膜成分进行差示分析 的方法。更特别地该方法涉及利用具有细胞渗透性特征的荧光染料来 在体内靶向和标记完整细胞群体，来标记和检测那些在细胞膜中或在 细胞膜上出现或表达的成分。

细胞膜具有重要的功能，这些功能对于细胞的生命是极其重要 的。所有的生物膜的特征在于具有共同的常规结构，由主要通过非共 价相互作用结合在一起的脂质和蛋白质分子组成。当膜脂质形成透性 屏障从而界定细胞边界时，膜蛋白介导着特殊的细胞过程，例如生物 学信号传送、小分子的转运和细胞粘附。因此，能够在各种细胞类型 和状态之间鉴别和区分膜成分、特别是蛋白质和它们的衍生物，对于 了解疾病状态是很重要的。

在2-D电泳分离之前，2-维(2D)差示凝胶电泳(DIGE)使用 匹配的、光谱分辩的荧光染料来标记细胞的蛋白质成分(Minden，J. 等，Electrophoresis，(1997)，18，2071)。WO 96/33406(Minden， J.和Waggoner，A.S.)描述了一种方法，根据这种方法溶解各种细胞 样品并提取总细胞蛋白质。然后用染料标记各种蛋白质样品，所述染 料按分子质量和电荷进行匹配以在2-DE中得到相等的迁移。该方法 使用具有N-羟基琥珀酰亚胺基(NHS)酯活性基团的花青染料来标记 胺。对蛋白质样品的荧光预标记允许多个样品在同一个凝胶上移动， 使得可以通过重叠荧光图像来容易地鉴别样品间的数量差别。然而， 这个方法不能从其他细胞蛋白质中区分出在细胞膜中出现的蛋白质成 分。

已经通过使用生物素标记试剂、增强的化学发光和通过使用荧光 标记试剂实现了对完整细胞的标记以靶向和表征细胞表面蛋白。例 如，Meier，T.等(Anal.Biochem.，(1992)，204，220-226)描 述了一种标记和检测免疫沉淀的细胞表面分子的过程，该过程使标记 了整个细胞的生物素琥珀酰亚胺酯与增强的化学发光物结合，在与链 霉抗生物素蛋白-HRP复合物结合之后，来检测硝化纤维转移的生物素 化抗原。然而这种生物素标记方法需要对凝胶进行印迹以将蛋白质转 移到固相的膜支持物上。通常利用链霉抗生物素蛋白-酶和底物共轭 产生可检测产物进行生物素化蛋白质的检测。不能对生物素化的样品 进行倍增以用于直接的比较研究，这降低了获得精确的定量信息的能 力。

C.等(J.Bacteriol.，(1998)，180(3)，605)描述 了使用荧光素马来酰亚胺来标记E.coli中细胞表面蛋白上的暴露半 胱氨酸残基，和通过流式细胞计和SDS-PAGE分析来研究FhuA膜蛋白 在结合铁色素时的构象变化。

WO 02/099077(Proteologics Inc.)公开了差示显示膜表面蛋 白质的方法，其中被分析的两个或多个样品各自用选定的记号部分进 行标记，从而成为可区分的。在标记之后，可以混合来自每个样品的 蛋白质，一同进行进一步的分析，例如，通过二维电泳分析。

本发明提供了荧光试剂，并描述了一种方法，用于可再生性地标 记膜成分例如那些在细胞表面表达的膜成分，随后分析该标记的成分 来检测不同细胞类型和状态之间的差别。此外，当前的方法利用了一 种内标物来使跨凝胶的蛋白质模式相匹配，从而避免凝胶-对-凝胶 的变异。根据本发明的方法可用于，例如，检测低丰度的膜蛋白、检 测在细胞膜中表达的受体中的变化，例如，在配体结合或响应刺激时 的变化。利用对细胞表面蛋白的荧光标记容许直接在凝胶中检测标记 的蛋白质，并且利用迁移匹配的染料容许倍增以用于差示分析。利用 具有各种膜渗透性特征的染料容许靶向细胞的各种蛋白质子集，例 如，膜蛋白和细胞质蛋白。

因此，在本发明的第一个方面中，提供了一种检测来自至少两个 包含闭合膜结构的样品的表面膜成分之间的差别的方法，所述方法包 括：

i)用选自染料配组的染料接触每个样品的独立等分试样，其中在 所述配组中的每种染料能够选择性地标记所述膜成分，并且其中每种 染料能够发出冷光，所述冷光具有可区别性地不同于所述配组中其余 染料所发出的冷光的性质；

ii)从每个独立等分试样中制备染料标记的成分的提取物；

iii)分离不同的染料标记的成分；和

iv)检测所述样品中不同染料标记的成分之间发光性质的差别；

其特征是所述分离步骤iii)在存在内标物的情况下进行，所述内 标物包含膜成分提取物，所述膜成分来自所述至少两个样品的等分试 样的集中混合物，并且其中使包含膜结构的所述样品的集中混合物与 选自所述染料配组的不同染料接触。

适当地，染料配组的每种染料相互间根据其电荷和分子量特征来 匹配，从而用任何一个所述染料标记的成分的相对迁移，基本上与用 该染料配组中任何其他染料标记的所述成分的相对迁移相同。

根据本发明的方法，每个样品的独立等分试样可以与相同的染料 接触，或与选自染料组的不同染料接触。因而，当与来自任何其他样 品的染料标记的成分的发光性质相比较时，来自一种样品的染料标记 的成分可以具有或不具有同样的发光性质。

因而，在根据该方法的步骤i)的第一个实施方式中，用选自染料 配组的不同染料接触每个所述样品的独立等分试样，以标记每个样品 中的表面膜成分。附图1的流程图说明了根据第一个实施方式，对两 个不同样品进行样品制备(1a，1b)，和分离和分析的方法(1c)。 在该方法的一个变体中，如附图1a所示，进行溶解步骤以从每个样品、 和从集中的混合物获得染料标记的成分的提取物。作为替代，如附图 1b所示，在溶解样品混合物之前，将每个染料标记的样品与标记的集 中样品混合，从而获得染料标记的提取物的混合物，之后分离和分析 标记的成分(附图1c)。根据附图1b的替代性程序有以下好处，即在 相同凝胶上分析的样品都将经历同样的溶解条件，可以避免可能在样 品制备过程中引入的可能的伪差。在这个实施方式中，该方法在步骤 iii)之前包含一个步骤，即，在分离各成分之前，使来自所有样品的 染料标记的成分的提取物的一部分相互混合，并与来自所述集中混合 物的染料标记的成分的提取物的一部分混合。

在第二个和优选的实施方式中，使所述样品的每个独立等分试样 与选自配组的相同染料接触。根据第二实施方式的方法通过附图2 (2a，2b和2c)的流程图关于两个不同样品来说明。在这个实施方式 中，可以进行溶解步骤(如附图2a所示)来从每个样品和从集中混合 物获得染料标记的成分的提取物，然后将如此获得的染料标记的提取 物与标记的集中提取物混合。做为选择，(如附图2b所示)，可以在 溶解步骤前进行染料标记的样品与集中混合物的混合。在这个实施方 式中，该方法在步骤iii)之前包含一个步骤，即，在分离各成分之前， 提供与来自每个独立样品的染料标记的成分的提取物的一部分混合了 的来自所述集中提取物的染料标记的成分的提取物的一部分。

适当地，内标物包含来自集中混合物的成分的提取物，所述集中 混合物包含近似相等的每个所述膜结构样品的等分试样。使集中混合 物与选自染料配组的不同染料接触，亦即，该染料拥有的发光性质不 同于被选用于标记每个独立样品的染料(或多个染料)。被选用于标 记集中混合物的染料应具有与配组中其余所有染料相同的迁移率和电 荷特征，并且该染料应能选择性地标记膜成分。然而，来自集中提取 物的染料标记的成分拥有的发光性质将不同于来自每个独立样品提取 物的染料标记的成分的发光性质。

因而，本发明涉及匹配的荧光染料，和涉及标记和检测来自不同 样品的膜结构的表面膜成分之间的差别的方法。适当地，膜可以是整 个细胞的成分。做为选择，膜可以形成内部细胞结构的一部分，例如 细胞器、线粒体和细胞核。特别地，本发明涉及对蛋白质成分，例如 膜蛋白或其片段的差示分析方法。做为选择，该方法可被用于分析细 胞样品之间碳水化合物成分的差别。

根据本发明，使用具有特殊细胞渗透性特征的反应性荧光染料来 靶向和标记在细胞膜的不同部分中表达的蛋白质，以用来进行蛋白质 表达和蛋白质成分的差示分析。在此定义的蛋白质包括翻译后修饰的 蛋白质和蛋白质片段，例如，肽。翻译后修饰的蛋白质的实例包括磷 酸化蛋白质(磷蛋白)和糖蛋白。该方法允许在不同的目标样品(例 如，对照组织与患病组织；对照组织或细胞与药物处理过的组织或细 胞)中比较完整细胞群体或生物组织的膜蛋白。

在优选的实施方式中，配对使用染料来标记膜蛋白。参考根据本 发明方法的附图2a和2b的流程图，将每个细胞或组织样品的独立等 分试样与选自染料配对的第一个染料一同反应。在配对中的每个染料 能够选择性地标记膜蛋白成分，并且每个染料都具有一些特征，从而 使得用染料配对中的任一个染料标记的蛋白质在分离介质中的相对迁 移，与用另一个染料标记的该成分在分离介质中的相对迁移相同。此 外，每个染料发出的光具有的性质可区别性地不同于另一个染料发出 的光的性质。

在差示蛋白质分析中对样品的倍增已经极大地改善了对不同样品 间蛋白水平的检测。然而，由于实验因素例如在样品进入凝胶条时的 蛋白质损失或凝胶-对-凝胶的差异产生的斑点强度方面的差异，可 能是实验设计中的主要误差来源。因而，为了避免由判读凝胶产生的 错误生物学结论，适当地，在每个凝胶中包括标准样品(内标物)， 与每次分离一同移动。早先已经描述了利用DIGE方法使用内标物来量 化总蛋白差别，参见Alban，A.等，Proteomics，(2003)，3，36 -44。样品中的每个蛋白质斑点可以与其在内标物中的样本相比较， 以产生相对表达的比例。基于样品与其凝胶中的内标物的相对变化， 进行凝胶间的样品定量比较。这个方法有效地去除了系统(凝胶-对 -凝胶)差异，允许对样品之间被诱发的生物学改变进行精确的定量。 也克服了进行凝胶重复实验的需要，从而减少了每次实验所需的凝胶 数量。使用在凝胶之间相匹配的内标物也更为直现。由于在实验中的 所有凝胶之间内标物的图像是共同的，可以在内标物图像之间进行匹 配。常规的2-D电泳需要在不同凝胶上的不同样品间进行匹配，由于 样品-对-样品和凝胶-对-凝胶的差异，这在斑点模式中引入了差 别。内标物间的匹配允许相同样品间的匹配；因而斑点模式的差别仅 由电泳差别产生。

在根据本发明的优选实施方式中，参考附图2a和2b，用染料配对 中的第二染料标记所有细胞样品的集中物。来自待研究的所有样品的 每一个表面膜成分都将被表现在内标物中，样品中的每个成分都可与 内标物中的自身相比较，从而允许对细胞样品之间细胞表面成分方面 的差别进行精确的定量。使用两种染料确保了在样品间不会引入标记 伪差，因为每个独立样品是用相同的染料标记，并且内标物总是用第 二染料来标记。根据优选的方法使用两种染料，因而提供了染料设计 特征的更简单的匹配，以确保标记的成分的相等的迁移。

本发明提供了适合于在根据本发明的优选方法中使用的试剂。优 选的，使用一对荧光染料，染料根据它们的电荷和分子量特征进行相 互匹配。因而，染料优选有近似相等的分子量，但这不是必须的。此 外，根据电荷对染料进行匹配，以使得在一维或二维上电泳分离之后 标记不同的蛋白质迁移到相同位置。维持蛋白质的天然电荷的染料是 特别优选的，因为用这种染料标记的蛋白不产生p1变化。当赖氨酸是 蛋白质的目标基团时，染料应具有+1的净电荷；对于靶向蛋白质中半 胱氨酸残基的染料，净电荷应当是不带电的。

适当地，根据本发明的方法使用的染料被设计为具有渗透性特征 以靶向细胞的特殊区域，例如外部暴露的蛋白质。示范性的特定标记 试剂基本上是膜不渗透性的，因而能选择性地标记表面膜成分，优选 的，能选择性地标记具有在细胞表面表达的暴露区域的目标膜蛋白。 这种试剂通过是膜不渗透性的而对表面蛋白是选择性的，从而避免标 记内部蛋白质。适合于标记细胞表面蛋白用于随后的检测和分析的试 剂是那些理想地拥有以下性质的试剂：

a)该试剂不能透过细胞膜。因而，通常，染料应具有总电荷，其 增强染料的亲水性并阻止染料分子穿过细胞膜的疏水脂质核心。因 而，该染料可含有共价连接到染料发色团的一个或多个取代基，赋予 染料素水特性。适合的取代基包括磺酸盐、磺酸和季铵，其可以直接 连接到染料结构上，或做为选择，通过连接基团例如C1到C6烷基链连 接。直接连接到染料结构的一个或多个磺酸盐或磺酸基团是特别优选 的。

b)该试剂应在生理条件下起反应以维持表面蛋白的天然状态。优 选的，配组中的每种染料能选择性地与膜成分反应从而通过共价连接 标记膜成分。在优选的实施方式中，染料应与具有互补性目标官能团 的蛋白质特异性地反应，从而与蛋白质形成稳定键。当下游分析需要 利用变性条件时(例如在电泳中)这是很重要的。

c)配组中的每个染料应当是通过检测手段很容易检测和分辨的。 因而，适当地，每个染料发出的光具有的性质可区别性地不同于该组 中其余染料发出的光的性质。优选的，依据其荧光波长和/或其荧光寿 命，每个染料是彼此可区分的。因而，发光性质可以是染料的发射波 长，每个染料的特征是其不同于配组中任何其他染料的发光波长。做 为选择，染料的发光性质可以是他们的发光寿命，在组中的每个染料 以不同的发光寿命为特征。

具有适合的用于本发明的特征约染料可以选自公知的荧光染料种 类，包括荧光素、罗丹明、花青染料、吖啶酮染料和喹吖啶酮染料。

用于本发明的优选的染料种类是花青染料。花青染料表现出强烈 的光谱吸收带特征，其吸收可以通过合成设计在很大的光谱范围内调 整。特别优选的染料选自具有结构(1)的花青染料。

其中：

n是1到3的整数；

X和Y是相同的或不同的，选自：＞C(CH3)2、O和S；

基团R1和R2之一是基团-E-F，其中E是具有选自线性或分支的 C1-20烷基链的、1-20个连结原子的链的间隔基团，其可任选地含有一 个或多个醚键、一个或多个酰胺键、和一个或多个不饱和基因，F是能 与待标记的成分上的互补性基团反应的目标键合基团；

余下的基团R1或R2选自：C1-C6烷基、或基团-(CH2)m-W，其 中W选自：

其中R′、R″和R″′选自C1-C4烷基，m是1到10的整数；

R3和R4的至少一个是磺酸盐或磺酸基团；

和当所述R3和R4基团之一不是磺酸盐或磺酸基团时，所述余下的 R3或R4是氢。

优选的，根据式(1)的花青染料是染料的配对，其中每个染料的 n不同并且是1或2；X和Y都是＞C(CH3)2。

用于本发明的可选择的染料可以选自具有结构(2)的吖啶酮染 料：

其中：

基团R1、R2和R3之一是基团-E-F，其中E是选自线性或分支的 C1-20烷基链的、具有1-20个连结原子的间隔基团，其可任选地含有 一个或多个醚键、一个或多个酰胺键、和一个或多个不饱和基因，F是 能与待标记的成分上的互补性基团反应的目标键合基团；

当R2或R3不是所述基团-E-F时，它们独立地选自氢、卤素、酰 胺、羟基、氨基、单-或双-C1-C4烷基取代的氨基、巯基、羧基、C1 -C6烷氧基、C1-C6烷基、磺酸盐、磺酸、季铵和基团-(CH2-)n-Z； 和

当基团R1不是所述基团-E-F时，其选自氢、C1-C6烷基、基团 -(CH2)k-Z，其中Z选自磺酸盐、磺酸、季铵和羧基；k是1到6 的整数。

适当地，在式(1)或(2)化合物中的目标键合基团F是反应或 官能基团。反应基团可以在适当的条件下与待标记的成分的官能基团 反应(如表1所示)；而官能基团可在适当的条件下与该成分的反应 基团反应，从而该成分被该化合物标记。

表1：可能的反应基团和可与之反应的官能基团

  反应基团   功能基团   琥珀酰亚胺基酯   异硫氰酸酯   卤代乙酰胺、马来酰亚胺   酰基卤   酸酐   酰肼   伯氨基、仲氨基   氨基基团   巯基、咪唑、羟基、胺   氨基基团   伯氨基、仲氨基、羟基   醛、酮

优选的，目标键合基团F是与羟基、氨基、巯基和醛基反应的反 应基团。更优选的，反应基团选自琥珀酰亚胺基酯、磺基-琥珀酰亚 胺基酯、异硫氰酸酯、马来酰亚胺、卤代乙酰胺和酰肼。

适当地，在式(1)和(2)的化合物中，间隔基团E具有1到20 个连结原子，优选的，6到15个原子。

优选的，E是-{(CHRa)p-Q-(CHRa)r)s-，其中Q选自：- CHRa-、-NRa-、-O-、-(CH＝CH)-、和-CO-NH-；Ra是氢或 C1-C4烷基，p是0-5，r是1-5，s是1或2。特别优选的Q是选自： -CHRa-、-O-和-CO-NH-，其中Ra如上述定义。

用于标记细胞表面蛋白上的赖氨酸残基的优选的花青染料对是 CyTM3和Cy5的单磺化的NHS酯，化合物I和II。

化合物I

化合物II

赖氨酸作为目标蛋白官能基团时，用花青染料标记导致正电荷的 损失。因此，优选的通过利用带正电荷的染料来补偿带电赖氨酸残基 的这种电荷损失，以维持蛋白质的天然p1。以这种方法，染料标记的 蛋白质的迁移位置与未标记的蛋白质相比没有改变。可以利用连接到 染料的带正电荷的连接基团来实现附加的正电荷，例如通过共价连接 吲哚氮原子的方法。

带正电荷的花青染料的适合的实例是具有季铵连接基团的单磺化 花青染料NHS酯，化合物III和IV。

化合物III

化合物IV

进一步的实例是具有吡啶鎓连接基团的单磺化花青染料NHS酯， 化合物V和VI。

化合物V

化合物VI

用于标记细胞表面蛋白的半胱氨酸残基的适合的花青染料对是 Cy3和Cy5的单磺化马来酰亚胺基衍生物，化合物VII和VIII。

化合物VII

化合物VIII

做为选择，可以使用能靶向蛋白质子集的染料，蛋白质子集例如 翻译后修饰的蛋白质，例如糖蛋白。通过首先将未端糖的邻位 (vicinial)羟基氧化为醛基，然后与带有酰肼反应基团的染料反应， 有可能标记糖蛋白的未端碳水化合物基团(参见Wilchek，M.和 Bayer，E.A.，Methods in Enzymology，Volume 138，429-442(1987)。 用于标记细胞表面糖蛋白的碳水化合物基团的适合的花青染料对是 Cy3和Cy5的单磺化酰肼衍生物，化合物IX和X。对标记碳水化合物 基团有用的可选择反应基团是氨基脲或氨基衍生物。为了维持糖蛋白 的总电荷，适合的染料应带有总的中性电荷。可通过利用适当带电的 连接基团，例如如上述定义的基团W，来获得总的净中性电荷。

化合物IX

化合物X

更特别地，该方法包括：在用选自染料配对的荧光染料，例如化 合物IX和X，标记细胞表面之前，首先用氧化试剂，例如偏高碘酸钠， 短时间处理完整细胞，以将邻位的二醇氧化为醛基。做为选择，可以 通过用半乳糖氧化酶处理细胞样品以在末端半乳糖上产生醛基，然后 与适合的荧光染料进行反应，来标记细胞表面糖蛋白。

根据本发明的方法可被用于各种细胞类型，包括所有正常的和转 化的细胞，其源自关于物种(例如，人、啮齿动物、猿)、组织来源 (例如，脑、肝、肺、心脏、肾脏、皮肤、肌肉)和细胞类型(例如， 上皮、内皮)的任何已识别的来源。本发明还可被用于比较来自植物， 例如，利用培养的植物细胞，的样品中的细胞表面成分。培养各种细 胞类型的已建立的方案是可获得的。(参见，例如，Freshney，R.I.， Culture of Animal Cells：A  Manual of Basic Technique，2nd Edition，Alan R.Liss Inc.1987)。另外，用于本发明的方法的样 品可以源自被重组基因转染然后培养的细胞，或那些已经受到外界刺 激(例如热休克或药物处理)的细胞。

如果希望靶向细胞器(例如，核、线粒体)中的膜蛋白，可以在 该方法中，在标记膜结构之前引入预分级步骤。在这种情况中，可以 通过任何公知的方法来富集膜结构。例如，差速离心、密度梯度离心 (例如，利用蔗糖梯度)、连续流动电泳或水性两相分配法。

用荧光染料标记表面膜成分的方法是公知的，一般包括用选定的 荧光标记试剂与膜接触充分的培养时间，以允许试剂的结合以及形成 染料和表面膜成分间的稳定连接。

可以利用各种公知的方法和提取试剂从完整的膜中分离染料标记 的膜成分来形成提取物。一般地，例如通过匀浆、超声处理、细胞溶 解作用来瓦解来自组织/培养物的细胞，并在存在试剂的情况下提取和 溶解蛋白质，所述试剂包括变性剂，例如尿素、硫脲，洗涤剂，例如 SDS、CHAPS、Triton X-100、NP-40，还原剂，例如二硫苏糖醇(DTT)、 巯基乙醇，和缓冲液，例如Tris、HEPES。在选择用于提取的缓冲液 和pH时应考虑许多因素，包括所需缓冲能力的程度、温度和离子强度 对pH的影响、与金属离子的相互作用和与随后的纯化操作的兼容性。 一般地，可以在pH范围5-9进行提取。也可以添加蛋白酶抑制剂， 例如甲苯磺酰基氟(PMSF)、乙二胺四乙酸(EDTA)、亮肽素、抑肽 酶，来最小化内源蛋白酶导致的降解作用。为了增强检测的敏感性， 可以在分析前利用各种公知的方法，例如，通过利用与染料结合的固 相抗体，来在样品中物理地富集低丰度的染料标记的膜成分。

通过能使样品分解成分离的成分的分离方法对来自每个细胞样品 的染料标记的成分进行分离。适当地，来自所有样品的集中混合物的 染料标记的成分的提取物的一部分，作为内标物来分离。优选的，在 分离前，向标记的膜成分的每个独立提取物的一部分中添加来自集中 混合物的染料标记的提取物的一部分。分离细胞成分，例如碳水化合 物、蛋白质和它们的衍生物的技术是公知的。分离步骤一般基于标记 的成分的物理性质(例如电荷和分子量)，可以通过电泳方法或色谱 方法进行。例如，可以通过一维电泳、二维电泳、毛细管区带电泳、 毛细管凝胶电泳或等电聚焦来分离肽和蛋白质。如果使用色谱法，可 以通过亲和色谱、尺寸排阻色谱、反相色谱、疏水作用色谱或离子交 换色谱来进行。优选的分离标记的成分、特别是标记的细胞表面蛋白 的分析方法是2-D凝胶电泳。

通过光学装置、适当地通过成像仪器，例如CCD照相机、荧光扫 描仪或共焦图像仪来检测和/或定量分离的蛋白质。通过分析不同的标 记成分发出的荧光信号，可以确定样品中存在的蛋白质之间的差别。 比较来自不同样品的蛋白质之间的相对荧光信号，可以用来量化蛋白 质丰度方面的变化，所述变化是诱导的生物学变化产生的结果，例如 疾病或药物治疗的结果。一般利用特意为2-DE分析而设计的软件来 进行凝胶图像的分析。例如，DeCyderTM(Amersham Biosciences) 是一种用于斑点检测、本底扣除、取准、量化、位置匹配和倍增图像 的差异蛋白质表达分析的完全自动化的图像分析软件。这允许共同检 测同一凝胶内不同的标记样品和横跨一个实验中所有凝胶的内标物样 品的凝胶间匹配。与内标物相比从而容许确定样品间的蛋白质丰度比 和容许进行统计学测试来确定数据的显著性。

通常通过在分离步骤之后分离目标蛋白质，用胰蛋白酶降解蛋白 质并通过MALDI-MS进行肽质量指纹分析，来获得样品中蛋白质的身 份。利用MS/MS肽测序也可以来确定单个蛋白质成分的身份。为了清 楚地鉴别标记的蛋白质(和因而细胞表面成分)，可以在分离和/或MS 分析之前利用各种公知的方法，例如，利用与染料结合的固相抗体， 来从未标记的成分富集或纯化染料标记的成分。

本发明也可被用于靶向存在于细胞表面或在细胞表面表达的受 体，例如那些参与细胞信号发送(例如，激素和生长因子受体，G蛋白 偶联受体)、转运蛋白质(例如，糖转运)、离子通道(例如，Na-K ATPase、H-ATPase)、换能器(例如，ATP合成酶)、酶、抗原受体、 配体结合(例如，胰岛素受体)的受体和那些与细胞外蛋白质如细胞 骨架连接的受体(例如，整合素)。该方法可被用于直接比较不同的 处理例如不同的细胞刺激的影响，或不同的环境效应对膜成分、丰度 改变、细胞位置或蛋白质构象(例如，通过比较游离硫醇或其他官能 团)和蛋白质的翻译后修饰(特别是糖基化)的影响。

本发明还提供染料配对，其中每种染料能选择性地标记细胞表面 成分。此外，每种染料发出的光的性质可区别性地不同于另一种染料 发出的光。因而在第二个方面，提供染料配对，其中每种所述染料选 自具有结构(1)的花青染料：

其中：

n是1到3的整数；

X和Y是相同的或不同的，选自：＞C(CH3)2、O和S；

基团R1和R2之一是基团-E-F，其中E是选自线性或分支的C1-20 烃基链的、具有1-20个连结原子的间隔基团，其可任选地含有一个 或多个醚键、一个或多个酰胺键、和一个或多个不饱和基因，F是能与 待标记的成分上的互补性基团反应的目标键合基团；

余下的基团R1或R2选自：C1-C6烷基、或基团-(CH2)m-W，其 中W选自：

其中R′、R″和R″′选自C1-C4烷基，m是1到10的整数；

R3和R4的至少一个是磺酸盐或磺酸基团；

和当所述R3和R4基团之一不是磺酸盐或磺酸基团时，所述余下的 R3或R4是氢。

优选的，每种所述染料根据其电荷和分子量特征相互匹配，从而 用所述染料之一标记的成分在分离介质中的相对迁移与用另一种染料 标记的该成分在所述分离介质中的相对迁移相同。

优选的，每种染料的n不相同并且是1或2，X和Y都是＞C(CH3) 2。

适当地，每种染料具有与羟基、氨基、巯基和醛基反应的目标键 合基团。优选的，目标键合基团是选自琥珀酰亚胺基酯、磺基琥珀酰 亚胺基酯、异硫氰酸酯、马来酰亚胺、卤代乙酰胺和酰肼的反应基团。

在一个实施方式中，基团R1和R2之一是如上述定义的基团-E- F，余下的基团R1或R2选自：C1-C6烷基。在另一个实施方式中，余下 的基团R1或R2是基团-(CH2)m-W，其中W选自：

其中R′、R″和R″′选自C1-C4烷基，m是1到10的整数；

本发明也可被用于靶向存在于细胞表面或在细胞表面表达的受 体，例如那些参与细胞信号发送(例如，激素和生长因子受体，G蛋白 偶联受体)、转运蛋白质(例如，糖转运)、离子通道(例如，Na-K ATPase、H-ATPase)、换能器(例如，ATP合成酶)、酶、抗原受 体、配体结合(例如，胰岛素受体)的受体和那些与细胞外蛋白质如 细胞骨架连接的受体(例如，整合素)。该方法可被用于直接比较不 同的处理例如不同的细胞刺激的影响，或不同的环境效应对膜成分、 丰度改变、细胞位置或蛋白质构象(例如，通过比较游离硫醇或其他 官能团)和蛋白质的翻译后修饰(特别是糖基化)的影响。

通过参考以下的实施例和附图进一步说明本发明，实施例和附图 在此仅用于说明性的目的，而不应被解释为限制本发明的范围，本发 明的范围由附随的权利要求来定义。

附图1(a、b和c)是说明利用三个标记染料的两个可选择的样品 制备过程(1a和1b)，以及根据本发明的方法的一个实施方式的分离 和分析方案(1c)的流程图。

附图2(a、b和c)是显示利用染料配对、根据本发明的方法的优 选实施方式的试验设计的相应流程图。

附图3是细胞培养渗透性分析的图像。这个图像显示了存活的 U937细胞(灰色细胞)对于PBS中(a)Cy3(化合物I)或(b)Cy5 (化合物II)的单磺化NHS酯是不渗透性的。用分开的活/死存活性色 斑来说明表现出高染料吸收的细胞(白色细胞)是群体中的非存活细 胞。

附图4显示了来自分离从U937细胞提取的蛋白质的2-D电泳凝 胶的图像：(a)在完整细胞上用Cy3单磺化NHS酯(化合物I)标记 细胞表面蛋白，(b)在细胞溶解和蛋白质提取之后用Cy5单磺化NHS 酯(化合物II)标记总细胞蛋白质。从每个图中，选出一个区域并放 大以突出细胞表面存在的蛋白质。

附图5显示了来自用(a)Cy3单磺化NHS酯(化合物I)或(b) Cy5单磺化NHS酯(化合物II)在完整U937细胞上标记的细胞表面蛋 白的2-D电泳凝胶的图像。提取蛋白质，混合，并在单个凝胶上分离， 共同检测两种染料。在每个图像的同样区域上的网线显示了用每个染 料标记的蛋白质的覆盖和共迁移。

实施例

实施例1染料的合成

i)一般实验步骤

在Jeol JNM-LA300 FT NMR光谱仪上记录1H NMR(δH)谱。化 学位移以δ(ppm)报告。将样品在适合的氘代溶剂例如d4-甲醇中制 备为溶液。利用Unicam UV3 UV/VIS光谱仪进行UV/VIS光谱。三甲 氧基丙稀购自Karl Industries Inc.，Ohio，USA。所有其他化学药 品购自Sigma-Aldrich Company Limited，Dorset，England。

ii)2，3，3-三甲基假吲哚-5-磺酸钾

将肼基苯磺酸(20.0g)溶解在乙酸(60ml)中，添加3-甲基- 2-丁酮(26.0g)，然后加热回流3小时。在冰箱中冷却并刮擦使期 望的化合物沉淀，用2-丙醇稀释灰白色稀浆并过滤(71％)。

将2，3，3-三甲基-5-磺酰基-假吲哚(16.45g)加热溶解在 甲醇(160ml)中，添加2-丙醇中的KOH饱和溶液(100ml)。溶液 变成黄色，形成固体。冷却溶液，滤出固体形成灰白色固体(15.9g， 98％)，δH(300MHz，CD3OD)7.84(m，2H)，7.46(d，1H)，3.30 (s，3H)和1.35(s，6H)。

iii)1，2，3，3-四甲基-5-磺酰基-吲哚碘盐

2，3，3-三甲基假吲哚-5-磺酸钾(1.0g，3.61mmol)和碘代 甲烷(0.25ml，3.97mmol)在氮保护气氛下与二氯苯(10ml)混合。 利用沙浴将溶液加热到100℃4小时。开始形成固体，但薄层色谱(30 ％MeOH/70％DCM)分析显示产物形成不完全，因此添加额外的等量碘 代甲烷，在冷却到室温之前额外加热反应2小时。通过过滤收集固体， 用二氯苯、二乙醚洗涤，然后真空干燥得到紫色固体(0.89g，98％)， δH(300MHz，CD3OD)8.06(m，1H)，7.94(dd，1H)，7.84(m， 1H)，4.02(s，3H)和1.61(s，6H)。

iv)1-乙基-2，3，3-三甲基-5-磺酰基-吲哚碘盐

2，3，3-三甲基假吲哚-5-磺酸钾(10.0g，41.97mmol)和碘 乙烷(4.0ml，50.35mmol)在氮保护气氛下与二氯苯(40ml)混合。 利用沙浴在120℃加热溶液16小时，产生紫色固体。过滤收集固体， 然后用二氯苯、氯仿和乙醚洗涤，产生浅粉色固体，(10.2g，91％)。 δH(300MHz，CD3OD)7.98(m，3H)，4.55(q，2H)，1.56(s，6H) 和1.48(t，3H)。

v)1-(5-羧基戊基)-2，3，3-三甲基-5-磺酰基-吲哚碘 盐

将2，3，3-三甲基假吲哚(6.4g，40mmol)溶解在二氯苯(25ml) 中，搅动直至溶液匀质化。向其中添加6-溴己酸(15.6g，80mmol)， 沙浴110℃加热6.5小时。在刮擦烧瓶壁的同时将反应冷却到室温，然 后将烧瓶放入冰箱1小时。此后，在紫色溶液中形成米黄色固体，过 滤收集固体然后用二氯苯和乙醚洗涤，得到米黄色固体(7.42g，52 ％)。δH(300MHz，CD3OD)7.91(m，1H)，7.78(m，1H)，7.62 (m，2H)，4.52(t，2H)，2.38(t，2H)，2.04(p，2H)，1.88 -2.45(m，4H)和1.61(s，6H)。

vi)1-(6-{[2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1 -基)乙基]氨基}-6-氧代己基)-2-[(1E，3E)-3-(1-乙 基-3，3-二甲基-5-磺基-1，3-二氢-2H-二氢亚吲哚-2-基) 丙-1-烯基]-3，3-二甲基-3H-吲哚盐(化合物I)

将1-乙基-2，3，3-三甲基-5-磺酰-吲哚碘盐(2.0g， 7.48mmol)，N，N′-二苯基甲脒(1.5g，7.48mmol)和三乙基原甲 酸酯(1.1g，7.48mmol)溶解在乙醇(10ml)中，然后加热回流(100 ℃)3小时。在反应烧瓶壁上形成固体，UV/VIS显示在408nm处的新 峰。添加二乙醚，过滤收集沉淀物和固体，用乙醚洗涤，在真空中干 燥获得黄色/橙色固体的(1.83g，66％)。UV/VIS(MeOH)；吸收λ max＝408nm。

向无水吡啶(10ml)中的Cy3半染料(1.83g，6.22mmol)溶液 中添加乙酸酐(1.0ml)，在氮保护气氛下搅动反应10分钟。此后添 加1-(5-羧基戊基)-2，3，3-三甲基吲哚溴盐(2.2g，6.22mmol)， 在室温下搅动反应16小时。用薄层色谱(20％MeOH/80％DCM)监视反 应的进展。减压移除溶剂，利用快速柱层析(反相硅胶：水-50％甲 醇梯度)产生299mg期望的Cy3酸产物(9％)。UV/VIS(MeOH)； 吸收λmax＝550nm。

在氮保护气氛下将Cy3酸(50mg，0.09mmol)溶解在无水DMF中， 然后在室温下搅动。添加DIPEA(16μl，0.09mmol)和TSTU(30mg， 0.09mmol)，搅动反应2小时直到由薄层色谱(20％MeOH/80％DCM) 确定完全成为NHS酯。在真空中除去溶剂，在乙醚存在下研磨残渣， 产生粉红色粉末(40g，67％)。δH(300MHz，CDCI3)8.35(m，2H)， 7.89(m，2H)，7.35-7.10(m，5H)，6.55(m，1H)，4.07(m， 4H)，3.69(m，2H)，3.11(m，2H)，2.54(m，2H)，1.75-1.60 (m，6H)和1.42(m，15H)。ESi+MS 648.3。UV/VIS(MeOH)；吸 收λmax＝550nm。

vii)1-(6-{[2-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1 -基)乙基]氨基}-6-氧代己基)-3，3-二甲基-2-[(1E，3E， 5E)-5-(1，3，3-三甲基-5-磺基-1，3-二氢-2H-二氢亚吲 哚-2-基)戊-1，3-二烯基]-3H-吲哚盐(化合物I I)

将1，2，3，3-四甲基-5-磺酰基-吲哚碘盐(5.00g， 11.90mmol)悬浮在乙酸(40ml)和TFA(2ml，18.0mmol)的混合物 中，直到固体溶解。向反应中添加1，3，3-三甲基丙稀(12.5ml， 95.0mmol)，在室温下搅动5小时。将溶液移入500ml二乙醚中，过 滤收集沉淀(4.80g，含盐)。

向甲醇(40ml)中的Cy5半染料(4.80g，14.9mmol)的溶液中 添加乙酸钾(3.00g，34.2mmol)和1-(5-羧基戊基)-2，3，3 -三甲基吲哚溴盐(3.00g，16.4mmol)。搅动过夜后，将溶液移入二 乙醚(500ml)中，过滤收集蓝色固体，真空干燥。通过快速柱层析(反 相硅胶：水-50％甲醇梯度)进行纯化，产生2.30g期望的产物(28 ％)。

在氮保护气氛下将Cy5酸(50mg，0.09mmol)溶解在无水DMF中， 然后在室温下搅动。添加DIPEA(16μl，0.09mmol)和TSTU(30mg， 0.09mmol)，搅动反应2小时直到由薄层色谱(20％MeOH/80％DCM) 确定完全成为NHS酯。在真空中除去溶剂，在乙醚存在下研磨残渣， 产生蓝色粉末(65g，90％)。δH(300MHz，CD3OD)8.29(m，2H)， 7.88(m，2H)，7.32-7.00(m，5H)，6.57(t，J＝13Hz，1H)， 6.13(m，2H)，3.97(m，2H)，3.66-3.51(m，3H)，3.08(m， 4H)，2.55(m，2H)，1.75(m，2H)，1.64(m，2H)和1.35(m， 12H)。ESi+MS 660.3。UV/VIS(MeOH)；吸收λmax＝642nm。

实施例2

2.1细胞培养，表面蛋白标记和蛋白质分离

最初的实验在U937细胞(高加索人组织细胞的淋巴瘤细胞)上进 行，该细胞由ECACC提供(ECACC No.85011440 CB No.CB2275)。 根据提供者推荐的方案培养U937细胞。在RPMI-1640生长培养基(10 ％胎牛血清)中，在37℃，5％ CO2，直立烧瓶中使细胞生长。对细胞 计数，每2-3天进行传代，将细胞浓度维持在2-9×105细胞/毫升。 收获之前一天，将细胞旋下，重悬浮在新鲜培养基中以最小化非存活 细胞的水平。

为了在标记过程中维持细胞的生存力和最小化CyDye水解，在即 将使用之前将花青染料在PBS中重构，得到80μM的最终浓度。

为了最小化蛋白水解，所有使用的缓冲液都是冰冷的，只要可能， 所有的步骤都在冰上进行；此外，溶解缓冲液包含PSC-保护物 (Roche)和蛋白酶抑制剂混合物(Roche)。一般地，每个标记反应 中使用1.5×108细胞，而每次实验收获5-10×108细胞。通过在4℃， 12,000×g离心10分钟使细胞团粒化，在Dulbecco的配方PBS pH 7.2 中洗涤。除去PBS，将细胞重新悬浮于PBS(3-6ml)中，分成1ml的 部分(每个标记实验1个)。对于每个1ml标记反应，通过离心使细 胞团粒化，除去PBS。将细胞重悬浮于50μl含CyDye荧光剂的PBS (80μM)中。为进行标记，每50μg总蛋白使用～45pmole荧光剂。 通过在冰上使细胞与荧光剂反应15分钟来标记细胞表面蛋白。离心使 细胞团粒化，尽可能除去未反应的荧光剂(防止标记内部蛋白)。为 了淬灭任何残余的未反应荧光剂，将细胞重悬浮于包含10mM赖氨酸的 溶解缓冲液(7M尿素，2M硫脲，4％w/v CHAPS，30mM Tris，pH 7.5) 中。通过超声使细胞溶解(6μm振辐20秒，冰水中冷却1分钟，10 个循环)。对溶液进行离心使细胞碎片团粒化，保留蛋白质(在上清 液中)。

利用Bio-Rad Dc Protein Assay按厂家的描述(Bio-Rad， Hertfordshire，UK)确定U937细胞溶解物的蛋白质浓度。

2.2总蛋白提取和标记

为了比较细胞表面表达的蛋白和总蛋白，制备细胞溶解物。如实 施例2描述的收获U937细胞之后，将细胞重新悬浮在溶解缓冲液中。 通过超声使细胞溶解(6μm振辐20秒，冰水中冷却1分钟，10个循 环)。离心溶液使细胞碎片团粒化，根据标准的CyDye DIGE最小标记 方案(Ettan DIGE用户手册，Amersham Biosciences， Buckinghamshire，UK)标记蛋白质(在上清液中)。

2.3通过2D电泳分离蛋白质

利用标准的Amersham Biosciences 2D PAGE设备和PlusOneTM 试剂(Buckinghamshire，UK)进行2-D电泳。在用2.5ml DryStrip Cover Fluid覆盖的450μl再水化缓冲液(7M尿素，2M硫脲，4％w/v CHAPS，1％ Pharmalytes(pH 3-10)，2mg/ml DTT)中，在Immobiline DryStrip Reswelling Tray中，使Immobiline DryStrips(pH 3- 10NL，24cm)再水化过夜。利用IPGphor等电聚焦系统使条带集中。 在第二维PAGE之前，每个条带用10ml平衡缓冲液A(7M尿素，2M硫 脲，100mM Tris-HCl pH 6.8，30％v/v甘油，1％w/v SDS，5mg/ml DTT)在摇摆台上平衡10分钟，随后用10ml平衡缓冲液B(7M尿素， 2M硫脲，100mM Tris-HCl pH 6.8，30％v/v甘油，1％w/v SDS，45mg/ml 碘代乙酰胺)再平衡10分钟。然后将条带加载到12.5％恒强度 (isochratic)Laemmli SDS-PAGE凝胶上，进行跑胶。

2.4荧光凝胶成像和图像分析

利用Typhoon 9410扫描仪(Amersham Biosciences， Buckinghamshire，UK)按以下设置使标记的蛋白质显像：

  激发   发射   Cy3   540nm(25nmBP)   590nm(35nmBP)   Cy5   620nm(30nmBP)   680nm(30nmBP)

对每个独立的实验优化曝光时间，以在99,000图像上得到最高的 像素值来避免信号的饱和。对于染料匹配的详细定量分析，将凝胶图 像输入到DeCyder(Amersham Biosciences，Buckinghamshire，UK)， 一种2D差示分析软件程序中。

2.5利用IN CellTM分析仪测定细胞膜渗透性

为了确定细胞膜对不同荧光剂的渗透性，按实施例2.1的描述制 备标记的细胞，用IN Cell分析仪分析完整细胞。这个仪器是一种共 焦荧光显微镜，能以＞0.5μm的分辨率使细胞可视化，可被用于确定荧 光标记的位置。为了最小化蛋白水解，所有使用的缓冲液都是冰冷的， 只要可能，所有步骤都在冰上进行。对于每种测试的荧光剂，制备细 胞并在冰上建立标记反应(如实施例2.1中所述)。在期望的时间点， 取出标记的细胞的双份等分试样。

将标记的细胞的等分试样置于384孔微量滴定平板中，在IN Cell 分析仪上读取。为了检查细胞的生活力，向孔中添加LIVE/DEAD生活 力着色剂(分子探针)，反应10分钟。在IN Cell分析仪上再次读取 每个孔以确定那些死亡了的细胞。只有那些显示是活着的细胞被用于 评定细胞渗透性，而非存活细胞对于染料是可渗透的。

洗涤标记的细胞的等分试样以除去未反应的游离染料。用PBS洗 涤细胞，然后通过离心使细胞团粒化。将细胞重新悬浮于PBS中，将 等分试样置于微量滴定平板中，在IN Cell分析仪上读取。对于其余 的量，添加LIVE/DEAD生活力着色剂，在冰上培养细胞10分钟。将进 一步的等分试样置于微量滴定平板中，在IN Cell分析仪上读取。