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核酸的解吸

阅读：209发布：2020-05-11

专利汇可以提供核酸的解吸专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及从样品解吸核酸的方法。为了简化从样品解吸核酸，将微流体系统（1）中的固相（16）多次用洗脱缓冲液冲洗，以将在微流体系统（1）中与固相（16）结合的核酸从固相（16）洗脱。，下面是核酸的解吸专利的具体信息内容。

权利要求

1.从样品解吸核酸的方法，其特征在于，将微流体系统（1；21；31）中的固相（16）多次用洗脱缓冲液冲洗，以将在微流体系统（1；21；31）中与固相（16）结合的核酸从固相（16）洗脱。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述洗脱通过集成在微流体系统（1；21；
31）中的微型泵（15）以对应于洗脱体积的限定的挤出体积进行。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述洗脱体积为1至100微升。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，将洗脱介质在微流体系统（1；
21；31）中经由过滤材料（16）来回泵送。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，翻转在微流体系统（1；21；31）中流过固相（16）的方向。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，将洗出液级分在微流体系统（1；21；31）中多次引导通过固相（16）。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，将洗出液级分n和另外的洗出液级分n+1在微流体系统（1；21；31）中合并成混合物，从该混合物中取出等分试样用于进一步分析。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，在洗脱之前，在微流体系统（1；21；31）中进行以下准备步骤中的至少一个、多个或每个：
- 将样品在洗脱之前在微流体系统（1；21；31）中裂解，以裂解靶细胞和释放核酸；
- 在结合步骤中，在微流体系统（1；21；31）中向裂解产物添加结合缓冲液，其中该结合缓冲液与裂解产物混合；
- 将裂解产物或在结合步骤中产生的混合物在微流体系统（1；21；31）中引导通过固相（16）。
9.具有通道网（3）的微流体系统（1；21；31），其中布置有固相（16）和至少一个微型泵（15，35），其特征在于，将微型泵（15，35）如此布置在通道网（3）中，并且构成为将微流体系统（1；21；31）中的固相（16）多次用洗脱缓冲液冲洗，以便从样品解吸核酸，特别是根据前述权利要求中任一项所述的方法。
10.根据权利要求9所述的微流体系统，其特征在于，所述固相（16）是布置在微流体系统（1；21；31）的通道网（3）中的过滤材料，该过滤材料经由连接通道（5）与微型泵（15，35）连接。

说明书全文

核酸的解吸

[0001] 本发明涉及从样品解吸核酸的方法。现有技术

[0002] 从德语公开文本DT 23 39 111 A1已知一种通过生物特异性吸附和通过解吸纯化蛋白质和其它可生物特异性吸附的物质的方法，其中吸附在超滤膜上进行。由欧洲专利文本EP 0 700 521 B1已知一种可拆卸地插入质谱仪中的探针，其中该探针具有用于将分析物呈现给能量源的样品呈现表面，该能量源发出适用于将分析物从探针解吸/电离以检测分析物的能量，其中将所述表面用能够结合分析物的亲和试剂衍生化，该亲和试剂选自金属离子，核酸，肽，碳水化合物，蛋白质及其组合，其中在所述表面上结合亲和试剂提供辅助解吸/电离的基质材料。

发明内容

[0003] 从样品解吸核酸的方法的特征在于，将微流体系统中的固相多次用洗脱缓冲液冲洗，以将在微流体系统中与固相结合的核酸从固相洗脱。所述样品优选是裂解的样品，例如含有靶细胞的液体，例如细胞悬浮液或患者样品，例如血液，灌洗液，唾液或者经冲洗的拭子或涂片。所述样品例如具有几微升至十毫升的体积。通常，所述样品具有半毫升至一毫升的体积。所述固相优选是过滤材料，例如二氧化硅过滤材料。所述洗脱缓冲液例如是水或具有合适添加物的水。所述固相也可以称为固定相。类似地，洗脱缓冲液（也称为洗脱剂）也可以称为流动相。为了从细胞获得核酸，通常首先将其裂解，并且在随后的步骤中纯化所释放的核酸。然后进一步处理或分析核酸。例如，可以通过PCR选择性地扩增经纯化的核酸。其中，大写字母PCR代表英文术语Polymerase Chain Reaction（聚合酶链反应）。这在德语中对应于Polymerase-Kettenreaktion。对于细胞裂解存在各种方法，例如这可以化学地、酶促地或机械地进行。为了纯化从细胞释放的核酸，通常将通过裂解产生的裂解产物与结合缓冲液混合，并且使其与固体基质例如二氧化硅过滤材料接触，其中核酸吸附到过滤材料上。然后可以洗涤和洗脱核酸。该洗出液含有核酸，并且可以用于进一步的酶促反应，例如PCR，测序或限制酶消化。通过在微流体系统中进行处理，可以减少洗出液中不希望的高浓度抑制剂成分。微流体系统本身是已知的，例如由德语公开文件DE 10 2009 028 496 AI。通过在微流体系统中实施所要求保护的方法，可以以特别低的损失制备洗出液的各个级分。级分是指限定的体积，该限定的体积例如通过集成在微流体系统中的微型泵挤出到同样集成在微流体系统中的通道系统中。各个级分的核酸和任选存在的抑制剂的浓度不同。
通过适当的工艺操作，可以任选地丢弃抑制剂浓度高的级分。然后，对于随后的洗出液分析，可以有利地使用其抑制剂浓度较低的级分。通过使洗脱缓冲液多次流过固相，可以建立饱和平衡，其中实现最大洗脱效率。

[0004] 所述方法的一个优选具体实施例的特征在于，洗脱通过集成在微流体系统中的微型泵以对应于洗脱体积的限定的挤出体积进行。所述洗脱有利地通过限定体积的洗脱缓冲液进行，该限定的体积通过微型泵挤出并且引导通过固相。该限定的体积称为洗脱体积。所述工艺和微流体通道网或网络的体积有利地彼此精确地匹配。各个级分的体积也可能不同。例如，在第一步骤中可以使用小型泵（每冲程5至15微升，通常11微升）以挤出仍存在于过滤材料以及导入和/或导出通道的区域中的洗涤缓冲液。然而，为了将洗出液输送到随后的工艺腔室中，例如用于PCR，需要更大的体积，这可以通过具有更大的泵送腔室（10到25微升；通常20微升）的泵来实现。每个洗脱级分的体积为10至100微升，特别是15至50微升，例如20微升。在一个有利的实施方案中，为了泵送液体在微流体系统中使用微型隔膜泵，该微型隔膜泵的泵送腔室体系正好对应于洗脱级分的体积。这样做的优点是，在每个泵送冲程中，正好推送洗脱级分的体积通过过滤材料，并且因此可以非常精确地设定体积。

[0005] 所述方法的另一个优选具体实施例的特征在于，洗脱体积为1至100微升。洗脱体积可以仅为几微升。洗脱体积优选为15至50微升。特别优选地，洗脱体积为约20微升。在该洗脱体积下，在本发明中进行的试验和分析获得了最佳结果。

[0006] 所述方法的另一个优选具体实施例的特征在于，将洗脱介质在微流体系统中经由过滤材料来回泵送。这尤其提供以下优点，即洗脱级分可以特别好地充分混合，并且核酸特别好地，特别是完全地从过滤材料脱落。

[0007] 所述方法的另一个优选具体实施例的特征在于，翻转在微流体系统中流过固相的方向。由此可以使洗脱体积多次引导通过相同的固相。根据微流体系统的设计，洗脱体积但也可以单向（即仅在一个方向上）多次引导通过固相。两种方法，即采用单向和双向地流过固相，尤其提供以下优点，即核酸可以以浓度梯度富集在级分中。

[0008] 所述方法的另一个优选具体实施例的特征在于，将洗出液级分在微流体系统中多次引导通过固相。洗脱的产物也称为洗出液。对于所要求保护的洗脱方法，如果洗涤缓冲液的物质在洗脱过程中仍在微流体系统的通道局部中，则它们潜在地可能与洗脱缓冲液接触。例如，如在洗涤步骤和洗脱步骤中的情况那样，如果微流体路径的一部分或流动的固相以彼此相继的顺序部分地被洗涤缓冲液和洗脱缓冲液分占，则会发生这种情况。如果将全部洗出液用于随后的分析，例如酶促反应，如聚合酶链反应，则高浓度的抑制剂物质可能使其停止。有利地，微流体系统中的洗脱步骤可以多次相继地进行。在这种情况下，洗脱体积可以多次引导通过过滤材料或固相。替代地或另外地，洗脱体积的部分体积可以彼此依次地引导通过固相或过滤材料。这样做的优点是，在每下一个洗出液级分中，抑制剂物质的浓度降低，因为它们已经被前面的洗出液级分挤出。然而，核酸的产率通常随着每下一个洗脱步骤而降低，由此预期在第一级分中最高浓度的核酸和抑制剂物质。因此，丢弃第一洗出液级分可以是有利的。有利地可以使用洗脱缓冲液的第一级分，以挤出洗涤缓冲液的残留物。例如，可以将洗脱缓冲液的该第一级分泵送到微流体系统的微流体网络或通道网内的收集腔室中。在这种情况下，级分体积在理想情况下都是相似的，例如死体积的倍数。死体积是指在固相中和在流体系统中充满洗涤缓冲液的通道中的自由体积。随后，可以将第二级分一次或多次引导通过固相，以提高核酸的产率。

[0009] 所述方法的另一个优选具体实施例的特征在于，将第一洗出液级分和第二洗出液级分在微流体系统的微流体腔室中合并成混合物，从该混合物中取出等分试样用于进一步分析。等分试样是指混合物的一部分。通过混合步骤降低抑制剂物质和核酸的浓度。例如，抑制剂物质的浓度可以通过该方法降低到这样的程度，使得现在只能成功地进行敏感的酶促检测反应。这在一定程度上是有利的，因为通过合适的酶促检测方法，例如PCR可以扩增核酸的甚至非常少的量，由此使得在取出的等分试样中核酸浓度的最初不利的降低被证明是有利的。

[0010] 所述方法的另一个优选具体实施例的特征在于，将洗出液级分n和洗出液级分n+1在微流体系统中合并成混合物。因此，可以例如将第三和第四洗出液级分合并成混合物。字母n代表自然数。

[0011] 所述方法的另一个优选具体实施例的特征在于，在洗脱之前，在微流体系统中进行以下准备步骤中的至少一个、多个或每个：将样品在洗脱之前在微流体系统中裂解，以裂解靶细胞和释放核酸；在任选的结合步骤中，在微流体系统中向裂解产物添加结合缓冲液，其中该结合缓冲液与裂解产物混合；将裂解产物或在结合步骤中产生的混合物在微流体系统中引导通过固相。在这种情况下，核酸吸附到固相上。通常，结合缓冲液包含高比例的离散物质，例如硫氰酸胍，盐酸胍或氯化铯和/或醇，例如乙醇或异丙醇。已知这些物质可抑制酶促下游应用，例如PCR，或任选使其完全停止。另外，裂解的样品材料带来了可能干扰核酸随后的酶促处理的物质。出于该原因，将带有吸附核酸的固相用洗涤缓冲液全面洗涤，其中洗涤缓冲液从固相除去干扰成分或降低其浓度。这些洗涤缓冲液通常包含离散物质和/或醇，其中该离散物质的浓度通常低于结合缓冲液的浓度。通过所要求保护的在微流体系统中的流体工艺操作可以有效地减少洗出液中抑制剂成分的浓度。

[0012] 本发明进一步涉及一种包括计算机程序的计算机程序产品，该计算机程序具有当其在计算机上运行时用于执行前述方法的软件工具。该计算机优选属于微流体平台，并且有利地用于控制微流体系统中的工艺操作。

[0013] 上述目的在具有通道网的微流体系统（其中布置有固相和至少一个微型泵）的情况下替代地或另外地通过如下方式而实现：将微型泵如此布置在通道网中，并且构成为将微流体系统中的固相多次用洗脱缓冲液冲洗，以便从优选裂解的样品解吸核酸，特别是根据上述方法。微型泵例如构成为如在德语公开文本DE 10 2010 001 410 A1中所述的微型隔膜泵。微型泵，特别是微型隔膜泵的泵送腔室体积对应于洗出液级分的体积。微流体系统有利地包括构成为芯片缩微实验腔室（Lab-on-Chip）的聚合物芯片，如德语公开文本DE 10 2011 085 371 A1中所公开的。

[0014] 所述微流体系统的一个优选具体实施例的特征在于，固相是布置在微流体系统的通道网中的过滤材料，该过滤材料经由连接通道与微型泵连接。过滤材料例如是二氧化硅过滤材料。微型泵有利地布置在储液器和过滤材料之间。在过滤材料下游有利地布置有至少两个排出路径。根据一个实施方案，侧通道有利地在微型泵和过滤材料之间分支。侧通道可以有利地构成为过滤材料的旁路。根据另一个有利的实施方案，过滤材料布置在两个微型泵之间。

[0015] 本发明的其他优点、特征和细节通过下面的描述将变得显而易见，其中参考附图详细描述了各种具体实施例。

[0016] 附图简述图1示出了根据第一具体实施例的具有通道网的微流体系统的简化示意图，其中在微流体系统中布置有微型泵和固相。

[0017] 图2示出了根据第二具体实施例的与图1类似的微流体系统，其具有绕过固相的侧通道；和图3示出了与图1和2类似的具有第二微型泵的微流体系统。

[0018] 具体实施例的描述在图1至3中，简化显示了用于从固相解吸核酸的微流体系统1；21；31的三个具体实施例。微流体系统1；21；31包括储液器2，其通过微流体通道网3；23；33与微型泵15和固相16连接。

[0019] 核酸例如是核糖核酸（RNA）或脱氧核糖核酸（DNA）。固相优选是过滤材料，例如织物过滤材料或二氧化硅过滤材料，其直径在1至25毫米之间，特别是在3至4毫米之间。

[0020] 核酸从裂解的样品中解吸。样品是含有靶细胞的液体，例如细胞悬浮液和/或患者样品。

[0021] 患者样本包括例如血液，灌洗液，尿液，脑脊液，唾液或者经冲洗的拭子或涂片。样品的体积在几微升至十毫升之间，特别是在0.2至1毫升之间。

[0022] 微型泵15例如是蠕动泵，隔膜泵或集成的微流体泵。级分是指限定的体积，该限定的体积例如通过集成的微流体泵挤出到微流体通道系统或通道网3；23；33中。

[0023] 为了准备解吸，优选进行至少一个裂解步骤，一个结合步骤和一个洗涤步骤。在裂解步骤中，将含有待检测靶细胞的样品通过合适的方法裂解。其中，裂解靶细胞并且释放核酸。所产生的混合物称为裂解产物。

[0024] 在任选的结合步骤中，向裂解产物添加结合缓冲液，并且将其与裂解产物混合。随后，将该混合物引导通过固相16，特别是二氧化硅过滤材料。其中，核酸吸附到固相或过滤材料16上。

[0025] 在洗涤步骤中，将至少一种或多种洗涤缓冲液引导通过固相或过滤材料16。在该步骤中，核酸保持与过滤材料16结合，而除去例如蛋白质或结合缓冲液中的物质。

[0026] 在随后的洗脱步骤中，将核酸用合适的洗脱缓冲液从固相或二氧化硅过滤材料16洗脱。所述洗脱有利地通过集成在微流体系统1中的微型泵15进行。其中，借助于限定体积的洗脱缓冲液进行洗脱，该限定体积在下文中称为级分，并且通过微型泵15挤出和引导通过过滤材料16。根据一个有利的变型方案，该步骤可以进行多次。在另一个实施方案中，可以翻转流过方向，和因此使得洗出液多次通过固相16。

[0027] 在图1至3中，微流体通道网3；23；33包括微流体通道4，5，6，7，8，9。微流体通道4至9也简称为通道。

[0028] 通道4将储液容器2与微型泵15连接。通道5将微型泵15与固相或过滤材料16连接。在通道5中布置有连接位点或分支位点11，从该位点导出称为侧通道6的通道6。

[0029] 通道7将固相或过滤材料16与连接位点或分支位点12连接，从该位点导出通道8和9。在通道8末端用矩形18表示排出路径18。在通道9末端用矩形19表示排出路径19。

[0030] 在图1所示的微流体系统1的情况下，在借助于微型泵15（其也简称泵）洗涤过滤材料16之后，将洗脱介质（例如水）经由通道网络3从储液器2吸出。洗脱介质的第一级分经由过滤材料16泵送到第一排出路径18中。在微流体系统1中还可以存在其他通道和储液器，例如用于储存其他试剂或用于接收试剂废物。

[0031] 随后，将洗脱介质的第二级分经由过滤材料16泵送到第二排出路径19。在第二排出路径19中，该第二洗脱级分例如接收在一个腔室中并进一步处理。在第一排出路径18和第二排出路径19之间的切换例如通过在连接位点或分支位点12处的微流体阀（未示出）进行，该位点也称为通道交叉点。任选地，也可以将其他洗脱级分泵送到其他排出路径。

[0032] 在图1所示的通道网络3的变型方案中，在过滤材料16之前分出侧通道6。该侧通道6在微型泵15将洗脱介质从储液器2吸出的过程中有利地起到微型泵15的排出通道的作用。
由此，将微型泵15在实际洗脱过程之前完全填满洗脱介质。这提供以下优点，即在第一级分洗脱时就已经精确地移动泵送腔室体积。

[0033] 根据图1中同样表示的处理变型方案，对于特定级分的洗脱，将洗脱介质经由过滤材料16来回泵送。为此，使用微型泵15将洗脱级分首先经由过滤材料16在排出路径18、19的方向上挤出。然后将该洗脱级分再经由过滤材料16吸回。任选地多次重复该过程，例如重复三次或五次。这提供以下优点，即可以特别好地充分混合洗脱级分，并且将核酸特别完全地从过滤材料16脱离。

[0034] 根据另一个处理变型方案，将在两个排出路径18、19中含有的级分在洗脱之后混合，例如通过借助于另外的泵（在图1中未示出）在位于相应的排出路径18、19中的腔室之间来回泵送。在排出路径18、19中，也可以直接存在用于接收洗出液级分的泵送腔室，其可以用于进一步输送洗出液级分。该处理变型方案的优点在于，将两个级分有效地混合并且因此降低了抑制剂的浓度。

[0035] 在图2所示的微流体系统21的情况下，相比于图1的通道网3，通道网23包括附加的连接位点或分支位点24，其也称为通道交叉点。侧通道6在通道网23中在连接位点或分支位点11和24之间延伸。由此可以有利地利用侧通道6以绕过过滤材料16。侧通道6在过滤材料16之后汇流到具有排出路径19的通道9。该变型方案的优点在于，洗脱介质可以经由过滤材料16循环。由此可以实现各级分的特别好的充分混合。

[0036] 图3所示的微流体系统31包括具有附加连接位点或分支位点34的通道网33。附加的连接位点或分支位点34布置在通向排出路径19的通道9中。从附加的连接位点或分支位点34分出另外的排出路径36。另外，在图3中，将第二微型泵或泵送腔室35布置在过滤材料16和连接位点或分支位点34之间的通道7中。使用第二微型泵或泵送腔室35可以在两个方向上主动地辅助来回泵送。

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