蛋白检测膜及制备方法和基于核酸适配体-石墨烯拉曼频移的蛋白检测方法
阅读：986发布：2020-05-16
专利汇可以提供蛋白检测膜及制备方法和基于核酸适配体-石墨烯拉曼频移的蛋白检测方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于 生物 技术领域，涉及一种蛋白检测膜及制备方法和基于核酸适配体- 石墨 烯 拉曼频移 的蛋白检测方法。其中，该检测膜包括：特异性识别该蛋白的核酸适配体和基底，所述基底包括 石墨烯 薄膜 ，所述核酸适配体附着在所述石墨烯薄膜的表面。本发明提供的检测膜将 单层 石墨烯作为拉曼 光谱 的响应基底，选用与石墨烯声子振动模式相关的拉曼特征G峰作为响应 信号 ，可灵敏地指示单层石墨烯的 电子 结构和界面性质，避免了传统拉曼检测技术中标志物的繁琐制备过程，简化了检测和操作程序。，下面是蛋白检测膜及制备方法和基于核酸适配体-石墨烯拉曼频移的蛋白检测方法专利的具体信息内容。
1.一种蛋白检测膜，其特征在于，所述蛋白检测膜包括：特异性识别该蛋白的核酸适配体和基底，所述基底包括石墨烯薄膜，所述核酸适配体附着在所述石墨烯薄膜的表面。
2.根据权利要求1所述的蛋白检测膜，其特征在于，所述核酸适配体具有20～100个核苷酸。
3.根据权利要求1所述的蛋白检测膜，其特征在于，所述蛋白为糖蛋白PSA，所述核酸适配体的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述SEQ ID NO:1为5'-TTTTTAATTAAAGCTCGCCATCAAATAGCTTT-3'。
4.根据权利要求1所述的蛋白检测膜，其特征在于，所述蛋白为凝血酶，所述核酸适配体的 核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示 ，所述SEQ ID NO :2为5 '-AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT-3'。
5.根据权利要求1-4任一项所述的蛋白检测膜，其特征在于，所述石墨烯薄膜为单层石墨烯薄膜。
6.根据权利要求1-4任一项所述的蛋白检测膜，其特征在于，所述基底还包括SiO2/Si层，所述石墨烯薄膜位于SiO2/Si层上。
7.权利要求1-6任一项所述的检测膜的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
将含有所述核酸适配体的磷酸盐缓冲溶液滴加在所述基底的表面，孵育至所述基底的表面干燥后，水洗所述表面，干燥处理，即获得所述蛋白检测膜。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括：将所述基底用磷酸盐缓冲溶液清洗，之后干燥处理。
9.一种基于核酸适配体-石墨烯拉曼频移的蛋白检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
1)获得权利要求1-6任一项所述的蛋白检测膜；
2)检测所述蛋白检测膜的拉曼光谱，记录所述蛋白检测膜的石墨烯的G峰峰位；
3)向附着所述核酸适配体的蛋白检测膜的表面滴加待测溶液，孵育后制成待测样品；
4)检测所述待测样品的拉曼光谱，记录所述待测样品的石墨烯的G峰峰位；
5)比较步骤2)获得的石墨烯的G峰峰位与步骤4)获得的石墨烯的G峰峰位，根据比较结果判断待测溶液中是否含有与蛋白检测膜相对应的目标蛋白和/或检测所述目标蛋白的含量。
10.根据权利要求9所述的蛋白检测方法，其特征在于，所述与蛋白检测膜相对应的目标蛋白为凝血酶。
蛋白检测膜及制备方法和基于核酸适配体-石墨烯拉曼频移
的蛋白检测方法
技术领域
背景技术
[0002] 拉曼光谱作为一种表征分子结构振动的指纹光谱，已成为分子检测研究的有利工具。然而因拉曼光谱信号微弱，限制了其在痕量分析中的应用。基于等离子体的表面增强拉曼光谱(surface-enhanced Raman spectroscopy，简称SERS)可弥补其不足。金或银等离子体纳米材料可产生强大的电磁增强效应，常用于SERS传感分析中。尽管如此，SERS技术仍然存在一些不利于其应用的因素，例如等离子体材料的不可控聚集和活性拉曼标签的繁琐制备过程等。这些不利因素使SERS技术成为一种高成本、费时的方法。因此，需要发展一种非等离子体且无标记的拉曼技术。
[0003] 近十几年来，纳米材料，如石墨烯、碳量子点等，由于具有独特的量子力学效应和高比表面积等优势，而被广泛用于检测分析领域。石墨烯是一种由碳原子sp2杂化形成二维蜂窝状结构的材料，单层石墨烯的理论厚度约为0.3nm，其分子振动模式极易受石墨烯界面的pH、应力等因素的影响。石墨烯由于其高量子电容、高载流子以及丰富的芳香环(π电子系统)，对掺杂和费米能级的变化十分敏感。因此，石墨烯在超灵敏分析中得到广泛的应用。
[0004] 典型的石墨烯拉曼光谱含有三个突出的拉曼区域，分别是在1580cm-1附近的G峰(平面内振动模式)、2700cm-1附近的2D峰(平面内振动的二阶泛音)和在1350cm-1附近的无序振动D峰。由于这三个特征峰与石墨烯中的声子振动模式有关，因而它们对石墨烯的电子结构和界面性质具有很高的灵敏性。因此，拉曼光谱是表征石墨烯的常用手段之一。基于此，Berry等人将脑细胞置于单层石墨烯界面上，二者发生相互作用，使得石墨烯中电荷发生重新排列，改变了石墨烯的原子振动能量，根据单个细胞在石墨烯界面上引起的2D峰频率变化，能够区分活跃的癌细胞和正常细胞，从而监测癌细胞的活动。然而，现有的对癌细胞检测的方法中所使用的癌细胞均经过厌氧发酵过程，发酵过程积累大量的有机酸，例如唾液酸在细胞膜上的表达增加，可诱导细胞活性增高，增强细胞膜的电活性。因此，几乎所有的癌细胞都可以通过空穴掺杂机制改变石墨烯的2D峰频移，从而导致对癌细胞的检测缺乏特异性，即未能实现不同癌细胞的鉴别。
[0005] 目前，尚未有基于拉曼光谱和石墨烯的高灵敏度和高特异性的检测蛋白的方法。
发明内容
[0006] 本发明的目的是提供一种灵敏度高和特异强的蛋白检测膜及制备方法和基于核酸适配体-石墨烯拉曼频移的蛋白检测方法。
[0008] 具体地，所述蛋白检测膜的长度可以为1～2.25cm，宽度可以为1～2.25cm，例如1cm×1cm。
[0009] 根据本发明，所述核酸适配体的长度可根据需要确定，以达到所需结合力且不影响检测为标准，具体地所述核酸适配体具有20～100个核苷酸。
[0011] 根据本发明，优选地，特异性识别该蛋白的核酸适配体为单链的核酸适配体。单链的核酸适配体包括：单链的核糖核酸适配体和单链的脱氧核糖核酸适配体。
[0012] 根据本发明一种具体实施方式，所述蛋白为糖蛋白PSA，所述核酸适配体的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述SEQ ID NO:1为5'-TTTTTAATTAAAGCTCGCCATCAAATAGCTTT-3'。
[0013] 根据本发明另一种具体实施方式，所述蛋白为凝血酶，所述核酸适配体的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述SEQ ID NO:2为5'-AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT-3'。
[0014] 根据本发明，具体地，所述石墨烯薄膜可以为单层石墨烯薄膜、双层的石墨烯薄膜以及多层的石墨烯薄膜。
[0015] 更具体地，所述石墨烯薄膜为单层石墨烯薄膜。
[0016] 更具体地，所述基底还包括SiO2/Si层，所述石墨烯薄膜位于SiO2/Si层上。
[0018] 本发明第二方面提供一种上述蛋白检测膜的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
[0020] 具体地，所述制备方法还包括：将所述基底用磷酸盐缓冲溶液清洗，之后干燥处理。
[0021] 在本发明中，所使用的磷酸盐缓冲溶液的pH值可以为7.4，浓度可以为10mM。对滴加含有所述核酸适配体的磷酸盐缓冲溶液的基底进行干燥，可以为在室温下晾干。水洗过程所使用的水可以为蒸馏水、去离子水等。干燥处理可以为室温下晾干或在隔绝氧气的条件下烘干。在隔绝氧气的条件下烘干可以为在氮气中干燥去除基底表面的水分。
[0022] 本发明第三方面提供一种基于核酸适配体-石墨烯拉曼频移的蛋白检测方法。该方法包括以下步骤：
[0023] 1)获得上述的蛋白检测膜；
[0024] 2)检测所述蛋白检测膜的拉曼光谱，记录所述蛋白检测膜的石墨烯的G峰峰位；
[0025] 3)向附着所述核酸适配体的蛋白检测膜的表面滴加待测溶液，孵育后制成待测样品；
[0026] 4)检测所述待测样品的拉曼光谱，记录所述待测样品的石墨烯的G峰峰位；
[0027] 5)比较步骤2)获得的石墨烯的G峰峰位与步骤4)获得的石墨烯的G峰峰位，根据比较结果判断待测溶液中是否含有与蛋白检测膜相对应的目标蛋白和/或检测所述目标蛋白的含量。
[0028] 根据本发明一种具体实施方式，所述与蛋白检测膜相对应的目标蛋白为凝血酶。
[0029] 根据本发明的方法，更具体地，孵育时间为15～40min，例如30min。
[0030] 本发明提供的蛋白检测膜通过核酸适配体中的多个芳香环与石墨烯中的芳香环之间的π-π堆叠作用，将核酸适配体吸附在单层石墨烯薄膜的表面，具有共轭π电子结构的石墨烯可接受核酸适配体表面的电子，使得石墨烯表面的电荷发生重排，石墨烯的G峰的振动频率在吸附核酸适配体后发生蓝移，在蛋白检测膜上滴加与该核酸适配体特异性识别的蛋白，石墨烯的G峰的振动频率会发生相对红移，因此，根据石墨烯的G峰的振动频率的改变检测蛋白，甚或定量检测蛋白。
[0031] 本发明提供的蛋白检测膜将单层石墨烯作为拉曼光谱的响应基底，选用与石墨烯声子振动模式相关的拉曼特征G峰作为响应信号，可灵敏地指示单层石墨烯的电子结构和界面性质，避免了传统拉曼检测技术中标志物的繁琐制备过程，简化了检测和操作程序。
[0032] 本发明的蛋白检测膜中的特异性识别蛋白的核酸适配体的核酸序列如SEQ ID NO:1所示时，能够特异性地识别糖蛋白PSA。
[0033] 本发明提供的蛋白检测膜中的特异性识别蛋白的核酸适配体的核酸序列如SEQ ID NO:2所示时，能够特异性地识别凝血酶。
[0034] 本发明提供的蛋白检测膜仅需直接滴加待检测样品，无需任何前处理，30min即可获得拉曼响应信号，快速检测样品。
[0035] 本发明提供的检测膜中的单层石墨烯振动频率在结合目标物后会发生变化，根据G峰频率偏移的变化量完成检测，相比于区分噪声信号以上的拉曼峰强度，本发明的检测膜更容易获得拉曼光谱响应信号，有利于进一步提高检测的灵敏度和准确性。
[0036] 本方法提供的蛋白检测膜灵敏度高，检测范围宽，蛋白的最低检测限为0.01ng/mL，检测范围为0.05ng/mL-25ng/mL，需要的蛋白的用量少，仅10μL的蛋白即可出检测结果，检测样品用量少。
[0037] 本发明提供的蛋白检测膜中的基底可以循环利用。
[0038] 本发明提供的蛋白检测膜的制备方法简单方便，可广泛推广应用。
[0039] 本发明提供的基于核酸适配体-石墨烯拉曼频移的蛋白检测方法，操作简单，检测快速灵敏。
[0041] 通过结合附图对本发明示例性实施方式进行更详细的描述，本发明的上述以及其它目的、特征和优势将变得更加明显。
[0042] 图1示出了未处理的石墨烯、浸泡PBS溶液后的石墨烯、结合核酸适配体的石墨烯的拉曼光谱图。
[0043] 图2示出了PSA核酸适配体-石墨烯拉曼频移技术检测PSA的原理图。
[0044] 图3示出了蛋白检测膜结合不同浓度PSA的石墨烯的拉曼光谱图。
[0045] 图4为图3的局部放大图。图中的曲线由上到下依次代表空白对照、浓度为0.01ng/mL、0.05ng/mL、0.1ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、4ng/mL、10ng/mL、15ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、以及200ng/mL的PSA标准品溶液。
[0046] 图5示出了不同浓度PSA对应的石墨烯G峰频移改变量的标准曲线图。
[0047] 图6示出了识别PSA的核酸适配体与PSA、以及其他蛋白的结合比较结果的柱状图。
[0048] 图7示出了石墨烯以及结合核酸适配体的石墨烯的拉曼光谱图。
[0049] 图8示出了石墨烯以及石墨烯表面具有凝血酶的石墨烯的拉曼光谱图。
[0050] 图9示出了不同浓度凝血酶对应的石墨烯G峰红移变化的谱图。
具体实施方式
[0051] 下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。
[0052] 实施例1蛋白检测膜的制备。
[0053] (1)在SiO2/Si(300nm SiO2，1cm×1cm)薄膜上，利用化学气相沉积法合成单层石墨烯薄膜，形成石墨烯/SiO2/Si片，即为基底。该基底从深圳六碳科技有限公司购买。未处理的石墨烯的拉曼光谱，结果详见图1，图1示出了未处理的石墨烯、浸泡PBS后的石墨烯、吸附有核酸适配体的石墨烯的拉曼光谱图。
[0054] (2)将基底浸泡在PBS溶液(10mM，pH 7.4)中2h，在氮气中干燥，去除水分。检测浸泡PBS溶液后的石墨烯的拉曼光谱，结果详见图1。
[0055] (3)在基底上滴加200μL，浓度为10μM的核酸适配体溶液，室温孵育至水分完全蒸发。然后将基底用蒸馏水冲洗两次，以除去未吸附的核酸适配体，在氮气中干燥，去除多余水分，制成蛋白检测膜。吸附有核酸适配体的石墨烯的拉曼光谱，结果详见图1。
[0056] (4)用共焦显微拉曼光谱仪(inVia Reflex，雷尼绍，英国)分别对未处理的石墨烯、浸泡PBS后的石墨烯、吸附有核酸适配体的石墨烯进行检测，检测参数包括：激发光：532nm；曝光时间：10s；5％功率衰减片，记录单层石墨烯的G峰峰位。
[0057] 由图1可知，在浸泡PBS溶液前后，石墨烯的G峰峰位无变化，而吸附核酸适配体后，石墨烯的G峰峰位发生明显改变，拉曼光谱发生蓝移。
[0058] 实施例2蛋白检测膜的制备和PSA检测。
[0059] (1)基底购买自深圳六碳科技有限公司。
[0060] (2)将基底在PBS溶液(10mM，pH 7.4)中浸泡2h，在氮气中干燥，去除水分。
[0061] (3)请参见图2，图2示出了PSA核酸适配体-石墨烯拉曼频移技术检测PSA的原理图。如图2所示，在基底上滴加200μL，浓度为10μM的特异性识别PSA的核酸适配体磷酸盐溶液，核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示：5'-TTTTTAATTAAAGCTCGCCATCAAATAGCTTT-3'(由上海生工生物(北京合成部)合成)，室温孵育至溶液完全蒸发。然后将基底用蒸馏水冲洗两次，以除去未吸附的核酸适配体，在氮气中干燥，去除多余水分，制成蛋白检测膜。
[0062] (4)用共焦显微拉曼光谱仪(inVia Reflex，雷尼绍，英国)对结合PSA前后的检测膜进行检测，检测参数包括：激发光：532nm；曝光时间：10s；5％功率衰减片，记录吸附该核酸适配体后单层石墨烯的G峰峰位。在蛋白检测膜上的核酸适配体与PSA结合后，石墨烯的G峰峰位发生明显改变，拉曼光谱发生红移。
[0063] 可见，本发明的蛋白检测膜可用于PSA检测。
[0064] 实施例3利用实施例2制备的蛋白检测膜对PSA进行检测。
[0065] (1)将PSA标准品在PBS中依次稀释至0.01ng/mL、0.05ng/mL、0.1ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、4ng/mL、10ng/mL、15ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、以及200ng/mL。
[0066] (2)在蛋白检测膜上分别滴加10μL步骤(1)中不同浓度的PSA溶液。将滴加好的样品用小烧杯盖上，尽量减少溶液蒸发，并室温孵育30分钟。
[0067] (3)用激光共焦显微拉曼光谱仪(inVia Reflex，雷尼绍，英国)分别进行检测，检测参数：激发光：532nm；曝光时间：10s；5％功率衰减片，记录吸附适配体后以及适配体结合不同浓度PSA的单层石墨烯的G峰峰位。
[0068] 如图3和图4所示，将不同浓度的PSA溶液加入吸附适配体的基底上，PSA特异性地结合核酸适配体，吸附核酸适配体的单层石墨烯G峰的振动频率发生了蓝移，随着PSA浓度的增加，G峰频移改变量逐渐增大，当PSA浓度的增加至50ng/mL时，G峰频移改变量基本不变，说明核酸适配体与PSA的结合位点已饱和。通过测量石墨烯G峰频移改变量(ΔRaman shift)建立PSA标准曲线，以PSA的浓度为横坐标，石墨烯G峰频移改变量(ΔRaman shift)为纵坐标，得到的标准曲线方程为：y＝0.2619x+0.8452(R2＝0.9976)，检测范围为0.05ng/mL-25ng/mL，检出限为0.01ng/mL，详见图5，图5示出了不同浓度PSA对应的石墨烯G峰频移改变量的标准曲线图。
[0069] 由实施例3可知，本发明的蛋白检测膜能够实现对蛋白进行定量检测。
[0070] 实施例4基于适配体-石墨烯拉曼频移技术检测PSA的特异性验证。
[0071] 在相同条件下检测PSA、其他蛋白(甲胎蛋白、癌胚抗原、人绒毛膜促性腺激素)及其他蛋白质类干扰物质(凝血酶、免疫球蛋白G)。
[0072] (1)实验方案分两种，第一种方案：PSA标准品用PBS稀释至浓度为10ng/mL(对照组，PSA)，甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、人绒毛膜促性腺激素(HCG)、凝血酶(Thrombin)、免疫球蛋白G(IgG)标准品用PBS稀释至浓度为20ng/mL(实验组)；第二种方案：PSA标准品用PBS稀释至5ng/mL(对照组，PSA)和10ng/mL，甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、人绒毛膜促性腺激素(HCG)、凝血酶(Thrombin)、免疫球蛋白G(IgG)标准品用PBS稀释至浓度为40ng/mL，将PSA标准品(10ng/mL)分别与干扰物质(40ng/mL)等体积充分震荡混匀，得到混合溶液(实验组)，浓度比为1:4。
[0073] (2)在吸附有核酸适配体的基底上直接加入10μL上述的检测样品。将滴加好的样品用小烧杯盖上，尽量减少样品溶液的蒸发，并室温孵育30分钟。
[0074] (3)用激光共焦显微拉曼光谱仪(inVia Reflex，雷尼绍，英国)进行检测，检测参数：激发光：532nm；曝光时间：10s；5％功率衰减片，记录结合了蛋白后的单层石墨烯的G峰峰位，以此为纵坐标绘制柱状图。
[0075] 请参见图6，图6示出了识别PSA的核酸适配体与PSA、以及其他蛋白的结合比较结果的柱状图。如图6所示，第一种方案如图6中实心柱子所示，在样品中加入10ng/mL的PSA溶液和20ng/mL其他干扰物质，对照组和实验组差异显著，说明核酸适配体不会与其他干扰物质结合。第二种方案如图6中空心柱子所示，对照组样品中PSA浓度仅为5ng/mL，实验组分别为终浓度为20ng/mL干扰物质与5ng/mL PSA的混合溶液，结果显示对照组和实验组结果相近，表明其他干扰物质的存在对PSA的检测没有显著影响，表明实施例2获得的检测膜对PSA检测具有优异的特异性和良好的灵敏度。
[0076] 实施例5蛋白检测膜的制备。
[0077] (1)在SiO2/Si(300nm SiO2，1cm×1cm)片上，选用化学气相沉积法合成的单层石墨烯薄膜，形成石墨烯/SiO2/Si片，即基底。该基底从深圳六碳科技有限公司购买。
[0078] (2)将基底在磷酸盐缓冲溶液(10mM，pH 7.4)中浸泡2h，在氮气中干燥，去除多余水分。
[0079] (3)将凝血酶适配体冻干粉(SEQ ID NO:2，5'-AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT-3'，由上海生工生物(北京合成部)合成)用PBS(10mM，pH7.4)稀释至10μM。
[0080] (4)在基底滴加200μL的10μM适配体溶液，室温孵育至溶液完全蒸发。
[0081] (5)将基底用蒸馏水冲洗两次，除去未吸附的适配体，在氮气中干燥多余水分。
[0082] (6)用激光共焦显微拉曼光谱仪(inVia Reflex，雷尼绍，英国)进行检测，检测参数：激发光：532nm；曝光时间：10s；5％功率衰减片，记录吸附适配体后单层石墨烯的G峰峰位。检测结果请参见图7，图7示出了石墨烯以及结合核酸适配体的石墨烯的拉曼光谱图。如-1图7所示，在吸附核酸适配体后，单层石墨烯G峰正常模式的振动频率红移了4.97cm 。
[0083] (7)将凝血酶标准品在PBS中稀释至500nM，在基底上直接加入10μL500nM的凝血酶溶液。将滴加好的样品用小烧杯盖上，尽量减少样品溶液的蒸发，并室温孵育30分钟。
[0084] (8)用激光共焦显微拉曼光谱仪(inVia Reflex，雷尼绍，英国)进行检测，检测参数：激发光：532nm；曝光时间：10s；5％功率衰减片，记录吸附单层石墨烯的G峰峰位。检测结果请参见图8，图8示出了石墨烯以及石墨烯表面具有凝血酶的石墨烯的拉曼光谱图。如图8所示，单层石墨烯在加入凝血酶时前后，G峰的振动频率未发生变化，即不产生响应信号。可见，凝血酶不与石墨烯作用，蛋白检测膜中的石墨烯的G峰发生变化，是凝血酶与核酸适配体结合引起的。从另一个角度来说，即便石墨烯的表面非特异性地吸附了其他蛋白，例如凝血酶，并不影响本发明的蛋白检测膜检测目标蛋白(例如凝血酶)的准确性。
[0085] 实施例6基于核酸适配体的单层石墨烯G峰对不同浓度凝血酶的响应。
[0086] (1)将单层石墨烯/SiO2基底在磷酸盐缓冲溶液(10mM，pH 7.4)中浸泡2h，在氮气中干燥多余水分。
[0087] (2)将凝血酶适配体冻干粉(SEQ ID NO:2，5'-AGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT-3'，由上海生工生物(北京合成部)合成)用PBS(10mM，pH 7.4)稀释至10μM。
[0088] (3)在基底上滴加200μL的10μM核酸适配体溶液，室温孵育至溶液完全蒸发。
[0089] (4)将基底用蒸馏水冲洗两次，除去未吸附的核酸适配体，在氮气中干燥多余水分，得到吸附有适配体的基底。
[0090] (5)将凝血酶标准品在PBS中稀释至500nM、250nM、125nM。
[0091] (6)分别在吸附核酸适配体的单层石墨烯/SiO2基底上直接加入10μL上述系列浓度的凝血酶溶液。将滴加好的样品用小烧杯盖上，尽量减少样品溶液的蒸发，并室温孵育30分钟。
[0092] (7)用激光共焦显微拉曼光谱仪(inVia Reflex，雷尼绍，英国)进行检测，检测参数：激发光：532nm；曝光时间：10s；5％功率衰减片，记录结合了凝血酶的单层石墨烯的G峰峰位。
[0093] 实施例6的检测结果请参见图9，图9示出了不同浓度凝血酶对应的石墨烯G峰红移变化的谱图。如图9所示，将不同浓度的凝血酶溶液加入吸附适配体的基底上，凝血酶通过特异性结合适配体，引起单层石墨烯G峰的振动频率发生了红移，随着凝血酶浓度的增加，G峰频移改变量逐渐增大。基于此，可以实现对凝血酶定量检测。
[0094] 以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。
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