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一种包载蛋白类药物的脂质体的制备方法

阅读:529发布:2020-08-03

专利汇可以提供一种包载蛋白类药物的脂质体的制备方法专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种新的包载蛋白类药物的小粒径高包封率脂质体的制备方法,属于 生物 医药技术领域。其制备工艺为:a、将用于形成脂质体的脂类物质溶于有机溶媒,和蛋白溶液及适量 表面活性剂 按合适的比例混合,制得微乳相;b、将用于形成脂质体的脂类物质溶于有机溶媒,用 水 或缓冲液和醇按合适的比例混合水化,制得胶束相;c、将上述两相混合,b相逆转为反胶束,又在减压除去有机溶媒的过程中,b相再次发生逆转并最终 覆盖 于a相胶束表面,形成脂质体。本发明制得的包封蛋白类药物脂质体的平均粒径在80nm左右,包封率可达90%以上。该制备工艺过程简单,有利于降低生产成本,易于工业化生产。,下面是一种包载蛋白类药物的脂质体的制备方法专利的具体信息内容。

1.一种包载蛋白类药物的脂质体的制备方法,其特征在于:
a.将用于形成脂质体的脂类物质溶于有机溶媒,减压成膜后,再加入适量有机溶媒使膜复溶形成油相,并和药物溶液及表面活性剂按比例混合乳化,即得W/O型微乳,其中,油相、水相及表面活性剂的比例根据伪三元相图进行优选;
b.将用于形成脂质体的脂类物质溶于有机溶媒,减压成膜后,用水或缓冲液和醇按比例混合水化,即得胶束相;
c.将步骤a得到的W/O型微乳相和步骤b得到的胶束相混合,胶束相随即翻转成反胶束状态,随即,减压旋蒸及氮气吹扫除尽有机溶媒,胶束相反胶束再次发生逆转,并重新覆盖于微乳相胶束表面,得到脂质体;
步骤a中制备的微乳中药物水溶液与有机溶媒体积比小于1:5;
步骤a中表面活性剂选自Tween-80、Poloxamer、Cremophor EL、Cremophor RH40、Solutol HS15,或者为几种表面活性剂的混合物;
步骤a中的有机溶媒指与水混溶性低且易挥发除去的有机溶媒,或其混合物。
2.根据权利要求1所述的一种包载蛋白类药物的脂质体的制备方法,其特征在于:步骤a中制备的微乳中药物水溶液与有机溶媒体积比是1:8~1:25;步骤b中制备的胶束中,水和醇体积比为1:1~10:1。
3.根据权利要求1或2所述的一种包载蛋白类药物的脂质体的制备方法,其特征在于:
所述的步骤b中制备的胶束中,水和醇体积比为2:1~8:1。
4.根据权利要求1或2所述的一种包载蛋白类药物的脂质体的制备方法,其特征在于:
步骤a与b中所述脂质中磷脂的物质的量比小于1:1。
5.根据权利要求1或2所述的一种包载蛋白类药物的脂质体的制备方法,其特征在于:
步骤a与b中所述脂质中磷脂的物质的量比为1:3~4:5。
6.根据权利要求1或2中所述的一种包载蛋白类药物的脂质体的制备方法,其特征在于:步骤b中的有机溶媒指与水混溶性低且易挥发除去的有机溶媒,或其混合物。
7.根据权利要求3所述的一种包载蛋白类药物的脂质体的制备方法,其特征在于:步骤b中的有机溶媒指与水混溶性低且易挥发除去的有机溶媒,或其混合物。
8.根据权利要求4中所述的一种包载蛋白类药物的脂质体的制备方法,其特征在于:步骤b中的有机溶媒指与水混溶性低且易挥发除去的有机溶媒,或其混合物。
9.根据权利要求5所述的一种包载蛋白类药物的脂质体的制备方法,其特征在于:步骤b中的有机溶媒指与水混溶性低且易挥发除去的有机溶媒,或其混合物。
10.根据权利要求1、2、7、8或9所述的一种包载蛋白类药物的脂质体的制备方法,其特征在于:所述易挥发的有机溶媒为乙醚、氯仿或二氯甲烷。
11.根据权利要求6所述的一种包载蛋白类药物的脂质体的制备方法,其特征在于:所述易挥发的有机溶媒为乙醚、氯仿或二氯甲烷。
12.根据权利要求1、2、7-9、11中任何一项所述的一种包载蛋白类药物的脂质体的制备方法,其特征在于:步骤a中的乳化是指搅拌,或振荡,或匀乳,或超声机械做功操作,或为搅拌、振荡、匀乳、超声组合操作,或为处方成分自动乳化。
13.根据权利要求3所述的一种包载蛋白类药物的脂质体的制备方法,其特征在于:步骤a中的乳化是指搅拌,或振荡,或匀乳,或超声机械做功操作,或为搅拌、振荡、匀乳、超声组合操作,或为处方成分自动乳化。
14.根据权利要求4所述的一种包载蛋白类药物的脂质体的制备方法,其特征在于:步骤a中的乳化是指搅拌,或振荡,或匀乳,或超声机械做功操作,或为搅拌、振荡、匀乳、超声组合操作,或为处方成分自动乳化。
15.根据权利要求5所述的一种包载蛋白类药物的脂质体的制备方法,其特征在于:步骤a中的乳化是指搅拌,或振荡,或匀乳,或超声机械做功操作,或为搅拌、振荡、匀乳、超声组合操作,或为处方成分自动乳化。
16.根据权利要求6所述的一种包载蛋白类药物的脂质体的制备方法,其特征在于:步骤a中的乳化是指搅拌,或振荡,或匀乳,或超声机械做功操作,或为搅拌、振荡、匀乳、超声组合操作,或为处方成分自动乳化。
17.根据权利要求10所述的一种包载蛋白类药物的脂质体的制备方法,其特征在于:步骤a中的乳化是指搅拌,或振荡,或匀乳,或超声机械做功操作,或为搅拌、振荡、匀乳、超声组合操作,或为处方成分自动乳化。
18.根据权利要求12所述的一种包载蛋白类药物的脂质体的制备方法,其特征在于:所述的振荡为涡旋振荡,匀乳为高压匀乳。
19.根据权利要求13-17任何一项所述的一种包载蛋白类药物的脂质体的制备方法,其特征在于:所述的振荡为涡旋振荡,匀乳为高压匀乳。
20.根据权利要求1、2、7-9、11、13-18任何一项所述的一种包载蛋白类药物的脂质体的制备方法,其特征在于:步骤b中的水化,采用蒸馏水或缓冲液与醇在适宜的温度下完成,或在机械的作用下完成,所述的缓冲液选自磷酸盐缓冲液系统、枸橼酸盐缓冲液系统、酸盐缓冲液系统,所述的醇选自乙醇、丙二醇、聚乙二醇200、聚乙二醇400。
21.根据权利要求3所述的一种包载蛋白类药物的脂质体的制备方法,其特征在于:步骤b中的水化,采用蒸馏水或缓冲液与醇在适宜的温度下完成,或在机械力的作用下完成,所述的缓冲液选自磷酸盐缓冲液系统、枸橼酸盐缓冲液系统、碳酸盐缓冲液系统,所述的醇选自乙醇、丙二醇、聚乙二醇200、聚乙二醇400。
22.根据权利要求4所述的一种包载蛋白类药物的脂质体的制备方法,其特征在于:步骤b中的水化,采用蒸馏水或缓冲液与醇在适宜的温度下完成,或在机械力的作用下完成,所述的缓冲液选自磷酸盐缓冲液系统、枸橼酸盐缓冲液系统、碳酸盐缓冲液系统,所述的醇选自乙醇、丙二醇、聚乙二醇200、聚乙二醇400。
23.根据权利要求5所述的一种包载蛋白类药物的脂质体的制备方法,其特征在于:步骤b中的水化,采用蒸馏水或缓冲液与醇在适宜的温度下完成,或在机械力的作用下完成,所述的缓冲液选自磷酸盐缓冲液系统、枸橼酸盐缓冲液系统、碳酸盐缓冲液系统,所述的醇选自乙醇、丙二醇、聚乙二醇200、聚乙二醇400。
24.根据权利要求6所述的一种包载蛋白类药物的脂质体的制备方法,其特征在于:步骤b中的水化,采用蒸馏水或缓冲液与醇在适宜的温度下完成,或在机械力的作用下完成,所述的缓冲液选自磷酸盐缓冲液系统、枸橼酸盐缓冲液系统、碳酸盐缓冲液系统,所述的醇选自乙醇、丙二醇、聚乙二醇200、聚乙二醇400。
25.根据权利要求10所述的一种包载蛋白类药物的脂质体的制备方法,其特征在于:步骤b中的水化,采用蒸馏水或缓冲液与醇在适宜的温度下完成,或在机械力的作用下完成,所述的缓冲液选自磷酸盐缓冲液系统、枸橼酸盐缓冲液系统、碳酸盐缓冲液系统,所述的醇选自乙醇、丙二醇、聚乙二醇200、聚乙二醇400。
26.根据权利要求12所述的一种包载蛋白类药物的脂质体的制备方法,其特征在于:步骤b中的水化,采用蒸馏水或缓冲液与醇在适宜的温度下完成,或在机械力的作用下完成,所述的缓冲液选自磷酸盐缓冲液系统、枸橼酸盐缓冲液系统、碳酸盐缓冲液系统,所述的醇选自乙醇、丙二醇、聚乙二醇200、聚乙二醇400。
27.根据权利要求19所述的一种包载蛋白类药物的脂质体的制备方法,其特征在于:步骤b中的水化,采用蒸馏水或缓冲液与醇在适宜的温度下完成,或在机械力的作用下完成,所述的缓冲液选自磷酸盐缓冲液系统、枸橼酸盐缓冲液系统、碳酸盐缓冲液系统,所述的醇选自乙醇、丙二醇、聚乙二醇200、聚乙二醇400。
28.根据权利要求1、2、7-9、11、13-18、21-27任何一项所述的一种包载蛋白类药物的脂质体的制备方法,其特征在于:步骤a、b中所述脂类物质是天然或人工合成的磷脂,调节磷脂膜性质的胆固醇,以及不同脂类的混合物;所述的磷脂选自磷脂酰胆、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、二磷脂酰甘油,二肉豆蔻酰卵磷酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸,二棕榈酰磷脂酰甘油,二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺,二硬脂酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰甘油,二硬脂酰磷脂酰乙醇胺;二油酰磷脂酰甘油、二油酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰乙醇胺、氢化豆磷脂;所述的调节磷脂膜性质的胆固醇包括胆固醇、胆固醇琥珀酸酯、胺基甲酰基胆固醇、植物甾醇及其混合物。
29.根据权利要求3所述的一种包载蛋白类药物的脂质体的制备方法,其特征在于:步骤a、b中所述脂类物质是天然或人工合成的磷脂,调节磷脂膜性质的胆固醇,以及不同脂类的混合物;所述的磷脂选自磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、二磷脂酰甘油,二肉豆蔻酰卵磷酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸,二棕榈酰磷脂酰甘油,二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺,二硬脂酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰甘油,二硬脂酰磷脂酰乙醇胺;二油酰磷脂酰甘油、二油酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰乙醇胺、氢化豆磷脂;所述的调节磷脂膜性质的胆固醇包括胆固醇、胆固醇琥珀酸酯、胺基甲酰基胆固醇、植物甾醇及其混合物。
30.根据权利要求4所述的一种包载蛋白类药物的脂质体的制备方法,其特征在于:步骤a、b中所述脂类物质是天然或人工合成的磷脂,调节磷脂膜性质的胆固醇,以及不同脂类的混合物;所述的磷脂选自磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、二磷脂酰甘油,二肉豆蔻酰卵磷酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸,二棕榈酰磷脂酰甘油,二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺,二硬脂酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰甘油,二硬脂酰磷脂酰乙醇胺;二油酰磷脂酰甘油、二油酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰乙醇胺、氢化豆磷脂;所述的调节磷脂膜性质的胆固醇包括胆固醇、胆固醇琥珀酸酯、胺基甲酰基胆固醇、植物甾醇及其混合物。
31.根据权利要求5所述的一种包载蛋白类药物的脂质体的制备方法,其特征在于:步骤a、b中所述脂类物质是天然或人工合成的磷脂,调节磷脂膜性质的胆固醇,以及不同脂类的混合物;所述的磷脂选自磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、二磷脂酰甘油,二肉豆蔻酰卵磷酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸,二棕榈酰磷脂酰甘油,二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺,二硬脂酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰甘油,二硬脂酰磷脂酰乙醇胺;二油酰磷脂酰甘油、二油酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰乙醇胺、氢化豆磷脂;所述的调节磷脂膜性质的胆固醇包括胆固醇、胆固醇琥珀酸酯、胺基甲酰基胆固醇、植物甾醇及其混合物。
32.根据权利要求6所述的一种包载蛋白类药物的脂质体的制备方法,其特征在于:步骤a、b中所述脂类物质是天然或人工合成的磷脂,调节磷脂膜性质的胆固醇,以及不同脂类的混合物;所述的磷脂选自磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、二磷脂酰甘油,二肉豆蔻酰卵磷酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸,二棕榈酰磷脂酰甘油,二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺,二硬脂酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰甘油,二硬脂酰磷脂酰乙醇胺;二油酰磷脂酰甘油、二油酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰乙醇胺、氢化豆磷脂;所述的调节磷脂膜性质的胆固醇包括胆固醇、胆固醇琥珀酸酯、胺基甲酰基胆固醇、植物甾醇及其混合物。
33.根据权利要求10所述的一种包载蛋白类药物的脂质体的制备方法,其特征在于:步骤a、b中所述脂类物质是天然或人工合成的磷脂,调节磷脂膜性质的胆固醇,以及不同脂类的混合物;所述的磷脂选自磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、二磷脂酰甘油,二肉豆蔻酰卵磷酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸,二棕榈酰磷脂酰甘油,二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺,二硬脂酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰甘油,二硬脂酰磷脂酰乙醇胺;二油酰磷脂酰甘油、二油酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰乙醇胺、氢化豆磷脂;所述的调节磷脂膜性质的胆固醇包括胆固醇、胆固醇琥珀酸酯、胺基甲酰基胆固醇、植物甾醇及其混合物。
34.根据权利要求12所述的一种包载蛋白类药物的脂质体的制备方法,其特征在于:步骤a、b中所述脂类物质是天然或人工合成的磷脂,调节磷脂膜性质的胆固醇,以及不同脂类的混合物;所述的磷脂选自磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、二磷脂酰甘油,二肉豆蔻酰卵磷酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸,二棕榈酰磷脂酰甘油,二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺,二硬脂酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰甘油,二硬脂酰磷脂酰乙醇胺;二油酰磷脂酰甘油、二油酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰乙醇胺、氢化豆磷脂;所述的调节磷脂膜性质的胆固醇包括胆固醇、胆固醇琥珀酸酯、胺基甲酰基胆固醇、植物甾醇及其混合物。
35.根据权利要求19所述的一种包载蛋白类药物的脂质体的制备方法,其特征在于:步骤a、b中所述脂类物质是天然或人工合成的磷脂,调节磷脂膜性质的胆固醇,以及不同脂类的混合物;所述的磷脂选自磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、二磷脂酰甘油,二肉豆蔻酰卵磷酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸,二棕榈酰磷脂酰甘油,二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺,二硬脂酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰甘油,二硬脂酰磷脂酰乙醇胺;二油酰磷脂酰甘油、二油酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰乙醇胺、氢化豆磷脂;所述的调节磷脂膜性质的胆固醇包括胆固醇、胆固醇琥珀酸酯、胺基甲酰基胆固醇、植物甾醇及其混合物。
36.根据权利要求1、2、7-9、11、13-18、21-27、29-35任何一项所述的一种包载蛋白类药物的脂质体的制备方法,其特征在于,还加入适量正电荷脂质,选自硬脂酰胺、油酰基脂肪胺衍生物、胆固醇衍生物。
37.根据权利要求1、2、7-9、11、13-18、21-27、29-35任何一项所述的一种包载蛋白类药物的脂质体的制备方法,其特征在于:还加入脂溶性抗化剂。
38.根据权利要求1、2、7-9、11、13-18、21-27、29-35任何一项所述的一种包载蛋白类药物的脂质体的制备方法,其特征在于:将步骤c中得到的脂质体除菌过滤,其它步骤采用无菌操作完成。

说明书全文

一种包载蛋白类药物的脂质体的制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及生物制药领域,确切的说是一种新型蛋白类药物的小粒径高包封率脂质体的制备方法。

背景技术

[0002] 纳米脂质体(nanoliposomes)是指粒径小于100nm的脂质体,结构多为单室脂质体,在稳定性、吸收和体内分布等方面具有纳米粒子的特殊效应,可以携带亲性、疏水性及两亲性药物,直接输送至靶组织发挥药效作用,从而提高药物的治疗指数、减少药物的治疗剂量和降低药物的毒性。
[0003] 目前,脂质体的制备方法有:逆向蒸发法、薄膜分散法、乙醇注入法、主动载药法等,但这些方法都存在对蛋白类药物包封率低、粒径不可控制、操作过于复杂等不足。例如:逆向蒸发法,常用于包裹大分子水溶性药物,但制得的脂质体粒径较大且分布不均;薄膜分散法,在水化过程中,脂质发生溶胀并被一层层洗脱,导致脂质膜层与层之间药物分布不均匀,水溶性药物包封率较低;乙醇注入法,需要在较高温度下制备,并易导致蛋白类药物的结构改变或活性丧失;主动载药法,制备脂质体包封率虽有所提高、但操作较为繁琐、重现性差、且仅适用于可离子化的药物、应用范围相对有限。侯冬枝等在“血清白蛋白脂质体包封率的测定方法研究”([J].药学学报,2007,42(5):545-549)中通过逆向蒸发法制得牛血清白蛋白脂质体的包封率为32.5%;梁晓晖等在“肝靶向牛血清白蛋白脂质体的制备及理化性质研究”([J].南京医科大学学报:自然科学版,2008,28(10):1229-1233)中先采用逆相蒸发法制备负电荷脂质体,再用O-羧甲基-N-乳糖酰化壳聚糖修饰,制备肝靶向脂质体的平均粒径为284.1nm,包封率为34.21%。包封率低不但会造成原料的浪费,而且可能达不到有效剂量,不能够体现脂质体制剂的优势。公开号为CN1633990A一种对水溶性药物有较高包封率的脂质体制备方法的专利中,在逆向蒸发法制备凝胶状脂质后,通过在优化的电场条件下得到的脂质体对水溶性药物的包封率可以达到70%。采用逆向蒸发法制备水溶性药物脂质体包封率较低的原因是在完成连续相从油相到水相的转变过程中,药物泄漏至水相所致,本专利设计的出发点就是希望克服药物的泄露过程,从而得到较高的包封率。

发明内容

[0004] 为了克服上述脂质体制备技术的不足,我们发明了一种新的包载蛋白类药物小粒径高包封率脂质体的制备方法,并将微乳及胶束的形成理论引入到脂质体的制备中,以提高脂质体对蛋白类药物的包封率。将该方法称为双层胶束逆转法。该制备方法包括以下步骤:
[0005] a.将用于形成脂质体的脂类物质溶于有机溶媒减压蒸发成膜后加入适量有机溶媒使膜复溶,并和药物的水溶液及表面活性剂按伪三元相图优选比例进行混合并乳化,得W/O型微乳;
[0006] b.将用于形成脂质体的脂类物质溶于有机溶媒减压蒸发成膜,将水或缓冲液(磷酸盐、枸橼酸盐或酸盐缓冲液系统)及醇按合适的比例混合水化即得胶束相。
[0007] c.将步骤a得到的W/O型微乳及步骤b得到的胶束相混合,胶束相随即翻转成反胶束状态,随即,减压旋蒸及氮气吹扫除尽有机溶媒,胶束相反胶束再次发生逆转,并重新覆盖于微乳相胶束表面,得到脂质体;
[0008] d.减小并均化粒径即得。
[0009] 下面我们将就该技术的具体操作进行详细的描述。
[0010] 步骤a、b中的有机溶媒指与水混溶性低、易挥发除去的有机溶媒,或其混合物,优选低沸点易挥发的有机溶媒,如乙醚、氯仿、二氯甲烷等。
[0011] 用于形成脂质体的脂类物质主要包括:天然或人工合成的磷脂,调节磷脂膜性质的胆固醇;以及不同脂类的混合物;所述的磷脂选自磷脂酰胆、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、二磷脂酰甘油,二肉豆蔻酰卵磷酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸,二棕榈酰磷脂酰甘油,二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺,二硬脂酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰甘油,二硬脂酰磷脂酰乙醇胺;二油酰磷脂酰甘油、二油酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰乙醇胺、氢化豆磷脂;所述的调节磷脂膜性质的胆固醇选自胆固醇、胆固醇琥珀酸酯、胺基甲酰基胆固醇、植物甾醇及其混合物。步骤a与b中所述脂质中磷脂的物质的量比小于1:1,优选1:3~4:5。
[0012] 所述的蛋白类药物选自通过化学合成或基因重组技术或生物提取方式获得的水溶性蛋白药物,可选牛血清白蛋白、卵清蛋白、胸腺五肽、胰岛素、降素等。
[0013] 为了提高待包封蛋白类药物的包封率,还可加入正电荷脂质,如:硬脂酰胺、油酰基脂肪胺衍生物、胆固醇衍生物等,通过电荷作用实现蛋白类药物的装载。
[0014] 为了提高磷脂的抗化能,也可加入脂溶性抗氧化剂
[0015] 进一步地,步骤a中必须得到稳定有淡蓝色乳光的W/O型微乳。步骤a制备的微乳中,药物水溶液与有机溶媒体积比小于1:5,优选的比例是1:8~1:25;步骤b中制备的胶束,水和醇体积比为1:1~10:1,优选的比例是2:1~8:1。
[0016] 步骤a中的乳化指的是搅拌,或振荡,或匀乳,或超声机械做功操作,或为搅拌、振荡、匀乳、超声组合操作,或为处方成分自动乳化。所述的振荡优选涡旋振荡,匀乳优选高压匀乳,W/O型微乳可以采用伪三元相图进行优化,制得澄明或淡蓝色乳光的均一稳定乳剂,如果有机溶媒和药物的水溶液比例不合适,则乳剂不稳定,分层沉淀,无法将待包封物质包封于内水相,从而导致包封率降低。
[0017] 步骤b中水化,可采用蒸馏水或缓冲液及醇在适宜的温度下完成,为加速水化,也可以在机械力的作用下完成,如可以进行搅拌或振荡,所述的缓冲液选自磷酸盐、枸橼酸盐或碳酸盐缓冲液系统。
[0018] 步骤a中表面活性剂包括Tween-80、Poloxamer、Cremophor EL、Cremophor RH40、Solutol HS15等非离子型表面活性剂,或者为几种表面活性剂的混合物。
[0019] 步骤b中所用的醇包括乙醇、丙二醇、聚乙二醇200、聚乙二醇400等常用助表面活性剂。
[0020] 为了得到无菌制剂,可将步骤c中得到的脂质体除菌过滤,其它步骤采用无菌操作完成。
[0021] 本发明中提到的待包封物质,可以是水溶性蛋白类药物,也可以是其它物质,如多肽、DNA、RNA等。
[0022] 本发明的制备工艺具有如下优点:
[0023] 脂质体工业化生产必须解决几个问题,例如:灭菌、除热原、生产工艺简单便于放大,保证脂质体在储藏期内稳定等。而我们发明的制备工艺可以解决上述问题:1)可将步骤c中得到的脂质体除菌过滤,其它步骤采用无菌操作完成;2)工艺相对简单,只需简单乳化、水化及均质等常用设备,易于放大;3)所得脂质体外观澄清,有淡蓝色乳光,质量稳定,并对其稳定性进行考察,经过6个月的加速试验表明质量无明显变化。
[0024] 本发明可以有效控制脂质体粒径,只需均质处理,即可得到粒度均一的小粒径脂质体,增加了本发明的应用价值。
[0025] 本制备方法对蛋白类药物包封率大于90%。由于蛋白类药物始终包含于微乳的内水相、有序磷脂层内部、再通过反胶束相逆转二次包封,大大提高了单位质量脂质的药物携带量,因此包封率较高。同时,我们的制备工艺可以充分保证蛋白类药物的活性。由于制备工艺在低温下完成,避免了药物的水解和氧化,且蛋白类药物不直接接触有机溶媒,因此具有良好的生物活性以及物理稳定性。附图说明
[0026] 图1为EL-PC-水的三元相图。
[0027] 图2为EL/PC=4:6的三元相图。
[0028] 图3为EL/PC=3:7的三元相图。

具体实施方式

[0029] 通过下列实例举例说明本发明的具体制备方法,但本发明的保护范围,不局限于此。
[0030] 实施例1:
[0031] 本实施例为采用本发明提出的方法制备牛血清白蛋白纳米脂质体。步骤a:微乳相的制备。称取12mg磷脂酰胆碱,加入5ml乙醚,减压蒸发成膜。加入5ml乙醚使膜复溶,并加入Cremophor EL8mg,在磁力搅拌下滴加0.2ml浓度为2mg/ml牛血清白蛋白水溶液至淡蓝色乳光,即得微乳相。油相、水相及表面活性剂的比例采用伪三元相图进行优化:以Cremophor EL和磷脂为混合乳化剂按照Km为9:1、8:2、7:3、6:4、5:5、4:6、3:7、2:8、1:9混合均匀,乙醚为油相,在磁力搅拌下逐滴加入蒸馏水,观察体系由浊至清或由清至浊的现象,记录临界点时的各组分百分比,由图1可见在Km=4:6或3:7附近可得微乳;再分别以Cremophor EL和磷脂为4:6和3:7为一个顶点,乙醚和水为另外两个顶点,得到乳化剂-乙醚-水的三元相图,见图2和图3,优选。
[0032] 步骤b:胶束相的制备。称取24mg磷脂酰胆碱,6mg胆固醇,加入适量乙醚,减压蒸发成膜。加入2ml蒸馏水和0.5ml乙醇于40℃水化,即得胶束相;
[0033] 步骤c:胶束相加入微乳相中,涡旋5min,超声10min后,40℃旋转蒸发除去乙醚,通过氮气吹扫进一步除尽体系中残留的乙醚,得到纳米脂质体,并采用高压乳匀的方式进一步减小粒径。采用动态光散射法测定牛血清白蛋白纳米脂质体的平均粒径为62.7nm,Sepharose4B琼脂糖凝胶柱测得包封率为91.34%。
[0034] 实施例2
[0035] 步骤a:微乳相的制备。称取24mg磷脂酰胆碱,加入二氯甲烷,减压蒸发成膜。加入9ml乙醚使膜复溶,并加入Cremophor EL16mg,在磁力搅拌下滴加0.6ml浓度为1mg/ml牛血清白蛋白水溶液至淡蓝色乳光,即得微乳相。
[0036] 步骤b:胶束相的制备。称取30mg磷脂酰胆碱,5mg胆固醇,5mg胆固醇琥珀酸酯,加入适量二氯甲烷,减压蒸发成膜。加入4ml蒸馏水和0.5m丙二醇于50℃水化,即得胶束相;
[0037] 步骤c:胶束相加入微乳相中,浴下探头超声10min后,30℃旋转蒸发除去乙醚,通过氮气吹扫进一步除尽体系中残留的乙醚,得到纳米脂质体。测得牛血清白蛋白纳米脂质体的平均粒径为78.06nm,Sepharose4B琼脂糖凝胶柱测得包封率为90.45%。
[0038] 实施例3
[0039] 卵清蛋白纳米脂质体的制备。步骤a:微乳相的制备。称取磷脂酰胆碱14mg,加入5ml二氯甲烷,减压蒸发成膜。加入5ml乙醚使膜复溶,并加入Cremophor RH406mg,在磁力搅拌下滴加0.5ml浓度为3mg/ml卵清蛋白磷酸盐缓冲液至淡蓝色乳光,即得微乳相。
[0040] 步骤b:胶束相的制备。称取二硬脂酰磷脂酰乙醇胺42mg,正电性脂质氨基甲酰基胆固醇5mg,胆固醇琥珀酸酯5mg,加入适量二氯甲烷,减压蒸发成膜。加入2ml磷酸盐缓冲液和1ml乙醇于60℃水化,即得胶束相;
[0041] 步骤c:按实施例1中步骤c操作,测定卵清蛋白纳米脂质体的平均粒径为68.68nm,Sepharose4B琼脂糖凝胶柱测得包封率为92.17%。
[0042] 实施例4:
[0043] 胸腺五肽脂质体的制备。步骤a:微乳相的制备。称取18mg二油酰基磷脂酰乙醇胺,加入5ml乙醚,减压蒸发成膜。加入4ml乙醚、4ml二氯甲烷使膜复溶,Solutol HS15加入10mg,在磁力搅拌下滴加1ml浓度为4mg/ml的胸腺五肽水溶液至淡蓝色乳光,即得微乳相。
[0044] 步骤b:胶束相的制备。称取30mg二油酰基磷脂酰乙醇胺,10mg胆固醇,加入适量乙醚,减压蒸发成膜。加入2ml枸橼酸盐缓冲液和0.2ml丙二醇于60℃水化,即得胶束相;
[0045] 步骤c:按照实施例2中步骤c操作,测定胸腺五肽纳米脂质体的平均粒径为74.54nm,Sepharose4B琼脂糖凝胶柱测得包封率为90.01%。
[0046] 对比实施例
[0047] 采用传统的逆向蒸发法制备牛血清白蛋白脂质体。称取磷脂酰胆碱40mg,胆固醇20mg,加入5ml乙醚,减压蒸发成膜。加入5ml乙醚使膜复溶,在室温下滴入0.5ml浓度为2mg/ml的牛血清白蛋白磷酸盐缓冲液,磁力搅拌15min成乳状,涡旋5min,水浴超声10min后,减压蒸发除有机溶剂至胶态继续蒸发至凝胶崩解,停止减压蒸发,加入2ml的pH=7.4的磷酸盐缓冲液,在40℃下水化,既得脂质体。采用实施例1步骤c中高压乳匀的方式减小粒径后,得到牛血清白蛋白脂质体的平均粒径是203.3nm,包封率为35.48%。
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