技术领域
[0001] 本
发明属于
生物检测领域，具体而言，涉及一种用于检测动物源食品中残留药物的液质数据库及其使用方法。
背景技术
[0002] 动物源食品在国际农产品贸易中占相当比重，针对动物源食品中药物残留的法规限制越来越严格，以日本06年5月实施的“肯定列表”制度为例，其对236种兽药和
饲料添加剂制定了具体限量标准，而在国内
食品安全领域，从早期的“氯霉素、硝基呋喃”到后来的“孔雀石绿、瘦肉精”，因药物残留导致的食品安全事件频发凸显我国食品安全监管控制体系技术
支撑能
力不足，迫切需要建立多种类残留快速筛选方法。目前，针对动物源食品中药物残留检测技术和方法已由单残留分析发展到了单种类多残留分析，03年以来，以物质种类界分的多残留检测标准占据了残留分析国家和行业标准的70％以上。同时期，质谱分析已经成为多残留检测的主要技术手段，以欧盟2002/657/EC法规为蓝本的技术指标规则也为国际上所承认和接受。随着残留分析技术的发展，多种类残留分析在信息量、检测效率等多方面具有优势使其成为研发热点，且质谱设备领域如Q-TOF，Q-Trap等
串联质谱仪的实用化，以高级质谱技术为
基础的谱库比对分析逐渐成熟也为多种类残留快速分析提供了技术可能。然而，无论是在方法开发、验证和标准化还是在法规完善等方面，同时检测多种类残留都存在较多困难：
[0003] (1)不同种类兽药物化性质差别很大，极性
覆盖范围宽，在不同基质中残留形态不一，个别兽药尚需衍生化方能有效检测，因此在通用前处理方法和色谱一次进样分析上难以实现有效突破；
[0004] (2)法规对不同兽药(禁用药物和限用药物)的限量要求和使用规定不一，多种类残留检测验证规则尚未完善；
[0005] (3)方法开发需要的空白基质难以获得，混合标准溶液制备困难；
[0006] (4)仪器的分析能力。在构建液质谱库方面，尽管有商业化谱库如AB公司法医毒物数据库(1250种目标分析物)、兽药数据库(139种目标分析物)；Freiburg大学医院的小分子药物数据库等，但存在如下应用局限：
[0007] 1)仅有MS/MS数据，无色谱体系信息特征；
[0008] 2)无在线信息特征；
[0009] 3)无统一前处理方法和仪器分析相偶联；
[0010] 4)缺乏基质标准数据。
[0011] 因此，在现有条件下，很难有效实现基于液质谱库技术的多种类残留快速筛查分析。
发明内容
[0012] 鉴于目前国内外在动物源食品多种类残留药物分析中存在的样品通用性前处理、仪器快速分析和筛选方法验证等技术难点。本发明以建立动物源食品中高
风险药物多种类残留快速筛选检测体系为目的，通过采用多
溶剂体系分段组合提取、建立样品高通量通用性前处理技术、综合优化色谱体系实现多目标分析物宽极性范围液相色谱有效保留与分离、并通过构建涵盖色谱-质谱多维信息的液相色谱-质谱/质谱数据库及依据法规要求和检测实践进行筛选方法验证等关键技术内容的研发，突破多种类残留分析技术难关，建立一个以多种类残留通用性前处理技术、快速分离体系和液质谱库为技术特征的开放性快速分析平台和有效筛查检测技术体系。
[0013] 本发明针对12种限量值在1.0μg/kg以下高风险残留药物(A类残留物质)作为检测目标，该组药物分别为，
[0014] (1)甾体
激素类化合物：睾
酮(T)、泼尼松龙(PNSL)、倍他米松(BTS)、地塞米松(DTS)；
[0015] (2)硝基咪唑类药物及其代谢产物：甲硝哒唑(MNZ)、咯硝哒唑(RNZ)、二甲硝咪唑(DMZ)；
[0016] (3)Beta-受体激动剂类物质：克伦特罗(CLB)、妥布特罗(TUL)、西
马特罗(CIM)；
[0017] (4)染料类物质：结晶紫(CV)和隐色结晶紫(LCV)；
[0018] 本发明首先涉及一种检测动物源食品中高风险药物多种类残留的快速筛选液质谱库的构建方法，所述的动物源食品为禽蛋类食品或蜂蜜类食品，具体包括如下步骤，[0019] (1)标准工作溶液的制备；
[0020] 甾体激素类化合物、硝基咪唑类药物及其代谢产物、Beta-受体激动剂类物质：采用乙腈分类配制其混合标准储备溶液(0.01g/L)；
[0021] 染料类等物质采用甲醇分类配制其混合标准储备溶液(0.01g/L)；
[0022] 混合和标准工作溶液(0.1mg/L)，分别移取睾酮、泼尼松龙、倍他米松、地塞米松、甲硝唑、咯硝哒唑、二甲硝咪唑、克伦特罗、妥布特罗、西马特罗、结晶紫和隐色结晶紫标准储备溶液适量，用乙腈配制浓度为0.1mg/L的混合标准溶液；
[0023] (2)分析前处理，采用快速酶解(释放结合态残留)+快速固相萃取(SPE)的提取
净化技术进行待测样本分析前处理工作，具体的提取净化过程如下：
[0024] 1)提取：称取均质样品5g，置于50mL聚四氟乙烯离心管中，加入乙酸铵缓冲液(0.2mol/L,pH 5.2)15mL，β-葡糖苷酸/
硫酸酯酶50μL，涡旋混匀，50℃
水浴振荡2h，放冷至室温，于0℃，15000rpm离心5min，转移上清至另一干净离心管中，用NaOH溶液(5mol/L)调节pH至9.0，再加入乙酸乙酯20mL,
氯化钠6g，振荡涡旋5min，于0℃，15000rpm离心5min，取上层有机相35℃旋蒸至近干，氮气吹干，残渣使用5mL 0.1mol/L
盐酸溶液溶解，超声1min，留待上柱净化；
[0025] 2)净化：MCX柱(Waters Oasis MCX SPE小柱)安装于固相萃取装置上(该装置在实用新型
专利CN201020014620.X中有详细记载)，依次使用甲醇3mL，水3mL，3mL 0.1mol/L盐
酸溶液活化。将提取溶液加载在固相萃取柱上，在重力作用下流出，依次使用3mL水，3mL甲醇和5mL正己烷淋洗小柱，抽干2min，加入6mL洗脱液(乙酸乙酯50mL，甲醇45mL，
氨水5mL，混匀)洗脱。洗脱液35℃下氮气流吹干，使用样品溶解液(量取0.1％
甲酸乙腈(V/V)溶液5mL，与甲酸铵(5mmol/L)-甲酸(0.1％)-水溶液95mL混匀)0.5mL溶解残渣，超声1min，过0.22μM微孔滤膜；所述的固相萃取装置整合
试剂架、氮吹仪的功能且操作压力相对均匀，其由试剂架、操作台、8个玻璃仓、8个梨形瓶和1个自动吸气装置组成，可实现目标分析物的快速SPE过程。
[0026] (3)一次性进样色谱分析
[0027] 使用色谱柱为Kinetex C18柱，采用乙腈为有机相，甲酸作为
离子化增强剂，
甲酸盐作为峰形优化剂，以水相/酸性乙腈的组合作为优化的流动相体系；
[0028] 具体条件为：色谱柱：Kinetex C18,2.6μm，2.1mm×100mm i.d.；
[0029] 流速：0.2mL/min；
[0030] 进样量：10μL；
[0031] 柱温：30℃；
[0032] 梯度洗脱程序：(A：0.1％甲酸-乙腈溶液；B：甲酸铵(5mmol/L)-甲酸(0.1％)-水溶液)
[0033] 0～2min：5％A；
[0034] ～8min：20％A；
[0035] ～15min：95％A；
[0036] ～16min：100％A；
[0037] ～19min：100％A；
[0038] 20min：5％A；
[0039] (4)构建液质谱库
[0040] 采用四级杆/
离子阱串联质谱的高级采集模式：预设定多反应检测(sMRM)-信息依赖性采集(IDA)-增强子离子扫描(EPI)；
[0041] 质谱参数确定过程如下：使用初始流动相按目标分析物类别稀释混标储备溶液至浓度为0.2mg/L，然后使用恒流注射
泵以5μL/min的流速注入质谱离子源中进行参数优化，
[0042] 分别使用Q1MS、Q1Multiple Ions、Product Ion、MRM等扫描模式确定目标分析物的母离子，子离子，并使用Ramp功能优化并确定解聚
电压(DP)、碰撞室入口电压(EP)、碰撞
能量(CE)、碰撞室出口电压(CXP)等化合物参数；
[0043] 质谱条件(API 4000和API 4000Q-TRAP)：
[0044] a)离子源：电喷雾离子源；
[0045] b)扫描方式：正离子扫描；
[0046] c)检测方式：sMRM-IDA-EPI
[0047] d)电喷雾电压：5500V；
[0048] e)雾化气压力：40psi；
[0049] f)气帘气压力：30psi；
[0050] g)辅助气压力：45psi；
[0052] i)sMRM参数设置：MRM检测窗口设为60s，目标物扫描时间设为1.4s；
[0053] j)IDA规则：响应
阈值：3000cps；动态背景扣除；最强离子选择为1到3；
[0054] k)增强子离子扫描(EPI)参数设置：扫描
质量数范围为70～1000Da；扫描速度为10000Da/s；扫描累加次数为1；碰撞能量为35eV；扩展碰撞能量为15eV；
[0055] 将针对12种A类物质的质谱结果，构建液质谱库。
[0056] 数据库的构建中使用的建库
软件是AB SCIEX公司的Analyst1.5，建库的标准根据设计思路设定为：
[0057] (1)给出每个目标分析物使用本研究设定液相色谱条件体系下的RT值；
[0058] (2)给出每个目标分析物的相关化学信息(如名称、化学式、分子量、CAS号、化合物类别、ID、分子结构式等)；
[0059] (3)给出每个目标分析物至少5张不同条件下的按照3.2.2项所述采集的EPI谱图，即CE为20eV、35eV、50eV及CE为35eV、CES为15eV时4张EPI谱图，此外，至少还要有一张在色谱条件下CE为35eV、CES为15eV时的EPI谱图；
[0060] (4)尽量给出不同基质中目标分析物的EPI谱图。
[0061] 前3条建库标准是必须满足的条件，第4条为根据实际情况的可选标准。
[0062] 根据以上条件选用的色谱体系和质谱条件实现了包含本发明所述的12种高残留A类物质在内的115种兽药多残留的高效分离。尽管有个别化合物保留时间接近，但其提取离子流图谱均能实现质谱分离，可以进行定量分析，此外，EPI谱库个目标分析物碎片信息特征，代表化合物定性的结构“指纹”信息，可以对目标分析物准确定性。由此获得的包含所述A类残留物质的液质信息的液质谱库，能够实现对所述动物源食品中高风险药物多种类残留快速筛选。
[0063] 在上述色谱和质谱条件下，除了12种A类物质之外，B类103种共115种目标分析物的总离子流图、典型的选择离子流图、各目标分析物提取离子流图及选用CES扩展时(即CE 35eV，CES 15eV)的数据库谱图如图1～图4。
[0064] 本发明还涉及由上述方法构建获得的用于检测动物源食品中高风险药物多种类残留的快速筛选液质谱库，所述的动物源食品为禽蛋类食品或蜂蜜类食品；
[0065] 所述的高风险药物为限量值在1.0μg/kg以下高风险残留药物，具体为：
[0066] (a)甾体激素类化合物：睾酮(T)、泼尼松龙(PNSL)、倍他米松(BTS)、地塞米松(DTS)；
[0067] (b)硝基咪唑类药物及其代谢产物：甲硝哒唑(MNZ)、咯硝哒唑(RNZ)、二甲硝咪唑(DMZ)；
[0068] (c)Beta-受体激动剂类物质：克伦特罗(CLB)、妥布特罗(TUL)、西马特罗(CIM)；
[0069] (d)染料类物质：结晶紫(CV)和隐色结晶紫(LCV)。
[0070] 本发明还涉及所述检测动物源食品中高风险药物多种类残留快速筛选液质谱库在检测动物源食品中的药物残留的应用。
[0071] 本发明还涉及使用所述液质谱库对目标动物源食品中的高风险药物残留进行定性或定量分析的方法，所述方法包括如下步骤，
[0072] (1)制备标准溶液，
[0073] (2)分析前处理，采用快速酶解(释放结合态残留)+快速固相萃取(SPE)的提取净化技术进行待测样本分析前处理工作，
[0074] (3)对待测样本进行色谱和液质分析，获得液质谱图，对比所述液质谱库，进行定性或定量分析检测。
[0075] 所述的定性分析采用谱库检索进行，定性标准如下：
[0076] (1)样品中化合物提取离子流的保留时间与标准溶液或添加样品中目标分析物提取离子流的保留时间相比，变化幅度不超过5％。
[0077] (2)目标分析物的母离子/子离子(传输离子对)必须同时出现，且传输离子对的
信噪比(S/N)≥3。
[0078] (3)样品中化合物EPI谱图与谱库中相近浓度水平(同一个浓度数量级)标准溶液或基质标准溶液EPI谱图相比，谱图匹配纯度(Purity值)≥60。
[0079] 所述的定量分析的定量方法如下：
[0080] 使用外标单点法定量，按式(1)计算目标分析物的含量。
[0081]
[0082] 式(1)中：
[0083] X-样品中目标分析物含量，μg/kg；
[0084] c-样品溶液中目标分析物的浓度，μg/L；
[0085] V-样品溶液的定容体积，mL；
[0086] m-样品的质量，g；
[0088] 图1.A类物质、B类物质共115种目标分析物的总离子流图。
[0089] 图2.A类物质、B类物质共115种目标分析物的典型选择离子流图。
[0090] 图3.A类物质的目标分析物提取离子流图。
[0091] 图4.A类物质的目标分析物谱库数据图。
具体实施方式
[0093] 甾体激素类化合物、硝基咪唑类药物及其代谢产物、Beta-受体激动剂类物质：采用乙腈分类配制其混合标准储备溶液(0.01g/L)，物质标准储备液均可稳定12个月。
[0094] 染料类等物质采用甲醇分类配制其混合标准储备溶液(0.01g/L)，可稳定3个月。
[0095] 混合和标准工作溶液(0.1mg/L)，分别移取睾酮、泼尼松龙、倍他米松、地塞米松、甲硝唑、咯硝哒唑、二甲硝咪唑、克伦特罗、妥布特罗、西马特罗、结晶紫和隐色结晶紫标准储备溶液适量，用乙腈配制浓度为0.1mg/L的混合标准溶液，该溶液-20℃可稳定1个月。
[0096] 实施例2.分析前处理方法
[0097] 12种目标化合物(A组物质)分别隶属于甾体激素类、硝基咪唑类、β-受体激动剂类和染料类等4个化合物种类，其执行限量要求范围在0.05μg/kg～0.8μg/kg，是一组目前国际上限量要求最为严格的药物。因此，在前处理过程设计时考虑了净化浓缩的步骤，以满足严格的限量要求。针对A组物质所涉及的化合物种类，研究设计了快速酶解(释放结合态残留)+快速固相萃取(SPE)的提取净化技术，可快速有效地完成12种超低限量物质的前处理过程。具体的提取净化过程如下：
[0098] (1)提取：称取均质样品5g(精确到0.01g)，置于50mL聚四氟乙烯离心管中(如需做添加样品，在此步骤加入适当浓度的A组物质混合标准工作溶液，并于暗处放置30min)，加入乙酸铵缓冲液(0.2mol/L,pH 5.2)15mL，β-葡糖苷酸/硫酸酯酶50μL，涡旋混匀，50℃水浴振荡2h，放冷至室温，于0℃，15000rpm离心5min，转移上清至另一干净离心管中，用NaOH溶液(5mol/L)调节pH至9.0，再加入乙酸乙酯20mL,氯化钠6g，振荡涡旋5min，于
0℃，15000rpm离心5min，取上层有机相35℃旋蒸至近干，氮气吹干，残渣使用5mL 0.1mol/L盐酸溶液溶解，超声1min，留待上柱净化。
[0099] (2)净化：MCX柱(Waters Oasis MCX SPE小柱，此种类型小柱填料
吸附剂是在HLB小柱N-乙烯基吡咯烷酮-DVB共聚物的基础上加入了-SO3H离子交换功能基。)安装于固相萃取装置(该装置在实用新型专利CN201020014620.X中有详细记载)上，依次使用甲醇3mL，水3mL，3mL 0.1mol/L盐酸溶液活化。将提取溶液加载在固相萃取柱上，在重力作用下流出，依次使用3mL水，3mL甲醇和5mL正己烷淋洗小柱，抽干2min，加入6mL洗脱液(乙酸乙酯50mL，甲醇45mL，氨水5mL，混匀)洗脱。洗脱液35℃下氮气流吹干，使用样品溶解液(量取0.1％甲酸乙腈(V/V)溶液5mL，与甲酸铵(5mmol/L)-甲酸(0.1％)-水溶液95mL混匀)0.5mL溶解残渣，超声1min，过0.22μM微孔滤膜，液相色谱-串联质谱测定。
[0100] 对提取净化过程的步骤说明如下：A组物质中睾酮、妥布特罗等物质分属激素和β-受体激动剂类，文献调研表明这类在动物组织中常以结合态存在，尤其是妥布特罗这种
苯酚型药物，故需加入β-葡糖苷酸/硫酸酯酶酶解残留组织轭合物，以释放出游离态药物，加入缓冲液一是提供酶解需要的pH值环境，另外也是作为提取溶剂使用，该步骤相比现有方法采用了提高酶解温度(由现有方法的36℃提升至50℃)的方式使原本需要过夜(16h)反应的过程缩短为2h，大大
加速了酶解过程；结晶紫和隐性结晶紫经试验证明也可以在此步骤被提取；采用冷冻高速离心的目的是沉淀脂肪和蛋白；将提取液
碱化及加入氯化钠的目的是促进硝基咪唑类化合物和β-受体激动剂由水相向有机相的分配。净化步骤由于涉及到多种类物质的净化，SPE柱选择了通用性的反相材料。研究比较了亲水亲脂平衡(HLB)柱和普通C18柱，均未能实现较好的效果。最终研究采用Waters Oasis MCX SPE小柱，此种类型小柱填料吸附剂是在HLB小柱N-乙烯基吡咯烷酮-DVB共聚物的基础上加入了-SO3H离子交换功能基。因此该SPE柱具备反相和离子交换的混合吸附功能，在低pH值时能吸附酸性、碱性和中性化合物，较HLB和C18柱具有更强的净化能力。洗脱程序的设计参照相关文献报道并在淋洗的步骤中增加了正己烷淋洗的步骤，以更好的去处脂质干扰，洗脱溶液采用了乙酸乙酯(50％)-甲醇(45％)-氨(5％)水的混合溶液，经试验，6mL可以完成对目标分析物的洗脱。
[0101] 此外，在使用SPE柱检测的过程中，由于现有SPE系统不易实现快速操作，课题组研发了一种新型固相萃取装置，该装置可整合试剂架、氮吹仪的功能且操作压力相对均匀，其由试剂架、操作台、8个玻璃仓、8个梨形瓶和1个自动吸气装置组成，可实现目标分析物的快速SPE过程。
[0102] 综上，A组物质前处理方法尽管采用经典的溶剂提取/固相萃取净化前处理流程，但在快速酶解和通用性快速SPE净化过程的设计上均考虑了多种类残留提取及通量处理因素，相比现有方法具有快速简便的优势，且在一个前处理过程中完成了4类12中超低限量物质的有效提取，符合快筛查分析的要求。
[0103] 实施例3.一次性进样色谱分析体系研究
[0104] 1.色谱柱的选择
[0105] 多目标分析物的液相色谱分离目前通常考虑使用超微颗粒(粒径＜2μm)色谱柱，但本研究采用常规HPLC系统，其耐压上限是400Bar，故无法使用超高效液相色谱柱。为实现设计的分离目的，考虑系统压力限制将色谱柱的粒径范围控制在2μm～3μm之间，色谱柱长度范围为100mm～150mm；此外，由于化合物种类较多，极性范围跨度较大，在色谱柱类型方面就选择了适宜于分离宽极性范围的C18色谱柱。通过上述限定，本研究依据极性(参考LogD值选择)选择了每类化合物中的一种，一共4种物质作为分析物代表筛查了4种类型的液相色谱柱。筛选条件及结果见表2。
[0106] 表2色谱柱选择性实验设计及分离分析结果
[0107]
[0108] 由上表可见，相比其他色谱柱，Kinetex C18柱分离度和灵敏度均较好。虽然该色谱柱粒径最小，但其柱背压仍在常规液相耐压范围内。而且填充颗粒采用了先进的核-壳技术，与传统完全多孔
硅胶柱相比，能明显改善分离度和灵敏度。研究确定使用该型色谱柱为优选分离柱。
[0109] 2.流动相体系的选择及其他色谱条件的确定
[0110] 对质谱分析常用流动相(水、甲酸-水溶液、乙酸-水溶液、甲醇、乙腈、
酸化甲醇、酸化乙腈、甲酸铵缓冲液、乙酸铵缓冲液等)及组成使用12种混合标准工作液进行了筛选。在综合考虑分离度、灵敏度和分析时间等因素的基础上，最终确定采用乙腈为有机相，甲酸作为离子化增强剂，甲酸盐作为峰形优化剂，以水相/酸性乙腈的组合作为优化的流动相体系。
[0111] 对进样量、柱温和流速等液相色谱参数进行优化，主要的考量因素包括色谱分辨、灵敏度、重现性和基质效应等。通过使用12种目标物混合标准溶液在筛选目标浓度水平(0.5μg/kg)上进行色谱分离试验并确定优化值。
[0112] 在优化相关参数和比较多次试验结果的基础上，本研究确定的一次性液相色谱分离体系的具体条件为：色谱柱：Kinetex C18,2.6μm，2.1mm×100mm i.d.；流速：0.2mL；进样量：10μL；柱温：30℃。梯度洗脱程序：(A：0.1％甲酸-乙腈溶液；B：甲酸铵(5mmol/L)-甲酸(0.1％)-水溶液)0-2min：5％A；8min：20％A；15min：95％A；16-19min：100％A；20-35min：5％A。
[0113] 实施例4.液质谱库构建
[0114] 1.质谱采集方法的建立及液质谱库构建
[0115] (1)质谱采集方法的建立
[0116] 本研究采用了四级杆/离子阱串联质谱的高级采集模式：预设定多反应检测(sMRM)-信息依赖性采集(IDA)-增强子离子扫描(EPI)。该采集模式的建立，首先要确定目标分析物在色谱体系中保留时间，其次建立多反应监测(MRM)质谱方法，然后设定触发EPI采集的条件(即IDA设定)，最后是确定EPI采集的条件设定。
[0117] 为建立相应的质谱采集方法，首先对12种目标分析物的质谱参数进行试验设定。研究采用先分类优化化合物参数(包括母离子、子离子及解聚电压、碰撞能量等)，再选取代表化合物优化离子源参数(包括雾化气压力、离子源温度等)。
[0118] ①化合物参数优化确定。有关RT参数的设定依据色谱分离结果。质谱参数确定过程如下：使用初始流动相按目标分析物类别稀释混标储备溶液至浓度为0.2mg/L，但要注意同一类别中有相同分子量的目标分析物要单独配制(因为被研究使用仪器为标准分辨，无法区分同分异构体)，然后使用恒流
注射泵以5μL/min的流速注入质谱离子源中进行参数优化。分别使用Q1MS、Q1Multiple Ions、Product Ion、MRM等扫描模式确定目标分析物的母离子，子离子(每种目标分析物至少选取2对传输离子备用，在后续试验中根据响应的信噪比和空白基质中的干扰情况选取最优的一对离子作为sMRM的采集离子)，并使用Ramp功能优化并确定解聚电压(DP)、碰撞室入口电压(EP)、碰撞能量(CE)、碰撞室出口电压(CXP)等化合物参数，12种物质化合物参数优化结果见表3。
[0119] 表3 12种目标分析物优化质谱条件及参考保留时间
[0120]
[0121] 注：1.该表中所列离子对均为经过后续试验考查基质效应和信噪比后确定的优化离子对，在此未列出备用离子对的参数；2.目标分析物保留时间(RT)在RT设定窗口(15s)内变动均属正常。
[0122] ②离子源参数的优化确定。采用流动注射分析(FIA)优化，因仪器对优化离子对的数目有限制本研究采用代表化合物进行优化，代表化合物选取原则是采用化合物参数优化时响应相对较低的目标分析物，经试验，离子源参数优化结果如下：气帘气压力：30psi；喷雾电压：5500V；离子源温度：475℃；雾化气压力：40psi；辅助气压力：45psi。
[0123] ③IDA条件设定。在IDA条件设定中，最重要的是响应阈值的测定，在筛选目标浓度水平(0.025μg/kg)上分析基质标准(使用“空白基质”提取液配制的标准溶液)，以最低响应物质响应强度的1/2为度设定响应阈值。需要说明的是，该阈值具有基质依赖性，不同的基质阈值有所不同，通常情况下，阈值设定原则为尽可能保证所有满足筛查目标浓度的响应均可触发EPI采集，同时尽量提高阈值以减少
数据采集量(易于分析)。本研究中考察了两种动物源基质(禽蛋类食品或蜂蜜类食品)，以最低值设定为3000cps。
[0124] 其次，在IDA设定种还要选择仪器动态背景扣除功能，能有效减少无效数据的产生。
[0125] ④EPI参数的设定。
[0126] a)EPI采集质量数范围：本研究中12种目标分析物分子离子峰的质量数范围为140Da～940Da，碎片离子质量数范围80Da～880Da，故EPI采集质量数范围设定在70Da～
1000Da；
[0127] b)EPI采集扫描速度：本研究使用设备为AB SCIEX 5500Q-Trap质谱仪，EPI采集共有1000Da/s、10000Da/s和20000Da/s 3档速度，为保证数据质量，选择10000Da/s为EPI采集扫描速度，这样既兼顾12种目标分析物的分析采集速率，又保证了谱图质量；
[0128] c)EPI采集DP值和EP值的设定：为保证谱库数据质量，对12种目标分析物DP值和EP值进行分段统计，取高比例区段的中位值为最终设定值。
[0129] 经分析，目标化合物DP值在60V～100V区段比例加大，取中位值80V为EPI采集的DP设定值。同样的，目标组化合物EP值在9V～11V区段比例较大，取中位值10V作为EPI采集的EP设定值。确定DP和EP设定值后，对DP值和EP值EPI采集，证实设定的DP值和EP值对这类化合物的EPI数据采集质量无明显影响；
[0130] d)EPI采集碰撞能量(CE)值的设定，参照表3，一般常见化合物的CE值在20eV～30eV，但是个别化合物如结晶紫的CE值在45～60eV时，才有质量较高的碎片数据。为此，先固定CE值为35，再设定扩展CE值(CES)为5、10、15等3种组合考查EPI谱图质量。最后选取CE为35eV，CES为15eV(相当于CE分别为20eV、35eV、50eV时3张谱图的累加平均)作为EPI采集的CE设定，该设定值能够较好的兼顾高、中、低碰撞能量段，可获得高质量的数据谱图。
[0131] 通过以上方法，建立了12种目标分析物的质谱高级采集方法(sMRM-IDA-EPI)，可利用此模式进行筛查采集(使用sMRM的采集离子对)，然后对符合筛查规则(浓度响应超过筛选目标浓度)的目标物进行EPI采集，获取详细的离子信息以进行定性分析。
[0132] (2)液质谱库构建
[0133] ①在线EPI谱图数据采集。使用12种目标物混合标准工作液使用流动相稀释后配制浓度为筛选目标浓度水平的混合标准溶液，上机分析以sMRM-IDA-EPI方式采集在线EPI数据，使用Analyst1.5软件构建谱库，并完善目标分析信息(如中英文名称、化学式、CAS号、化学结构图等)。
[0134] ②离线EPI谱图数据采集。使用分类配制的标准储备液(如同类中有同分异构体，需要单独进样)使用流动相稀释至0.2mg/L，直接质谱进样，参照在线EPI条件采集离线EPI数据，此外再单独采集3个CE水平(低、中、高)EPI谱图，可依据化合物实际性质采用优化的碰撞能量。将上述采集数据录入谱库。
[0135] ③液质谱库判定使用规则。谱库检索是最有效的定性手段之一，但是在液质谱库检索的匹配规则制定方面目前尚无任何法规和技术规定。本研究依据欧盟和美国相关规定确定了保留时间和信噪比的判定规则；EPI谱图比对临界匹配因子的确定采用10个“空白基质”(蜂蜜和鸡蛋样品各5个)配制基质标准，与EPI谱库中的标准EPI图谱使用Analyst1.5软件进行匹配分析，获取纯度值(purity)，获取平均值和标准偏差。经比对，所有目标物Purity平均值减去标准偏差均大于60，为最大限度控制假阴性率，本研究确定purity值
60为临界匹配因子。综上，研究确定的谱库检索规则为：
[0136] a)样品中化合物提取离子流的保留时间与标准溶液或添加样品中目标分析物提取离子流的保留时间相比，变化幅度不超过5％；
[0137] b)表3中所列目标分析物的母离子/子离子(传输离子对)必须同时出现，且传输离子对的信噪比(S/N)≥3；
[0138] c)谱图匹配纯度(Purity值)或临界匹配因子≥60。
[0139] 谱库比对定性功能强大，因其提供的信息较多。根据欧盟2002/657/EC规定，本研究采集模式可获得确证点数≥5.5(欧盟最严格的禁用兽药仅要求确证点数≥4)。因此如果谱库检索匹配的话，可以对目标分析物进行快速定性确证。
