治疗粘膜感染的组合物和方法
阅读：662发布：2023-03-07
专利汇可以提供治疗粘膜感染的组合物和方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及用于 预防 性 治疗 和/或治疗粘膜感染的新组合物和 疫苗 ，尤其是涉及口服疫苗和增强 呼吸道 粘膜抗感染或治疗已建立的呼吸道感染的方法。，下面是治疗粘膜感染的组合物和方法专利的具体信息内容。
1.可粘膜给药的组合物，其包括一种或多种来自至少一种能在粘 膜表面引起感染的微生物的抗原和能诱导Th1细胞免疫应答的佐剂， 其中所述的佐剂不是来自能在粘膜表面引起感染的微生物。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述的抗原来自细菌，真菌 或病毒。
3.如权利要求1或2所述的组合物，其中，以完整的微生物作为 所述抗原。
4.如权利要求3所述的组合物，其中，所述的完整微生物是已杀 死的微生物。
5.如权利要求4所述的组合物，其中，所述的活微生物是活的或 活的减毒微生物。
6.如权利要求1或2所述的组合物，其中，以一种或多种微生物的 匀浆物或超声处理物作为所述抗原。
7.如权利要求1到6中任意一项所述的组合物，其中，所述的微 生物是呼吸道细菌和/或真菌病原体、或通常寄居于呼吸道并具有潜在 引起感染的能力的微生物。
8.如权利要求7所述的组合物，其中，所述的微生物选自：非典型 的流感嗜血杆菌(NTHI)、铜绿假单胞菌、肺炎链球菌、白色葡萄球菌 和金黄色葡萄球菌，或其任意组合。
9.如权利要求1到8中任意一项所述的组合物，其中，所述的佐 剂是能诱导Th1型细胞免疫应答但不属于能够在粘膜表面引起感染的 生物体的微生物或其部分。
10.如权利要求9所述的组合物，其中所述的佐剂是细菌。
11.如权利要求10所述的组合物，其中，所述的细菌选自乳酸细 菌，分枝杆菌和双歧杆菌，或其任意组合。
12.如权利要求11所述的组合物，其中，所述的细菌选自：能够诱 导Th1型细胞应答的嗜酸乳芽孢杆菌、发酵乳芽孢杆菌和牝牛分枝杆 菌，或其部分。
13.如权利要求12所述的组合物，其中，所述的细菌是嗜酸乳芽孢 杆菌。
14.如权利要求9到13中任意一项所述的组合物，其中，所述的 细菌是活的。
15.如权利要求1到14中任意一项所述的组合物，其中，所述的组 合物是可口服给药的组合物。
16.如权利要求15所述的组合物，其还包括一种或多种药学上可接 受的载体、佐剂、溶剂或赋形剂。
17.如权利要求1到15中任意一项所述的组合物，其是食品或食 品增补剂。
18.一种包括权利要求1到15中任意一项所述的组合物的疫苗。
19.治疗或预防性地治疗粘膜感染的方法，其包括对需要进行所述 治疗的患者施用如权利要求1到16中任意一项所述的组合物，或如权 利要求18所述的疫苗。
20.治疗或预防性地治疗粘膜感染的方法，其包括对需要进行所述 治疗的患者施用如权利要求1到16中任意一项所述的组合物的佐剂部 分，然后施用如权利要求1到16中任意一项所述的组合物的抗原部分。
21.如权利要求20所述的方法，其中，用佐剂部分进行的治疗是通 过施用单一的佐剂大丸剂进行的。
22.如权利要求20所述的方法，其中，用佐剂部分进行的治疗是 通过重复施用佐剂进行的。
23.如权利要求20或22所述的方法，其中，在施用抗原部份后继 续施用佐剂。
24.如权利要求19到23中任意一项所述的方法，其中，所述的化 合物或疫苗可施用于任何粘膜表面。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述的粘膜表面选自口腔，呼 吸道和肠道。
26.如权利要求19到25中任意一项所述的方法，其中所述的组合 物或疫苗通过口服给药。
27.如权利要求19到26中任意一项所述的方法，其中，施用所述 疫苗两个疗程，然后接加强疗程。
28.如权利要求19到27中任意一项所述的方法，其中，所述的佐 剂是细菌，并且所施用的细菌量为约1×108到约1×1012个生物体。
29.如权利要求19到28中任意一项所述的方法，其中，以完整的 死微生物作为所述抗原，并且所施用的微生物量为约1×108到约1×1012 个生物体。
30.如权利要求28或29所述的方法，其中，完整的死微生物与佐 剂微生物的比例为约5∶1或更高。
技术领域
本发明涉及诱导粘膜保护的新的疫苗组合物，特别是口服疫苗， 以及加强粘膜抗感染或治疗已建立的感染的方法。
背景技术
支气管粘膜炎被用作粘膜免疫学的模型，更具体地用于反映在粘 膜表面宿主与寄生物关系的特定平衡。通常无菌的支气管粘膜会被在 一般情况下不侵袭宿主的＂无毒＂细菌寄居。最突出的是非典型的流感 嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)(NTHI)。在慢性肺部疾病患者中 急性感染事件可能是由于打破了支气管粘膜与寄居细菌之间的精细平 衡引起的。局限性宿主应答涉及通过募集和激活支气管粘膜中的嗜中 性粒细胞起作用的Th1 T细胞(其产生γ干扰素)。这一过程若过度和/或 不适当，在已患有慢性肺部疾病的患者中将导致咳嗽和脓痰增多，即 “急性支气管炎”的特点。
起初的口服疫苗使用杀死的NTHI活化正常的粘膜系统以增强沿 小肠的派尔淋巴集结的淋巴细胞释放(当时被认为是产生抗体的B淋 巴细胞)，所述细胞在支气管粘膜内进行重新定位，产生阻止细菌侵 入支气管的IgA抗体。这种概念已被替代。这种疫苗需要(i)单一的细 菌内容物，和(ii)不添加佐剂。为了避免当时被认为由高度下调的粘膜 环境造成的限制，没有佐剂被认为是必需的，即向简单的单细菌疫苗 中添加佐剂将增强粘膜下调，减弱疫苗效力，甚至促进或加剧感染。
本发明的目的在于克服或至少改善现有技术中的一种或多种局限 性，或提供有用的替代方案。
发明简述
依照本发明的第一方面提供一种可粘膜给药的组合物，其包括一 种或多种来源于至少一种能在粘膜表面引起感染的微生物的抗原和能 诱导Th1型细胞免疫应答的佐剂，其中所述的佐剂不是来源于能在粘 膜表面引起感染的微生物。
优选地，所述抗原来自细菌，真菌或病毒。甚至更优选的是以完 整的微生物作为所述抗原。作为进一步优选，当所述抗原是完整的微 生物时，它是一种已被杀死的微生物，但可以理解也可有效地利用活 的或活的减毒微生物。然而，也应当理解为获得类似的结果也可以使 用单个抗原或微生物的匀浆物及超声处理物。
特别优选的是呼吸道细菌和真菌病原体或正常寄居于呼吸道但具 有引起感染的潜力的那些病原体，例如NTHI，铜绿假单胞菌 (Pseudomonas aeruginosa)，肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)， 白色葡萄球菌(Staphylococcus albus)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)等，单独地或它们的组合。
本发明所述的组合物意为口服施用，因此可以与药学上可接受的 载体，溶剂和赋形剂结合。
优选地，用于本发明组合物中的佐剂是能诱导Th1型的细胞免疫 应答但不属于能在粘膜表面引起感染的生物的微生物或其部分。还优 选的是，所述的佐剂是细菌，例如其可选自，但不限于乳酸细菌，分 枝杆菌(Mycobacterium)种或双歧杆菌(Bifidobacterium)种。甚至更 优选的是使用能诱导Th1型的细胞免疫应答的嗜酸乳芽孢杆菌 (Lactobacillus acidophilus)(L.acidophilus)，发酵乳芽孢杆菌 (Lactobacillus fermentum)(L.fermentum)或牝牛分枝杆菌 (Mycobacterium vaccae)(M.vaccae)，或其部分。特别优选的是嗜酸 乳芽孢杆菌。嗜酸乳芽孢杆菌、发酵乳芽孢杆菌或牝牛分枝杆菌可以 以活的或灭活制剂的形式使用，条件是它们能诱导Th1型应答。优选 嗜酸乳芽孢杆菌和发酵乳芽孢杆菌以活制剂的形式使用。其它细菌被 认为也可适合用作佐剂(无论其是否具有益生作用)，例如，熟知的佐剂 细菌如干酪乳芽孢杆菌(L.casei)，植物乳芽孢杆菌(L.Plantarum)， 鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)，短双歧杆菌(Bifidobecterium breve) 等。使用益生细菌作为佐剂是优选的。
其它已知的常用佐剂也可以包括在内。一系列合适的药物佐剂、 赋形剂和载体，以及制备合适的药物制剂的方法是药物制剂领域的技 术人员已知的，这些佐剂、赋形剂和载体的详情可以在标准教科书和 手册，例如＂Remington：The Science and Practice of Pharmacy(Mack Publishing Co.，1995)中找到，上述文献在这里全文引入作为参考。另 外，本发明的组合物也可以是食品或食品增补剂的形式，例如乳制品 或增补剂。这些产品和增补剂的制备方法，特别是那些有关如酸乳酪 和其它奶制品生产的方法，由于是公知的方法和步骤故也是本领域的 技术人员所明了的。
依照本发明的第二方面，提供包含根据第一方面的组合物的疫苗。
依照本发明的第三方面，提供一种治疗或预防性治疗粘膜感染的 方法，其包括对需要接受所述治疗的患者施用本发明第一方面的组合 物或依照本发明第二方面的疫苗。
然而，可以理解对于需要治疗的患者，无论是预防性的还是治疗 性的，均可以先施用所述组合物的仅一个部分，例如细菌形式的佐剂 如嗜酸乳芽孢杆菌和发酵乳芽孢杆菌，此后再施用旨在最终针对潜在 的病原体提供特异免疫的抗原或多种抗原。使用佐剂进行的起始治疗 可以采取单一的大丸剂的形式，但也可以，并优选地，在施用抗原前 的一段时间内重复给药。也可以在停止使用抗原后继续施用所述佐剂。
目前已明确粘膜免疫系统对所有的粘膜表面是共同的，因此本发 明的组合物和疫苗可以应用于任何潜在的粘膜病原体和任何粘膜表 面，包括但不限于口腔，呼吸道和肠道。
优选本发明的组合物或疫苗通过口服给药，但也可以应用于任何 粘膜表面，例如呼吸道粘膜或肠道粘膜。
本发明的组合物和疫苗用于诱导针对感染的粘膜保护是有利的， 但也可以用作预防剂治疗已有的细菌，真菌和/或病毒粘膜感染。而且， 当粘膜表面已被细菌寄居的时候，优选使用本发明的组合物和疫苗。
因此，依照本发明的第四方面提供一种治疗或预防性治疗粘膜感 染的方法，其包括对需要所述治疗的患者施用依照本发明第一方面的 组合物的佐剂部分，再施用依照本发明第一方面的组合物的抗原部分。
优选地使用佐剂部分进行的治疗采取施用单一的佐剂大丸剂的方 式进行，但用佐剂部分进行的治疗也可通过重复给予佐剂的方式进行。 但更优选的是佐剂和抗原一起施用。
在本发明另一实施方案中，当所述的佐剂在所述的抗原之前施用 或与所述抗原一起施用时，可以在施用抗原部份后继续施用所述的佐 剂。
由于存在共同的粘膜免疫系统，本发明的组合物和疫苗可以施用 于任何粘膜表面并达到期望的效果。优选的粘膜表面是口腔，呼吸道 和肠道，但是，如上所述，本领域技术人员知道对任何粘膜表面进行 施用均是有效的。
优选地，所述组合物或疫苗通过口服给药。
优选地，施用所述疫苗两个疗程，然后接一个加强疗程。
当所述佐剂是完整的活益生细菌时，优选的佐剂剂量是约1×108 到约1×1012个生物体。
当以完整的死微生物作为抗原时，优选的抗原剂量是从约1×108 到约1×1012个生物体，更优选其中完整的死微生物(抗原)与益生细 菌(佐剂)的比率为约5∶1或更高的剂量。
还优选的是在每年的季节性感染爆发之前施用本发明的组合物或 疫苗。
附图简述
图1：喂嗜酸乳芽孢杆菌后IL-4和IFN-γ的产生。
优选实施方案的详细描述
令人惊讶地发现，例如将与粘膜感染相关的特异抗原(例如完整的 细菌，如流感嗜血杆菌)和非特异的细菌(即那些通常不与粘膜感染相 关的细菌)结合，可以获得对粘膜感染的延长保护。不希望受到任何 具体作用机制的约束，但本发明是基于下述观念，即使用非特异性的 细菌可以诱导T细胞产生特定的细胞因子应答，所述的应答扩大了预 期通过施用传统的疫苗制剂所能获得的保护。更具体地说，但仍不希 望受到任何具体作用机制的约束，可以认为施用非特异的细菌使粘膜 免疫系统偏向于T细胞应答谱的Th1(即IFN-γ)一端。Th1应答被认为 能最好地控制微生物在粘膜的寄居。使用这样的生物体和其他能刺激 Th1应答的佐剂可以确定Th1应答，该Th1应答可在远离施用位点处被 检测到并起作用。
本文中已证明了在高度＂Th2偏向性＂的小鼠模型中(参见实施例 1)，非特异性的细菌如乳酸细菌具有下调IL-4并加强IFN-γ产生的能 力。本文中还证明了非特异性的细菌，如乳芽孢杆菌在从支气管中清 除非典型的流感嗜血杆菌(NTHI)的大鼠模型中提供了额外的保护(显 示出涉及CD4T细胞，不涉及抗体)(参见实施例2)。
在本研究中举例使用的动物模型是与治疗和预防感染均相关的微 生物寄居模型。寄居是感染的本质决定因素，对于其他治疗和预防性 疫苗，该模型已被用于确定效力、剂量、给药方案等。
在本发明的特定实施方案中，治疗性口服疫苗中结合了：1)单独 的或联合的在呼吸道内发现的特异细菌(例如，但不限于NTHI，肺炎 链球菌，铜绿假单胞菌，白色葡萄球菌，和金黄色葡萄球菌)，所述细 菌为死的或活的细菌形式，和2)非特异性的细菌(本文中也称作益生细 菌)，该细菌具有使粘膜免疫转向Th1型T细胞应答方向的能力(也可 以用活的或死的)，例如但不限于乳芽孢杆菌(Lactobacillus)种(如嗜 酸乳芽孢杆菌)和/或分枝杆菌种(如牝牛分枝杆菌)。
这种类型的口服疫苗在粘膜表面已经寄居有细菌时作用最佳(因为 这些细菌可再次刺激新近在粘膜中重新定位的细胞)，即作为治疗性疫 苗。但是它也可以用作预防性疫苗。
为避免胃酸灭活细菌，可使用肠溶胶囊(或类似物)沿小肠释放细菌 内容物。另一种选择是在施用特异的抗原或细菌以图诱导针对潜在粘 膜病原体的特异性免疫应答前，长期使用非特异性细菌以建立更持久 的Th1粘膜环境。所述的“非特异性”细菌单独并不诱导特异性的保 护。
非特异性的细菌也可以加强对来自肠胃外途径的某些抗原的应 答，特别是影响粘膜保护的那些(通过促进特定免疫结果的出现)。
革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌结合作为益生菌佐剂在这一系统中 具有协同活性，并且也包含在本发明的范围内。由于粘膜免疫系统对 所有的粘膜表面(例如尤其是支气管，窦道和中耳等)是共同的，所以各 种呼吸粘膜表面均可得到保护。
下面通过特定的但是非限定性的实施例对本发明进行更具体的描 述。 实施例1：益生细菌对Th1/Th2细胞因子应答的影响
为确定益生细菌是否下调Th2并上调Th1细胞因子应答，用饲喂 针经胃内将不同数量的嗜酸乳芽孢杆菌(获自University of New South Wales，School of Microbiology and Immunology Culture Collection，Sydney，澳大利亚)喂给C57/B16小鼠，连续喂养两周，此 后通过腹膜注射0.2mL磷酸盐缓冲液中的8μg卵清蛋白(OVA)和氢氧 化铝以致敏小鼠。上述小鼠在处死前，进一步用嗜酸乳芽孢杆菌喂10 次，每两天一次共两周。过筛切割脾脏以分离淋巴细胞，用PBS洗并 按10×106重悬。将1mL小份的细胞悬液分配到24-孔平底微滴定板 的孔中，用OVA(5μg/mL)进行刺激。培养4天后，收集上清液，通 过标准的ELISA技术用IL-4或IFN-γ单克隆抗体对分析IL-4和IFN-γ 的产量。
简要地说，24-孔微滴定板的板孔用俘获抗-IL-4抗体包被。在室温 下温育1小时后，洗孔并将生物素酰化的抗-IL-4抗体加到每孔中。再 温育1小时后，洗孔并向每孔中加入链霉亲和素-过氧化物酶偶联物。 温育30分钟后，洗孔并加入TMB底物。在ELISA平板读数器中于 450/620nm下读取显示的颜色。在未知的样品中IL-4的水平利用标准 曲线通过插值法定量。用类似的步骤测定IFN-γ。
在图1A和B中显示的结果表明饲喂嗜酸乳芽孢杆菌导致IL-4的 产生以剂量依赖方式受到抑制(图1A)而IFN-γ的产生增强(图1B)。 实施例2：通过单次腔内给予活的嗜酸乳芽孢杆菌和死NTHi诱导 NTHi从呼吸道中的增强清除
我们利用大鼠模型研究了嗜酸乳芽孢杆菌增强从呼吸道中清除非 典型的流感嗜血杆菌(NTHI)的能力。
DA大鼠(200-250克，8-10周龄，Animal Resource Centre，Perth， WA)通过单次腔内(IL)注射(进入小肠腔)0.75mL仅含5×109个死 NTHi或还含2.5×1010个嗜酸乳芽孢杆菌的PBS进行免疫(如表1所 示)。所述的IL给药在剖腹手术暴露出十二指肠后通过直接注射到肠 腔中完成。这被认为等价于口服摄入后被释放到肠腔中的包肠溶衣药 (如可以制备用于人的包肠溶衣药)。在第14天用单独的(A组)或含 5×108个死NTHI(B-D组)的50μL PBS给所述的大鼠进行气管内(IT) 加强。在第21天用50μL PBS中的5×108个活NTHI对小鼠进行气 管内感染。4小时后，将大鼠处死，在巧克力琼脂平板上接种10倍系 列稀释的支气管灌洗液(BAL)或肺匀浆物(LH)以确定NTHI在BAL和 LH中的总数。37℃过夜培养后计长出的菌落数。BAL和LH中的总 细菌数由菌落形成单位(CFU)表示，如表2所示。
表1：大鼠组：IL给药和IT加强 组 IL给药 IT加强 A PBS PBS B NTHi NTHi C NTHi/嗜酸乳芽孢杆菌 NTHi D 嗜酸乳芽孢杆菌 NTHi
表2.由呼吸道回收的活NTHi(平均值±SEM) 组 BAL CFU(106) LH CFU(106) A 3.2±1.1 19.4±5.9 B 1.0±0.3 19.2±10.4 C 0.5±0.3a，c 3.3±0.7b，d D 1.7±0.3 25.9±10.0
a，p＝0.034，与A组相比
b，p＝0.018，与A组相比
c，p＝0.264，与B组相比
d，p＝0.165，与B组相比
p＜0.05被认为是统计学上显著的
这些数据表明死NTHi与活嗜酸乳芽孢杆菌的组合比单独的NTHi 或单独的嗜酸乳芽孢杆菌都更有效。 实施例3：NTHi自饲喂嗜酸乳芽孢杆菌的免疫大鼠的肺部的清除增加
通过管饲法将1.0mL PBS中的5×1010个嗜酸乳芽孢杆菌或单独的 PBS喂给DA大鼠(200-250克，8-10周龄，Animal Resource Centre， Perth，WA)，每两天一次共7天，其间所述大鼠通过腔内(IT)施用 0.5ml PBS中的福尔马林灭活的NTHI(每只大鼠5×109个)进行免疫。 继续饲喂大鼠，每2天一次共2周，之后，经气管内(IT)途径用含 有福尔马林灭活的NTHi(每只大鼠5×108个)的50μl PBS进行加 强。继续饲喂嗜酸乳芽孢杆菌7天后，用50μL PBS中的5×108个活 NTHI对大鼠进行IT感染。4小时后，如实施例2中所述在BAL和 LH中确定肺内微生物的寄居水平。不同组的免疫和喂养情况列于表3。 细菌回收情况列于表4。
表3：大鼠组：给药方案 组(每组5只大鼠) 饲喂 IL给药 IT加强 A Nil PBS PBS B Nil NTHi NTHi C 嗜酸乳芽孢杆菌 PBS PBS D 嗜酸乳芽孢杆菌 NTHi NTHi
表4由肺部回收的活NTHi 组 BAL CFU(106/ml) LH CFU(106/mL) A 25.9±7.4 90.2±29.0 B 4.6±3.0a 4.9±1.2b C 0.7±0.3c 12.5±5.7d D 0.2±0.1e，g 3.2±2.0f，h ap＝与A相比为0.011 gp＝与B相比为0.235 bp＝与A相比为0.018 hp＝与B相比在统计学上不显著 cp＝与A相比为0.043 dp＝与A相比为0.093 ep＝与A相比为0.018 fp＝与A相比为0.033
用嗜酸乳芽孢杆菌喂养并用死NTHi免疫的大鼠比仅用死NTHi 免疫或仅用嗜酸乳芽孢杆菌喂养的大鼠更抗NTHi在肺部的感染。而 且，用管饲法重复饲喂嗜酸乳芽孢杆菌的大鼠比给予单一的嗜酸乳芽 孢杆菌大丸剂的大鼠(实施例2)更抗感染。不希望受任何特定的作用机 制约束，但这些数据表明清除的加强可能是由于重复喂养后提高了嗜 酸乳芽孢杆菌在肠内的寄居所致。 实施例4：死NTHi和活发酵乳芽孢杆菌的腔内给药提供了对后续急性 NTHi感染的增强保护
用急性NTHi呼吸道感染大鼠模型对单独的或与死NTHi结合的发 酵乳芽孢杆菌增强清除NTHi的能力进行了评估。
无特异病原体的DA大鼠(177-200g)从Central Animal house， (University of Newcastle，Newcastle，NSW)获得。5只大鼠为一组， 如下述表5所述将0.75mL PBS，或仅含5×109个死NTHi的PBS，或 者含5×109个死NTHi加2.5×1010个发酵乳芽孢杆菌的PBS，或者仅含 2.5×1010个发酵乳芽孢杆菌的PBS，一次注射到大鼠小肠肠腔中。在 第14天，用50μl PBS通过IT假加强A组大鼠，用50μL含5×108个 死NTHi的PBS加强B-D组的大鼠。在第21天，用50μL PBS中的5×108 个活NTHi通过IT感染大鼠。4小时后通过腹膜内施用过量的戊巴比 妥将大鼠处死。用10mL PBS灌洗肺部获得支气管肺泡灌洗液(BAL)。 然后，将肺在10mL PBS中进行匀浆以获得肺匀浆物(LH)。BAL和 HL中的细菌数通过将BAL和HL系列稀释并再将已知的体积接种到 巧克力平板上进行测定。在37℃下过夜培养后，计数菌落数并确定 BAL和HL中的菌落形成单位(CFU)的总数。每个大鼠组中的细菌数 量列于表6。
表5：用死NTHi和活的发酵乳芽孢杆菌的如下多种结合对大鼠 (每组5只)作单次腔内给药： 大鼠组 IL免疫 IT加强 A PBS PBS B NTHi5×109 NTHi5×108 C NTHi5×109+ 发酵乳芽孢杆菌2.5×1010 NTHi5×108 D 发酵乳芽孢杆菌2.5×1010 NTHi5×108
表6：从肺中回收的活NTHi： 大鼠组 BAL CFU(106) LH CFU(106) A(5) 3.67±1.30 103.5±34.2 B(5) 0.40±0.22P＝0.038* 17.4±6.8P＝0.039* C(5) 0.27±0.11P＝0.032* 5.7±1.5P＝0.021* D(5) 0.49±0.19P＝0.042* 0.82±0.37P＝0.017*
*与A组相比
另外，对于LH，B＞D(P＝0.041)，和C＞D(P＝0.015).
这些数据提示单独的或与死NTHi结合的发酵乳芽孢杆菌与单独 的死NTHi相比可以更为有效地预防接下来的急性呼吸道感染。因此， 此乳芽孢杆菌菌株也能有效地抗急性呼吸道感染。 实施例5：与固定的NTHi剂量一起施用的嗜酸乳芽孢杆菌的剂量范围 研究
无特异病原体的DA大鼠(197-230g)从Central Animal house (University of Newcastle，Newcastle，NSW)获得。6只大鼠为一组， 如下述表7所述单次IL施用PBS，或固定剂量的死NTHi(5×109)加一 种不同剂量的活嗜酸乳芽孢杆菌。在第14天用50μl PBS假加强A组 大鼠，用50μL含5×108个死NTHi的PBS加强B-D组的大鼠。加强 是通过气管内递送的方式进行的。在第21天，用50μL PBS中的5×108 个活NTHi通过气管内滴注感染大鼠。4小时后通过腹膜内施用过量的 戊巴比妥将大鼠处死。用10mL PBS灌洗肺以获得支气管肺泡灌洗液 (BAL)。然后将肺脏在10mL PBS中进行匀浆化以获得肺匀浆物 (LH)。BAL和LH中的细菌数通过将BAL和LH系列稀释并再将 已知的体积接种到巧克力平板上进行测定。在37℃下过夜培养后，数 菌落数并确定在BAL和LH中的菌落形成单位(CFU)总数。每个大鼠 组中的细菌数量列于表8。
表7：大鼠组：IT给药和IT加强 大鼠组 IL免疫 IT加强 A(6) PBS PBS B(5) NTHi+嗜酸乳芽孢杆菌2×108 NTHi C(6) NTHi+嗜酸乳芽孢杆菌1×109 NTHi D(6) NTHi+嗜酸乳芽孢杆菌5×109 NTHi E(6) NTHi+嗜酸乳芽孢杆菌2.5×1010 NTHi
表8：从肺部回收的活NTHi： 大鼠组 BAL CFU(106) LH CFU(106) A(6) 1.96±0.54 17.9±4.5 B(5) 0.65±0.46 3.3±1.7P＝0.021* C(6) 1.22±0.49 4.7±1.4P＝0.019* D(6) 0.71±0.22 6.8±2.8 E(6) 3.75±1.74 13.2±5.2
*与A组相比。
较低剂量的乳芽孢杆菌比较高剂量的乳芽孢杆菌更有效。还是不 希望受任何特定的作用机制的限制，但这些数据提示“佐剂作用”方 式可能与仅用乳芽孢杆菌的作用方式不同。
由上述结果，用于人的等价剂量可能是大约1×108到1×1012个细 菌。 实施例6：对NTHi免疫的最佳剂量大小/给药方案的评估
我们确定了对于死NTHi免疫的最佳剂量大小和给药方案。所评估 的不同方案列于表9。评估了单次IL给药，单次IL给药后接一次管 饲法给药，和单次IL给药后接两次管饲法给药。仅一次给药可通过IL 方式进行，因为这涉及到手术暴露十二指肠。从动物论理学考虑仅允 许一次手术干预。因此接下来通过管饲法递送给药。
表9：给药方案 方案 第1次给药 (IL) 第2次给药 (管饲法) 第3次给药 (管饲法) IT加强 感染/死亡 1 第0天 - - 第28天 第35天 2 第0天 第14天 - 第28天 第35天 3 第0天 第14天 第21天 第28天 第35天
结果：
(i)方案1
无特异病原体的DA大鼠(187-213g)从Central Animal house (University of Newcastle，Newcastle，NSW)获得。按表9中方案1单次 IL给予大鼠(6只为一组)表10中所示不同剂量大小的死NTHi。所述 的死NTHi含于0.3mL PBS中。用PBS(A组)或2×107个死NTHi(B-D 组)进行IT加强。用50μL含5×108个活NTHi的PBS对大鼠进行气管 内感染。从BAL和LH中回收的细菌列于表11。
表10：在方案1中测定的剂量大小 大鼠组 IL免疫 IT加强 A PBS PBS B NTHi3×109 NTHi2×107 C NTHi3×108 NTHi2×107 D NTHi3×107 NTHi2×107
表11：从肺部回收的活NTHi： 大鼠组 BAL CFU(106) LH CFU(106) A(5) 1.12±0.20 17.1±1.9 B(6) 0.76±0.14P＝0.029a 8.0±1.5P＝0.042* C(6) 0.70±0.20P＝0.030a 5.2±1.4P＝0.0006* D(6) 1.76±0.37 16.1±4.7
a与D组相比
*与A组相比
显然，对于单次IL给药进行的免疫，较高剂量水平(3×109和 3×108)在提供保护性免疫方面起到同等效果。最低的剂量(3×107)不起 作用。
(ii)方案2
无特异病原体的DA大鼠(187-219g)从Central Animal house (University of Newcastle，Newcastle，NSW)获得。按表9中方案2单次 IL给予大鼠(6只为一组)表12中所示不同剂量大小的死NTHi。所述 的死NTHi含于0.3mL PBS中。用PBS(A组)或50μl PBS中的2×107 个死NTHi(B-D组)进行IT加强。用50μL含5×108个活NTHi的PBS 对大鼠进行气管内感染。从BAL和LH中回收的细菌列于表13。
表12：方案2中测试的剂量大小 大鼠组 IL给药 口服给药 IT加强 感染/死亡 A PBS PBS PBS NTHi3×108 B NTHi3×107 NTHi3×107 NTHi8×107 NTHi3×108 C NTHi3×108 NTHi3×108 NTHi8×107 NTHi3×108 D NTHi3×109 NTHi3×109 NTHi8×107 NTHi3×108 天 0 14 28 35
表13：由肺部回收的活细菌： 大鼠组 BAL CFU(106) LH CFU(106) A(6) 12.7±4.0 44.7±10.0 B(5) 2.9±1.3 13.5±1.2P＝0.019* C(5) 5.1±3.4 17.2±4.7P＝0.042* D(6) 2.9±4.0P＝0.042* 15.4±9.8P＝0.045*
*与A组相比。
显然，当给药两次时，所有三种剂量大小在LH中给出同等程度的 保护。在BAL中这三种剂量的保护水平也是相似的，但本试验中只有 最高剂量才有统计学上的显著性。
(ii)方案3
无特异病原体的DA大鼠(176-213g)从Central Animal house (University of Newcastle，Newcastle，NSW)获得。按表9中方案3单次 IL给予大鼠(6只为一组)表14中所示不同剂量大小的死NTHi。所述 的死NTHi含于0.3mL PBS中。用50μl PBS(A组)或50μl PBS中的 2×107个死NTHi(B-D组)进行IT加强。用50μL含5×108个活NTHi 的PBS对大鼠进行气管内感染。从BAL和LH中回收的细菌列于表 15。
表14：方案3中测定的剂量大小 大鼠组 IL给药 口服给药 IT加强 感染/死亡 A PBS PBS PBS NTHi3×108 B NTHi3×107 NTHi3×107 NTHi8×107 NTHi3×108 C NTHi3×108 NTHi3×108 NTHi8×107 NTHi3×108 D NTHi3×109 NTHi3×109 NTHi8×107 NTHi3×108 天 0 14和21 28 35
表15：从肺部回收的活细菌： 大鼠组 BAL CFU(106) LH CFU(106) A(6) 2.2±0.7 16.8±8.0 B(6) 0.48±0.23P＝0.045* 3.3±1.4 C(6) 0.79±0.21 5.6±1.8 D(6) 0.45±0.23P＝0.042* 3.7±1.5
*与A组相比
对3次肠内给药(1次IL加2次管饲法给药)，所有的三个剂量水 平提供了类似的保护。三次给药与二次给药(方案2)相比没有明显的优 势。
由上述数据，用于人的等价剂量可能是大约1×108到1×1012个细菌。 实施例7：通过单次IL给药用NTHi和嗜酸乳芽孢杆菌进行长期免疫
我们用试验确定通过添加嗜酸乳芽孢杆菌提供的增强保护的持续 时间。无特异病原体的DA大鼠(201-293g)从Central Animal house (University of Newcastle，Newcastle，NSW)获得。6只大鼠为一组， 如表16所示IL给予0.75mL PBS，或含5×109个死NTHi的PBS，或 者含5×109个死NTHi与2.5×1010个活嗜酸乳芽孢杆菌的混合物的 PBS。如表16所示，14天后用50μL PBS或含5×108个死NTHi的 PBS对大鼠进行IT加强。IL给药后3个月，用50μL含5×108个活 NTHi的PBS进行气管内(IT)感染大鼠。感染后4小时，处死大鼠， 制备BAL和LH并如上述实施例中所述确定总的细菌数并以菌落形成 单位(CFU)表示。
表16：大鼠组：IL给药和IT加强 大鼠组 IL免疫 IT加强 A PBS PBS B NTHi NTHi C 嗜酸乳芽孢杆菌 PBS D NTHi+嗜酸乳芽孢杆菌 NTHi
表17：由肺部回收的活细菌数： 大鼠组 BAL CFU(106) LH CFU(106) A(6) 6.2±1.3 10.4±1.7 B(6) 1.7±0.4P＝0.007* 7.3±1.4P＝0.02a C(6) 3.0±0.8 18.8±3.9 D(5) 2.6±2.0 16.6±8.4 注释：D组中的一只大鼠在通过外科手术实施IL给药时死亡。
*与A组相比
a与C组相比。
通过此3个月的实验，用单独的NTHi进行免疫最有效。在此期间 添加嗜酸乳芽孢杆菌没有明显的效果。
尽管本发明参照具体的实施例和优选的实施方案进行了描述，但 应当理解的是符合本文所述的本发明的广义概念和精神的变化形式也 包括在本发明的范围内。
起初的口服疫苗使用杀死的NTHI活化正常的粘膜系统以增强沿 小肠的派尔淋巴集结的淋巴细胞释放(当时被认为是产生抗体的B淋 巴细胞)，所述细胞在支气管粘膜内进行重新定位，产生阻止细菌侵 入支气管的IgA抗体。这种概念已被替代。这种疫苗需要(i)单一的细 菌内容物，和(ii)不添加佐剂。为了避免当时被认为由高度下调的粘膜 环境造成的限制，没有佐剂被认为是必需的，即向简单的单细菌疫苗 中添加佐剂将增强粘膜下调，减弱疫苗效力，甚至促进或加剧感染。
本发明的目的在于克服或至少改善现有技术中的一种或多种局限 性，或提供有用的替代方案。
发明简述
依照本发明的第一方面提供一种可粘膜给药的组合物，其包括一 种或多种来源于至少一种能在粘膜表面引起感染的微生物的抗原和能 诱导Th1型细胞免疫应答的佐剂，其中所述的佐剂不是来源于能在粘 膜表面引起感染的微生物。
优选地，所述抗原来自细菌，真菌或病毒。甚至更优选的是以完 整的微生物作为所述抗原。作为进一步优选，当所述抗原是完整的微 生物时，它是一种已被杀死的微生物，但可以理解也可有效地利用活 的或活的减毒微生物。然而，也应当理解为获得类似的结果也可以使 用单个抗原或微生物的匀浆物及超声处理物。
特别优选的是呼吸道细菌和真菌病原体或正常寄居于呼吸道但具 有引起感染的潜力的那些病原体，例如NTHI，铜绿假单胞菌 (Pseudomonas aeruginosa)，肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)， 白色葡萄球菌(Staphylococcus albus)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)等，单独地或它们的组合。
本发明所述的组合物意为口服施用，因此可以与药学上可接受的 载体，溶剂和赋形剂结合。
优选地，用于本发明组合物中的佐剂是能诱导Th1型的细胞免疫 应答但不属于能在粘膜表面引起感染的生物的微生物或其部分。还优 选的是，所述的佐剂是细菌，例如其可选自，但不限于乳酸细菌，分 枝杆菌(Mycobacterium)种或双歧杆菌(Bifidobacterium)种。甚至更 优选的是使用能诱导Th1型的细胞免疫应答的嗜酸乳芽孢杆菌 (Lactobacillus acidophilus)(L.acidophilus)，发酵乳芽孢杆菌 (Lactobacillus fermentum)(L.fermentum)或牝牛分枝杆菌 (Mycobacterium vaccae)(M.vaccae)，或其部分。特别优选的是嗜酸 乳芽孢杆菌。嗜酸乳芽孢杆菌、发酵乳芽孢杆菌或牝牛分枝杆菌可以 以活的或灭活制剂的形式使用，条件是它们能诱导Th1型应答。优选 嗜酸乳芽孢杆菌和发酵乳芽孢杆菌以活制剂的形式使用。其它细菌被 认为也可适合用作佐剂(无论其是否具有益生作用)，例如，熟知的佐剂 细菌如干酪乳芽孢杆菌(L.casei)，植物乳芽孢杆菌(L.Plantarum)， 鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)，短双歧杆菌(Bifidobecterium breve) 等。使用益生细菌作为佐剂是优选的。
其它已知的常用佐剂也可以包括在内。一系列合适的药物佐剂、 赋形剂和载体，以及制备合适的药物制剂的方法是药物制剂领域的技 术人员已知的，这些佐剂、赋形剂和载体的详情可以在标准教科书和 手册，例如＂Remington：The Science and Practice of Pharmacy(Mack Publishing Co.，1995)中找到，上述文献在这里全文引入作为参考。另 外，本发明的组合物也可以是食品或食品增补剂的形式，例如乳制品 或增补剂。这些产品和增补剂的制备方法，特别是那些有关如酸乳酪 和其它奶制品生产的方法，由于是公知的方法和步骤故也是本领域的 技术人员所明了的。
依照本发明的第二方面，提供包含根据第一方面的组合物的疫苗。
依照本发明的第三方面，提供一种治疗或预防性治疗粘膜感染的 方法，其包括对需要接受所述治疗的患者施用本发明第一方面的组合 物或依照本发明第二方面的疫苗。
然而，可以理解对于需要治疗的患者，无论是预防性的还是治疗 性的，均可以先施用所述组合物的仅一个部分，例如细菌形式的佐剂 如嗜酸乳芽孢杆菌和发酵乳芽孢杆菌，此后再施用旨在最终针对潜在 的病原体提供特异免疫的抗原或多种抗原。使用佐剂进行的起始治疗 可以采取单一的大丸剂的形式，但也可以，并优选地，在施用抗原前 的一段时间内重复给药。也可以在停止使用抗原后继续施用所述佐剂。
目前已明确粘膜免疫系统对所有的粘膜表面是共同的，因此本发 明的组合物和疫苗可以应用于任何潜在的粘膜病原体和任何粘膜表 面，包括但不限于口腔，呼吸道和肠道。
优选本发明的组合物或疫苗通过口服给药，但也可以应用于任何 粘膜表面，例如呼吸道粘膜或肠道粘膜。
本发明的组合物和疫苗用于诱导针对感染的粘膜保护是有利的， 但也可以用作预防剂治疗已有的细菌，真菌和/或病毒粘膜感染。而且， 当粘膜表面已被细菌寄居的时候，优选使用本发明的组合物和疫苗。
因此，依照本发明的第四方面提供一种治疗或预防性治疗粘膜感 染的方法，其包括对需要所述治疗的患者施用依照本发明第一方面的 组合物的佐剂部分，再施用依照本发明第一方面的组合物的抗原部分。
优选地使用佐剂部分进行的治疗采取施用单一的佐剂大丸剂的方 式进行，但用佐剂部分进行的治疗也可通过重复给予佐剂的方式进行。 但更优选的是佐剂和抗原一起施用。
在本发明另一实施方案中，当所述的佐剂在所述的抗原之前施用 或与所述抗原一起施用时，可以在施用抗原部份后继续施用所述的佐 剂。
由于存在共同的粘膜免疫系统，本发明的组合物和疫苗可以施用 于任何粘膜表面并达到期望的效果。优选的粘膜表面是口腔，呼吸道 和肠道，但是，如上所述，本领域技术人员知道对任何粘膜表面进行 施用均是有效的。
优选地，所述组合物或疫苗通过口服给药。
优选地，施用所述疫苗两个疗程，然后接一个加强疗程。
当所述佐剂是完整的活益生细菌时，优选的佐剂剂量是约1×108 到约1×1012个生物体。
当以完整的死微生物作为抗原时，优选的抗原剂量是从约1×108 到约1×1012个生物体，更优选其中完整的死微生物(抗原)与益生细 菌(佐剂)的比率为约5∶1或更高的剂量。
还优选的是在每年的季节性感染爆发之前施用本发明的组合物或 疫苗。
附图简述
图1：喂嗜酸乳芽孢杆菌后IL-4和IFN-γ的产生。
优选实施方案的详细描述
令人惊讶地发现，例如将与粘膜感染相关的特异抗原(例如完整的 细菌，如流感嗜血杆菌)和非特异的细菌(即那些通常不与粘膜感染相 关的细菌)结合，可以获得对粘膜感染的延长保护。不希望受到任何 具体作用机制的约束，但本发明是基于下述观念，即使用非特异性的 细菌可以诱导T细胞产生特定的细胞因子应答，所述的应答扩大了预 期通过施用传统的疫苗制剂所能获得的保护。更具体地说，但仍不希 望受到任何具体作用机制的约束，可以认为施用非特异的细菌使粘膜 免疫系统偏向于T细胞应答谱的Th1(即IFN-γ)一端。Th1应答被认为 能最好地控制微生物在粘膜的寄居。使用这样的生物体和其他能刺激 Th1应答的佐剂可以确定Th1应答，该Th1应答可在远离施用位点处被 检测到并起作用。
本文中已证明了在高度＂Th2偏向性＂的小鼠模型中(参见实施例 1)，非特异性的细菌如乳酸细菌具有下调IL-4并加强IFN-γ产生的能 力。本文中还证明了非特异性的细菌，如乳芽孢杆菌在从支气管中清 除非典型的流感嗜血杆菌(NTHI)的大鼠模型中提供了额外的保护(显 示出涉及CD4T细胞，不涉及抗体)(参见实施例2)。
在本研究中举例使用的动物模型是与治疗和预防感染均相关的微 生物寄居模型。寄居是感染的本质决定因素，对于其他治疗和预防性 疫苗，该模型已被用于确定效力、剂量、给药方案等。
在本发明的特定实施方案中，治疗性口服疫苗中结合了：1)单独 的或联合的在呼吸道内发现的特异细菌(例如，但不限于NTHI，肺炎 链球菌，铜绿假单胞菌，白色葡萄球菌，和金黄色葡萄球菌)，所述细 菌为死的或活的细菌形式，和2)非特异性的细菌(本文中也称作益生细 菌)，该细菌具有使粘膜免疫转向Th1型T细胞应答方向的能力(也可 以用活的或死的)，例如但不限于乳芽孢杆菌(Lactobacillus)种(如嗜 酸乳芽孢杆菌)和/或分枝杆菌种(如牝牛分枝杆菌)。
这种类型的口服疫苗在粘膜表面已经寄居有细菌时作用最佳(因为 这些细菌可再次刺激新近在粘膜中重新定位的细胞)，即作为治疗性疫 苗。但是它也可以用作预防性疫苗。
为避免胃酸灭活细菌，可使用肠溶胶囊(或类似物)沿小肠释放细菌 内容物。另一种选择是在施用特异的抗原或细菌以图诱导针对潜在粘 膜病原体的特异性免疫应答前，长期使用非特异性细菌以建立更持久 的Th1粘膜环境。所述的“非特异性”细菌单独并不诱导特异性的保 护。
非特异性的细菌也可以加强对来自肠胃外途径的某些抗原的应 答，特别是影响粘膜保护的那些(通过促进特定免疫结果的出现)。
革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌结合作为益生菌佐剂在这一系统中 具有协同活性，并且也包含在本发明的范围内。由于粘膜免疫系统对 所有的粘膜表面(例如尤其是支气管，窦道和中耳等)是共同的，所以各 种呼吸粘膜表面均可得到保护。
下面通过特定的但是非限定性的实施例对本发明进行更具体的描 述。 实施例1：益生细菌对Th1/Th2细胞因子应答的影响
为确定益生细菌是否下调Th2并上调Th1细胞因子应答，用饲喂 针经胃内将不同数量的嗜酸乳芽孢杆菌(获自University of New South Wales，School of Microbiology and Immunology Culture Collection，Sydney，澳大利亚)喂给C57/B16小鼠，连续喂养两周，此 后通过腹膜注射0.2mL磷酸盐缓冲液中的8μg卵清蛋白(OVA)和氢氧 化铝以致敏小鼠。上述小鼠在处死前，进一步用嗜酸乳芽孢杆菌喂10 次，每两天一次共两周。过筛切割脾脏以分离淋巴细胞，用PBS洗并 按10×106重悬。将1mL小份的细胞悬液分配到24-孔平底微滴定板 的孔中，用OVA(5μg/mL)进行刺激。培养4天后，收集上清液，通 过标准的ELISA技术用IL-4或IFN-γ单克隆抗体对分析IL-4和IFN-γ 的产量。
简要地说，24-孔微滴定板的板孔用俘获抗-IL-4抗体包被。在室温 下温育1小时后，洗孔并将生物素酰化的抗-IL-4抗体加到每孔中。再 温育1小时后，洗孔并向每孔中加入链霉亲和素-过氧化物酶偶联物。 温育30分钟后，洗孔并加入TMB底物。在ELISA平板读数器中于 450/620nm下读取显示的颜色。在未知的样品中IL-4的水平利用标准 曲线通过插值法定量。用类似的步骤测定IFN-γ。
在图1A和B中显示的结果表明饲喂嗜酸乳芽孢杆菌导致IL-4的 产生以剂量依赖方式受到抑制(图1A)而IFN-γ的产生增强(图1B)。 实施例2：通过单次腔内给予活的嗜酸乳芽孢杆菌和死NTHi诱导 NTHi从呼吸道中的增强清除
我们利用大鼠模型研究了嗜酸乳芽孢杆菌增强从呼吸道中清除非 典型的流感嗜血杆菌(NTHI)的能力。
DA大鼠(200-250克，8-10周龄，Animal Resource Centre，Perth， WA)通过单次腔内(IL)注射(进入小肠腔)0.75mL仅含5×109个死 NTHi或还含2.5×1010个嗜酸乳芽孢杆菌的PBS进行免疫(如表1所 示)。所述的IL给药在剖腹手术暴露出十二指肠后通过直接注射到肠 腔中完成。这被认为等价于口服摄入后被释放到肠腔中的包肠溶衣药 (如可以制备用于人的包肠溶衣药)。在第14天用单独的(A组)或含 5×108个死NTHI(B-D组)的50μL PBS给所述的大鼠进行气管内(IT) 加强。在第21天用50μL PBS中的5×108个活NTHI对小鼠进行气 管内感染。4小时后，将大鼠处死，在巧克力琼脂平板上接种10倍系 列稀释的支气管灌洗液(BAL)或肺匀浆物(LH)以确定NTHI在BAL和 LH中的总数。37℃过夜培养后计长出的菌落数。BAL和LH中的总 细菌数由菌落形成单位(CFU)表示，如表2所示。
表1：大鼠组：IL给药和IT加强 组 IL给药 IT加强 A PBS PBS B NTHi NTHi C NTHi/嗜酸乳芽孢杆菌 NTHi D 嗜酸乳芽孢杆菌 NTHi
表2.由呼吸道回收的活NTHi(平均值±SEM) 组 BAL CFU(106) LH CFU(106) A 3.2±1.1 19.4±5.9 B 1.0±0.3 19.2±10.4 C 0.5±0.3a，c 3.3±0.7b，d D 1.7±0.3 25.9±10.0
a，p＝0.034，与A组相比
b，p＝0.018，与A组相比
c，p＝0.264，与B组相比
d，p＝0.165，与B组相比
p＜0.05被认为是统计学上显著的
这些数据表明死NTHi与活嗜酸乳芽孢杆菌的组合比单独的NTHi 或单独的嗜酸乳芽孢杆菌都更有效。 实施例3：NTHi自饲喂嗜酸乳芽孢杆菌的免疫大鼠的肺部的清除增加
通过管饲法将1.0mL PBS中的5×1010个嗜酸乳芽孢杆菌或单独的 PBS喂给DA大鼠(200-250克，8-10周龄，Animal Resource Centre， Perth，WA)，每两天一次共7天，其间所述大鼠通过腔内(IT)施用 0.5ml PBS中的福尔马林灭活的NTHI(每只大鼠5×109个)进行免疫。 继续饲喂大鼠，每2天一次共2周，之后，经气管内(IT)途径用含 有福尔马林灭活的NTHi(每只大鼠5×108个)的50μl PBS进行加 强。继续饲喂嗜酸乳芽孢杆菌7天后，用50μL PBS中的5×108个活 NTHI对大鼠进行IT感染。4小时后，如实施例2中所述在BAL和 LH中确定肺内微生物的寄居水平。不同组的免疫和喂养情况列于表3。 细菌回收情况列于表4。
表3：大鼠组：给药方案 组(每组5只大鼠) 饲喂 IL给药 IT加强 A Nil PBS PBS B Nil NTHi NTHi C 嗜酸乳芽孢杆菌 PBS PBS D 嗜酸乳芽孢杆菌 NTHi NTHi
表4由肺部回收的活NTHi 组 BAL CFU(106/ml) LH CFU(106/mL) A 25.9±7.4 90.2±29.0 B 4.6±3.0a 4.9±1.2b C 0.7±0.3c 12.5±5.7d D 0.2±0.1e，g 3.2±2.0f，h ap＝与A相比为0.011 gp＝与B相比为0.235 bp＝与A相比为0.018 hp＝与B相比在统计学上不显著 cp＝与A相比为0.043 dp＝与A相比为0.093 ep＝与A相比为0.018 fp＝与A相比为0.033
用嗜酸乳芽孢杆菌喂养并用死NTHi免疫的大鼠比仅用死NTHi 免疫或仅用嗜酸乳芽孢杆菌喂养的大鼠更抗NTHi在肺部的感染。而 且，用管饲法重复饲喂嗜酸乳芽孢杆菌的大鼠比给予单一的嗜酸乳芽 孢杆菌大丸剂的大鼠(实施例2)更抗感染。不希望受任何特定的作用机 制约束，但这些数据表明清除的加强可能是由于重复喂养后提高了嗜 酸乳芽孢杆菌在肠内的寄居所致。 实施例4：死NTHi和活发酵乳芽孢杆菌的腔内给药提供了对后续急性 NTHi感染的增强保护
用急性NTHi呼吸道感染大鼠模型对单独的或与死NTHi结合的发 酵乳芽孢杆菌增强清除NTHi的能力进行了评估。
无特异病原体的DA大鼠(177-200g)从Central Animal house， (University of Newcastle，Newcastle，NSW)获得。5只大鼠为一组， 如下述表5所述将0.75mL PBS，或仅含5×109个死NTHi的PBS，或 者含5×109个死NTHi加2.5×1010个发酵乳芽孢杆菌的PBS，或者仅含 2.5×1010个发酵乳芽孢杆菌的PBS，一次注射到大鼠小肠肠腔中。在 第14天，用50μl PBS通过IT假加强A组大鼠，用50μL含5×108个 死NTHi的PBS加强B-D组的大鼠。在第21天，用50μL PBS中的5×108 个活NTHi通过IT感染大鼠。4小时后通过腹膜内施用过量的戊巴比 妥将大鼠处死。用10mL PBS灌洗肺部获得支气管肺泡灌洗液(BAL)。 然后，将肺在10mL PBS中进行匀浆以获得肺匀浆物(LH)。BAL和 HL中的细菌数通过将BAL和HL系列稀释并再将已知的体积接种到 巧克力平板上进行测定。在37℃下过夜培养后，计数菌落数并确定 BAL和HL中的菌落形成单位(CFU)的总数。每个大鼠组中的细菌数 量列于表6。
表5：用死NTHi和活的发酵乳芽孢杆菌的如下多种结合对大鼠 (每组5只)作单次腔内给药： 大鼠组 IL免疫 IT加强 A PBS PBS B NTHi5×109 NTHi5×108 C NTHi5×109+ 发酵乳芽孢杆菌2.5×1010 NTHi5×108 D 发酵乳芽孢杆菌2.5×1010 NTHi5×108
表6：从肺中回收的活NTHi： 大鼠组 BAL CFU(106) LH CFU(106) A(5) 3.67±1.30 103.5±34.2 B(5) 0.40±0.22P＝0.038* 17.4±6.8P＝0.039* C(5) 0.27±0.11P＝0.032* 5.7±1.5P＝0.021* D(5) 0.49±0.19P＝0.042* 0.82±0.37P＝0.017*
*与A组相比
另外，对于LH，B＞D(P＝0.041)，和C＞D(P＝0.015).
这些数据提示单独的或与死NTHi结合的发酵乳芽孢杆菌与单独 的死NTHi相比可以更为有效地预防接下来的急性呼吸道感染。因此， 此乳芽孢杆菌菌株也能有效地抗急性呼吸道感染。 实施例5：与固定的NTHi剂量一起施用的嗜酸乳芽孢杆菌的剂量范围 研究
无特异病原体的DA大鼠(197-230g)从Central Animal house (University of Newcastle，Newcastle，NSW)获得。6只大鼠为一组， 如下述表7所述单次IL施用PBS，或固定剂量的死NTHi(5×109)加一 种不同剂量的活嗜酸乳芽孢杆菌。在第14天用50μl PBS假加强A组 大鼠，用50μL含5×108个死NTHi的PBS加强B-D组的大鼠。加强 是通过气管内递送的方式进行的。在第21天，用50μL PBS中的5×108 个活NTHi通过气管内滴注感染大鼠。4小时后通过腹膜内施用过量的 戊巴比妥将大鼠处死。用10mL PBS灌洗肺以获得支气管肺泡灌洗液 (BAL)。然后将肺脏在10mL PBS中进行匀浆化以获得肺匀浆物 (LH)。BAL和LH中的细菌数通过将BAL和LH系列稀释并再将 已知的体积接种到巧克力平板上进行测定。在37℃下过夜培养后，数 菌落数并确定在BAL和LH中的菌落形成单位(CFU)总数。每个大鼠 组中的细菌数量列于表8。
表7：大鼠组：IT给药和IT加强 大鼠组 IL免疫 IT加强 A(6) PBS PBS B(5) NTHi+嗜酸乳芽孢杆菌2×108 NTHi C(6) NTHi+嗜酸乳芽孢杆菌1×109 NTHi D(6) NTHi+嗜酸乳芽孢杆菌5×109 NTHi E(6) NTHi+嗜酸乳芽孢杆菌2.5×1010 NTHi
表8：从肺部回收的活NTHi： 大鼠组 BAL CFU(106) LH CFU(106) A(6) 1.96±0.54 17.9±4.5 B(5) 0.65±0.46 3.3±1.7P＝0.021* C(6) 1.22±0.49 4.7±1.4P＝0.019* D(6) 0.71±0.22 6.8±2.8 E(6) 3.75±1.74 13.2±5.2
*与A组相比。
较低剂量的乳芽孢杆菌比较高剂量的乳芽孢杆菌更有效。还是不 希望受任何特定的作用机制的限制，但这些数据提示“佐剂作用”方 式可能与仅用乳芽孢杆菌的作用方式不同。
由上述结果，用于人的等价剂量可能是大约1×108到1×1012个细 菌。 实施例6：对NTHi免疫的最佳剂量大小/给药方案的评估
我们确定了对于死NTHi免疫的最佳剂量大小和给药方案。所评估 的不同方案列于表9。评估了单次IL给药，单次IL给药后接一次管 饲法给药，和单次IL给药后接两次管饲法给药。仅一次给药可通过IL 方式进行，因为这涉及到手术暴露十二指肠。从动物论理学考虑仅允 许一次手术干预。因此接下来通过管饲法递送给药。
表9：给药方案 方案 第1次给药 (IL) 第2次给药 (管饲法) 第3次给药 (管饲法) IT加强 感染/死亡 1 第0天 - - 第28天 第35天 2 第0天 第14天 - 第28天 第35天 3 第0天 第14天 第21天 第28天 第35天
结果：
(i)方案1
无特异病原体的DA大鼠(187-213g)从Central Animal house (University of Newcastle，Newcastle，NSW)获得。按表9中方案1单次 IL给予大鼠(6只为一组)表10中所示不同剂量大小的死NTHi。所述 的死NTHi含于0.3mL PBS中。用PBS(A组)或2×107个死NTHi(B-D 组)进行IT加强。用50μL含5×108个活NTHi的PBS对大鼠进行气管 内感染。从BAL和LH中回收的细菌列于表11。
表10：在方案1中测定的剂量大小 大鼠组 IL免疫 IT加强 A PBS PBS B NTHi3×109 NTHi2×107 C NTHi3×108 NTHi2×107 D NTHi3×107 NTHi2×107
表11：从肺部回收的活NTHi： 大鼠组 BAL CFU(106) LH CFU(106) A(5) 1.12±0.20 17.1±1.9 B(6) 0.76±0.14P＝0.029a 8.0±1.5P＝0.042* C(6) 0.70±0.20P＝0.030a 5.2±1.4P＝0.0006* D(6) 1.76±0.37 16.1±4.7
a与D组相比
*与A组相比
显然，对于单次IL给药进行的免疫，较高剂量水平(3×109和 3×108)在提供保护性免疫方面起到同等效果。最低的剂量(3×107)不起 作用。
(ii)方案2
无特异病原体的DA大鼠(187-219g)从Central Animal house (University of Newcastle，Newcastle，NSW)获得。按表9中方案2单次 IL给予大鼠(6只为一组)表12中所示不同剂量大小的死NTHi。所述 的死NTHi含于0.3mL PBS中。用PBS(A组)或50μl PBS中的2×107 个死NTHi(B-D组)进行IT加强。用50μL含5×108个活NTHi的PBS 对大鼠进行气管内感染。从BAL和LH中回收的细菌列于表13。
表12：方案2中测试的剂量大小 大鼠组 IL给药 口服给药 IT加强 感染/死亡 A PBS PBS PBS NTHi3×108 B NTHi3×107 NTHi3×107 NTHi8×107 NTHi3×108 C NTHi3×108 NTHi3×108 NTHi8×107 NTHi3×108 D NTHi3×109 NTHi3×109 NTHi8×107 NTHi3×108 天 0 14 28 35
表13：由肺部回收的活细菌： 大鼠组 BAL CFU(106) LH CFU(106) A(6) 12.7±4.0 44.7±10.0 B(5) 2.9±1.3 13.5±1.2P＝0.019* C(5) 5.1±3.4 17.2±4.7P＝0.042* D(6) 2.9±4.0P＝0.042* 15.4±9.8P＝0.045*
*与A组相比。
显然，当给药两次时，所有三种剂量大小在LH中给出同等程度的 保护。在BAL中这三种剂量的保护水平也是相似的，但本试验中只有 最高剂量才有统计学上的显著性。
(ii)方案3
无特异病原体的DA大鼠(176-213g)从Central Animal house (University of Newcastle，Newcastle，NSW)获得。按表9中方案3单次 IL给予大鼠(6只为一组)表14中所示不同剂量大小的死NTHi。所述 的死NTHi含于0.3mL PBS中。用50μl PBS(A组)或50μl PBS中的 2×107个死NTHi(B-D组)进行IT加强。用50μL含5×108个活NTHi 的PBS对大鼠进行气管内感染。从BAL和LH中回收的细菌列于表 15。
表14：方案3中测定的剂量大小 大鼠组 IL给药 口服给药 IT加强 感染/死亡 A PBS PBS PBS NTHi3×108 B NTHi3×107 NTHi3×107 NTHi8×107 NTHi3×108 C NTHi3×108 NTHi3×108 NTHi8×107 NTHi3×108 D NTHi3×109 NTHi3×109 NTHi8×107 NTHi3×108 天 0 14和21 28 35
表15：从肺部回收的活细菌： 大鼠组 BAL CFU(106) LH CFU(106) A(6) 2.2±0.7 16.8±8.0 B(6) 0.48±0.23P＝0.045* 3.3±1.4 C(6) 0.79±0.21 5.6±1.8 D(6) 0.45±0.23P＝0.042* 3.7±1.5
*与A组相比
对3次肠内给药(1次IL加2次管饲法给药)，所有的三个剂量水 平提供了类似的保护。三次给药与二次给药(方案2)相比没有明显的优 势。
由上述数据，用于人的等价剂量可能是大约1×108到1×1012个细菌。 实施例7：通过单次IL给药用NTHi和嗜酸乳芽孢杆菌进行长期免疫
我们用试验确定通过添加嗜酸乳芽孢杆菌提供的增强保护的持续 时间。无特异病原体的DA大鼠(201-293g)从Central Animal house (University of Newcastle，Newcastle，NSW)获得。6只大鼠为一组， 如表16所示IL给予0.75mL PBS，或含5×109个死NTHi的PBS，或 者含5×109个死NTHi与2.5×1010个活嗜酸乳芽孢杆菌的混合物的 PBS。如表16所示，14天后用50μL PBS或含5×108个死NTHi的 PBS对大鼠进行IT加强。IL给药后3个月，用50μL含5×108个活 NTHi的PBS进行气管内(IT)感染大鼠。感染后4小时，处死大鼠， 制备BAL和LH并如上述实施例中所述确定总的细菌数并以菌落形成 单位(CFU)表示。
表16：大鼠组：IL给药和IT加强 大鼠组 IL免疫 IT加强 A PBS PBS B NTHi NTHi C 嗜酸乳芽孢杆菌 PBS D NTHi+嗜酸乳芽孢杆菌 NTHi
表17：由肺部回收的活细菌数： 大鼠组 BAL CFU(106) LH CFU(106) A(6) 6.2±1.3 10.4±1.7 B(6) 1.7±0.4P＝0.007* 7.3±1.4P＝0.02a C(6) 3.0±0.8 18.8±3.9 D(5) 2.6±2.0 16.6±8.4 注释：D组中的一只大鼠在通过外科手术实施IL给药时死亡。
*与A组相比
a与C组相比。
通过此3个月的实验，用单独的NTHi进行免疫最有效。在此期间 添加嗜酸乳芽孢杆菌没有明显的效果。
尽管本发明参照具体的实施例和优选的实施方案进行了描述，但 应当理解的是符合本文所述的本发明的广义概念和精神的变化形式也 包括在本发明的范围内。
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