用于癌症和其他疾病的亲病灶性靶向基因递送系统
阅读：98发布：2023-02-25
专利汇可以提供用于癌症和其他疾病的亲病灶性靶向基因递送系统专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且提供了亲病灶性的(寻找病变的)靶向基因递送系统，包括具有极高滴度的病毒颗粒。特别地，病毒颗粒经过工程化可特异性地将 治疗 性或诊断性药剂递送至病变部位，如癌症转移部位。还提供个性化的 给药 方案以有效地治疗 疾病 如癌症，并且可减少不良 副作用 。，下面是用于癌症和其他疾病的亲病灶性靶向基因递送系统专利的具体信息内容。
1.一种对受试对象预防发生、治疗或防止复发/再发与暴露的细胞外 基质相关的疾病或病症的方法，包括：向受试对象施用治疗有效量的滴 度至少为每毫升2×109集落形成单位(cfu/ml)的逆转录病毒载体，其中该 逆转录病毒载体包含一种包含受体结合区的修饰的病毒包膜蛋白，其中 该受体结合区修饰为包含具有可结合细胞外基质成分的结合区的靶向 多肽。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述疾病或病症是癌症、肿瘤、 心血管疾病、慢性炎症、自身免疫性疾病、类风湿性关节炎、狼疮、糖 尿病、银屑病、子宫内膜异位症、新生血管性青光眼、肥胖症、肝硬化、 结缔组织病、与胶原暴露相关的血管病、新内膜形成、血管损伤、再狭 窄、纤维化、溃疡性病变、炎症、激光损伤、角膜浑浊、手术损伤、关 节炎性关节、伤疤或瘢痕疙瘩。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述疾病或病症是癌症或肿瘤的 转移。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述疾病或病症选自乳腺癌、皮 肤癌、骨癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、脑癌、子宫癌、喉癌、胆囊癌、 胰腺癌、直肠癌、甲状旁腺癌、甲状腺癌、肾上腺癌、神经组织癌、头 颈癌、结肠癌、胃癌、支气管癌、肾癌、基底细胞癌、溃疡型和乳头样 鳞状细胞癌、转移性皮肤癌、骨肉瘤、尤因肉瘤、网状细胞肉瘤、骨髓 瘤、巨细胞瘤、小细胞肺肿瘤、胆结石、胰岛细胞瘤、原发性脑肿瘤、 急性和慢性淋巴细胞瘤和粒细胞瘤、毛细胞瘤、腺瘤、增生、髓样癌、 嗜铬细胞瘤、粘膜神经瘤、肠神经节瘤、增生性角膜神经瘤、马方综合 征样体质肿瘤、肾母细胞瘤、精原细胞瘤、卵巢肿瘤、平滑肌肿瘤、宫 颈发育异常和原位癌、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、软组织肉瘤、 纤维肉瘤、恶性类癌瘤、局部皮肤损伤、蕈样肉芽肿、横纹肌肉瘤、卡 波西肉瘤、成骨肉瘤和其他肉瘤、恶性高钙血症、肾细胞瘤、真性红细 胞增多症、腺癌、多形性胶质母细胞瘤、白血病、淋巴瘤、恶性黑素瘤、 表皮样癌和其他癌和肉瘤。
5.如权利要求3所述的方法，其中所述疾病或病症是骨肉瘤、肉瘤、 胰腺癌、乳腺癌或结肠癌。
6.如权利要求1所述的方法，还包括：向受试对象施用不同的治疗 剂。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述不同的治疗剂是不同于逆转 录病毒载体的化疗药剂或生物制剂。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述受试对象是人。
9.如权利要求8所述的方法，其中，在施用逆转录病毒载体后，该 人遭受的不良副作用相比他或她接受不同于所述逆转录病毒载体的化 疗药剂或生物制剂时减少。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述不良副作用选自脱发、毛 发减少、毛发变细或微小化、骨髓抑制、肝功能和肾功能的实质性不良 改变、恶心、呕吐、粘膜炎、皮疹和便秘。
11.如权利要求1所述的方法，其中治疗有效量的逆转录病毒载体 经局部、静脉内、动脉内、结肠内、气管内、腹膜内、鼻内、血管内、 鞘内、颅内、骨髓内、胸膜内、皮内、皮下、肌内、眼内、骨内和/或滑 膜腔内给药。
12.如权利要求11所述的方法，其中通过静脉内输注向受试对象 施用治疗有效量的逆转录病毒载体。
13.如权利要求1所述的方法，其中所述靶向多肽是胶原结合结构 域。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述胶原结合结构域包括冯 维勒布兰德因子D2结构域衍生的肽。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述冯维勒布兰德因子是牛 冯维勒布兰德因子。
16.如权利要求15所述的方法，其中肽包含氨基酸序列 Gly-His-Val-Trp-Arg-Glu-Pro-Ser-Phe-Met-Ala-Lys-Ser-Ala-Ala(SEQ ID NO：1)。
17.如权利要求15所述的方法，其中肽包含氨基酸序列 Gly-His-Val-Gly-Trp-Arg-Glu-Pro-Ser-Phe-Met-Ala-Lys-Ser-Ala-Ala(SEQ ID NO：2)。
18.如权利要求1所述的方法，其中所述修饰的病毒包膜蛋白是双 嗜性的。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述修饰的双嗜性病毒包膜 是4070A双嗜性包膜蛋白。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述4070A双嗜性包膜蛋白 包括含有胶原结合结构域的靶向多肽。
21.如权利要求19所述的方法，其中所述靶向多肽包含于4070A 双嗜性包膜蛋白的gp70部分中。
22.如权利要求1所述的方法，其中所述逆转录病毒载体包含与启 动子有效连接的异源核酸序列，其中该序列编码诊断性或治疗性多肽。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述治疗性多肽选自抑癌多 肽、促凋亡多肽、胸苷激酶、细胞因子和杀细胞多肽。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述杀细胞多肽是细胞周期 蛋白G1的N末端缺失突变体。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述细胞周期蛋白G1的N 末端缺失突变体包含人细胞周期蛋白G1的大约氨基酸41至249。
25.如权利要求22所述的方法，其中所述细胞因子是粒细胞巨噬 细胞集落刺激因子(GM-CSF)。
26.如权利要求22所述的方法，其中所述胸苷激酶是单纯疱疹病 毒胸苷激酶。
27.如权利要求1所述的方法，其中所述逆转录病毒载体以 1.0×1010cfu-1.0×1012cfu的每日剂量给药。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述每日剂量连续给药五天。
29.如权利要求27所述的方法，其中所述每日剂量一周两次给药。
30.如权利要求27所述的方法，其中所述每日剂量一周三次给药。
31.如权利要求27所述的方法，其中所述逆转录病毒载体以约 1-500ml的体积给药。
32.如权利要求1所述的方法，其中所述逆转录病毒载体以1×1011 cfu-1×1014cfu的每周剂量给药。
33.如权利要求1所述的方法，其中治疗有效量的逆转录病毒载体 按包括治疗四周接着休息两周的治疗周期给药。
34.如权利要求33所述的方法，其中如果受试对象表现出客观反 应则再给予另一个治疗周期。
35.如权利要求34所述的方法，其中所述疾病是癌症并且其中客 观反应包括临床观察、放射检查结果、组织病理学结果、免疫组织化学 结果和临床化学结果。
36.如权利要求35所述的方法，其中所述临床观察包括通过测径 器或触诊检测到肿瘤大小缩小，机体状态改善，包括食欲增加、活动性 增强、疼痛减少，或对支持性医护的需要减少，包括麻醉药或氧气的使 用减少。
37.如权利要求35所述的方法，其中所述放射检查结果包括MRI、 x射线、CT、PET、SPECT或超声检查结果。
38.如权利要求35所述的方法，其中所述组织病理学结果包括与 以前的结果或历史对照相比凋亡的肿瘤或新血管系统细胞的百分比增 加、坏死的肿瘤或新血管系统细胞的百分比增加、反应性纤维化的百分 比增加。
39.如权利要求35所述的方法，其中所述免疫组织化学结果包括 肿瘤浸润淋巴细胞的百分比增加或者表达细胞因子转基因的肿瘤细胞 出现或百分比增加。
40.如权利要求1所述的方法，还包括给予治疗有效量的包含与启 动子有效连接的异源核酸序列的逆转录病毒载体，其中该序列编码不同 的治疗性多肽。
41.如权利要求40所述的方法，其中所述不同的治疗性多肽是GM -CSF。
42.如权利要求1所述的方法，其中所述病毒颗粒在受试对象的胶 原暴露区域聚集。
43.如权利要求42所述的方法，其中胶原暴露区域包括肿瘤病变 部位、血管生成活跃区域、肿瘤病变部位、血管损伤部位、手术部位、 炎症部位和组织破坏区域。
44.一种采用治疗性病毒颗粒治疗具有一个或多个肿瘤(含有癌细 胞的肿瘤的受试对象的方法，该方法包括：
a)通过以下步骤确定治疗性病毒颗粒的剂量：
i)按受试对象肿瘤内存在的癌细胞数或肿瘤内的肿瘤细胞总数来 确定受试对象的肿瘤负荷；
ii)用治疗性病毒颗粒的生理感染复数(pMOI)乘以肿瘤负荷；和
iii)将得到的数值除以治疗性病毒颗粒的滴度，得到向受试对象施 用治疗性病毒颗粒的体积；
b)向受试对象施用已确定的治疗性病毒颗粒的剂量；
c)监测该一个或多个肿瘤对治疗的应答；和
d)按肿瘤控制的需要重复步骤a)-c)。
45.如权利要求44所述的方法，其中逆转录病毒载体以1.0×1010 cfu-1.0×1012cfu的每日剂量给药。
46.如权利要求45所述的方法，其中所述每日剂量连续给药五天。
47.如权利要求45所述的方法，其中所述每日剂量一周两次给药。
48.如权利要求45所述的方法，其中所述每日剂量一周三次给药。
49.如权利要求44所述的方法，其中所述逆转录病毒载体以约为 1-500ml的体积给药。
50.如权利要求44所述的方法，其中所述逆转录病毒载体以1×1011 cfu-1×1014cfu的每周剂量给药。
51.如权利要求44所述的方法，其中治疗有效量的逆转录病毒载 体按包括治疗四周接着休息两周的治疗周期给药。
52.如权利要求44所述的方法，其中按以下公式计算以毫升为单 位的治疗性病毒颗粒的剂量：
其中pMOI是4-250。
53.如权利要求52所述的方法，其中pMOI是大约100。
54.如权利要求44所述的方法，其中按以下公式确定肿瘤负荷：
(目标病变或肿瘤的最长直径之和(cm))×1×109癌细胞/cm。
55.如权利要求54所述的方法，其中通过测径器或放射成像技术 测量目标病变或肿瘤。
56.如权利要求55所述的方法，其中所述放射成像技术是MRI、 CT、PET或SPECT扫描。
57.如权利要求44所述的方法，其中治疗性病毒颗粒经局部、静 脉内、动脉内、结肠内、气管内、腹膜内、鼻内、血管内、鞘内、颅内、 骨髓内、胸膜内、皮内、皮下、肌内、眼内、骨内和/或滑膜腔内给药。
58.如权利要求57所述的方法，其中通过静脉内输注向受试对象 施用治疗性病毒颗粒。
59.如权利要求44所述的方法，其中所述受试对象是人。
59.如权利要求44所述的方法，其中所述癌症选自乳腺癌、皮肤癌、 骨癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、脑癌、子宫癌、喉癌、胆囊癌、胰腺癌、 直肠癌、甲状旁腺癌、甲状腺癌、肾上腺癌、神经组织癌、头颈癌、结 肠癌、胃癌、支气管癌、肾癌、基底细胞癌、溃疡型和乳头样鳞状细胞 癌、转移性皮肤癌、骨肉瘤、尤因肉瘤、网状细胞肉瘤、骨髓瘤、巨细 胞瘤、小细胞肺肿瘤、胆结石、胰岛细胞瘤、原发性脑肿瘤、急性和慢 性淋巴细胞瘤和粒细胞瘤、毛细胞瘤、腺瘤、增生、髓样癌、嗜铬细胞 瘤、粘膜神经瘤、肠神经节瘤、增生性角膜神经瘤、马方综合征样体质 肿瘤、肾母细胞瘤、精原细胞瘤、卵巢肿瘤、平滑肌肿瘤、宫颈发育异 常和原位癌、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、软组织肉瘤、纤维肉瘤、 恶性类癌瘤、局部皮肤损伤、蕈样肉芽肿、横纹肌肉瘤、卡波西肉瘤、 成骨肉瘤和其他肉瘤、恶性高钙血症、肾细胞瘤、真性红细胞增多症、 腺癌、多形性胶质母细胞瘤、白血病、淋巴瘤、恶性黑素瘤和表皮样癌。
60.如权利要求44所述的方法，其中所述癌症是是骨肉瘤、肉瘤、 胰腺癌、乳腺癌或结肠癌。
61.如权利要求44所述的方法，其中所述病毒颗粒在受试对象的 胶原暴露区域聚集。
62.如权利要求61所述的方法，其中所述胶原暴露区域包括肿瘤 病变部位、血管生成活跃区域、肿瘤病变部位、血管损伤部位、手术部 位、炎症部位和组织破坏区域。
63.如权利要求44所述的方法，其中所述治疗性病毒颗粒是具有 经修饰后包含胶原结合结构域的包膜蛋白的逆转录病毒载体，并且编码 对抗癌症的治疗剂。
64.如权利要求44所述的方法，其中所述监测方式选自临床观察、 放射检查结果、组织病理学结果、免疫组织化学结果和临床化学结果。
65.如权利要求64所述的方法，其中所述临床观察包括通过测径 器或触诊检测到肿瘤大小缩小，机体状态改善，包括食欲增加、活动性 增强、疼痛减少，或对支持性医护的需要减少，包括麻醉药或氧气的使 用减少。
66.如权利要求64所述的方法，其中所述放射检查包括MRI、x 射线、CT、PET、SPECT或超声检查。
67.如权利要求64所述的方法，其中所述组织病理学结果包括与 以前的结果或历史对照相比凋亡的肿瘤或新血管系统细胞的百分比增 加、坏死的肿瘤或新血管系统细胞的百分比增加、反应性纤维化的百分 比增加。
68.如权利要求64所述的方法，其中所述免疫组织化学结果包括 肿瘤浸润淋巴细胞的百分比增加或者表达细胞因子转基因的肿瘤细胞 出现或百分比增加。
69.如权利要求63所述的方法，其中所述逆转录病毒载体是双嗜 性的。
70.如权利要求63所述的方法，其中所述治疗剂是细胞周期蛋白 G1突变体。
71.如权利要求63所述的方法，其中所述治疗剂是GM-CSF。
72.如权利要求44所述的方法，其中所述肿瘤控制包括肿瘤根除、 完全肿瘤应答、部分肿瘤应答、疾病稳定和预防复发。
73.如权利要求44所述的方法，还包括在施用治疗性病毒颗粒之 前、同时或之后向受试对象施用化疗药、生物制剂或放射治疗。
74.如权利要求44所述的方法，还包括施用另外的编码不同的抗 癌治疗剂的治疗性病毒颗粒。
75.如权利要求74所述的方法，其中所述另外的病毒颗粒在施用 其他病毒颗粒之前、同时或之后施用。
76.如权利要求74所述的方法，其中所述不同的治疗剂是细胞因 子或胸苷激酶。
77.如权利要求76所述的方法，其中所述细胞因子选自GM-CSF、 TNF-α、IFN-α、IFN-γ；白介素1(IL1)、白介素β(IL-β)、白介素2(IL2)、 白介素4(IL4)、白介素5(IL5)、白介素6(IL6)、白介素8(IL8)、白介素 10(IL10)、白介素12(IL12)、白介素13(IL13)、白介素14(IL14)、白介 素15(IL15)、白介素16(IL16)、白介素18(IL18)、白介素23(IL23)、白 介素24(IL24)。
78.一种通过包括以下步骤的方法制备的逆转录病毒载体：
a)用以下物质瞬时转染生产细胞：
i)第一质粒，其包含编码修饰为含有胶原结合结构域的4070A双 嗜性包膜蛋白的核酸序列，其中该核酸序列与启动子有效连接；
ii)第二质粒，其包含：
与启动子有效连接的核酸序列，其中该序列编码病毒gag-pol多肽，
与启动子有效连接的核酸序列，其中该序列编码能将抗药性赋予生 产细胞的多肽，
SV40复制起点；
iii)第三质粒，其包含：
与启动子有效连接的异源核酸序列，其中该序列编码诊断性或治疗 性多肽，
5’和3’长末端重复序列(LTR)，
ψ逆转录病毒包装序列，
位于5’LTR上游的CMV启动子，
与启动子有效连接的核酸序列，其中该序列编码能将抗药性赋予生 产细胞的多肽，
SV40复制起点，
其中所述生产细胞是表达SV 40大T抗原的人细胞；
b)在允许产生靶向递送载体并释放至培养上清液中的条件下，培 养a)的生产细胞；
c)分离上清液并将其引入闭环多管系统中以收集病毒颗粒；和
d)收集逆转录病毒载体。
79.如权利要求78所述的载体，其中所述第一质粒是Bv1/pCAEP 质粒。
80.如权利要求78所述的载体，其中所述第一质粒是pB-RVE质 粒。
81.如权利要求78所述的载体，其中所述第二质粒是pCgpn质粒。
82.如权利要求78所述的载体，其中所述第三质粒是 pdnG1/UBER-REX质粒。
83.如权利要求78所述的载体，其中所收集的逆转录病毒颗粒的 病毒滴度约为1×109-1×1014集落形成单位/毫升。
84.如权利要求78所述的载体，其中所收集的逆转录病毒颗粒的 病毒滴度至少为2×109集落形成单位/毫升。
85.如权利要求78所述的载体，其中所收集的逆转录病毒颗粒的 病毒滴度至少为5×109集落形成单位/毫升。
86.如权利要求78所述的载体，其中所收集的逆转录病毒颗粒的 病毒滴度为2×109-1×1014集落形成单位/毫升。
87.如权利要求78所述的载体，其中所收集的逆转录病毒颗粒的 病毒滴度为2×109-1×1013集落形成单位/毫升。
88.如权利要求78所述的方法，其中所述逆转录病毒颗粒的直径 为50nm-150nm。
技术领域
本发明总的涉及治疗各种疾病、紊乱或病症的方法和组合物。具体 地，本发明涉及制备治疗上有效的载体的方法和系统。
背景技术
在所有基因治疗方案中约有70％是针对治疗转移性癌症的。大部分 有效方案涉及通过基于细胞的细胞因子或肿瘤抗原基因转移进行的癌 症免疫治疗方式，另一些涉及肿瘤内运送溶瘤病毒或带有前药、化学保 护剂、反义构建体或肿瘤抑制基因的载体。然而，阻碍有效的癌症基因 治疗发展和应用的尚未解决的主要问题是在体内运送至靶细胞的效率 低下，这一问题取消和排除了许多直接治疗方法(Tseng和Mulligan，Surg. Oncol.Clin.N.Am.11：537-569，2002)。在这个方面，亲病灶性靶向方法的 出现为癌症基因治疗提供了新的范例。通过靶向病变的组织病理-而不 是癌细胞本身-以优化转移部位的有效载体浓度，循环基因治疗载体在 临床前研究中的安全性和有效性均得到显著增加(Gordon等人，Cancer Res.60：3343-3347，2000；Gordon等人，Hum.Gene Ther.12：193-204，2001)。 通过进一步增强基于鼠白细胞病毒的载体(选择性转导分裂细胞)的固 有特性和表现出肿瘤破坏性和抗血管生成活性的细胞周期控制基因的 重要特异性(Gordon等人，Hum.Gene Ther.12：193-204，2001)，亲病灶性 载体的临床前和临床表现确立了系统递送基因药物以生理监视和治疗 原发的、远距离的、转移的和潜伏的癌症的可能性。
期望提供改良载体、制备改良载体的系统和施用该载体的治疗方 案，以使靶向递送系统能被应用于临床环境。
期望提供改良载体、制备改良载体的系统和施用该载体的治疗方 案，以使靶向递送系统能被应用于临床环境。
发明内容
本公开内容涉及“靶向的”病毒和非病毒颗粒，包括逆转录病毒载体 颗粒、腺病毒载体颗粒、腺相关病毒载体颗粒、疱疹病毒载体颗粒和假 型病毒如水泡性口炎病毒G蛋白(VSV-G)，以及含有病毒蛋白作为病 毒体部分的非病毒载体或其他脂蛋白体基因转移载体。
还提供了用于产生靶向病毒颗粒的新型逆转录病毒表达系统、瞬时 转染的人生产细胞在制备颗粒中的应用、大规模制备病毒颗粒的生产方 法和收集并保存靶向病毒载体的方法。
在一种实施方式中，提供了一种制备靶向递送载体的方法。该方法 包括用以下物质瞬时转染生产细胞：1)第一质粒，其包含编码经修饰含 胶原结合结构域的4070A双嗜性包膜蛋白的核酸序列；2)第二质粒，其 包含i)与启动子有效连接的核酸序列，其中该序列编码病毒gag-pol多 肽；ii)与启动子有效连接的核酸序列，其中该序列编码能将抗药性赋 予生产细胞的多肽；和iii)SV40复制起点；3)第三质粒，其包含i)与 启动子有效连接的异源核酸序列，其中该序列编码诊断性或治疗性多 肽；ii)5’和3’长末端重复序列；iii)ψ逆转录病毒包装序列；iv)5’LTR 上游的CMV启动子；v)与启动子有效连接的核酸序列，其中该序列编 码能将抗药性赋予生产细胞的多肽；vi)SV40复制起点。生产细胞是表 达SV40大T抗原的人细胞。在一方面，生产细胞是293T细胞。
该方法还包括在允许靶向递送载体在培养上清液中产生的条件下 培养转染的生产细胞，分离上清液并将其引入闭环多管系统(closed loop manifold system)中以收集载体。图19A和图19B展示了一个闭环多管 系统的例子。在一种实施方式中，靶向递送载体是病毒颗粒。在另一实 施方式中，靶向递送载体是非病毒颗粒。
在一个方案中，第一质粒是Bv1/pCAEP质粒，第二质粒是pCgpn 质粒，第三质粒是pdnG1/C-REX质粒、pdnG1/C-REX II质粒、 pdnG1/UBER-REX质粒。
收集的颗粒的病毒滴度通常约为1×107-1×1011、1×108-1× 1011、1×109-1×1011、5×108-5×1010、2×109-5×1010、3×109-5× 1010、4×109-1×1010、5×109-1×1010、3×109-5×1011，至少为5×108、 1×109、2×109、3×109、4×109、5×109、8×109、1×1011、5×1010 或1×1011集落形成单位(cfu)/毫升。此外，病毒颗粒的直径通常约为10nm -1000nm、20nm-500nm、50nm-300nm、50nm-200nm或者50nm -150nm。
在一种实施方式中，胶原结合结构域包括冯维勒布兰德因子(von Willebrand factor)D2结构域衍生的肽。冯维勒布兰德因子通常来源于 哺乳动物。所述肽包括Gly-His-Val-Trp-Arg-Glu-Pro-Ser-Phe Met-Ala-Lys-Ser-Ala-Ala(SEQ ID NO：1)或 Gly-His-Val-Gly-Trp-Arg-Glu-Pro-Ser-Phe Met-Ala-Lys-Ser-Ala-Ala(SEQ ID NO：8)氨基酸序列。
在另一种实施方式中，所述肽包含于4070A双嗜性包膜蛋白的gp70 部分中。
在另一种实施方式中，治疗性多肽为细胞周期蛋白G1的N末端缺 失突变体、白介素2(IL-2)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)或 胸苷激酶。
本文披露的靶向递送载体通常包含编码诊断性或治疗性多肽的核 酸序列。如本说明书其他部分所详述，本发明的治疗性蛋白质和多肽的 例子包括但不限于自杀蛋白、凋亡诱导蛋白、细胞因子、白介素和TNF 家族蛋白质几大类。诊断性蛋白质或多肽的例子包括例如绿色荧光蛋白 和萤光素酶。
本发明的基因靶向递送系统可用于选择性靶向于具有暴露的细胞 外基质成分的组织，所述细胞外基质成分例如是胶原(如I型胶原和IV 型胶原)、层粘连蛋白、纤连蛋白、弹性蛋白、糖胺聚糖、蛋白聚糖或 RGD序列。组织中可被本发明的载体颗粒感染或转导的细胞包括但不限 于内皮细胞、肿瘤细胞、软骨细胞、结缔组织的成纤维细胞和弹性纤维 细胞；骨中的骨细胞和成骨细胞；脉管系统的内皮细胞和平滑肌细胞； 胃肠道和呼吸道的上皮细胞和上皮下细胞；纤维化肝脏的血管细胞、结 缔组织细胞和肝细胞，以及炎性组织的修补性单个核细胞和浸润性粒细 胞。
可被本发明的载体颗粒预防或治疗的疾病或病症包括但不限于与 外露的细胞外基质成分相关的疾病或病症。这种疾病或病症包括但不限 于以异常或不受控制的细胞增殖和/或异常血管发生为特征的或与之相 关的疾病。涉及异常细胞增殖和/或血管发生的疾病包括，例如：癌症(如 实体瘤和血液肿瘤，特别是转移性癌症)、心血管疾病(如动脉粥样硬 化和再狭窄)、慢性炎症(类风湿性关节炎、克罗恩病)、糖尿病(糖尿 病性视网膜病)、银屑病、子宫内膜异位症、新生血管性青光眼和肥胖 性心血管疾病；肝硬化；结缔组织病(包括韧带、腱和软骨相关疾病)； 与胶原暴露相关的血管病。载体颗粒可被用于递送治疗性基因，以恢复 内皮细胞功能和对抗血栓形成，并且抑制与新内膜形成相关的增殖和纤 维化反应。载体颗粒还可被用于预防或治疗血管损伤；再狭窄；纤维化 如肝和肺纤维化；溃疡性损伤；炎症区域；激光损伤部位如眼睛；角膜 浑浊；手术部位；关节炎性关节；伤疤；和瘢痕疙瘩。载体颗粒还可被 用于创伤愈合。
特别地，载体颗粒可被用于预防或治疗肿瘤，包括原发或继发的恶 性和非恶性肿瘤、血液疾病；以及预防或治疗癌症或肿瘤的转移。尽管 申请人不希望限于任何理论，肿瘤在侵袭正常组织或器官时会分泌酶， 例如胶原酶或金属蛋白酶，导致细胞外基质成分暴露。通过将载体颗粒 靶向于这些暴露的细胞外基质成分，载体颗粒可在接近肿瘤的暴露基质 成分处聚集，从而感染肿瘤细胞。这些肿瘤包括但不限于癌、肉瘤，例 如乳腺癌、皮肤癌、骨癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、脑癌、喉癌、胆囊 癌、胰腺癌、直肠癌、甲状旁腺癌、甲状腺癌、肾上腺癌、神经组织癌、 头颈癌、结肠癌、胃癌、支气管癌、肾癌、基底细胞癌、溃疡型和乳头 样鳞状细胞癌、转移性皮肤癌、骨肉瘤、尤因肉瘤、网状细胞肉瘤、骨 髓瘤、巨细胞瘤、小细胞肺癌、胆结石、胰岛细胞瘤、原发性脑肿瘤、 急性和慢性淋巴细胞瘤和粒细胞瘤、毛细胞瘤、腺瘤、增生、髓样癌、 嗜铬细胞瘤、粘膜神经瘤、肠神经节瘤、增生性角膜神经瘤、马方综合 征样体质肿瘤、肾母细胞瘤、精原细胞瘤、卵巢肿瘤、平滑肌 (leiomyomater)肿瘤、宫颈发育异常和原位癌、神经母细胞瘤、视网 膜母细胞瘤、软组织肉瘤、纤维肉瘤、恶性类癌瘤、局部皮肤损伤、蕈 样肉芽肿、横纹肌肉瘤、卡波西肉瘤、成骨肉瘤和其他肉瘤、恶性高钙 血症、肾细胞瘤、真性红细胞增多症、腺癌、多形性胶质母细胞瘤、白 血病、淋巴瘤、恶性黑素瘤、表皮样癌和其他癌和肉瘤。
血液病包括可导致血细胞发育异常变化的血细胞异常生长和血液 恶性肿瘤如各种白血病。血液病的实例包括但不限于急性髓细胞性白血 病、急性前髓细胞性白血病、急性淋巴母细胞性白血病、慢性淋巴细胞 性白血病、慢性髓细胞性白血病、骨髓增生异常综合征和镰状细胞贫血。
在一种实施方式中，提供了一种预防或减少受试对象患上与暴露的 细胞外基质成分相关的疾病或病症的风险的方法。该方法包括向受试对 象施用本发明的靶向载体。
在另一种实施方式中，提供了一种抑制癌症患者的癌转移的方法。 该方法包括向受试对象施用本发明的靶向载体。
在另一种实施方式中，提供了一种治疗患有与暴露的细胞外基质成 分成分相关的疾病或病症的受试对象的方法。该方法包括向受试对象施 用本发明的靶向载体。该方法还可任选地包括向受试对象施用其他治疗 剂，例如化疗药剂和生物制剂，或者在施用靶向载体之前、同时或之后 与其他疗法如放射治疗、手术和热解联合治疗受试对象。
化疗药剂的实例包括但不限于：烷基化剂，如塞替派和环磷酰胺 (CYTOXANTM)；磺酸烷基酯，如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶 类，如苯并多巴、卡波醌、美妥替哌(meturedopa)和uredopa；乙烯亚 胺和甲基蜜胺(methylamelamines)，包括六甲蜜胺、三亚乙基蜜胺、三 亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲蜜胺 (trimethylolomelamine)；乙酰精宁(特别是泡番荔枝辛(bullatacin)和 布拉它辛酮(bullatacinone))；喜树碱(包括合成的类似物托泊替康)； 苔藓抑素；callystatin；CC-1065(包括它的阿多来新、卡折来新和比折 来新合成类似物)；自念珠藻环肽类(cryptophycins)(特别是自念珠藻 环肽1和自念珠藻环肽8)；多拉司他汀；多卡米星(包括合成类似物 KW-2189和CBI-TMI)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；水鬼蕉碱 (pancratistatin)；sarcodictyin；海绵素(spongistatin)；氮芥类，如苯丁 酸氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺、雌莫司汀、异环磷酰胺、二氯甲基二乙胺、 盐酸氧化氮芥、美法仑、新氮芥、苯芥胆甾醇、泼尼莫司汀、曲磷胺、 尿嘧啶氮芥；亚硝基脲类，如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司 汀、尼莫司汀、雷莫司汀；抗生素，如烯二炔抗生素(如卡里奇霉素， 特别是卡里奇霉素γ1I和卡里奇霉素phiI1，参见如Agnew，Chem.Intl.Ed. Engl.，33：183-186(1994)；达内霉素(dynemicin)，包括达内霉素A；双 膦酸盐化合物，如氯膦酸盐；埃斯培拉霉素(esperamicin)；以及新制癌 菌素发色团和相关色蛋白烯二炔抗生素发色团)、阿克拉霉素 (aclacinomysins)、放线菌素、安曲霉素、偶氮丝氨酸、博来霉素、放 线菌素C、卡柔比星(carabicin)、洋红霉素、嗜癌霉素、色霉素、更生 霉素、柔红霉素、地托比星、6-重氮-5-氧-L-正亮氨酸、多柔比星(甲烯 土霉素TM)(包括吗啉代-多柔比星、氰吗啉代-多柔比星、2-吡咯啉并-多 柔比星和去氧多柔比星)、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、 丝裂霉素类如丝裂霉素C、麦考酚酸、诺拉霉素、橄榄霉素、培洛霉素、 泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑霉 素、链佐星、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗代谢药， 如氨甲喋呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，如二甲叶酸(demopterin)、 氨甲喋呤、蝶罗呤、三甲曲沙；嘌呤类似物，如氟达拉滨、6-巯嘌呤、 硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮尿苷、 卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷；雄 激素类，如卡普睾酮、丙酸屈他雄酮、环硫雄醇、美雄烷、睾内酪；抗 肾上腺素药，如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂，如亚叶酸 (frolinic acid)；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；恩尿嘧啶； 安吖啶；bestrabucil；比生群；edatraxate；defofamine；秋水仙胺；地吖 醌；依氟鸟氨酸；依利醋铵；埃博霉素(epothilone)；依托格鲁；硝酸 镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；类美登醇，如美登素和安丝菌素； 米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；硝氨丙吖啶；喷司他丁；蛋氨氮芥； 吡柔比星；洛索蒽醌；鬼臼酸；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；PSKTM；雷佐 生；根瘤菌素(rhizoxin)；西佐喃；锗螺胺；替奴佐酸；三亚胺醌；2，2′，2″- 三氯三乙胺；单端孢霉烯(特别是T-2毒素、verracurin A、杆孢菌素A 和anguidine)；乌拉坦；长春地辛；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露 醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿糖胞苷(″Ara-C″)；环磷酰胺； 噻替派(thiopeta)；紫杉烷(taxoid)，如紫杉醇(TAXOLTM，Bristol Meyers Squibb Oncology，Princeton，N.J.)和多西紫杉醇(TAXOTERETM， Rhone-Poulenc Rorer，Antony，法国)；苯丁酸氮芥；吉西他滨(GemzarTM)； 6-硫代鸟嘌呤；巯嘌呤；氨甲喋呤；铂类似物，如顺铂和卡铂；长春碱； 铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨 (NavelbineTM)；诺肖林；替尼泊苷；依达曲沙；柔红霉素；氨基蝶呤； xeoloda；伊班膦酸盐；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基 鸟氨酸(DMFO)；类视黄醇，如视黄酸；卡培他滨；和上述任意化合物 的药学可接受的盐、酸或衍生物。定义“化疗药剂”还包括用于调节或抑 制激素对肿瘤的作用的抗激素药，如抗雌激素药和选择性雌激素受体调 节剂(SERMs)，包括例如他莫昔芬(包括诺瓦得士(Nolvadex)TM)、雷 洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬、雷洛昔芬 (keoxifene)、LY117018、奥那司酮和托瑞米芬(法乐通(Fareston)TM)； 调节肾上腺产生雌激素的芳香酶抑制剂，例如4(5)-咪唑，氨鲁米特、醋 酸甲地孕酮(美可治(Megace)TM)、依西美坦、福美坦、法倔唑、伏氯 唑(RivisorTM)、来曲唑(弗隆(Femara)TM)和阿那曲唑(瑞宁得(Arimidex)TM)； 和抗雄激素药物，例如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林和戈舍 瑞林；和上述任意化合物的药学可接受的盐、酸或衍生物。
在一种具体实施方式中，与靶向载体联用的治疗药剂是酪氨酸激酶 抑制剂，如ZD1839(易瑞沙(Iressa)TM，AstraZeneca K.K.)；IMC-C225或 西妥昔单抗(爱必妥(Erbitux)TM)；曲妥单抗(赫赛汀(HERCEPTIN)TM)；甲 磺酸伊马替尼(格列卫(CLEEVEC)TM，以前称为STI-571)；和索拉非尼 (多吉美(Nexavar)TM)。
生物制剂可以是治疗性抗体，例如利妥昔单抗(RITUXANTM)；阿仑 单抗(坎帕斯(CAMPATH)TM)；和吉妥珠单抗奥唑米星(麦罗塔 (MYLOTARG)TM)。
通过使用靶向载体实施本发明，接受治疗的受试对象(特别是人类 受试对象)不仅自身疾病得到预防或缓解，其生活质量也有所改善，因 为本发明的靶向治疗方法能大大减轻或消除通常与其他治疗类型例如 化疗和生物治疗相关的副作用，包括脱发或毛发减少、骨髓抑制、肝功 能和肾功能明显改变、恶心和呕吐、粘膜炎、皮疹或便秘。
在该实施方式的一种变化方案中，该方法包括第一期方案，该第一 期方案包括用本文所述的病毒颗粒接触受试对象，其中受试对象接触i) 约1×109-6×109单位/天的第一病毒颗粒剂量水平，给受试对象连续 施用1至大约6天；ii)约7×109-约1×1010单位/天的第二病毒颗粒 剂量水平，给受试对象连续施用1至大约3天，再接着给予第一载体剂 量；和iii)约1×1010-约5×1010单位/天的病毒颗粒剂量水平，给受试 对象连续施用1-3天，再接着给予第二载体剂量。该方法还包括第二期 方案，该第二期方案包括用如本文所述产生的病毒颗粒接触受试对象， 其中给受试对象施用约1×109-约5×1010单位/天的病毒颗粒剂量水 平，连续1至大约15天，之后转为第一期方案。
根据该变化方案，该方法任选地包括在第一期和第二期方案之前、 同时或之后向受试对象施用化疗药剂。病毒颗粒的第一剂量水平可为约 4×109-5×109单位/天。病毒颗粒的第二剂量水平可为约9×109-约 1×1010单位/天。病毒颗粒的第三剂量水平可为约1×1010-约2×1010 单位/天。
本文披露的靶向递送载体可经局部、静脉内、动脉内、结肠内、气 管内、腹膜内、鼻内、血管内、鞘内、颅内、骨髓内、胸膜内、皮内、 皮下、肌内、眼内、骨内和/或滑膜腔内施用。
在另一实施方式中，提供了一种质粒，其包含与启动子功能连接的 多克隆位点，其中该启动子支持异源核酸序列的表达；5′和3′长末端重 复序列；ψ逆转录病毒包装序列；位于5′LTR上游的CMV启动子；与 启动子有效连接的核酸序列，其中该序列编码能将抗药性赋予含有该质 粒的生产细胞的多肽；和SV40复制起点。质粒的实例包括pC-REX II、 pC-REX和pUBER-REX。其他衍生物的实例包括那些含有编码治疗性 或诊断性多肽的异源核酸序列的质粒。
在其他实施方式中，提供了一种制备靶向递送载体的试剂盒。该试 剂盒主要包括含有本文披露的用于产生(例如)病毒颗粒的质粒的容器。 该试剂盒还可包括适合质粒转染的生产细胞，和用质粒瞬时转染生产细 胞的说明书。说明书还可包括在允许产生靶向递送载体的条件下培养转 染的生产细胞的方法。例如，供制备靶向递送载体的试剂盒可包括含有 Bvl/pCAEP质粒、pCgpn质粒和pdnG1/C-REX质粒、pdnG1/C-REX II质 粒或pdnG1/UBER-REX质粒的容器。该试剂盒还可包括293T细胞和说 明书，用于用质粒瞬时转染细胞和在允许产生靶向病毒颗粒的条件下培 养转染的细胞。
在其他实施方式中，提供了一种治疗肿瘤病症的试剂盒。该试剂盒 包括含有按本文所述方法制备的、存在于药学可接受载体中的病毒颗粒 的容器和向受试对象施用病毒颗粒的说明书。可按照表1提供的示例性 治疗方案进行施用。
在另一实施方式中，提供了一种进行基因治疗商业活动的方法。该 方法包括生产靶向递送载体，和通过收集载体颗粒、将其混悬于适宜的 培养基溶液中并保存混悬液而建立载体库。该方法还包括向医师或保健 提供者提供颗粒和使用颗粒的说明书，以施用于需要的受试对象(患 者)。载体的使用说明书还可包括表1提供的示例性治疗方案。该方法 任选地包括给患者或者患者的保险提供者开账单。
在另一种实施方式中，提供了一种进行基因治疗商业活动的方法， 包括向医师或保健提供者提供本文所披露的试剂盒。
在另一种实施方式中，提供了一种采用治疗性病毒颗粒治疗具有一 个或多个含有癌细胞的肿瘤的受试对象的方法。该方法包括：a)通过以 下步骤确定治疗性病毒颗粒的剂量：i)根据受试对象肿瘤内存在的癌细 胞数或肿瘤中的肿瘤细胞总数来确定受试对象的肿瘤负荷；ii)用治疗 性病毒颗粒的生理感染复数(pMOI)乘以肿瘤负荷；和iii)将得到的数值 除以治疗性病毒颗粒的滴度，得到向受试对象施用治疗性病毒颗粒的体 积；和b)向受试对象施用已确定的治疗性病毒颗粒的剂量。
根据该实施方式，受试对象每天按确定的剂量接受治疗性病毒颗粒 的治疗，连续1-5天或1至大约6天。任选地，受试对象连续在周一、 周三和周五按确定的每日剂量接受治疗性病毒颗粒的治疗。受试对象可 被允许休息1-2天，该时间也组成治疗周期。受试对象可经2-8个治疗 周期的治疗，优选3-4个治疗周期。
根据该实施方式，也可以按照以下公式计算以毫升为单位的治疗性 病毒颗粒的剂量：
其中pMOI是4-250，优选100。
根据该实施方式，方法还可包括以下步骤：在受试对象用确定剂量 的治疗性病毒颗粒治疗之后，测定受试对象的肿瘤负荷；重新计算治疗 性病毒颗粒的剂量；和向受试对象施用重新计算的剂量的治疗性病毒颗 粒。
根据该实施方式，还可以用以下公开计算肿瘤负荷：
(目标病变或肿瘤的最长直径之和(cm))×1×109癌细胞/cm。
目标病变或肿瘤可通过测径器或通过放射成像如MRI、CT、PET 或SPECT扫描加以测量。
根据该实施方式，治疗性病毒颗粒可经局部、静脉内、动脉内、结 肠内、气管内、腹膜内、鼻内、血管内、鞘内、颅内、骨髓内、胸膜内、 皮内、皮下、肌内、眼内、骨内和/或滑膜腔内给药。优选地，治疗性病 毒颗粒通过静脉内输注施用于受试对象。
根据该实施方式，受试对象为哺乳动物，优选为人类。
根据该实施方式，所述癌症选自乳腺癌、皮肤癌、骨癌、前列腺癌、 肝癌、肺癌、脑癌、子宫癌、喉癌、胆囊癌、胰腺癌、直肠癌、甲状旁 腺癌、甲状腺癌、肾上腺癌、神经组织癌、头颈癌、结肠癌、胃癌、支 气管癌、肾癌、基底细胞癌、溃疡型和乳头样鳞状细胞癌、转移性皮肤 癌、骨肉瘤、尤因肉瘤、网状细胞肉瘤、骨髓瘤、巨细胞瘤、小细胞肺 癌、胆结石、胰岛细胞瘤、原发性脑肿瘤、急性和慢性淋巴细胞瘤和粒 细胞瘤、毛细胞瘤、腺瘤、增生、髓样癌、嗜铬细胞瘤、粘膜神经瘤、 肠神经节瘤、增生性角膜神经瘤、马方综合征样体质肿瘤、肾母细胞瘤、 精原细胞瘤、卵巢肿瘤、平滑肌肿瘤、宫颈发育异常和原位癌、神经母 细胞瘤、视网膜母细胞瘤、软组织肉瘤、恶性类癌瘤、局部皮肤损伤、 蕈样肉芽肿、横纹肌肉瘤、卡波西肉瘤、成骨肉瘤和其他肉瘤、恶性高 钙血症、肾细胞瘤、真性红细胞增多症、腺癌、多形性胶质母细胞瘤、 白血病、淋巴瘤、恶性黑素瘤和表皮样癌。癌症优选为骨肉瘤、肉瘤、 胰腺癌、乳腺癌或结肠癌。
根据该实施方式，治疗性病毒颗粒为本文所公开的本发明的病毒载 体，例如为逆转录病毒(优选双嗜性)载体的病毒载体，该载体具有经 修饰包含胶原结合结构域的包膜蛋白，并且编码针对癌症的治疗剂(如 细胞周期蛋白G1的杀细胞突变体)。
根据该实施方式，所述方法还可包括以下步骤：在施用治疗性病毒 颗粒之前、同时或之后向受试对象施用化疗药剂、生物制剂或放射治疗。
当结合附图阅读下面的发明详述后，可更全面地理解本发明的这些 及其它方面、实施方式、目的和特征，以及最佳实施方式。
还提供了用于产生靶向病毒颗粒的新型逆转录病毒表达系统、瞬时 转染的人生产细胞在制备颗粒中的应用、大规模制备病毒颗粒的生产方 法和收集并保存靶向病毒载体的方法。
在一种实施方式中，提供了一种制备靶向递送载体的方法。该方法 包括用以下物质瞬时转染生产细胞：1)第一质粒，其包含编码经修饰含 胶原结合结构域的4070A双嗜性包膜蛋白的核酸序列；2)第二质粒，其 包含i)与启动子有效连接的核酸序列，其中该序列编码病毒gag-pol多 肽；ii)与启动子有效连接的核酸序列，其中该序列编码能将抗药性赋 予生产细胞的多肽；和iii)SV40复制起点；3)第三质粒，其包含i)与 启动子有效连接的异源核酸序列，其中该序列编码诊断性或治疗性多 肽；ii)5’和3’长末端重复序列；iii)ψ逆转录病毒包装序列；iv)5’LTR 上游的CMV启动子；v)与启动子有效连接的核酸序列，其中该序列编 码能将抗药性赋予生产细胞的多肽；vi)SV40复制起点。生产细胞是表 达SV40大T抗原的人细胞。在一方面，生产细胞是293T细胞。
该方法还包括在允许靶向递送载体在培养上清液中产生的条件下 培养转染的生产细胞，分离上清液并将其引入闭环多管系统(closed loop manifold system)中以收集载体。图19A和图19B展示了一个闭环多管 系统的例子。在一种实施方式中，靶向递送载体是病毒颗粒。在另一实 施方式中，靶向递送载体是非病毒颗粒。
在一个方案中，第一质粒是Bv1/pCAEP质粒，第二质粒是pCgpn 质粒，第三质粒是pdnG1/C-REX质粒、pdnG1/C-REX II质粒、 pdnG1/UBER-REX质粒。
收集的颗粒的病毒滴度通常约为1×107-1×1011、1×108-1× 1011、1×109-1×1011、5×108-5×1010、2×109-5×1010、3×109-5× 1010、4×109-1×1010、5×109-1×1010、3×109-5×1011，至少为5×108、 1×109、2×109、3×109、4×109、5×109、8×109、1×1011、5×1010 或1×1011集落形成单位(cfu)/毫升。此外，病毒颗粒的直径通常约为10nm -1000nm、20nm-500nm、50nm-300nm、50nm-200nm或者50nm -150nm。
在一种实施方式中，胶原结合结构域包括冯维勒布兰德因子(von Willebrand factor)D2结构域衍生的肽。冯维勒布兰德因子通常来源于 哺乳动物。所述肽包括Gly-His-Val-Trp-Arg-Glu-Pro-Ser-Phe Met-Ala-Lys-Ser-Ala-Ala(SEQ ID NO：1)或 Gly-His-Val-Gly-Trp-Arg-Glu-Pro-Ser-Phe Met-Ala-Lys-Ser-Ala-Ala(SEQ ID NO：8)氨基酸序列。
在另一种实施方式中，所述肽包含于4070A双嗜性包膜蛋白的gp70 部分中。
在另一种实施方式中，治疗性多肽为细胞周期蛋白G1的N末端缺 失突变体、白介素2(IL-2)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)或 胸苷激酶。
本文披露的靶向递送载体通常包含编码诊断性或治疗性多肽的核 酸序列。如本说明书其他部分所详述，本发明的治疗性蛋白质和多肽的 例子包括但不限于自杀蛋白、凋亡诱导蛋白、细胞因子、白介素和TNF 家族蛋白质几大类。诊断性蛋白质或多肽的例子包括例如绿色荧光蛋白 和萤光素酶。
本发明的基因靶向递送系统可用于选择性靶向于具有暴露的细胞 外基质成分的组织，所述细胞外基质成分例如是胶原(如I型胶原和IV 型胶原)、层粘连蛋白、纤连蛋白、弹性蛋白、糖胺聚糖、蛋白聚糖或 RGD序列。组织中可被本发明的载体颗粒感染或转导的细胞包括但不限 于内皮细胞、肿瘤细胞、软骨细胞、结缔组织的成纤维细胞和弹性纤维 细胞；骨中的骨细胞和成骨细胞；脉管系统的内皮细胞和平滑肌细胞； 胃肠道和呼吸道的上皮细胞和上皮下细胞；纤维化肝脏的血管细胞、结 缔组织细胞和肝细胞，以及炎性组织的修补性单个核细胞和浸润性粒细 胞。
可被本发明的载体颗粒预防或治疗的疾病或病症包括但不限于与 外露的细胞外基质成分相关的疾病或病症。这种疾病或病症包括但不限 于以异常或不受控制的细胞增殖和/或异常血管发生为特征的或与之相 关的疾病。涉及异常细胞增殖和/或血管发生的疾病包括，例如：癌症(如 实体瘤和血液肿瘤，特别是转移性癌症)、心血管疾病(如动脉粥样硬 化和再狭窄)、慢性炎症(类风湿性关节炎、克罗恩病)、糖尿病(糖尿 病性视网膜病)、银屑病、子宫内膜异位症、新生血管性青光眼和肥胖 性心血管疾病；肝硬化；结缔组织病(包括韧带、腱和软骨相关疾病)； 与胶原暴露相关的血管病。载体颗粒可被用于递送治疗性基因，以恢复 内皮细胞功能和对抗血栓形成，并且抑制与新内膜形成相关的增殖和纤 维化反应。载体颗粒还可被用于预防或治疗血管损伤；再狭窄；纤维化 如肝和肺纤维化；溃疡性损伤；炎症区域；激光损伤部位如眼睛；角膜 浑浊；手术部位；关节炎性关节；伤疤；和瘢痕疙瘩。载体颗粒还可被 用于创伤愈合。
特别地，载体颗粒可被用于预防或治疗肿瘤，包括原发或继发的恶 性和非恶性肿瘤、血液疾病；以及预防或治疗癌症或肿瘤的转移。尽管 申请人不希望限于任何理论，肿瘤在侵袭正常组织或器官时会分泌酶， 例如胶原酶或金属蛋白酶，导致细胞外基质成分暴露。通过将载体颗粒 靶向于这些暴露的细胞外基质成分，载体颗粒可在接近肿瘤的暴露基质 成分处聚集，从而感染肿瘤细胞。这些肿瘤包括但不限于癌、肉瘤，例 如乳腺癌、皮肤癌、骨癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、脑癌、喉癌、胆囊 癌、胰腺癌、直肠癌、甲状旁腺癌、甲状腺癌、肾上腺癌、神经组织癌、 头颈癌、结肠癌、胃癌、支气管癌、肾癌、基底细胞癌、溃疡型和乳头 样鳞状细胞癌、转移性皮肤癌、骨肉瘤、尤因肉瘤、网状细胞肉瘤、骨 髓瘤、巨细胞瘤、小细胞肺癌、胆结石、胰岛细胞瘤、原发性脑肿瘤、 急性和慢性淋巴细胞瘤和粒细胞瘤、毛细胞瘤、腺瘤、增生、髓样癌、 嗜铬细胞瘤、粘膜神经瘤、肠神经节瘤、增生性角膜神经瘤、马方综合 征样体质肿瘤、肾母细胞瘤、精原细胞瘤、卵巢肿瘤、平滑肌 (leiomyomater)肿瘤、宫颈发育异常和原位癌、神经母细胞瘤、视网 膜母细胞瘤、软组织肉瘤、纤维肉瘤、恶性类癌瘤、局部皮肤损伤、蕈 样肉芽肿、横纹肌肉瘤、卡波西肉瘤、成骨肉瘤和其他肉瘤、恶性高钙 血症、肾细胞瘤、真性红细胞增多症、腺癌、多形性胶质母细胞瘤、白 血病、淋巴瘤、恶性黑素瘤、表皮样癌和其他癌和肉瘤。
血液病包括可导致血细胞发育异常变化的血细胞异常生长和血液 恶性肿瘤如各种白血病。血液病的实例包括但不限于急性髓细胞性白血 病、急性前髓细胞性白血病、急性淋巴母细胞性白血病、慢性淋巴细胞 性白血病、慢性髓细胞性白血病、骨髓增生异常综合征和镰状细胞贫血。
在一种实施方式中，提供了一种预防或减少受试对象患上与暴露的 细胞外基质成分相关的疾病或病症的风险的方法。该方法包括向受试对 象施用本发明的靶向载体。
在另一种实施方式中，提供了一种抑制癌症患者的癌转移的方法。 该方法包括向受试对象施用本发明的靶向载体。
在另一种实施方式中，提供了一种治疗患有与暴露的细胞外基质成 分成分相关的疾病或病症的受试对象的方法。该方法包括向受试对象施 用本发明的靶向载体。该方法还可任选地包括向受试对象施用其他治疗 剂，例如化疗药剂和生物制剂，或者在施用靶向载体之前、同时或之后 与其他疗法如放射治疗、手术和热解联合治疗受试对象。
化疗药剂的实例包括但不限于：烷基化剂，如塞替派和环磷酰胺 (CYTOXANTM)；磺酸烷基酯，如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶 类，如苯并多巴、卡波醌、美妥替哌(meturedopa)和uredopa；乙烯亚 胺和甲基蜜胺(methylamelamines)，包括六甲蜜胺、三亚乙基蜜胺、三 亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲蜜胺 (trimethylolomelamine)；乙酰精宁(特别是泡番荔枝辛(bullatacin)和 布拉它辛酮(bullatacinone))；喜树碱(包括合成的类似物托泊替康)； 苔藓抑素；callystatin；CC-1065(包括它的阿多来新、卡折来新和比折 来新合成类似物)；自念珠藻环肽类(cryptophycins)(特别是自念珠藻 环肽1和自念珠藻环肽8)；多拉司他汀；多卡米星(包括合成类似物 KW-2189和CBI-TMI)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；水鬼蕉碱 (pancratistatin)；sarcodictyin；海绵素(spongistatin)；氮芥类，如苯丁 酸氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺、雌莫司汀、异环磷酰胺、二氯甲基二乙胺、 盐酸氧化氮芥、美法仑、新氮芥、苯芥胆甾醇、泼尼莫司汀、曲磷胺、 尿嘧啶氮芥；亚硝基脲类，如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司 汀、尼莫司汀、雷莫司汀；抗生素，如烯二炔抗生素(如卡里奇霉素， 特别是卡里奇霉素γ1I和卡里奇霉素phiI1，参见如Agnew，Chem.Intl.Ed. Engl.，33：183-186(1994)；达内霉素(dynemicin)，包括达内霉素A；双 膦酸盐化合物，如氯膦酸盐；埃斯培拉霉素(esperamicin)；以及新制癌 菌素发色团和相关色蛋白烯二炔抗生素发色团)、阿克拉霉素 (aclacinomysins)、放线菌素、安曲霉素、偶氮丝氨酸、博来霉素、放 线菌素C、卡柔比星(carabicin)、洋红霉素、嗜癌霉素、色霉素、更生 霉素、柔红霉素、地托比星、6-重氮-5-氧-L-正亮氨酸、多柔比星(甲烯 土霉素TM)(包括吗啉代-多柔比星、氰吗啉代-多柔比星、2-吡咯啉并-多 柔比星和去氧多柔比星)、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、 丝裂霉素类如丝裂霉素C、麦考酚酸、诺拉霉素、橄榄霉素、培洛霉素、 泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑霉 素、链佐星、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗代谢药， 如氨甲喋呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，如二甲叶酸(demopterin)、 氨甲喋呤、蝶罗呤、三甲曲沙；嘌呤类似物，如氟达拉滨、6-巯嘌呤、 硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮尿苷、 卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷；雄 激素类，如卡普睾酮、丙酸屈他雄酮、环硫雄醇、美雄烷、睾内酪；抗 肾上腺素药，如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂，如亚叶酸 (frolinic acid)；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；恩尿嘧啶； 安吖啶；bestrabucil；比生群；edatraxate；defofamine；秋水仙胺；地吖 醌；依氟鸟氨酸；依利醋铵；埃博霉素(epothilone)；依托格鲁；硝酸 镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；类美登醇，如美登素和安丝菌素； 米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；硝氨丙吖啶；喷司他丁；蛋氨氮芥； 吡柔比星；洛索蒽醌；鬼臼酸；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；PSKTM；雷佐 生；根瘤菌素(rhizoxin)；西佐喃；锗螺胺；替奴佐酸；三亚胺醌；2，2′，2″- 三氯三乙胺；单端孢霉烯(特别是T-2毒素、verracurin A、杆孢菌素A 和anguidine)；乌拉坦；长春地辛；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露 醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿糖胞苷(″Ara-C″)；环磷酰胺； 噻替派(thiopeta)；紫杉烷(taxoid)，如紫杉醇(TAXOLTM，Bristol Meyers Squibb Oncology，Princeton，N.J.)和多西紫杉醇(TAXOTERETM， Rhone-Poulenc Rorer，Antony，法国)；苯丁酸氮芥；吉西他滨(GemzarTM)； 6-硫代鸟嘌呤；巯嘌呤；氨甲喋呤；铂类似物，如顺铂和卡铂；长春碱； 铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨 (NavelbineTM)；诺肖林；替尼泊苷；依达曲沙；柔红霉素；氨基蝶呤； xeoloda；伊班膦酸盐；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基 鸟氨酸(DMFO)；类视黄醇，如视黄酸；卡培他滨；和上述任意化合物 的药学可接受的盐、酸或衍生物。定义“化疗药剂”还包括用于调节或抑 制激素对肿瘤的作用的抗激素药，如抗雌激素药和选择性雌激素受体调 节剂(SERMs)，包括例如他莫昔芬(包括诺瓦得士(Nolvadex)TM)、雷 洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬、雷洛昔芬 (keoxifene)、LY117018、奥那司酮和托瑞米芬(法乐通(Fareston)TM)； 调节肾上腺产生雌激素的芳香酶抑制剂，例如4(5)-咪唑，氨鲁米特、醋 酸甲地孕酮(美可治(Megace)TM)、依西美坦、福美坦、法倔唑、伏氯 唑(RivisorTM)、来曲唑(弗隆(Femara)TM)和阿那曲唑(瑞宁得(Arimidex)TM)； 和抗雄激素药物，例如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林和戈舍 瑞林；和上述任意化合物的药学可接受的盐、酸或衍生物。
在一种具体实施方式中，与靶向载体联用的治疗药剂是酪氨酸激酶 抑制剂，如ZD1839(易瑞沙(Iressa)TM，AstraZeneca K.K.)；IMC-C225或 西妥昔单抗(爱必妥(Erbitux)TM)；曲妥单抗(赫赛汀(HERCEPTIN)TM)；甲 磺酸伊马替尼(格列卫(CLEEVEC)TM，以前称为STI-571)；和索拉非尼 (多吉美(Nexavar)TM)。
生物制剂可以是治疗性抗体，例如利妥昔单抗(RITUXANTM)；阿仑 单抗(坎帕斯(CAMPATH)TM)；和吉妥珠单抗奥唑米星(麦罗塔 (MYLOTARG)TM)。
通过使用靶向载体实施本发明，接受治疗的受试对象(特别是人类 受试对象)不仅自身疾病得到预防或缓解，其生活质量也有所改善，因 为本发明的靶向治疗方法能大大减轻或消除通常与其他治疗类型例如 化疗和生物治疗相关的副作用，包括脱发或毛发减少、骨髓抑制、肝功 能和肾功能明显改变、恶心和呕吐、粘膜炎、皮疹或便秘。
在该实施方式的一种变化方案中，该方法包括第一期方案，该第一 期方案包括用本文所述的病毒颗粒接触受试对象，其中受试对象接触i) 约1×109-6×109单位/天的第一病毒颗粒剂量水平，给受试对象连续 施用1至大约6天；ii)约7×109-约1×1010单位/天的第二病毒颗粒 剂量水平，给受试对象连续施用1至大约3天，再接着给予第一载体剂 量；和iii)约1×1010-约5×1010单位/天的病毒颗粒剂量水平，给受试 对象连续施用1-3天，再接着给予第二载体剂量。该方法还包括第二期 方案，该第二期方案包括用如本文所述产生的病毒颗粒接触受试对象， 其中给受试对象施用约1×109-约5×1010单位/天的病毒颗粒剂量水 平，连续1至大约15天，之后转为第一期方案。
根据该变化方案，该方法任选地包括在第一期和第二期方案之前、 同时或之后向受试对象施用化疗药剂。病毒颗粒的第一剂量水平可为约 4×109-5×109单位/天。病毒颗粒的第二剂量水平可为约9×109-约 1×1010单位/天。病毒颗粒的第三剂量水平可为约1×1010-约2×1010 单位/天。
本文披露的靶向递送载体可经局部、静脉内、动脉内、结肠内、气 管内、腹膜内、鼻内、血管内、鞘内、颅内、骨髓内、胸膜内、皮内、 皮下、肌内、眼内、骨内和/或滑膜腔内施用。
在另一实施方式中，提供了一种质粒，其包含与启动子功能连接的 多克隆位点，其中该启动子支持异源核酸序列的表达；5′和3′长末端重 复序列；ψ逆转录病毒包装序列；位于5′LTR上游的CMV启动子；与 启动子有效连接的核酸序列，其中该序列编码能将抗药性赋予含有该质 粒的生产细胞的多肽；和SV40复制起点。质粒的实例包括pC-REX II、 pC-REX和pUBER-REX。其他衍生物的实例包括那些含有编码治疗性 或诊断性多肽的异源核酸序列的质粒。
在其他实施方式中，提供了一种制备靶向递送载体的试剂盒。该试 剂盒主要包括含有本文披露的用于产生(例如)病毒颗粒的质粒的容器。 该试剂盒还可包括适合质粒转染的生产细胞，和用质粒瞬时转染生产细 胞的说明书。说明书还可包括在允许产生靶向递送载体的条件下培养转 染的生产细胞的方法。例如，供制备靶向递送载体的试剂盒可包括含有 Bvl/pCAEP质粒、pCgpn质粒和pdnG1/C-REX质粒、pdnG1/C-REX II质 粒或pdnG1/UBER-REX质粒的容器。该试剂盒还可包括293T细胞和说 明书，用于用质粒瞬时转染细胞和在允许产生靶向病毒颗粒的条件下培 养转染的细胞。
在其他实施方式中，提供了一种治疗肿瘤病症的试剂盒。该试剂盒 包括含有按本文所述方法制备的、存在于药学可接受载体中的病毒颗粒 的容器和向受试对象施用病毒颗粒的说明书。可按照表1提供的示例性 治疗方案进行施用。
在另一实施方式中，提供了一种进行基因治疗商业活动的方法。该 方法包括生产靶向递送载体，和通过收集载体颗粒、将其混悬于适宜的 培养基溶液中并保存混悬液而建立载体库。该方法还包括向医师或保健 提供者提供颗粒和使用颗粒的说明书，以施用于需要的受试对象(患 者)。载体的使用说明书还可包括表1提供的示例性治疗方案。该方法 任选地包括给患者或者患者的保险提供者开账单。
在另一种实施方式中，提供了一种进行基因治疗商业活动的方法， 包括向医师或保健提供者提供本文所披露的试剂盒。
在另一种实施方式中，提供了一种采用治疗性病毒颗粒治疗具有一 个或多个含有癌细胞的肿瘤的受试对象的方法。该方法包括：a)通过以 下步骤确定治疗性病毒颗粒的剂量：i)根据受试对象肿瘤内存在的癌细 胞数或肿瘤中的肿瘤细胞总数来确定受试对象的肿瘤负荷；ii)用治疗 性病毒颗粒的生理感染复数(pMOI)乘以肿瘤负荷；和iii)将得到的数值 除以治疗性病毒颗粒的滴度，得到向受试对象施用治疗性病毒颗粒的体 积；和b)向受试对象施用已确定的治疗性病毒颗粒的剂量。
根据该实施方式，受试对象每天按确定的剂量接受治疗性病毒颗粒 的治疗，连续1-5天或1至大约6天。任选地，受试对象连续在周一、 周三和周五按确定的每日剂量接受治疗性病毒颗粒的治疗。受试对象可 被允许休息1-2天，该时间也组成治疗周期。受试对象可经2-8个治疗 周期的治疗，优选3-4个治疗周期。
根据该实施方式，也可以按照以下公式计算以毫升为单位的治疗性 病毒颗粒的剂量：
其中pMOI是4-250，优选100。
根据该实施方式，方法还可包括以下步骤：在受试对象用确定剂量 的治疗性病毒颗粒治疗之后，测定受试对象的肿瘤负荷；重新计算治疗 性病毒颗粒的剂量；和向受试对象施用重新计算的剂量的治疗性病毒颗 粒。
根据该实施方式，还可以用以下公开计算肿瘤负荷：
(目标病变或肿瘤的最长直径之和(cm))×1×109癌细胞/cm。
目标病变或肿瘤可通过测径器或通过放射成像如MRI、CT、PET 或SPECT扫描加以测量。
根据该实施方式，治疗性病毒颗粒可经局部、静脉内、动脉内、结 肠内、气管内、腹膜内、鼻内、血管内、鞘内、颅内、骨髓内、胸膜内、 皮内、皮下、肌内、眼内、骨内和/或滑膜腔内给药。优选地，治疗性病 毒颗粒通过静脉内输注施用于受试对象。
根据该实施方式，受试对象为哺乳动物，优选为人类。
根据该实施方式，所述癌症选自乳腺癌、皮肤癌、骨癌、前列腺癌、 肝癌、肺癌、脑癌、子宫癌、喉癌、胆囊癌、胰腺癌、直肠癌、甲状旁 腺癌、甲状腺癌、肾上腺癌、神经组织癌、头颈癌、结肠癌、胃癌、支 气管癌、肾癌、基底细胞癌、溃疡型和乳头样鳞状细胞癌、转移性皮肤 癌、骨肉瘤、尤因肉瘤、网状细胞肉瘤、骨髓瘤、巨细胞瘤、小细胞肺 癌、胆结石、胰岛细胞瘤、原发性脑肿瘤、急性和慢性淋巴细胞瘤和粒 细胞瘤、毛细胞瘤、腺瘤、增生、髓样癌、嗜铬细胞瘤、粘膜神经瘤、 肠神经节瘤、增生性角膜神经瘤、马方综合征样体质肿瘤、肾母细胞瘤、 精原细胞瘤、卵巢肿瘤、平滑肌肿瘤、宫颈发育异常和原位癌、神经母 细胞瘤、视网膜母细胞瘤、软组织肉瘤、恶性类癌瘤、局部皮肤损伤、 蕈样肉芽肿、横纹肌肉瘤、卡波西肉瘤、成骨肉瘤和其他肉瘤、恶性高 钙血症、肾细胞瘤、真性红细胞增多症、腺癌、多形性胶质母细胞瘤、 白血病、淋巴瘤、恶性黑素瘤和表皮样癌。癌症优选为骨肉瘤、肉瘤、 胰腺癌、乳腺癌或结肠癌。
根据该实施方式，治疗性病毒颗粒为本文所公开的本发明的病毒载 体，例如为逆转录病毒(优选双嗜性)载体的病毒载体，该载体具有经 修饰包含胶原结合结构域的包膜蛋白，并且编码针对癌症的治疗剂(如 细胞周期蛋白G1的杀细胞突变体)。
根据该实施方式，所述方法还可包括以下步骤：在施用治疗性病毒 颗粒之前、同时或之后向受试对象施用化疗药剂、生物制剂或放射治疗。
当结合附图阅读下面的发明详述后，可更全面地理解本发明的这些 及其它方面、实施方式、目的和特征，以及最佳实施方式。
附图说明
图1A显示1号患者在第一个治疗周期结束一天后的代表性MRI， 图示在手术床区域内的胰腺区中有一个大的圆形复发肿瘤(T；括出的 区域)，和一个增大的主动脉旁淋巴结(N)，表明肿瘤转移。
图1B显示1号患者在第二个治疗周期结束四天后的后续MRI，图 示复发肿瘤(T；括出的区域)形状呈不规则性，40-50％的肿瘤出现大 面积的中心性坏死(nec)，主动脉旁淋巴结转移(N)大小明显减小。
图1C为表明Rexin-G引起1号患者的血清CA19-9水平降低的图。 血清CA19-9水平(U/ml)(标于纵轴)表示为时间(日期)(标于横轴) 的函数。箭头标明每个治疗周期的开始。
图2A提供2号患者在第一个治疗周期伊始的代表性腹部CT扫描， 图示在胰腺头(T)侵占肠系膜上静脉(SMV)和肠系膜上动脉(SMA)的区 域有一6.0cm3肿块。
图2B提供2号患者在第二个治疗周期结束两天后的后续腹部CT 扫描，图示胰腺肿瘤肿块(T)的大小缩小，并且远离肠系膜上血管(SMV 和SMA)缩回。箭头标明每个治疗周期的开始。
图2C为表明Rexin-G阻止2号患者原发肿瘤生长的图。通过Rexin-G 连续治疗，注意到肿瘤大小呈进行性减小。肿瘤体积(cm3)采用以下公式 计算：宽度2×长度×0.52(O′Reilly等人，Cell 88，277，1997)(标于纵轴)， 并表示为时间(标于横轴)的函数。箭头标明每个治疗周期的开始。
图3A描述的数据表明Rexin-G加吉西他滨诱导患转移性胰腺癌的3 号患者肿瘤消退。原发肿瘤的肿瘤体积(cm3)标于Y轴上，并表示为时间 (日期)的函数。箭头标明Rexin-G输注开始。
图3B描述的数据表明Rexin-G加吉西他滨诱导患转移性胰腺癌的3 号患者肿瘤消退。门静脉节结的肿瘤体积标于Y轴上，并表示为时间(日 期)的函数。箭头标明Rexin-G输注开始。
图3C描述的数据表明Rexin-G加吉西他滨诱导患转移性胰腺癌的3 号患者肿瘤消退。肝脏节结数标于Y轴上，并表示为时间(日期)的函 数。箭头标明Rexin-G输注开始。
图4A纵轴为1号患者的收缩压(以mm Hg表示)，而横轴为 REXIN-G输注时间。
图4B纵轴为1号患者的每分钟脉搏率，而横轴为REXIN-G输注时 间。
图4C纵轴为1号患者的每分钟呼吸频率，而横轴为REXIN-G输注 时间。
图5A描述的数据显示1号患者的血红蛋白(gms％)、白细胞计数和 血小板计数(标于Y轴)，其表示为治疗天数(标于X轴)的函数。
图5B描述的数据表明Rexin-G对1号患者的肝功能无不良作用。 AST(U/L)、ALT(U/L)和胆红素(mg％)标于Y轴，并表示为治疗天数(标 于X轴)的函数。
图5C显示1号患者的血尿素氮(mg％)、肌酐(mg％)和钾(mmol/L) 水平(标于Y轴)，并表示为治疗天数(标于X轴)的函数。以剂量水 平I(4.5x109cfu/剂)连续施用6天，休息期为2天，接着以剂量水平II(9 x109cfu/剂)连续施用2天，再以剂量水平III(1.4x1010cfu/剂)连续施用 2天。
图6提供的数据表明Rexin-G的剂量递增对2号患者的血液动力学 功能无不良作用。对每个剂量水平，收缩压(mm Hg)、脉搏率/分钟和呼 吸频率/分钟均作为输注时间(标于横轴)的函数在纵轴上作图。
图7A表示2号患者的血红蛋白(gms％)、白细胞计数和血小板计数 (标于Y轴)，其表示为治疗天数(标于X轴)的函数。
图7B描述的数据表明Rexin-G对2号患者的肝功能无不良作用。 AST(U/L)、ALT(U/L)和胆红素(mg％)标于Y轴上，并表示为治疗天数 (标于X轴)的函数。
图7C表示2号患者的血尿素氮(mg％)、肌酐(mg％)和钾(mmol/L) 水平(标于Y轴)，其表示为治疗天数(标于X轴)的函数。以剂量水 平I(4.5x109cfu/剂)连续施用5天，接着以剂量水平II(9x109cfu/剂)连 续施用3天，再以剂量水平III(1.4x1010cfu/剂)连续施用2天。
图8A表示3号患者的血红蛋白(gms％)、白细胞计数和血小板计数 (标于Y轴)，其表示为治疗天数(标于X轴)的函数。
图8B描述的数据表明Rexin-G对3号患者的肝功能无不良作用。 AST(U/L)、ALT(U/L)和胆红素(mg％)标于Y轴上，并表示为治疗天数 (标于X轴)的函数。
图8C表明Rexin-G对3号患者的肾功能无不良作用。血尿素氮(mg ％)、肌酐(mg％)和钾(mmol/L)水平标于Y轴上，并表示为治疗天数(标 于X轴)的函数。以剂量水平I(4.5x109cfu/剂)连续施用6天。
图9显示对Rexin-G纳米颗粒的大小测量。采用精度检测仪(Franklin， MA 02038 U.S.A.)，通过动态光散射(DLS)以分批模式分析载体样品，以 流体力学半径(rh)确定其分子大小。采用精度反卷积软件由DLS数据计 算确定不同大小群。Rexin-G临床使用批次的平均颗粒大小分别为95、 105和95nm，并且未检测到病毒聚集。
图10展示GTI表达载体G1nXSvNa的高感染滴度(HIT)形式。 pRV109质粒提供强CMV启动子。所得pREX表达载体具有用于在表达 SV40大T抗原的生产细胞系(293T)中进行游离型复制和质粒拯救的 SV40起点、用于在大肠杆菌中筛选和维持的氨苄青霉素抗性基因和由 SV 40e.p.驱动的可测定载体滴度的新霉素抗性基因。目的基因最初克隆 为具有Not I和Sal I突出端的PCR产物。扩增片段经DNA测序验证后， 通过将相应片段克隆至pG1XsvNa(Gene Therapy Inc.)中而插入逆转录病 毒表达载体pREX中，接着切除该质粒的Kpn I片段，并与线性化的(Kpn I消化的)pRV109质粒连接得到相应的HIT/pREX载体。
图11A展示pC-REX质粒的限制酶切图谱。质粒来源于G1XSvNa (Genetic Therapy，Inc.)，CMV即启动子增强子克隆至位于5′LTR上游的 独特Sac II位点中。编码诊断性或治疗性多肽的异源核酸序列(HS)可 包含在Not I和Sal I限制性酶切位点之间。neo基因由具有嵌套ori的 SV40 e.p.驱动。所得pC-REX质粒设计用于在293T细胞中制备高滴度 载体。
图11B展示pdnG1/C-RE×质粒的限制酶切图谱。该质粒与图11A 所示的pC-REX质粒基本相同，不同之处在于它含有编码209个氨基酸 (630bp)的显性阴性突变dnG1的核酸序列(472-1098核苷酸；41-249氨 基酸；登录号U47413)，该序列通过PCR制备而包含了Not I和Sal I突 出端。
图11C展示pdnG1/C-REX的限制性酶切结果。
图12A展示Bv1/pCAEP质粒的限制酶切图谱。CAEP(P＝Pst I)的制 备是在靠近CAE双嗜性包膜蛋白(4070A)N末端处、在成熟gp70多肽 的氨基酸6和7之间加入独特Pst I位点。Bv1为来源于vWF的胶原结 合十肽，侧翼为关键连接体，并且作为符合阅读框的编码序列插入 PCAEP的Pst 1位点。
图12B展示Bv1/pCAEP的限制性酶切结果。
图13A展示pCgpn质粒的限制酶切图谱。该质粒编码由CMV立即 早期启动子增强子驱动的MoMuLv gag-pol。侧翼为EcoR I克隆位点的 gag-pol编码序列来源于3PO克隆，作为pGag-pol-gpt(Moarkowitz等人， 1988)。载体骨架为pcDNA3.1+(Invitrogen)。来源于牛生长激素的聚腺 苷酸化信号和转录终止序列可增强RNA稳定性。SV40复制起点连同e.p. 用于在表达SV40大T抗原的细胞系中进行游离型复制。
图13B展示pCgpn的限制性酶切结果。
图14展示新型pC-REX II(即EPEIUS-REX)质粒的图谱。
图15展示插入治疗性细胞因子基因IL-2的新型pC-REX II(即 EPEIUS-REX)质粒的图谱。
图16展示插入治疗性细胞因子基因GM-CSF的新型pC-REX II(即 EPEIUS-REX)质粒的图谱。
图17A-G展示一系列利用pC-REX II的MCS位点靠近HStk(报告) 基因的辅助启动子。
图17H展示在肿瘤细胞中不同基因从图17A-G所示辅助启动子开 始表达的Western blot结果。
图18表示来自pIRES的CMV启动子序列的核酸序列。
图19A展示制备靶向载体的闭环多管系统。
图19B提供关于闭环多管系统部件的信息。
图20A展示新型pB-RVE质粒的图谱，pB-RVE是一种增强的CMV 表达质粒，带有靶向逆转录病毒载体的包膜构建体(Epeius-BV1)：最小 的双嗜性env(4070A)，其通过在成熟蛋白质(CAE-P)N末端附近加入独 特限制酶切位点加以修饰；经基因工程改造而展现出胶原结合基序 (GHVGWREPSFMALSAA)；并经PCR再生以去除所有上游(5′)和下游(3′) 的病毒序列。除了SV 40启动子/增强子以外，质粒骨架(phCMV1)还提 供优化的CMV启动子/增强子/内含子以驱动env表达，使得能在表达 SV40大T抗原的载体生产细胞(293T)中进行游离型复制。通过卡那霉素 抗性基因提供阳性筛选。
图20B展示pB-RVE的限制性酶切结果。
图21A展示新型pdnG1/UBER-REX质粒的图谱。该质粒编码209 氨基酸(630bp)的显性阴性突变dnG1(472-1098核苷酸；41-249氨基酸； 登录号U47413)。该质粒来源于G1XSvNa(GTI)，CMV即启动子增强 子在5′LTR上游的独特Sac II位点处克隆至该质粒中。去除487bp残留 gag序列以降低RCR的可能性，并在dnG1上游加入97bp剪接受体位点 (ESA)。dnG1编码序列(核苷酸472-1098加终止密码子＝1101)经PCR 制备，包含Not I和Sal I突出端。neo基因由具有嵌套ori的SV40e.p. 驱动。pdnG1/UBER-REX质粒被设计用于在293T细胞中产生高滴度的 载体。
图21B展示pdnG1/UBER-REX的限制性酶切结果。
图22A展示野生型莫洛尼小鼠白血病病毒(MoML V)包膜剪接受体 位点(ESA)的图谱。
图22B展示pUBER-REX的包膜剪接受体位点(ESA)的图谱。
图23A表示C-REX质粒的图示。
图23B表示UBER-REX质粒的图示。
图24表明从IV期胰腺癌患者(A3号患者)的手术切除肝切片观 察，静脉注射Rexin-GTM诱导了转移性肿瘤节结的坏死和纤维化。(A) 代表性的肝活检肿瘤节结组织切片的苏木精伊红染色图；t＝肿瘤细胞； n＝坏死；f＝纤维化。(B)相同肿瘤节结组织切片的三色染色图。蓝色染 色物质表明纤维化区域中存在胶原蛋白。
图25表明从胰腺癌患者(A3号患者)的结果看出，静脉注射 Rexin-GTM诱导了在转移性肿瘤节结中出现明显细胞凋亡。(A-D)代表性 的免疫染色的肝活检肿瘤节结组织切片，表明出现可见的Tunel阳性凋 亡细胞核(褐色染色物质)。
图26显示从经Rexin-GTM治疗的胰腺癌患者(A3号患者)切除的 转移肿瘤节结中肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的免疫组织化学特征。肝活检中 残留肿瘤节结的典型组织切片显示明显的TIL浸润伴有免疫反应性T和 B细胞的功能性补体。从左上方按顺时针方向依次为：辅助T细胞(cd4+)、 杀伤性T细胞(cd8+)、B细胞(cd20+)、单核细胞/巨噬细胞(cd45+)、树 突状细胞(cd35+)和自然杀伤细胞(cd56+)。注意：出现(即迁移)在细 胞介导的免疫和体液免疫情形中具有功能的TIL结构，提示在免疫活性 宿主中具备癌症免疫的可能性。
图27表明静脉注射Rexin-GTM诱导了恶性黑素瘤患者(B4号患者) 的癌淋巴结中出现坏死、凋亡和纤维化。(A)腹股沟淋巴结组织切片的 H&E染色显示广泛的癌细胞坏死(n)、凋亡(箭头指示)和纤维化(f)， 四周边缘为活肿瘤细胞(t)；(B)A切片的高倍放大(100×)显示具有固 缩或破碎的细胞核的小细胞，表明大量细胞正在发生凋亡；(C)A切片 的高倍放大(100×)显示金黄色的充满含铁血黄素的巨噬细胞；(D)代 表性的腹股沟淋巴结组织切片显示明显的免疫反应性CD35+树突状细 胞、(E)CD68+巨噬细胞和(F)CD8+杀伤性T细胞的浸润。
图28显示喉鳞状细胞癌患者(B6号患者)出现肿瘤退缩的迹象。 在Rexin-GTM治疗前(上图)、后(下图)取得颈部MRI影像。对一系 列上呼吸道切片直径的测定显示，与治疗前获得的切片相比，重复输注 Rexin-GTM后上呼吸道的直径显著增大(约300％)(白色箭头所示)。呼吸 道畅通的增加与周围肿瘤块的消退和发声能力的恢复相符。
图29显示在具有大块肿瘤负荷的胰腺癌患者(C1号患者)中观察到 的Rexin GTM输注对转移性肝损伤的数量和性质的影响。在用计算(等 价计算(Calculus of parity))的剂量输注Rexin-GTM进行治疗前(A)和治 疗后(B)取得腹部MRI。注意在图像左上四分之一中有大量小的致密肿瘤 节结完全消除(括号括出)，以及已建立的肝节结出现囊样转变(黑色 箭头指示)。此后吸取增大的肝囊肿(白色箭头指示)进行细胞学检测 证实治疗后吸取物中的癌细胞完全消失。
图30展示化疗难治性骨肉瘤患者的连续CT-PET影像。治疗后1 个月病变部位的18FDG摄取减少以及治疗后2个月病变部位的钙化增加 证明了Rexin-G的抗肿瘤活性。
图31表明经Rexin-G治疗的化疗难治性转移骨肉瘤患者的肿瘤发展 速度降低，其证据是在第二轮治疗周期之后没有出现新的病变。
图32表明经Rexin-G治疗的化疗难治性转移骨肉瘤患者目标病变部 位的18FDG摄取最大SUV值呈进行性降低。
图33表明经Rexin-G治疗的化疗难治性转移骨肉瘤患者的癌性病变 部位钙化增加，其证据是亨斯菲尔德(Hounsfield)单位增加。
图34显示难治性IV期胰腺癌患者的原发胰腺肿瘤中的广泛细胞坏 死和局部GM-CSF产生。(A)原发胰腺肿瘤的组织切片的H&E染色表 明癌细胞广泛(约95％)坏死(n)，伴有部分反应性纤维化(f)，周围可见活 肿瘤细胞的退化(deg)边缘和细胞器结构。(B&C)(A)中所见切片的纤 维化、坏死和退化区域的高倍放大图。(D)GM-CSF转基因的免疫染色 证实有小簇免疫反应性分泌GM-CSF的肿瘤细胞(箭头所示)保留在这 个不能手术治疗的原发肿瘤中。(E)D的高倍放大显示残留的活肿瘤细 胞中的免疫反应性GM-CSF蛋白(深染色物质指示)；(F)对明显免疫浸 润区域的近距离检查表明在坏死的肿瘤细胞(箭头所示)中和在伴有单 核细胞浸润(im)的肿瘤细胞碎片的片段中存在GM-CSF阳性。
发明详述
本文展示和说明了本发明的优选实施方式，但本领域的技术人员会 清楚这些实施方式仅作为实例提供。在不背离本发明的情况下，本领域 技术人员将会想到大量变更、改进和替换。应理解可应用本文所述的本 发明实施方式的各种备选方案来实施本发明。后面的权利要求限定了本 发明的范围，从而覆盖了这些权利要求范围内的方法和结构及其等同方 案。
靶向递送系统在体内将逆转录病毒载体或任何其他的病毒或非病 毒载体、蛋白质或药物选择性地高效靶向至病理性区域(即亲病灶性靶 向)，使得优先递送基因至血管(Hall等人，Hum Gene Ther，8：2183-92， 1997；Hall等人，Hum Gene Ther，11：983-93，2000)或癌性病变部位 (Gordon等人，Hum Gene Ther 12：193-204，2001；Gordon等人，Curiel DT， Douglas JT，eds.Vector Targeting Strategies for Therapeutic Gene Delivery， New York，NY：Wiley-Liss，Inc.293-320，2002)、血管发生活跃区域和组织 损伤或炎症区域。
定义
除非另作定义，否则本文使用的所有科技术语的意义与本发明所属 领域内的技术人员通常理解的相同。除非另外注明，否则本公开内容通 篇涉及到的所有专利、专利申请、公开申请和出版物、Genbank序列、 互联网站点和其他公开材料的全部内容均以引用方式并入本文。如果本 文的术语有多个定义，则取其在本节中的定义。如果提到的是URL或 其他类似标识符或地址，应理解这类标识符可能改变，并且互联网上的 特定信息会时有时无，然而其等效信息应能通过互联网搜索而查到。其 参考表明了这类信息的可获得性及公众传播性。
本文使用的“核酸”是指含有至少两个经共价键连接的核苷酸或核苷 酸类似物亚单位的多核苷酸。核酸可为脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸 (RNA)或者DNA或RNA类似物。核苷酸类似物可作为商品获得，制备 含有这些核苷酸类似物的多核苷酸的方法为已知方法(Lin等人(1994) Nucl.Acids Res.22：5220-5234；Jellinek等人(1995)Biochemistry 34：11363-11372；Pagratis等人(1997)Nature Biotechnol.15：68-73)。核酸 可为单链、双链或它们的混合物。对于本文来说，除非有其他特殊说明， 核酸是双链的，或者能从上下文中明确获知。
本文使用的DNA意欲包括所有类型和大小的DNA分子，包括 cDNA、质粒和包括修饰核苷酸和核苷酸类似物的DNA。
本文使用的核苷酸包括核苷的单、二和三磷酸盐。核苷酸还包括修 饰核苷酸，例如但不限于硫代磷酸核苷酸和脱氮嘌呤核苷酸及其他核苷 酸类似物。
本文使用的术语“受试对象”是指可向其引入大DNA分子的动物、 植物、昆虫和鸟类。包括高等生物，例如哺乳动物和鸟类，包括人、灵 长类、啮齿类、牛、猪、兔、山羊、绵羊、小鼠、大鼠、豚鼠、猫、狗、 马和鸡等。
本文使用的“向受试对象施用”是向受试对象同时或分别引入或施用 一种或多种递送药剂和/或大核酸分子的操作，以使存在于受试对象体内 的靶细胞最终能与所述药剂和/或大核酸分子接触。
本文使用的“靶向递送载体”或“靶向递送媒介物”是指携带外源核酸 分子并将其转运至靶细胞或靶组织的病毒和非病毒颗粒。病毒载体包括 但不限于逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒。非病毒载体包括但不限于 微粒、纳米颗粒、病毒体和脂质体。本文使用的“靶向”是指利用与递送 载体结合的配体将载体导向至细胞或组织。配体包括但不限于抗体、受 体和胶原结合结构域。
本文使用的“递送”可与“转导”交换使用，是指将外源核酸分子转移 至细胞以使其位于细胞内部的过程。核酸递送是不同于核酸表达的一个 过程。
本文使用的“多克隆位点(MCS)”是质粒中含有多个限制性酶切位点 的核酸区域，每个位点都可与标准重组技术结合使用，以消化该载体。 “限制性酶切”是指用仅在核酸分子的特定部位处起作用的酶催化切割核 酸分子。许多限制性酶都可作为商品获得。本领域技术人员普遍掌握这 些酶的使用。通常，用在MCS内酶切的限制性酶将载体线性化或片段 化，使得外源序列能够与该载体连接。
本文使用的“复制起点”(常称作″ori″)是一段特殊的核酸序列，复 制从此处起始。可选地，如果宿主细胞为酵母，则可使用自主复制序列 (ARS)。
本文使用的“选择性标记或可筛选标记”将可被鉴别的变化赋予细 胞，从而允许容易地鉴别出含有表达载体的细胞。通常，选择性标记提 供允许进行选择的特性。阳性选择性标记是当标记存在时允许其选择， 而阴性选择性标记是当标记存在时阻止其选择。阳性选择性标记的实例 是抗药性标记。
通常包含药物选择标记有助于转化体的克隆和鉴定，例如，提供新 霉素、嘌呤霉素、潮霉素、DHFR、GPT、zeocin和组氨醇抗性的基因是 有用的选择性标记。除了提供允许基于条件实现鉴别转化体的表型的标 记以外，也考虑其他类型的标记，包括可筛选的标记如GFP，其基础是 量热分析。或者，可以使用可筛选的酶，例如单纯疱疹病毒胸苷激酶(tk) 或氯霉素乙酰转移酶(CAT)。本领域技术人员还清楚如何使用免疫标记， 可能需与FACS分析结合使用。据认为使用的标记并不重要，只要能够 与编码基因产物的核酸同时表达即可。更多的选择性标记和可筛选标记 的实例为本领域技术人员所熟知。
术语“转染”用于表示细胞吸收外来DNA。当外源DNA被引入细胞 膜内部时，该细胞即被“转染”了。许多转染技术为本领域所公知。参见， 例如Graham等人，Virology 52：456(1973)；Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(1989)；Davis等人，Basic Methods in Molecular Biology(1986)；Chu等人，Gene 13：197(1981)。该技术可被用 于向适合的宿主细胞中引进一个或多个外源DNA部分，例如核苷酸整 合载体和其他核酸分子。该术语囊括化学的、电学的和病毒介导的转染 操作。
本文使用的“表达”是指核酸被翻译为肽或转录为RNA的过程，例 如可被翻译为肽、多肽或蛋白质。如果核酸来源于基因组DNA，则在选 择了合适的真核宿主细胞或生物的情形下，表达可包括mRNA剪接。对 于要在宿主细胞中表达的异源核酸，它必须首先被运送至细胞中，一旦 进入细胞将最终存在于细胞核中。
本文使用的“应用于受试对象”是存在于受试对象体内的靶细胞最终 接触能量例如超声波或电能的过程。可通过任意施加能量的过程进行应 用。
术语“宿主细胞”表示，例如微生物、酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动 物细胞，它们能够用作或已被用作多重构建体的受者以生产靶向递送载 体。该术语包括已被转染的原代细胞的后代。因此，本文使用的“宿主细 胞”主要是指已用外源DNA序列转染的细胞。应理解由于天然的、偶然 的或有意的突变，单亲本细胞的后代在形态学上或其基因组或总DNA 补体上不一定与原始亲本完全相同。
本文使用的“基因治疗”涉及将异源DNA转移至患有治疗或诊断针 对的病症或疾病的哺乳动物特别是人的部分细胞、靶细胞。将DNA以 某种方式引入所选的靶细胞中，使得异源DNA表达，因而产生其编码 的治疗性产物。可选地，异源DNA可以以某种方式介导编码治疗性产 物的DNA的表达，它可编码一种产物，例如肽或RNA，该产物以某种 方式直接或间接地介导治疗性产物的表达。基因治疗也可用于运送编码 基因产物的核酸替换有缺陷的基因或补充由被引入的哺乳动物或细胞 产生的基因产物。被引入的核酸可编码治疗性化合物，例如生长因子或 其抑制剂，或者肿瘤坏死因子或其抑制剂，如它的受体，正常情况下这 些化合物在哺乳动物宿主体内不产生，或者不能以治疗性有效量产生， 或不在治疗有用的时间产生。编码治疗性产物的异源DNA可在引入患 病宿主的细胞之前进行修饰，以增强或者改变产物或其表达。
本文使用的“异源核酸序列”通常是指这样的DNA，该DNA编码通 常不能由表达它们的细胞在体内产生的RNA和蛋白质，或者介导或编 码通过影响转录、翻译或其他可调节的生化过程而改变内源DNA表达 的介质。异源核酸序列还可称为外来DNA。本文的异源DNA包括本领 域技术人员认为其相对于表达该DNA的细胞为异源或外源的任何 DNA。异源DNA的实例包括但不限于编码可示踪标记蛋白质如提供抗 药性的蛋白质的DNA、编码治疗有效性物质如抗癌药、酶和激素的 DNA、和编码其他类型蛋白质如抗体的DNA。由异源DNA编码的抗体 可由异源DNA所导入的细胞分泌或在其表面上表达。
质粒
本文披露的质粒用于转染和制备靶向递送载体供治疗和诊断过程 使用。一般而言，该质粒提供编码本文披露的靶向载体的病毒或非病毒 元件的核酸序列。该质粒包括编码例如经修饰包含胶原结合结构域的 4070A双嗜性包膜蛋白的核酸序列。其他质粒可包括与启动子有效连接 的核酸序列。该序列通常编码病毒gag-pol多肽。质粒还包括与启动子 有效连接的核酸序列，以及编码给生产细胞提供抗药性的多肽的序列。 也包括复制起点。其他质粒可包括编码诊断性或治疗性多肽的异源核酸 序列、5′和3′长末端重复序列；ψ逆转录病毒包装序列、位于5′LTR 上游的CMV启动子、与启动子有效连接的核酸序列和SV40复制起点。
异源核酸序列通常编码诊断性或治疗性多肽。在特定实施方式中， 治疗性多肽或蛋白质是一种“自杀蛋白”，可通过其自身或在其他化合物 存在下引起细胞死亡。这种自杀蛋白的一个代表性实例是单纯疱疹病毒 胸苷激酶。其他实例包括水痘-带状疱疹病毒胸苷激酶、细菌基因胞嘧啶 脱氨酶(将5-氟胞嘧啶转化为高毒性化合物5-氟尿嘧啶)、p450氧化还 原酶、羧肽酶G2、β-葡糖醛酸糖苷酶、青霉素-V-酰胺酶、青霉素-G-酰 胺酶、β-内酰胺酶、硝基还原酶、羧肽酶A、亚麻苦苷酶(也称作β-葡 萄糖苷酶)、大肠杆菌gpt基因和大肠杆菌Deo基因，但是其他实例也是 本领域所公知的。在部分实施方式中，自杀蛋白将前药转化为毒性化合 物。本文使用的“前药”意指在本发明方法中有用的、能被转化为毒性产 物(即对肿瘤细胞具有毒性)的任意化合物。前药被自杀蛋白转化为毒 性产物。该前药的代表性实例包括：针对胸苷激酶的更昔洛韦、阿昔洛 韦和FIAU(1-(2-脱氧-2-氟-β-D-阿糖呋喃糖基)-5-碘尿嘧啶)；针对氧化还 原酶的异环磷酰胺；针对VZV-TK的6-甲氧嘌呤阿糖胞苷；针对胞嘧啶 脱氨酶的5-氟胞嘧啶；针对β-葡糖醛酸糖苷酶的多柔比星；针对硝基还 原酶的CB 1954和呋喃西林；和针对羧肽酶A的N-(氰基乙酰基)-L-苯 丙氨酸或N-(3-氯丙酰基)-L-苯丙氨酸。本领域普通技术人员可容易地进 行前药给药。本领域普通技术人员还能容易地确定前药的最佳给药剂量 和途径。
在部分实施方式中，治疗性蛋白质或多肽是癌症抑制剂，例如p53 或Rb，或编码该蛋白质或多肽的核酸。当然，技术人员了解大批这样的 癌症抑制剂，并且知道如何获得它们和/或其编码核酸。
治疗性蛋白质或多肽的其他实例包括促凋亡的治疗性蛋白质和多 肽，例如p15、p16或p21WAF-1。
细胞因子和编码它的核酸也可用作治疗性蛋白质和多肽。其实例包 括：GM-CSF(粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)；TNF-α(肿瘤坏死因子 α)；干扰素，包括但不限于IFN-α和IFN-γ；以及白介素，包括但不限 于白介素1(IL1)、白介素β(IL-β)、白介素2(IL2)、白介素4(IL4)、白 介素5(IL5)、白介素6(IL6)、白介素8(IL8)、白介素10(IL10)、白 介素12(IL12)、白介素13(IL13)、白介素14(IL14)、白介素15(IL15)、 白介素16(IL16)、白介素18(IL18)、白介素23(IL23)、白介素24 (IL24)，但是本领域中也了解其他实施方案。
杀细胞基因的其他实例包括但不限于突变细胞周期蛋白G1基因。 举例来说，杀细胞基因可以是细胞周期蛋白G1的显性阴性突变体(如 WO/01/64870所述)。
在以前，逆转录病毒载体(RV)构建体一般是通过将两个独立的逆 转录病毒(RV)质粒克隆并融合而制备的：一个包含逆转录病毒LTR、 包装序列和相应的目的基因；另一个逆转录病毒载体包含强启动子(如 CMV)以及一组外来的功能性序列。本文披露的pC-REX II(e-REX)载 体是指一种改良质粒，其包含在原始质粒中插入的一组独特克隆位点， 以促进试验基因的定向克隆。在质粒骨架中使用强启动子(如CMV)， 以增加在受者生产细胞内产生的信使RNA的量，但其自身不被包装到 逆转录病毒颗粒中，而是位于基因侧翼的逆转录病毒LTR之外。
因此，改良质粒设计为将强CMV启动子(通过PCR获得)包括在 GlxSvNa载体(该载体以前被FDA批准用于人体)中的关键部位内， 从而消除了对已报道的载体的质粒大小和序列方面的担心。该改良构建 体被命名为pC-REX。PC-REX再经进一步修饰，引入一系列独特克隆 位点(见图14，pC-REX II中的MCS)，以便能够定向克隆和/或插入多 基因及辅助功能性结构域。因此，新质粒被命名为pC-REX和pC-REX II(EPEIUS-REX或eREX)。pC-REX质粒设计(见图11A)在直接并列 对比中胜过pHIT-112/pREX。新质粒还经进一步修饰以包括各种治疗活 性多肽的编码序列。在一个实施例中，包含显性阴性细胞周期蛋白G1 (dnG1)(见图11B)作为治疗基因。三重病毒颗粒(env、gag-pol和dnG1载 体构建体)在临床试验的公开报道中统称为REXIN-GTM。REXIN-G表 示已被包装、包壳和包膜在可注射靶向病毒颗粒中的靶向递送载体 dnG1/C-REX。
有复制能力的逆转录病毒不太可能出现在瞬时质粒共转染系统，例 如用于Rexin-G制备的系统中，因为鼠源逆转录病毒包膜构建体、包装 构建体gag pol和逆转录载体是在独立的质粒中表达，各由自身的启动子 驱动。此外，人生产细胞也被用于生产病毒体。人细胞不含能与Rexin-G 中使用的鼠源逆转录载体重组的内源性鼠序列。近期对REX1N-G制备 做了一些改进，目的是进一步减少产生有复制能力的逆转录病毒的可能 性。质粒dnG1/C-REX包含残留的gag-pol序列，这些序列可能与各 gag-pol构建体中含有的5′DNA序列重叠。因此，从亲本dnG1/C-REX 质粒中去除487个碱基对，再插入97个碱基对的剪接受体位点，得到 pdnG1/UBER-REX(图21A)。
本文披露的质粒中包括靶向配体。通常，该配体被插入由质粒核酸 序列编码的逆转录病毒包膜的天然(即未修饰的)受体结合区域的两个 连续编号氨基酸残基之间，例如修饰的双嗜性CAE包膜多肽中，其中 靶向多肽被插入氨基酸残基6和7之间。该多肽是被称作gp70的蛋白 质的一部分，后者包含于莫洛尼鼠白血病病毒的双嗜性包膜中。一般而 言，靶向多肽包括结合细胞外基质成分的结合部位，该成分包括但不限 于胶原(包括I型胶原和IV型胶原)、层粘连蛋白、纤连蛋白、弹性蛋 白、糖胺聚糖、蛋白聚糖及结合纤连蛋白的序列，如精氨酸-甘氨酸-天 冬氨酸或RGD序列。可包含在靶向多肽中的结合区域包括但不限于属 于冯维勒布兰德因子及其衍生物内的功能性结构域的多肽结构域，其中 该多肽结构域可与胶原结合。在一种实施方式中，该结合结构域为具有 以下结构式的多肽：Trp-Arg-Glu-Pro-Ser-Phe-Met-Ala-Leu-Ser。
制备靶向载体的方法
本公开内容涉及病毒和非病毒载体颗粒的制备，包括逆转录病毒载 体颗粒、腺病毒载体颗粒、腺相关病毒载体颗粒、疱疹病毒载体颗粒、 假型病毒，以及具有修饰的或靶向的病毒表面蛋白的非病毒载体，例如 靶向病毒包膜多肽，其中该修饰病毒表面蛋白，如修饰病毒包膜多肽， 包括靶向多肽，该多肽包含结合细胞外基质成分如胶原的结合区域。靶 向多肽可被置于病毒表面蛋白的两个连续氨基酸残基之间，或者可以替 换已从病毒表面蛋白中去除的氨基酸残基。
进行基因治疗的最常用的递送系统之一包括病毒载体，最为常用的 是腺病毒和逆转录病毒载体。基于病毒的载体的例子包括但不限于重组 逆转录病毒(参见，例如WO 90/07936；WO 94/03622；WO 93/25698；WO 93/25234；美国专利No.5,219,740；WO 93/11230；WO 93/10218；美国专 利No.4,777,127；英国专利No.2,200,651；EP 0 345 242；和WO 91/02805)、基于α病毒的载体(例如辛德毕斯病毒载体、塞姆利基森林 病毒(ATCC VR-67；ATCC VR-1247)、罗斯河病毒(ATCC VR-373；ATCC VR-1246)和委内瑞拉马脑炎病毒(ATCC VR-923；ATCC VR-1250；ATCC VR 1249；ATCC VR-532))和腺相关病毒(AAV)载体(参见，例如WO 94/12649，WO 93/03769；WO 93/19191；WO 94/28938；WO 95/11984和 WO 95/00655)。还可使用Curiel，Hum.Gene Ther.(1992)3：147中描述的 与杀死的腺病毒相连的DNA。
为达到基因递送目的，病毒颗粒可由天然针对靶细胞的病毒或非天 然针对靶细胞的病毒发展而来。通常，与天然病毒载体相比，更希望采 用非天然病毒载体。尽管天然病毒载体可能具有对靶细胞的天然亲和 力，然而由于其更有可能在靶细胞中增殖，因此这种病毒会带来较大风 险。在这点上，并非天然设计为在人细胞中增殖的动物病毒载体可用于 针对人细胞进行基因递送。然而为了获得足够产量的这种动物病毒载体 用于基因递送，需要在天然的动物包装细胞中进行生产。这样产生的病 毒载体常常缺乏任何作为包膜部分或衣壳部分的成分，这些成分能提供 对人细胞的趋向性。例如，非人类病毒载体，如亲嗜性小鼠(鼠)逆转 录病毒，像MMLV，当前是在小鼠包装细胞系中制备的。必须提供另一 种人细胞趋向性所需的成分。
一般而言，病毒载体的增殖(无辅助病毒)在包装细胞中进行，其 中包装成分的核酸序列被稳定整合到细胞基因组中，编码病毒核酸的核 酸也被引入该细胞系中。现有的包装系生产的生产克隆滴度足够转导人 细胞供基因治疗应用，并已开始进行人体临床试验。然而这些包装系仍 有两方面的不足。
首先，设计用于特定用途的合适的逆转录病毒载体需要构建并试验 数个载体配置。例如，Belmont等人Molec.and Cell.Biol.8(12)：5116-5125 (1988)，为了鉴定既能够产生最高滴度生产细胞又能够获得最佳表达的 载体，由16个逆转录病毒载体构建了稳定的生产细胞系。部分检验过 的配置包括：(1)LTR驱动的表达对比内部启动子；(2)选择来源于病毒 或细胞基因的内部启动子；和(3)选择性标记是否被整合到构建体中。提 供快速高滴度病毒生产而不需生产稳定生产细胞系的包装系统将具有 明显优势，因为这可节省鉴定来源于多个构建体的高滴度生产细胞克隆 所需的大约两个月的时间。
其次，与NIH 3T3细胞相比，高滴度双嗜性逆转录病毒生产载体对 原代培养的哺乳动物体细胞的感染效率变化很大。已经证实小鼠肌原细 胞(Dhawan等人，Science 254：1509-1512(1991)或大鼠毛细血管内皮细胞 (Yao等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：8101-8105(1991))与NIH 3T3细 胞的转导效率大致相当，而犬肝细胞(Armentano等人，Proc.Natl.Acad. Sci.USA 87：6141-6145(199))的转导效率却仅为NIH 3T3细胞的25％。 相比NIH 3T3细胞，从外周血淋巴细胞分离得到的原代人肿瘤浸润淋巴 细胞(“TIL”)、人CD4+和CD8+T细胞以及灵长类长期重建造血干细胞 代表了低转导效率的极端实例。曾报道纯化的人CD4+和CD8+T细胞 有时被稳定生产克隆上清液感染的水平为6％-9％(Morecki等人，Cancer Immunol.Immunother.32：342-352(1991))。如果逆转录病毒载体含有 neoR基因，经G418选择可得到高度富集的转导细胞群。然而发现选择 性标记的表达对体内造血干细胞中的长期基因表达具有不利作用 (Apperly等人Blood 78：310-317(1991))。
为克服这些局限性，提供了用于新型瞬时转染包装系统的方法和组 合物。逆转录病毒载体的设计改良使得能够：(1)代替现有技术下繁杂的 质粒克隆和融合操作，(2)提供单一直线质粒构建体，避免了可能影响试 剂获得监管部门(即FDA)批准的亲本构建体的过度融合与突变，(3) 除去获得的逆转录病毒载体中冗长的、不起作用的和/或不需要的序列， (4)选择治疗性基因构建体并将其定向克隆至逆转录病毒载体的灵活性 增加，(5)简化逆转录病毒载体内各种辅助结构域的分子克隆，(6)引入关 键性修饰提高亲本质粒在载体生产细胞中的性能，从而增加所得逆转录 病毒载体产物的效力，(7)显著减小逆转录病毒载体构建体的总尺寸至一 定程度，以使质粒产量从生物发酵中的“低拷贝，低产量”反应物提高至 中等产量。总之，这些改良保持了目前使用的逆转录病毒载体的优点(在 载体安全性、基因整合和基因表达方面)，同时还对期望用于人体基因 治疗的逆转录病毒载体的结构、确认、生产和性能提供了重要改进。这 代表了第二代TDS组件，包括高效逆转录病毒表达载体，命名为C-REX 载体。
瞬时转染相比包装细胞方法具有许多优势。在这点上，瞬时转染避 免了生产稳定产载体细胞系所需的较长时间，可在载体基因组或逆转录 病毒包装组分对细胞有毒性作用时使用。如果载体基因组编码毒性基因 或干扰宿主细胞复制的基因，例如细胞周期抑制基因或诱导凋亡的基 因，可能会难以产生稳定的产载体细胞系，但可采用瞬时转染在细胞死 亡前产生载体。也利用瞬时感染开发了可产生与稳定的产载体细胞系相 当的滴度水平的细胞系(Pear等人1993，PNAS 90：8392-8396)。
提供了一种大规模生产高滴度和高生物活性的带有杀细胞基因构 建体的逆转录病毒载体原种的高效生产方法。该生产方法描述了对瞬时 转染的293T生产细胞的使用；生产细胞放大的工程方法；和产生保持 杀细胞基因高保真表达的逆转录病毒载体的瞬时转染操作。
在另一种实施方式中，提供了一个用于生产临床用逆转录病毒载体 的完全验证的293T(用SV40大T转化的人胚肾细胞)原始细胞库。尽管 293T细胞已用于生产少量中、高滴度载体原种供实验室使用，但尚无报 道该生产细胞可用于临床载体原种的大规模生产。美国FDA严格控制 和限制可转移完整癌基因的载体在临床产品中的应用。本生产方法在最 终的载体收获与采集步骤中结合了一种不会引起载体效力降低的DNA 降解方法。在另一种实施方式中，提供了一种将用于持续生产临床用载 体产品的逆转录病毒载体原种浓缩到109cfu/ml的方法。临床产品的最 终制剂包括用于收获、采集和保存高滴度临床用载体原种的化学成分确 定的无血清溶液。
在另一种实施方式中，提供了一种采集临床用载体的方法，该方法 采用闭环多管系统保持无菌性、进行质控样品采样并简化最终填充步 骤。闭环多管组合装置(参见图19A和19B)设计为满足收集临床用产 品所需的规范要求，即在采样、采集、浓缩和最终填充过程中保持无菌 性，该装置尚未商品化。本文披露的用于病毒颗粒采集、浓缩和保存的 闭环多管组合装置包括用Stedim 71薄膜制造的flexboy袋和多管系统； 由醋酸乙烯乙酯(EVA)液体接触层、乙基乙烯醇(EVOH)阻气层和EVA外 层组成的3层复合薄膜。薄膜总厚度为300毫米。EVA是惰性非PVC 材质薄膜，不需要添加增塑剂，因此可萃取物保持最少。Stem已进行了 广泛的生物相容性试验并且FDA建立了该产品的药品管理档案。薄膜 和进料管符合美国药典VI级要求。所有袋的定制生产在Stedim的10,000 控制级生产环境中完成。薄膜、管道和所有使用部件的γ射线相容性达 45kGy。进行γ照射，最低照射量为25kGy，最高照射量为45kGy。产 品合格证由Stedim及其合同消毒公司提供。
将临床用载体以150ml体积装入500ml冷冻袋中于-80℃冻存。完全 验证的产品的病毒滴度为每毫升3×107集落形成单位，生物效力为对人 乳腺癌、结肠癌和胰腺癌细胞的生长抑制活性达65-70％，均匀颗粒大小 为大约100nm，并且没有病毒聚集，DNA残留低于550bp，表明无完 整癌基因，无可检测到的E1A或SV40大T抗原，在印度侏儒小鼠(mus Dunni)和人293细胞中5次传代中未检测到有复制能力的逆转录病毒 (RCR)。产品为无菌的，其内毒素水平＜0.3EU/ml，生产结束时细胞无 支原体及其他外来病毒。
将采用新pB-RVE和pdnG1/UBER-REX质粒生产的Rexin-G以 20-40ml体积装入150ml塑料冷冻袋中于-70±10℃冻存。临床批次的滴 度范围是0.5-5.0×109单位(U)/ml，每个批次经验证均没有有复制能力 的逆转录病毒(RCR)，并且具有供人体系统使用所需的纯度、生物效 力、无菌性和全面安全性。
病毒包膜包括靶向配体，后者包括但不限于可与纤连蛋白结合的精 氨酸-甘氨酸-天冬氨酸或RGD序列，以及也可与纤连蛋白结合的具有 Gly-Gly-Trp-Ser-His-Trp序列的多肽。除了结合区域以外，靶向多肽还可 包括位于结合区域N末端和/或C末端的一个或多个氨基酸残基的连接 序列，该连接体可增加旋转灵活性和/或使修饰包膜多肽的位阻最小化。 多核苷酸可通过本领域技术人员公知的基因工程技术进行构建。
因此，依照本发明制备的靶向递送载体包含与其相关的、能够促进 载体在靶标部位聚集的配体，即靶标特异性配体。配体为化学部分，例 如分子、官能团及其片段，它对选择的靶标具有特异性反应性，而对其 他靶标的反应性较低，因而使靶向递送载体具有能够将编码治疗性或诊 断性多肽的核酸选择性地转移到接近所选靶标的细胞中的优点。具有“反 应性”是指对细胞或组织具有结合亲和力或者能够被内化到细胞内，其中 结合亲和力可通过本领域已知的任意方法检测，例如通过任意标准体外 检测法如ELISA、流式细胞术、免疫细胞化学法、表面等离子共振技术 等。通常配体结合特定分子部分-表位，例如分子、官能团或与细胞或 组织结合的分子复合物，形成具有两个成员的结合对。应知道在结合对 中，任一成员可为配体，同时另一个为表位。该结合对为本领域所公知。 结合对的例子有抗体-抗原、激素-受体、酶-底物、营养成分(如维 生素)-转运蛋白、生长因子-生长因子受体、碳水化合物-凝集素和 具有互补序列的两个多肽。配体的片段只要保留结合适当细胞表面表位 的能力，则可被看作是配体并可用于本发明。优选地，配体是包含免疫 球蛋白的抗原结合序列的蛋白质和肽类。更为优选地，配体是缺乏Fc 序列的抗原结合抗体片段。这样的优选配体有免疫球蛋白Fab片段、免 疫球蛋白F(ab)2片段、Fv抗体片段或单链Fv抗体片段。这些片段可通 过酶法产生或重组制备。在其功能方面，配体优选为可内化配体，即， 例如通过细胞内吞过程可被所选细胞内化的配体。同样地，发生替换或 其他变化但仍保留表位结合能力的配体也可使用。优先选择识别病理性 细胞，例如恶性细胞或病原体的配体。例如，结合暴露胶原的配体能够 将载体靶向至受试对象含恶性组织的区域。通常，细胞转移至机体另一 区域是通过侵袭和破坏健康组织而实现的。这种侵袭会导致胶原暴露， 暴露的胶原能够被本文所提供的载体靶向。
可用于靶向载体的另一类配体是能够与在许多肿瘤细胞表面过度 表达的酪氨酸激酶生长因子受体形成结合对的配体。酪氨酸激酶生长因 子受体的例子有VEGF受体、FGF受体、PDGF受体、IGF受体、EGF 受体、TGF-α受体、TGF-β受体、HB-EGF受体、ErbB2受体、ErbB3 受体和ErbB4受体。EGF受体vIII和ErbB2(HEr2)受体尤其优选在采 用插入物(INSERTS)治疗癌症的情形下使用，因为这些受体对于恶性 细胞有更高的特异性，而很少出现于正常细胞上。可选地，选择的配体 识别需要通过引入有利基因进行遗传校正或遗传改造的细胞，例如有遗 传缺陷机体的肝细胞、上皮细胞、内分泌细胞，体外的胚胎细胞、胚细 胞、干细胞、生殖细胞、杂交细胞、植物细胞或任何用于工业过程的细 胞。
配体可以在病毒颗粒表面上表达或通过任意本领域已有的适宜方 法附着于非病毒颗粒上。附着可以是共价的或非共价的，例如通过吸附 或形成复合物。附着优选涉及能够通过形成共价键或非共价键与配体偶 联的亲脂性分子部分，其被称作“锚”。锚对亲脂性环境具有亲和力，例 如类脂微泡、双层和其他浓缩相，因此可将配体附着于脂质-核酸微粒 上。通过亲脂性锚的配体附着方法为本领域所公知。(参见，例如，F. Schuber，″Chemistry of ligand-coupling to liposomes″，在Liposomes as Tools for Basic Research and Industry中，由J.R.Philippot和F.Schuber 编辑，CRC Press，Boca Raton，1995，p.21-37)。
应认识到本文披露的靶向递送载体包括病毒颗粒和非病毒颗粒。非 病毒颗粒包括脂双层中的包封核蛋白，包括全部或部分组装的病毒颗 粒。将病毒包装进脂双层的方法为本领域所公知。方法包括被动捕获至 脂双层包裹的囊泡(脂质体)中，并将病毒体与脂质体孵育(美国专利 No.5,962,429；Fasbender等人，J.Biol.Chem.272：6479-6489；Hodgson和 Solaiman，Nature Biotechnology 14：339-342(1996))。不被理论所束缚，我 们认为暴露于病毒体表面的酸性蛋白质提供了与靶向递送载体的阳离 子脂质/阳离子聚合物成分发生络合的界面，并作为“支架”供中性脂质成 分形成双层。病毒的典型类型包括腺病毒、逆转录病毒、疱疹病毒、慢 病毒和噬菌体。
非病毒递送系统，如微粒或纳米颗粒，包括例如阳离子脂质体和聚 阳离子，提供了递送系统的备选方法，也包括在本公开内容中。
非病毒递送系统的实例包括，例如Wheeler等人的美国专利No. 5,976,567和5,981,501。这些专利披露了通过将含有阳离子和非阳离子 脂质的有机溶液与质粒的水溶液接触而制备血清稳定的质粒-脂质颗 粒。Thierry等人的美国专利No.6,096,335披露了包含整体阴离子生物活 性物质、阳离子组份和阴离子组份的复合物的制备。Allen和Stuart的 PCT/US98/12937(WO 98/58630)披露了在适合阳离子脂质溶解的脂溶剂 中形成多核苷酸-阳离子脂质颗粒、向含颗粒的溶剂中加入中性成囊泡 脂质、蒸发脂溶剂以形成其内包埋有多核苷酸的脂质体。Allen和Stuart 的美国专利No.6,120,798披露了多核苷酸-脂质微粒的形成，包括将多 核苷酸溶于第一溶剂(如水性溶剂)、将脂质溶于不与所述第一溶剂混 溶的第二溶剂(如有机溶剂)、加入第三溶剂形成单一相、再加入一定 量的第一和第二溶剂形成两个脂质相。Bally等人的美国专利No. 5,705,385和Zhang等人的美国专利No.6,110,745披露了制备脂质-核酸 颗粒的方法，包括用含非阳离子脂质和阳离子脂质的溶液与核酸接触而 形成脂质-核酸混合物。Maurer等人的PCT/CA00/00843(WO 01/06574) 披露了制备带电荷治疗药剂的全脂质包裹治疗药物颗粒的方法，包括在 去稳定溶剂中将形成的脂囊泡、带电荷治疗药剂和去稳定剂相混合形成 混合物，去稳定溶剂使囊泡去稳定，但不会破坏囊泡，之后再去除去稳 定剂。
成颗粒组份(“PFC”)一般包括脂质如阳离子脂质，任选与除阳离子脂 质以外的PFC联用。阳离子脂质是其分子能够电离产生净正离子电荷的 脂质，pH范围为约3-约10，优选约4-约9的生理pH范围。该阳离子脂 质包括例如阳离子去污剂，如具有单烃链的阳离子两亲化合物。专利和 科学文献中描述了大量具备促核酸转染性质的阳离子脂质。这些促转染 的阳离子脂质包括但不限于例如：1，2-二油基氧-3-(N，N，N-三甲基铵基) 氯化丙烷-，DOTMA(美国专利No.4,897,355)；DOSPA(参见 Hawley-Nelson等人，Focus 15(3)：73(1993))；N，N-双十八烷基-N，N-二甲 基-溴化铵或DDAB(美国专利No.5,279,833)；1，2-二油基氧-3-(N，N，N-三 甲基铵基)氯化丙烷-DOTAP(Stamatatos等人，Biochemistry 27：3917-3925 (1988)；基于甘油的脂质(参见Leventis等人，Biochem.Biophys.Acta 1023：124(1990)；精氨酰-PE(美国专利No.5,980,935)；赖氨酰-PE (Puyal等人J.Biochem.228：697(1995))、脂多胺(美国专利No.5,171,678) 和基于胆固醇的脂质(WO 93/05162，美国专利No.5,283,185)；CHIM (1-(3-胆固醇基)-氧基羰基-氨甲基咪唑)等等。已有对转染用阳离子脂质 的综述，例如：Behr，Bioconjugate Chemistry，5：382-389(1994)。优选的 阳离子脂质有DDAB、CHIM或二者的联用。阳离子脂质的实例有阳离 子去污剂，包括(C12-C18)-烷基-和(C12-C18)-烯基-三甲铵盐、N-(C12- -C18)-烷基-和N-(C12-C18)-烯基-吡啶盐等等。
根据本发明制备的靶向递送载体的大小在约40nm至约1500nm的 范围内，优选范围为约50-500nm，最优选为约20-150nm。选择该尺寸 有利于靶向递送载体在向机体施用后穿透血管进入患病组织如恶性肿 瘤，并将治疗性核酸转移至此。靶向递送载体的一个特有的和有利的性 质是在细胞外生物液体如体外细胞培养基或血浆存在下其大小基本不 会增加(例如经动态光散射方法测定)。
可选地，如Culver等人(1992)Science 256，1550-1552所述，可将严 生逆转录病毒的细胞注射到肿瘤中。所引入的产生逆转录病毒的细胞构 建为可活跃地产生靶向递送载体如病毒载体颗粒，由此在肿瘤块中原位 发生载体持续产生。因此，若与产生逆转录病毒载体的细胞相混合，可 在体内成功转导增殖的肿瘤细胞。
治疗方法
本发明的靶向载体也可作为基因治疗方案的一部分用于递送编码 治疗剂如突变细胞周期蛋白G多肽的核酸。因此，本发明另一方面提供 用于在体内或体外将治疗剂转染至受试对象含有转移性肿瘤疾病相关 细胞型的部位的表达载体。本文提供的靶向载体意图用作基因治疗的载 体。可用突变细胞周期蛋白G多肽和核酸分子代替其他靶向载体中的相 应基因。可选地，本文披露的靶向载体(如包含胶原结合结构域的靶向 载体)可包含编码任意治疗剂(如胸苷激酶)的核酸。更希望的是用于 治疗肿瘤性疾病的治疗剂。
本研究提供了来自人体内临床试验的数据。然而，本文披露的靶向 载体的其他毒性和治疗有效性可通过标准药学方法由细胞培养或实验 性动物来确定，例如确定LDS50(50％群体致死的剂量)和ED50(50％ 群体治疗有效的剂量)。治疗指数是毒性与疗效的剂量比，可表示为 LD50/ED50。优选治疗指数大的剂量。在本发明中，可以采用正常情况下 会表现出毒性副作用的剂量，因为递送系统设计为靶向治疗部位，以使 对未受处理细胞的损伤最小化并减少副作用。
人体临床试验(见下)所得数据证实本发明的靶向载体在体内发挥 了抑制肿瘤性疾病进展的功能。表1中的数据提供了向患者施用该载体 的治疗方案。此外，采用靶向载体替代形式(如替代的靶向机制或替代 的治疗剂)进行的细胞培养试验和动物实验所得数据可用于配制一定范 围的剂量供人体使用。剂量优选地处于具有极低毒性或无毒性的、包括 ED50值的循环浓度范围内。在该范围内剂量可根据使用的剂型及给药 途径而变化。最初，治疗有效剂量可通过细胞培养试验加以估计。剂量 可在动物模型中试验，以达到包含IC50(即试验化合物达到半数最大感染 或半数最大抑制时的浓度)的循环血浆浓度范围(在细胞培养物中测定)。 这些信息可用于更加精准地确定人体使用的有效剂量。血浆水平可通过 例如高效液相色谱法进行测定。
包含靶向递送载体的药物组合物可按任意传统方式将所选数量的 载体与一种或多种生理可接受的载体或赋形剂混合而配制。例如，可将 靶向递送载体混悬于载体如PBS(磷酸盐缓冲液)中。活性化合物可以 液体、半液体或固体形式经任意适宜的途径给药，例如经口、肠胃外、 静脉内、皮内、皮下或局部给药，并按适合各给药途径的方式进行配制。 优选的给药方式包括口服和肠胃外给药方式。
靶向递送载体和生理可接受的盐和溶剂化物可配制为供吸入或吹 入给药(经口或鼻)或者供口服、含服、肠胃外或直肠给药。对于吸入 给药，靶向递送载体可借助适合的喷射剂，例如二氯二氟甲烷、三氯氟 甲烷、氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适的气体，从加压包或喷雾器中 以喷雾剂形式递送。对于加压气雾剂，可通过设置阀门按量递送来确定 剂量单位。例如供吸入器或吹入器使用的明胶的胶囊和盒可以配制为包 含治疗性化合物与适宜粉末基质如乳糖或淀粉的混合粉末。
对于口服给药，药物组合物可采用以下剂型：例如用药学可接受的 赋形剂通过常规方法制备的片剂或胶囊剂，所述赋形剂如粘合剂(例如 预胶化玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；充填剂(例 如乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(例如硬脂酸镁、滑石粉或 二氧化硅)；崩解剂(例如土豆淀粉或羟乙酸淀粉钠)；或湿润剂(例如 十二烷基硫酸钠)。可采用本领域熟知的方法对片剂进行包衣。供口服 给药的液体制剂可采用的形式有例如溶液剂、糖浆剂或混悬剂，或者可 以干产品提供，在临用前与水或其他适合的溶媒配制。该液体制剂可采 用药学可接受的添加剂经常规方法制备，所述添加剂如混悬剂(例如山 梨醇糖浆、纤维素衍生物或氢化食用脂)；乳化剂(例如卵磷脂或阿拉 伯胶)；非水性溶媒(例如杏仁油、油酯、乙醇或分馏植物油)；以及防 腐剂(例如甲基或丙基-对羟基苯甲酸酯或山梨酸)。制剂必要时还可包 含缓冲盐、调味剂、着色剂和甜味剂。
口服给药制剂可经适当配制以实现活性化合物的控制释放。含服给 药的组合物可采用按常规方式配制的片剂或锭剂的形式。
靶向递送载体可制备为用于通过注射例如通过推注或持续输注进 行肠胃外给药。注射制剂可提供为单元剂量形式，例如装于安瓿或多剂 量容器中，并加入防腐剂。组合物可采用在油或水性载体中的混悬剂、 溶液剂或乳剂的形式，并且可包含配制试剂如混悬剂、稳定剂和/或分散 剂。可选地，活性成分可以是冻干粉形式，临用前用适当的溶媒例如无 菌无热原水配制。
除上述制剂外，靶向递送载体还可制成储库型(depot)制剂。该长 效制剂可通过植入(例如经皮下或肌内)或肌内注射给药。因此，例如， 治疗性化合物可采用适宜的聚合物或疏水性材料(例如作为在可接受的 油中的乳剂)或离子交换树脂制备，或制备为微溶性衍生物如微溶性盐。
活性剂可制备为凝胶剂、乳膏剂和洗剂形式，供局部或表面应用， 例如供皮肤和粘膜(如眼内)表面使用，以及供眼部应用或者供脑池内 或脊柱内应用。这种溶液，特别是打算供眼部使用的溶液，可采用适宜 的盐配制为pH约5-7的0.01％-10％等渗溶液。化合物可制成气雾剂供 局部应用，例如吸入。
药物组合物中活性化合物的浓度取决于活性化合物的吸收、失活和 排泄速度、剂量日程和给药量以及本领域技术人员公知的其他因素。例 如，给药量应足以治疗高血压症状。
组合物可根据需要装入包装或分配装置中，其中可包含有一个或多 个含活性成分的单元剂量形式。包装包括例如金属的或塑料薄膜，例如 泡包装(blister pack)。包装或分配装置可附给药说明书。
活性剂可以包装为一种产品，该产品包含包装材料、其中提供的药 剂以及标明该药剂的适应症的标签。
包含细胞因子基因的靶向逆转录病毒颗粒可单独给药或与其他治 疗性处置或活性剂联用。例如，包含细胞因子基因的靶向逆转录病毒颗 粒可与包含杀细胞基因的靶向逆转录病毒颗粒联合给药。包含杀细胞基 因的靶向逆转录病毒颗粒的给药量将根据本文上述的病毒颗粒滴度而 定。例如，如果包含细胞因子基因的靶向逆转录病毒颗粒与包含杀细胞 基因的靶向逆转录病毒颗粒联合给药，则每个载体的逆转录病毒颗粒滴 度应低于各载体单独使用时的滴度。包含细胞因子基因的靶向逆转录病 毒颗粒可与包含杀细胞基因的靶向逆转录病毒颗粒同时给药或分开给 药。
本发明方法还涉及通过施用靶向逆转录病毒颗粒(例如，表达细胞 因子的靶向逆转录病毒载体，其单独使用或与表达杀细胞基因的靶向逆 转录病毒载体联用)与一种或多种其他活性剂治疗癌症的方法。可能使 用的其他活性剂的实例包括但不限于化疗药剂、抗炎症药剂、蛋白酶抑 制剂如HIV蛋白酶抑制剂、核苷酸类似物如AZT。一种或多种活性剂可 与另外一种或多种活性剂同时或分开给药(例如，在施用靶向逆转录病 毒颗粒之前或之后)。本领域技术人员会理解靶向逆转录病毒颗粒给药 途径可与一种或多种药剂给药途径相同(例如，靶向逆转录病毒颗粒与 药剂均采取静脉内给药)或不同(例如，靶向逆转录病毒颗粒为静脉内 给药，而一种或多种药剂则为口服给药)。
有多种方法可确定向需要治疗的受试对象施用的靶向逆转录病毒 颗粒的有效量或治疗有效量。例如，可根据病毒滴度或在动物模型中的 效力确定用量。可选地，临床试验所用的剂量方案可作为一般指导原则。 每日剂量可以单剂量给药或在一天中不同时间分次给药。开始时可能需 要较高剂量，一段时间后当达到最佳初始反应时则可降低剂量。例如， 治疗可连续数天、数周或数年，或者可以间隔进行，其中插入休息期。 根据个体可能接受的其他治疗，其剂量可作相应修改。然而，治疗方法 绝不限于靶向逆转录病毒颗粒的特定浓度或范围，可根据治疗的每个个 体及所使用的各种衍生物而变化。
本领域技术人员会理解，针对给定个体可能需要将剂量个体化，以 获得最佳疗效。本领域技术人员还会了解施用于受治个体的剂量会根据 个体的年龄、疾病严重程度或分期以及对治疗过程的反应而不同。本领 域技术人员将知道为通过本文所述方法治疗的个体评价和确定适当剂 量的临床参数。可用于评价并确定剂量的临床参数包括但不限于肿瘤大 小、用于临床检测特定恶性肿瘤的肿瘤标志物水平改变。根据这些参数， 治疗医师将确定用于给定个体的治疗有效剂量。经治疗医师判断，这种 治疗可以必要地经常进行，并且持续必要的一段时间。
在本研究中，示例性方案针对癌症患者而设计。静脉输注Rexin-G 的患者内剂量递增方案每天进行一次，连续8-10天。该治疗方案结束后 休息一周时间，进行毒性评估；此后，静脉内施用最大耐受剂量的 Rexin-G，持续8-10天。如果在治疗期间患者未出现Rexin-G相关的3 级或4级不良事件，则Rexin-G剂量如下递增：
表1：治疗方案
治疗日 剂量水平 载体剂量/天 第1-6天 (剂量递增方案) I 4.5x109单位 第7-8天 II 9.0x109单位 第9-10天 III 1.4x1010单位 第18-27天 (高剂量方案) III 1.4x1010单位
根据对前两名患者所观察到的安全性，第三名患IVB期胰腺癌伴多 处肝转移患者采用静脉注射Rexin-G进行一线治疗6天，随后进入经菲 律宾食品药物管理局批准的第二个临床治疗方案，施用吉西他滨周剂量 1000mg/m2连续8周。
采用改良pB-RVE和pdnG1/UBER-REX质粒得以生产Rexin-GTM高 效制剂(1-5×109U/ml)。它克服了现有产品输注体积大而致用量限制 的问题，并得以发展了重要的如等价计算定义的剂量密集方案。在癌症 治疗中，影响试验药物有效性的关键因素是肿瘤负荷的程度。试验药物 的安全范围非常窄，因为常常在达到肿瘤控制之前就已出现剂量限制性 毒性。因此，发展能够实际定位于肿瘤负荷而不引起剂量限制性副作用 或器官损害的抗癌药物代表了癌症治疗的重要里程碑和进步。另一个重 要问题是癌症生长的天然动力学，这要求给出适宜的动力学方案。历史 上的肿瘤生长模型现已被认为过度简单化(Heitjan.(1991)Stat.Med. 10：1075-1088，Norton.(2005)Oncologist 10：370-381)，时至今日这些简单 化的模型极大地影响着今天仍在实施的癌症治疗标准的发展；即，联合 使用药物，以及在相等间隔周期中以相等密度用药。尽管对肿瘤皱缩与 预后良好相关的预测是正确的，然而给予传统药物足够长的时间即可根 除肿瘤的预测则被证明是错误的(Norton.(2006)Oncol.4：3637)。对更加 复杂动力学的理解，如Benjamin Gompertz所述并以Norton-Simon模型 使之形式化，考虑了转移动力学及肿瘤负荷与预测转移能力之间的数量 关系。因此，出现了剂量密集化学疗法的概念，该疗法强调能在较短的 时间间隔中引起肿瘤退缩的最佳药物剂量，并且偏重于序贯方法而非联 用法((Norton.(2006)Oncol.4：36-37；Fomier和Norton.(2005)Breast Cancer Res.7：64-69)。此后，大量临床试验提供了支持证据，证明更加 密集地给药在优化杀死癌细胞方面具有显著性差异。
引入亲病灶性纳米颗粒实施靶向基因递送以独特且具有战略意义 的方式开辟了一种全新的治疗转移性癌症的定量方法。本文描述的等价 计算表示在高度压缩的时间段内寻求满足并匹配给定肿瘤负荷的新标 准；换句话说，在量上基于对总肿瘤负荷的最准确估计的剂量密集诱导 方案。等价计算从开始就假定(i)治疗药剂(本文中为Rexin-GTM)充 分定向，足以抵抗生理屏障包括稀释、湍流、流动、扩散屏障、滤过、 灭活和清除的影响，因而能够计算生理性能系数(ф)或生理感染复数 (P-MOI)，(ii)药剂在不引起限定的剂量限制性毒性的水平时是有效的； 以及(iii)能获得足够高浓度的药剂，以允许按个体化剂量经静脉给药 而不引起容量过度负荷。杀细胞性细胞周期蛋白G1构建体的生理性能 系数从4至250变化，并部分取决于药物的滴度(Gordon等人(2000) Cancer Res.60：3343-3347)。为计算Rexin-GTM每日给药的最佳剂量，需 要考虑以下因素：(1)基于放射影像分析的总肿瘤负荷，(2)系统的生理 性能系数(ф)，该系数决定了每个靶标癌细胞所需的可诱导基因转移单位 复数，以及(3)以载体滴度定义的精确药物效力，以集落形成单位(U)/ml 表示。一个基因转移单位与一个集落形成单位相当。等价计算预测，如 果靶向载体给药剂量与新出现的肿瘤负荷相当，则可实现肿瘤控制；然 而总剂量给药应考虑在安全范围内于尽可能短的时间内完成，目的是在 留出时间供网状内皮系统清除产生的肿瘤碎片的同时可防止肿瘤继续 生长(Gordon等人(2000)Cancer Res.60：3343-3347)。
等价计算公式：
应用于Rexin-G治疗的等价计算
其中肿瘤负荷由公式[目标病变最长直径之和(cm)]×[1×109癌细 胞/cm]算出
其中ф或pMOI为由临床前和临床研究估计的经验数值
对于Rexin-G，pMOI是100
其中效力是每ml药物溶液的集落形成单位(U)数值。
对于新构建体pB-RVE和pdnG1/EREX产生的Rexin-G，效力范围 是5×108-5×109单位/ml
实施例：对于转移性胰腺癌患者的Rexin-G剂量计算
其中患者有一个尺寸为2cm×2cm的局部晚期肿瘤，4个肝病变， 其中3个的尺寸为1cm×1cm，第4个的尺寸为2cm×2cm
肿瘤负荷(胰腺、肝)＝(4cm+(2cm+2cm+2cm+4cm))×1×109 细胞/cm＝14×109癌细胞
其中特定批次的Rexin-G的效力为1×109U/ml
实施例：施用所需的Rexin-G冷冻袋数量的计算
为确定输注所需的Rexin-G冷冻袋的数量，用所用批次冷冻袋包含 的Rexin-G标准体积除Rexin-G剂量总体积。冷冻袋提供的Rexin-G体 积为20ml或40ml。
对于以40ml等份提供的Rexin-G，所需袋数是：
采用等价计算得到针对不同肿瘤负荷的三种给药方案(见上)
等价计算估计 的肿瘤负荷 开始/诱导(4周) 维持(6个月) 小肿瘤负荷 (＜5×109癌细 胞) 4.0×1010单位/天，周一-周五加周末休息×4周； 休息2周后经CT、MRJ或PET扫描评价肿瘤反应 重复2至4周的周期 重新进行等价计算确 定施用的的累积剂量 中肿瘤负荷 (5-10×109癌细 胞) 8.0×1010单位/天，周一-周五加周末休息×4周； 休息2周后经CT、MRI或PET扫描评价肿瘤反应 重复2至4周的周期 重新进行等价计算确 定施用 的累积剂量 大肿瘤负荷 (＞10×109癌细 胞) 1.2×1011单位/天，周一-周五加周末休息×4周； 或2.0×1011单位/天，周一-周三-周五×4周； 休息2周后经CT、MRI或PET扫描评价肿瘤反应 重复2至4周的周期 重新进行等价计算确 定施用 的累积剂量
我们利用该算法进行的初步临床实验(参见研究C)限于三名患者， 每人均具有相对高的肿瘤负荷；然而，从两名标准化疗失败的患者及一 名拒绝标准化疗的患者身上观察到了非常显著的应答(100％应答率)， 该结果凸显了其应用潜力及深入研究该定量方法的迫切需要。
靶向治疗包括靶向基因治疗的出现，正在改变肿瘤对受试抗癌药物 的应答方式。癌症治疗的指导原则曾经是从有应用前景的化疗药获得的 治疗益处必须超过候选药物可能引起严重或致死性系统毒性的风险。为 此目的，美国国立癌症研究所(NCI，Bethesda Maryland，USA)制定了实 体瘤反应评价标准(RECIST)，曾经被绝大多数(如果不是全部的话)学 术机构用作肿瘤反应评价的通用标准(Therasse等人，(2000)J.Nat′l. Cancer Inst.92：205-216)。特别地，客观肿瘤反应(OTR)曾经甚至近期 还被考虑作为评价实体瘤癌症治疗成功的黄金标准。OTR包括目标病变 大小至少减少30％和/或转移病灶或非目标病变完全消失。然而，许多癌 症的生物反应调节剂事实上并不引起肿瘤皱缩，但却显示能延长无进展 存活期(PFS)及总存活期(OS)(Abeloff，(2006)Oncol.News Int′l，15：2-16)。 因此，对有效生物制剂的反应通常是生理性的，RECIST可能不再是评 价肿瘤对生物疗法应答的恰当标准了。因此，呼吁采用备选的替代终点， 例如测定肿瘤密度(坏死的指标)、肿瘤内的血流和葡萄糖利用以及其 他成像方法，来评价肿瘤反应的机理。
因此，了解疾病过程以及推荐干预措施的可能作用机制在预测对给 定临床终点的治疗效果时尤为重要。关于肿瘤Rexin-GTM的反应，其主 要作用机制是诱导增殖肿瘤细胞及辅助的生血管脉管系统中的细胞凋 亡，促进肿瘤内部发生坏死及囊性变。这是由于靶向破坏了肿瘤血供使 肿瘤饥饿，从而导致肿瘤内部发生坏死。在Rexin-GTM治疗患者的肿瘤 中，细胞凋亡是最主要特征，在随后的影像检查中可见肿瘤出现皱缩并 消失。然而在坏死为主要特征的肿瘤中，肿瘤大小在经Rexin-GTM治疗 后实际上可能变大，这是由于坏死肿瘤和肿瘤的囊性转化激发了炎症反 应。在此情形中，CT扫描、PET扫描或MRI显示的肿瘤结节大小增加 并不必然指示疾病进展。因此，需要有另一些能反映受治肿瘤组织学性 质的辅助评价来更加精准地确定由Rexin-GTM治疗引起的坏死或囊性变 的程度。对于CT扫描，肿瘤密度测定(表示为亨斯菲尔德单位(HU)) 是一项准确并可重复的反映肿瘤坏死程度的指标。目标病变密度进行性 降低(HU降低)指示阳性治疗效果。对于PET扫描，目标病变的标准 摄取值(SUV)呈进行性下降指示肿瘤活性降低和阳性治疗效果。对于 肿瘤活检，出现细胞凋亡、坏死、反应性纤维化和肿瘤浸润淋巴细胞(TIL) 指示阳性治疗效果。
在骨肉瘤中，通过连续CT扫描证实肿瘤坏死和病变部位钙化增加， 以及通过连续PET扫描出现18FDG的SUV进行性下降证实病变部位的 葡萄糖利用降低，可指示有利的肿瘤反应。观察到病变部位的钙化增加 至少10％、25％、50％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、 700％、800％、900％或1000％是阳性杀肿瘤反应的证据，可用于评价治 疗结果并计划下一步治疗方案。病变部位的18FDG利用降低至少10％、 20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％是阳性杀肿瘤 反应的证据，也可用于评价治疗结果并计划下一步治疗方案。
通过适应性治疗设计的临床试验可加速确定剂量限制性毒性(DLT) 和最大耐受剂量(MTD)的进程，由此如果已观测到临床有效并且所有治 疗相关毒性确定≤1级，那么患者可采用相同的治疗周期进行治疗。可 选地，若未见客观治疗反应，而所有治疗相关毒性确定≤1级，则患者 可应用下一个更高的剂量水平。两个机制均增加了获得肿瘤控制的机 会，而不会危及患者安全，同时可减少招募患者的时间和花费。
为进一步促进肿瘤消除并延长癌症存活期，发展了一种辅助基因转 移策略，其特别设计为将肿瘤靶向杀细胞基因表达载体定位于病变部位 或其周围区域。利用带有细胞因子基因的肿瘤靶向表达定位于病变部位 或其周围区域可以诱导局部而不是全身暴露于表达的细胞因子。这种定 位的细胞因子诱导的免疫应答不仅促进急性肿瘤破坏，还可提供原位癌 症接种，致使免疫监督增强并降低癌症复发的发生率。这种肿瘤接种方 法有助于靶向休眠的脱落细胞和转移性癌细胞，以及原发肿瘤和肿瘤引 流淋巴结中残留的活癌细胞。
一种正在研发用于靶向递送的细胞因子基因是粒细胞巨噬细胞集 落刺激因子(GM-CSF)，在被包装为与Rexin-G相同的亲病灶性纳米颗粒 后被称作Reximmune-C。另一些可使用的细胞因子包括：TNF-α(肿瘤 坏死因子α)；干扰素，包括但不限于IFN-α和IFN-γ；以及白介素，包 括但不限于白介素1(IL1)、白介素β(IL-β)、白介素2(IL2)、白介素4 (IL4)、白介素5(IL5)、白介素6(IL6)、白介素8(IL8)、白介素10 (IL10)、白介素12(IL12)、白介素13(IL13)、白介素14(IL14)、白 介素15(IL 15)、白介素16(IL16)、白介素18(IL18)、白介素23(IL23)、 白介素24(IL24)。此外，肿瘤靶向表达载体可运送一个以上的细胞因子 基因。例如GM-CSF可与IL1共同表达。
带有细胞因子基因的肿瘤靶向表达载体可在施用杀细胞亲病灶性 纳米颗粒之前、同时或之后施用。最佳方案可能是直到患者经Rexin-G 作为单药或联合治疗后表现出明显肿瘤缩小(且生命延长)的时候再施 用Reximmne-C，并主要依靠Reximmune-C来抑制复发。在另一方面， 需要Rexin-G与Reximmune-C的协同作用直接作用于肿瘤负荷。在此情 形中，在每个时间点对预期终点的组织学评价需采用增加的组织学和放 射成像的混合评价标准进行。
表达杀细胞和细胞因子基因的亲病灶性纳米颗粒可以不同顺序多 次施用。例如，首先施用表达杀细胞基因的亲病灶性纳米颗粒，再施用 表达细胞因子基因的亲病灶性纳米颗粒，接着再施用表达杀细胞基因的 亲病灶性纳米颗粒。该联合施用可作为交替的个别给药、交替的治疗周 期或其组合来执行。首先施用Rexin-G，接着是Reximmune-C，再后来 是Rexin-G，这被称为3-Rex方案。对于一名乳腺癌伴广泛淋巴结、肝 脏、肺和骨转移的患者，3-Rex方案完全根除了肿瘤活检组织内的所有 癌细胞。其累积剂量是，第一个Rexin-G治疗周期为6×1011cfu， Reximmune-C治疗周期为1×1010cfu，第二个Rexin-G治疗周期为4×1011 cfu。该治疗方案导致肿瘤结节全面坏死，坏死区域广泛，具有明显的宿 主单核细胞浸润，没有残留或者只有极少的肿瘤细胞。免疫细胞浸润显 示了大量补充的CD35+树突细胞、CD8+杀伤性T细胞和CD138+浆B 细胞，提供了活跃的原位免疫的证据。
使用表达杀细胞和细胞因子基因的亲病灶性纳米颗粒的联合治疗 方案，可制定灵活的治疗计划，以考虑所观察到的临床、放射学、组织 病理学、免疫组织化学和临床化学结果。例如，如果患者根据一条、数 条或所有的不同检测标准均未见客观的、有意义的肿瘤应答，而医师认 为需要更高的表达杀细胞基因的亲病灶性纳米颗粒累积剂量将肿瘤抗 原充分暴露于活化的免疫细胞，则采用更高的表达杀细胞基因的亲病灶 性纳米颗粒的累积剂量进行另一个治疗周期，但是表达细胞因子基因的 亲病灶性纳米颗粒可以维持相同的累积剂量。
用于检测在施用或不施用表达细胞因子基因的亲病灶性纳米颗粒 时，表达杀细胞基因的亲病灶性纳米颗粒的个别施用、多重施用或治疗 周期的效果的组织病理学指标包括病灶部位的明显血管生成抑制伴随 肿瘤细胞退化、大范围的坏死与反应性纤维化以及凋亡结构的TUNEL 染色阳性。治疗效果的免疫组织化学指标包括出现肿瘤浸润淋巴细胞， 例如CD4+(Th)、CD8+(Tc)、CD68+(巨噬细胞)、CD138+(浆B细胞)、CD35+ (树突状细胞)、CD20+(B细胞)和CD45+(单核细胞-巨噬细胞)细胞。鉴 定到细胞因子(如GM-CSF)转基因表达阳性细胞也是有效性的标志。
临床化学结果包括观察到可溶的、分泌的或脱落的肿瘤标志物/抗原 减少，例如前列腺特异性抗原(PSA)或HER2/neu脱落抗原的血清水平降 低。
进行组织病理学和免疫组织化学评价的样本来源包括肿瘤、淋巴结 和器官活检或针活检，以及切除的肿瘤、淋巴结或器官。
通过将自杀基因整合到质粒构建中能够更好地控制细胞因子表达， 因而通过使用口服前药如更昔洛韦等可获得临床转换，该前药可立即除 去所有细胞因子转基因分泌肿瘤细胞。为实现这个目标，近期研制了包 括单纯疱疹病毒(HSV)胸苷激酶基因的第二代Reximmune-C，被称作 Reximmune-C-TNT。用治疗性病毒颗粒如Rexin-G预治疗还可用于术前 减小肿瘤体积及存活性。这对于先前不可切除的肿瘤特别有益，能够将 其转化为可被手术切除的肿瘤，并且还可减少脱落的活癌细胞进入手术 切缘的情况发生。
对于具有癌症家族史或已知遗传异常/突变如BRACI基因突变而增 加了罹患癌症风险的患者，可采用Rexin-G、Reximmune-C或二者联用 的预防疗法来防止已知疾病的发生。实现该作用是通过破坏已开始补充 持续长大所需新血管系统的微小癌细胞簇，或者通过吸引淋巴细胞至微 小癌细胞簇而对免疫系统进行训练，或者依靠这两方面的组合。
施用逆转录病毒载体可能会引起受者体内产生载体中和抗体，从而 阻止进一步的治疗(Halbert等人(2006)Hum.Gene Ther. 17(4)：440-447)。然而本领域公知，在施用载体的时间前后进行免疫抑 制处理即可阻断中和抗体产生的诱导。该免疫抑制处理包括药物(环磷酰 胺、FK506)、细胞因子(干扰素γ、白介素12)和单克隆抗体(抗-CD4、 抗-pgp39、CTLA4-Ig)(Potter和Chang，(1999)Ann.N.Y.Acad.Sci.875： 159-174)。此外，中和抗体可在体外通过免疫吸附除去(Nilsson等人(1990) Clin.Exp.Immunol.82(3)440-444)。还可通过施用较高剂量的载体在体内 减少中和抗体。Rexin-G载体具有低免疫原性，并且至今仍未在6个月 随访期的患者血清中检测到载体中和抗体。
试剂盒
还提供了包含用于本文所述方法的组合物的试剂盒或给药系统。施 用靶向逆转录病毒颗粒所需的全部必要材料和试剂可以组合在一个试 剂盒中(例如包装细胞构建体或细胞系、细胞因子表达载体)。试剂盒 的各成分可以上述多种形式提供。一种或多种靶向逆转录病毒颗粒可与 一种或多种药剂(例如化疗药)配制为单一的药学可接受的组合物或独 立的药学可接受的组合物。
试剂盒或给药系统的成分还可以干燥或冻干形式提供。当试剂或成 分以干燥形式提供时，通常需加入适宜的溶剂进行配制，该溶剂也可装 于另一个容器中提供。本发明的试剂盒还可包括关于靶向逆转录病毒颗 粒的剂量和/或给药信息的说明书。本发明的试剂盒或给药系统通常还可 包括将小瓶装入封闭装置中供商品销售的工具，例如容纳所需小瓶的注 射或吹塑成型的塑料容器。不论容器的数量或类型如何，试剂盒还可包 括辅助注射/给药或将最终复合组合物置于受试对象身体中的装置或与 该装置一起包装。该装置可以是涂药器、吸入器、注射器、吸管、镊子、 测量匙、滴眼器或任何批准的医学递送工具。
在另一种实施方式中，提供了一种进行基因治疗商业活动的方法。 该方法包括生产靶向递送载体，和通过收集载体颗粒、将其混悬于适宜 的基质溶液中并保存混悬液而建立载体库。该方法还包括向医师或保健 提供者提供颗粒和使用颗粒的说明书，以施用于需要的受试对象(患 者)。载体的使用说明书还可包括表1列出的示例性治疗方案。该方法 任选地包括给患者或者患者的保险提供者开账单。
在另一种实施方式中，提供了一种进行基因治疗商业活动的方法， 包括向医师或保健提供者提供本文所公开的试剂盒。
以下的实施例仅用于说明目的，而不是限定本发明的范围。所例举 的具体方法可施用于其他物种。这些实施例旨在举例说明一般方法。
实施例
胰腺癌是美国癌症死亡的排第四位的原因，而且是所有癌症中致 死性最强的。完全手术切除胰腺肿瘤是该疾病的唯一有效的治疗方 法。遗憾的是，这种“治疗性”手术仅在10-15％的胰腺癌患者中是可 能的，一般是表现症状为黄疸的个体。不可切除胰腺癌患者的存活时 间中值为3-6个月。因此，晚期胰腺癌患者的控制通常涉及症状的缓 解。外线束照射看来不能延长存活期，尽管足够的肿瘤大小缩小可能 导致疼痛的缓解。外线束照射加使用氟尿嘧啶(5-FU)的化学治疗延 长了这些患者的存活时间(18)。最近证明，吉西他滨，一种脱氧胞苷 酸类似物，可改善晚期胰腺癌患者的生活质量，尽管存活期只延长了 8-10周。
手术切除也是对结肠直肠癌患者的主要的治疗手段，结肠直肠癌 是美国居第二位的癌症死亡原因。附加的化学治疗和放射治疗有助于 减少早期疾病患者的结肠直肠癌复发(7)。然而，这些治疗对于局部 晚期肿瘤的效果不太令人满意(8)。当前，通过手术切除治疗的结肠 直肠癌患者的5年存活率如下：I期约为90％，II期约为70％，II期 约为50％，IV期低于5％。尽管化学治疗对于结肠癌仍然是一种有用 的治疗选择，甚至扩展到病变降期(down-staging)，但是大多数结肠 癌患者在18个月内从标准治疗中获得的益处已经消失。而且，似乎 一流的临床肿瘤学家一致认为靶向“生物治疗”在胰腺癌和结肠癌未 来临床发展方面具有远大的前景。
实施例1：构建体
质粒pBv1/CAEP含有4070A双嗜性包膜蛋白的编码序列 (GenBank登录号M33469)，它已经通过修饰引入了胶原结合功能(Hall 等人.，Human Gene Therapy，8：2183-2192，1997)。亲代表达质粒pCAE (Morgan等人.，Journal of Virology，67：4712-4721，1967)由USC Gene Therapy Laboratories提供。该pCAE质粒通过靠近成熟蛋白质的N末 端在编码序列的氨基酸6和7之间插入Pst I位点(gct gca gga，编码氨 基酸AAG)而修饰(pCAEP)。将合成寡核苷酸双链体(gga cat gta gga tgg aga gaa cca tca ttc atg gct ctg tca gct gca，编码氨基酸 GHVGWREPSFMALSAA，最小胶原结合十肽(粗体)，来源于牛冯维 勒布兰德因子的D2结构域(Hall等人.，Human Gene Therapy， 11：983-993，2000)，侧翼为关键连接体(以下划线标出))克隆到该独特 Pst I位点内，产生pBv1/CAEP。
嵌合包膜蛋白在293T生产细胞中的表达由强CMV(即启动子) 驱动。嵌合包膜正确加工，并且稳定导入逆转录病毒颗粒内，该逆转 录病毒颗粒显示功能增加表型，而感染滴度没有明显损失。胶原结合 结构域的正确方向通过DNA序列分析进行验证，质粒质量控制通过 Pst I限制酶消化进行验证，Pst I将质粒线性化，并且释放胶原结合结 构域。
进一步改善原质粒pBv1/CAEP，以减少在Rexin-GTM生产过程中 产生有复制能力的逆转录病毒(RCR)的潜力。载体pBv1/CAEP在莫洛 尼(Moloney)包膜ATG起始密码子上游含有38个碱基对的非翻译 序列。该载体在莫洛尼包膜终止密码子下游也含有76个碱基对的非 翻译序列。利用聚合酶链反应技术除去这两个非翻译序列(38+76＝ 114碱基对)，仅扩增从ATG起始密码子到TGA终止密码子的莫洛尼 包膜开放阅读框序列。使用以下引物组：
NewEnvF1
5′ATGCGGCCGCCCACCATGGCGCGTTCAACGCTCTCAAAACCCC CTCAAGATA 3′
NewEnvR1
5′CCTCTAGATTATCATGGCTC GTACTCTATGGGTTTTAGCTGG 3′
用pBv1/CAEP作为PCR反应的模板，以确保将独特的冯维勒布 兰德胶原结合位点(GHVGWREPSFMALSAA)正确拷贝到仅有新的开 放阅读框的包膜PCR产物内。产生正确的2037个碱基对的PCR产物， 使其连接到pCR2克隆载体内，测序，确保与预期序列具有100％的 序列一致性。从pCR2质粒骨架上切下这一正确测序的仅有莫洛尼包 膜开放阅读框的基因，将其亚克隆到来自Genelantis(以前称为Gene Therapy Systems)的超高表达质粒pHCMV中，产生新的质粒pB-RVE。
该质粒在大量不同的滴度测定中进行检测，发现它的强度增加， 使得现在在转染293T细胞时最好使用少3-5倍的量，与pCgpn和 pE-REX达到类似的滴度。这暗示pB-RVE质粒比相应的pBV1/CAEP 质粒在生产功能性包膜蛋白方面强3-5倍。然而，如果使用相同量的 pB-RVE质粒作为正常量的pBv1/CAEP，将产生低的多的滴度。该结 果强调了进行一整套质粒比例研究对于获得产生最高滴度的最佳比 例的重要性。在某些情况下，三种质粒成分基因中任一个的过量表达 可以在装配和加工过程中破坏病毒部分的精细平衡，并且可以导致如 在较低滴度时发现的抑制效果。我们选用比pBV1/CAEP少3-5倍的 pB-RVE获得类似高的滴度，并利用该质粒获得了使用相当低的量进 行GMP逆转录病毒生产的优点。这种高水平表达的效果最可能是由 于包膜基因从与CMV内含子串联的CMV启动子增强子表达。这种 组合比从CMV启动子表达(如pBV1/CAEP质粒)强3-5倍。
质粒pCgpn含有MoMuLV gag-pol编码序列(GenBank登录号 331934)，该序列最初来源于原病毒克隆3PO，为pGag-pol-gpt， (Markowitz等人.，Journal of Virology，62：1120-1124，1988)，显示Ψ包装 信号的134个碱基对的缺失和env编码序列的截短。该构建体作为 pCgp中的EcoRI片段提供，其中5′EcoRI位点对应于位于Gag上游 的XmaIII位点，3′EcoRI位点添加到env中ScaI位点的附近。从pCgp 上切下EcoRI片段，连接到pcDNA3.1+表达载体(Invitrogen)的独特 EcoRI克隆位点内。
通过用SalI进行限制酶消化来证实正确的方向，并且通过用 EcoRI和HindIII进行消化进一步表征插入片段。分别利用T7启动子 结合位点引物(S1)和pcDNA3.1/BGH反向引物位点(AS1)，通过DNA 序列分析证实gag-pol插入片段的5′和3′序列。获得的质粒命名为 pCgpn，它编码由强CMV启动子驱动的gag-pol多蛋白质和由SV40 早期启动子驱动的新霉素抗性基因。该质粒中SV40ori的存在使得在 表达SV40大T抗原的细胞系(即293T生产细胞)中能够进行游离 型复制。
下面描述了携带pdnG1/C-REX逆转录病毒表达载体的质粒的构 建，其含有显性阴性细胞周期G1构建体(dnG1)。通过瞬时转染方案， 该质粒在生产高感染滴度载体方面增强。通过PCR，由全长细胞周期 蛋白G1模板产生编码人细胞周期蛋白G1的氨基酸41-249的cDNA 序列(472-1098+终止密码子)(CYCG1，Wu等人，Oncology Reports， 1：705-11，1994；登录号U47413)，引入Not I/Sal I突出端。开始时将 N末端缺失突变体构建体克隆到TA克隆载体(Invitrogen)内，然后进 行Not I/Sal I消化，并将纯化的插入片段连接到Not I/SalI消化的 pG1XSvNa逆转录病毒表达载体(Genetic Therapy，Inc.)内，产生具有 5′和3′长末端重复(LTR)序列和Ψ逆转录病毒包装序列的pdnG1SvNa 载体。
CMV，即启动子-增强子，通过PCR由CMV驱动的pIRES模板 (Clontech)制备，引入Sac II突出端，并且克隆到位于5′LTR上游的 pdnG1SvNa的独特Sac II位点内。有利于测定载体滴度的新霉素抗性 基因由具有嵌套ori的Sv40 e.p.驱动。除了Sv40 ori以外还包含强 CMV启动子促进了在表达大T抗原的293T细胞中产生高滴度逆转录 病毒载体(Soneoka等人.，Nucleic Acid Research，23：628-633，1995)。 CMV启动子的正确的方向和序列通过限制性消化和DNA序列分析加 以验证，dnG1编码序列也是如此。质粒身份和质量控制通过用Sac II (其释放750bp CMV启动子)和Bgl II(其在dnG1构建体内的独特位 点进行切割)进行消化来验证。
已经证明使用pdnG1/C-REX和pBv1-CAEP进行多GMP逆转录 病毒生产是安全的并且不含RCR。第4代和第5代基于MLV的逆转 录病毒载体和载体生产方法，即断裂(split)基因组设计，在标准GMP 条件下已经产生了一致的生产质量，而不产生RCR(Sheridan等人.， 2000；Merten，2004)。然而，我们以及其他人已经看出所有可以获得的 载体构建体含有显著量的残余gag-pol序列，该序列可能与相应 gag-pol质粒构建体中所含的5′DNA序列重叠(Yu等人.，2000)；当载 体生产最终放大到使用较大细胞数和相应质粒浓度的商业规模时，这 些显著的重叠区域可能成为问题。
考虑到这些，我们选择通过限制性消化和PCR克隆从亲本 pdnG1/C-REX载体中除去487个碱基对的残余gag-pol序列 (pdnG1/C-ΔREX)，接着插入合成的97bp包膜剪接受体位点(ESA) (Lazo等人.，(1987)J.Virol.61(6)：2038-41)，该位点用来抵消包装(滴 度)和基因表达(效能)方面的损害(图22)。pdnG1/C-REX的这些 产生的安全性改变导致产生pdnG1/UBER-REX，它编码并且表达完全 相同的转基因(dnG1和neo)，不含487个碱基对的GAG，现在代替以 前的质粒产生Rexin-G。图23显示了C-REX和C-REXII质粒和 UBER-REX质粒之间的示意性比较。
在高度控制和优化的生产条件下pB-RVE、pCgpn、pdnG1/UBER 质粒以确定比例的组合产生了不含RCR的临床载体产物，报告的最 高非浓缩GMP终产物逆转录病毒滴度＞5×109Cfu/mL。
实施例2：REXIN-G
终产物Mx-dnG1(REXIN-GTM)是基质(胶原)靶向的逆转录病 毒载体，其编码N末端缺失突变人细胞周期蛋白G1构建体，在杂合 LTR/CMV启动子的控制之下。该载体也含有由SV40早期启动子驱 动的新霉素抗性基因。
Mx-dnG1载体通过用3种质粒瞬时共转染从完全验证的原始细 胞库中获得的293T(用SV40大T抗原转化的人胚肾293细胞)细胞而 获得。
转染系统的成分包括pdnG1/C-REX治疗性质粒构建体，其含有 由CMV立即早期启动子驱动的编码氨基酸41-249的人细胞周期蛋白 G1基因的缺失突变体、包装序列和在内部SV40早期启动子控制下驱 动的细菌新霉素抗性基因。开始时将截短的细胞周期G1基因克隆到 TA克隆载体(Invitrogen)内，接着进行Not I/Sal I消化，将纯化的插入 片段连接到Not I/SalI消化的pG1XSvNa逆转录病毒表达载体 (Genetic Therapy，Inc.，Gaithersburg，MD提供)中，产生包含5′和3′LTR 序列和Ψ序列的pdnG1SvNa载体。CMV，即启动子-增强子，通过PCR 由CMV驱动的pIRES模板(Clontech)制备，引入Sac II突出端，并且 克隆到位于5′LTR上游的pdnG1SvNa的独特SacII位点内。
用pdnG1/UBER-REX代替质粒pdnG1/C-REX，它是下一代质粒， 编码并且表达完全相同的转基因(dnG1和neo)，而不含在原 pdnG1/C-REX中发现的487个碱基对的GAG。
该系统进一步包括Mx(Bv1/pCAEP)包膜质粒，该质粒含有CMV 驱动的修饰的双嗜性4070A包膜蛋白，其中胶原结合肽插入位于 4070A包膜N末端区氨基酸6和7之间的工程化的Pst I位点中。
用pB-RVE代替Mx(Bv1/pCAEP)包膜质粒，pB-RVE是一种改善 的质粒，其中取消了可能与天然非翻译(UTR)序列重叠的114bp的外 来逆转录病毒序列。
该系统还包括pCgpn质粒，该质粒含有由CMV立即早期启动子 驱动的MLV gag-pol元件。它作为pGag-pol-gpt来源于克隆3PO。载 体骨架是来自Invitrogen的pcDNA3.1+。来自牛生长激素的聚腺苷酸 化信号和转录终止序列提高了RNA稳定性。SV40 ori与e.p.一起，用 于在表达SV40靶T抗原的细胞系中进行游离型复制和载体拯救。
通过限制性内切核酸酶消化分析了这些质粒，细胞培养基由添加 了每升4克葡萄糖、每升3克碳酸氢钠、10％γ射线照射的胎牛血清 (Biowhittaker)的DMEM培养基组成。血清从USA来源获得，经检测 不含牛病毒，符合USDA的规定。用丁酸钠诱导增强逆转录病毒颗粒 的芽殖。使上清液通过0.45微米滤器，或者利用切向流/渗滤法浓缩， 处理得到的病毒颗粒。病毒颗粒从外观上看是C型逆转录病毒。收获 逆转录病毒颗粒，悬浮在95％DMEM培养基和1.2％人血清白蛋白的 溶液中。该制剂以150ml等份贮存在500ml冷冻袋中，冻存于-70 至-86℃直到使用。
对于使用改良的pB-RVE和pdnG1/UBER-REX质粒产生的 Rexin-GTM，治疗性纳米颗粒的生产、悬浮和收集在培养基最终配方 中不含牛血清的情况下进行，该培养基在无菌闭环系统中通过连续的 澄清、过滤和最终装入冷冻袋中来处理。得到的C型逆转录病毒颗粒， 平均直径为100纳米，缺乏所有病毒基因，并且是完全复制缺陷的。 临床用批次的滴度范围为3×107至5×109集落形成单位(U)/ml，验 证每一批的必需纯度和生物学效能。
给患者施用的Mx-dnG1载体的准备包括在37℃80％乙醇浴中在 载体袋中融化该载体。每个载体袋在给患者输注前1小时融化，用阿 法链道酶(10U/ml)处理，在1-3小时内立即输注。
用改良的pB-RVE和pdnG1/UBER-REX质粒产生的经处理的临 床级Rexin-GTM密封在冷冻袋中，在运输前贮存在-70±10℃冰箱中。 每批经验证和发出的含有Rexin-GTM载体的冷冻袋在干冰上运输至临 床地点，在该地点载体保存在-70±10℃冰箱中直到使用。在静脉内 输注前15分钟，将载体在32-37℃水浴中快速融化，立即输注，或 者在专用盘或冷却器中在冰上运输到患者房间或临床地点立即使用。 患者经周围静脉、中心IV线或肝动脉接受Rexin-GTM输注。使用各种 给药方案，如临床研究A、B和C所述(下文)；然而，8ml/kg/剂的 最大体积每天给予一次。每袋Rexin-GTM以4ml/min的速度在10-30 分钟内输注。
实施例3：Mx-dnG1载体的治疗有效性
检验了Mx-dnG1在体外抑制癌细胞增殖、在肝转移裸鼠模型体 内阻止肿瘤生长的有效性。选择胰腺来源的未分化的人癌细胞系作为 转移性癌的原型。逆转录病毒在这些癌细胞中的转导效率是极佳的， 范围为26％至85％，取决于感染复数(分别为4和250)。为了筛选治 疗性基因，在使用携带各种细胞周期蛋白G1构建体的载体转导的细 胞中进行细胞增殖研究。在标准条件下，Mx-dnG1载体一致性地表现 出最大的抗增殖效果，伴随着在20kDa区域处出现免疫反应性细胞 周期G1，代表dnG1蛋白。基于这些结果，选择Mx-dnG1载体进行 随后的体内有效性研究。
为了评价Mx-dnG1在体内的表现，通过保持14天的留置导管将 7×105人胰腺癌细胞输入门静脉内建立了肝转移裸鼠模型。在三天后 开始载体输注，包括200ml/天的Mx-dnG1(REXIN-GTM；滴度：9.5× 108cfu/ml)或PBS盐水对照，总共9天。载体输注结束1天后处死小 鼠。
对来自用PBS或低剂量Mx-dnG1治疗的小鼠的转移性肿瘤灶进 行了组织学和免疫细胞化学评价，并用Optimas成像系统进行了评价。 人细胞周期蛋白G1蛋白在转移性肿瘤灶中高度表达，证据是在PBS 治疗的动物中以及在Mx-dnG1载体治疗的动物的剩余肿瘤灶中周期 蛋白G1的核免疫反应性(棕色染色物质)提高。对来自对照动物的 肝切片的组织学检查显示了具有血管生成和基质形成区域的肿瘤灶； 上皮成分为细胞角蛋白染色阳性，相关的肿瘤基质细胞/内皮细胞为波 形蛋白和FLK受体染色阳性。相比之下，低剂量Mx-dnG1治疗的动 物中肿瘤灶的平均大小显著低于PBS对照(p＝0.001)，同时显示凋亡 细胞核密度比PBS对照组局灶性增加。此外，在Mx-dnG1治疗的动 物的残留肿瘤灶中观察到PAS+，CD68+和带有含铁血黄素的巨噬细 胞的浸润，提示退化的肿瘤细胞和肿瘤碎片被肝脏网状内皮系统主动 清除。总之，这些发现证明了带有杀细胞细胞周期控制基因的靶向可 注射逆转录病毒载体的体内抗肿瘤效果，并且代表了用于转移癌的靶 向可注射载体的发展中的重要进展。
在裸鼠的皮下人胰腺癌模型中，我们证明了与非靶向的 CAE-dnG1载体(p＝0.014)、带有标记基因的对照基质靶向载体 (Mx-nBg；p＝.004)和PBS对照(p＝.001)相比，静脉内(IV)输注 Mx-dnG1增强了基因递送，并且阻止了皮下肿瘤的生长。增强的肿瘤 结节的载体渗透和转导(35.7+S.D.1.4％)与疗效有关，而没有相关的 全身毒性。也在用PBS安慰剂、非靶向CAE-dnG1载体和Mx-dnG1 载体处理的小鼠中进行了Kaplan-Meier生存研究。使用Tarone对数 秩检验，用于同时比较所有三个组的总p值为0.003，趋势显著性水 平为0.004，表明使用靶向Mx-dnG1载体长期控制肿瘤生长的可能性 显著大于使用非靶向CAE-dnG1载体或PBS安慰剂。总之，本研究 证实通过外周静脉注射使用的Mx-dnG1(i)在一小时内在生成血管的 肿瘤血管系统中积累，(ii)高效率地转导肿瘤细胞，和(iii)增强治疗 性基因递送和长期有效性，而不引发可检测到的毒性。
实施例4：药理学/毒理学研究
已经证实整合了靶向胞外基质成分(例如胶原)的肽的基质靶向 可注射逆转录病毒载体增强了体内治疗性基因的递送。使用两个小鼠 癌症模型和两个携带杀细胞/细胞生长抑制显性阴性细胞周期G1构建 体的基质靶向的基于MLV的逆转录病毒载体(命名为Mx-dnG1和 MxV-dnG1)，获得了另外的数据。Mx-dnG1和MxV-dnG1都是基于 4070A MLV的双嗜性逆转录病毒载体，显示基质(胶原)靶向的基序， 用于靶向至病变区域。这两种载体的唯一区别是MxV-dnG1是假型， 具有水疱性口炎病毒G蛋白。
在皮下人癌异种移植模型中，将1×107人MiaPaca2胰腺癌细胞 (转移性胃肠癌的原型)皮下植入裸鼠的侧腹部。6天后，每天向尾 静脉内直接注射200μl Mx-dnG 1载体，持续一个或两个10天的治疗 周期(总载体剂量分别为：5.6×107[n＝6]或1.6×108cfu[n＝4])。在 肝转移裸鼠模型中，经由保持10-14天的留置导管通过门静脉注射7× 105 MiaPaca2细胞。从输入肿瘤细胞三天后开始，每天在10分钟内 输注200ml MxV-dnG1载体，持续6天或9天(总载体剂量分别为： 4.8×106[n＝3]或1.1×109cfu剂量[n＝4])。对于生物分布研究，开发 了基于TaqManTM的试验来检测在小鼠基因组DNA背景中含有 SV40和新霉素(Neo)基因序列的基于G1XSvNa的载体(Althea Technologies，San Diego，CA，USA)。该试验检测95个核苷酸的扩增 子(G1XSvNa质粒载体的核苷酸1779-1874)，其中荧光标记的探针 与SV40基因的3′部分和新霉素磷酸转移酶抗性(Neor)基因的5′部分 重叠。
对于Mx-dnG1或MxV-dnG1载体，没有观察到与载体相关的死 亡率或发病率。在用低剂量和高剂量载体治疗的动物的肝脏、肺和脾 脏中检测到低水平阳性信号。在用载体治疗的动物的睾丸、脑或心脏 中没有检测到PCR信号。在两只具有留置导管而没有抗生素预防的 动物中，组织病理学检查显示门静脉静脉炎、肾盂肾炎伴有局灶性心 肌炎。在Mx-dnG1-或MxV-dnG1治疗的小鼠的非靶器官中没有注意 到其他病理学状况。血清化学谱显示Mx-dnG1治疗的动物比PBS对 照的ALT和AST温和升高。然而，其水平仍然处于小鼠的正常限度 内。在7周随访期，在载体治疗的动物的血清中没有检测到载体中和 抗体。
上述临床前发现证实了在两个人胰腺癌裸鼠模型中静脉内输注 Mx-dnG 1显示没有可检测到的相邻正常组织的损伤，也没有全身副作 用。通过静脉内输注的靶向基因递送方法具有几个临床相关的优点。 向静脉系统内输注允许治疗肿瘤以及潜伏的肿瘤灶。一般认为在分裂 的肿瘤细胞中观察到的较高的有丝分裂速度将导致较高的肿瘤转导 效率，而节约肝细胞和其他正常组织。因此，我们提出使用静脉内施 用Mx-dnG1载体治疗局部晚期或转移性胰腺癌和其他标准化疗难治 性实体瘤的人临床研究方案。
实施例5：临床研究
本研究的目标是：(1)确定连续静脉内输注Rexin-G的剂量限制 性毒性和最大耐受剂量(安全性)，和(2)评价潜在的抗肿瘤应答。该 方案是为估计存活期至少为3个月的末期癌症患者而设计的。邀请肿 瘤科医生认为难以用标准化疗治疗的三名IV期胰腺癌患者参加由菲 律宾食品药物管理局批准的使用Rexin-G的同情使用方案，。通过每天 静脉内输注Rexin-G，持续8-10天，给予患者内剂量递增方案。该方 案结束后，为一周的剂量限制性毒性评价期；之后，施用最大耐受剂 量的Rexin-G，再持续8-10天。如果患者在观察期内没有发生与 Rexin-G有关的3或4级不良事件，则如表1(见上)所示增加Rexin-G 的剂量。
用测径器或通过放射成像技术(MRI或CT扫描)测量，按照公式 宽度2×长度×0.52连续确定肿瘤体积，以此评价肿瘤应答。
1号患者是一名47岁的菲律宾女性，通过活检肿瘤组织的组织学 检查和分期研究诊断为在胰头具有局限性腺癌。她接受了Whipples 外科手术，包括完全切除了原发肿瘤。然后每周使用单药吉西他滨， 共7次剂量，但是由于难以承受的毒性而中断了化疗。几个月后，后 续MRI显示原发肿瘤复发，转移扩散到锁骨上和腹部淋巴结。按照 临床方案，该名患者在28天内接受了两次治疗周期为10天的 Rexin-G，累积剂量为2.1×1011单位，中间休息期为1周。在没有全 身毒性的情况下，该患者接受了另外10天的治疗周期，总累积剂量 为3×1011单位。
使用测径器手工测量两个浅表锁骨上淋巴结的尺寸。观察到锁骨 上淋巴结的肿瘤体积进行性缩小，到第28天第2治疗周期结束时肿 瘤尺寸分别缩小了33％和62％(表2)。
表2：1号患者的锁骨上淋巴结的测径器测量值
日期 测径器测量值 cm 肿瘤体积* cm3 从Rexin-G Rx开始 尺寸缩小的百分比 第1天 LN1 1.9×2.1 LN2 1.5×1.8 3.9 2.1 第26天 LN1 1.8×1.8 LN2 1.3×1.3 3.0 1.1 23 48 第27天 LN1 1.7×1.7 LN2 1.15×1.15 2.6 0.8 33 62
后续腹部MRI显示：(i)没有新的肿瘤转移区，(ii)可以辨别的 中心性坏死区，涉及40-50％的原发肿瘤，和(iii)主动脉旁腹部淋巴 结的大小显著缩小(图1A-B)。在第54天，后续MRI显示原发肿瘤 的大小没有间隔改变。与这些发现一致，观察到CA19-9血清水平进 行性降低(从峰值1200U/ml降至低值584U/ml)，在第54天CA19-9 水平达到50％的降低(图1C)。然而，第101天的后续CT扫描显示 原发肿瘤和锁骨上淋巴结的大小明显增大。患者拒绝进一步化疗，直 到第175天，该患者同意每周接受吉西他滨1000mg/m2。根据RECIST 标准，1号患者在第189天存活，疾病进展，距开始Rexin-G输注6.75 个月，距肿瘤复发11个月，距最初诊断时20个月。
2号患者是一名56岁的菲律宾女性，根据胆道清洗液的细胞学检 查，她被诊断为IVA期局部晚期和不可手术切除的胰头癌。剖腹探查 术显示肿瘤环绕在门静脉周围，密切靠近地侵入肠系膜上动脉和静 脉。她曾经接受了外线束放射治疗以及5-氟尿嘧啶，并进一步接受了 单药吉西他滨，每周一次，共8次，然后每月维持剂量。然而，观察 到CA19-9血清水平进行性升高，后续CT扫描显示肿瘤大小增大(图 2A)。患者接受两个治疗周期的Rexin-G，每天静脉内输注，总累积 剂量为1.8×1011单位。结果：连续腹部CT扫描显示肿瘤体积明显缩 小，从开始Rexin-G输注时的6.0cm3降至治疗结束时的3.2cm3，在 第28天肿瘤大小缩小47％(图2A-C)。在第103天的后续CT扫描显 示肿瘤大小没有间隔改变，之后患者保持每月吉西他滨给药。根据 RECIST标准，2号患者在第154天随访时存活，无症状，疾病稳定， 距开始Rexin-G输注5.5个月，最初诊断后14个月。
3号患者是一名47岁的中国糖尿病男性，诊断为患有IVB期胰 体和胰尾腺癌，肝脏和肝门淋巴结广泛转移，通过CT引导的肝活检 得到证实。基于IVB期胰腺腺癌的快速致命性后果，邀请该患者参与 第二临床方案，使用前线Rexin-G，然后每周吉西他滨给药。施用致 敏剂量的Rexin-G，以使肿瘤对吉西他滨化疗敏感，以具有更好的杀 细胞效果。该患者每天接受静脉内输注剂量为4.5×109单位/剂的 Rexin-G，共6天，总累积剂量为2.7×1010单位，然后8次每周吉西 他滨给药(1000mg/m2)。第62天，后续腹部CT扫描显示原发肿瘤的 大小从7.0×4.2cm(肿瘤体积：64.2cm3)基线测量值缩小到6.0×3.8 cm(肿瘤体积：45cm3)(图3A)。进一步地，在第62天，肝结节数也 从18个结节(基线)显著减少为5个结节(图3C)，最大的肝脏结 节从基线2.2×2cm(肿瘤体积：4.6cm3)消退至1×1cm(肿瘤体积： 0.52cm3)(图3B)。根据RECIST标准，3号患者在第133天仍然存活， 疾病稳定，距开始Rexin-G输注4.7个月，距诊断时约5个月。
表3显示3名患者中总肿瘤反应的对比评价。使用RECIST标准， Rexin-G在全部3名患者中都导致肿瘤生长稳定。
表3：根据RECIST对总肿瘤反应的评价
患者编号 1 2 3 疾病分期 复发IVB IVA IVB 以前的Rx Whipples手术 外线束放射治疗 吉西他滨 外线束放射治疗 5-氟尿嘧啶 吉西他滨 无 治疗前的 Karnofsky评分 0 0 0
治疗与剂量 Rexin-G IV (3.0×1011U) Rexin-G IV (1.8×1011U) Rexin-G IV (2.7×1010U) 吉西他滨IV [1000mg/m2×8] 反应 肿瘤生长稳定 肿瘤生长稳定 肿瘤生长稳定 反应持续时间 3.4个月 ＞5.5个月 ＞4.7个月 存活状态 存活，疾病进展， 距诊断20个月 存活，疾病稳定， 距诊断14个月 存活，疾病稳定， 距诊断5个月
在本研究中，使用两种方法评价肿瘤对静脉内输注Rexin-G的应 答。使用测量大于2cm的目标病变最长直径总和的NCI-RECIST标 准，以及作为对比点的所有非目标病变的消失及持续存在，3名用 Rexin-G治疗的患者全部(100％)肿瘤生长稳定超过100天(3个月)(表 3)。通过肿瘤体积测定(公式：宽度2×长度×0.52)(16)对应答的评 价显示，在全部3名(100％)患者中Rexin-G均诱导肿瘤消退，即，1 号患者的转移性淋巴结病有33-62％的消退(表2)，2号患者的原发 肿瘤有47％的消退(图2C)，3号患者的原发肿瘤有30％的消退，72％ (13/18)的转移性肝病灶消除，转移性肝门结节89％消退，这通过影像 学研究(MRI或CT扫描)和测径器测量得到证明(图3)。进一步地， 安全性评价显示直到累积载体剂量为3×1011单位时没有发生剂量限 制性毒素，表明可以给予更多的载体，以达到更大的治疗效果。 Rexin-G载体输注与恶心或呕吐、腹泻、神经病、脱发、血液动力学 不稳定、骨髓抑制、肝或肾损伤无关。
实施例6：临床试验A，I/II期，Rexin-GTM，局部晚期或转移性 胰腺癌
临床研究A包括I/II期或单用方案，用于研究静脉内输注 Rexin-GTM对于局部晚期或转移性胰腺癌的效果，由菲律宾食品药品管 理局(BFAD)或美国食品药品管理局(FDA)和机构审查委员会或医院伦 理委员会(Institutional Review Board or Hospital Ethics Committee)批 准(Gordon等人.(2004)Int′l.J.Oncol.24：177-185)。本研究的目标是： (1)确定每日静脉内输注Rexin-GTM的安全性/毒性，和(2)评价静脉内 输注较高剂量水平的Rexin-GTM的潜在抗肿瘤反应。该方案是为估计 存活期至少为3个月的患者而设计的。在获得知情同意后，6名不可 手术切除的局部晚期或转移性胰腺癌患者通过重复输注Rexin-GTM进 行治疗。6名患者中有5名的标准化疗失败；这些患者在菲律宾马尼 拉和/或美国纽约Brooklyn完成如下的患者内剂量递增方案：第1-2 天：3.8×109单位；第3-4天：7.5×109单位；第5-6天：1.1×1010 单位；第7-10天：1.5×1010单位；休息一周；第18-27天：1.5×1010 单位。两名患者接受另外一个治疗周期，一名患者接受另外7个治疗 周期。患有不可手术切除的IV期胰腺癌的第六名患者接受联合治疗 作为一线治疗，包括6天的静脉内Rexin-GTM(3.8×109单位/天)，然 后是每周一次吉西他滨(1000mg/m2)，共8周。对于临床研究A， Rexin-GTM制剂的效能为3×107单位/ml。
不良事件按照NIH普通毒性标准(CTCAE版本2或3)(Common Toxicity Criteria Version 2.0.Cancer Therapy Evaluation Program. DCTD，NCI，NIH，DHHS，March，1998.)分级。为了评价Rexin-GTM的 临床有效性，我们考虑药物的总体杀细胞活性和抗血管生成活性 (Gordon等人.(2000)Cancer Res.60：3343-3347，Gordon等人.(2001) Hum.Gene Ther.12：193-204)，以及亲病灶性纳米颗粒向转移病变中 的动态摄取(Gordon等人.(2001)Hum.Gene Ther.12：193-204)，这将 影响治疗过程中靶向纳米颗粒的生物分布或生物利用性。由于载体更 容易在某些癌性病变内积累-这取决于肿瘤侵占和血管生成的程度， 预期不会均匀分布到其余的肿瘤结节，特别是在具有高肿瘤负荷的患 者中。这将可预测地诱导混合肿瘤反应，其中部分肿瘤的大小可能缩 小，而其他肿瘤结节可能变得更大，和/或新病变可能出现。之后，随 着总肿瘤负荷的正常化或下降，亲病灶性监视功能将略微更均匀地分 布循环纳米颗粒。另外，被治疗的病变在开始时由于坏死性肿瘤诱导 的炎症反应或囊性变而可能变得尺寸较大。因此，在对Rexin-GTM治 疗的客观肿瘤反应的评价中，除了实体瘤标准反应评价标准(RECIST； Therasse等人.(2000)J.Nat′l.Cancer Inst.92：205-216)以外，还使用另 外两个标准，即：(1)用于估计肿瘤体积的O′Reilly公式：L×W2×0.52 (O′Reilly等人.(1997)Cell 88：277-285)，和(2)在治疗期间肿瘤坏死或 囊性变的诱导。因此，目标病变肿瘤体积缩小30％或更多或者诱导肿 瘤内的坏死或囊性变被认为是部分反应(PR)或阳性治疗效果。利用单 侧精确检验(one-sided exact test)确定用Rexin-GTM治疗的患者的PR 和历史对照之间差异的显著性，预期为5％PR。
这一最初的I/II期研究检查了患者内剂量递增方案的安全性和潜 在有效性。如表4所示，在6名用Rexin-GTM治疗的患者中有5名表 现不同程度的部分反应(PR)，而在其余患者中观察到疾病稳定。根据 RECIST或者通过肿瘤体积测量，6名患者中有3名(50％)的肿瘤尺寸 缩小30％或更多，通过活检和/或后续MRI/CAT扫描，发现6名患者 中有2名(33％)的原发肿瘤或转移结节出现坏死。利用肝活检对一名 特殊患者(A3)进一步分析，CT扫描可见该患者的8个肿瘤结节中有6 个消失，这表明肿瘤结节内的凋亡、坏死和纤维化的发生率提高，这 与临床前研究中的发现(18，19)类似，并且在肝活检物的残余肝脏肿瘤 中观察到大量肿瘤浸润淋巴细胞(图20-22)。浸润剩余肝脏肿瘤的免 疫反应性T和B淋巴细胞的存在(图22)表明Rexin-GTM不抑制局部 免疫应答。6名患者中有4名(67％)的无进展存活期长于3个月。耐受 化疗的患者在Rexin-GTM治疗后的存活期中值为10个月，诊断后的存 活期中值为25个月。相比之下报道的接受吉西他滨或5-FU(标准治 疗)作为一线药物的胰腺癌患者的存活期中值分别为诊断后5.65和 4.41个月(Burris等人.(1997)J.Clin.Oncol.15：2403-2413)。利用单侧 精确检验，与历史对照的PR率相比，Rexin-GTM-治疗的患者中部分 反应的显著性水平＜0.025。这些最初的发现，尽管只在较少的患者中 得到证实，但是足以表明Rexin-GTM在临床上是有效的，甚至在适中 的剂量时，显然优于没有药物治疗，并且在作为单药治疗晚期或转移 胰腺癌患者时，可能优于吉西他滨。
表4：临床研究A参与者的客观肿瘤反应、无进展存活期和总存活期
患者编号， 年龄 客观肿瘤反应 无进展存 活期 Rexin-G治 疗后的状态 /存活期 距Dx的 总存活期 A1 46岁 部分反应：原发肿瘤坏 死，肿瘤尺寸缩小24％； 锁骨上淋巴结尺寸缩小 33-62％；疼痛症状缓解 3.5个月 死亡 10个月 23个月 A2 55岁 部分反应(RECIST)：原发 肿瘤体积减少47％，然后 肿瘤完全消失 疼痛症状缓解 9个月 死亡 13个月 25个月 A3 45岁 部分反应(RECIST)：原发 肿瘤体积减少47％；8个 肝脏结节中有6个消失； 活检肝脏中的肝结节凋 亡和坏死 疼痛症状缓解 4个月 死亡 9个月 19个月 A4 64岁 部分反应/疾病稳定：11 个肝结节中有5个消失； 原发肿瘤稳定 2个月 死亡 8个月 48个月 A5 53岁 疾病稳定：原发肿瘤没有 变化；3个肝脏结节中有 一个消失 2个月 死亡 10个月 30个月 A6 46岁 部分反应(RECIST)：原 发肿瘤体积减少30％；18 个肝结节中有13个消失 5个月 死亡 7个月 7个月
全部6名患者良好地耐受Rexin-GTM输注，没有相关的恶心和呕 吐、腹泻、粘膜炎、脱发或神经病。6名患者中有3名(50％)的疼痛症 状缓解。没有与研究药物相关的血液动力学功能的显著改变、骨髓抑 制、肝脏、肾脏或任何器官的功能障碍。明确与研究药物有关的唯一 的不良事件是在6名患者的2名中出现全身皮疹和荨麻疹(1-2级)， 可能相关的不良事件是在6名患者的2名中出现间歇热(I级)。在该 研究中观察到有限数量的治疗引起的不良事件，提示以递增剂量静脉 内施用的Rexin-GTM是相对安全的治疗。
实施例7：在各种晚期或转移性实体瘤中的临床研究B，I/II期 Rexin-GTM
临床研究B代表临床研究A的扩展。基于最初使用Rexin-GTM获 得的临床经验的令人鼓舞的结果，扩展了I/II期研究，以进一步确定 较高剂量Rexin-GTM的安全性和潜在有效性，以将临床适应症扩大到 所有难以用标准化疗治疗的晚期或转移性实体瘤，并且调整治疗日程 和方案以允许门诊治疗。该研究的目的是：(1)确定每日静脉内输注 Rexin-GTM的安全性/毒性，和(2)评价静脉内输注较高剂量水平的 Rexin-GTM的潜在抗肿瘤反应。该方案是为估计存活期至少为3个月 的患者而设计的。在获得知情同意后，10名患有起源于外胚层(黑素 瘤，1；喉鳞状细胞癌，1)、中胚层(平滑肌肉瘤，1)或内胚层(胰 腺癌，2；乳腺癌，2；子宫癌，1；结肠癌，2)的转移癌的患者，和 一名以前未接受治疗并且拒绝进行化疗的新诊断的转移性胰腺癌患 者(患者总数为11)，按照以下治疗方案静脉内接受剂量为每天3.0× 1010的作为单一药物的Rexin-GTM：第1-5、8-12、15-19和22-26天； 周一到周五，周末为休息期。改良的GMP生产和生物加工方案允许 生产实质更高滴度的Rexin-GTM，因此用于临床研究B的制品显示出 7×108单位/ml的载体效价。
不良事件按照NIH普通毒性标准(CTCAE版本2或3)(Common Toxicity Criteria Version 2.0.Cancer Therapy Evaluation Program. DCTD，NCI，NIH，DHHS，March，1998.)分级。为了评价Rexin-GTM的 临床有效性，我们考虑药物的总体杀细胞活性和抗血管生成活性 (Gordon等人.(2000)Cancer Res.60：3343-3347，Gordon等人.(2001) Hum.Gene Ther.12：193-204)，以及亲病灶性纳米颗粒向转移病变中 的动态摄取(Gordon等人.(2001)Hum.Gene Ther.12：193-204)，这将 影响治疗过程中靶向纳米颗粒的生物分布或生物利用性。由于载体更 容易在某些癌性病变内积累-这取决于肿瘤侵占和血管生成的程度， 预期不会均匀分布到其余的肿瘤结节，特别是在具有高肿瘤负荷的患 者中。这将可预测地诱导混合肿瘤反应，其中部分肿瘤的大小可能缩 小，而其他肿瘤结节可能变得更大，和/或新病变可能出现。之后，随 着总肿瘤负荷的正常化或下降，亲病灶性监视功能将略微更均匀地分 布循环纳米颗粒。另外，被治疗的病变在开始时由于坏死性肿瘤诱导 的炎症反应或囊性变而可能变得尺寸较大。因此，在对Rexin-GTM治 疗的客观肿瘤反应的评价中，除了实体瘤标准反应评价标准(RECIST； Therasse等人.(2000)J.Nat′l.Cancer Inst.92：205-216)以外，还使用另 外两个标准，即：(1)用于估计肿瘤体积的O′Reilly公式：L×W2×0.52 (O′Reilly等人.(1997)Cell 88：277-285)，和(2)在治疗期间肿瘤坏死或 囊性变的诱导。因此，目标病变肿瘤体积缩小30％或更多或者诱导肿 瘤内的坏死或囊性变被认为是部分反应(PR)或阳性治疗效果。
本研究通过剂量增加扩展了最初的I/II期胰腺癌方案，并且将其 临床应用扩大到所有实体瘤。如表5所示，在11名患者中的7人中 (64％)观察到不同程度的原发肿瘤或转移性结节的部分反应。通过活 检或CT扫描确定，11名患者中有5人(45％)发生原发肿瘤和/或转移 性结节坏死或凋亡，根据RECIST或肿瘤体积测量确定，11名患者中 有5人(45％)的原发肿瘤或转移性结节的尺寸缩小了30％以上。11名 患者中有2人的疾病稳定，一名具有大肿瘤负荷的患者发生混合肿瘤 反应，一名具有高肿瘤负荷(约50个肝脏结节)的患者的疾病进展。
表5：临床研究B的参与者的客观肿瘤反应、无进展存活期和总存活 期
患者编号、 年龄、Dx 和Dx日 总肿瘤反应[症状缓解， 测径器，CT扫描和MRI] 无进展 存活期 Rexin-G治 疗后的状态 /存活期 距离诊断 的总存活 期 B1 53岁 乳腺癌 部分反应(RECIST)：活检 可见肿瘤结节凋亡和坏 死；PET/CT扫描可见锁 骨上淋巴结减少50％ 3个月 存活 ＞13个月 ＞6.6年 B2 58岁 子宫癌 部分反应：CT扫描可见锁 骨上淋巴结坏死；测径器 测得颈淋巴结缩小33％ 神经痛症状缓解 3个月 死亡 4个月 2年4个月 B3 52岁 乳腺癌 疾病稳定：肺结节没有间 隔改变 咳嗽和骨痛症状缓解 2个月 存活 ＞7个月 ＞3年5个 月 B4 41岁 黑素瘤 部分反应：活检肿瘤结节 坏死和凋亡；CT扫描可见 肿瘤体积缩小50％ 3个月 存活 ＞6个月 ＞15个月 B 5 53岁 胰腺癌 疾病进展 疼痛症状缓解 N.A. 存活 ＞6个月 ＞11个月 B6 48岁 鳞状细胞 癌，喉 部分反应(RECIST)：上呼 吸道直径增加300％；肺结 节稳定 声音恢复 3个月 存活 ＞6个月 ＞24个月
在胰腺癌患者中，以及在子宫癌、结肠癌、乳腺癌和恶性黑素瘤 患者中，一致性地观察到重复输注Rexin-GTM引起的癌性淋巴结的进 行性缩小，这在理解有关药效学方面是显著的和有意义的。众所周知 前哨淋巴结-癌可能从原发肿瘤扩散到的第一个淋巴结-对于我们 理解转移疾病的发病机理、诊断和预期治疗来说相当重要，Rexin-GTM 向局部和远处淋巴结的明显渗透是明显的和顺利的(表4和表5)。 Rexin-GTM中的亲病灶性纳米颗粒在体内循环时保持其生物活性的发 现的临床意义无需夸大，不仅在原发和转移病变中积累，而且到达治 疗影响的淋巴结中。如图23所示，来自恶性黑素瘤患者腹股沟区的 癌淋巴结的手术活检显示实质坏死(23-A)、大面积的明显凋亡(23-B) 和充满含铁血黄素的巨噬细胞(23-C)排出肿瘤碎片的区域。而且，免 疫组化染色显示明显的CD35+树突细胞(23-D)、CD68+巨噬细胞 (23-E)、CD8+杀伤T细胞(23-F)和CD4+辅助T细胞(未示出)的单 核细胞浸润。亲病灶性纳米颗粒在渗入前哨淋巴结内转移病变时其基 因递送功能(既杀细胞活性)保持活性，并且不破坏免疫系统而是与 免疫系统协同作用，这再次证实了未来使用这种携带细胞因子基因的 靶向基因递送系统进行原位癌症接种的潜力。
在另外一名喉鳞状细胞癌患者中，颈部MRI证实了上呼吸道明 显再开放(图24)，这与患者声音的恢复相关。无进展存活期的范围 从1个月到大于5个月。存活时间中值大于从开始Rexin-GTM治疗起 6个月，超过距诊断24个月。11名患者中有8人(72％)存活/存活超过 Rexin-GTM治疗后6-13个月。总之，Rexin-GTM在广泛的抗性肿瘤类 型范围中可能具有单药活性。此外，注意到在大多数患者中观察到持 久的疗效，尽管治疗比较简短。
全部11名患者良好耐受载体输注，没有相关的恶心或呕吐、腹 泻、粘膜炎、脱发或神经病。11人有8人(73％)的疼痛、胃气胀、搏 动、声音嘶哑和疲劳症状缓解。没有与研究药物相关的血液动力学功 能的显著改变、骨髓抑制、肝脏、肾脏或任何器官的功能障碍。没有 与治疗相关的不良事件进一步提示甚至在提高载体剂量时， Rexin-GTM仍然是相对安全的治疗。在这点上，没有剂量限制性毒性， 以及令人注意的在多种不同肿瘤类型中具有单药有效性的迹象，和最 近可以获得较高效能的Rexin-GTM制剂，这些结合起来促进了为提高 临床有效性和优化治疗方案而设计的临床试验的进展和批准
实施例8：临床研究C，Rexin-GTM在转移性胰腺癌和结肠癌中的 扩展应用和“等价计算”
临床研究C涉及一小组患者，他们参与Rexin-GTM对于所有实体 瘤的扩展应用计划(Expanded Access Program)，这是最近菲律宾 BFAD批准的一项临时计划。设计这一创新性的方案来尽可能快速且 安全地解决(即减少或根除)特定患者的总肿瘤负荷，以防止或阻止 “追赶性的”肿瘤生长，由此使这一混合参数最小化。估计的总应用 剂量通过经验计算来确定，在此称为“等价计算”(称为一种在量上 相等的方法，或功能等价)。基本公式考虑根据影像研究估计的总肿 瘤负荷(1cm＝大约1×109癌细胞)、对于靶向载体系统的经验表现 系数(φ)或生理感染复数(P-MOI，病毒学)(非靶向载体系统的P-MOI 基本上是无限的)、和临床级制剂的效能(单位/ml)。肿瘤负荷通过 将以厘米为单位的肿瘤结节最长直径之和乘以1×109确定，表示为 癌细胞总数。“运算定义的”表现系数(φ)或生理感染复数MOI (P-MOI)对于Rexin-GTM为100，基于在多项临床前研究中证实的靶 向基因递送系统的转导效率提高的定量证明，并且基于在最初临床试 验中观察到的Rexin-GTM的剂量依赖性表现。重要的是，高效 Rexin-GTM产物(～1.0×109单位/ml)的产生允许静脉内施用计算的 Rexin-GTM最适剂量，而没有体积过载的风险。开创性研究：在前20 天的Rexin-GTM输注结束后，两名转移性胰腺癌患者和一名转移性结 肠癌患者(取得知情同意)分别在6周(1名患者)和16周(2名患 者)内继续接受静脉内Rexin-GTM输注，可达大约2.5×1012单位的总 剂量。这提供了等价计算，与基于CT扫描或MRI估计的患者肿瘤负 荷大致平行。
不良事件按照NIH普通毒性标准(CTCAE版本2或3)(Common Toxicity Criteria Version 2.0.Cancer Therapy Evaluation Program. DCTD，NCI，NIH，DHHS，March，1998.)分级。为了评价Rexin-GTM的 临床有效性，我们考虑药物的总体杀细胞活性和抗血管生成活性 (Gordon等人.(2000)Cancer Res.60：3343-3347，Gordon等人.(2001) Hum.Gene Ther.12：193-204)，以及亲病灶性纳米颗粒向转移病变中 的动态摄取(Gordon等人.(2001)Hum.Gene Ther.12：193-204)，这将 影响治疗过程中靶向纳米颗粒的生物分布或生物利用性。由于载体更 容易在某些癌性病变内积累-这取决于肿瘤侵占和血管生成的程度， 预期不会均匀分布到其余的肿瘤结节，特别是在具有高肿瘤负荷的患 者中。这将可预测地诱导混合肿瘤反应，其中部分肿瘤的大小可能缩 小，而其他肿瘤结节可能变得更大，和/或新病变可能出现。之后，随 着总肿瘤负荷的正常化或下降，亲病灶性监视功能将略微更均匀地分 布循环纳米颗粒。另外，被治疗的病变在开始时由于坏死性肿瘤诱导 的炎症反应或囊性变而可能变得尺寸较大。因此，在对Rexin-GTM治 疗的客观肿瘤反应的评价中，除了实体瘤标准反应评价标准(RECIST； Therasse等人.(2000)J.Nat′l.Cancer Inst.92：205-216)以外，还使用另 外两个标准，即：(1)用于估计肿瘤体积的O′Reilly公式：L×W2×0.52 (O′Reilly等人.(1997)Cell 88：277-285)，和(2)在治疗期间肿瘤坏死或 囊性变的诱导。因此，目标病变肿瘤体积缩小30％或更多或者诱导肿 瘤内的坏死或囊性变被认为是部分反应(PR)或阳性治疗效果。
本研究是Rexin-GTM治疗所有实体瘤的扩散应用计划中的临床经 历首次报告，引入了被称为等价计算的创新的个体化剂量密集方案。 在这个初步但是重要的间断分析中，在全部3名具有广泛肿瘤负荷的 患者中都观察到显著反应。对于一名患者(C1)，等价计算(或功能 等同的方案)估计了累积剂量，后续MRI显示，该累积剂量导致不 可切除的胰腺肿瘤液化性坏死和囊性转变，以及所有转移性肝结节的 囊性转变或消失(图25)。一个囊性肿瘤结节的吸出物为恶性细胞阴 性。对于患有IV期结肠癌的第二名患者(C2)，接近预定等价计算的 累积剂量有效地减少转移性病变的大小：影像分析证实在肝肿瘤结节 中观察到84％的坏死。对于第三名患者(C3)，CT扫描可见原发性胰 腺肿瘤以及肺结节的数目(从28个肺结节降至12个)和大小显著降 低。两名患者在Rexin-GTM治疗后的无进展存活期和总存活期超过6 个月。这些结果提供了初步证据，支持等价计算可以用来确定解决特 定患者肿瘤负荷的Rexin-GTM总累积剂量的假设，因此包括最佳诱导 方案。
全部三名患者都良好地耐受载体输注，没有相关的恶心或呕吐、 腹泻、粘膜炎、脱发或神经病。没有与研究药物相关的血液动力学功 能急性改变、骨髓抑制、肝脏、肾脏或任何器官的功能障碍。两名患 者发生需要红细胞输入的贫血(3级)，这可能与后来的坏死肿瘤内出 血有关。一名患者发生散发的血小板减少(1-2级)，这可能与研究药 物有关。一名患者在Rexin-GTM治疗3个月后死于急性暴发的葡萄球 菌表皮炎败血病，这不是研究药物引起的。这名患者的尸检结果显示 残余的胰腺肿瘤几乎完全坏死，肝脏和腹部肠系膜中剩余的转移性肿 瘤75-95％坏死，而在骨髓、心脏和脑中为正常组织学。Rexin-GTM施 用不引起全身毒性强调了Rexin-GTM相对于标准化疗在控制转移癌以 及其他生活质量方面的潜在优点。这各种情况下，总体肿瘤破坏程度 是明显的。证明了特别是为克服患者的肿瘤负荷而设计的Rexin-GTM 剂量密集方案能够达到这些有效性水平，这强调了需要进一步精练等 价计算，以确定最佳肿瘤消除率，并且确定用于经历杀肿瘤后创伤愈 合的患者的最佳支持疗法。
实施例9：临床研究D，Rexin-G用于标准化疗难治性局部晚期或 转移性胰腺癌的I期临床试验
在临床研究D中，12名局部晚期或转移性胰腺癌患者接受静脉 内输注Rexin-G治疗，以证实在以上临床研究A的6名患者中观察到 的初步临床结果。这些最初的患者接受重复Rexin-G输注，累积剂量 可达1012cfu，而不显示骨髓抑制或器官损伤。
设计该研究用来按照剂量递增方案基于观察到的剂量限制性毒 性(DLT)评价最大耐受剂量(MTD)，其中MTD被定义为6名患者中最 多有1人发生DLT、而下一较高剂量水平时6名患者中至少2人发生 DLT的最高安全耐受剂量。血液学不良事件定义为根据NCI不良事 件普通术语标准v3.0，任何≥3级的至少可能与Rexin-G相关的事件。 3级ANC持续＜72小时。非血液学不良事件定义为根据NCI不良事 件普通术语标准v3.0，任何≥3级的至少可能与Rexin-G相关的事件。 只有患者已经接受最大支持治疗时，才认为≥3级的恶心、呕吐或腹泻 是剂量限制性的。不认为脱发是剂量限制性的。
患者接受三个不同剂量水平的Rexin-G。对于剂量水平1，有3 名患者在第1-7和15-21天时接受7.5×109cfu的治疗。对于剂量水 平2，有6名患者在第1-7和15-21天时接受1.1×1010cfu的治疗。 对于剂量水平3，有3名患者在第1-5、8-12、15-19和22-26天时接 受3.0×1010cfu的治疗。所有患者都接受每次每千克体重8ml的最 大体积。
对于剂量水平1，所有3名患者都完成疗程，并且接受100％的 剂量。没有患者在治疗过程中或在1周的观察期内发生DLT。对于剂 量水平2，4名患者接受完全剂量的Rexin-G。在2名没有接受完全剂 量的患者中，一名患者由于可能与治疗有关的3级AST和ALT升高 而调整了剂量。然而，该患者还每日施用1000mg醋氨酚。在中断 Rexin-G和醋氨酚后72小时内，所述升高降至I级。另一名患者由于 发生2级碱性磷酸酶不利事件而坚持了一天的治疗。对于剂量水平3， 至今还没有毒性总结报告，但是没有患者发生SAE或DLT。
证实了Rexin-G在测试剂量水平的安全性后，研究了病毒颗粒在 静脉输注后的药代动力学和它们引起免疫应答、发生重组事件(产生 有复制能力的逆转录病毒)和载体整合到非靶器官中的能力。对于病 毒颗粒的药代动力学，在第1天载体输注后0、5、30、60、120min 和24小时时获得全部12名患者的血样。基于新霉素抗性(neor)基因 产物的表达确定并定量Rexin-G载体浓度(病毒滴度)。
简要地说，在转导前一天，将1.5×104HT1080(人纤维肉瘤细胞) 细胞接种在12孔板上。培养基与0.5ml连续稀释的含有8μg/ml聚凝 胺(polybrene)的病毒上清液一起在32℃、5％CO2条件下轻摇孵育 3.5小时。向培养物中加入0.5ml新鲜培养基，然后在37℃、5％CO2 条件下保持过夜。对于neor基因产物的表达，从转导24小时后开始， 通过用G418药物(500μg/ml)处理筛选G418抗性集落。在G418药物 中孵育13天后通过限制稀释定量用亚甲蓝染色的G418抗性集落数。 病毒滴度表示为每毫升血清的集落形成单位数(cfu/ml)。
结果证明，在接受剂量水平1的全部3名患者、接受剂量水平2 的6名患者中的2人、接受剂量水平3的3名患者中的2人在Rexin-G 输注5分钟后获得的血样中，neor选择性Rexin-G载体含量极低(＜1× 102cfu/ml)，但是可以检测到。在30分钟以外的时间点没有回收到载 体。最低的载体回收可能是由于许多因素，这一发现最可能表明载体 向肿瘤内的生物分布，已知其在输注数分钟内发生。这符合临床前研 究结果，其中发现在静脉内输注后数分钟内，显著量的免疫反应性 Rexin-G在癌异种移植物中积累(Gordon等人.，2001)。循环载体向肿 瘤内的这种快速分配是由于亲病灶性(寻找病变的)载体对于在活跃 血管生成和/或肿瘤侵占区域特征性暴露的胶原蛋白微阵列的特定亲 和力和粘附性(例如在血小板粘附中)。因此，Rexin-G在受治疗患者循 环中的短生物半衰期可能是由于向原发和转移病变内的快速生物分布。 无论有关的机制如何，在输注后，极少的(如果有的话)循环Rexin-G 在系统循环中保留超过30分钟。
在输注前和治疗4周(剂量水平1、2)后和6周(剂量水平3) 后从全部12名患者获得血清样品，用来检测抗载体抗体的存在。用 载体中和试验和Western狭缝印迹分析结合检测抗载体抗体的存在。 在用剂量水平I-III的Rexin-G治疗的患者的血清中未检测到载体中和 抗体和抗gp70 env蛋白抗体。这些数据证实了在小鼠中的临床前结 果，其中在重复输注Rexin-G后没有检测到载体中和抗体。这些发现 证实了Rexin-G的低免疫原性，这允许重复静脉内施用，而不会丧失 潜在的临床有效性。
在时间0(载体输注前)和开始载体输注4周(剂量水平2)后 或6周(剂量水平3)后从7名患者获得外周血淋巴细胞，从中提取 DNA进行RCR检测。该试验设计用来通过PCR检测Rexin-G逆转录 病毒载体中存在的2001bp莫洛尼鼠白血病病毒包膜(MoMLV Env)基 因一小部分(来自411-574bp的164bp片段)的存在。发现检测的所有 输注后样品都是RCR阴性的。
在输注前、治疗后1周、4周(剂量水平1、2)、第5天和6周 (剂量水平3)后从9名患者获得外周血淋巴细胞，从中提取DNA 检测是否存在载体DNA整合。对外周血淋巴细胞中载体DNA整合的 检测如下进行：离心患者的血样，从RBC和血清中分离白细胞。使 用Neo引物，对分离的白细胞DNA进行实时PCR，以扩增dnG1-Erex 逆转录病毒载体中存在的795bp新霉素磷酸转移酶(NPT)基因的一小 部分(来自382-456bp的75bp片段)。
在外周血淋巴细胞DNA中没有检测到载体DNA序列，证实了临 床前数据，其中除了Rexin-G治疗的小鼠、大鼠和兔子的肝脏和脾脏 (病毒清除器官)以外，在非靶器官中没有检测到载体DNA。
静脉内施用Rexin-G后的抗肿瘤活性利用RECIST进行评价。接 受剂量水平1的所有3名患者都在第28天前后进展。接受剂量水平2 的6名患者中有5名在治疗开始大约1个月内进展。其他患者按照 RECIST被认为疾病稳定，但确实遭受症状恶化。接受剂量水平3的 全部3名患者在第42天评价时进展。
利用测量的以Hounsfield单位表示的肿瘤密度来评价Rexin-G的 生物学活性。对于接受剂量水平1的3名患者和接受剂量水平2的6 名患者中的每一名，以Hounsfield单位表示的基线处和第28天时的 肿瘤密度数据由多处病变获得(7名患者中的5处病变，一名患者的 3处病变，和一名患者的2处病变)。这些数据以两种方式进行总结。
表6显示了每名患者中，肿瘤密度任意降低的病变的比例，以及 至少降低10％、15％和20％的病变的比例。病变显然倾向于密度降低： 全部9名患者所测的病变的Hounsfield单位均为净减少，其显著性高 于单独偶然的预期(双侧p值＝0.004)。然而，剂量水平没有强烈的差 异指示；例如，在针对显示至少降低20％的病变比例比较剂量水平时， 双侧p值为0.43(连续校正的Wilcoxon秩和检验)。
表6：满足肿瘤密度降低的各患者的病变比例
剂量水平 患者 所有降低 ≥10％降低 ≥15％降低 ≥20％降低 1 1 3/5(60％) 3/5(60％) 2/5(40％) 1/5(20％) 1 2 4/5(80％) 2/5(40％) 2/5(40％) 2/5(40％) 1 3 5/5(100％) 4/5(80％) 3/5(60％) 2/5(40％) 2 4 1/2(50％) 1/2(50％) 1/2(50％) 1/2(50％) 2 5 3/5(60％) 3/5(60％) 3/5(60％) 1/5(20％) 2 6 2/3(67％) 2/3(67％) 0/3(0％) 0/3(0％) 2 7 5/5(100％) 5/5(100％) 5/5(100％) 5/5(100％) 2 8 4/5(80％) 4/5(80％) 4/5(80％) 4/5(80％) 2 9 4/5(80％) 4/5(80％) 4/5(80％) 3/5(60％)
表7按照剂量水平总结了肿瘤密度降低满足各种标准的患者的比 例，例如，至少50％的病变的密度任意降低。另外，没有清楚的证据 表明剂量水平之间的差异。
表7：根据几个标准，具有有效治疗的患者的比例
标准 剂量水平 1 剂量水平2 所有患者 ≥50％的病变任意降 低 3/3(100％) 6/6(100％) 9/9(100％) ≥60％的病变任意降 低 3/3(100％) 5/6(83％) 8/9(89％) ≥75％的病变任意降 低 2/3(67％) 3/6(50％) 5/9(56％) ≥80％的病变任意降 低 2/3(67％) 3/6(80％) 5/9(56％) 100％的病变降低 1/3(33％) 1/6(17％) 2/9(22％) ≥1/3的病变降低 ≥20％ 2/3(67％) 4/6(67％) 6/9(67％) ≥2/3的病变降低 ≥20％ 0/3(0％) 2/6(33％) 2/9(22％)
这些数据证实与基线测定值相比，在Rexin-G治疗后目标病变的 肿瘤密度显著降低，表明癌细胞数减少和/或肿瘤结节内的坏死或囊性 转化，这满足CHOI的部分反应(PR)标准，因此证实了Rexin-G生物 学活性。
接受剂量水平1的患者均具有导致死亡的疾病进展，存活期中值 为3.5个月。接受剂量水平2的所有患者具有导致死亡的疾病进展， 存活期中值为2.5个月。对于剂量水平3，一名患者在治疗后存活4 个月后死于疾病进展，在最后一次随访时另外两名患者仍然存活。
本研究证实了在最初临床研究A中获得的结果，证明了Rexin-G 在剂量水平1、2和3时的安全性。进一步地，静脉输注后病毒颗粒 的药代动力学指示快速肿瘤靶向，施用5分钟后在血液中检测到极少 的病毒颗粒。在6周的随访期内没有观察到诱发的针对病毒颗粒的免 疫应答，表明载体具有低免疫原性，因此允许重复治疗周期。没有发 现重组事件，证实了3-质粒转染系统显著降低这些事件的风险的能 力。也没有发现载体在非靶器官中的整合。接受剂量水平1和2的所 有9名患者证实都有肿瘤密度降低，表明Rexin-G的生物学活性，但 是在两个剂量水平之间没有观察到肿瘤应答的差异。
实施例10：单药Rexin-G对于转移性骨肉瘤的有效性的病例研究
于2003年12月诊断为右胫骨骨肉瘤的17岁的男性接受手术前 顺铂、阿霉素和高剂量氨甲喋呤化疗，然后行四肢救助术。对肿瘤的 组织病理学检查显示手术前化疗只引起50％的坏死。手术后，他接受 两次顺铂和阿霉素，两次阿霉素和异环磷酰胺，使阿霉素的累积剂量 达到400mg/m2。化疗在2005年2月结束。2006年3月，后续CT扫 描显示有两个左侧肺转移，通过VATS胸腔镜手术切除。CT扫描和 PET扫描显示在手术区存在持久的病变。从2006年6月至11月，他 接受了高剂量的氨甲喋呤和异环磷酰胺，然后在2006年11月接受了 开胸手术。2006年12月的重复CT扫描显示肺转移进展，证实标准 化疗失败。2007年1月开始使用泰素帝(taxotere)、健择(gemzar) 和阿霉素进行挽救治疗，但是连续影像学检查证明他的肺肿瘤在尺寸 和数量上都增长，到2007年4月，从大小为1cm的一个肺结节生长 为超过10个肺结节，最大病变的大小为4.2cm。
在获得正式知情同意后，患者加入Rexin-G单用方案。在开始 Rexin-G治疗之前，使用以前Gordon等人.(2006)描述的等价计算确 定累积载体剂量：将估计的肿瘤负荷(定义为1×109个癌细胞的所 有病变最长直径之和)乘以经验靶向或生理系数100(生理感染复数， pMOI)。累积载体剂量确定为1.8×1012cfu Rexin-G载体，预测该患 者需要18-20次Rexin-G输注(每次1×1011cfu)才能终止疾病进展并 且诱导客观肿瘤反应。
Rexin-G的第一治疗周期为每周静脉内施用两次1×1011cfu，持 续4周，然后是2周的休息期，导致累积剂量为8×1011cfu。在连续 治疗周期之前和之后进行连续PET-CT扫描(图30)。第一周期结束后 一周获得的PET-CT扫描显示目标病变的总大小增加28％，目标病变 的总肿瘤密度减少6％，4个目标病变的SUV最大值之和降低33％， 注意到3个新的小肺病变。由于替代治疗选择极少，并且没有观察到 对Rexin-G输注的毒性，FDA批准另外的Rexin-G治疗周期：静脉内 施用1×1011cfu，每周两次，共4周，使累积剂量达到1.6×1012cfu， 这接近基于最初肿瘤负荷预测的Rexin-G总剂量。值得注意的是，在 完成第二周期2周后进行的PET-CT扫描显示没有新的病变，肿瘤密 度之和增加539％，表明目标病变钙化，4个目标病变的SUV最大值 之和减少48％(图31-33)。主要研究人员认为这是对治疗的阳性部分 反应，尽管肿瘤直径之和增加。
基于阳性肿瘤反应，开始了对化疗难治性复发或转移性骨肉瘤的 II期临床试验。由于PET成像是测定肿瘤反应的最有效的成像方法， 并且因为RECIST标准由于肿瘤结节持续修补钙化而不能准确反映肿 瘤反应，FDA不使用标准RECIST标准而代之以国际PET标准，来 监视和报告肿瘤反应。
实施例11：使用适应性试验设计的晚期I/II期临床试验
在美国对复发性或转移性肉瘤、乳腺癌或胰腺癌患者同时进行三 个具有适应性试验设计的晚期I/II期临床试验。这些研究的目标有三 方面。1)确定通过静脉内(IV)输注施用的Rexin-G的剂量限制性毒性 和最大耐受剂量。2)评价静脉内Rexin-G引起免疫应答、重组事件 和不希望的载体在非靶器官中整合的能力。3)鉴定静脉内施用的 Rexin-G的抗肿瘤反应。
每项研究有总共有15-24名患者加入。表8示出了5个计划的剂 量水平，已经以剂量水平0进行治疗。
表8：Rexin-G的计划剂量水平
治疗周期＊(4周) 剂量水平 载体剂量/天 最大体积/剂量
每周两次 0 1.0×1011cfu 200ml
起始剂量：
每周三次 I 1.0×1011cfu 200ml
每周三次 II 2.0×1011cfu 200ml
每周三次 III 3.0×1011cfu 200ml
每周三次 IV 4.0×1011cfu 200ml
*每个治疗周期均为6周(4周治疗，两周休息)。毒性＜I级的患者 可以进行重复治疗周期。
三名采用肉瘤方案的患者以剂量水平0(1×1011cfu，每周两次)治 疗，观察42天，没有DLT。如果观察到临床效果并且所有治疗相关 毒性≤1级，适应性试验设计允许患者用相同治疗周期治疗。此外， 如果毒性＜1级，则患者也可以继续接受下一个较高的剂量水平。剂 量水平0的肉瘤患者目前加入剂量水平1。这将增加获得肿瘤生长控 制并且诱导客观肿瘤反应的机会，而不会影响安全性。
适应性试验设计也使主要研究者能够在第一个治疗周期结束后 推荐手术斑块切除或手术切除剩余的肿瘤。如果通过PET-CT扫描在 组织病理学标本中检测到残余肿瘤，并且该患者具有1级或更低的毒 性，则重新开始治疗周期。
对于全部三项临床试验，三名患者将加入剂量水平1。如果接受 剂量水平1的3名患者中有一人发生3或4级与Rexin-G相关或可能 相关的不良事件(CTCAE版本3.0)，则另外3名患者加入同一剂量水 平。如果接受剂量水平1的前3名患者中至少有两人或者6名患者中 有3人发生3至4级与Rexin-G相关或可能相关的不良事件，则向该 研究中继续增加，直到食品药品监督管理局(FDA)讨论这些数据， 并作出是继续还是终止研究的决定。这些剂量限制性毒素原则适用于 所有剂量水平。
直到3名患者已经用前一剂量水平治疗，并且观察了42天(6 周)，才将剂量升高到下一剂量水平。没有组内剂量递增。在任意剂 量水平时，如果在前3名患者中证明有生物学活性，则可以加入最多 6名患者。如果存在生物学活性的明显证据，则可以终止剂量递增。 进行一次修改，以允许基于明显的生物学活性进一步扩大剂量水平。
研究的主要终点是根据患者机体状态、毒性评价评分、血液学和 代谢谱确定的、通过DLT和MTD证实的临床毒性。次要终点是 Rexin-G引起免疫应答、重组事件或不希望的载体在非靶器官中整合 的潜力。
根据RECIST、CHOI和PET标准测定对Rexin-G的客观肿瘤反 应。迄今为止，10名患者已经用1×1011cfu的第一剂量水平治疗，每 周两次，共4周(肉瘤，n＝6；乳腺癌，n＝1；胰腺癌，n＝3)。对 4名患者进行4周的肿瘤反应评价，在表9中列出。
表9：4名用剂量水平1的Rexin-G治疗的患者的肿瘤反应
患者编号 疾病 根据RECIST 的反应 根据PET的 反应 根据CHOI的 反应 1 肉瘤 疾病稳定 疾病稳定 疾病进展 2 肉瘤 疾病稳定 疾病稳定 疾病稳定 3 肉瘤 疾病进展 疾病稳定 疾病稳定 4 胰腺癌 疾病稳定 疾病稳定 疾病稳定
表9显示在Rexin-G治疗4周后，三名接受肉瘤方案的患者中的 两人，和一名接受胰腺癌方案的患者，根据RECIST显示疾病稳定， 4名患者根据PET显示疾病稳定。全部4名Rexin-G治疗的患者在进 行标准化疗时经CT扫描均证明有肿瘤进展。这些数据表明，根据 RECIST，Rexin-G终止了4名患者中的3人(75％)的肿瘤进展，根据 CHOI标准，终止了4名患者中的3人(75％)的肿瘤进展，根据PET， 终止了全部4名患者(100％)的肿瘤进展，表明PET扫描成像结果可以 用作肿瘤对Rexin-G治疗的反应的早期指示。按照FDA批准的I/II 期方案，另外3名患者加入第一剂量水平的肉瘤方案，因为显示 Rexin-G在该剂量水平时具有生物学活性。进一步地，肉瘤和胰腺癌 方案中每一方案的6名患者都以每个剂量水平加入，以评价剂量应答， 并确定Rexin-G对于每个临床适应症的最佳生物学剂量和治疗方案。
实施例12：49名用Rexin-G治疗的患者的有效性和安全性数据 的总结
积累的临床证据表明，与传统化学治疗相比，Rexin-G具有独特 的安全性分布。观察到客观肿瘤反应(表10)，而没有明显发生不良 事件或毒性(表11)。
表10：施用的Rexin-G剂量和肿瘤应答的总结
累积剂量 部分反应 疾病稳定 疾病进展 ＜1×1011/周(n＝11) 1/11(9％) 1/11(9％) 9/11(82％) 1×1011/周(n＝9) 5/9(56％) 11/9(11％) 3/9(33％) 2×1011/周(n＝11) 7/11(64％) 3/11(27％) 11/11(9％) 4×1011/周(n＝18) 9/18(50％) 6/18(33％) 3/18(16％)
表11：报告的副作用的总结
变态反应/免疫学 斑丘疹，可能痒或不痒，全身(4％) 血液学 高剂量Rexin-G施用可见肿瘤内出血引起的轻度 到中度贫血，需要输入红细胞(4％)， 轻度散发性血小板减少(2％) 胃肠 腹痛，轻度(2％) 腹胀，轻度(2％) 厌食，轻度(2％) 便秘(16％)注意：常规使用麻醉药 体质 轻度到中度发热，伴有或不伴有寒冷，同时没有中 性白细胞减少(4％) 轻度不明疲劳(24％) 异常化学 镁水平轻度升高(2％) AST和ALT水平短暂升高，持续＜72小时(1％)
实施例13，Rexin-G在化疗难治性复发性或转移性骨肉瘤患者中 的II期临床研究
利用PET-CT成像研究的结果计算估计的肿瘤负荷，据此将20-30 名化疗难治性复发性或转移性骨肉瘤患者分入两个不同的Rexin-G 剂量水平。估计的肿瘤负荷的计算是将单位为cm的目标病变最长直 径之和乘以109癌细胞。如果肿瘤负荷小于100亿个细胞，则患者归 入剂量水平1，如果肿瘤负荷大于100亿个细胞，则患者归入剂量水 平2(表12)。
表12：难治性复发性或转移性骨肉瘤的Rexin-G治疗的剂量水平和治疗周 期
治疗周期 剂量水平 载体剂量/天 最大体积/剂量
每周两次 1 1.0×1011cfu 200ml
每周三次 2 1.0×1011cfu 200ml
治疗周期为6周，包括4周的治疗，然后是两周的休息期。毒性 ＜I级的患者可以进行重复周期。对于前4个周期，每6周进行一次 PET-CT，然后每12周进行一次。一或两个治疗周期后，主要研究人 员可以推荐手术斑块切除或者完全手术切除。如果通过组织病理学检 查或者通过PET-CT扫描发现存在残余的病变，如果手术切口愈合并 且患者具有＜I级的毒性，则可以在手术4周后给予重复治疗周期。
临床研究的目标是评价静脉内(IV)Rexin-G的临床有效性和总体 安全性。临床有效性包括肿瘤反应率、无进展存活期和总存活期。利 用国际PET标准将肿瘤反应率评价为CR、PR或SD。无进展存活期 是超过一个月的存活期，总存活期定义为6个月或更长的存活期。静 脉内施用的Rexin-G的总体安全性根据机体状态、毒性评分、血液学、 代谢谱、免疫应答、载体向PBL中的整合和重组事件来确定。
实施例14，用Rexin-G治疗然后用Reximmune-C治疗的晚期转 移性胰腺癌患者的病例研究
当放射和化学治疗不能控制转移性胰腺癌向肝脏及在肝脏内的 扩散时，这一重要器官中的肿瘤负荷可能生长到巨大的比例，从而以 大量形成的肿瘤代替正常的肝实质。这时，同情使用和知情同意结合 起来支持应用更具攻击性的方案来减少致命肿瘤的负荷。图34显示 了一组切片，这些切片显示了从通过28天连续输注Rexin-G(累积剂 量：2×1012cfu)然后6天Reximmune-C(累积剂量：3×1010cfu)治 疗的难治性转移性胰腺癌患者中获得的尸检肿瘤标本中原发肿瘤的 广泛坏死。尽管这组输注是良好耐受的，并且总体肿瘤负荷显著减少， 但是患者不能正常生长以及容易地消退大的病变，需要支持治疗。遗 憾的是，患者在治疗3个月后死于暴发性大肠杆菌细菌脓毒症，这被 认为与Rexin-G干预无关，而在更广的意义上可能涉及烧伤后创伤愈 合的问题。从图34的A图中可以看出，在图B和C中放大，尸检所 见指示大量的坏死(n)，涉及该胰腺肿瘤的大约95％，具有多个纤维化 区域(f)，侧面为退化(deg)和细胞器结构。针对GM-CSF的免疫组化 染色鉴定了几个区域，其中表达GM-CSF的肿瘤细胞(图E和F)在小 岛中是明显的(箭头所示)(框入的区域，在E图中放大)，在看起来 象GM-CSF分泌细胞坏死片段的附近可见明显的免疫浸润(im)(图 F)。这一临床病例研究强调了三个重要的问题：(i)在癌症产生无法挽 救的器官损伤之前早期治疗患者具有总体的重要性，(ii)Rexin-G具有 满足并适合极大肿瘤负荷的潜力，和(iii)具有免疫刺激负载的 Reximmune-C具有参与肿瘤破坏过程的潜力。
除非另外说明，本发明的实施使用常规细胞生物学、细胞培养、 分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学技术， 它们都是本领域内的技术。这些技术在文献中均有描述。参见，例如， Molecular Cloning A Laboratory Manual，2nd Ed.，ed.by Sambrook， Fritsch and Maniatis(Cold Spring Harbor Laboratory Press：1989)；DNA Cloning，Volumes I and II(D.N.Glover ed.，1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait ed.，1984)；Mullis等人.美国专利No.4,683,195； Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames和S.J.Higgins eds.1984)； Transcription And Translation(B.D.Hames和S.J.Higgins eds.1984)； Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney，Alan R.Liss，Inc.，1987)； Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press，1986)；B.Perbal，A Practical Guide To Molecular Cloning(1984)；the treatise，Methods In Enzymology(Academic Press，Inc.，N.Y.)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J.H.Miller和M.P.Calos eds.，1987，Cold Spring Harbor Laboratory)；Methods In Enzymology，Vols.154 and 155(Wu等 人.eds.)，Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer和Walker，eds.，Academic Press，London，1987)；Handbook Of Experimental Immunology，Volumes I-IV(D.M.Weir和C.C.Blackwell， eds.，1986)；Manipulating the Mouse Embryo，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor.N.Y.，1986)。
交叉引用
本申请要求于2006年11月3日提交的美国专利申请第11/556,666 号的优先权，该美国申请是于2004年4月21日提交的美国专利申请第 10/829,926号的部分继续申请，后者要求于2003年4月21日提交的美 国临时申请第60/464,571号的优先权，上述申请均以引用的方式并入本 文。
图1B显示1号患者在第二个治疗周期结束四天后的后续MRI，图 示复发肿瘤(T；括出的区域)形状呈不规则性，40-50％的肿瘤出现大 面积的中心性坏死(nec)，主动脉旁淋巴结转移(N)大小明显减小。
图1C为表明Rexin-G引起1号患者的血清CA19-9水平降低的图。 血清CA19-9水平(U/ml)(标于纵轴)表示为时间(日期)(标于横轴) 的函数。箭头标明每个治疗周期的开始。
图2A提供2号患者在第一个治疗周期伊始的代表性腹部CT扫描， 图示在胰腺头(T)侵占肠系膜上静脉(SMV)和肠系膜上动脉(SMA)的区 域有一6.0cm3肿块。
图2B提供2号患者在第二个治疗周期结束两天后的后续腹部CT 扫描，图示胰腺肿瘤肿块(T)的大小缩小，并且远离肠系膜上血管(SMV 和SMA)缩回。箭头标明每个治疗周期的开始。
图2C为表明Rexin-G阻止2号患者原发肿瘤生长的图。通过Rexin-G 连续治疗，注意到肿瘤大小呈进行性减小。肿瘤体积(cm3)采用以下公式 计算：宽度2×长度×0.52(O′Reilly等人，Cell 88，277，1997)(标于纵轴)， 并表示为时间(标于横轴)的函数。箭头标明每个治疗周期的开始。
图3A描述的数据表明Rexin-G加吉西他滨诱导患转移性胰腺癌的3 号患者肿瘤消退。原发肿瘤的肿瘤体积(cm3)标于Y轴上，并表示为时间 (日期)的函数。箭头标明Rexin-G输注开始。
图3B描述的数据表明Rexin-G加吉西他滨诱导患转移性胰腺癌的3 号患者肿瘤消退。门静脉节结的肿瘤体积标于Y轴上，并表示为时间(日 期)的函数。箭头标明Rexin-G输注开始。
图3C描述的数据表明Rexin-G加吉西他滨诱导患转移性胰腺癌的3 号患者肿瘤消退。肝脏节结数标于Y轴上，并表示为时间(日期)的函 数。箭头标明Rexin-G输注开始。
图4A纵轴为1号患者的收缩压(以mm Hg表示)，而横轴为 REXIN-G输注时间。
图4B纵轴为1号患者的每分钟脉搏率，而横轴为REXIN-G输注时 间。
图4C纵轴为1号患者的每分钟呼吸频率，而横轴为REXIN-G输注 时间。
图5A描述的数据显示1号患者的血红蛋白(gms％)、白细胞计数和 血小板计数(标于Y轴)，其表示为治疗天数(标于X轴)的函数。
图5B描述的数据表明Rexin-G对1号患者的肝功能无不良作用。 AST(U/L)、ALT(U/L)和胆红素(mg％)标于Y轴，并表示为治疗天数(标 于X轴)的函数。
图5C显示1号患者的血尿素氮(mg％)、肌酐(mg％)和钾(mmol/L) 水平(标于Y轴)，并表示为治疗天数(标于X轴)的函数。以剂量水 平I(4.5x109cfu/剂)连续施用6天，休息期为2天，接着以剂量水平II(9 x109cfu/剂)连续施用2天，再以剂量水平III(1.4x1010cfu/剂)连续施用 2天。
图6提供的数据表明Rexin-G的剂量递增对2号患者的血液动力学 功能无不良作用。对每个剂量水平，收缩压(mm Hg)、脉搏率/分钟和呼 吸频率/分钟均作为输注时间(标于横轴)的函数在纵轴上作图。
图7A表示2号患者的血红蛋白(gms％)、白细胞计数和血小板计数 (标于Y轴)，其表示为治疗天数(标于X轴)的函数。
图7B描述的数据表明Rexin-G对2号患者的肝功能无不良作用。 AST(U/L)、ALT(U/L)和胆红素(mg％)标于Y轴上，并表示为治疗天数 (标于X轴)的函数。
图7C表示2号患者的血尿素氮(mg％)、肌酐(mg％)和钾(mmol/L) 水平(标于Y轴)，其表示为治疗天数(标于X轴)的函数。以剂量水 平I(4.5x109cfu/剂)连续施用5天，接着以剂量水平II(9x109cfu/剂)连 续施用3天，再以剂量水平III(1.4x1010cfu/剂)连续施用2天。
图8A表示3号患者的血红蛋白(gms％)、白细胞计数和血小板计数 (标于Y轴)，其表示为治疗天数(标于X轴)的函数。
图8B描述的数据表明Rexin-G对3号患者的肝功能无不良作用。 AST(U/L)、ALT(U/L)和胆红素(mg％)标于Y轴上，并表示为治疗天数 (标于X轴)的函数。
图8C表明Rexin-G对3号患者的肾功能无不良作用。血尿素氮(mg ％)、肌酐(mg％)和钾(mmol/L)水平标于Y轴上，并表示为治疗天数(标 于X轴)的函数。以剂量水平I(4.5x109cfu/剂)连续施用6天。
图9显示对Rexin-G纳米颗粒的大小测量。采用精度检测仪(Franklin， MA 02038 U.S.A.)，通过动态光散射(DLS)以分批模式分析载体样品，以 流体力学半径(rh)确定其分子大小。采用精度反卷积软件由DLS数据计 算确定不同大小群。Rexin-G临床使用批次的平均颗粒大小分别为95、 105和95nm，并且未检测到病毒聚集。
图10展示GTI表达载体G1nXSvNa的高感染滴度(HIT)形式。 pRV109质粒提供强CMV启动子。所得pREX表达载体具有用于在表达 SV40大T抗原的生产细胞系(293T)中进行游离型复制和质粒拯救的 SV40起点、用于在大肠杆菌中筛选和维持的氨苄青霉素抗性基因和由 SV 40e.p.驱动的可测定载体滴度的新霉素抗性基因。目的基因最初克隆 为具有Not I和Sal I突出端的PCR产物。扩增片段经DNA测序验证后， 通过将相应片段克隆至pG1XsvNa(Gene Therapy Inc.)中而插入逆转录病 毒表达载体pREX中，接着切除该质粒的Kpn I片段，并与线性化的(Kpn I消化的)pRV109质粒连接得到相应的HIT/pREX载体。
图11A展示pC-REX质粒的限制酶切图谱。质粒来源于G1XSvNa (Genetic Therapy，Inc.)，CMV即启动子增强子克隆至位于5′LTR上游的 独特Sac II位点中。编码诊断性或治疗性多肽的异源核酸序列(HS)可 包含在Not I和Sal I限制性酶切位点之间。neo基因由具有嵌套ori的 SV40 e.p.驱动。所得pC-REX质粒设计用于在293T细胞中制备高滴度 载体。
图11B展示pdnG1/C-RE×质粒的限制酶切图谱。该质粒与图11A 所示的pC-REX质粒基本相同，不同之处在于它含有编码209个氨基酸 (630bp)的显性阴性突变dnG1的核酸序列(472-1098核苷酸；41-249氨 基酸；登录号U47413)，该序列通过PCR制备而包含了Not I和Sal I突 出端。
图11C展示pdnG1/C-REX的限制性酶切结果。
图12A展示Bv1/pCAEP质粒的限制酶切图谱。CAEP(P＝Pst I)的制 备是在靠近CAE双嗜性包膜蛋白(4070A)N末端处、在成熟gp70多肽 的氨基酸6和7之间加入独特Pst I位点。Bv1为来源于vWF的胶原结 合十肽，侧翼为关键连接体，并且作为符合阅读框的编码序列插入 PCAEP的Pst 1位点。
图12B展示Bv1/pCAEP的限制性酶切结果。
图13A展示pCgpn质粒的限制酶切图谱。该质粒编码由CMV立即 早期启动子增强子驱动的MoMuLv gag-pol。侧翼为EcoR I克隆位点的 gag-pol编码序列来源于3PO克隆，作为pGag-pol-gpt(Moarkowitz等人， 1988)。载体骨架为pcDNA3.1+(Invitrogen)。来源于牛生长激素的聚腺 苷酸化信号和转录终止序列可增强RNA稳定性。SV40复制起点连同e.p. 用于在表达SV40大T抗原的细胞系中进行游离型复制。
图13B展示pCgpn的限制性酶切结果。
图14展示新型pC-REX II(即EPEIUS-REX)质粒的图谱。
图15展示插入治疗性细胞因子基因IL-2的新型pC-REX II(即 EPEIUS-REX)质粒的图谱。
图16展示插入治疗性细胞因子基因GM-CSF的新型pC-REX II(即 EPEIUS-REX)质粒的图谱。
图17A-G展示一系列利用pC-REX II的MCS位点靠近HStk(报告) 基因的辅助启动子。
图17H展示在肿瘤细胞中不同基因从图17A-G所示辅助启动子开 始表达的Western blot结果。
图18表示来自pIRES的CMV启动子序列的核酸序列。
图19A展示制备靶向载体的闭环多管系统。
图19B提供关于闭环多管系统部件的信息。
图20A展示新型pB-RVE质粒的图谱，pB-RVE是一种增强的CMV 表达质粒，带有靶向逆转录病毒载体的包膜构建体(Epeius-BV1)：最小 的双嗜性env(4070A)，其通过在成熟蛋白质(CAE-P)N末端附近加入独 特限制酶切位点加以修饰；经基因工程改造而展现出胶原结合基序 (GHVGWREPSFMALSAA)；并经PCR再生以去除所有上游(5′)和下游(3′) 的病毒序列。除了SV 40启动子/增强子以外，质粒骨架(phCMV1)还提 供优化的CMV启动子/增强子/内含子以驱动env表达，使得能在表达 SV40大T抗原的载体生产细胞(293T)中进行游离型复制。通过卡那霉素 抗性基因提供阳性筛选。
图20B展示pB-RVE的限制性酶切结果。
图21A展示新型pdnG1/UBER-REX质粒的图谱。该质粒编码209 氨基酸(630bp)的显性阴性突变dnG1(472-1098核苷酸；41-249氨基酸； 登录号U47413)。该质粒来源于G1XSvNa(GTI)，CMV即启动子增强 子在5′LTR上游的独特Sac II位点处克隆至该质粒中。去除487bp残留 gag序列以降低RCR的可能性，并在dnG1上游加入97bp剪接受体位点 (ESA)。dnG1编码序列(核苷酸472-1098加终止密码子＝1101)经PCR 制备，包含Not I和Sal I突出端。neo基因由具有嵌套ori的SV40e.p. 驱动。pdnG1/UBER-REX质粒被设计用于在293T细胞中产生高滴度的 载体。
图21B展示pdnG1/UBER-REX的限制性酶切结果。
图22A展示野生型莫洛尼小鼠白血病病毒(MoML V)包膜剪接受体 位点(ESA)的图谱。
图22B展示pUBER-REX的包膜剪接受体位点(ESA)的图谱。
图23A表示C-REX质粒的图示。
图23B表示UBER-REX质粒的图示。
图24表明从IV期胰腺癌患者(A3号患者)的手术切除肝切片观 察，静脉注射Rexin-GTM诱导了转移性肿瘤节结的坏死和纤维化。(A) 代表性的肝活检肿瘤节结组织切片的苏木精伊红染色图；t＝肿瘤细胞； n＝坏死；f＝纤维化。(B)相同肿瘤节结组织切片的三色染色图。蓝色染 色物质表明纤维化区域中存在胶原蛋白。
图25表明从胰腺癌患者(A3号患者)的结果看出，静脉注射 Rexin-GTM诱导了在转移性肿瘤节结中出现明显细胞凋亡。(A-D)代表性 的免疫染色的肝活检肿瘤节结组织切片，表明出现可见的Tunel阳性凋 亡细胞核(褐色染色物质)。
图26显示从经Rexin-GTM治疗的胰腺癌患者(A3号患者)切除的 转移肿瘤节结中肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的免疫组织化学特征。肝活检中 残留肿瘤节结的典型组织切片显示明显的TIL浸润伴有免疫反应性T和 B细胞的功能性补体。从左上方按顺时针方向依次为：辅助T细胞(cd4+)、 杀伤性T细胞(cd8+)、B细胞(cd20+)、单核细胞/巨噬细胞(cd45+)、树 突状细胞(cd35+)和自然杀伤细胞(cd56+)。注意：出现(即迁移)在细 胞介导的免疫和体液免疫情形中具有功能的TIL结构，提示在免疫活性 宿主中具备癌症免疫的可能性。
图27表明静脉注射Rexin-GTM诱导了恶性黑素瘤患者(B4号患者) 的癌淋巴结中出现坏死、凋亡和纤维化。(A)腹股沟淋巴结组织切片的 H&E染色显示广泛的癌细胞坏死(n)、凋亡(箭头指示)和纤维化(f)， 四周边缘为活肿瘤细胞(t)；(B)A切片的高倍放大(100×)显示具有固 缩或破碎的细胞核的小细胞，表明大量细胞正在发生凋亡；(C)A切片 的高倍放大(100×)显示金黄色的充满含铁血黄素的巨噬细胞；(D)代 表性的腹股沟淋巴结组织切片显示明显的免疫反应性CD35+树突状细 胞、(E)CD68+巨噬细胞和(F)CD8+杀伤性T细胞的浸润。
图28显示喉鳞状细胞癌患者(B6号患者)出现肿瘤退缩的迹象。 在Rexin-GTM治疗前(上图)、后(下图)取得颈部MRI影像。对一系 列上呼吸道切片直径的测定显示，与治疗前获得的切片相比，重复输注 Rexin-GTM后上呼吸道的直径显著增大(约300％)(白色箭头所示)。呼吸 道畅通的增加与周围肿瘤块的消退和发声能力的恢复相符。
图29显示在具有大块肿瘤负荷的胰腺癌患者(C1号患者)中观察到 的Rexin GTM输注对转移性肝损伤的数量和性质的影响。在用计算(等 价计算(Calculus of parity))的剂量输注Rexin-GTM进行治疗前(A)和治 疗后(B)取得腹部MRI。注意在图像左上四分之一中有大量小的致密肿瘤 节结完全消除(括号括出)，以及已建立的肝节结出现囊样转变(黑色 箭头指示)。此后吸取增大的肝囊肿(白色箭头指示)进行细胞学检测 证实治疗后吸取物中的癌细胞完全消失。
图30展示化疗难治性骨肉瘤患者的连续CT-PET影像。治疗后1 个月病变部位的18FDG摄取减少以及治疗后2个月病变部位的钙化增加 证明了Rexin-G的抗肿瘤活性。
图31表明经Rexin-G治疗的化疗难治性转移骨肉瘤患者的肿瘤发展 速度降低，其证据是在第二轮治疗周期之后没有出现新的病变。
图32表明经Rexin-G治疗的化疗难治性转移骨肉瘤患者目标病变部 位的18FDG摄取最大SUV值呈进行性降低。
图33表明经Rexin-G治疗的化疗难治性转移骨肉瘤患者的癌性病变 部位钙化增加，其证据是亨斯菲尔德(Hounsfield)单位增加。
图34显示难治性IV期胰腺癌患者的原发胰腺肿瘤中的广泛细胞坏 死和局部GM-CSF产生。(A)原发胰腺肿瘤的组织切片的H&E染色表 明癌细胞广泛(约95％)坏死(n)，伴有部分反应性纤维化(f)，周围可见活 肿瘤细胞的退化(deg)边缘和细胞器结构。(B&C)(A)中所见切片的纤 维化、坏死和退化区域的高倍放大图。(D)GM-CSF转基因的免疫染色 证实有小簇免疫反应性分泌GM-CSF的肿瘤细胞(箭头所示)保留在这 个不能手术治疗的原发肿瘤中。(E)D的高倍放大显示残留的活肿瘤细 胞中的免疫反应性GM-CSF蛋白(深染色物质指示)；(F)对明显免疫浸 润区域的近距离检查表明在坏死的肿瘤细胞(箭头所示)中和在伴有单 核细胞浸润(im)的肿瘤细胞碎片的片段中存在GM-CSF阳性。
发明详述
本文展示和说明了本发明的优选实施方式，但本领域的技术人员会 清楚这些实施方式仅作为实例提供。在不背离本发明的情况下，本领域 技术人员将会想到大量变更、改进和替换。应理解可应用本文所述的本 发明实施方式的各种备选方案来实施本发明。后面的权利要求限定了本 发明的范围，从而覆盖了这些权利要求范围内的方法和结构及其等同方 案。
靶向递送系统在体内将逆转录病毒载体或任何其他的病毒或非病 毒载体、蛋白质或药物选择性地高效靶向至病理性区域(即亲病灶性靶 向)，使得优先递送基因至血管(Hall等人，Hum Gene Ther，8：2183-92， 1997；Hall等人，Hum Gene Ther，11：983-93，2000)或癌性病变部位 (Gordon等人，Hum Gene Ther 12：193-204，2001；Gordon等人，Curiel DT， Douglas JT，eds.Vector Targeting Strategies for Therapeutic Gene Delivery， New York，NY：Wiley-Liss，Inc.293-320，2002)、血管发生活跃区域和组织 损伤或炎症区域。
定义
除非另作定义，否则本文使用的所有科技术语的意义与本发明所属 领域内的技术人员通常理解的相同。除非另外注明，否则本公开内容通 篇涉及到的所有专利、专利申请、公开申请和出版物、Genbank序列、 互联网站点和其他公开材料的全部内容均以引用方式并入本文。如果本 文的术语有多个定义，则取其在本节中的定义。如果提到的是URL或 其他类似标识符或地址，应理解这类标识符可能改变，并且互联网上的 特定信息会时有时无，然而其等效信息应能通过互联网搜索而查到。其 参考表明了这类信息的可获得性及公众传播性。
本文使用的“核酸”是指含有至少两个经共价键连接的核苷酸或核苷 酸类似物亚单位的多核苷酸。核酸可为脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸 (RNA)或者DNA或RNA类似物。核苷酸类似物可作为商品获得，制备 含有这些核苷酸类似物的多核苷酸的方法为已知方法(Lin等人(1994) Nucl.Acids Res.22：5220-5234；Jellinek等人(1995)Biochemistry 34：11363-11372；Pagratis等人(1997)Nature Biotechnol.15：68-73)。核酸 可为单链、双链或它们的混合物。对于本文来说，除非有其他特殊说明， 核酸是双链的，或者能从上下文中明确获知。
本文使用的DNA意欲包括所有类型和大小的DNA分子，包括 cDNA、质粒和包括修饰核苷酸和核苷酸类似物的DNA。
本文使用的核苷酸包括核苷的单、二和三磷酸盐。核苷酸还包括修 饰核苷酸，例如但不限于硫代磷酸核苷酸和脱氮嘌呤核苷酸及其他核苷 酸类似物。
本文使用的术语“受试对象”是指可向其引入大DNA分子的动物、 植物、昆虫和鸟类。包括高等生物，例如哺乳动物和鸟类，包括人、灵 长类、啮齿类、牛、猪、兔、山羊、绵羊、小鼠、大鼠、豚鼠、猫、狗、 马和鸡等。
本文使用的“向受试对象施用”是向受试对象同时或分别引入或施用 一种或多种递送药剂和/或大核酸分子的操作，以使存在于受试对象体内 的靶细胞最终能与所述药剂和/或大核酸分子接触。
本文使用的“靶向递送载体”或“靶向递送媒介物”是指携带外源核酸 分子并将其转运至靶细胞或靶组织的病毒和非病毒颗粒。病毒载体包括 但不限于逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒。非病毒载体包括但不限于 微粒、纳米颗粒、病毒体和脂质体。本文使用的“靶向”是指利用与递送 载体结合的配体将载体导向至细胞或组织。配体包括但不限于抗体、受 体和胶原结合结构域。
本文使用的“递送”可与“转导”交换使用，是指将外源核酸分子转移 至细胞以使其位于细胞内部的过程。核酸递送是不同于核酸表达的一个 过程。
本文使用的“多克隆位点(MCS)”是质粒中含有多个限制性酶切位点 的核酸区域，每个位点都可与标准重组技术结合使用，以消化该载体。 “限制性酶切”是指用仅在核酸分子的特定部位处起作用的酶催化切割核 酸分子。许多限制性酶都可作为商品获得。本领域技术人员普遍掌握这 些酶的使用。通常，用在MCS内酶切的限制性酶将载体线性化或片段 化，使得外源序列能够与该载体连接。
本文使用的“复制起点”(常称作″ori″)是一段特殊的核酸序列，复 制从此处起始。可选地，如果宿主细胞为酵母，则可使用自主复制序列 (ARS)。
本文使用的“选择性标记或可筛选标记”将可被鉴别的变化赋予细 胞，从而允许容易地鉴别出含有表达载体的细胞。通常，选择性标记提 供允许进行选择的特性。阳性选择性标记是当标记存在时允许其选择， 而阴性选择性标记是当标记存在时阻止其选择。阳性选择性标记的实例 是抗药性标记。
通常包含药物选择标记有助于转化体的克隆和鉴定，例如，提供新 霉素、嘌呤霉素、潮霉素、DHFR、GPT、zeocin和组氨醇抗性的基因是 有用的选择性标记。除了提供允许基于条件实现鉴别转化体的表型的标 记以外，也考虑其他类型的标记，包括可筛选的标记如GFP，其基础是 量热分析。或者，可以使用可筛选的酶，例如单纯疱疹病毒胸苷激酶(tk) 或氯霉素乙酰转移酶(CAT)。本领域技术人员还清楚如何使用免疫标记， 可能需与FACS分析结合使用。据认为使用的标记并不重要，只要能够 与编码基因产物的核酸同时表达即可。更多的选择性标记和可筛选标记 的实例为本领域技术人员所熟知。
术语“转染”用于表示细胞吸收外来DNA。当外源DNA被引入细胞 膜内部时，该细胞即被“转染”了。许多转染技术为本领域所公知。参见， 例如Graham等人，Virology 52：456(1973)；Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(1989)；Davis等人，Basic Methods in Molecular Biology(1986)；Chu等人，Gene 13：197(1981)。该技术可被用 于向适合的宿主细胞中引进一个或多个外源DNA部分，例如核苷酸整 合载体和其他核酸分子。该术语囊括化学的、电学的和病毒介导的转染 操作。
本文使用的“表达”是指核酸被翻译为肽或转录为RNA的过程，例 如可被翻译为肽、多肽或蛋白质。如果核酸来源于基因组DNA，则在选 择了合适的真核宿主细胞或生物的情形下，表达可包括mRNA剪接。对 于要在宿主细胞中表达的异源核酸，它必须首先被运送至细胞中，一旦 进入细胞将最终存在于细胞核中。
本文使用的“应用于受试对象”是存在于受试对象体内的靶细胞最终 接触能量例如超声波或电能的过程。可通过任意施加能量的过程进行应 用。
术语“宿主细胞”表示，例如微生物、酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动 物细胞，它们能够用作或已被用作多重构建体的受者以生产靶向递送载 体。该术语包括已被转染的原代细胞的后代。因此，本文使用的“宿主细 胞”主要是指已用外源DNA序列转染的细胞。应理解由于天然的、偶然 的或有意的突变，单亲本细胞的后代在形态学上或其基因组或总DNA 补体上不一定与原始亲本完全相同。
本文使用的“基因治疗”涉及将异源DNA转移至患有治疗或诊断针 对的病症或疾病的哺乳动物特别是人的部分细胞、靶细胞。将DNA以 某种方式引入所选的靶细胞中，使得异源DNA表达，因而产生其编码 的治疗性产物。可选地，异源DNA可以以某种方式介导编码治疗性产 物的DNA的表达，它可编码一种产物，例如肽或RNA，该产物以某种 方式直接或间接地介导治疗性产物的表达。基因治疗也可用于运送编码 基因产物的核酸替换有缺陷的基因或补充由被引入的哺乳动物或细胞 产生的基因产物。被引入的核酸可编码治疗性化合物，例如生长因子或 其抑制剂，或者肿瘤坏死因子或其抑制剂，如它的受体，正常情况下这 些化合物在哺乳动物宿主体内不产生，或者不能以治疗性有效量产生， 或不在治疗有用的时间产生。编码治疗性产物的异源DNA可在引入患 病宿主的细胞之前进行修饰，以增强或者改变产物或其表达。
本文使用的“异源核酸序列”通常是指这样的DNA，该DNA编码通 常不能由表达它们的细胞在体内产生的RNA和蛋白质，或者介导或编 码通过影响转录、翻译或其他可调节的生化过程而改变内源DNA表达 的介质。异源核酸序列还可称为外来DNA。本文的异源DNA包括本领 域技术人员认为其相对于表达该DNA的细胞为异源或外源的任何 DNA。异源DNA的实例包括但不限于编码可示踪标记蛋白质如提供抗 药性的蛋白质的DNA、编码治疗有效性物质如抗癌药、酶和激素的 DNA、和编码其他类型蛋白质如抗体的DNA。由异源DNA编码的抗体 可由异源DNA所导入的细胞分泌或在其表面上表达。
质粒
本文披露的质粒用于转染和制备靶向递送载体供治疗和诊断过程 使用。一般而言，该质粒提供编码本文披露的靶向载体的病毒或非病毒 元件的核酸序列。该质粒包括编码例如经修饰包含胶原结合结构域的 4070A双嗜性包膜蛋白的核酸序列。其他质粒可包括与启动子有效连接 的核酸序列。该序列通常编码病毒gag-pol多肽。质粒还包括与启动子 有效连接的核酸序列，以及编码给生产细胞提供抗药性的多肽的序列。 也包括复制起点。其他质粒可包括编码诊断性或治疗性多肽的异源核酸 序列、5′和3′长末端重复序列；ψ逆转录病毒包装序列、位于5′LTR 上游的CMV启动子、与启动子有效连接的核酸序列和SV40复制起点。
异源核酸序列通常编码诊断性或治疗性多肽。在特定实施方式中， 治疗性多肽或蛋白质是一种“自杀蛋白”，可通过其自身或在其他化合物 存在下引起细胞死亡。这种自杀蛋白的一个代表性实例是单纯疱疹病毒 胸苷激酶。其他实例包括水痘-带状疱疹病毒胸苷激酶、细菌基因胞嘧啶 脱氨酶(将5-氟胞嘧啶转化为高毒性化合物5-氟尿嘧啶)、p450氧化还 原酶、羧肽酶G2、β-葡糖醛酸糖苷酶、青霉素-V-酰胺酶、青霉素-G-酰 胺酶、β-内酰胺酶、硝基还原酶、羧肽酶A、亚麻苦苷酶(也称作β-葡 萄糖苷酶)、大肠杆菌gpt基因和大肠杆菌Deo基因，但是其他实例也是 本领域所公知的。在部分实施方式中，自杀蛋白将前药转化为毒性化合 物。本文使用的“前药”意指在本发明方法中有用的、能被转化为毒性产 物(即对肿瘤细胞具有毒性)的任意化合物。前药被自杀蛋白转化为毒 性产物。该前药的代表性实例包括：针对胸苷激酶的更昔洛韦、阿昔洛 韦和FIAU(1-(2-脱氧-2-氟-β-D-阿糖呋喃糖基)-5-碘尿嘧啶)；针对氧化还 原酶的异环磷酰胺；针对VZV-TK的6-甲氧嘌呤阿糖胞苷；针对胞嘧啶 脱氨酶的5-氟胞嘧啶；针对β-葡糖醛酸糖苷酶的多柔比星；针对硝基还 原酶的CB 1954和呋喃西林；和针对羧肽酶A的N-(氰基乙酰基)-L-苯 丙氨酸或N-(3-氯丙酰基)-L-苯丙氨酸。本领域普通技术人员可容易地进 行前药给药。本领域普通技术人员还能容易地确定前药的最佳给药剂量 和途径。
在部分实施方式中，治疗性蛋白质或多肽是癌症抑制剂，例如p53 或Rb，或编码该蛋白质或多肽的核酸。当然，技术人员了解大批这样的 癌症抑制剂，并且知道如何获得它们和/或其编码核酸。
治疗性蛋白质或多肽的其他实例包括促凋亡的治疗性蛋白质和多 肽，例如p15、p16或p21WAF-1。
细胞因子和编码它的核酸也可用作治疗性蛋白质和多肽。其实例包 括：GM-CSF(粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)；TNF-α(肿瘤坏死因子 α)；干扰素，包括但不限于IFN-α和IFN-γ；以及白介素，包括但不限 于白介素1(IL1)、白介素β(IL-β)、白介素2(IL2)、白介素4(IL4)、白 介素5(IL5)、白介素6(IL6)、白介素8(IL8)、白介素10(IL10)、白 介素12(IL12)、白介素13(IL13)、白介素14(IL14)、白介素15(IL15)、 白介素16(IL16)、白介素18(IL18)、白介素23(IL23)、白介素24 (IL24)，但是本领域中也了解其他实施方案。
杀细胞基因的其他实例包括但不限于突变细胞周期蛋白G1基因。 举例来说，杀细胞基因可以是细胞周期蛋白G1的显性阴性突变体(如 WO/01/64870所述)。
在以前，逆转录病毒载体(RV)构建体一般是通过将两个独立的逆 转录病毒(RV)质粒克隆并融合而制备的：一个包含逆转录病毒LTR、 包装序列和相应的目的基因；另一个逆转录病毒载体包含强启动子(如 CMV)以及一组外来的功能性序列。本文披露的pC-REX II(e-REX)载 体是指一种改良质粒，其包含在原始质粒中插入的一组独特克隆位点， 以促进试验基因的定向克隆。在质粒骨架中使用强启动子(如CMV)， 以增加在受者生产细胞内产生的信使RNA的量，但其自身不被包装到 逆转录病毒颗粒中，而是位于基因侧翼的逆转录病毒LTR之外。
因此，改良质粒设计为将强CMV启动子(通过PCR获得)包括在 GlxSvNa载体(该载体以前被FDA批准用于人体)中的关键部位内， 从而消除了对已报道的载体的质粒大小和序列方面的担心。该改良构建 体被命名为pC-REX。PC-REX再经进一步修饰，引入一系列独特克隆 位点(见图14，pC-REX II中的MCS)，以便能够定向克隆和/或插入多 基因及辅助功能性结构域。因此，新质粒被命名为pC-REX和pC-REX II(EPEIUS-REX或eREX)。pC-REX质粒设计(见图11A)在直接并列 对比中胜过pHIT-112/pREX。新质粒还经进一步修饰以包括各种治疗活 性多肽的编码序列。在一个实施例中，包含显性阴性细胞周期蛋白G1 (dnG1)(见图11B)作为治疗基因。三重病毒颗粒(env、gag-pol和dnG1载 体构建体)在临床试验的公开报道中统称为REXIN-GTM。REXIN-G表 示已被包装、包壳和包膜在可注射靶向病毒颗粒中的靶向递送载体 dnG1/C-REX。
有复制能力的逆转录病毒不太可能出现在瞬时质粒共转染系统，例 如用于Rexin-G制备的系统中，因为鼠源逆转录病毒包膜构建体、包装 构建体gag pol和逆转录载体是在独立的质粒中表达，各由自身的启动子 驱动。此外，人生产细胞也被用于生产病毒体。人细胞不含能与Rexin-G 中使用的鼠源逆转录载体重组的内源性鼠序列。近期对REX1N-G制备 做了一些改进，目的是进一步减少产生有复制能力的逆转录病毒的可能 性。质粒dnG1/C-REX包含残留的gag-pol序列，这些序列可能与各 gag-pol构建体中含有的5′DNA序列重叠。因此，从亲本dnG1/C-REX 质粒中去除487个碱基对，再插入97个碱基对的剪接受体位点，得到 pdnG1/UBER-REX(图21A)。
本文披露的质粒中包括靶向配体。通常，该配体被插入由质粒核酸 序列编码的逆转录病毒包膜的天然(即未修饰的)受体结合区域的两个 连续编号氨基酸残基之间，例如修饰的双嗜性CAE包膜多肽中，其中 靶向多肽被插入氨基酸残基6和7之间。该多肽是被称作gp70的蛋白 质的一部分，后者包含于莫洛尼鼠白血病病毒的双嗜性包膜中。一般而 言，靶向多肽包括结合细胞外基质成分的结合部位，该成分包括但不限 于胶原(包括I型胶原和IV型胶原)、层粘连蛋白、纤连蛋白、弹性蛋 白、糖胺聚糖、蛋白聚糖及结合纤连蛋白的序列，如精氨酸-甘氨酸-天 冬氨酸或RGD序列。可包含在靶向多肽中的结合区域包括但不限于属 于冯维勒布兰德因子及其衍生物内的功能性结构域的多肽结构域，其中 该多肽结构域可与胶原结合。在一种实施方式中，该结合结构域为具有 以下结构式的多肽：Trp-Arg-Glu-Pro-Ser-Phe-Met-Ala-Leu-Ser。
制备靶向载体的方法
本公开内容涉及病毒和非病毒载体颗粒的制备，包括逆转录病毒载 体颗粒、腺病毒载体颗粒、腺相关病毒载体颗粒、疱疹病毒载体颗粒、 假型病毒，以及具有修饰的或靶向的病毒表面蛋白的非病毒载体，例如 靶向病毒包膜多肽，其中该修饰病毒表面蛋白，如修饰病毒包膜多肽， 包括靶向多肽，该多肽包含结合细胞外基质成分如胶原的结合区域。靶 向多肽可被置于病毒表面蛋白的两个连续氨基酸残基之间，或者可以替 换已从病毒表面蛋白中去除的氨基酸残基。
进行基因治疗的最常用的递送系统之一包括病毒载体，最为常用的 是腺病毒和逆转录病毒载体。基于病毒的载体的例子包括但不限于重组 逆转录病毒(参见，例如WO 90/07936；WO 94/03622；WO 93/25698；WO 93/25234；美国专利No.5,219,740；WO 93/11230；WO 93/10218；美国专 利No.4,777,127；英国专利No.2,200,651；EP 0 345 242；和WO 91/02805)、基于α病毒的载体(例如辛德毕斯病毒载体、塞姆利基森林 病毒(ATCC VR-67；ATCC VR-1247)、罗斯河病毒(ATCC VR-373；ATCC VR-1246)和委内瑞拉马脑炎病毒(ATCC VR-923；ATCC VR-1250；ATCC VR 1249；ATCC VR-532))和腺相关病毒(AAV)载体(参见，例如WO 94/12649，WO 93/03769；WO 93/19191；WO 94/28938；WO 95/11984和 WO 95/00655)。还可使用Curiel，Hum.Gene Ther.(1992)3：147中描述的 与杀死的腺病毒相连的DNA。
为达到基因递送目的，病毒颗粒可由天然针对靶细胞的病毒或非天 然针对靶细胞的病毒发展而来。通常，与天然病毒载体相比，更希望采 用非天然病毒载体。尽管天然病毒载体可能具有对靶细胞的天然亲和 力，然而由于其更有可能在靶细胞中增殖，因此这种病毒会带来较大风 险。在这点上，并非天然设计为在人细胞中增殖的动物病毒载体可用于 针对人细胞进行基因递送。然而为了获得足够产量的这种动物病毒载体 用于基因递送，需要在天然的动物包装细胞中进行生产。这样产生的病 毒载体常常缺乏任何作为包膜部分或衣壳部分的成分，这些成分能提供 对人细胞的趋向性。例如，非人类病毒载体，如亲嗜性小鼠(鼠)逆转 录病毒，像MMLV，当前是在小鼠包装细胞系中制备的。必须提供另一 种人细胞趋向性所需的成分。
一般而言，病毒载体的增殖(无辅助病毒)在包装细胞中进行，其 中包装成分的核酸序列被稳定整合到细胞基因组中，编码病毒核酸的核 酸也被引入该细胞系中。现有的包装系生产的生产克隆滴度足够转导人 细胞供基因治疗应用，并已开始进行人体临床试验。然而这些包装系仍 有两方面的不足。
首先，设计用于特定用途的合适的逆转录病毒载体需要构建并试验 数个载体配置。例如，Belmont等人Molec.and Cell.Biol.8(12)：5116-5125 (1988)，为了鉴定既能够产生最高滴度生产细胞又能够获得最佳表达的 载体，由16个逆转录病毒载体构建了稳定的生产细胞系。部分检验过 的配置包括：(1)LTR驱动的表达对比内部启动子；(2)选择来源于病毒 或细胞基因的内部启动子；和(3)选择性标记是否被整合到构建体中。提 供快速高滴度病毒生产而不需生产稳定生产细胞系的包装系统将具有 明显优势，因为这可节省鉴定来源于多个构建体的高滴度生产细胞克隆 所需的大约两个月的时间。
其次，与NIH 3T3细胞相比，高滴度双嗜性逆转录病毒生产载体对 原代培养的哺乳动物体细胞的感染效率变化很大。已经证实小鼠肌原细 胞(Dhawan等人，Science 254：1509-1512(1991)或大鼠毛细血管内皮细胞 (Yao等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：8101-8105(1991))与NIH 3T3细 胞的转导效率大致相当，而犬肝细胞(Armentano等人，Proc.Natl.Acad. Sci.USA 87：6141-6145(199))的转导效率却仅为NIH 3T3细胞的25％。 相比NIH 3T3细胞，从外周血淋巴细胞分离得到的原代人肿瘤浸润淋巴 细胞(“TIL”)、人CD4+和CD8+T细胞以及灵长类长期重建造血干细胞 代表了低转导效率的极端实例。曾报道纯化的人CD4+和CD8+T细胞 有时被稳定生产克隆上清液感染的水平为6％-9％(Morecki等人，Cancer Immunol.Immunother.32：342-352(1991))。如果逆转录病毒载体含有 neoR基因，经G418选择可得到高度富集的转导细胞群。然而发现选择 性标记的表达对体内造血干细胞中的长期基因表达具有不利作用 (Apperly等人Blood 78：310-317(1991))。
为克服这些局限性，提供了用于新型瞬时转染包装系统的方法和组 合物。逆转录病毒载体的设计改良使得能够：(1)代替现有技术下繁杂的 质粒克隆和融合操作，(2)提供单一直线质粒构建体，避免了可能影响试 剂获得监管部门(即FDA)批准的亲本构建体的过度融合与突变，(3) 除去获得的逆转录病毒载体中冗长的、不起作用的和/或不需要的序列， (4)选择治疗性基因构建体并将其定向克隆至逆转录病毒载体的灵活性 增加，(5)简化逆转录病毒载体内各种辅助结构域的分子克隆，(6)引入关 键性修饰提高亲本质粒在载体生产细胞中的性能，从而增加所得逆转录 病毒载体产物的效力，(7)显著减小逆转录病毒载体构建体的总尺寸至一 定程度，以使质粒产量从生物发酵中的“低拷贝，低产量”反应物提高至 中等产量。总之，这些改良保持了目前使用的逆转录病毒载体的优点(在 载体安全性、基因整合和基因表达方面)，同时还对期望用于人体基因 治疗的逆转录病毒载体的结构、确认、生产和性能提供了重要改进。这 代表了第二代TDS组件，包括高效逆转录病毒表达载体，命名为C-REX 载体。
瞬时转染相比包装细胞方法具有许多优势。在这点上，瞬时转染避 免了生产稳定产载体细胞系所需的较长时间，可在载体基因组或逆转录 病毒包装组分对细胞有毒性作用时使用。如果载体基因组编码毒性基因 或干扰宿主细胞复制的基因，例如细胞周期抑制基因或诱导凋亡的基 因，可能会难以产生稳定的产载体细胞系，但可采用瞬时转染在细胞死 亡前产生载体。也利用瞬时感染开发了可产生与稳定的产载体细胞系相 当的滴度水平的细胞系(Pear等人1993，PNAS 90：8392-8396)。
提供了一种大规模生产高滴度和高生物活性的带有杀细胞基因构 建体的逆转录病毒载体原种的高效生产方法。该生产方法描述了对瞬时 转染的293T生产细胞的使用；生产细胞放大的工程方法；和产生保持 杀细胞基因高保真表达的逆转录病毒载体的瞬时转染操作。
在另一种实施方式中，提供了一个用于生产临床用逆转录病毒载体 的完全验证的293T(用SV40大T转化的人胚肾细胞)原始细胞库。尽管 293T细胞已用于生产少量中、高滴度载体原种供实验室使用，但尚无报 道该生产细胞可用于临床载体原种的大规模生产。美国FDA严格控制 和限制可转移完整癌基因的载体在临床产品中的应用。本生产方法在最 终的载体收获与采集步骤中结合了一种不会引起载体效力降低的DNA 降解方法。在另一种实施方式中，提供了一种将用于持续生产临床用载 体产品的逆转录病毒载体原种浓缩到109cfu/ml的方法。临床产品的最 终制剂包括用于收获、采集和保存高滴度临床用载体原种的化学成分确 定的无血清溶液。
在另一种实施方式中，提供了一种采集临床用载体的方法，该方法 采用闭环多管系统保持无菌性、进行质控样品采样并简化最终填充步 骤。闭环多管组合装置(参见图19A和19B)设计为满足收集临床用产 品所需的规范要求，即在采样、采集、浓缩和最终填充过程中保持无菌 性，该装置尚未商品化。本文披露的用于病毒颗粒采集、浓缩和保存的 闭环多管组合装置包括用Stedim 71薄膜制造的flexboy袋和多管系统； 由醋酸乙烯乙酯(EVA)液体接触层、乙基乙烯醇(EVOH)阻气层和EVA外 层组成的3层复合薄膜。薄膜总厚度为300毫米。EVA是惰性非PVC 材质薄膜，不需要添加增塑剂，因此可萃取物保持最少。Stem已进行了 广泛的生物相容性试验并且FDA建立了该产品的药品管理档案。薄膜 和进料管符合美国药典VI级要求。所有袋的定制生产在Stedim的10,000 控制级生产环境中完成。薄膜、管道和所有使用部件的γ射线相容性达 45kGy。进行γ照射，最低照射量为25kGy，最高照射量为45kGy。产 品合格证由Stedim及其合同消毒公司提供。
将临床用载体以150ml体积装入500ml冷冻袋中于-80℃冻存。完全 验证的产品的病毒滴度为每毫升3×107集落形成单位，生物效力为对人 乳腺癌、结肠癌和胰腺癌细胞的生长抑制活性达65-70％，均匀颗粒大小 为大约100nm，并且没有病毒聚集，DNA残留低于550bp，表明无完 整癌基因，无可检测到的E1A或SV40大T抗原，在印度侏儒小鼠(mus Dunni)和人293细胞中5次传代中未检测到有复制能力的逆转录病毒 (RCR)。产品为无菌的，其内毒素水平＜0.3EU/ml，生产结束时细胞无 支原体及其他外来病毒。
将采用新pB-RVE和pdnG1/UBER-REX质粒生产的Rexin-G以 20-40ml体积装入150ml塑料冷冻袋中于-70±10℃冻存。临床批次的滴 度范围是0.5-5.0×109单位(U)/ml，每个批次经验证均没有有复制能力 的逆转录病毒(RCR)，并且具有供人体系统使用所需的纯度、生物效 力、无菌性和全面安全性。
病毒包膜包括靶向配体，后者包括但不限于可与纤连蛋白结合的精 氨酸-甘氨酸-天冬氨酸或RGD序列，以及也可与纤连蛋白结合的具有 Gly-Gly-Trp-Ser-His-Trp序列的多肽。除了结合区域以外，靶向多肽还可 包括位于结合区域N末端和/或C末端的一个或多个氨基酸残基的连接 序列，该连接体可增加旋转灵活性和/或使修饰包膜多肽的位阻最小化。 多核苷酸可通过本领域技术人员公知的基因工程技术进行构建。
因此，依照本发明制备的靶向递送载体包含与其相关的、能够促进 载体在靶标部位聚集的配体，即靶标特异性配体。配体为化学部分，例 如分子、官能团及其片段，它对选择的靶标具有特异性反应性，而对其 他靶标的反应性较低，因而使靶向递送载体具有能够将编码治疗性或诊 断性多肽的核酸选择性地转移到接近所选靶标的细胞中的优点。具有“反 应性”是指对细胞或组织具有结合亲和力或者能够被内化到细胞内，其中 结合亲和力可通过本领域已知的任意方法检测，例如通过任意标准体外 检测法如ELISA、流式细胞术、免疫细胞化学法、表面等离子共振技术 等。通常配体结合特定分子部分-表位，例如分子、官能团或与细胞或 组织结合的分子复合物，形成具有两个成员的结合对。应知道在结合对 中，任一成员可为配体，同时另一个为表位。该结合对为本领域所公知。 结合对的例子有抗体-抗原、激素-受体、酶-底物、营养成分(如维 生素)-转运蛋白、生长因子-生长因子受体、碳水化合物-凝集素和 具有互补序列的两个多肽。配体的片段只要保留结合适当细胞表面表位 的能力，则可被看作是配体并可用于本发明。优选地，配体是包含免疫 球蛋白的抗原结合序列的蛋白质和肽类。更为优选地，配体是缺乏Fc 序列的抗原结合抗体片段。这样的优选配体有免疫球蛋白Fab片段、免 疫球蛋白F(ab)2片段、Fv抗体片段或单链Fv抗体片段。这些片段可通 过酶法产生或重组制备。在其功能方面，配体优选为可内化配体，即， 例如通过细胞内吞过程可被所选细胞内化的配体。同样地，发生替换或 其他变化但仍保留表位结合能力的配体也可使用。优先选择识别病理性 细胞，例如恶性细胞或病原体的配体。例如，结合暴露胶原的配体能够 将载体靶向至受试对象含恶性组织的区域。通常，细胞转移至机体另一 区域是通过侵袭和破坏健康组织而实现的。这种侵袭会导致胶原暴露， 暴露的胶原能够被本文所提供的载体靶向。
可用于靶向载体的另一类配体是能够与在许多肿瘤细胞表面过度 表达的酪氨酸激酶生长因子受体形成结合对的配体。酪氨酸激酶生长因 子受体的例子有VEGF受体、FGF受体、PDGF受体、IGF受体、EGF 受体、TGF-α受体、TGF-β受体、HB-EGF受体、ErbB2受体、ErbB3 受体和ErbB4受体。EGF受体vIII和ErbB2(HEr2)受体尤其优选在采 用插入物(INSERTS)治疗癌症的情形下使用，因为这些受体对于恶性 细胞有更高的特异性，而很少出现于正常细胞上。可选地，选择的配体 识别需要通过引入有利基因进行遗传校正或遗传改造的细胞，例如有遗 传缺陷机体的肝细胞、上皮细胞、内分泌细胞，体外的胚胎细胞、胚细 胞、干细胞、生殖细胞、杂交细胞、植物细胞或任何用于工业过程的细 胞。
配体可以在病毒颗粒表面上表达或通过任意本领域已有的适宜方 法附着于非病毒颗粒上。附着可以是共价的或非共价的，例如通过吸附 或形成复合物。附着优选涉及能够通过形成共价键或非共价键与配体偶 联的亲脂性分子部分，其被称作“锚”。锚对亲脂性环境具有亲和力，例 如类脂微泡、双层和其他浓缩相，因此可将配体附着于脂质-核酸微粒 上。通过亲脂性锚的配体附着方法为本领域所公知。(参见，例如，F. Schuber，″Chemistry of ligand-coupling to liposomes″，在Liposomes as Tools for Basic Research and Industry中，由J.R.Philippot和F.Schuber 编辑，CRC Press，Boca Raton，1995，p.21-37)。
应认识到本文披露的靶向递送载体包括病毒颗粒和非病毒颗粒。非 病毒颗粒包括脂双层中的包封核蛋白，包括全部或部分组装的病毒颗 粒。将病毒包装进脂双层的方法为本领域所公知。方法包括被动捕获至 脂双层包裹的囊泡(脂质体)中，并将病毒体与脂质体孵育(美国专利 No.5,962,429；Fasbender等人，J.Biol.Chem.272：6479-6489；Hodgson和 Solaiman，Nature Biotechnology 14：339-342(1996))。不被理论所束缚，我 们认为暴露于病毒体表面的酸性蛋白质提供了与靶向递送载体的阳离 子脂质/阳离子聚合物成分发生络合的界面，并作为“支架”供中性脂质成 分形成双层。病毒的典型类型包括腺病毒、逆转录病毒、疱疹病毒、慢 病毒和噬菌体。
非病毒递送系统，如微粒或纳米颗粒，包括例如阳离子脂质体和聚 阳离子，提供了递送系统的备选方法，也包括在本公开内容中。
非病毒递送系统的实例包括，例如Wheeler等人的美国专利No. 5,976,567和5,981,501。这些专利披露了通过将含有阳离子和非阳离子 脂质的有机溶液与质粒的水溶液接触而制备血清稳定的质粒-脂质颗 粒。Thierry等人的美国专利No.6,096,335披露了包含整体阴离子生物活 性物质、阳离子组份和阴离子组份的复合物的制备。Allen和Stuart的 PCT/US98/12937(WO 98/58630)披露了在适合阳离子脂质溶解的脂溶剂 中形成多核苷酸-阳离子脂质颗粒、向含颗粒的溶剂中加入中性成囊泡 脂质、蒸发脂溶剂以形成其内包埋有多核苷酸的脂质体。Allen和Stuart 的美国专利No.6,120,798披露了多核苷酸-脂质微粒的形成，包括将多 核苷酸溶于第一溶剂(如水性溶剂)、将脂质溶于不与所述第一溶剂混 溶的第二溶剂(如有机溶剂)、加入第三溶剂形成单一相、再加入一定 量的第一和第二溶剂形成两个脂质相。Bally等人的美国专利No. 5,705,385和Zhang等人的美国专利No.6,110,745披露了制备脂质-核酸 颗粒的方法，包括用含非阳离子脂质和阳离子脂质的溶液与核酸接触而 形成脂质-核酸混合物。Maurer等人的PCT/CA00/00843(WO 01/06574) 披露了制备带电荷治疗药剂的全脂质包裹治疗药物颗粒的方法，包括在 去稳定溶剂中将形成的脂囊泡、带电荷治疗药剂和去稳定剂相混合形成 混合物，去稳定溶剂使囊泡去稳定，但不会破坏囊泡，之后再去除去稳 定剂。
成颗粒组份(“PFC”)一般包括脂质如阳离子脂质，任选与除阳离子脂 质以外的PFC联用。阳离子脂质是其分子能够电离产生净正离子电荷的 脂质，pH范围为约3-约10，优选约4-约9的生理pH范围。该阳离子脂 质包括例如阳离子去污剂，如具有单烃链的阳离子两亲化合物。专利和 科学文献中描述了大量具备促核酸转染性质的阳离子脂质。这些促转染 的阳离子脂质包括但不限于例如：1，2-二油基氧-3-(N，N，N-三甲基铵基) 氯化丙烷-，DOTMA(美国专利No.4,897,355)；DOSPA(参见 Hawley-Nelson等人，Focus 15(3)：73(1993))；N，N-双十八烷基-N，N-二甲 基-溴化铵或DDAB(美国专利No.5,279,833)；1，2-二油基氧-3-(N，N，N-三 甲基铵基)氯化丙烷-DOTAP(Stamatatos等人，Biochemistry 27：3917-3925 (1988)；基于甘油的脂质(参见Leventis等人，Biochem.Biophys.Acta 1023：124(1990)；精氨酰-PE(美国专利No.5,980,935)；赖氨酰-PE (Puyal等人J.Biochem.228：697(1995))、脂多胺(美国专利No.5,171,678) 和基于胆固醇的脂质(WO 93/05162，美国专利No.5,283,185)；CHIM (1-(3-胆固醇基)-氧基羰基-氨甲基咪唑)等等。已有对转染用阳离子脂质 的综述，例如：Behr，Bioconjugate Chemistry，5：382-389(1994)。优选的 阳离子脂质有DDAB、CHIM或二者的联用。阳离子脂质的实例有阳离 子去污剂，包括(C12-C18)-烷基-和(C12-C18)-烯基-三甲铵盐、N-(C12- -C18)-烷基-和N-(C12-C18)-烯基-吡啶盐等等。
根据本发明制备的靶向递送载体的大小在约40nm至约1500nm的 范围内，优选范围为约50-500nm，最优选为约20-150nm。选择该尺寸 有利于靶向递送载体在向机体施用后穿透血管进入患病组织如恶性肿 瘤，并将治疗性核酸转移至此。靶向递送载体的一个特有的和有利的性 质是在细胞外生物液体如体外细胞培养基或血浆存在下其大小基本不 会增加(例如经动态光散射方法测定)。
可选地，如Culver等人(1992)Science 256，1550-1552所述，可将严 生逆转录病毒的细胞注射到肿瘤中。所引入的产生逆转录病毒的细胞构 建为可活跃地产生靶向递送载体如病毒载体颗粒，由此在肿瘤块中原位 发生载体持续产生。因此，若与产生逆转录病毒载体的细胞相混合，可 在体内成功转导增殖的肿瘤细胞。
治疗方法
本发明的靶向载体也可作为基因治疗方案的一部分用于递送编码 治疗剂如突变细胞周期蛋白G多肽的核酸。因此，本发明另一方面提供 用于在体内或体外将治疗剂转染至受试对象含有转移性肿瘤疾病相关 细胞型的部位的表达载体。本文提供的靶向载体意图用作基因治疗的载 体。可用突变细胞周期蛋白G多肽和核酸分子代替其他靶向载体中的相 应基因。可选地，本文披露的靶向载体(如包含胶原结合结构域的靶向 载体)可包含编码任意治疗剂(如胸苷激酶)的核酸。更希望的是用于 治疗肿瘤性疾病的治疗剂。
本研究提供了来自人体内临床试验的数据。然而，本文披露的靶向 载体的其他毒性和治疗有效性可通过标准药学方法由细胞培养或实验 性动物来确定，例如确定LDS50(50％群体致死的剂量)和ED50(50％ 群体治疗有效的剂量)。治疗指数是毒性与疗效的剂量比，可表示为 LD50/ED50。优选治疗指数大的剂量。在本发明中，可以采用正常情况下 会表现出毒性副作用的剂量，因为递送系统设计为靶向治疗部位，以使 对未受处理细胞的损伤最小化并减少副作用。
人体临床试验(见下)所得数据证实本发明的靶向载体在体内发挥 了抑制肿瘤性疾病进展的功能。表1中的数据提供了向患者施用该载体 的治疗方案。此外，采用靶向载体替代形式(如替代的靶向机制或替代 的治疗剂)进行的细胞培养试验和动物实验所得数据可用于配制一定范 围的剂量供人体使用。剂量优选地处于具有极低毒性或无毒性的、包括 ED50值的循环浓度范围内。在该范围内剂量可根据使用的剂型及给药 途径而变化。最初，治疗有效剂量可通过细胞培养试验加以估计。剂量 可在动物模型中试验，以达到包含IC50(即试验化合物达到半数最大感染 或半数最大抑制时的浓度)的循环血浆浓度范围(在细胞培养物中测定)。 这些信息可用于更加精准地确定人体使用的有效剂量。血浆水平可通过 例如高效液相色谱法进行测定。
包含靶向递送载体的药物组合物可按任意传统方式将所选数量的 载体与一种或多种生理可接受的载体或赋形剂混合而配制。例如，可将 靶向递送载体混悬于载体如PBS(磷酸盐缓冲液)中。活性化合物可以 液体、半液体或固体形式经任意适宜的途径给药，例如经口、肠胃外、 静脉内、皮内、皮下或局部给药，并按适合各给药途径的方式进行配制。 优选的给药方式包括口服和肠胃外给药方式。
靶向递送载体和生理可接受的盐和溶剂化物可配制为供吸入或吹 入给药(经口或鼻)或者供口服、含服、肠胃外或直肠给药。对于吸入 给药，靶向递送载体可借助适合的喷射剂，例如二氯二氟甲烷、三氯氟 甲烷、氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适的气体，从加压包或喷雾器中 以喷雾剂形式递送。对于加压气雾剂，可通过设置阀门按量递送来确定 剂量单位。例如供吸入器或吹入器使用的明胶的胶囊和盒可以配制为包 含治疗性化合物与适宜粉末基质如乳糖或淀粉的混合粉末。
对于口服给药，药物组合物可采用以下剂型：例如用药学可接受的 赋形剂通过常规方法制备的片剂或胶囊剂，所述赋形剂如粘合剂(例如 预胶化玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；充填剂(例 如乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(例如硬脂酸镁、滑石粉或 二氧化硅)；崩解剂(例如土豆淀粉或羟乙酸淀粉钠)；或湿润剂(例如 十二烷基硫酸钠)。可采用本领域熟知的方法对片剂进行包衣。供口服 给药的液体制剂可采用的形式有例如溶液剂、糖浆剂或混悬剂，或者可 以干产品提供，在临用前与水或其他适合的溶媒配制。该液体制剂可采 用药学可接受的添加剂经常规方法制备，所述添加剂如混悬剂(例如山 梨醇糖浆、纤维素衍生物或氢化食用脂)；乳化剂(例如卵磷脂或阿拉 伯胶)；非水性溶媒(例如杏仁油、油酯、乙醇或分馏植物油)；以及防 腐剂(例如甲基或丙基-对羟基苯甲酸酯或山梨酸)。制剂必要时还可包 含缓冲盐、调味剂、着色剂和甜味剂。
口服给药制剂可经适当配制以实现活性化合物的控制释放。含服给 药的组合物可采用按常规方式配制的片剂或锭剂的形式。
靶向递送载体可制备为用于通过注射例如通过推注或持续输注进 行肠胃外给药。注射制剂可提供为单元剂量形式，例如装于安瓿或多剂 量容器中，并加入防腐剂。组合物可采用在油或水性载体中的混悬剂、 溶液剂或乳剂的形式，并且可包含配制试剂如混悬剂、稳定剂和/或分散 剂。可选地，活性成分可以是冻干粉形式，临用前用适当的溶媒例如无 菌无热原水配制。
除上述制剂外，靶向递送载体还可制成储库型(depot)制剂。该长 效制剂可通过植入(例如经皮下或肌内)或肌内注射给药。因此，例如， 治疗性化合物可采用适宜的聚合物或疏水性材料(例如作为在可接受的 油中的乳剂)或离子交换树脂制备，或制备为微溶性衍生物如微溶性盐。
活性剂可制备为凝胶剂、乳膏剂和洗剂形式，供局部或表面应用， 例如供皮肤和粘膜(如眼内)表面使用，以及供眼部应用或者供脑池内 或脊柱内应用。这种溶液，特别是打算供眼部使用的溶液，可采用适宜 的盐配制为pH约5-7的0.01％-10％等渗溶液。化合物可制成气雾剂供 局部应用，例如吸入。
药物组合物中活性化合物的浓度取决于活性化合物的吸收、失活和 排泄速度、剂量日程和给药量以及本领域技术人员公知的其他因素。例 如，给药量应足以治疗高血压症状。
组合物可根据需要装入包装或分配装置中，其中可包含有一个或多 个含活性成分的单元剂量形式。包装包括例如金属的或塑料薄膜，例如 泡包装(blister pack)。包装或分配装置可附给药说明书。
活性剂可以包装为一种产品，该产品包含包装材料、其中提供的药 剂以及标明该药剂的适应症的标签。
包含细胞因子基因的靶向逆转录病毒颗粒可单独给药或与其他治 疗性处置或活性剂联用。例如，包含细胞因子基因的靶向逆转录病毒颗 粒可与包含杀细胞基因的靶向逆转录病毒颗粒联合给药。包含杀细胞基 因的靶向逆转录病毒颗粒的给药量将根据本文上述的病毒颗粒滴度而 定。例如，如果包含细胞因子基因的靶向逆转录病毒颗粒与包含杀细胞 基因的靶向逆转录病毒颗粒联合给药，则每个载体的逆转录病毒颗粒滴 度应低于各载体单独使用时的滴度。包含细胞因子基因的靶向逆转录病 毒颗粒可与包含杀细胞基因的靶向逆转录病毒颗粒同时给药或分开给 药。
本发明方法还涉及通过施用靶向逆转录病毒颗粒(例如，表达细胞 因子的靶向逆转录病毒载体，其单独使用或与表达杀细胞基因的靶向逆 转录病毒载体联用)与一种或多种其他活性剂治疗癌症的方法。可能使 用的其他活性剂的实例包括但不限于化疗药剂、抗炎症药剂、蛋白酶抑 制剂如HIV蛋白酶抑制剂、核苷酸类似物如AZT。一种或多种活性剂可 与另外一种或多种活性剂同时或分开给药(例如，在施用靶向逆转录病 毒颗粒之前或之后)。本领域技术人员会理解靶向逆转录病毒颗粒给药 途径可与一种或多种药剂给药途径相同(例如，靶向逆转录病毒颗粒与 药剂均采取静脉内给药)或不同(例如，靶向逆转录病毒颗粒为静脉内 给药，而一种或多种药剂则为口服给药)。
有多种方法可确定向需要治疗的受试对象施用的靶向逆转录病毒 颗粒的有效量或治疗有效量。例如，可根据病毒滴度或在动物模型中的 效力确定用量。可选地，临床试验所用的剂量方案可作为一般指导原则。 每日剂量可以单剂量给药或在一天中不同时间分次给药。开始时可能需 要较高剂量，一段时间后当达到最佳初始反应时则可降低剂量。例如， 治疗可连续数天、数周或数年，或者可以间隔进行，其中插入休息期。 根据个体可能接受的其他治疗，其剂量可作相应修改。然而，治疗方法 绝不限于靶向逆转录病毒颗粒的特定浓度或范围，可根据治疗的每个个 体及所使用的各种衍生物而变化。
本领域技术人员会理解，针对给定个体可能需要将剂量个体化，以 获得最佳疗效。本领域技术人员还会了解施用于受治个体的剂量会根据 个体的年龄、疾病严重程度或分期以及对治疗过程的反应而不同。本领 域技术人员将知道为通过本文所述方法治疗的个体评价和确定适当剂 量的临床参数。可用于评价并确定剂量的临床参数包括但不限于肿瘤大 小、用于临床检测特定恶性肿瘤的肿瘤标志物水平改变。根据这些参数， 治疗医师将确定用于给定个体的治疗有效剂量。经治疗医师判断，这种 治疗可以必要地经常进行，并且持续必要的一段时间。
在本研究中，示例性方案针对癌症患者而设计。静脉输注Rexin-G 的患者内剂量递增方案每天进行一次，连续8-10天。该治疗方案结束后 休息一周时间，进行毒性评估；此后，静脉内施用最大耐受剂量的 Rexin-G，持续8-10天。如果在治疗期间患者未出现Rexin-G相关的3 级或4级不良事件，则Rexin-G剂量如下递增：
表1：治疗方案
治疗日 剂量水平 载体剂量/天 第1-6天 (剂量递增方案) I 4.5x109单位 第7-8天 II 9.0x109单位 第9-10天 III 1.4x1010单位 第18-27天 (高剂量方案) III 1.4x1010单位
根据对前两名患者所观察到的安全性，第三名患IVB期胰腺癌伴多 处肝转移患者采用静脉注射Rexin-G进行一线治疗6天，随后进入经菲 律宾食品药物管理局批准的第二个临床治疗方案，施用吉西他滨周剂量 1000mg/m2连续8周。
采用改良pB-RVE和pdnG1/UBER-REX质粒得以生产Rexin-GTM高 效制剂(1-5×109U/ml)。它克服了现有产品输注体积大而致用量限制 的问题，并得以发展了重要的如等价计算定义的剂量密集方案。在癌症 治疗中，影响试验药物有效性的关键因素是肿瘤负荷的程度。试验药物 的安全范围非常窄，因为常常在达到肿瘤控制之前就已出现剂量限制性 毒性。因此，发展能够实际定位于肿瘤负荷而不引起剂量限制性副作用 或器官损害的抗癌药物代表了癌症治疗的重要里程碑和进步。另一个重 要问题是癌症生长的天然动力学，这要求给出适宜的动力学方案。历史 上的肿瘤生长模型现已被认为过度简单化(Heitjan.(1991)Stat.Med. 10：1075-1088，Norton.(2005)Oncologist 10：370-381)，时至今日这些简单 化的模型极大地影响着今天仍在实施的癌症治疗标准的发展；即，联合 使用药物，以及在相等间隔周期中以相等密度用药。尽管对肿瘤皱缩与 预后良好相关的预测是正确的，然而给予传统药物足够长的时间即可根 除肿瘤的预测则被证明是错误的(Norton.(2006)Oncol.4：3637)。对更加 复杂动力学的理解，如Benjamin Gompertz所述并以Norton-Simon模型 使之形式化，考虑了转移动力学及肿瘤负荷与预测转移能力之间的数量 关系。因此，出现了剂量密集化学疗法的概念，该疗法强调能在较短的 时间间隔中引起肿瘤退缩的最佳药物剂量，并且偏重于序贯方法而非联 用法((Norton.(2006)Oncol.4：36-37；Fomier和Norton.(2005)Breast Cancer Res.7：64-69)。此后，大量临床试验提供了支持证据，证明更加 密集地给药在优化杀死癌细胞方面具有显著性差异。
引入亲病灶性纳米颗粒实施靶向基因递送以独特且具有战略意义 的方式开辟了一种全新的治疗转移性癌症的定量方法。本文描述的等价 计算表示在高度压缩的时间段内寻求满足并匹配给定肿瘤负荷的新标 准；换句话说，在量上基于对总肿瘤负荷的最准确估计的剂量密集诱导 方案。等价计算从开始就假定(i)治疗药剂(本文中为Rexin-GTM)充 分定向，足以抵抗生理屏障包括稀释、湍流、流动、扩散屏障、滤过、 灭活和清除的影响，因而能够计算生理性能系数(ф)或生理感染复数 (P-MOI)，(ii)药剂在不引起限定的剂量限制性毒性的水平时是有效的； 以及(iii)能获得足够高浓度的药剂，以允许按个体化剂量经静脉给药 而不引起容量过度负荷。杀细胞性细胞周期蛋白G1构建体的生理性能 系数从4至250变化，并部分取决于药物的滴度(Gordon等人(2000) Cancer Res.60：3343-3347)。为计算Rexin-GTM每日给药的最佳剂量，需 要考虑以下因素：(1)基于放射影像分析的总肿瘤负荷，(2)系统的生理 性能系数(ф)，该系数决定了每个靶标癌细胞所需的可诱导基因转移单位 复数，以及(3)以载体滴度定义的精确药物效力，以集落形成单位(U)/ml 表示。一个基因转移单位与一个集落形成单位相当。等价计算预测，如 果靶向载体给药剂量与新出现的肿瘤负荷相当，则可实现肿瘤控制；然 而总剂量给药应考虑在安全范围内于尽可能短的时间内完成，目的是在 留出时间供网状内皮系统清除产生的肿瘤碎片的同时可防止肿瘤继续 生长(Gordon等人(2000)Cancer Res.60：3343-3347)。
等价计算公式：
应用于Rexin-G治疗的等价计算
其中肿瘤负荷由公式[目标病变最长直径之和(cm)]×[1×109癌细 胞/cm]算出
其中ф或pMOI为由临床前和临床研究估计的经验数值
对于Rexin-G，pMOI是100
其中效力是每ml药物溶液的集落形成单位(U)数值。
对于新构建体pB-RVE和pdnG1/EREX产生的Rexin-G，效力范围 是5×108-5×109单位/ml
实施例：对于转移性胰腺癌患者的Rexin-G剂量计算
其中患者有一个尺寸为2cm×2cm的局部晚期肿瘤，4个肝病变， 其中3个的尺寸为1cm×1cm，第4个的尺寸为2cm×2cm
肿瘤负荷(胰腺、肝)＝(4cm+(2cm+2cm+2cm+4cm))×1×109 细胞/cm＝14×109癌细胞
其中特定批次的Rexin-G的效力为1×109U/ml
实施例：施用所需的Rexin-G冷冻袋数量的计算
为确定输注所需的Rexin-G冷冻袋的数量，用所用批次冷冻袋包含 的Rexin-G标准体积除Rexin-G剂量总体积。冷冻袋提供的Rexin-G体 积为20ml或40ml。
对于以40ml等份提供的Rexin-G，所需袋数是：
采用等价计算得到针对不同肿瘤负荷的三种给药方案(见上)
等价计算估计 的肿瘤负荷 开始/诱导(4周) 维持(6个月) 小肿瘤负荷 (＜5×109癌细 胞) 4.0×1010单位/天，周一-周五加周末休息×4周； 休息2周后经CT、MRJ或PET扫描评价肿瘤反应 重复2至4周的周期 重新进行等价计算确 定施用的的累积剂量 中肿瘤负荷 (5-10×109癌细 胞) 8.0×1010单位/天，周一-周五加周末休息×4周； 休息2周后经CT、MRI或PET扫描评价肿瘤反应 重复2至4周的周期 重新进行等价计算确 定施用 的累积剂量 大肿瘤负荷 (＞10×109癌细 胞) 1.2×1011单位/天，周一-周五加周末休息×4周； 或2.0×1011单位/天，周一-周三-周五×4周； 休息2周后经CT、MRI或PET扫描评价肿瘤反应 重复2至4周的周期 重新进行等价计算确 定施用 的累积剂量
我们利用该算法进行的初步临床实验(参见研究C)限于三名患者， 每人均具有相对高的肿瘤负荷；然而，从两名标准化疗失败的患者及一 名拒绝标准化疗的患者身上观察到了非常显著的应答(100％应答率)， 该结果凸显了其应用潜力及深入研究该定量方法的迫切需要。
靶向治疗包括靶向基因治疗的出现，正在改变肿瘤对受试抗癌药物 的应答方式。癌症治疗的指导原则曾经是从有应用前景的化疗药获得的 治疗益处必须超过候选药物可能引起严重或致死性系统毒性的风险。为 此目的，美国国立癌症研究所(NCI，Bethesda Maryland，USA)制定了实 体瘤反应评价标准(RECIST)，曾经被绝大多数(如果不是全部的话)学 术机构用作肿瘤反应评价的通用标准(Therasse等人，(2000)J.Nat′l. Cancer Inst.92：205-216)。特别地，客观肿瘤反应(OTR)曾经甚至近期 还被考虑作为评价实体瘤癌症治疗成功的黄金标准。OTR包括目标病变 大小至少减少30％和/或转移病灶或非目标病变完全消失。然而，许多癌 症的生物反应调节剂事实上并不引起肿瘤皱缩，但却显示能延长无进展 存活期(PFS)及总存活期(OS)(Abeloff，(2006)Oncol.News Int′l，15：2-16)。 因此，对有效生物制剂的反应通常是生理性的，RECIST可能不再是评 价肿瘤对生物疗法应答的恰当标准了。因此，呼吁采用备选的替代终点， 例如测定肿瘤密度(坏死的指标)、肿瘤内的血流和葡萄糖利用以及其 他成像方法，来评价肿瘤反应的机理。
因此，了解疾病过程以及推荐干预措施的可能作用机制在预测对给 定临床终点的治疗效果时尤为重要。关于肿瘤Rexin-GTM的反应，其主 要作用机制是诱导增殖肿瘤细胞及辅助的生血管脉管系统中的细胞凋 亡，促进肿瘤内部发生坏死及囊性变。这是由于靶向破坏了肿瘤血供使 肿瘤饥饿，从而导致肿瘤内部发生坏死。在Rexin-GTM治疗患者的肿瘤 中，细胞凋亡是最主要特征，在随后的影像检查中可见肿瘤出现皱缩并 消失。然而在坏死为主要特征的肿瘤中，肿瘤大小在经Rexin-GTM治疗 后实际上可能变大，这是由于坏死肿瘤和肿瘤的囊性转化激发了炎症反 应。在此情形中，CT扫描、PET扫描或MRI显示的肿瘤结节大小增加 并不必然指示疾病进展。因此，需要有另一些能反映受治肿瘤组织学性 质的辅助评价来更加精准地确定由Rexin-GTM治疗引起的坏死或囊性变 的程度。对于CT扫描，肿瘤密度测定(表示为亨斯菲尔德单位(HU)) 是一项准确并可重复的反映肿瘤坏死程度的指标。目标病变密度进行性 降低(HU降低)指示阳性治疗效果。对于PET扫描，目标病变的标准 摄取值(SUV)呈进行性下降指示肿瘤活性降低和阳性治疗效果。对于 肿瘤活检，出现细胞凋亡、坏死、反应性纤维化和肿瘤浸润淋巴细胞(TIL) 指示阳性治疗效果。
在骨肉瘤中，通过连续CT扫描证实肿瘤坏死和病变部位钙化增加， 以及通过连续PET扫描出现18FDG的SUV进行性下降证实病变部位的 葡萄糖利用降低，可指示有利的肿瘤反应。观察到病变部位的钙化增加 至少10％、25％、50％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、 700％、800％、900％或1000％是阳性杀肿瘤反应的证据，可用于评价治 疗结果并计划下一步治疗方案。病变部位的18FDG利用降低至少10％、 20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％是阳性杀肿瘤 反应的证据，也可用于评价治疗结果并计划下一步治疗方案。
通过适应性治疗设计的临床试验可加速确定剂量限制性毒性(DLT) 和最大耐受剂量(MTD)的进程，由此如果已观测到临床有效并且所有治 疗相关毒性确定≤1级，那么患者可采用相同的治疗周期进行治疗。可 选地，若未见客观治疗反应，而所有治疗相关毒性确定≤1级，则患者 可应用下一个更高的剂量水平。两个机制均增加了获得肿瘤控制的机 会，而不会危及患者安全，同时可减少招募患者的时间和花费。
为进一步促进肿瘤消除并延长癌症存活期，发展了一种辅助基因转 移策略，其特别设计为将肿瘤靶向杀细胞基因表达载体定位于病变部位 或其周围区域。利用带有细胞因子基因的肿瘤靶向表达定位于病变部位 或其周围区域可以诱导局部而不是全身暴露于表达的细胞因子。这种定 位的细胞因子诱导的免疫应答不仅促进急性肿瘤破坏，还可提供原位癌 症接种，致使免疫监督增强并降低癌症复发的发生率。这种肿瘤接种方 法有助于靶向休眠的脱落细胞和转移性癌细胞，以及原发肿瘤和肿瘤引 流淋巴结中残留的活癌细胞。
一种正在研发用于靶向递送的细胞因子基因是粒细胞巨噬细胞集 落刺激因子(GM-CSF)，在被包装为与Rexin-G相同的亲病灶性纳米颗粒 后被称作Reximmune-C。另一些可使用的细胞因子包括：TNF-α(肿瘤 坏死因子α)；干扰素，包括但不限于IFN-α和IFN-γ；以及白介素，包 括但不限于白介素1(IL1)、白介素β(IL-β)、白介素2(IL2)、白介素4 (IL4)、白介素5(IL5)、白介素6(IL6)、白介素8(IL8)、白介素10 (IL10)、白介素12(IL12)、白介素13(IL13)、白介素14(IL14)、白 介素15(IL 15)、白介素16(IL16)、白介素18(IL18)、白介素23(IL23)、 白介素24(IL24)。此外，肿瘤靶向表达载体可运送一个以上的细胞因子 基因。例如GM-CSF可与IL1共同表达。
带有细胞因子基因的肿瘤靶向表达载体可在施用杀细胞亲病灶性 纳米颗粒之前、同时或之后施用。最佳方案可能是直到患者经Rexin-G 作为单药或联合治疗后表现出明显肿瘤缩小(且生命延长)的时候再施 用Reximmne-C，并主要依靠Reximmune-C来抑制复发。在另一方面， 需要Rexin-G与Reximmune-C的协同作用直接作用于肿瘤负荷。在此情 形中，在每个时间点对预期终点的组织学评价需采用增加的组织学和放 射成像的混合评价标准进行。
表达杀细胞和细胞因子基因的亲病灶性纳米颗粒可以不同顺序多 次施用。例如，首先施用表达杀细胞基因的亲病灶性纳米颗粒，再施用 表达细胞因子基因的亲病灶性纳米颗粒，接着再施用表达杀细胞基因的 亲病灶性纳米颗粒。该联合施用可作为交替的个别给药、交替的治疗周 期或其组合来执行。首先施用Rexin-G，接着是Reximmune-C，再后来 是Rexin-G，这被称为3-Rex方案。对于一名乳腺癌伴广泛淋巴结、肝 脏、肺和骨转移的患者，3-Rex方案完全根除了肿瘤活检组织内的所有 癌细胞。其累积剂量是，第一个Rexin-G治疗周期为6×1011cfu， Reximmune-C治疗周期为1×1010cfu，第二个Rexin-G治疗周期为4×1011 cfu。该治疗方案导致肿瘤结节全面坏死，坏死区域广泛，具有明显的宿 主单核细胞浸润，没有残留或者只有极少的肿瘤细胞。免疫细胞浸润显 示了大量补充的CD35+树突细胞、CD8+杀伤性T细胞和CD138+浆B 细胞，提供了活跃的原位免疫的证据。
使用表达杀细胞和细胞因子基因的亲病灶性纳米颗粒的联合治疗 方案，可制定灵活的治疗计划，以考虑所观察到的临床、放射学、组织 病理学、免疫组织化学和临床化学结果。例如，如果患者根据一条、数 条或所有的不同检测标准均未见客观的、有意义的肿瘤应答，而医师认 为需要更高的表达杀细胞基因的亲病灶性纳米颗粒累积剂量将肿瘤抗 原充分暴露于活化的免疫细胞，则采用更高的表达杀细胞基因的亲病灶 性纳米颗粒的累积剂量进行另一个治疗周期，但是表达细胞因子基因的 亲病灶性纳米颗粒可以维持相同的累积剂量。
用于检测在施用或不施用表达细胞因子基因的亲病灶性纳米颗粒 时，表达杀细胞基因的亲病灶性纳米颗粒的个别施用、多重施用或治疗 周期的效果的组织病理学指标包括病灶部位的明显血管生成抑制伴随 肿瘤细胞退化、大范围的坏死与反应性纤维化以及凋亡结构的TUNEL 染色阳性。治疗效果的免疫组织化学指标包括出现肿瘤浸润淋巴细胞， 例如CD4+(Th)、CD8+(Tc)、CD68+(巨噬细胞)、CD138+(浆B细胞)、CD35+ (树突状细胞)、CD20+(B细胞)和CD45+(单核细胞-巨噬细胞)细胞。鉴 定到细胞因子(如GM-CSF)转基因表达阳性细胞也是有效性的标志。
临床化学结果包括观察到可溶的、分泌的或脱落的肿瘤标志物/抗原 减少，例如前列腺特异性抗原(PSA)或HER2/neu脱落抗原的血清水平降 低。
进行组织病理学和免疫组织化学评价的样本来源包括肿瘤、淋巴结 和器官活检或针活检，以及切除的肿瘤、淋巴结或器官。
通过将自杀基因整合到质粒构建中能够更好地控制细胞因子表达， 因而通过使用口服前药如更昔洛韦等可获得临床转换，该前药可立即除 去所有细胞因子转基因分泌肿瘤细胞。为实现这个目标，近期研制了包 括单纯疱疹病毒(HSV)胸苷激酶基因的第二代Reximmune-C，被称作 Reximmune-C-TNT。用治疗性病毒颗粒如Rexin-G预治疗还可用于术前 减小肿瘤体积及存活性。这对于先前不可切除的肿瘤特别有益，能够将 其转化为可被手术切除的肿瘤，并且还可减少脱落的活癌细胞进入手术 切缘的情况发生。
对于具有癌症家族史或已知遗传异常/突变如BRACI基因突变而增 加了罹患癌症风险的患者，可采用Rexin-G、Reximmune-C或二者联用 的预防疗法来防止已知疾病的发生。实现该作用是通过破坏已开始补充 持续长大所需新血管系统的微小癌细胞簇，或者通过吸引淋巴细胞至微 小癌细胞簇而对免疫系统进行训练，或者依靠这两方面的组合。
施用逆转录病毒载体可能会引起受者体内产生载体中和抗体，从而 阻止进一步的治疗(Halbert等人(2006)Hum.Gene Ther. 17(4)：440-447)。然而本领域公知，在施用载体的时间前后进行免疫抑 制处理即可阻断中和抗体产生的诱导。该免疫抑制处理包括药物(环磷酰 胺、FK506)、细胞因子(干扰素γ、白介素12)和单克隆抗体(抗-CD4、 抗-pgp39、CTLA4-Ig)(Potter和Chang，(1999)Ann.N.Y.Acad.Sci.875： 159-174)。此外，中和抗体可在体外通过免疫吸附除去(Nilsson等人(1990) Clin.Exp.Immunol.82(3)440-444)。还可通过施用较高剂量的载体在体内 减少中和抗体。Rexin-G载体具有低免疫原性，并且至今仍未在6个月 随访期的患者血清中检测到载体中和抗体。
试剂盒
还提供了包含用于本文所述方法的组合物的试剂盒或给药系统。施 用靶向逆转录病毒颗粒所需的全部必要材料和试剂可以组合在一个试 剂盒中(例如包装细胞构建体或细胞系、细胞因子表达载体)。试剂盒 的各成分可以上述多种形式提供。一种或多种靶向逆转录病毒颗粒可与 一种或多种药剂(例如化疗药)配制为单一的药学可接受的组合物或独 立的药学可接受的组合物。
试剂盒或给药系统的成分还可以干燥或冻干形式提供。当试剂或成 分以干燥形式提供时，通常需加入适宜的溶剂进行配制，该溶剂也可装 于另一个容器中提供。本发明的试剂盒还可包括关于靶向逆转录病毒颗 粒的剂量和/或给药信息的说明书。本发明的试剂盒或给药系统通常还可 包括将小瓶装入封闭装置中供商品销售的工具，例如容纳所需小瓶的注 射或吹塑成型的塑料容器。不论容器的数量或类型如何，试剂盒还可包 括辅助注射/给药或将最终复合组合物置于受试对象身体中的装置或与 该装置一起包装。该装置可以是涂药器、吸入器、注射器、吸管、镊子、 测量匙、滴眼器或任何批准的医学递送工具。
在另一种实施方式中，提供了一种进行基因治疗商业活动的方法。 该方法包括生产靶向递送载体，和通过收集载体颗粒、将其混悬于适宜 的基质溶液中并保存混悬液而建立载体库。该方法还包括向医师或保健 提供者提供颗粒和使用颗粒的说明书，以施用于需要的受试对象(患 者)。载体的使用说明书还可包括表1列出的示例性治疗方案。该方法 任选地包括给患者或者患者的保险提供者开账单。
在另一种实施方式中，提供了一种进行基因治疗商业活动的方法， 包括向医师或保健提供者提供本文所公开的试剂盒。
以下的实施例仅用于说明目的，而不是限定本发明的范围。所例举 的具体方法可施用于其他物种。这些实施例旨在举例说明一般方法。
实施例
胰腺癌是美国癌症死亡的排第四位的原因，而且是所有癌症中致 死性最强的。完全手术切除胰腺肿瘤是该疾病的唯一有效的治疗方 法。遗憾的是，这种“治疗性”手术仅在10-15％的胰腺癌患者中是可 能的，一般是表现症状为黄疸的个体。不可切除胰腺癌患者的存活时 间中值为3-6个月。因此，晚期胰腺癌患者的控制通常涉及症状的缓 解。外线束照射看来不能延长存活期，尽管足够的肿瘤大小缩小可能 导致疼痛的缓解。外线束照射加使用氟尿嘧啶(5-FU)的化学治疗延 长了这些患者的存活时间(18)。最近证明，吉西他滨，一种脱氧胞苷 酸类似物，可改善晚期胰腺癌患者的生活质量，尽管存活期只延长了 8-10周。
手术切除也是对结肠直肠癌患者的主要的治疗手段，结肠直肠癌 是美国居第二位的癌症死亡原因。附加的化学治疗和放射治疗有助于 减少早期疾病患者的结肠直肠癌复发(7)。然而，这些治疗对于局部 晚期肿瘤的效果不太令人满意(8)。当前，通过手术切除治疗的结肠 直肠癌患者的5年存活率如下：I期约为90％，II期约为70％，II期 约为50％，IV期低于5％。尽管化学治疗对于结肠癌仍然是一种有用 的治疗选择，甚至扩展到病变降期(down-staging)，但是大多数结肠 癌患者在18个月内从标准治疗中获得的益处已经消失。而且，似乎 一流的临床肿瘤学家一致认为靶向“生物治疗”在胰腺癌和结肠癌未 来临床发展方面具有远大的前景。
实施例1：构建体
质粒pBv1/CAEP含有4070A双嗜性包膜蛋白的编码序列 (GenBank登录号M33469)，它已经通过修饰引入了胶原结合功能(Hall 等人.，Human Gene Therapy，8：2183-2192，1997)。亲代表达质粒pCAE (Morgan等人.，Journal of Virology，67：4712-4721，1967)由USC Gene Therapy Laboratories提供。该pCAE质粒通过靠近成熟蛋白质的N末 端在编码序列的氨基酸6和7之间插入Pst I位点(gct gca gga，编码氨 基酸AAG)而修饰(pCAEP)。将合成寡核苷酸双链体(gga cat gta gga tgg aga gaa cca tca ttc atg gct ctg tca gct gca，编码氨基酸 GHVGWREPSFMALSAA，最小胶原结合十肽(粗体)，来源于牛冯维 勒布兰德因子的D2结构域(Hall等人.，Human Gene Therapy， 11：983-993，2000)，侧翼为关键连接体(以下划线标出))克隆到该独特 Pst I位点内，产生pBv1/CAEP。
嵌合包膜蛋白在293T生产细胞中的表达由强CMV(即启动子) 驱动。嵌合包膜正确加工，并且稳定导入逆转录病毒颗粒内，该逆转 录病毒颗粒显示功能增加表型，而感染滴度没有明显损失。胶原结合 结构域的正确方向通过DNA序列分析进行验证，质粒质量控制通过 Pst I限制酶消化进行验证，Pst I将质粒线性化，并且释放胶原结合结 构域。
进一步改善原质粒pBv1/CAEP，以减少在Rexin-GTM生产过程中 产生有复制能力的逆转录病毒(RCR)的潜力。载体pBv1/CAEP在莫洛 尼(Moloney)包膜ATG起始密码子上游含有38个碱基对的非翻译 序列。该载体在莫洛尼包膜终止密码子下游也含有76个碱基对的非 翻译序列。利用聚合酶链反应技术除去这两个非翻译序列(38+76＝ 114碱基对)，仅扩增从ATG起始密码子到TGA终止密码子的莫洛尼 包膜开放阅读框序列。使用以下引物组：
NewEnvF1
5′ATGCGGCCGCCCACCATGGCGCGTTCAACGCTCTCAAAACCCC CTCAAGATA 3′
NewEnvR1
5′CCTCTAGATTATCATGGCTC GTACTCTATGGGTTTTAGCTGG 3′
用pBv1/CAEP作为PCR反应的模板，以确保将独特的冯维勒布 兰德胶原结合位点(GHVGWREPSFMALSAA)正确拷贝到仅有新的开 放阅读框的包膜PCR产物内。产生正确的2037个碱基对的PCR产物， 使其连接到pCR2克隆载体内，测序，确保与预期序列具有100％的 序列一致性。从pCR2质粒骨架上切下这一正确测序的仅有莫洛尼包 膜开放阅读框的基因，将其亚克隆到来自Genelantis(以前称为Gene Therapy Systems)的超高表达质粒pHCMV中，产生新的质粒pB-RVE。
该质粒在大量不同的滴度测定中进行检测，发现它的强度增加， 使得现在在转染293T细胞时最好使用少3-5倍的量，与pCgpn和 pE-REX达到类似的滴度。这暗示pB-RVE质粒比相应的pBV1/CAEP 质粒在生产功能性包膜蛋白方面强3-5倍。然而，如果使用相同量的 pB-RVE质粒作为正常量的pBv1/CAEP，将产生低的多的滴度。该结 果强调了进行一整套质粒比例研究对于获得产生最高滴度的最佳比 例的重要性。在某些情况下，三种质粒成分基因中任一个的过量表达 可以在装配和加工过程中破坏病毒部分的精细平衡，并且可以导致如 在较低滴度时发现的抑制效果。我们选用比pBV1/CAEP少3-5倍的 pB-RVE获得类似高的滴度，并利用该质粒获得了使用相当低的量进 行GMP逆转录病毒生产的优点。这种高水平表达的效果最可能是由 于包膜基因从与CMV内含子串联的CMV启动子增强子表达。这种 组合比从CMV启动子表达(如pBV1/CAEP质粒)强3-5倍。
质粒pCgpn含有MoMuLV gag-pol编码序列(GenBank登录号 331934)，该序列最初来源于原病毒克隆3PO，为pGag-pol-gpt， (Markowitz等人.，Journal of Virology，62：1120-1124，1988)，显示Ψ包装 信号的134个碱基对的缺失和env编码序列的截短。该构建体作为 pCgp中的EcoRI片段提供，其中5′EcoRI位点对应于位于Gag上游 的XmaIII位点，3′EcoRI位点添加到env中ScaI位点的附近。从pCgp 上切下EcoRI片段，连接到pcDNA3.1+表达载体(Invitrogen)的独特 EcoRI克隆位点内。
通过用SalI进行限制酶消化来证实正确的方向，并且通过用 EcoRI和HindIII进行消化进一步表征插入片段。分别利用T7启动子 结合位点引物(S1)和pcDNA3.1/BGH反向引物位点(AS1)，通过DNA 序列分析证实gag-pol插入片段的5′和3′序列。获得的质粒命名为 pCgpn，它编码由强CMV启动子驱动的gag-pol多蛋白质和由SV40 早期启动子驱动的新霉素抗性基因。该质粒中SV40ori的存在使得在 表达SV40大T抗原的细胞系(即293T生产细胞)中能够进行游离 型复制。
下面描述了携带pdnG1/C-REX逆转录病毒表达载体的质粒的构 建，其含有显性阴性细胞周期G1构建体(dnG1)。通过瞬时转染方案， 该质粒在生产高感染滴度载体方面增强。通过PCR，由全长细胞周期 蛋白G1模板产生编码人细胞周期蛋白G1的氨基酸41-249的cDNA 序列(472-1098+终止密码子)(CYCG1，Wu等人，Oncology Reports， 1：705-11，1994；登录号U47413)，引入Not I/Sal I突出端。开始时将 N末端缺失突变体构建体克隆到TA克隆载体(Invitrogen)内，然后进 行Not I/Sal I消化，并将纯化的插入片段连接到Not I/SalI消化的 pG1XSvNa逆转录病毒表达载体(Genetic Therapy，Inc.)内，产生具有 5′和3′长末端重复(LTR)序列和Ψ逆转录病毒包装序列的pdnG1SvNa 载体。
CMV，即启动子-增强子，通过PCR由CMV驱动的pIRES模板 (Clontech)制备，引入Sac II突出端，并且克隆到位于5′LTR上游的 pdnG1SvNa的独特Sac II位点内。有利于测定载体滴度的新霉素抗性 基因由具有嵌套ori的Sv40 e.p.驱动。除了Sv40 ori以外还包含强 CMV启动子促进了在表达大T抗原的293T细胞中产生高滴度逆转录 病毒载体(Soneoka等人.，Nucleic Acid Research，23：628-633，1995)。 CMV启动子的正确的方向和序列通过限制性消化和DNA序列分析加 以验证，dnG1编码序列也是如此。质粒身份和质量控制通过用Sac II (其释放750bp CMV启动子)和Bgl II(其在dnG1构建体内的独特位 点进行切割)进行消化来验证。
已经证明使用pdnG1/C-REX和pBv1-CAEP进行多GMP逆转录 病毒生产是安全的并且不含RCR。第4代和第5代基于MLV的逆转 录病毒载体和载体生产方法，即断裂(split)基因组设计，在标准GMP 条件下已经产生了一致的生产质量，而不产生RCR(Sheridan等人.， 2000；Merten，2004)。然而，我们以及其他人已经看出所有可以获得的 载体构建体含有显著量的残余gag-pol序列，该序列可能与相应 gag-pol质粒构建体中所含的5′DNA序列重叠(Yu等人.，2000)；当载 体生产最终放大到使用较大细胞数和相应质粒浓度的商业规模时，这 些显著的重叠区域可能成为问题。
考虑到这些，我们选择通过限制性消化和PCR克隆从亲本 pdnG1/C-REX载体中除去487个碱基对的残余gag-pol序列 (pdnG1/C-ΔREX)，接着插入合成的97bp包膜剪接受体位点(ESA) (Lazo等人.，(1987)J.Virol.61(6)：2038-41)，该位点用来抵消包装(滴 度)和基因表达(效能)方面的损害(图22)。pdnG1/C-REX的这些 产生的安全性改变导致产生pdnG1/UBER-REX，它编码并且表达完全 相同的转基因(dnG1和neo)，不含487个碱基对的GAG，现在代替以 前的质粒产生Rexin-G。图23显示了C-REX和C-REXII质粒和 UBER-REX质粒之间的示意性比较。
在高度控制和优化的生产条件下pB-RVE、pCgpn、pdnG1/UBER 质粒以确定比例的组合产生了不含RCR的临床载体产物，报告的最 高非浓缩GMP终产物逆转录病毒滴度＞5×109Cfu/mL。
实施例2：REXIN-G
终产物Mx-dnG1(REXIN-GTM)是基质(胶原)靶向的逆转录病 毒载体，其编码N末端缺失突变人细胞周期蛋白G1构建体，在杂合 LTR/CMV启动子的控制之下。该载体也含有由SV40早期启动子驱 动的新霉素抗性基因。
Mx-dnG1载体通过用3种质粒瞬时共转染从完全验证的原始细 胞库中获得的293T(用SV40大T抗原转化的人胚肾293细胞)细胞而 获得。
转染系统的成分包括pdnG1/C-REX治疗性质粒构建体，其含有 由CMV立即早期启动子驱动的编码氨基酸41-249的人细胞周期蛋白 G1基因的缺失突变体、包装序列和在内部SV40早期启动子控制下驱 动的细菌新霉素抗性基因。开始时将截短的细胞周期G1基因克隆到 TA克隆载体(Invitrogen)内，接着进行Not I/Sal I消化，将纯化的插入 片段连接到Not I/SalI消化的pG1XSvNa逆转录病毒表达载体 (Genetic Therapy，Inc.，Gaithersburg，MD提供)中，产生包含5′和3′LTR 序列和Ψ序列的pdnG1SvNa载体。CMV，即启动子-增强子，通过PCR 由CMV驱动的pIRES模板(Clontech)制备，引入Sac II突出端，并且 克隆到位于5′LTR上游的pdnG1SvNa的独特SacII位点内。
用pdnG1/UBER-REX代替质粒pdnG1/C-REX，它是下一代质粒， 编码并且表达完全相同的转基因(dnG1和neo)，而不含在原 pdnG1/C-REX中发现的487个碱基对的GAG。
该系统进一步包括Mx(Bv1/pCAEP)包膜质粒，该质粒含有CMV 驱动的修饰的双嗜性4070A包膜蛋白，其中胶原结合肽插入位于 4070A包膜N末端区氨基酸6和7之间的工程化的Pst I位点中。
用pB-RVE代替Mx(Bv1/pCAEP)包膜质粒，pB-RVE是一种改善 的质粒，其中取消了可能与天然非翻译(UTR)序列重叠的114bp的外 来逆转录病毒序列。
该系统还包括pCgpn质粒，该质粒含有由CMV立即早期启动子 驱动的MLV gag-pol元件。它作为pGag-pol-gpt来源于克隆3PO。载 体骨架是来自Invitrogen的pcDNA3.1+。来自牛生长激素的聚腺苷酸 化信号和转录终止序列提高了RNA稳定性。SV40 ori与e.p.一起，用 于在表达SV40靶T抗原的细胞系中进行游离型复制和载体拯救。
通过限制性内切核酸酶消化分析了这些质粒，细胞培养基由添加 了每升4克葡萄糖、每升3克碳酸氢钠、10％γ射线照射的胎牛血清 (Biowhittaker)的DMEM培养基组成。血清从USA来源获得，经检测 不含牛病毒，符合USDA的规定。用丁酸钠诱导增强逆转录病毒颗粒 的芽殖。使上清液通过0.45微米滤器，或者利用切向流/渗滤法浓缩， 处理得到的病毒颗粒。病毒颗粒从外观上看是C型逆转录病毒。收获 逆转录病毒颗粒，悬浮在95％DMEM培养基和1.2％人血清白蛋白的 溶液中。该制剂以150ml等份贮存在500ml冷冻袋中，冻存于-70 至-86℃直到使用。
对于使用改良的pB-RVE和pdnG1/UBER-REX质粒产生的 Rexin-GTM，治疗性纳米颗粒的生产、悬浮和收集在培养基最终配方 中不含牛血清的情况下进行，该培养基在无菌闭环系统中通过连续的 澄清、过滤和最终装入冷冻袋中来处理。得到的C型逆转录病毒颗粒， 平均直径为100纳米，缺乏所有病毒基因，并且是完全复制缺陷的。 临床用批次的滴度范围为3×107至5×109集落形成单位(U)/ml，验 证每一批的必需纯度和生物学效能。
给患者施用的Mx-dnG1载体的准备包括在37℃80％乙醇浴中在 载体袋中融化该载体。每个载体袋在给患者输注前1小时融化，用阿 法链道酶(10U/ml)处理，在1-3小时内立即输注。
用改良的pB-RVE和pdnG1/UBER-REX质粒产生的经处理的临 床级Rexin-GTM密封在冷冻袋中，在运输前贮存在-70±10℃冰箱中。 每批经验证和发出的含有Rexin-GTM载体的冷冻袋在干冰上运输至临 床地点，在该地点载体保存在-70±10℃冰箱中直到使用。在静脉内 输注前15分钟，将载体在32-37℃水浴中快速融化，立即输注，或 者在专用盘或冷却器中在冰上运输到患者房间或临床地点立即使用。 患者经周围静脉、中心IV线或肝动脉接受Rexin-GTM输注。使用各种 给药方案，如临床研究A、B和C所述(下文)；然而，8ml/kg/剂的 最大体积每天给予一次。每袋Rexin-GTM以4ml/min的速度在10-30 分钟内输注。
实施例3：Mx-dnG1载体的治疗有效性
检验了Mx-dnG1在体外抑制癌细胞增殖、在肝转移裸鼠模型体 内阻止肿瘤生长的有效性。选择胰腺来源的未分化的人癌细胞系作为 转移性癌的原型。逆转录病毒在这些癌细胞中的转导效率是极佳的， 范围为26％至85％，取决于感染复数(分别为4和250)。为了筛选治 疗性基因，在使用携带各种细胞周期蛋白G1构建体的载体转导的细 胞中进行细胞增殖研究。在标准条件下，Mx-dnG1载体一致性地表现 出最大的抗增殖效果，伴随着在20kDa区域处出现免疫反应性细胞 周期G1，代表dnG1蛋白。基于这些结果，选择Mx-dnG1载体进行 随后的体内有效性研究。
为了评价Mx-dnG1在体内的表现，通过保持14天的留置导管将 7×105人胰腺癌细胞输入门静脉内建立了肝转移裸鼠模型。在三天后 开始载体输注，包括200ml/天的Mx-dnG1(REXIN-GTM；滴度：9.5× 108cfu/ml)或PBS盐水对照，总共9天。载体输注结束1天后处死小 鼠。
对来自用PBS或低剂量Mx-dnG1治疗的小鼠的转移性肿瘤灶进 行了组织学和免疫细胞化学评价，并用Optimas成像系统进行了评价。 人细胞周期蛋白G1蛋白在转移性肿瘤灶中高度表达，证据是在PBS 治疗的动物中以及在Mx-dnG1载体治疗的动物的剩余肿瘤灶中周期 蛋白G1的核免疫反应性(棕色染色物质)提高。对来自对照动物的 肝切片的组织学检查显示了具有血管生成和基质形成区域的肿瘤灶； 上皮成分为细胞角蛋白染色阳性，相关的肿瘤基质细胞/内皮细胞为波 形蛋白和FLK受体染色阳性。相比之下，低剂量Mx-dnG1治疗的动 物中肿瘤灶的平均大小显著低于PBS对照(p＝0.001)，同时显示凋亡 细胞核密度比PBS对照组局灶性增加。此外，在Mx-dnG1治疗的动 物的残留肿瘤灶中观察到PAS+，CD68+和带有含铁血黄素的巨噬细 胞的浸润，提示退化的肿瘤细胞和肿瘤碎片被肝脏网状内皮系统主动 清除。总之，这些发现证明了带有杀细胞细胞周期控制基因的靶向可 注射逆转录病毒载体的体内抗肿瘤效果，并且代表了用于转移癌的靶 向可注射载体的发展中的重要进展。
在裸鼠的皮下人胰腺癌模型中，我们证明了与非靶向的 CAE-dnG1载体(p＝0.014)、带有标记基因的对照基质靶向载体 (Mx-nBg；p＝.004)和PBS对照(p＝.001)相比，静脉内(IV)输注 Mx-dnG1增强了基因递送，并且阻止了皮下肿瘤的生长。增强的肿瘤 结节的载体渗透和转导(35.7+S.D.1.4％)与疗效有关，而没有相关的 全身毒性。也在用PBS安慰剂、非靶向CAE-dnG1载体和Mx-dnG1 载体处理的小鼠中进行了Kaplan-Meier生存研究。使用Tarone对数 秩检验，用于同时比较所有三个组的总p值为0.003，趋势显著性水 平为0.004，表明使用靶向Mx-dnG1载体长期控制肿瘤生长的可能性 显著大于使用非靶向CAE-dnG1载体或PBS安慰剂。总之，本研究 证实通过外周静脉注射使用的Mx-dnG1(i)在一小时内在生成血管的 肿瘤血管系统中积累，(ii)高效率地转导肿瘤细胞，和(iii)增强治疗 性基因递送和长期有效性，而不引发可检测到的毒性。
实施例4：药理学/毒理学研究
已经证实整合了靶向胞外基质成分(例如胶原)的肽的基质靶向 可注射逆转录病毒载体增强了体内治疗性基因的递送。使用两个小鼠 癌症模型和两个携带杀细胞/细胞生长抑制显性阴性细胞周期G1构建 体的基质靶向的基于MLV的逆转录病毒载体(命名为Mx-dnG1和 MxV-dnG1)，获得了另外的数据。Mx-dnG1和MxV-dnG1都是基于 4070A MLV的双嗜性逆转录病毒载体，显示基质(胶原)靶向的基序， 用于靶向至病变区域。这两种载体的唯一区别是MxV-dnG1是假型， 具有水疱性口炎病毒G蛋白。
在皮下人癌异种移植模型中，将1×107人MiaPaca2胰腺癌细胞 (转移性胃肠癌的原型)皮下植入裸鼠的侧腹部。6天后，每天向尾 静脉内直接注射200μl Mx-dnG 1载体，持续一个或两个10天的治疗 周期(总载体剂量分别为：5.6×107[n＝6]或1.6×108cfu[n＝4])。在 肝转移裸鼠模型中，经由保持10-14天的留置导管通过门静脉注射7× 105 MiaPaca2细胞。从输入肿瘤细胞三天后开始，每天在10分钟内 输注200ml MxV-dnG1载体，持续6天或9天(总载体剂量分别为： 4.8×106[n＝3]或1.1×109cfu剂量[n＝4])。对于生物分布研究，开发 了基于TaqManTM的试验来检测在小鼠基因组DNA背景中含有 SV40和新霉素(Neo)基因序列的基于G1XSvNa的载体(Althea Technologies，San Diego，CA，USA)。该试验检测95个核苷酸的扩增 子(G1XSvNa质粒载体的核苷酸1779-1874)，其中荧光标记的探针 与SV40基因的3′部分和新霉素磷酸转移酶抗性(Neor)基因的5′部分 重叠。
对于Mx-dnG1或MxV-dnG1载体，没有观察到与载体相关的死 亡率或发病率。在用低剂量和高剂量载体治疗的动物的肝脏、肺和脾 脏中检测到低水平阳性信号。在用载体治疗的动物的睾丸、脑或心脏 中没有检测到PCR信号。在两只具有留置导管而没有抗生素预防的 动物中，组织病理学检查显示门静脉静脉炎、肾盂肾炎伴有局灶性心 肌炎。在Mx-dnG1-或MxV-dnG1治疗的小鼠的非靶器官中没有注意 到其他病理学状况。血清化学谱显示Mx-dnG1治疗的动物比PBS对 照的ALT和AST温和升高。然而，其水平仍然处于小鼠的正常限度 内。在7周随访期，在载体治疗的动物的血清中没有检测到载体中和 抗体。
上述临床前发现证实了在两个人胰腺癌裸鼠模型中静脉内输注 Mx-dnG 1显示没有可检测到的相邻正常组织的损伤，也没有全身副作 用。通过静脉内输注的靶向基因递送方法具有几个临床相关的优点。 向静脉系统内输注允许治疗肿瘤以及潜伏的肿瘤灶。一般认为在分裂 的肿瘤细胞中观察到的较高的有丝分裂速度将导致较高的肿瘤转导 效率，而节约肝细胞和其他正常组织。因此，我们提出使用静脉内施 用Mx-dnG1载体治疗局部晚期或转移性胰腺癌和其他标准化疗难治 性实体瘤的人临床研究方案。
实施例5：临床研究
本研究的目标是：(1)确定连续静脉内输注Rexin-G的剂量限制 性毒性和最大耐受剂量(安全性)，和(2)评价潜在的抗肿瘤应答。该 方案是为估计存活期至少为3个月的末期癌症患者而设计的。邀请肿 瘤科医生认为难以用标准化疗治疗的三名IV期胰腺癌患者参加由菲 律宾食品药物管理局批准的使用Rexin-G的同情使用方案，。通过每天 静脉内输注Rexin-G，持续8-10天，给予患者内剂量递增方案。该方 案结束后，为一周的剂量限制性毒性评价期；之后，施用最大耐受剂 量的Rexin-G，再持续8-10天。如果患者在观察期内没有发生与 Rexin-G有关的3或4级不良事件，则如表1(见上)所示增加Rexin-G 的剂量。
用测径器或通过放射成像技术(MRI或CT扫描)测量，按照公式 宽度2×长度×0.52连续确定肿瘤体积，以此评价肿瘤应答。
1号患者是一名47岁的菲律宾女性，通过活检肿瘤组织的组织学 检查和分期研究诊断为在胰头具有局限性腺癌。她接受了Whipples 外科手术，包括完全切除了原发肿瘤。然后每周使用单药吉西他滨， 共7次剂量，但是由于难以承受的毒性而中断了化疗。几个月后，后 续MRI显示原发肿瘤复发，转移扩散到锁骨上和腹部淋巴结。按照 临床方案，该名患者在28天内接受了两次治疗周期为10天的 Rexin-G，累积剂量为2.1×1011单位，中间休息期为1周。在没有全 身毒性的情况下，该患者接受了另外10天的治疗周期，总累积剂量 为3×1011单位。
使用测径器手工测量两个浅表锁骨上淋巴结的尺寸。观察到锁骨 上淋巴结的肿瘤体积进行性缩小，到第28天第2治疗周期结束时肿 瘤尺寸分别缩小了33％和62％(表2)。
表2：1号患者的锁骨上淋巴结的测径器测量值
日期 测径器测量值 cm 肿瘤体积* cm3 从Rexin-G Rx开始 尺寸缩小的百分比 第1天 LN1 1.9×2.1 LN2 1.5×1.8 3.9 2.1 第26天 LN1 1.8×1.8 LN2 1.3×1.3 3.0 1.1 23 48 第27天 LN1 1.7×1.7 LN2 1.15×1.15 2.6 0.8 33 62
后续腹部MRI显示：(i)没有新的肿瘤转移区，(ii)可以辨别的 中心性坏死区，涉及40-50％的原发肿瘤，和(iii)主动脉旁腹部淋巴 结的大小显著缩小(图1A-B)。在第54天，后续MRI显示原发肿瘤 的大小没有间隔改变。与这些发现一致，观察到CA19-9血清水平进 行性降低(从峰值1200U/ml降至低值584U/ml)，在第54天CA19-9 水平达到50％的降低(图1C)。然而，第101天的后续CT扫描显示 原发肿瘤和锁骨上淋巴结的大小明显增大。患者拒绝进一步化疗，直 到第175天，该患者同意每周接受吉西他滨1000mg/m2。根据RECIST 标准，1号患者在第189天存活，疾病进展，距开始Rexin-G输注6.75 个月，距肿瘤复发11个月，距最初诊断时20个月。
2号患者是一名56岁的菲律宾女性，根据胆道清洗液的细胞学检 查，她被诊断为IVA期局部晚期和不可手术切除的胰头癌。剖腹探查 术显示肿瘤环绕在门静脉周围，密切靠近地侵入肠系膜上动脉和静 脉。她曾经接受了外线束放射治疗以及5-氟尿嘧啶，并进一步接受了 单药吉西他滨，每周一次，共8次，然后每月维持剂量。然而，观察 到CA19-9血清水平进行性升高，后续CT扫描显示肿瘤大小增大(图 2A)。患者接受两个治疗周期的Rexin-G，每天静脉内输注，总累积 剂量为1.8×1011单位。结果：连续腹部CT扫描显示肿瘤体积明显缩 小，从开始Rexin-G输注时的6.0cm3降至治疗结束时的3.2cm3，在 第28天肿瘤大小缩小47％(图2A-C)。在第103天的后续CT扫描显 示肿瘤大小没有间隔改变，之后患者保持每月吉西他滨给药。根据 RECIST标准，2号患者在第154天随访时存活，无症状，疾病稳定， 距开始Rexin-G输注5.5个月，最初诊断后14个月。
3号患者是一名47岁的中国糖尿病男性，诊断为患有IVB期胰 体和胰尾腺癌，肝脏和肝门淋巴结广泛转移，通过CT引导的肝活检 得到证实。基于IVB期胰腺腺癌的快速致命性后果，邀请该患者参与 第二临床方案，使用前线Rexin-G，然后每周吉西他滨给药。施用致 敏剂量的Rexin-G，以使肿瘤对吉西他滨化疗敏感，以具有更好的杀 细胞效果。该患者每天接受静脉内输注剂量为4.5×109单位/剂的 Rexin-G，共6天，总累积剂量为2.7×1010单位，然后8次每周吉西 他滨给药(1000mg/m2)。第62天，后续腹部CT扫描显示原发肿瘤的 大小从7.0×4.2cm(肿瘤体积：64.2cm3)基线测量值缩小到6.0×3.8 cm(肿瘤体积：45cm3)(图3A)。进一步地，在第62天，肝结节数也 从18个结节(基线)显著减少为5个结节(图3C)，最大的肝脏结 节从基线2.2×2cm(肿瘤体积：4.6cm3)消退至1×1cm(肿瘤体积： 0.52cm3)(图3B)。根据RECIST标准，3号患者在第133天仍然存活， 疾病稳定，距开始Rexin-G输注4.7个月，距诊断时约5个月。
表3显示3名患者中总肿瘤反应的对比评价。使用RECIST标准， Rexin-G在全部3名患者中都导致肿瘤生长稳定。
表3：根据RECIST对总肿瘤反应的评价
患者编号 1 2 3 疾病分期 复发IVB IVA IVB 以前的Rx Whipples手术 外线束放射治疗 吉西他滨 外线束放射治疗 5-氟尿嘧啶 吉西他滨 无 治疗前的 Karnofsky评分 0 0 0
治疗与剂量 Rexin-G IV (3.0×1011U) Rexin-G IV (1.8×1011U) Rexin-G IV (2.7×1010U) 吉西他滨IV [1000mg/m2×8] 反应 肿瘤生长稳定 肿瘤生长稳定 肿瘤生长稳定 反应持续时间 3.4个月 ＞5.5个月 ＞4.7个月 存活状态 存活，疾病进展， 距诊断20个月 存活，疾病稳定， 距诊断14个月 存活，疾病稳定， 距诊断5个月
在本研究中，使用两种方法评价肿瘤对静脉内输注Rexin-G的应 答。使用测量大于2cm的目标病变最长直径总和的NCI-RECIST标 准，以及作为对比点的所有非目标病变的消失及持续存在，3名用 Rexin-G治疗的患者全部(100％)肿瘤生长稳定超过100天(3个月)(表 3)。通过肿瘤体积测定(公式：宽度2×长度×0.52)(16)对应答的评 价显示，在全部3名(100％)患者中Rexin-G均诱导肿瘤消退，即，1 号患者的转移性淋巴结病有33-62％的消退(表2)，2号患者的原发 肿瘤有47％的消退(图2C)，3号患者的原发肿瘤有30％的消退，72％ (13/18)的转移性肝病灶消除，转移性肝门结节89％消退，这通过影像 学研究(MRI或CT扫描)和测径器测量得到证明(图3)。进一步地， 安全性评价显示直到累积载体剂量为3×1011单位时没有发生剂量限 制性毒素，表明可以给予更多的载体，以达到更大的治疗效果。 Rexin-G载体输注与恶心或呕吐、腹泻、神经病、脱发、血液动力学 不稳定、骨髓抑制、肝或肾损伤无关。
实施例6：临床试验A，I/II期，Rexin-GTM，局部晚期或转移性 胰腺癌
临床研究A包括I/II期或单用方案，用于研究静脉内输注 Rexin-GTM对于局部晚期或转移性胰腺癌的效果，由菲律宾食品药品管 理局(BFAD)或美国食品药品管理局(FDA)和机构审查委员会或医院伦 理委员会(Institutional Review Board or Hospital Ethics Committee)批 准(Gordon等人.(2004)Int′l.J.Oncol.24：177-185)。本研究的目标是： (1)确定每日静脉内输注Rexin-GTM的安全性/毒性，和(2)评价静脉内 输注较高剂量水平的Rexin-GTM的潜在抗肿瘤反应。该方案是为估计 存活期至少为3个月的患者而设计的。在获得知情同意后，6名不可 手术切除的局部晚期或转移性胰腺癌患者通过重复输注Rexin-GTM进 行治疗。6名患者中有5名的标准化疗失败；这些患者在菲律宾马尼 拉和/或美国纽约Brooklyn完成如下的患者内剂量递增方案：第1-2 天：3.8×109单位；第3-4天：7.5×109单位；第5-6天：1.1×1010 单位；第7-10天：1.5×1010单位；休息一周；第18-27天：1.5×1010 单位。两名患者接受另外一个治疗周期，一名患者接受另外7个治疗 周期。患有不可手术切除的IV期胰腺癌的第六名患者接受联合治疗 作为一线治疗，包括6天的静脉内Rexin-GTM(3.8×109单位/天)，然 后是每周一次吉西他滨(1000mg/m2)，共8周。对于临床研究A， Rexin-GTM制剂的效能为3×107单位/ml。
不良事件按照NIH普通毒性标准(CTCAE版本2或3)(Common Toxicity Criteria Version 2.0.Cancer Therapy Evaluation Program. DCTD，NCI，NIH，DHHS，March，1998.)分级。为了评价Rexin-GTM的 临床有效性，我们考虑药物的总体杀细胞活性和抗血管生成活性 (Gordon等人.(2000)Cancer Res.60：3343-3347，Gordon等人.(2001) Hum.Gene Ther.12：193-204)，以及亲病灶性纳米颗粒向转移病变中 的动态摄取(Gordon等人.(2001)Hum.Gene Ther.12：193-204)，这将 影响治疗过程中靶向纳米颗粒的生物分布或生物利用性。由于载体更 容易在某些癌性病变内积累-这取决于肿瘤侵占和血管生成的程度， 预期不会均匀分布到其余的肿瘤结节，特别是在具有高肿瘤负荷的患 者中。这将可预测地诱导混合肿瘤反应，其中部分肿瘤的大小可能缩 小，而其他肿瘤结节可能变得更大，和/或新病变可能出现。之后，随 着总肿瘤负荷的正常化或下降，亲病灶性监视功能将略微更均匀地分 布循环纳米颗粒。另外，被治疗的病变在开始时由于坏死性肿瘤诱导 的炎症反应或囊性变而可能变得尺寸较大。因此，在对Rexin-GTM治 疗的客观肿瘤反应的评价中，除了实体瘤标准反应评价标准(RECIST； Therasse等人.(2000)J.Nat′l.Cancer Inst.92：205-216)以外，还使用另 外两个标准，即：(1)用于估计肿瘤体积的O′Reilly公式：L×W2×0.52 (O′Reilly等人.(1997)Cell 88：277-285)，和(2)在治疗期间肿瘤坏死或 囊性变的诱导。因此，目标病变肿瘤体积缩小30％或更多或者诱导肿 瘤内的坏死或囊性变被认为是部分反应(PR)或阳性治疗效果。利用单 侧精确检验(one-sided exact test)确定用Rexin-GTM治疗的患者的PR 和历史对照之间差异的显著性，预期为5％PR。
这一最初的I/II期研究检查了患者内剂量递增方案的安全性和潜 在有效性。如表4所示，在6名用Rexin-GTM治疗的患者中有5名表 现不同程度的部分反应(PR)，而在其余患者中观察到疾病稳定。根据 RECIST或者通过肿瘤体积测量，6名患者中有3名(50％)的肿瘤尺寸 缩小30％或更多，通过活检和/或后续MRI/CAT扫描，发现6名患者 中有2名(33％)的原发肿瘤或转移结节出现坏死。利用肝活检对一名 特殊患者(A3)进一步分析，CT扫描可见该患者的8个肿瘤结节中有6 个消失，这表明肿瘤结节内的凋亡、坏死和纤维化的发生率提高，这 与临床前研究中的发现(18，19)类似，并且在肝活检物的残余肝脏肿瘤 中观察到大量肿瘤浸润淋巴细胞(图20-22)。浸润剩余肝脏肿瘤的免 疫反应性T和B淋巴细胞的存在(图22)表明Rexin-GTM不抑制局部 免疫应答。6名患者中有4名(67％)的无进展存活期长于3个月。耐受 化疗的患者在Rexin-GTM治疗后的存活期中值为10个月，诊断后的存 活期中值为25个月。相比之下报道的接受吉西他滨或5-FU(标准治 疗)作为一线药物的胰腺癌患者的存活期中值分别为诊断后5.65和 4.41个月(Burris等人.(1997)J.Clin.Oncol.15：2403-2413)。利用单侧 精确检验，与历史对照的PR率相比，Rexin-GTM-治疗的患者中部分 反应的显著性水平＜0.025。这些最初的发现，尽管只在较少的患者中 得到证实，但是足以表明Rexin-GTM在临床上是有效的，甚至在适中 的剂量时，显然优于没有药物治疗，并且在作为单药治疗晚期或转移 胰腺癌患者时，可能优于吉西他滨。
表4：临床研究A参与者的客观肿瘤反应、无进展存活期和总存活期
患者编号， 年龄 客观肿瘤反应 无进展存 活期 Rexin-G治 疗后的状态 /存活期 距Dx的 总存活期 A1 46岁 部分反应：原发肿瘤坏 死，肿瘤尺寸缩小24％； 锁骨上淋巴结尺寸缩小 33-62％；疼痛症状缓解 3.5个月 死亡 10个月 23个月 A2 55岁 部分反应(RECIST)：原发 肿瘤体积减少47％，然后 肿瘤完全消失 疼痛症状缓解 9个月 死亡 13个月 25个月 A3 45岁 部分反应(RECIST)：原发 肿瘤体积减少47％；8个 肝脏结节中有6个消失； 活检肝脏中的肝结节凋 亡和坏死 疼痛症状缓解 4个月 死亡 9个月 19个月 A4 64岁 部分反应/疾病稳定：11 个肝结节中有5个消失； 原发肿瘤稳定 2个月 死亡 8个月 48个月 A5 53岁 疾病稳定：原发肿瘤没有 变化；3个肝脏结节中有 一个消失 2个月 死亡 10个月 30个月 A6 46岁 部分反应(RECIST)：原 发肿瘤体积减少30％；18 个肝结节中有13个消失 5个月 死亡 7个月 7个月
全部6名患者良好地耐受Rexin-GTM输注，没有相关的恶心和呕 吐、腹泻、粘膜炎、脱发或神经病。6名患者中有3名(50％)的疼痛症 状缓解。没有与研究药物相关的血液动力学功能的显著改变、骨髓抑 制、肝脏、肾脏或任何器官的功能障碍。明确与研究药物有关的唯一 的不良事件是在6名患者的2名中出现全身皮疹和荨麻疹(1-2级)， 可能相关的不良事件是在6名患者的2名中出现间歇热(I级)。在该 研究中观察到有限数量的治疗引起的不良事件，提示以递增剂量静脉 内施用的Rexin-GTM是相对安全的治疗。
实施例7：在各种晚期或转移性实体瘤中的临床研究B，I/II期 Rexin-GTM
临床研究B代表临床研究A的扩展。基于最初使用Rexin-GTM获 得的临床经验的令人鼓舞的结果，扩展了I/II期研究，以进一步确定 较高剂量Rexin-GTM的安全性和潜在有效性，以将临床适应症扩大到 所有难以用标准化疗治疗的晚期或转移性实体瘤，并且调整治疗日程 和方案以允许门诊治疗。该研究的目的是：(1)确定每日静脉内输注 Rexin-GTM的安全性/毒性，和(2)评价静脉内输注较高剂量水平的 Rexin-GTM的潜在抗肿瘤反应。该方案是为估计存活期至少为3个月 的患者而设计的。在获得知情同意后，10名患有起源于外胚层(黑素 瘤，1；喉鳞状细胞癌，1)、中胚层(平滑肌肉瘤，1)或内胚层(胰 腺癌，2；乳腺癌，2；子宫癌，1；结肠癌，2)的转移癌的患者，和 一名以前未接受治疗并且拒绝进行化疗的新诊断的转移性胰腺癌患 者(患者总数为11)，按照以下治疗方案静脉内接受剂量为每天3.0× 1010的作为单一药物的Rexin-GTM：第1-5、8-12、15-19和22-26天； 周一到周五，周末为休息期。改良的GMP生产和生物加工方案允许 生产实质更高滴度的Rexin-GTM，因此用于临床研究B的制品显示出 7×108单位/ml的载体效价。
不良事件按照NIH普通毒性标准(CTCAE版本2或3)(Common Toxicity Criteria Version 2.0.Cancer Therapy Evaluation Program. DCTD，NCI，NIH，DHHS，March，1998.)分级。为了评价Rexin-GTM的 临床有效性，我们考虑药物的总体杀细胞活性和抗血管生成活性 (Gordon等人.(2000)Cancer Res.60：3343-3347，Gordon等人.(2001) Hum.Gene Ther.12：193-204)，以及亲病灶性纳米颗粒向转移病变中 的动态摄取(Gordon等人.(2001)Hum.Gene Ther.12：193-204)，这将 影响治疗过程中靶向纳米颗粒的生物分布或生物利用性。由于载体更 容易在某些癌性病变内积累-这取决于肿瘤侵占和血管生成的程度， 预期不会均匀分布到其余的肿瘤结节，特别是在具有高肿瘤负荷的患 者中。这将可预测地诱导混合肿瘤反应，其中部分肿瘤的大小可能缩 小，而其他肿瘤结节可能变得更大，和/或新病变可能出现。之后，随 着总肿瘤负荷的正常化或下降，亲病灶性监视功能将略微更均匀地分 布循环纳米颗粒。另外，被治疗的病变在开始时由于坏死性肿瘤诱导 的炎症反应或囊性变而可能变得尺寸较大。因此，在对Rexin-GTM治 疗的客观肿瘤反应的评价中，除了实体瘤标准反应评价标准(RECIST； Therasse等人.(2000)J.Nat′l.Cancer Inst.92：205-216)以外，还使用另 外两个标准，即：(1)用于估计肿瘤体积的O′Reilly公式：L×W2×0.52 (O′Reilly等人.(1997)Cell 88：277-285)，和(2)在治疗期间肿瘤坏死或 囊性变的诱导。因此，目标病变肿瘤体积缩小30％或更多或者诱导肿 瘤内的坏死或囊性变被认为是部分反应(PR)或阳性治疗效果。
本研究通过剂量增加扩展了最初的I/II期胰腺癌方案，并且将其 临床应用扩大到所有实体瘤。如表5所示，在11名患者中的7人中 (64％)观察到不同程度的原发肿瘤或转移性结节的部分反应。通过活 检或CT扫描确定，11名患者中有5人(45％)发生原发肿瘤和/或转移 性结节坏死或凋亡，根据RECIST或肿瘤体积测量确定，11名患者中 有5人(45％)的原发肿瘤或转移性结节的尺寸缩小了30％以上。11名 患者中有2人的疾病稳定，一名具有大肿瘤负荷的患者发生混合肿瘤 反应，一名具有高肿瘤负荷(约50个肝脏结节)的患者的疾病进展。
表5：临床研究B的参与者的客观肿瘤反应、无进展存活期和总存活 期
患者编号、 年龄、Dx 和Dx日 总肿瘤反应[症状缓解， 测径器，CT扫描和MRI] 无进展 存活期 Rexin-G治 疗后的状态 /存活期 距离诊断 的总存活 期 B1 53岁 乳腺癌 部分反应(RECIST)：活检 可见肿瘤结节凋亡和坏 死；PET/CT扫描可见锁 骨上淋巴结减少50％ 3个月 存活 ＞13个月 ＞6.6年 B2 58岁 子宫癌 部分反应：CT扫描可见锁 骨上淋巴结坏死；测径器 测得颈淋巴结缩小33％ 神经痛症状缓解 3个月 死亡 4个月 2年4个月 B3 52岁 乳腺癌 疾病稳定：肺结节没有间 隔改变 咳嗽和骨痛症状缓解 2个月 存活 ＞7个月 ＞3年5个 月 B4 41岁 黑素瘤 部分反应：活检肿瘤结节 坏死和凋亡；CT扫描可见 肿瘤体积缩小50％ 3个月 存活 ＞6个月 ＞15个月 B 5 53岁 胰腺癌 疾病进展 疼痛症状缓解 N.A. 存活 ＞6个月 ＞11个月 B6 48岁 鳞状细胞 癌，喉 部分反应(RECIST)：上呼 吸道直径增加300％；肺结 节稳定 声音恢复 3个月 存活 ＞6个月 ＞24个月
在胰腺癌患者中，以及在子宫癌、结肠癌、乳腺癌和恶性黑素瘤 患者中，一致性地观察到重复输注Rexin-GTM引起的癌性淋巴结的进 行性缩小，这在理解有关药效学方面是显著的和有意义的。众所周知 前哨淋巴结-癌可能从原发肿瘤扩散到的第一个淋巴结-对于我们 理解转移疾病的发病机理、诊断和预期治疗来说相当重要，Rexin-GTM 向局部和远处淋巴结的明显渗透是明显的和顺利的(表4和表5)。 Rexin-GTM中的亲病灶性纳米颗粒在体内循环时保持其生物活性的发 现的临床意义无需夸大，不仅在原发和转移病变中积累，而且到达治 疗影响的淋巴结中。如图23所示，来自恶性黑素瘤患者腹股沟区的 癌淋巴结的手术活检显示实质坏死(23-A)、大面积的明显凋亡(23-B) 和充满含铁血黄素的巨噬细胞(23-C)排出肿瘤碎片的区域。而且，免 疫组化染色显示明显的CD35+树突细胞(23-D)、CD68+巨噬细胞 (23-E)、CD8+杀伤T细胞(23-F)和CD4+辅助T细胞(未示出)的单 核细胞浸润。亲病灶性纳米颗粒在渗入前哨淋巴结内转移病变时其基 因递送功能(既杀细胞活性)保持活性，并且不破坏免疫系统而是与 免疫系统协同作用，这再次证实了未来使用这种携带细胞因子基因的 靶向基因递送系统进行原位癌症接种的潜力。
在另外一名喉鳞状细胞癌患者中，颈部MRI证实了上呼吸道明 显再开放(图24)，这与患者声音的恢复相关。无进展存活期的范围 从1个月到大于5个月。存活时间中值大于从开始Rexin-GTM治疗起 6个月，超过距诊断24个月。11名患者中有8人(72％)存活/存活超过 Rexin-GTM治疗后6-13个月。总之，Rexin-GTM在广泛的抗性肿瘤类 型范围中可能具有单药活性。此外，注意到在大多数患者中观察到持 久的疗效，尽管治疗比较简短。
全部11名患者良好耐受载体输注，没有相关的恶心或呕吐、腹 泻、粘膜炎、脱发或神经病。11人有8人(73％)的疼痛、胃气胀、搏 动、声音嘶哑和疲劳症状缓解。没有与研究药物相关的血液动力学功 能的显著改变、骨髓抑制、肝脏、肾脏或任何器官的功能障碍。没有 与治疗相关的不良事件进一步提示甚至在提高载体剂量时， Rexin-GTM仍然是相对安全的治疗。在这点上，没有剂量限制性毒性， 以及令人注意的在多种不同肿瘤类型中具有单药有效性的迹象，和最 近可以获得较高效能的Rexin-GTM制剂，这些结合起来促进了为提高 临床有效性和优化治疗方案而设计的临床试验的进展和批准
实施例8：临床研究C，Rexin-GTM在转移性胰腺癌和结肠癌中的 扩展应用和“等价计算”
临床研究C涉及一小组患者，他们参与Rexin-GTM对于所有实体 瘤的扩展应用计划(Expanded Access Program)，这是最近菲律宾 BFAD批准的一项临时计划。设计这一创新性的方案来尽可能快速且 安全地解决(即减少或根除)特定患者的总肿瘤负荷，以防止或阻止 “追赶性的”肿瘤生长，由此使这一混合参数最小化。估计的总应用 剂量通过经验计算来确定，在此称为“等价计算”(称为一种在量上 相等的方法，或功能等价)。基本公式考虑根据影像研究估计的总肿 瘤负荷(1cm＝大约1×109癌细胞)、对于靶向载体系统的经验表现 系数(φ)或生理感染复数(P-MOI，病毒学)(非靶向载体系统的P-MOI 基本上是无限的)、和临床级制剂的效能(单位/ml)。肿瘤负荷通过 将以厘米为单位的肿瘤结节最长直径之和乘以1×109确定，表示为 癌细胞总数。“运算定义的”表现系数(φ)或生理感染复数MOI (P-MOI)对于Rexin-GTM为100，基于在多项临床前研究中证实的靶 向基因递送系统的转导效率提高的定量证明，并且基于在最初临床试 验中观察到的Rexin-GTM的剂量依赖性表现。重要的是，高效 Rexin-GTM产物(～1.0×109单位/ml)的产生允许静脉内施用计算的 Rexin-GTM最适剂量，而没有体积过载的风险。开创性研究：在前20 天的Rexin-GTM输注结束后，两名转移性胰腺癌患者和一名转移性结 肠癌患者(取得知情同意)分别在6周(1名患者)和16周(2名患 者)内继续接受静脉内Rexin-GTM输注，可达大约2.5×1012单位的总 剂量。这提供了等价计算，与基于CT扫描或MRI估计的患者肿瘤负 荷大致平行。
不良事件按照NIH普通毒性标准(CTCAE版本2或3)(Common Toxicity Criteria Version 2.0.Cancer Therapy Evaluation Program. DCTD，NCI，NIH，DHHS，March，1998.)分级。为了评价Rexin-GTM的 临床有效性，我们考虑药物的总体杀细胞活性和抗血管生成活性 (Gordon等人.(2000)Cancer Res.60：3343-3347，Gordon等人.(2001) Hum.Gene Ther.12：193-204)，以及亲病灶性纳米颗粒向转移病变中 的动态摄取(Gordon等人.(2001)Hum.Gene Ther.12：193-204)，这将 影响治疗过程中靶向纳米颗粒的生物分布或生物利用性。由于载体更 容易在某些癌性病变内积累-这取决于肿瘤侵占和血管生成的程度， 预期不会均匀分布到其余的肿瘤结节，特别是在具有高肿瘤负荷的患 者中。这将可预测地诱导混合肿瘤反应，其中部分肿瘤的大小可能缩 小，而其他肿瘤结节可能变得更大，和/或新病变可能出现。之后，随 着总肿瘤负荷的正常化或下降，亲病灶性监视功能将略微更均匀地分 布循环纳米颗粒。另外，被治疗的病变在开始时由于坏死性肿瘤诱导 的炎症反应或囊性变而可能变得尺寸较大。因此，在对Rexin-GTM治 疗的客观肿瘤反应的评价中，除了实体瘤标准反应评价标准(RECIST； Therasse等人.(2000)J.Nat′l.Cancer Inst.92：205-216)以外，还使用另 外两个标准，即：(1)用于估计肿瘤体积的O′Reilly公式：L×W2×0.52 (O′Reilly等人.(1997)Cell 88：277-285)，和(2)在治疗期间肿瘤坏死或 囊性变的诱导。因此，目标病变肿瘤体积缩小30％或更多或者诱导肿 瘤内的坏死或囊性变被认为是部分反应(PR)或阳性治疗效果。
本研究是Rexin-GTM治疗所有实体瘤的扩散应用计划中的临床经 历首次报告，引入了被称为等价计算的创新的个体化剂量密集方案。 在这个初步但是重要的间断分析中，在全部3名具有广泛肿瘤负荷的 患者中都观察到显著反应。对于一名患者(C1)，等价计算(或功能 等同的方案)估计了累积剂量，后续MRI显示，该累积剂量导致不 可切除的胰腺肿瘤液化性坏死和囊性转变，以及所有转移性肝结节的 囊性转变或消失(图25)。一个囊性肿瘤结节的吸出物为恶性细胞阴 性。对于患有IV期结肠癌的第二名患者(C2)，接近预定等价计算的 累积剂量有效地减少转移性病变的大小：影像分析证实在肝肿瘤结节 中观察到84％的坏死。对于第三名患者(C3)，CT扫描可见原发性胰 腺肿瘤以及肺结节的数目(从28个肺结节降至12个)和大小显著降 低。两名患者在Rexin-GTM治疗后的无进展存活期和总存活期超过6 个月。这些结果提供了初步证据，支持等价计算可以用来确定解决特 定患者肿瘤负荷的Rexin-GTM总累积剂量的假设，因此包括最佳诱导 方案。
全部三名患者都良好地耐受载体输注，没有相关的恶心或呕吐、 腹泻、粘膜炎、脱发或神经病。没有与研究药物相关的血液动力学功 能急性改变、骨髓抑制、肝脏、肾脏或任何器官的功能障碍。两名患 者发生需要红细胞输入的贫血(3级)，这可能与后来的坏死肿瘤内出 血有关。一名患者发生散发的血小板减少(1-2级)，这可能与研究药 物有关。一名患者在Rexin-GTM治疗3个月后死于急性暴发的葡萄球 菌表皮炎败血病，这不是研究药物引起的。这名患者的尸检结果显示 残余的胰腺肿瘤几乎完全坏死，肝脏和腹部肠系膜中剩余的转移性肿 瘤75-95％坏死，而在骨髓、心脏和脑中为正常组织学。Rexin-GTM施 用不引起全身毒性强调了Rexin-GTM相对于标准化疗在控制转移癌以 及其他生活质量方面的潜在优点。这各种情况下，总体肿瘤破坏程度 是明显的。证明了特别是为克服患者的肿瘤负荷而设计的Rexin-GTM 剂量密集方案能够达到这些有效性水平，这强调了需要进一步精练等 价计算，以确定最佳肿瘤消除率，并且确定用于经历杀肿瘤后创伤愈 合的患者的最佳支持疗法。
实施例9：临床研究D，Rexin-G用于标准化疗难治性局部晚期或 转移性胰腺癌的I期临床试验
在临床研究D中，12名局部晚期或转移性胰腺癌患者接受静脉 内输注Rexin-G治疗，以证实在以上临床研究A的6名患者中观察到 的初步临床结果。这些最初的患者接受重复Rexin-G输注，累积剂量 可达1012cfu，而不显示骨髓抑制或器官损伤。
设计该研究用来按照剂量递增方案基于观察到的剂量限制性毒 性(DLT)评价最大耐受剂量(MTD)，其中MTD被定义为6名患者中最 多有1人发生DLT、而下一较高剂量水平时6名患者中至少2人发生 DLT的最高安全耐受剂量。血液学不良事件定义为根据NCI不良事 件普通术语标准v3.0，任何≥3级的至少可能与Rexin-G相关的事件。 3级ANC持续＜72小时。非血液学不良事件定义为根据NCI不良事 件普通术语标准v3.0，任何≥3级的至少可能与Rexin-G相关的事件。 只有患者已经接受最大支持治疗时，才认为≥3级的恶心、呕吐或腹泻 是剂量限制性的。不认为脱发是剂量限制性的。
患者接受三个不同剂量水平的Rexin-G。对于剂量水平1，有3 名患者在第1-7和15-21天时接受7.5×109cfu的治疗。对于剂量水 平2，有6名患者在第1-7和15-21天时接受1.1×1010cfu的治疗。 对于剂量水平3，有3名患者在第1-5、8-12、15-19和22-26天时接 受3.0×1010cfu的治疗。所有患者都接受每次每千克体重8ml的最 大体积。
对于剂量水平1，所有3名患者都完成疗程，并且接受100％的 剂量。没有患者在治疗过程中或在1周的观察期内发生DLT。对于剂 量水平2，4名患者接受完全剂量的Rexin-G。在2名没有接受完全剂 量的患者中，一名患者由于可能与治疗有关的3级AST和ALT升高 而调整了剂量。然而，该患者还每日施用1000mg醋氨酚。在中断 Rexin-G和醋氨酚后72小时内，所述升高降至I级。另一名患者由于 发生2级碱性磷酸酶不利事件而坚持了一天的治疗。对于剂量水平3， 至今还没有毒性总结报告，但是没有患者发生SAE或DLT。
证实了Rexin-G在测试剂量水平的安全性后，研究了病毒颗粒在 静脉输注后的药代动力学和它们引起免疫应答、发生重组事件(产生 有复制能力的逆转录病毒)和载体整合到非靶器官中的能力。对于病 毒颗粒的药代动力学，在第1天载体输注后0、5、30、60、120min 和24小时时获得全部12名患者的血样。基于新霉素抗性(neor)基因 产物的表达确定并定量Rexin-G载体浓度(病毒滴度)。
简要地说，在转导前一天，将1.5×104HT1080(人纤维肉瘤细胞) 细胞接种在12孔板上。培养基与0.5ml连续稀释的含有8μg/ml聚凝 胺(polybrene)的病毒上清液一起在32℃、5％CO2条件下轻摇孵育 3.5小时。向培养物中加入0.5ml新鲜培养基，然后在37℃、5％CO2 条件下保持过夜。对于neor基因产物的表达，从转导24小时后开始， 通过用G418药物(500μg/ml)处理筛选G418抗性集落。在G418药物 中孵育13天后通过限制稀释定量用亚甲蓝染色的G418抗性集落数。 病毒滴度表示为每毫升血清的集落形成单位数(cfu/ml)。
结果证明，在接受剂量水平1的全部3名患者、接受剂量水平2 的6名患者中的2人、接受剂量水平3的3名患者中的2人在Rexin-G 输注5分钟后获得的血样中，neor选择性Rexin-G载体含量极低(＜1× 102cfu/ml)，但是可以检测到。在30分钟以外的时间点没有回收到载 体。最低的载体回收可能是由于许多因素，这一发现最可能表明载体 向肿瘤内的生物分布，已知其在输注数分钟内发生。这符合临床前研 究结果，其中发现在静脉内输注后数分钟内，显著量的免疫反应性 Rexin-G在癌异种移植物中积累(Gordon等人.，2001)。循环载体向肿 瘤内的这种快速分配是由于亲病灶性(寻找病变的)载体对于在活跃 血管生成和/或肿瘤侵占区域特征性暴露的胶原蛋白微阵列的特定亲 和力和粘附性(例如在血小板粘附中)。因此，Rexin-G在受治疗患者循 环中的短生物半衰期可能是由于向原发和转移病变内的快速生物分布。 无论有关的机制如何，在输注后，极少的(如果有的话)循环Rexin-G 在系统循环中保留超过30分钟。
在输注前和治疗4周(剂量水平1、2)后和6周(剂量水平3) 后从全部12名患者获得血清样品，用来检测抗载体抗体的存在。用 载体中和试验和Western狭缝印迹分析结合检测抗载体抗体的存在。 在用剂量水平I-III的Rexin-G治疗的患者的血清中未检测到载体中和 抗体和抗gp70 env蛋白抗体。这些数据证实了在小鼠中的临床前结 果，其中在重复输注Rexin-G后没有检测到载体中和抗体。这些发现 证实了Rexin-G的低免疫原性，这允许重复静脉内施用，而不会丧失 潜在的临床有效性。
在时间0(载体输注前)和开始载体输注4周(剂量水平2)后 或6周(剂量水平3)后从7名患者获得外周血淋巴细胞，从中提取 DNA进行RCR检测。该试验设计用来通过PCR检测Rexin-G逆转录 病毒载体中存在的2001bp莫洛尼鼠白血病病毒包膜(MoMLV Env)基 因一小部分(来自411-574bp的164bp片段)的存在。发现检测的所有 输注后样品都是RCR阴性的。
在输注前、治疗后1周、4周(剂量水平1、2)、第5天和6周 (剂量水平3)后从9名患者获得外周血淋巴细胞，从中提取DNA 检测是否存在载体DNA整合。对外周血淋巴细胞中载体DNA整合的 检测如下进行：离心患者的血样，从RBC和血清中分离白细胞。使 用Neo引物，对分离的白细胞DNA进行实时PCR，以扩增dnG1-Erex 逆转录病毒载体中存在的795bp新霉素磷酸转移酶(NPT)基因的一小 部分(来自382-456bp的75bp片段)。
在外周血淋巴细胞DNA中没有检测到载体DNA序列，证实了临 床前数据，其中除了Rexin-G治疗的小鼠、大鼠和兔子的肝脏和脾脏 (病毒清除器官)以外，在非靶器官中没有检测到载体DNA。
静脉内施用Rexin-G后的抗肿瘤活性利用RECIST进行评价。接 受剂量水平1的所有3名患者都在第28天前后进展。接受剂量水平2 的6名患者中有5名在治疗开始大约1个月内进展。其他患者按照 RECIST被认为疾病稳定，但确实遭受症状恶化。接受剂量水平3的 全部3名患者在第42天评价时进展。
利用测量的以Hounsfield单位表示的肿瘤密度来评价Rexin-G的 生物学活性。对于接受剂量水平1的3名患者和接受剂量水平2的6 名患者中的每一名，以Hounsfield单位表示的基线处和第28天时的 肿瘤密度数据由多处病变获得(7名患者中的5处病变，一名患者的 3处病变，和一名患者的2处病变)。这些数据以两种方式进行总结。
表6显示了每名患者中，肿瘤密度任意降低的病变的比例，以及 至少降低10％、15％和20％的病变的比例。病变显然倾向于密度降低： 全部9名患者所测的病变的Hounsfield单位均为净减少，其显著性高 于单独偶然的预期(双侧p值＝0.004)。然而，剂量水平没有强烈的差 异指示；例如，在针对显示至少降低20％的病变比例比较剂量水平时， 双侧p值为0.43(连续校正的Wilcoxon秩和检验)。
表6：满足肿瘤密度降低的各患者的病变比例
剂量水平 患者 所有降低 ≥10％降低 ≥15％降低 ≥20％降低 1 1 3/5(60％) 3/5(60％) 2/5(40％) 1/5(20％) 1 2 4/5(80％) 2/5(40％) 2/5(40％) 2/5(40％) 1 3 5/5(100％) 4/5(80％) 3/5(60％) 2/5(40％) 2 4 1/2(50％) 1/2(50％) 1/2(50％) 1/2(50％) 2 5 3/5(60％) 3/5(60％) 3/5(60％) 1/5(20％) 2 6 2/3(67％) 2/3(67％) 0/3(0％) 0/3(0％) 2 7 5/5(100％) 5/5(100％) 5/5(100％) 5/5(100％) 2 8 4/5(80％) 4/5(80％) 4/5(80％) 4/5(80％) 2 9 4/5(80％) 4/5(80％) 4/5(80％) 3/5(60％)
表7按照剂量水平总结了肿瘤密度降低满足各种标准的患者的比 例，例如，至少50％的病变的密度任意降低。另外，没有清楚的证据 表明剂量水平之间的差异。
表7：根据几个标准，具有有效治疗的患者的比例
标准 剂量水平 1 剂量水平2 所有患者 ≥50％的病变任意降 低 3/3(100％) 6/6(100％) 9/9(100％) ≥60％的病变任意降 低 3/3(100％) 5/6(83％) 8/9(89％) ≥75％的病变任意降 低 2/3(67％) 3/6(50％) 5/9(56％) ≥80％的病变任意降 低 2/3(67％) 3/6(80％) 5/9(56％) 100％的病变降低 1/3(33％) 1/6(17％) 2/9(22％) ≥1/3的病变降低 ≥20％ 2/3(67％) 4/6(67％) 6/9(67％) ≥2/3的病变降低 ≥20％ 0/3(0％) 2/6(33％) 2/9(22％)
这些数据证实与基线测定值相比，在Rexin-G治疗后目标病变的 肿瘤密度显著降低，表明癌细胞数减少和/或肿瘤结节内的坏死或囊性 转化，这满足CHOI的部分反应(PR)标准，因此证实了Rexin-G生物 学活性。
接受剂量水平1的患者均具有导致死亡的疾病进展，存活期中值 为3.5个月。接受剂量水平2的所有患者具有导致死亡的疾病进展， 存活期中值为2.5个月。对于剂量水平3，一名患者在治疗后存活4 个月后死于疾病进展，在最后一次随访时另外两名患者仍然存活。
本研究证实了在最初临床研究A中获得的结果，证明了Rexin-G 在剂量水平1、2和3时的安全性。进一步地，静脉输注后病毒颗粒 的药代动力学指示快速肿瘤靶向，施用5分钟后在血液中检测到极少 的病毒颗粒。在6周的随访期内没有观察到诱发的针对病毒颗粒的免 疫应答，表明载体具有低免疫原性，因此允许重复治疗周期。没有发 现重组事件，证实了3-质粒转染系统显著降低这些事件的风险的能 力。也没有发现载体在非靶器官中的整合。接受剂量水平1和2的所 有9名患者证实都有肿瘤密度降低，表明Rexin-G的生物学活性，但 是在两个剂量水平之间没有观察到肿瘤应答的差异。
实施例10：单药Rexin-G对于转移性骨肉瘤的有效性的病例研究
于2003年12月诊断为右胫骨骨肉瘤的17岁的男性接受手术前 顺铂、阿霉素和高剂量氨甲喋呤化疗，然后行四肢救助术。对肿瘤的 组织病理学检查显示手术前化疗只引起50％的坏死。手术后，他接受 两次顺铂和阿霉素，两次阿霉素和异环磷酰胺，使阿霉素的累积剂量 达到400mg/m2。化疗在2005年2月结束。2006年3月，后续CT扫 描显示有两个左侧肺转移，通过VATS胸腔镜手术切除。CT扫描和 PET扫描显示在手术区存在持久的病变。从2006年6月至11月，他 接受了高剂量的氨甲喋呤和异环磷酰胺，然后在2006年11月接受了 开胸手术。2006年12月的重复CT扫描显示肺转移进展，证实标准 化疗失败。2007年1月开始使用泰素帝(taxotere)、健择(gemzar) 和阿霉素进行挽救治疗，但是连续影像学检查证明他的肺肿瘤在尺寸 和数量上都增长，到2007年4月，从大小为1cm的一个肺结节生长 为超过10个肺结节，最大病变的大小为4.2cm。
在获得正式知情同意后，患者加入Rexin-G单用方案。在开始 Rexin-G治疗之前，使用以前Gordon等人.(2006)描述的等价计算确 定累积载体剂量：将估计的肿瘤负荷(定义为1×109个癌细胞的所 有病变最长直径之和)乘以经验靶向或生理系数100(生理感染复数， pMOI)。累积载体剂量确定为1.8×1012cfu Rexin-G载体，预测该患 者需要18-20次Rexin-G输注(每次1×1011cfu)才能终止疾病进展并 且诱导客观肿瘤反应。
Rexin-G的第一治疗周期为每周静脉内施用两次1×1011cfu，持 续4周，然后是2周的休息期，导致累积剂量为8×1011cfu。在连续 治疗周期之前和之后进行连续PET-CT扫描(图30)。第一周期结束后 一周获得的PET-CT扫描显示目标病变的总大小增加28％，目标病变 的总肿瘤密度减少6％，4个目标病变的SUV最大值之和降低33％， 注意到3个新的小肺病变。由于替代治疗选择极少，并且没有观察到 对Rexin-G输注的毒性，FDA批准另外的Rexin-G治疗周期：静脉内 施用1×1011cfu，每周两次，共4周，使累积剂量达到1.6×1012cfu， 这接近基于最初肿瘤负荷预测的Rexin-G总剂量。值得注意的是，在 完成第二周期2周后进行的PET-CT扫描显示没有新的病变，肿瘤密 度之和增加539％，表明目标病变钙化，4个目标病变的SUV最大值 之和减少48％(图31-33)。主要研究人员认为这是对治疗的阳性部分 反应，尽管肿瘤直径之和增加。
基于阳性肿瘤反应，开始了对化疗难治性复发或转移性骨肉瘤的 II期临床试验。由于PET成像是测定肿瘤反应的最有效的成像方法， 并且因为RECIST标准由于肿瘤结节持续修补钙化而不能准确反映肿 瘤反应，FDA不使用标准RECIST标准而代之以国际PET标准，来 监视和报告肿瘤反应。
实施例11：使用适应性试验设计的晚期I/II期临床试验
在美国对复发性或转移性肉瘤、乳腺癌或胰腺癌患者同时进行三 个具有适应性试验设计的晚期I/II期临床试验。这些研究的目标有三 方面。1)确定通过静脉内(IV)输注施用的Rexin-G的剂量限制性毒性 和最大耐受剂量。2)评价静脉内Rexin-G引起免疫应答、重组事件 和不希望的载体在非靶器官中整合的能力。3)鉴定静脉内施用的 Rexin-G的抗肿瘤反应。
每项研究有总共有15-24名患者加入。表8示出了5个计划的剂 量水平，已经以剂量水平0进行治疗。
表8：Rexin-G的计划剂量水平
治疗周期＊(4周) 剂量水平 载体剂量/天 最大体积/剂量
每周两次 0 1.0×1011cfu 200ml
起始剂量：
每周三次 I 1.0×1011cfu 200ml
每周三次 II 2.0×1011cfu 200ml
每周三次 III 3.0×1011cfu 200ml
每周三次 IV 4.0×1011cfu 200ml
*每个治疗周期均为6周(4周治疗，两周休息)。毒性＜I级的患者 可以进行重复治疗周期。
三名采用肉瘤方案的患者以剂量水平0(1×1011cfu，每周两次)治 疗，观察42天，没有DLT。如果观察到临床效果并且所有治疗相关 毒性≤1级，适应性试验设计允许患者用相同治疗周期治疗。此外， 如果毒性＜1级，则患者也可以继续接受下一个较高的剂量水平。剂 量水平0的肉瘤患者目前加入剂量水平1。这将增加获得肿瘤生长控 制并且诱导客观肿瘤反应的机会，而不会影响安全性。
适应性试验设计也使主要研究者能够在第一个治疗周期结束后 推荐手术斑块切除或手术切除剩余的肿瘤。如果通过PET-CT扫描在 组织病理学标本中检测到残余肿瘤，并且该患者具有1级或更低的毒 性，则重新开始治疗周期。
对于全部三项临床试验，三名患者将加入剂量水平1。如果接受 剂量水平1的3名患者中有一人发生3或4级与Rexin-G相关或可能 相关的不良事件(CTCAE版本3.0)，则另外3名患者加入同一剂量水 平。如果接受剂量水平1的前3名患者中至少有两人或者6名患者中 有3人发生3至4级与Rexin-G相关或可能相关的不良事件，则向该 研究中继续增加，直到食品药品监督管理局(FDA)讨论这些数据， 并作出是继续还是终止研究的决定。这些剂量限制性毒素原则适用于 所有剂量水平。
直到3名患者已经用前一剂量水平治疗，并且观察了42天(6 周)，才将剂量升高到下一剂量水平。没有组内剂量递增。在任意剂 量水平时，如果在前3名患者中证明有生物学活性，则可以加入最多 6名患者。如果存在生物学活性的明显证据，则可以终止剂量递增。 进行一次修改，以允许基于明显的生物学活性进一步扩大剂量水平。
研究的主要终点是根据患者机体状态、毒性评价评分、血液学和 代谢谱确定的、通过DLT和MTD证实的临床毒性。次要终点是 Rexin-G引起免疫应答、重组事件或不希望的载体在非靶器官中整合 的潜力。
根据RECIST、CHOI和PET标准测定对Rexin-G的客观肿瘤反 应。迄今为止，10名患者已经用1×1011cfu的第一剂量水平治疗，每 周两次，共4周(肉瘤，n＝6；乳腺癌，n＝1；胰腺癌，n＝3)。对 4名患者进行4周的肿瘤反应评价，在表9中列出。
表9：4名用剂量水平1的Rexin-G治疗的患者的肿瘤反应
患者编号 疾病 根据RECIST 的反应 根据PET的 反应 根据CHOI的 反应 1 肉瘤 疾病稳定 疾病稳定 疾病进展 2 肉瘤 疾病稳定 疾病稳定 疾病稳定 3 肉瘤 疾病进展 疾病稳定 疾病稳定 4 胰腺癌 疾病稳定 疾病稳定 疾病稳定
表9显示在Rexin-G治疗4周后，三名接受肉瘤方案的患者中的 两人，和一名接受胰腺癌方案的患者，根据RECIST显示疾病稳定， 4名患者根据PET显示疾病稳定。全部4名Rexin-G治疗的患者在进 行标准化疗时经CT扫描均证明有肿瘤进展。这些数据表明，根据 RECIST，Rexin-G终止了4名患者中的3人(75％)的肿瘤进展，根据 CHOI标准，终止了4名患者中的3人(75％)的肿瘤进展，根据PET， 终止了全部4名患者(100％)的肿瘤进展，表明PET扫描成像结果可以 用作肿瘤对Rexin-G治疗的反应的早期指示。按照FDA批准的I/II 期方案，另外3名患者加入第一剂量水平的肉瘤方案，因为显示 Rexin-G在该剂量水平时具有生物学活性。进一步地，肉瘤和胰腺癌 方案中每一方案的6名患者都以每个剂量水平加入，以评价剂量应答， 并确定Rexin-G对于每个临床适应症的最佳生物学剂量和治疗方案。
实施例12：49名用Rexin-G治疗的患者的有效性和安全性数据 的总结
积累的临床证据表明，与传统化学治疗相比，Rexin-G具有独特 的安全性分布。观察到客观肿瘤反应(表10)，而没有明显发生不良 事件或毒性(表11)。
表10：施用的Rexin-G剂量和肿瘤应答的总结
累积剂量 部分反应 疾病稳定 疾病进展 ＜1×1011/周(n＝11) 1/11(9％) 1/11(9％) 9/11(82％) 1×1011/周(n＝9) 5/9(56％) 11/9(11％) 3/9(33％) 2×1011/周(n＝11) 7/11(64％) 3/11(27％) 11/11(9％) 4×1011/周(n＝18) 9/18(50％) 6/18(33％) 3/18(16％)
表11：报告的副作用的总结
变态反应/免疫学 斑丘疹，可能痒或不痒，全身(4％) 血液学 高剂量Rexin-G施用可见肿瘤内出血引起的轻度 到中度贫血，需要输入红细胞(4％)， 轻度散发性血小板减少(2％) 胃肠 腹痛，轻度(2％) 腹胀，轻度(2％) 厌食，轻度(2％) 便秘(16％)注意：常规使用麻醉药 体质 轻度到中度发热，伴有或不伴有寒冷，同时没有中 性白细胞减少(4％) 轻度不明疲劳(24％) 异常化学 镁水平轻度升高(2％) AST和ALT水平短暂升高，持续＜72小时(1％)
实施例13，Rexin-G在化疗难治性复发性或转移性骨肉瘤患者中 的II期临床研究
利用PET-CT成像研究的结果计算估计的肿瘤负荷，据此将20-30 名化疗难治性复发性或转移性骨肉瘤患者分入两个不同的Rexin-G 剂量水平。估计的肿瘤负荷的计算是将单位为cm的目标病变最长直 径之和乘以109癌细胞。如果肿瘤负荷小于100亿个细胞，则患者归 入剂量水平1，如果肿瘤负荷大于100亿个细胞，则患者归入剂量水 平2(表12)。
表12：难治性复发性或转移性骨肉瘤的Rexin-G治疗的剂量水平和治疗周 期
治疗周期 剂量水平 载体剂量/天 最大体积/剂量
每周两次 1 1.0×1011cfu 200ml
每周三次 2 1.0×1011cfu 200ml
治疗周期为6周，包括4周的治疗，然后是两周的休息期。毒性 ＜I级的患者可以进行重复周期。对于前4个周期，每6周进行一次 PET-CT，然后每12周进行一次。一或两个治疗周期后，主要研究人 员可以推荐手术斑块切除或者完全手术切除。如果通过组织病理学检 查或者通过PET-CT扫描发现存在残余的病变，如果手术切口愈合并 且患者具有＜I级的毒性，则可以在手术4周后给予重复治疗周期。
临床研究的目标是评价静脉内(IV)Rexin-G的临床有效性和总体 安全性。临床有效性包括肿瘤反应率、无进展存活期和总存活期。利 用国际PET标准将肿瘤反应率评价为CR、PR或SD。无进展存活期 是超过一个月的存活期，总存活期定义为6个月或更长的存活期。静 脉内施用的Rexin-G的总体安全性根据机体状态、毒性评分、血液学、 代谢谱、免疫应答、载体向PBL中的整合和重组事件来确定。
实施例14，用Rexin-G治疗然后用Reximmune-C治疗的晚期转 移性胰腺癌患者的病例研究
当放射和化学治疗不能控制转移性胰腺癌向肝脏及在肝脏内的 扩散时，这一重要器官中的肿瘤负荷可能生长到巨大的比例，从而以 大量形成的肿瘤代替正常的肝实质。这时，同情使用和知情同意结合 起来支持应用更具攻击性的方案来减少致命肿瘤的负荷。图34显示 了一组切片，这些切片显示了从通过28天连续输注Rexin-G(累积剂 量：2×1012cfu)然后6天Reximmune-C(累积剂量：3×1010cfu)治 疗的难治性转移性胰腺癌患者中获得的尸检肿瘤标本中原发肿瘤的 广泛坏死。尽管这组输注是良好耐受的，并且总体肿瘤负荷显著减少， 但是患者不能正常生长以及容易地消退大的病变，需要支持治疗。遗 憾的是，患者在治疗3个月后死于暴发性大肠杆菌细菌脓毒症，这被 认为与Rexin-G干预无关，而在更广的意义上可能涉及烧伤后创伤愈 合的问题。从图34的A图中可以看出，在图B和C中放大，尸检所 见指示大量的坏死(n)，涉及该胰腺肿瘤的大约95％，具有多个纤维化 区域(f)，侧面为退化(deg)和细胞器结构。针对GM-CSF的免疫组化 染色鉴定了几个区域，其中表达GM-CSF的肿瘤细胞(图E和F)在小 岛中是明显的(箭头所示)(框入的区域，在E图中放大)，在看起来 象GM-CSF分泌细胞坏死片段的附近可见明显的免疫浸润(im)(图 F)。这一临床病例研究强调了三个重要的问题：(i)在癌症产生无法挽 救的器官损伤之前早期治疗患者具有总体的重要性，(ii)Rexin-G具有 满足并适合极大肿瘤负荷的潜力，和(iii)具有免疫刺激负载的 Reximmune-C具有参与肿瘤破坏过程的潜力。
除非另外说明，本发明的实施使用常规细胞生物学、细胞培养、 分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学技术， 它们都是本领域内的技术。这些技术在文献中均有描述。参见，例如， Molecular Cloning A Laboratory Manual，2nd Ed.，ed.by Sambrook， Fritsch and Maniatis(Cold Spring Harbor Laboratory Press：1989)；DNA Cloning，Volumes I and II(D.N.Glover ed.，1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait ed.，1984)；Mullis等人.美国专利No.4,683,195； Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames和S.J.Higgins eds.1984)； Transcription And Translation(B.D.Hames和S.J.Higgins eds.1984)； Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney，Alan R.Liss，Inc.，1987)； Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press，1986)；B.Perbal，A Practical Guide To Molecular Cloning(1984)；the treatise，Methods In Enzymology(Academic Press，Inc.，N.Y.)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J.H.Miller和M.P.Calos eds.，1987，Cold Spring Harbor Laboratory)；Methods In Enzymology，Vols.154 and 155(Wu等 人.eds.)，Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer和Walker，eds.，Academic Press，London，1987)；Handbook Of Experimental Immunology，Volumes I-IV(D.M.Weir和C.C.Blackwell， eds.，1986)；Manipulating the Mouse Embryo，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor.N.Y.，1986)。
交叉引用
本申请要求于2006年11月3日提交的美国专利申请第11/556,666 号的优先权，该美国申请是于2004年4月21日提交的美国专利申请第 10/829,926号的部分继续申请，后者要求于2003年4月21日提交的美 国临时申请第60/464,571号的优先权，上述申请均以引用的方式并入本 文。
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