一种双光子扫描结构光显微成像方法及装置
阅读：633发布：2020-05-16
专利汇可以提供一种双光子扫描结构光显微成像方法及装置专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了一种双 光子 扫描结构光显微成像方法及装置，通过将激光调制成光强随时间按正弦函数周期性变化的激发光，并使用调制后的激发光对待成像样品进行扫描，形成扫描结构 光激发 ；采集待成像样品被激发光扫描激发产生的 荧光 信号 ，得到荧 光信号 对应的非正弦荧光结构光图像，并提取荧光结构光图像的 频率 分量；根据不同方向上的荧光结构光图像的频率分量的 叠加 重构得到待成像样品的超 分辨率 图像，本 实施例 的方法不需要对荧光饱和激发和高功率的附件STED光就可以实现比线性结构光双光子超分辨 显微镜 更高的分辨率成像，分辨率比衍射极限提高3倍甚至更高，因此可以满足几十纳米甚至更高的双光子荧光成像需求，提高双光子荧光图像分辨率。，下面是一种双光子扫描结构光显微成像方法及装置专利的具体信息内容。
1.一种双光子扫描结构光显微成像方法，其特征在于，包括：
按照预设调制函数将激光调制成光强随时间按正弦函数周期性变化的激发光，并使用调制后的激发光对待成像样品进行扫描激发；
采集待成像样品被激发光扫描激发产生的荧光信号，得到荧光信号对应的荧光结构光图像组；其中，所述荧光结构光图像组包括：多个荧光结构光图像；各个荧光结构光图像对应的激发光图案的取向和相位不同；
提取各个所述荧光结构光图像中的频率分量，并且对其中对应的激发光图案为同一取向和不同相位的频率分量进行复位后叠加，根据叠加出的各个取向上的频率分量的叠加值组，重构出所述待成像样品的超分辨率图像。
2.根据权利要求1所述的双光子扫描结构光显微成像的方法，其特征在于，所述采集待成像样品被激发光扫描激发产生的荧光信号，得到荧光信号对应的荧光结构光图像组的步骤包括：
通过改变所述预设调制函数的周期和相位，获取到不同取向和不同相位的激发光图案对应的荧光结构光图像组。
3.根据权利要求2所述的双光子扫描结构光显微成像的方法，其特征在于，所述使用调制后的激光对待成像样品进行扫描激发的步骤包括：
沿所述待成像样品纵向进行逐点扫描，当一个纵向扫描完成，则沿所述待成像样品横向进行步进扫描一次，然后再进行纵向逐点扫描，重复执行上述逐点扫描和横向步进扫描的步骤，直至所述待成像样品扫描完成。
4.根据权利要求2所述的双光子扫描结构光显微成像的方法，其特征在于，所述采集待成像样品被激发光扫描激发产生的荧光信号，得到荧光信号对应的荧光结构光图像组的步骤包括：
逐点采集记录所述待成像样品被激发光扫描激发产生的荧光信号，得到荧光信号对应的荧光结构光图像组，其中所述荧光信号为非正弦结构光。
5.根据权利要求1所述的双光子扫描结构光显微成像的方法，其特征在于，所述调制函数满足以下公式：
其中，I为待成像样品成像面上的激发光的光强，ωm为调制频率，θ是荧光结构光图像中条纹与水平方向夹角，t为X方向扫描的时间，h表示所述扫描振镜扫描时Y方向上扫描的步数，为初始位相。
6.根据权利要求1所述的双光子扫描结构光显微成像的方法，其特征在于，所述根据各个荧光结构光图像的频率分量的叠加重构得到待成像样品的超分辨率图像的步骤包括：
对叠加出的频率分量的叠加值组进行傅里叶逆变换，得到重构出的荧光信号的超分辨率图像。
7.一种双光子扫描结构光显微成像的装置，其特征在于，包括：
激光器，用于产生激光；
强度调制器，用于根据预设调制函数将激光调制成光强随时间按正弦函数周期性变化的激发光；
扫描振镜，用于控制所述激发光对待成像样品进行扫描；
探测器，用于采集待成像样品在激发光扫描后产生的荧光信号，得到荧光信号对应的荧光结构光图像组；其中，所述荧光结构光图像组包括：多个荧光结构光图像；各个荧光结构光图像对应的激发光图案的取向和相位不同；
计算终端，用于提取各个所述荧光结构光图像中的频率分量，对其中对应激发光图案为同一取向和不同相位的频率分量进行复位后叠加，根据叠加出的各个取向上的频率分量的叠加值组，重构出所述待成像样品的超分辨率图像。
其中，所述强度调制器、扫描振镜、探测器和计算终端连接。
8.根据权利要求7所述的双光子扫描结构光显微成像的装置，其特征在于，在所述强度调制器和扫描振镜之间设置有空间滤波器；
所述空间滤波器包括：第一透镜、光阑和第二透镜。
9.根据权利要求7所述的双光子扫描结构光显微成像的装置，其特征在于，所述扫描振镜与所述探测器之间的光路中还设置有凸透镜、管镜、第一滤光片和双色镜，所述待成像样品与所述探测器之间的光路中还设置有物镜；
所述凸透镜的后焦面与所述管镜的前焦面重合；所述管镜的后焦面与所述物镜的前焦面重合；所述第一滤光片和双色镜分别用于对激发光进行过滤和反射；
所述扫描振镜发出的扫描光线经过凸透镜后，入射到所述管镜内，经过所述管镜发出平行光入射到所述第一滤光片，所述第一滤光片过滤出激发光，并将过滤出的所述激发光入射到所述双色镜，所述双色镜反射所述激发光，同时透射出荧光信号。
10.根据权利要求9所述的双光子扫描结构光显微成像的装置，其特征在于，所述双色镜与所述探测器之间的光路中设置有发射滤光片和第三透镜；
所述发射滤光片接收从所述双色镜透射的荧光信号，反射所述荧光信号中的激发光和杂散光，透射出所述荧光信号；
所述第三透镜，用于接收所述发射滤光片透射出的荧光信号，并将所述荧光信号聚焦成像到所述探测器上。
一种双光子扫描结构光显微成像方法及装置
技术领域
[0001] 本发明涉及光学显微成像技术领域，尤其涉及的是一种双光子扫描结构光显微成像方法及装置。
背景技术
[0002] 近年来，随着高强度激光、高灵敏探测器等光电器件研制技术以及新型荧光探针开发等相关领域的快速发展，超分辨显微成像技术取得了令人瞩目的巨大成就，曾经被认为是不可逾越的衍射极限不再是获得生物标本高分辨率信息的障碍。超分辨显微成像技术改变了传统的光学显微成像，打破了Abbe的衍射极限，为光学研究生物成像的纳米结构提供了一个独特的平台。现在有几种方法能够很好地解决衍射极限：光激活定位显微镜(photo-activation localization microscopy,PALM)，随机光学重构显镜(stochastic optical reconstruction microscopy,STORM)，Stimulated emission depletion(STED)microscopy以及受激发射损耗(stimulated emission depletion,STED)技术、结构光照明显微镜(structured illumination microscopy,SIM)技术。PLAM,STORM,STED方法分辨率都可以达到10nm，但PLAM，STORM为了获得超分辨的图像，平均需要获取几千张raw images，成像速度受限，通常只能用于固定细胞，到目前为止仍难以对生物活细胞实时探测成像。STED成像速度取决于扫描速度，可以适应活细胞成像的需求，然而STED光功率密度相比STORM光功率密度要高4-6个数量级，因此对活细胞的光毒性和光损伤比较严重，且高功率STED光在实现荧光擦除的同时也加剧了荧光分子的光漂白，这些也限制了STED在活细胞成像中的应用。SIM属于宽场显微成像，不需要扫描，成像速度快，无特殊标记，对激发光功率要求不高(其激光功率密度比STORM/PALM技术还要低2-3个数量级)，光漂白和光损伤程度小。因此SIM在活细胞成像方面具有独特的优势。线性SIM的分辨率最多能在衍射极限基础上提高2倍。
[0003] 基于双光子的扫描结构光显微技术(2P-SPIM)利用飞秒激光在样品上产生双光子激发效应，使用强度调制器调制飞秒激光的脉冲峰值随时间按正弦函数变化，并结合振镜扫描，在样品上产生强度正弦变化的双光子荧光，然后利用线性结构光重构算法获取超分辨图像，分辨率比衍射极限最多提高2倍。而且，目前存在的基于双光子的扫描结构光显微技术要么控制时间调制频率ωt大于系统传递函数截止频率 (ωt取决于EOM和扫描速度，目的是使产生的谐波落在有效双光子传递函数以外)；要么控制调制图案为正弦开方形式，避免谐波的产生，但是由于谐波的产生与分辨率相关联，抑制谐波产生的同时，限制了分辨率的提高，因此现有技术中的双光子扫描结构光显微技术实现超分辨均需要使荧光满足正弦强度分布，因此，导致其分辨率的提高最多不超过2倍衍射极限(即线性扫描结构光的分辨率)，不能满足人们对几十纳米甚至更高分辨率的超分辨率图像获取的需求。
[0004] 因此，现有技术有待于进一步的改进。
发明内容
[0005] 鉴于上述现有技术中的不足之处，本发明提供了一种双光子扫描结构光显微成像方法及装置，克服现有双光子扫描结构光的分辨率的提高最多不超过2倍衍射极限的限制，不能满足人们对几十纳米甚至更高分辨率的双光子荧光超分辨率图像获取的需求，限制了双光子显微技术的应用。
[0006] 第一方面，本实施例公开了一种双光子扫描结构光显微成像方法，其中，包括：
[0007] 按照预设调制函数将激光调制成光强随时间按正弦函数周期性变化的激发光，并使用调制后的激发光对待成像样品进行扫描激发；
[0008] 采集待成像样品被激发光扫描激发产生的荧光信号，得到荧光信号对应的荧光结构光图像组；其中，所述荧光结构光图像组包括：多个荧光结构光图像；各个荧光结构光图像对应的激发光图案的取向和相位不同；
[0009] 提取各个所述荧光结构光图像中的频率分量，并且对其中对应的激发光图案为同一取向和不同相位的频率分量进行复位后叠加，根据叠加出的各个取向上的频率分量的叠加值组，重构出所述待成像样品的超分辨率图像。
[0010] 可选的，所述采集待成像样品被激发光扫描激发产生的荧光信号，得到荧光信号对应的荧光结构光图像组的步骤包括：
[0011] 通过改变所述预设调制函数的周期和相位，获取到不同取向和不同相位的激发光图案对应的荧光结构光图像组。
[0012] 可选的，所述使用调制后的激光对待成像样品进行扫描激发的步骤包括：
[0013] 沿所述待成像样品纵向进行逐点扫描，当一个纵向扫描完成后，再沿所述待成像样品一个横向进行步进扫描一次，重复执行上述逐点扫描和横向步进扫描的步骤，直至所述待成像样品扫描完成。
[0014] 可选的，所述采集待成像样品在激发光扫描后产生的荧光信号，得到荧光信号对应的荧光结构光图像组的步骤包括：
[0015] 逐点采集记录所述待成像样品在激发光扫描后产生的荧光信号，得到荧光信号对应的荧光结构光图像组，其中所述荧光信号为非正弦结构光。
[0016] 可选的，所述调制函数满足以下公式：
[0017]
[0019] 可选的，所述根据各个荧光结构光图像的频率分量的叠加重构得到待成像样品的超分辨率图像的步骤包括：
[0020] 对叠加出的频率分量的叠加值组进行傅里叶逆变换，得到重构出的荧光信号的超分辨率图像。
[0021] 第二方面，本实施例还公开了一种双光子扫描结构光显微成像的装置，其中，包括：
[0022] 激光器，用于产生激光；
[0023] 强度调制器，用于将激光调制成光强随时间按正弦函数周期性变化的激发光；
[0024] 扫描振镜，用于控制所述激发光对待成像样品进行扫描；
[0025] 探测器，用于采集待成像样品在激发光扫描后产生的荧光信号，得到荧光信号对应的荧光结构光图像组；其中，所述荧光结构光图像组包括：多个荧光结构光图像；各个荧光结构光图像对应的激发光图案的取向和相位不同；
[0026] 计算终端，用于提取各个所述荧光结构光图像中的频率分量，对其中对应同一取向和不同相位的频率分量进行复位后叠加，根据叠加出的各个取向上的频率分量的叠加值组，重构出所述待成像样品的超分辨率图像；
[0027] 其中，所述强度调制器、扫描振镜、探测器和计算终端连接。
[0028] 可选的，在所述强度调制器和扫描振镜之间还设置有空间滤波器；
[0029] 所述空间滤波器包括：第一透镜、光阑和第二透镜。
[0030] 可选的，所述扫描振镜与所述探测器之间的光路中还设置有凸透镜、管镜、第一滤光片和双色镜，所述待成像样品与所述探测器之间的光路中还设置有物镜；
[0031] 所述凸透镜的后焦面与所述管镜的前焦面重合；所述管镜的后焦面与所述物镜的前焦面重合；所述第一滤光片和双色镜分别用于对激发光进行过滤和反射。
[0032] 所述扫描振镜出射的扫描光线经过凸透镜后，入射到所述管镜内，经过所述管镜发出平行光入射到所述第一滤光片，所述第一滤光片过滤出激发光，并将过滤出的所述激发光入射到所述双色镜，所述双色镜反射所述激发光，同时透射出荧光信号。
[0033] 可选的，所述双色镜与所述探测器之间的光路中设置有发射滤光片和第三透镜；
[0034] 所述发射滤光片接受从所述双色镜透射的荧光信号，反射所述荧光信号中的激发光和杂散光，透射出所述荧光信号；
[0035] 所述第三透镜，用于接收所述发射滤光片发出的荧光信号，并将所述荧光信号聚焦成像到所述探测器上。
[0036] 与现有技术相比，本发明实施例具有以下优点：
[0037] 根据本发明实施方式提供的方法，通过将激光调制成光强随时间按正弦函数周期性变化的激发光，并使用调制后的激发光对待成像样品进行扫描激发；采集待成像样品被激发光扫描激发产生的荧光信号，得到荧光信号对应的非正弦荧光结构光图像；分别获取激发光图案处于不同取向和不同相位时的荧光结构光图像，并将各个荧光结构光图像中的频率分量分离，将处于同一方向上的频率分量进行复位后叠加，根据叠加出的各个方向上的叠加值组，重构出的各个方向上荧光信号的超分辨率图像。本实施例中采用由非正弦荧光结构光图像分离出的处于同一方向上的包含高次谐波的所有频率分量进行复位后叠加，根据叠加出的各个取向上的频率分量的叠加值组重构出所述待成像样品的超分辨率图像，因此本实施例的方法不需要对荧光饱和激发和高功率的STED附加光便可以实现双光子显微超分辨成像，更重的是利用非正弦荧光结构光使其分辨率比衍射极限提高3倍甚至更高，可以实现几十纳米甚至更高分辨率的双光子荧光结构光成像。附图说明
[0038] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0039] 图1是本发明实施例中一种双光子扫描结构光显微成像的方法步骤流程图；
[0040] 图2是本发明实施例中强度调制器调制后飞秒激光强度随时间按正弦函数变化曲线图；
[0041] 图3是本发明实施例中所述双光子扫描结构光显微成像装置的结构示意图；
[0042] 图4是本发明实施例中所述激发光条纹结构光图案示意图；
[0043] 图5是本发明实施例中点扩展函数曲线图。
具体实施方式
[0044] 为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚、明确，以下参照附图并举实施例对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。
[0045] 由于现有技术中的双光子扫描结构光照明显微技术为了实现超分辨成像必须避免双光子非线性效应产生的荧光图案的谐波(该谐波导致荧光强度非正弦分布)，以获得正弦分布荧光结构光图案，利用等幅正弦条纹结构光重构算法重构超分辨图像，最终分辨率最多提高2倍衍射极限，即约二分之一波长(约120纳米)，因此无法满足几十纳米的超分辨率图像成像的需要。为了实现几十纳米甚至更高的分辨率的双光子结构光成像，本实施例公开了一种非线性的双光子扫描结构光显微成像方法及装置，实现了非饱和激发条件下双光子扫描结构光超分辨显微成像，达到分辨率3倍衍射极限的提高，甚至更高，即74nm的分辨率，进一步提高了成像的分辨率，满足几十纳米甚至更高的分辨率的双光子结构光成像的要求。
[0046] 第一方面，本实施例公开了一种双光子扫描结构光显微成像方法，如图1所示，所述方法包括：
[0047] 步骤S1、按照预设调制函数将激光调制成光强随时间按正弦函数周期性变化的激发光，并使用调制后的激发光对待成像样品进行扫描。
[0049] 为了实现得到不同方向上不同相位上的多幅待成像样品的成像图像，所述将激光调制成光强随时间按正弦函数周期性变化的激发光的步骤包括：
[0050] 按照预设调制函数对将激光调制成光强随时间按正弦函数周期性变化的激发光，并且通过改变调制函数的相位获取同一个方向下不同相位的荧光图像。
[0051] 本实施例中利用强度调制器以预设调制函数对激光进行调节，使得调制出的激光的光强随着时间正弦周期性变化，其中，所述强度调制器为电光调制器或声光调制器。如图2所示为调节后调制所得到的激发光的光强随时间按正弦函数周期变换的波形示意图，所述预设调制函数的函数表达式满足：
[0052]
[0053] 其中，I是待成像样品成像面上的激发光的光强，ωm为根据需要预设的调制频率，θ是荧光结构光图像中条纹与水平方向夹角，t为X方向扫描的时间，h表示所述扫描振镜扫描时Y方向上扫描的步数，为初始位相。
[0054] 结合图3所示，为了实现更好的激光传输，在激光器1与强度调制器3之间的光路中，还设置有第一半波片2，所述第一半波片2用于调制激光器1发出激光的偏振方向，使得激光的偏振方向与强度调制器3的偏振方向匹配。
[0055] 所述使用调制后的激发光对待成像样品进行扫描的步骤包括：
[0056] 沿所述待成像样品纵向进行逐点扫描，当一个纵向扫描完成后，再沿所述待成像样品横向进行步进扫描一步，重复执行上述逐点扫描和横向逐步扫描的步骤，直至所述待成像样品扫描完成。
[0057] 在一种实施方式中，使用扫描振镜控制激发光对待成像样品进行扫描，具体的，包括以下步骤：
[0058] 首先在Y方向的振镜开始在纵向进行逐点扫描，当Y方向的振镜逐点扫描结束后，Y方向的振镜返回到原位置，同时X方向的振镜沿横向进行步进扫描，即调整激发光点的纵向位置。
[0059] 循环执行上述的逐点扫描和步进扫描，对应到待成像样品上逐点扫描和步进扫描，直至完成对所述待成像样品的扫描。
[0060] 激发出荧光信号，所述荧光信号为非正弦结构光，并且所述扫描振镜控制激发光沿着待成像样品纵向逐点扫描，当扫描到一个纵向的底端，则沿待成像样品的横向进行步进扫描一步，然后再进行纵向逐点扫描，重复执行上述纵向逐点扫描和横向步进扫描的步骤，直至扫描完整个待成像样品，从而使得整个待成像样品激发出荧光信号。可以想到的是，也可以采用横向逐点扫描，纵向步进扫描的方式进行待成像样品的扫描。
[0061] 步骤S2、采集待成像样品被激发光扫描激发产生的荧光信号，得到荧光信号对应的荧光结构光图像组；其中，所述荧光结构光图像组包括：多个荧光结构光图像；各个荧光结构光图像对应的激发光图案的取向和相位不同。
[0062] 由于在待成像样品的内部分布有荧光物质，当激发光扫描待成像样品时，所述待成像样品内荧光物质在激发光点的作用下产生双光子激发效应，并产生荧光信号。激发光点激发待成像样品，产生双光子信号，并且扫描振镜扫描完整个待成像样品后，得到整个待成像样品激发出的荧光信号。
[0063] 结合图3所示，各个光束经扫描振镜9沿待成像样品15纵向进行逐点扫描，沿待成像样品15纵向的一行扫描结束后，扫描振镜9步进扫描即沿样品横向移至下一位置，进行下一纵向位置的逐点扫描，即第二行扫描，如此循环，即可实现对整个待成像样品15的扫描，获取整个待成像样品15区域激发出的荧光信息。对应的激发光条纹结构光图案如图4所示。探测器18在扫描开始时同步逐点记录荧光信号，在整个样品的扫描完成时荧光信号记录也完成，即记录一幅图像，并存储在计算终端19中。
[0064] 上述步骤中所述计算记录出的图像为非正弦的荧光结构光图像，该非正弦的荧光结构光图像中含有频率信息，通过改变调制函数的周期和相位即可获得不同取向相位相同和取向相同但相位不同的荧光结构光图像组。所述荧光结构光图像组中含有多个荧光结构光图像，且各个荧光结构光可以具有相同取向，但对应的激发图案的相位不同，或者对应不同取向，但是对应的激光图案的相位相同。
[0065] 步骤S3、提取各个所述荧光结构光图像中的频率分量，并且对其中对应同一取向和不同相位的频率分量进行复位后叠加，根据叠加出的各个取向上的频率分量的叠加值组，重构出所述待成像样品的超分辨率图像。
[0066] 通过上述步骤S2获取到的不同取向、同一个取向不同相位的荧光结构光图像后，对荧光结构光图像中荧光信号的频率分量进行分离，并对分离出的各个频率分量进行复位，并将复位后的各个频率分量整合，得到处于同一方向上的频率分量的叠加值组，并进行傅立叶逆变换，得到待成像样品的超分辨率图像。
[0067] 进一步的，所述根据各个荧光结构光图像的频率分量的叠加重构得到待成像样品的超分辨率图像的步骤包括：
[0068] 对叠加出的频率值组所对应的荧光图像进行傅里叶逆变换，得到重构出的荧光信号的超分辨率图像。
[0069] 具体的，结合图3所示，调制的激光由扫描振镜9扫描后照射到待成像样品15，形成正弦条纹激发，例如图4所示，形成非正弦的荧光结构光图案，该非正弦荧光结构光图案包含了高次谐波的所有频率信息，即 其中，k是空间频率，wt是时间调制频率，通过改变强度调制器3的调制函数的相位，获得一个取向下的不同相位的条纹图案。在一种实施方式中，结合图4所示，相邻图像之间的相位差均为2π/5，通过重构算法重构出一幅同一方向下的超分辨图像，为了获得各向一致的超分辨图像，需要在0度，120度和240度三个取向下分别获得相位差恒定(2π/5)的不同相位图案，然后通过重构算法重构出各向一致的超分辨图像。
[0070] 本发明中实施例中定义构成这个非正弦荧光结构光图案的频率s％(k)，成分满足方程(4)和(5-9)，同时，本实施方式不需要饱和激发，激发光功率与传统双光子激发功率类似，而且不需要特殊染料，普通双光子染料即可，因此该技术可以直接用于双光子显微镜实现超分辨成像。
[0071] 另一个重要发明点是提出了WS重构算法，具体WS重构算法如下：
[0072] 假设激发的结构光(即激发光)为：
[0073]
[0074] 其中 m＝1,2,…,M。
[0075] 对双光子结构光成像时M必须大于等于5，因为分离高频信息时候会产生项。
[0076] 经过光学系统之后，被探测器18逐点记录并形成的强度图像：
[0077]
[0078] 其中，Iex激发光强度，h2p激发点扩展函数，s(x)样本结构，hem发射点扩展函数，x是样本位置。
[0079] 对上式(2)进行傅里叶变换，并将各频率分量s％(k)，s％(k-ωt)，s％(k+ωt)，s％(k-2ωt)和s％(k+2ωt)进行分离、平移：
[0080] 将信号频谱相加得到：
[0081]
[0082] 由此可得
[0083]
[0084] 将每次平移后的频谱乘以 并求和，可得：
[0085]
[0086] 所以，
[0087]
[0088] 同理可得：
[0089]
[0090]
[0091]
[0092] 本实施例通过将处于同一个取向且不同相位的各个频率分量先进行分离，在将分离后的各个频率分量复位，然后将复位分离的频率分量相叠加，最后将各个取向得到的频率分量的叠加值做傅立叶逆变换，即可得到所述待成像样品的超分辨的图像。
[0093] 改变强度调制器3的调制函数，使待成像样品上正弦照明光图案的方向转动(也即旋转激发光图案的取向)，重复上述操作，即可提高样品另一个方向上的分辨率。以此类推，即可提高该样品平面内各个方向扫描区域的成像分辨率。最后将各方向的频谱线性相加并进行逆傅立叶变化重构出最终的超分辨图像，最高分辩率比衍射极限提高约3倍甚至更高。
[0094] 结合图5所示，将本实施例所提供的图像重构算法模拟了宽场荧光显微、线性SIM、双光子荧光SIM、三光子荧光SIM和四光子荧光SIM的点扩展函数，其分辨率分别达到210nm、112nm、74nm、53nm和43nm，理论上，光学非线性阶数足够大，我们的专利技术能够达到无限小分辨率能力。
[0095] 值得注意的是，本发明实施例所提供的图像重构算法不仅适合于结构光照明的双光子荧光超分辨显微成像，也适合于二次谐波结构光超分辨显微成像，并且同样的原理也适合于多光子和高次谐波结构光超分辨成像。同时，也适用于宽场结构光照明的双光子荧光超分辨显微成像。
[0096] 在上述方法的基础上，本实施例还公开了一种双光子扫描结构光显微成像的装置，结合图3所示，包括：
[0097] 激光器1，用于产生激光；
[0098] 强度调制器3，用于将激光调制成光强随时间按正弦函数周期性变化的激发光；
[0099] 扫描振镜9，用于控制所述激发光对待成像样品进行扫描；
[0100] 探测器18，用于采集待成像样品在激发光扫描后产生的荧光信号，得到荧光信号对应的荧光结构光图像组；其中，所述荧光结构光图像组包括：多个荧光结构光图像；各个荧光结构光图像对应的激发光图案的取向和相位不同；
[0101] 计算终端19，用于提取各个所述荧光结构光图像中的频率分量，对其中对应同一取向和不同相位的频率分量进行复位后叠加，根据叠加出的各个取向上的频率分量的叠加值组，重构出所述待成像样品的超分辨率图像；
[0102] 其中，所述强度调制器3、扫描振镜9、探测器18和计算终端19连接。所述强度调制器3为电光调制器或声光调制器。
[0103] 所述强度调制器3，扫描振镜9，探测器18与计算终端19连接。计算终端19控制强度调制器3改变调制函数，以使透过的激光调制成光强随时间按正弦变化的激发光，以及控制所述扫描振镜9的扫描速度和范围，所述计算终端19还用于控制所述探测器18逐点采集荧光信号。
[0104] 在所述强度调制器3之前还设置有第一半波片2，在所述强度调制器3与所述扫描振镜9之间，还分别设置有第一反射镜4和第二半波片5。所述第一半波片2和第二半波片5分别用于调制入射光的偏振方向，所述第一反射镜4用于调节激光的传播路径。
[0105] 具体的，为了实现更好的激光传输效果，结合图3所示，在所述强度调制器3和扫描振镜9之间还设置有空间滤波器；所述空间滤波器用于过滤与杂散光。所述空间滤波器包括：第一透镜6、光阑7和第二透镜8。
[0106] 进一步的，所述扫描振镜9与所述探测器18之间的光路中还设置有凸透镜10、管镜11、第一滤光片12和双色镜13，所述待成像样品15与所述探测器18之间的光路中还设置有物镜14；所述凸透镜10的后焦面与所述管镜11的前焦面重合；所述管镜11的后焦面与所述物镜14的前焦面重合；所述第一滤光片12和双色镜13分别用于对激发光进行过滤和反射。
[0107] 所述扫描振镜9出射的扫描光线经过凸透镜10后，入射到所述管镜11内，经过所述管镜11发出平行光入射到所述第一滤光片12，所述第一滤光片12过滤出激发光，并将过滤出的所述激发光入射到所述双色镜13，所述双色镜13反射所述激发光，同时透射出荧光信号。
[0108] 经过管镜11后出射平行光，分别透过第一滤光片12，双色镜13反射后经物镜14聚焦到待成像样品15的成像面上。其中，第一滤光片12滤除激发光以外的光噪声，双色镜13反射激发光透射荧光信号。对激发光束来说，位于管镜11前焦面的扫描焦点与待成像样品15的成像面上扫描焦点共轭，在扫描振镜9扫描时，待成像样品15上的扫描点沿样品15纵向进行逐点扫描，荧光物质在激发光点的作用下产生双光子激发效应，并产生荧光。对待成像样品15纵向的逐点扫描结束后，待成像样品15横向进行步进扫描即调整激发光阵列点在待成像样品15横向的位置。循环执行上述逐点扫描和步进扫描，直至完成对待成像样品15成像区域的扫描。
[0109] 所述双色镜13与所述探测器18之间的光路中还设置有发射滤光片16和第三透镜17；
[0110] 所述发射滤光片16接收从所述双色镜13透射的荧光信号，反射所述荧光信号中的激发光和杂散光，透射出所述荧光信号；
[0111] 所述第三透镜17，用于接收所述发射滤光片发出的荧光信号，并将所述荧光信号聚焦到所述探测器18上。
[0112] 在一种实施方式中，双色镜13设于物镜14与待成像样品15之间，双色镜13对脉冲激光高反，对荧光高透，双色镜13与各个光束之间的夹角为45°或135°。荧光经双色镜13透射后的光路上依次设有发射滤光片16、第三透镜17，最后由探测器18接收。发射滤光片16为带通滤光片，对激发光高反，只允许荧光信号通过。
[0113] 本发明实施所提供的所述方法，根据本发明实施方式提供的方法，通过将激光调制成光强随时间按正弦函数周期性变化的激发光，并使用调制后的激发光对待成像样品进行扫描激发；采集待成像样品被激发光扫描激发产生的荧光信号，得到荧光信号对应的非正弦荧光结构光图像；分别获取激发光处于不同相位时，荧光结构光图像中荧光信号对应的包括高次谐波的所有频率分量，并将处于同一方向上的频率分量进行复位后叠加，根据叠加出的各个方向上的频率值组，重构出的各个方向上荧光信号的超分辨率图像。本实施例中采用同一个方向上荧光信号的频率分量进行叠加，获取到不同方向上的荧光信号的频率分量的叠加值组，并根据各个荧光信号频率分量的叠加值组得到待成像样品的超分辨率图像，因此本实施例的方法不需要对荧光饱和激发和附加的高功率的STED光便可以实现双光子显微超分辨成像，更重的是利用非正弦荧光结构光使其分辨率比衍射极限提高3倍甚至更高，可以实现几十纳米甚至更高分辨率的双光子荧光结构光成像。
[0114] 本领域技术人员在考虑说明书及实践这里公开的发明后，将容易想到本发明的其它实施方案。本发明旨在涵盖本发明的任何变型、用途或者适应性变化，这些变型、用途或者适应性变化遵循本发明的一般性原理并包括本公开未公开的本技术领域中的公知常识或惯用技术手段。说明书和实施例仅被视为示例性的，本发明的真正范围和精神由权利要求指出。
[0115] 应当理解的是，本发明并不局限于上面已经描述并在附图中示出的精确结构，并且可以在不脱离其范围进行各种修改和改变。本发明的范围仅由所附的权利要求来限制[0116] 以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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