光敏性超分子水凝胶成胶因子及其制备方法和应用
阅读：624发布：2020-12-28
专利汇可以提供光敏性超分子水凝胶成胶因子及其制备方法和应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且光敏性超分子 水 凝胶成胶因子及其制备方法和应用，其结构通式如下所示，由于该水凝胶的成胶浓度低，其中水占比可大于99.9%，可用于干旱地区的抗旱、 化妆品 中的面膜、退热贴、 镇痛 贴、农用 薄膜 、建筑中的结露防止剂、 原油 或成品油的脱水，食品中的保鲜剂、 增稠剂 ，细胞三维 支架 以及利用光点击后产物的 荧光 可以实现信息的记录与读取。，下面是光敏性超分子水凝胶成胶因子及其制备方法和应用专利的具体信息内容。
1.一种光敏性超分子水凝胶成胶因子，其特征在于其结构通式如式1所示:
其中，R1和R3为H、F、Cl、Br、CF3、CON（CH3）2、NHCOCH3、N（CH3）2、OCnH2n+1、CN、CO2CH3或者至少2个天然或非天然氨基酸组成的肽链，Ar1和Ar2为n’个不同或相同官能团：F、Cl、Br、CF3、NHCOCH3、N（CH3）2、OCnH2n+1、CN或CO2CH3取代的五元、六元芳环或稠环类化合物或缺失，R2为NHCOC2H4CO或缺失，其中n=1、2、3，n’=0、1、2、3、4、5。
2.如权利要求1所述光敏性超分子水凝胶成胶因子，其特征在于所述化合物结构式如式14或15所示：
3.如权利要求1所述光敏性超分子水凝胶成胶因子，其特征在于所述天然氨基酸为：
甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸、色氨酸或组氨酸，非天然氨基酸为羊毛硫氨酸、2-氨基异丁酸、脱氢丙氨酸、γ-氨基丁氨酸、硒代半胱氨酸、
8-羟基2,7,10-三氨基癸酸或β-丙氨酸。
4.如权利要求1所述光敏性超分子水凝胶成胶因子，其特征在于所述Ar2为苯环、
2-甲氧基苯环、3-甲氧基苯环、4-甲氧基苯环、2-烯丙氧基苯环、4-乙酰氨基苯环、1-萘环、2-萘环、吡啶环、吡咯、呋喃、噻吩、吡喃或噻喃。
5.如权利要求1所述光敏性超分子水凝胶成胶因子，其特征在于所述Ar2为取代或非取代的苯环、1-萘环或2-萘环时，R2为NHCOC2H4CO或缺失。
6.如权利要求1所述光敏性超分子水凝胶成胶因子，其特征在于所述R3为H、F、Cl、Br、CF3、CON(CH3)2、NHCOCH3、N(CH3)2、OCnH2n+1、CN、CO2CH3或为用Xaa1Xaa2Xaa3Xaa4Xaa5Xaa6Xaa7Xaa8Xaa9Xaa10表示的短肽，其中Xaa1，Xaa2为天然氨基酸或非天然氨基酸；Xaa3、Xaa4、Xaa5、Xaa6、Xaa7、Xaa8、Xaa9或Xaa10中任意多个缺失、为天然氨基酸或非天然氨基酸，氨基酸的构型为D型或L型；Xaa1，Xaa2，Xaa3，Xaa4，Xaa5，Xaa6，Xaa7，Xaa8，Xaa9，Xaa10同时为天然氨基酸、同时为非天然氨基酸、或任意多个为天然氨基酸，其中n=1、2、3。
7.如权利要求1所述光敏性超分子水凝胶成胶因子，其特征在于所述Ar1为苯环、2-甲氧基苯环、3-甲氧基苯环、4-甲氧基苯环、2-烯丙氧基苯环、4-乙酰氨基苯环、1-萘环、
2-萘环、吡啶环、吡咯、呋喃、噻吩、吡喃或噻喃。
8.如权利要求1所述光敏性超分子水凝胶成胶因子，其特征在于所述R1为H、F、Cl、Br、CF3、CON(CH3)2、NHCOCH3、N(CH3)2、OCnH2n+1、CN、CO2CH3或为用Xaa1Xaa2Xaa3Xaa4Xaa5Xaa6Xaa7Xaa8Xaa9Xaa10表示的短肽，其中Xaa1，Xaa2为天然氨基酸或非天然氨基酸，Xaa3，Xaa4，Xaa5，Xaa6，Xaa7，Xaa8，Xaa9，Xaa10中任意多个缺失、为天然氨基酸或非天然氨基酸，氨基酸的构型为D型或L型。Xaa1，Xaa2，Xaa3，Xaa4，Xaa5，Xaa6，Xaa7，Xaa8，Xaa9，Xaa10同时为天然氨基酸、同时为非天然氨基酸、或任意多个为天然氨基酸，其中n=1、2、3。
9.如权利要求1所述光敏性超分子水凝胶成胶因子，其特征在于所述光敏性超分子水凝胶成胶因子，如式2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12及其对应的盐：
n n
其中，对于R,n=1,3,5,7,9时，R 缺失或为H；
n n+1
R 为H，R 为H，OH，SH，COOH，COOR，烷基，链烯基，炔基，芳基，杂环基，杂芳基，芳烷基，胺或酰胺；
n n+1 n
R 缺失，R 为亚烷基并且与NR 上的N原子相连形成杂环。
1 3 5 7 9
10.如权利要求9所述光敏性超分子水凝胶成胶因子，其特征在于所述R，R，R，R，R均为H。
n
11.如权利要求9所述光敏性超分子水凝胶成胶因子，其特征在于所述一个或多个R缺失，
n+1 n
R 与NR 上的N原子相连形成C3-C6的杂环。
12.一种通过光控制将如权利要求1或2所述的成胶因子形成的水凝胶进行荧光打开、由凝胶向溶液转变或降低水凝胶的机械性能以致破坏凝胶的方法。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于所述光源为波长为254nm、302nm或365nm的紫外灯，405nm的激光，可进行双光子激发的激光源，功率范围为100W-500W的高压汞灯，功率范围为100W-500W的氙灯，以及通过滤光片、光掩模控制光源波长和光照面积方式的光源，荧光打开的光照时间从1s-120s，由凝胶向溶液转变或破坏凝胶的光照时间从
1min-24h，水凝胶中掺杂或不掺杂如式13所示的烯烃，其中B1，B2，B3，B4可任意为CO2Me，CN，CHO，CONHR，alkyl，Ph，取代的芳环或缺失
14.一种利用权利要求1或2所述光敏性超分子水凝胶成胶因子在光照下对生物大分子、重组蛋白及药物分子进行控制释放中的应用。
15.权利要求1或2所述光敏性超分子水凝胶成胶因子在进行一种波长光照下信息的记录、在同一种或另一种波长光照下读取中的应用。
16.权利要求1或2所述光敏性超分子水凝胶成胶因子在作为生物支架在其表面进行二维培养细胞或在其内部进行三维培养中的应用。
17.含有四氮唑的短肽Tet(I)-GFF的合成方法，其特征在于步骤为按比例：四氮唑Tet(I)-OH的合成：将2mL含有5mmol亚硝酸钠的水溶液滴加到8mL含有5mmol2-烯丙氧基苯胺和1.3mL37%wt浓盐酸的50%wt的乙醇水溶液中，控制反应过程中的温度低于5℃，滴加完即得到2-烯丙氧基氯化重氮苯的1水溶液；1水溶液在30min内滴加到30mL含5mmol有4-((2-磺酰腙)甲基)苯甲酸的吡啶溶液中整个反应温度控制在-10～-15℃，反应1h后，反应液用氯仿和水萃取；氯仿层分别用稀盐酸和水洗，无水硫酸钠干燥；减压蒸去溶剂后，粗产物用柱层析分离，石油醚:乙酸乙酯体积比=1:1，得到白色粉末四氮唑Tet(I)-OH；
1.在固相合成管中，加入1g2-chlorotrityl chloride树脂和8mL无水CH2Cl2，在摆床上震荡5min后，抽滤除去溶剂；2.加入2.2mmol Fmoc-Gly-OH、4.4mmol DIEA溶于CH2Cl2后，加入到树脂中，振摇30min，抽滤；DMF洗树脂，DCM:MeOH:DIEA体积比=80:15:5的溶液洗树脂；再用DMF洗，10mL25%wt哌啶的DMF溶液洗涤3min，抽滤后再用10mL25%wt哌啶的DMF溶液洗涤树脂10min,用DMF洗涤6次除去哌啶后抽滤；3.将5mmol Fmoc-Phe-OH、5mmol HOBT、5mmol TBTU加入到5mL DMF后，加入10mmol的DIEA充分混合，使其成透明粘稠液，加入到树脂中，反应1h，做Kaiser检测，若树脂不变色则反应完全，抽滤，分别用DMF洗3次、20%wt哌啶的DMF溶液洗3次、DMF洗6次后抽滤；若树脂显示蓝色，继续反应2小时，Kaiser检测还是蓝色则抽去反应液，DMF洗涤5次，重新加入5mmol Fmoc-Phe-OH、5mmol HOBT、5mmol TBTU、10mmol的DIEA反应液，直到Kaiser检测不变色；4.重复第3步，将Fmoc-Phe-OH接到树脂上,再次重复第3步，用5mmol Tet(I)-OH替换Fmoc-Phe-OH，将其接到树脂上；5.反应结束后，树脂经DMF、异丙醇、正己烷的洗涤，抽干后，浸没于三氟乙酸中静置3h，抽滤，CH2Cl2洗涤，减压除去滤液中的CH2Cl2和三氟乙酸，用乙醚分散得到黄色固体，用乙醚洗涤固体3次，得到的固体在真空干燥箱中干燥，称重，利用高压液相色谱对短肽进行提纯得产物。
光敏性超分子水凝胶成胶因子及其制备方法和应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一种光敏性超分子水凝胶成胶因子及其制备方法和应用。
背景技术
[0002] 超分子水凝胶是一种小分子进行通过氢键、静电相互作用、π-π堆积等作用自组装而形成的介于水溶液及固体状态的“软物质”。与高分子水凝胶相比，超分子水凝胶由于其自组装机理可以使其易受外界环境如温度、pH、光照、酶等影响形成智能超分子水凝胶，可以广泛被用于药物释放及组织工程等领域。超分子短肽水凝胶，尤其是含有功能性短肽序列的水凝胶，具有生物相容性、可降解、能被生物体系识别而功能化等优势在近几年的研究中得到越来越广泛的关注。
[0003] 光敏性超分子水凝胶通常利用光致变色基团（如螺吡喃、偶氮苯）及光致离去基团（如邻硝基苄醇类、香豆素类化合物）等在光照下发生结构变化从而导致水凝胶自组装结构的改变，使得宏观上发生收缩/膨胀甚至凝胶/溶液的相变过程，实现水凝胶的智能响应，应用于药物的控制释放、细胞基质的修饰等过程。
[0004] 二取代四氮唑可经过光引发脱去一分子N2进而与烯烃，如甲基丁烯酸酯，发生1,3-偶极环加成反应。此类四氮唑与烯烃间的光反应具有高立体选择性，反应底物较为广泛，是一个优秀的生物正交反应。且其产物二氢二氮唑类化合物已被报导具有广泛的生物活性，如抗菌活性(幽门螺杆菌)、抗病毒活性(西尼罗病毒)、治疗肥胖药剂以及可以作为治疗帕金森综合症的候选药物（Rajendra Prasad,Y.;Lakshmana Rao,A.;Prasoona,L.;Murali,K.;Ravi Kumar,P.Bioorg Med Chem Lett2005,15,5030；Camacho,M.E.;Leon,J.;Entrena,A.;Velasco,G.;Carrion,M.D.;Escames,G.;Vivo,A.;Acuna-Castroviejo,D.;Gallo,M.A.;Espinosa,A.Journal of Medicinal Chemistry2004,47,5641.）。将二取代四氮唑与短肽分子相连是一种新颖的构建光敏性超分子水凝胶的方法。
发明内容
[0005] 解决的技术问题：
[0006] 本发明提供一种光敏性超分子水凝胶成胶因子及其制备方法和应用，由于超分子水凝胶在生物体系潜在的用途，对于生物相容性具有较高的要求。如图1所示，不同浓度的Tet(I)-GFF存在下，不同的细胞C2C12及hMSC细胞在不同的培养时间下均有较高的细胞存活率，表明基于连有二取代四氮唑的短肽水凝胶具有较好的生物相容性。
[0007] 由于之前的光敏性超分子水凝胶体系多数基于邻硝基苄醇类化合物的光致离去过程或者螺吡喃、偶氮苯类化合物的光致变色过程，这两种结构变化的动力学较为一般，所得到的水凝胶发生光响应所需要的时间都一般限制在数小时以上（Muraoka,T.;Koh,C.Y.;Cui,H.G.;Stupp,S.I.Angew.Chem.Int.Ed.2009,48,5946；Haines,L.A.;Rajagopal,K.;Ozbas,B.;Salick,D.A.;Pochan,D.J.;Schneider,J.P.J.Am.Chem.
Soc.2005,127,17025.）。由于长时间的光照对于生物体系带来的不可避免的影响，如生物酶的活性降低、细胞毒性等，这大大影响了该类水凝胶在生物体系的应用。基于二取代四氮唑的水凝胶由于二取代四氮唑与烯烃之间反应在数分钟之内即完成，使得该类水凝胶在光照下10min内即可产生凝胶向溶液的转变过程，提高了在生物体系的应用价值。
Soc.2005,127,17025.）。由于长时间的光照对于生物体系带来的不可避免的影响，如生物酶的活性降低、细胞毒性等，这大大影响了该类水凝胶在生物体系的应用。基于二取代四氮唑的水凝胶由于二取代四氮唑与烯烃之间反应在数分钟之内即完成，使得该类水凝胶在光照下10min内即可产生凝胶向溶液的转变过程，提高了在生物体系的应用价值。
[0008] 由于光的特殊性质，使得二取代四氮唑的水凝胶获得了对光的时空分辨的响应，这在调控细胞在水凝胶的三维骨架结构中的微环境从而控制细胞的行为具有巨大的优势。通过光掩模技术，实现了对水凝胶200μm分辨率下的调控，同时利用反应产物的荧光可以对调控后的区域进行追踪研究细胞的行为。此外，通过对于光照时间的改变，可以调节该类水凝胶的机械性能，结合两者，可以从时空分辨上来调控细胞的行为。利用该类水凝胶将生物分子包裹在水凝胶中，通过光照将生物分子控制释放到细胞培养液中，从而调控C2C12细胞的调控过程。此外，将hMSC细胞包裹在水凝胶的三维骨架结构中，通过控制光照时间的不同可以调节细胞的行为。
[0009] 技术方案：
[0010] 一种光敏性超分子水凝胶成胶因子，其结构通式如式1所示:
[0011]
[0012] 其中，R1和R3为H、F、Cl、Br、CF3、CON（CH3）2、NHCOCH3、N（CH3）2、OCnH2n+1、CN、CO2CH3或者至少2个天然或非天然氨基酸组成的肽链，Ar1和Ar2为n’个不同或相同官能团：F、Cl、Br、CF3、NHCOCH3、N（CH3）2、OCnH2n+1、CN或CO2CH3取代的五元、六元芳环或稠环类化合物或缺失，R2为NHCOC2H4CO或缺失，其中n=1、2、3，n’=0、1、2、3、4、5。
[0013] 所述光敏性超分子水凝胶成胶因子结构式如式14或15所示：
[0014]
[0015] 所述天然氨基酸为：甘氨酸（Gly，G）、丙氨酸(Ala，A)、丝氨酸(Ser，S)、半胱氨酸(Cys，C)、苏氨酸(Thr，T)、缬氨酸(Val，V)、亮氨酸(Leu，L)、异亮氨酸(Ile，I)、蛋氨酸（Met，M）、苯丙氨酸(Phe，F)、脯氨酸（Pro，P）、酪氨酸(Tyr，Y)、天冬氨酸(Asp，D)、天冬酰胺(Asn，N)、谷氨酸(Glu，E)、谷氨酰胺(Gln，Q)、赖氨酸(Lys，K)、精氨酸（Arg，R）、色氨酸（Trp，W）或组氨酸（His，H），非天然氨基酸为羊毛硫氨酸、2-氨基异丁酸、脱氢丙氨酸、γ-氨基丁氨酸、硒代半胱氨酸、8-羟基2,7,10-三氨基癸酸或β-丙氨酸。
[0017] 所述Ar2为取代或非取代的苯环、1-萘环或2-萘环时，R2为NHCOC2H4CO或缺失。
[0018] 所述R3为H、F、Cl、Br、CF3、CON(CH3)2、NHCOCH3、N(CH3)2、OCnH2n+1、CN、CO2CH3或为用Xaa1Xaa2Xaa3Xaa4Xaa5Xaa6Xaa7Xaa8Xaa9Xaa10表示的短肽，其中Xaa1，Xaa2为天然氨基酸或非天然氨基酸；Xaa3、Xaa4、Xaa5、Xaa6、Xaa7、Xaa8、Xaa9或Xaa10中任意多个缺失、为天然氨基酸或非天然氨基酸，氨基酸的构型为D型或L型；Xaa1，Xaa2，Xaa3，Xaa4，Xaa5，Xaa6，Xaa7，Xaa8，Xaa9，Xaa10同时为天然氨基酸、同时为非天然氨基酸、或任意多个为天然氨基酸，其中n=1、2、3。
[0019] 所述Ar1为苯环、2-甲氧基苯环、3-甲氧基苯环、4-甲氧基苯环、2-烯丙氧基苯环、4-乙酰氨基苯环、1-萘环、2-萘环、吡啶环、吡咯、呋喃、噻吩、吡喃或噻喃。
[0020] 所述R1为H、F、Cl、Br、CF3、CON(CH3)2、NHCOCH3、N(CH3)2、OCnH2n+1、CN、CO2CH3或为用Xaa1Xaa2Xaa3Xaa4Xaa5Xaa6Xaa7Xaa8Xaa9Xaa10表示的短肽，其中Xaa1，Xaa2为天然氨基酸或非天然氨基酸，Xaa3，Xaa4，Xaa5，Xaa6，Xaa7，Xaa8，Xaa9，Xaa10中任意多个缺失、为天然氨基酸或非天然氨基酸，氨基酸的构型为D型或L型。Xaa1，Xaa2，Xaa3，Xaa4，Xaa5，Xaa6，Xaa7，Xaa8，Xaa9，Xaa10同时为天然氨基酸、同时为非天然氨基酸、或任意多个为天然氨基酸，其中n=1、2、3。
[0021] 所述光敏性超分子水凝胶成胶因子，如式2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12及其对应的盐：
[0022]n n n n+1
[0023] 其中，对于R,n=1,3,5,7,9时，R 缺失或为H；R 为H，R 为H，OH，SH，COOH，COOR，n n+烷基，链烯基，炔基，芳基，杂环基，杂芳基，芳烷基，胺或酰胺；R 缺失，R 1为亚烷基并且与n
NR 上的N原子相连形成杂环。
NR 上的N原子相连形成杂环。
[0024] 所述R1，R3，R5，R7，R9均为H。
[0025] 所述一个或多个Rn缺失，Rn+1与NRn上的N原子相连形成C3-C6的杂环。
[0026] 一种通过光控制将上述的成胶因子形成的水凝胶进行荧光打开、由凝胶向溶液转变或降低水凝胶的机械性能以致破坏凝胶的方法。
[0027] 所述方法光源为波长为254nm、302nm或365nm的紫外灯，405nm的激光，可进行双光子激发的激光源，功率范围为100W-500W的高压汞灯，功率范围为100W-500W的氙灯，以及通过滤光片、光掩模控制光源波长和光照面积方式的光源，荧光打开的光照时间从1s-120s，由凝胶向溶液转变或破坏凝胶的光照时间从1min-24h，水凝胶中掺杂或不掺杂如式13所示的烯烃，其中B1，B2，B3，B4可任意为CO2Me，CN，CHO，CONHR，alkyl，Ph，取代的芳环或缺失
[0028]
[0029] 一种利用所述光敏性超分子水凝胶成胶因子在光照下对生物大分子、重组蛋白及药物分子进行控制释放中的应用。所述生物大分子为蛋白质、核酸、脂类、多糖、马血清或牛血清；药物分子为抗癌药、镇痛药、抗凝血剂、抗焦虑药、胰岛素、垂体激素、非甾体抗炎药、免疫抑制剂、局部麻醉剂、镇静剂、疫苗或维生素。
[0030] 所述光敏性超分子水凝胶成胶因子在进行一种波长光照下信息的记录、在同一种或另一种波长光照下读取中的应用。
[0031] 所述光敏性超分子水凝胶成胶因子在作为生物支架在其表面进行二维培养细胞或在其内部进行三维培养中的应用。
[0032] 含有四氮唑的短肽Tet(I)-GFF的合成方法，步骤为：四氮唑Tet(I)-OH的合成：将2mL含有5mmol亚硝酸钠的水溶液滴加到8mL含有5mmol2-烯丙氧基苯胺和1.3mL37%wt浓盐酸的50%wt的乙醇水溶液中，控制反应过程中的温度低于5℃，滴加完即得到2-烯丙氧基氯化重氮苯的1水溶液；1水溶液在30min内滴加到30mL含5mmol有4-((2-磺酰腙)甲基)苯甲酸的吡啶溶液中整个反应温度控制在-10～-15℃，反应1h后，反应液用氯仿和水萃取；氯仿层分别用稀盐酸和水洗，无水硫酸钠干燥；减压蒸去溶剂后，粗产物用柱层析分离，石油醚：乙酸乙酯体积比=1:1，得到白色粉末四氮唑Tet(I)-OH；1.在固相合成管中，加入1g2-chlorotrityl chloride树脂和8mL无水CH2Cl2，在摆床上震荡5min后，抽滤除去溶剂；2.加入2.2mmol Fmoc-Gly-OH、4.4mmol DIEA溶于CH2Cl2后，加入到树脂中，振摇30min，抽滤；DMF洗树脂，DCM:MeOH:DIEA体积比=80:15:5的溶液洗树脂；再用DMF洗，
10mL25%wt哌啶的DMF溶液洗涤3min，抽滤后再用10mL25%wt哌啶的DMF溶液洗涤树脂
10min,用DMF洗涤6次除去哌啶后抽滤；3.将5mmol Fmoc-Phe-OH、5mmol HOBT、5mmol TBTU加入到5mL DMF后，加入10mmol的DIEA充分混合，使其成透明粘稠液，加入到树脂中，反应
1h，做Kaiser检测，若树脂不变色则反应完全，抽滤，分别用DMF洗3次、20%wt哌啶的DMF溶液洗3次、DMF洗6次后抽滤；若树脂显示蓝色，继续反应2小时，Kaiser检测还是蓝色则抽去反应液，DMF洗涤5次，重新加入5mmol Fmoc-Phe-OH、5mmol HOBT、5mmol TBTU、10mmol的DIEA反应液，直到Kaiser检测不变色；4.重复第3步，将Fmoc-Phe-OH接到树脂上,再次重复第3步，用5mmol Tet(I)-OH替换Fmoc-Phe-OH，将其接到树脂上；5.反应结束后，树脂经DMF、异丙醇、正己烷的洗涤，抽干后，浸没于三氟乙酸中静置3h，抽滤，CH2Cl2洗涤，减压除去滤液中的CH2Cl2和三氟乙酸，用乙醚分散得到黄色固体，用乙醚洗涤固体3次，得到的固体在真空干燥箱中干燥，称重，利用高压液相色谱对短肽进行提纯得产物。
10mL25%wt哌啶的DMF溶液洗涤3min，抽滤后再用10mL25%wt哌啶的DMF溶液洗涤树脂
10min,用DMF洗涤6次除去哌啶后抽滤；3.将5mmol Fmoc-Phe-OH、5mmol HOBT、5mmol TBTU加入到5mL DMF后，加入10mmol的DIEA充分混合，使其成透明粘稠液，加入到树脂中，反应
1h，做Kaiser检测，若树脂不变色则反应完全，抽滤，分别用DMF洗3次、20%wt哌啶的DMF溶液洗3次、DMF洗6次后抽滤；若树脂显示蓝色，继续反应2小时，Kaiser检测还是蓝色则抽去反应液，DMF洗涤5次，重新加入5mmol Fmoc-Phe-OH、5mmol HOBT、5mmol TBTU、10mmol的DIEA反应液，直到Kaiser检测不变色；4.重复第3步，将Fmoc-Phe-OH接到树脂上,再次重复第3步，用5mmol Tet(I)-OH替换Fmoc-Phe-OH，将其接到树脂上；5.反应结束后，树脂经DMF、异丙醇、正己烷的洗涤，抽干后，浸没于三氟乙酸中静置3h，抽滤，CH2Cl2洗涤，减压除去滤液中的CH2Cl2和三氟乙酸，用乙醚分散得到黄色固体，用乙醚洗涤固体3次，得到的固体在真空干燥箱中干燥，称重，利用高压液相色谱对短肽进行提纯得产物。
[0033] 通过将可以发生光点击反应的二取代四氮唑与短肽相连，利用四氮唑分子间的π-π堆积作用稳定短肽之间氢键及静电作用，通过分子间的自组装形成三维网状结构，从而形成水凝胶。通过光点击反应过程中，二取代四氮唑结构的破坏破坏了π-π堆积与氢键作用之间的平衡使得自组装被破坏，纤维状结构断裂，导致水凝胶的机械性能的降低，进而实现凝胶向溶液的相变，该结构变化有利于生物分子的释放以及对微环境改变有响应的细胞行为的调控。同时，利用光点击产物的荧光和光掩模的技术，通过共聚焦显微镜可以追踪调控过的区域。
[0034] 有益效果：与现有的光敏性超分子水凝胶相比，本发明利用可以发生光点击反应的二取代四氮唑作为光敏基团得到了生物相容性好，机械性能优异，可用于细胞的二维培-1 -1养和三维培养的超分子水凝胶。同时，由于光点击反应的反应速率达到10M S ，该水凝胶获得了快速的光响应，与之前的光敏性超分子水凝胶数小时的光照时间相比，基于二取代四氮唑的水凝胶在10min之内即可产生明显的凝胶向溶液的转变过程。此外，由于光的特殊性质，利用光掩模蚀刻的技术，实现了对水凝胶进行时空分辨的调控，同时由于光点击产物二氢二氮唑具有荧光，使得可以对水凝胶微环境的调控进行追踪或用于信息的记录与存储。基于以上优点，该类水凝胶还被用于马血清等生物大分子或药物的控制释放用于调控C2C12细胞的分化以及hMSC细胞在水凝胶三维结构中的行为。
附图说明
附图说明
[0035] 图1.成胶因子Tet(I)-GFF在不同浓度下(10,100,500μM)对C2C12细胞(A)和hMSC细胞(B)在1-5天的培养时间下的细胞毒性示意图。
[0036] 图2.超分子水凝胶成胶因子在光照下发生的分子内（A）及分子间（B）的光点击反应示意图。
[0037] 图3.超分子水凝胶成胶因子在最低成胶浓度下形成的水凝胶及最低成胶浓度 和 对 应 的pH 示 意 图：A)TetI-GAGAS（2.7mg/mL,pH=5.6），B)TetI-YGFGG（4.2mg/mL,pH=4.5），C)TetI-FF(4.5mg/mL,pH=12.7)，D)TetI-GFRGD(4.0mg/mL,pH=7.4)，E)TetII-VTEEI(5.0mg/mL,pH=4.4),F)TetI-GFF(0.4mg/mL,pH=6.4)，G)TetIV-YIGSR(2.8mg/mL,pH=8.0)，H)TetVIII-GA(0.8mg/mL,pH=7.2)。
[0038] 图4.超分子水凝胶成胶因子Tet(I)-GFF在凝胶状态下的光点击反应HPLC监测结果示意图。
[0039] 图5超分子水凝胶成胶因子Tet(I)-GFF(0.8mg/mL)在8W302nm手提紫外灯的照射下发生凝胶向溶液的转变示意图。
[0040] 图6.超分子水凝胶成胶因子Tet(II)-GFRGD(1.5mg/mL)在8W302nm手提紫外灯的照射下发生凝胶向溶液的转变示意图。
[0041] 图 7. 超 分 子 水 凝 胶 成 胶 因 子 Tet(I)-FF(A)，Tet(I)-GAGAS(B)，Tet(I)-VTEEI(C)，Tet(I)-VYGGG(D)，Tet(I)-YGFGG(E)和Tet(I)-GFRGD(F)形成的水凝胶的微观结构示意图.Scale bar=200nm。
[0042] 图8.超分子水凝胶成胶因子Tet(I)-GFF（1.5mg/mL）形成的水凝胶在不同的光照时间A)0s，B)10s，C)60s，D)120s，E)300s，F)600s下的储能模量(G’）和耗能模量(G’’）在固定张力为1%时随频率的变化示意图，使用的光源为手提302nm紫外灯。
[0043] 图9.成胶因子Tet(II)-GFRGD在不同浓度下(10,100,500μM)对C2C12细胞(A)和hMSC细胞(B)在1-5天的培养时间下的细胞毒性示意图。
[0044] 图10.Tet(I)-GFF(0.8mg/mL)(A)和Tet(II)-GFRGD(1.5mg/mL)(B)水凝胶的光蚀刻用于水凝胶的时空分辨的调节示意图。Scale bar=400μm.
[0045] 图11.Tet(I)-GFF(0.8mg/mL)水凝胶的光蚀刻用于信息的记录和读取示意图。
[0046] 图12.hMSC细胞在Tet(I)-GFF水凝胶(1.5mg/mL)的三维培养示意图。培养24h2
后，将细胞用钙黄素进行染色后图片利用激光共聚焦拍照，XY平面为600×600μm，对Z方
3
向每0.3μm进行拍照，得到600×600×600μm 区域内细胞在三维的水凝胶的结构中分布。
后，将细胞用钙黄素进行染色后图片利用激光共聚焦拍照，XY平面为600×600μm，对Z方
3
向每0.3μm进行拍照，得到600×600×600μm 区域内细胞在三维的水凝胶的结构中分布。
[0047] 图13.C2C12细胞在Tet(I)-GFF水凝胶(1.5mg/mL)表面的二维培养示意图。水凝胶分别为不含马血清未经过302nm手提紫外灯光照(-UV，-HS)、不含马血清经过302nm手提紫外灯光照(+UV，-HS)、含有3%wt马血清且未经过2min302nm手提紫外灯光照(-UV，+HS)和含3%wt马血清马血清经过2min光照(+UV，+HS)。经过48h二维培养的的C2C12细胞用分化标记物的抗体（rabbit polyclonal anti-MyoD antibody）和对应的的二抗Cy3-labeled Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)的荧光标记。
[0048] 图14.hMSC细胞分别在Tet(I)-GFF水凝胶(1.5mg/mL)和Tet(II)-GFRGD水凝胶(2.5mg/mL)的三维培养，以及利用紫外光照（2min）对细胞行为的调控示意图。培养36h后，将细胞用rhodamine palloidin(Invitrogen)进行染色后进行激光共聚焦拍照。Scale bar=100μm.
[0049] 图15.hMSC细胞在不经过（上面一排）和经过（下面一排）8W302nm手提紫外灯照射120s后的Tet(II)-GFRGD水凝胶三维环境中培育不同时间（36h，72h，108h）的形态示意图。
具体实施方式
[0050] 下面的实施例可使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
[0051] 实施例1～8所合成化合物结构式：
[0052]
[0053] 实施例1：四氮唑Tet(I)-OH的合成
[0054] 将2mL含有5mmol亚硝酸钠的水溶液滴加到8mL含有5mmol2-烯丙氧基苯胺和1.3mL浓盐酸（37%wt）的50%wt的乙醇水溶液中，控制反应过程中的温度低于5℃，滴加完即得到2-烯丙氧基氯化重氮苯的1水溶液。上述1水溶液在30min内滴加到30mL含5mmol有4-((2-磺酰腙)甲基)苯甲酸的吡啶溶液中整个反应温度控制
在-10～-15℃，反应1h后，反应液用氯仿和水萃取。氯仿层分别用稀盐酸和水洗，无水硫酸钠干燥。减压蒸去溶剂后，粗产物用柱层析分离（石油醚：乙酸乙酯体积比=1:1），得 到白 色 粉 末(1.0g,62%)，m.p.159–161 ℃。1H NMR(300MHz,Acetone-d6)δ8.40–
8.31(m,2H),8.30–8.20(m,2H),7.74(dd,J=7.9,1.7Hz,1H),7.71–7.63(m,1H),7.44–
7.36(m,1H),7.25(td,J=7.7,1.0Hz,1H),6.11–5.86(m,1H),5.40–5.27(m,1H),-
5.26–5.12(m,1H,OCH2CHCH2),4.74(dt,J=4.7,1.5Hz,2H);13C NMR(75MHz,Acetone-d6)168.2,163.8,152.8,132.7,132.5,132.2,131.5,130.4,127.2,126.7,126.6,120.9,116.7,11
4.5,69.2.HRMS(ESI)calcd for C17H14N4O3Na345.0958[M+Na]+;found345.0961.[0055] 实施例2：四氮唑Tet(II)-OH的合成
在-10～-15℃，反应1h后，反应液用氯仿和水萃取。氯仿层分别用稀盐酸和水洗，无水硫酸钠干燥。减压蒸去溶剂后，粗产物用柱层析分离（石油醚：乙酸乙酯体积比=1:1），得 到白 色 粉 末(1.0g,62%)，m.p.159–161 ℃。1H NMR(300MHz,Acetone-d6)δ8.40–
8.31(m,2H),8.30–8.20(m,2H),7.74(dd,J=7.9,1.7Hz,1H),7.71–7.63(m,1H),7.44–
7.36(m,1H),7.25(td,J=7.7,1.0Hz,1H),6.11–5.86(m,1H),5.40–5.27(m,1H),-
5.26–5.12(m,1H,OCH2CHCH2),4.74(dt,J=4.7,1.5Hz,2H);13C NMR(75MHz,Acetone-d6)168.2,163.8,152.8,132.7,132.5,132.2,131.5,130.4,127.2,126.7,126.6,120.9,116.7,11
4.5,69.2.HRMS(ESI)calcd for C17H14N4O3Na345.0958[M+Na]+;found345.0961.[0055] 实施例2：四氮唑Tet(II)-OH的合成
[0056] 将2mL含有5mmol亚硝酸钠的水溶液滴加到8mL含有5mmol2-烯丙氧基-4-硝基苯胺和1.3mL浓盐酸（37%wt）的50%wt的乙醇水溶液中，控制反应过程中的温度低于5℃，滴加完即得到2-烯丙氧基-4-硝基氯化重氮苯的水溶液。将上述溶液在30min内滴加到30mL含有5mmol N'-亚苄基-4-甲基苯磺腙的吡啶溶液中，整个反应温度控制在-10～-15℃，反应1h后，反应液用氯仿和水萃取。氯仿层分别用稀盐酸和水洗，无水硫酸钠干燥。减压蒸去溶剂后，粗产物直接溶于12mL EtOH,6mL H2O和12mL HOAc的混合溶液后，加入1.3g（25mmol）铁粉，超声直至TLC跟踪反应完全。过滤除去剩余的铁粉，混合液用乙酸乙酯萃取后，有机相用无水硫酸钠干燥，减压蒸去溶剂后，加入5mmol丁二酸酐和30mL氯仿，反应液回流12h。减压蒸去溶剂，柱层析分离(CH2Cl2/CH3OH=1:20)得到白
1
色粉末(1.0g,52%),m.p.138–141℃.H NMR(300MHz,Acetone-d6)δ9.58(s,1H),8.27–
8.14(m,2H),7.90(d,J=1.7Hz,1H),7.65–7.50(m,4H),7.36(dd,J=8.6,1.5Hz,1H),6.07–
5.89(m,1H,OCH2CHCH2),5.41–5.28(m,1H),5.22–5.13(m,1H),4.72–4.58(m,2H),2.80–
13
2.66(m,4H); C NMR(75MHz,DMSO-d6)δ174.2,171.4,164.4,153.0,143.4,133.0,131.2,1
29.8,128.0,127.2,126.9,120.9,117.7,111.1,104.6,69.2,31.7,29.1.HRMS(ESI)calcd +
for C20H19N5O4Na:416.1329[M+Na];found416.1337。
1
色粉末(1.0g,52%),m.p.138–141℃.H NMR(300MHz,Acetone-d6)δ9.58(s,1H),8.27–
8.14(m,2H),7.90(d,J=1.7Hz,1H),7.65–7.50(m,4H),7.36(dd,J=8.6,1.5Hz,1H),6.07–
5.89(m,1H,OCH2CHCH2),5.41–5.28(m,1H),5.22–5.13(m,1H),4.72–4.58(m,2H),2.80–
13
2.66(m,4H); C NMR(75MHz,DMSO-d6)δ174.2,171.4,164.4,153.0,143.4,133.0,131.2,1
29.8,128.0,127.2,126.9,120.9,117.7,111.1,104.6,69.2,31.7,29.1.HRMS(ESI)calcd +
for C20H19N5O4Na:416.1329[M+Na];found416.1337。
[0057] 实施例3：四氮唑Tet(III)-OH的合成
[0058] 用5mmol苯胺替 换实施 例1中的5mmol2-烯丙 氧基苯 胺，反应条 件1
和 处 理 如 实 施 例 1 中 Tet(I)-OH 的 合 成。H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.30(s,1H),8.29(t,J=7.4Hz,2H),8.17(t,J=6.3Hz,4H),7.72(dd,J=12.5,7.4Hz,2
13
H),7.69–7.61(m,1H). CNMR(75MHz,DMSO-d6):166.6,163.7,136.0,132.7,130.3,1-
30.2,130.1,130.1,126.7,119.9。
和 处 理 如 实 施 例 1 中 Tet(I)-OH 的 合 成。H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.30(s,1H),8.29(t,J=7.4Hz,2H),8.17(t,J=6.3Hz,4H),7.72(dd,J=12.5,7.4Hz,2
13
H),7.69–7.61(m,1H). CNMR(75MHz,DMSO-d6):166.6,163.7,136.0,132.7,130.3,1-
30.2,130.1,130.1,126.7,119.9。
[0059] 实施例4：四氮唑Tet(IV)-OH的合成
[0060] 用5mmol对硝基苯胺替换实施例2中的5mmol2-烯丙氧基-4-硝基苯胺，反应条1
件和处理如实施例2中Tet(II)-OH的合成。HNMR(300MHz,DMSO-d6):10.36(s,1H),8.18–
8.07(m,4H),7.90–7.87(m,2H),7.63–7.57(m,3H),2.65–
13
2.53(m,4H); CNMR(75MHz,DMSO-d6):173.8,170.6,164.3,140.9,131.0,130.8,129.3,126.6,126.5,120.6,119.6,31.1,28.7。
件和处理如实施例2中Tet(II)-OH的合成。HNMR(300MHz,DMSO-d6):10.36(s,1H),8.18–
8.07(m,4H),7.90–7.87(m,2H),7.63–7.57(m,3H),2.65–
13
2.53(m,4H); CNMR(75MHz,DMSO-d6):173.8,170.6,164.3,140.9,131.0,130.8,129.3,126.6,126.5,120.6,119.6,31.1,28.7。
[0061] 实施例5：四氮唑Tet(V)-OH的合成
[0062] 用5mmol2-萘胺替换实施例1中的5mmol2-烯丙氧基苯胺，反应条件和处1
理 如 实 施 例 1中Tet(I)-OH 的 合 成。HNMR(300MHz,DMSO-d6):10.48(s,1H),8.18–
8.10(m,5H),7.95–7.83(m,2H),7.72–7.63(m,1H),7.58–7.51(m,2H),7.35–
13
7.23(m,1H); CNMR(75MHz,DMSO-d6):166.0,163.5,133.6,130.2,128.1,127.8,127,5,127.3,126.2,126.0,125.9。
理 如 实 施 例 1中Tet(I)-OH 的 合 成。HNMR(300MHz,DMSO-d6):10.48(s,1H),8.18–
8.10(m,5H),7.95–7.83(m,2H),7.72–7.63(m,1H),7.58–7.51(m,2H),7.35–
13
7.23(m,1H); CNMR(75MHz,DMSO-d6):166.0,163.5,133.6,130.2,128.1,127.8,127,5,127.3,126.2,126.0,125.9。
[0063] 实施例6：四氮唑Tet(VI)-OH的合成
[0064] 将乙醛酸的甲苯溶液（1.5g,50wt%）加入到30mL含有5mmol对甲苯磺酸阱的乙醇溶液中，室温搅拌30min。减压蒸去溶剂后得到白色固体，将其溶解在30mL吡啶溶液中得到溶液A。同时将2mL含有5mmol亚硝酸钠的水溶液滴加到8mL含有5mmol4-硝基苯胺和1.3mL浓盐酸（37%wt）的50%wt的乙醇水溶液中，控制反应过程中的温度低于5℃，滴加完即得到4-硝基氯化重氮苯的水溶液B。将上述溶液B在30min内滴加到溶液A中，整个反应温度控制在-10～-15℃，反应1h后，反应液用氯仿和水萃取。氯仿层分别用稀盐酸和水洗，无水硫酸钠干燥。减压蒸去溶剂后，将粗产物直接溶于30mL THF中，加入20mL氨水（28wt%），室温搅拌至反应完全，柱层析分离，得白色粉末（432mg，37%）。将其溶解在12mL EtOH,6mL H2O和12mL HOAc的混合溶液后，加入1.3g（25mmol）铁粉，超声直至TLC跟踪反应完全。过滤除去剩余的铁粉，混合液用乙酸乙酯萃取后，有机相用无水硫酸钠干燥，减压蒸去溶剂后，加入5mmol丁二酸酐和30mL氯仿，反应液回流12h。减压蒸去
1
溶剂，柱层析分离(CH2Cl2/CH3OH=1:40)得到白色粉末(484mg,86%)。HNMR(300MHz,DMSO-d
6):11.16(s,1H),7.85(s,2H),7.90–7.87(m,2H),7.63–7.57(m,2H),7.23(s,1H),2.65–
13
2.53(m,4H); CNMR(75MHz,DMSO-d6):173.8,170.5,163.8,146.7,137.5,129.3,126.3,126.1,120.2,119.8,30.9,28.6。
1
溶剂，柱层析分离(CH2Cl2/CH3OH=1:40)得到白色粉末(484mg,86%)。HNMR(300MHz,DMSO-d
6):11.16(s,1H),7.85(s,2H),7.90–7.87(m,2H),7.63–7.57(m,2H),7.23(s,1H),2.65–
13
2.53(m,4H); CNMR(75MHz,DMSO-d6):173.8,170.5,163.8,146.7,137.5,129.3,126.3,126.1,120.2,119.8,30.9,28.6。
[0065] 实施例7：四氮唑Tet(VII)-OH的合成
[0066] 用5mmol2-噻吩氨基替换实施例1中的5mmol2-烯丙氧基苯胺，反应条件和处理1
如实施例1中Tet(I)-OH的合成。HNMR(300MHz,DMSO-d6):12.25(s,1H),8.14–8.05(m,4
13
H),7.71(d,1H,J=7.1Hz),7.28(dd,1H,J=7.1,6.3Hz),7.13(d,1H,J=6.3Hz); CNMR(75MHz,DMSO-d6):169.8,164.1,148.9,137.2,130.4,128.2,128.1,127.5,125.3。
如实施例1中Tet(I)-OH的合成。HNMR(300MHz,DMSO-d6):12.25(s,1H),8.14–8.05(m,4
13
H),7.71(d,1H,J=7.1Hz),7.28(dd,1H,J=7.1,6.3Hz),7.13(d,1H,J=6.3Hz); CNMR(75MHz,DMSO-d6):169.8,164.1,148.9,137.2,130.4,128.2,128.1,127.5,125.3。
[0067] 实施例8：四氮唑Tet(VIII)-OH的合成
[0068] 用5mmol五氟苯氨替换实施例1中的5mmol2-烯丙氧基苯胺，反应条件和处理如1
实施例1中Tet(I)-OH的合成。HNMR(300MHz,DMSO-d6):11.10(s,1H),8.18–8.07(m,4H);
13
CNMR(75MHz,DMSO-d6):168.3,163.6,148.3,148.2,143.8,137.5,137.2,130.8,127.6,12
7.5,103.6。
实施例1中Tet(I)-OH的合成。HNMR(300MHz,DMSO-d6):11.10(s,1H),8.18–8.07(m,4H);
13
CNMR(75MHz,DMSO-d6):168.3,163.6,148.3,148.2,143.8,137.5,137.2,130.8,127.6,12
7.5,103.6。
[0069] 实施例9～37所合成化合物结构式：
[0070]
[0071]
[0072] 实施例9：含有四氮唑的短肽Tet(I)-GFF的合成
[0073] Tet(I)-GFF合成采用固相短肽合成的方法：
[0074] 1.在固相合成管中，加入1g2-chlorotrityl chloride树脂（1.15mmol氯/克树脂）和8mL无水CH2Cl2，在摆床上震荡5min后，抽滤除去溶剂；
[0075] 2.加入2.2mmol Fmoc-Gly-OH、4.4mmol DIEA溶于CH2Cl2后，加入到树脂中，振摇30min，抽滤。DMF洗树脂(3×10mL)，DCM:MeOH:DIEA体积比=80:15:5的溶液洗树脂(2×10mL)，每次10min。再用DMF洗(3×10mL)，10mL25%wt哌啶的DMF溶液洗涤3min，抽滤后再用10mL25%wt哌啶的DMF溶液洗涤树脂10min,用DMF洗涤6次除去哌啶后抽滤；
[0076] 3.将5mmol Fmoc-Phe-OH、5mmol HOBT、5mmol TBTU加入到5mL DMF后，加入10mmol的DIEA充分混合，使其成透明粘稠液，迅速加入到树脂中，反应1h，做Kaiser检测，若树脂不变色则反应完全，抽滤，分别用DMF洗3次、20%wt哌啶的DMF溶液洗3次、DMF洗
6次后抽滤；若树脂显示蓝色，继续反应2小时，Kaiser检测还是蓝色则抽去反应液，DMF洗涤5次，重新加入5mmol Fmoc-Phe-OH、5mmol HOBT、5mmol TBTU、10mmol的DIEA反应液，直到Kaiser检测不变色；
6次后抽滤；若树脂显示蓝色，继续反应2小时，Kaiser检测还是蓝色则抽去反应液，DMF洗涤5次，重新加入5mmol Fmoc-Phe-OH、5mmol HOBT、5mmol TBTU、10mmol的DIEA反应液，直到Kaiser检测不变色；
[0077] 4.重复第3步，将Fmoc-Phe-OH接到树脂上,再次重复第3步，用5mmol Tet(I)-OH替换Fmoc-Phe-OH，将其接到树脂上；
[0078] 5.反应结束后，树脂经DMF、异丙醇、正己烷的洗涤，抽干后，浸没于三氟乙酸中静置3h，抽滤，CH2Cl2洗涤，减压除去滤液中的CH2Cl2和三氟乙酸，用乙醚分散得到黄色固体，用乙醚洗涤固体3次，得到的固体在真空干燥箱中干燥，称重，利用高压液相色谱1
对短肽进行提纯。Tet(I)-GFFH NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.78(s,1H,COOH),8.86(t,J=5.8Hz,1H),8.29–8.21(m,2H),8.12–8.04(m,3H),7.75(dd,J=7.8,1.5Hz,1H),7.71–
7.62(m,1H),7.41(d,J=8.4Hz,1H),7.34–7.10(m,11H),-
6.03–5.85(m,1H,OCH2CHCH2),5.34–5.13(m,2H,OCH2CHCH2),4.77–4.67(m,2H,OCH2CHCH2),4.59(td,J=9.0,4.2Hz,1H),4.46(td,J=8.2,5.5Hz,1H),3.93(dd,J=16.4,5.9Hz,1H)-,3.80(dd,J=16.4,5.7Hz,1H),3.14–2.90(m,3H),2.77(dd,J=13.8,9.0Hz,1H).HRMS(ESI)+
calcd.for C37H35N7O6Na696.2541[M+Na];found696.2546.
对短肽进行提纯。Tet(I)-GFFH NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.78(s,1H,COOH),8.86(t,J=5.8Hz,1H),8.29–8.21(m,2H),8.12–8.04(m,3H),7.75(dd,J=7.8,1.5Hz,1H),7.71–
7.62(m,1H),7.41(d,J=8.4Hz,1H),7.34–7.10(m,11H),-
6.03–5.85(m,1H,OCH2CHCH2),5.34–5.13(m,2H,OCH2CHCH2),4.77–4.67(m,2H,OCH2CHCH2),4.59(td,J=9.0,4.2Hz,1H),4.46(td,J=8.2,5.5Hz,1H),3.93(dd,J=16.4,5.9Hz,1H)-,3.80(dd,J=16.4,5.7Hz,1H),3.14–2.90(m,3H),2.77(dd,J=13.8,9.0Hz,1H).HRMS(ESI)+
calcd.for C37H35N7O6Na696.2541[M+Na];found696.2546.
[0079] 实施例10：含有四氮唑的短肽Tet(I)-FF的合成
[0080] 利用短肽固相合成的方法，将实施例9中的Fmoc保护的氨基酸依次替换为Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Phe-OH，反应条件和处理如实施例9中Tet(I)-GFF的合成。1
Tet(I)-FFH NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.79(s,1H,COOH),8.74(d,J=8.6Hz,1H),8.38(d,J=7.8Hz,1H),8.25-8.19(m,2H),8.03–7.96(m,2H),7.74(dd,J=7.8,1.6Hz,1H),7.71–
7.63(m,1H),7.43–7.33(m,3H),7.30–7.14(m,9H),5.99–5.87(m,1H,OCH2CHCH2),5.30–
5.14(m,2H,OCH2CHCH2),4.86–4.77(m,1H),4.73–4.67(m,2H,OCH2CHCH2),4.56–
4.46(m,1H),3.13(dd,J=13.9,4.8Hz,2H),3.04–2.94(m,2H).HRMS(ESI)calcd.for C35H32N+
6O5Na639.2326[M+Na];found639.2333.
Tet(I)-FFH NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.79(s,1H,COOH),8.74(d,J=8.6Hz,1H),8.38(d,J=7.8Hz,1H),8.25-8.19(m,2H),8.03–7.96(m,2H),7.74(dd,J=7.8,1.6Hz,1H),7.71–
7.63(m,1H),7.43–7.33(m,3H),7.30–7.14(m,9H),5.99–5.87(m,1H,OCH2CHCH2),5.30–
5.14(m,2H,OCH2CHCH2),4.86–4.77(m,1H),4.73–4.67(m,2H,OCH2CHCH2),4.56–
4.46(m,1H),3.13(dd,J=13.9,4.8Hz,2H),3.04–2.94(m,2H).HRMS(ESI)calcd.for C35H32N+
6O5Na639.2326[M+Na];found639.2333.
[0081] 实施例11：含有四氮唑的短肽Tet(I)-RGD的合成
[0082] 利用短肽固相合成的方法，将实施例9中的Fmoc保护的氨基酸依次替换为Fmoc-Asp（OtBu）-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Arg（Pbf）-OH，反应条件和处理如实施例9中1
Tet(I)-GFF的合成。Tet(I)-RGDH NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.61(s,2H,COOH),8.75(d,J=
7.6Hz,1H),8.30(t,J=5.8Hz,1H),8.25(m,2H),8.19(d,J=8.0Hz,1H),8.13(m,2H),7.75(dd,J=7.8,1.6Hz,1H),7.72–7.64(m,1H),7.58(t,J=5.5Hz,1H),7.41(dd,J=8.4,0.7Hz,1H),
7.23(td,J=7.7,1.0Hz,1H),6.00–5.86(m,1H,OCH2CHCH2),5.30-5.14(m,2H,OCH2CHCH2),4.
71(dt,J=4.6,1.6Hz,2H,OCH2CHCH2),4.61–4.54(m,1H),4.54–4.46(m,1H),3.78(d,J=6.0Hz,2H),3.15(dd,J=12.8,6.6Hz,2H),2.71(dd,J=16.7,5.9Hz,1H),2.60(dd,J=16.7,6.7Hz,1H),1.96–1.82(m,1H),1.82–1.69(m,1H),1.67-1.50(m,2H).HRMS(ESI)calcd.for C29H+
34N10O8Na673.2453[M+Na];found673.2459.
Tet(I)-GFF的合成。Tet(I)-RGDH NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.61(s,2H,COOH),8.75(d,J=
7.6Hz,1H),8.30(t,J=5.8Hz,1H),8.25(m,2H),8.19(d,J=8.0Hz,1H),8.13(m,2H),7.75(dd,J=7.8,1.6Hz,1H),7.72–7.64(m,1H),7.58(t,J=5.5Hz,1H),7.41(dd,J=8.4,0.7Hz,1H),
7.23(td,J=7.7,1.0Hz,1H),6.00–5.86(m,1H,OCH2CHCH2),5.30-5.14(m,2H,OCH2CHCH2),4.
71(dt,J=4.6,1.6Hz,2H,OCH2CHCH2),4.61–4.54(m,1H),4.54–4.46(m,1H),3.78(d,J=6.0Hz,2H),3.15(dd,J=12.8,6.6Hz,2H),2.71(dd,J=16.7,5.9Hz,1H),2.60(dd,J=16.7,6.7Hz,1H),1.96–1.82(m,1H),1.82–1.69(m,1H),1.67-1.50(m,2H).HRMS(ESI)calcd.for C29H+
34N10O8Na673.2453[M+Na];found673.2459.
[0083] 实施例12：含有四氮唑的短肽Tet(I)-GAGAS的合成
[0084] 利用短肽固相合成的方法，将实施例9中的Fmoc保护的氨基酸依次替换为Fmoc-Ser（tBu）-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Gly-OH，反应条件和1
处理如实施例9中Tet(I)-GFF的合成。Tet(I)-GAGASH NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.57(s,1H,COOH).8.91(t,J=5.7Hz,1H),8.31–8.18(m,4H),8.09(m,2H),8.04(d,J=7.9Hz,1H),7.86(d,J=7.6Hz,1H),7.74(dd,J=7.9,1.6Hz,1H),7.71–7.63(m,1H),7.41(dd,J=7.9,1.3Hz,1H),7.22(td,J=7.9,1.3Hz,1H),6.01–5.84(m,1H,OCH2CHCH2),5.33–5.12(m,2H,OCH2CHCH2),4.71(dt,J=4.8,1.7Hz,2H,OCH2CHCH2),4.47–4.19(m,3H),3.96(dd,J=5.7,1.8Hz,2H),3.72(d,J=5.7Hz,2H),3.71(dd,J=11.0,5.3Hz,1H),3.63(dd,J=11.0,4.2Hz,1H),1.26(+
d,J=7.1Hz,3H),1.18(d,J=7.0Hz,3H).HRMS(ESI)calcd.for C30H35N9O9Na688.2450[M+Na];
found688.2441.
处理如实施例9中Tet(I)-GFF的合成。Tet(I)-GAGASH NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.57(s,1H,COOH).8.91(t,J=5.7Hz,1H),8.31–8.18(m,4H),8.09(m,2H),8.04(d,J=7.9Hz,1H),7.86(d,J=7.6Hz,1H),7.74(dd,J=7.9,1.6Hz,1H),7.71–7.63(m,1H),7.41(dd,J=7.9,1.3Hz,1H),7.22(td,J=7.9,1.3Hz,1H),6.01–5.84(m,1H,OCH2CHCH2),5.33–5.12(m,2H,OCH2CHCH2),4.71(dt,J=4.8,1.7Hz,2H,OCH2CHCH2),4.47–4.19(m,3H),3.96(dd,J=5.7,1.8Hz,2H),3.72(d,J=5.7Hz,2H),3.71(dd,J=11.0,5.3Hz,1H),3.63(dd,J=11.0,4.2Hz,1H),1.26(+
d,J=7.1Hz,3H),1.18(d,J=7.0Hz,3H).HRMS(ESI)calcd.for C30H35N9O9Na688.2450[M+Na];
found688.2441.
[0085] 实施例13：含有四氮唑的短肽Tet(I)-VTEEI的合成
[0086] 利用短肽固相合成的方法，将实施例9中的Fmoc保护的氨基酸依次替换为 Fmoc-Ile-OH，Fmoc-Glu（OtBu）-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Thr(tBu)-OH，1
Fmoc-Val-OH，反应条件和处理如实施例9中Tet(I)-GFF的合成。Tet(I)-VTEEIH NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.22(s,3H,COOH),8.59(d,J=8.3Hz,1H),8.24(m,2H),8.09(m,2H),7.99(d,J=7.8Hz,1H),7.95(d,J=8.2Hz,2H),7.83(d,J=7.9Hz,1H),7.75(dd,J=7.
8,1.6Hz,1H),7.71–7.64(m,1H),7.41(dd,J=8.6,1.2Hz,1H),7.22(td,J=7.8,1,2Hz,1H),6.00–5.86(m,1H,OCH2CHCH2),5.31–5.13(m,2H,OCH2CHCH2),4.70(dt,J=4.7,1.6Hz,2H,OCH2CHCH2),4.40(t,J=8.5Hz,1H),4.37–4.28(m,2H),4.24(dd,J=8.0,4.4Hz,1H),4.14(dd,J=8.1,5.8Hz,1H),4.05–3.97(m,1H),2.34–2.13(m,5H),1.97–1.67(m,5H),1.47–
1.33(m,1H),1.25–1.14(m,1H),1.05(d,J=6.3Hz,3H),0.96(d,J=6.7Hz,6H),0.85(d,J=7+
.0Hz,3H),0.83(t,J=7.5Hz,3H).HRMS(ESI)calcd.for C42H55N9O13Na916.3812[M+Na];found916.3817.
Fmoc-Val-OH，反应条件和处理如实施例9中Tet(I)-GFF的合成。Tet(I)-VTEEIH NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.22(s,3H,COOH),8.59(d,J=8.3Hz,1H),8.24(m,2H),8.09(m,2H),7.99(d,J=7.8Hz,1H),7.95(d,J=8.2Hz,2H),7.83(d,J=7.9Hz,1H),7.75(dd,J=7.
8,1.6Hz,1H),7.71–7.64(m,1H),7.41(dd,J=8.6,1.2Hz,1H),7.22(td,J=7.8,1,2Hz,1H),6.00–5.86(m,1H,OCH2CHCH2),5.31–5.13(m,2H,OCH2CHCH2),4.70(dt,J=4.7,1.6Hz,2H,OCH2CHCH2),4.40(t,J=8.5Hz,1H),4.37–4.28(m,2H),4.24(dd,J=8.0,4.4Hz,1H),4.14(dd,J=8.1,5.8Hz,1H),4.05–3.97(m,1H),2.34–2.13(m,5H),1.97–1.67(m,5H),1.47–
1.33(m,1H),1.25–1.14(m,1H),1.05(d,J=6.3Hz,3H),0.96(d,J=6.7Hz,6H),0.85(d,J=7+
.0Hz,3H),0.83(t,J=7.5Hz,3H).HRMS(ESI)calcd.for C42H55N9O13Na916.3812[M+Na];found916.3817.
[0087] 实施例14：含有四氮唑的短肽Tet(I)-VYGGG的合成
[0088] 利用短肽固相合成的方法，将实施例9中的Fmoc保护的氨基酸依次替换为Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Tyr(tBu)-OH，Fmoc-Val-OH，反 应 条1
件和处理如实施例9中Tet(I)-GFF的合成。Tet(I)-VYGGGH NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.53(s,1H,COOH),9.11(s,1H),8.44(d,J=8.7Hz,1H),8.28–8.21(m,3H),8.17–
8.03(m,5H),7.75(dd,J=7.8,1.5Hz,1H),7.71–7.63(m,1H),7.41(d,J=8.1Hz,1H),7.23(m-,1H),7.06–6.99(m,2H),6.62–6.55(m,2H),6.00–5.86(m,1H,OCH2CHCH2),5.37–
5.10(m,2H,OCH2CHCH2),4.78–4.60(m,2H,OCH2CHCH2),4.54–
4.44(m,1H),4.30(t,J=8.4Hz,1H),3.81–3.71(m,6H),2.93(dd,J=13.9,4.8Hz,1H),2.73(dd,J=13.9,9.1Hz,1H),2.14–2.00(m,1H),0.89(d,J=6.7Hz,3H),0.84(d,J=6.6Hz,3H).+
HRMS(ESI)calcd.for C37H41N9O9Na778.2919[M+Na];found778.2913.
件和处理如实施例9中Tet(I)-GFF的合成。Tet(I)-VYGGGH NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.53(s,1H,COOH),9.11(s,1H),8.44(d,J=8.7Hz,1H),8.28–8.21(m,3H),8.17–
8.03(m,5H),7.75(dd,J=7.8,1.5Hz,1H),7.71–7.63(m,1H),7.41(d,J=8.1Hz,1H),7.23(m-,1H),7.06–6.99(m,2H),6.62–6.55(m,2H),6.00–5.86(m,1H,OCH2CHCH2),5.37–
5.10(m,2H,OCH2CHCH2),4.78–4.60(m,2H,OCH2CHCH2),4.54–
4.44(m,1H),4.30(t,J=8.4Hz,1H),3.81–3.71(m,6H),2.93(dd,J=13.9,4.8Hz,1H),2.73(dd,J=13.9,9.1Hz,1H),2.14–2.00(m,1H),0.89(d,J=6.7Hz,3H),0.84(d,J=6.6Hz,3H).+
HRMS(ESI)calcd.for C37H41N9O9Na778.2919[M+Na];found778.2913.
[0089] 实施例15：含有四氮唑的短肽Tet(I)-YGFGG的合成
[0090] 利用短肽固相合成的方法，将实施例9中的Fmoc保护的氨基酸依次替换为Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Tyr(tBu)-OH，反 应 条1
件和处理如实施例9中Tet(I)-GFF的合成。Tet(I)-YGFGGH NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.77(d,J=8.1Hz,1H),8.36(t,J=5.6Hz,1H),8.31(t,J=5.6Hz,1H),8.23(s,1H),8.20(s,1H),8.14–7.98(m,4H),7.74(dd,J=7.8,1.2Hz,1H),7.67(td,J=8.2,1.
4Hz,1H),7.40(d,J=8.4Hz,1H),7.28–7.10(m,7H),6.65(d,J=8.3Hz,2H),6.01–
5.87(m,1H,OCH2CHCH2),5.31–5.13(m,2H,OCH2CHCH2),4.74–4.52(m,4H),3.84–
3.60(m,6H),3.14–2.98(m,2H),2.94–2.76(m,2H).HRMS(ESI)calcd.for C41H41N9O9Na826.+
2919[M+Na];found826.2914.
件和处理如实施例9中Tet(I)-GFF的合成。Tet(I)-YGFGGH NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.77(d,J=8.1Hz,1H),8.36(t,J=5.6Hz,1H),8.31(t,J=5.6Hz,1H),8.23(s,1H),8.20(s,1H),8.14–7.98(m,4H),7.74(dd,J=7.8,1.2Hz,1H),7.67(td,J=8.2,1.
4Hz,1H),7.40(d,J=8.4Hz,1H),7.28–7.10(m,7H),6.65(d,J=8.3Hz,2H),6.01–
5.87(m,1H,OCH2CHCH2),5.31–5.13(m,2H,OCH2CHCH2),4.74–4.52(m,4H),3.84–
3.60(m,6H),3.14–2.98(m,2H),2.94–2.76(m,2H).HRMS(ESI)calcd.for C41H41N9O9Na826.+
2919[M+Na];found826.2914.
[0091] 实施例16：含有四氮唑的短肽Tet(I)-GFRGD的合成
[0092] 利用短肽固相合成的方法，将实施例9中的Fmoc保护的氨基酸依次替换为Fmoc-Asp（OtBu）-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Gly-OH，反应1
条件和处理如实施例9中Tet(I)-GFF的合成。Tet(I)-GFRGDH NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.65(br,2H,COOH),8.90(t,J=5.6Hz,1H),8.30–8.20(m,4H),8.15(d,J=8.2Hz,1H),8.10–
8.01(m,3H),7.74(dd,J=7.8,1.5Hz,1H),7.71–7.64(m,1H),7.49(t,J=5.6Hz,1-H),7.41(d,J=8.2Hz,1H),7.27–7.19(m,6H),5.99–5.87(m,1H,OCH2CHCH2),5.35–
5.10(m,2H,OCH2CHCH2),4.75–4.67(m,2H,OCH2CHCH2),4.63–4.50(m,2H),4.34–
4.26(m,1H),3.95(dd,J=16.4,6.0Hz,1H),3.85–3.73(m,3H),3.11(q,J=6.1Hz,2H),3.04(dd,J=13.8,4.0Hz,1H),2.82(dd,J=13.8,9.6Hz,1H),2.69(dd,J=16.7,5.8Hz,1H),2.60(dd,J=16.7,6.8Hz,1H),1.80–1.67(m,1H),1.64–1.44(m,3H).HRMS(ESI)calcd.for C40H46N12+
O10Na877.3352[M+Na];found877.3361.
条件和处理如实施例9中Tet(I)-GFF的合成。Tet(I)-GFRGDH NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.65(br,2H,COOH),8.90(t,J=5.6Hz,1H),8.30–8.20(m,4H),8.15(d,J=8.2Hz,1H),8.10–
8.01(m,3H),7.74(dd,J=7.8,1.5Hz,1H),7.71–7.64(m,1H),7.49(t,J=5.6Hz,1-H),7.41(d,J=8.2Hz,1H),7.27–7.19(m,6H),5.99–5.87(m,1H,OCH2CHCH2),5.35–
5.10(m,2H,OCH2CHCH2),4.75–4.67(m,2H,OCH2CHCH2),4.63–4.50(m,2H),4.34–
4.26(m,1H),3.95(dd,J=16.4,6.0Hz,1H),3.85–3.73(m,3H),3.11(q,J=6.1Hz,2H),3.04(dd,J=13.8,4.0Hz,1H),2.82(dd,J=13.8,9.6Hz,1H),2.69(dd,J=16.7,5.8Hz,1H),2.60(dd,J=16.7,6.8Hz,1H),1.80–1.67(m,1H),1.64–1.44(m,3H).HRMS(ESI)calcd.for C40H46N12+
O10Na877.3352[M+Na];found877.3361.
[0093] 实施例17：含有四氮唑的短肽Tet(II)-GFRGD的合成
[0094] 利用短肽固相合成的方法，将实施例9中的Fmoc保护的氨基酸依次替 换 为 Fmoc-Asp（OtBu）-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Gly-OH，同时 将四氮唑Tet(I)-OH替 换为5mmol Tet(II)-OH，反应条 件和
1
处 理 如 实 施 例9 中Tet(I)-GFF 的 合 成。Tet(II)-GFRGDH NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.75(s,1H,COOH),12.44(s,1H,COOH),10.37(s,1H),8.22(t,J=8.2Hz,
2H),8.19–8.10(m,3H),8.06–7.97(m,2H),7.74(d,J=2.0Hz,1H),7.67–
7.56(m,4H),7.48(s,1H),7.34(dd,J=8.7,2.0Hz,1H),7.27–7.16(m,6H),5.97–
5.86(m,1H,OCH2CHCH2),5.29–5.15(m,2H,OCH2CHCH2),4.64–
4.59(m,2H,OCH2CHCH2),4.59–4.50(m,2H),4.29(dd,J=13.5,7.
5Hz,1H),3.82–3.68(m,3H),3.60(dd,J=16.7,5.6Hz,1H),3.13–
2.98(m,3H),2.80(dd,J=13.8,9.6Hz,1H),2.72–2.51(m,6H),1.78–1.68(m,1H),1.60–+
1.44(m,3H).HRMS(ESI)calcd for C43H51N13O11Na948.3723[M+Na];found948.3743.[0095] 实施例18：含有四氮唑的短肽Tet(II)-GAGAS的合成
1
处 理 如 实 施 例9 中Tet(I)-GFF 的 合 成。Tet(II)-GFRGDH NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.75(s,1H,COOH),12.44(s,1H,COOH),10.37(s,1H),8.22(t,J=8.2Hz,
2H),8.19–8.10(m,3H),8.06–7.97(m,2H),7.74(d,J=2.0Hz,1H),7.67–
7.56(m,4H),7.48(s,1H),7.34(dd,J=8.7,2.0Hz,1H),7.27–7.16(m,6H),5.97–
5.86(m,1H,OCH2CHCH2),5.29–5.15(m,2H,OCH2CHCH2),4.64–
4.59(m,2H,OCH2CHCH2),4.59–4.50(m,2H),4.29(dd,J=13.5,7.
5Hz,1H),3.82–3.68(m,3H),3.60(dd,J=16.7,5.6Hz,1H),3.13–
2.98(m,3H),2.80(dd,J=13.8,9.6Hz,1H),2.72–2.51(m,6H),1.78–1.68(m,1H),1.60–+
1.44(m,3H).HRMS(ESI)calcd for C43H51N13O11Na948.3723[M+Na];found948.3743.[0095] 实施例18：含有四氮唑的短肽Tet(II)-GAGAS的合成
[0096] 利用短肽固相合成的方法，将实施例9中的Fmoc保护的氨基酸依次替换为Fmoc-Ser（tBu）-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Gly-OH，同时将四氮唑Tet(I)-OH替换为5mmol Tet(II)-OH，反应条件和处理如实施例9中Tet(I)-GFF的合1
成。TetII-GAGASHNMR(400MHz,DMSO)δ12.58(s,1H),10.37(s,1H),8.23-8.11(m,4H),8.0
7(d,J=7.0Hz,1H),8.06(d,J=7.9Hz,1H),7.86(d,J=7.7Hz,1H),7.75(d,J=2.0Hz,1H),7.64-7.54(m,4H),7.34(dd,J=8.7,2.0Hz,1H),6.00-5.85(m,1H),5.30-5.15(m,2H),4.97(s,1H),4.65-4.58(m,2H),4.45-4.35(m,1H),4.32-4.22(m,2H),3.77-3.60(m,6H),2.64(t,J=6.
9Hz,1H),2.54-2.51(m,2H),1.22(t,J=6.7Hz,6H).
成。TetII-GAGASHNMR(400MHz,DMSO)δ12.58(s,1H),10.37(s,1H),8.23-8.11(m,4H),8.0
7(d,J=7.0Hz,1H),8.06(d,J=7.9Hz,1H),7.86(d,J=7.7Hz,1H),7.75(d,J=2.0Hz,1H),7.64-7.54(m,4H),7.34(dd,J=8.7,2.0Hz,1H),6.00-5.85(m,1H),5.30-5.15(m,2H),4.97(s,1H),4.65-4.58(m,2H),4.45-4.35(m,1H),4.32-4.22(m,2H),3.77-3.60(m,6H),2.64(t,J=6.
9Hz,1H),2.54-2.51(m,2H),1.22(t,J=6.7Hz,6H).
[0097] 实施例19：含有四氮唑的短肽Tet(II)-VTEEI的合成
[0098] 利用短肽固相合成的方法，将实施例9中的Fmoc保护的氨基酸依次替换为Fmoc-Ile-OH，Fmoc-Glu（OtBu）-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Thr(tBu)-OH，Fmoc-Val-OH，同时将四氮唑Tet(I)-OH替换为5mmol Tet(II)-OH，反应条件和处理如实施例9中1
Tet(I)-GFF的合成。TetII-VTEEIH NMR(400MHz,DMSO)δ12.50(s,1H),12.11(s,2H),10.
34(s,1H),8.19-8.10(m,2H),8.05-7.91(m,3H),7.81(t,J=7.7Hz,2H),7.74(d,J=2.0Hz,1H),7.69-7.53(m,4H),7.35(dd,J=8.7,2.0Hz,1H),6.00-5.87(m,1H),5.31-5.16(m,2H),4.8
8(s,1H),4.62(dd,J=3.2,1.6Hz,2H),4.37-4.22(m,3H),4.20(dd,J=8.0,4.6Hz,1H),4.14(dd,J=8.1,5.8Hz,1H),4.01-3.93(m,1H),2.72-2.52(m,4H),2.29-2.16(m,4H),2.00(m,1H),1.95-1.83(m,2H),1.81-1.67(m,3H),1.45-1.35(m,1H),1.24-1.15(m,1H),1.03(d,J=6.3Hz,3H),0.92-0.80(m,12H).
Tet(I)-GFF的合成。TetII-VTEEIH NMR(400MHz,DMSO)δ12.50(s,1H),12.11(s,2H),10.
34(s,1H),8.19-8.10(m,2H),8.05-7.91(m,3H),7.81(t,J=7.7Hz,2H),7.74(d,J=2.0Hz,1H),7.69-7.53(m,4H),7.35(dd,J=8.7,2.0Hz,1H),6.00-5.87(m,1H),5.31-5.16(m,2H),4.8
8(s,1H),4.62(dd,J=3.2,1.6Hz,2H),4.37-4.22(m,3H),4.20(dd,J=8.0,4.6Hz,1H),4.14(dd,J=8.1,5.8Hz,1H),4.01-3.93(m,1H),2.72-2.52(m,4H),2.29-2.16(m,4H),2.00(m,1H),1.95-1.83(m,2H),1.81-1.67(m,3H),1.45-1.35(m,1H),1.24-1.15(m,1H),1.03(d,J=6.3Hz,3H),0.92-0.80(m,12H).
[0099] 实施例20：含有四氮唑的短肽Tet(II)-VYGGG的合成
[0100] 利用短肽固相合成的方法，将实施例9中的Fmoc保护的氨基酸依次替换为Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Tyr(tBu)-OH，Fmoc-Val-OH，同时将四氮唑Tet(I)-OH替换为5mmol Tet(II)-OH，反应条件和处理如实施例9中Tet(I)-GFF的合成。1
TetII-VYGGGHNMR(400MHz,DMSO)δ12.56(s,1H),9.14(s,1H),8.20-8.08(m,4H),8.03(t,J=5.8Hz,1H),7.97(d,J=8.0Hz,1H),7.92(d,J=8.5Hz,1H),7.73(d,J=2.0Hz,1H),7.66-7.5
4(m,4H),7.35(dd,J=8.7,2.0Hz,1H),7.02(d,J=8.5Hz,2H),6.63(d,J=8.5Hz,2H),5.96-5.
86(m,1H),5.29-5.15(m,2H),4.60(m,2H),4.47-4.39(m,1H),4.11(dd,J=8.3,6.9Hz,1H),3.80-3.64(m,6H),2.93(dd,J=14.0,4.8Hz,1H),2.75-2.54(m,4H),1.92(m,1H),0.77(t,J=6.3Hz,6H).
TetII-VYGGGHNMR(400MHz,DMSO)δ12.56(s,1H),9.14(s,1H),8.20-8.08(m,4H),8.03(t,J=5.8Hz,1H),7.97(d,J=8.0Hz,1H),7.92(d,J=8.5Hz,1H),7.73(d,J=2.0Hz,1H),7.66-7.5
4(m,4H),7.35(dd,J=8.7,2.0Hz,1H),7.02(d,J=8.5Hz,2H),6.63(d,J=8.5Hz,2H),5.96-5.
86(m,1H),5.29-5.15(m,2H),4.60(m,2H),4.47-4.39(m,1H),4.11(dd,J=8.3,6.9Hz,1H),3.80-3.64(m,6H),2.93(dd,J=14.0,4.8Hz,1H),2.75-2.54(m,4H),1.92(m,1H),0.77(t,J=6.3Hz,6H).
[0101] 实施例21：含有四氮唑的短肽Tet(II)-YGFGG的合成
[0102] 利用短肽固相合成的方法，将实施例9中的Fmoc保护的氨基酸依次替换为Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Tyr(tBu)-OH，同时将四氮唑Tet(I)-OH替换为5mmol Tet(II)-OH，反应条件和处理如实施例9中Tet(I)-GFF的合成。1
TetII-YGFGGHNMR(400MHz,DMSO)δ10.33(s,1H),9.14(s,1H),8.32(t,J=5.8Hz,1H),8.21-8.11(m,4H),8.11-8.02(m,2H),7.72(d,J=1.7Hz,1H),7.66-7.53(m,2H),7.33(dd,J=8.6,
1.7Hz,1H),7.28-7.21(m,4H),7.20-7.13(m,1H),7.06-7.00(m,2H),6.70-6.61(m,2H),5.9
8-5.86(m,1H),5.30-5.14(m,2H),4.60(m,2H),4.57-4.49(m,1H),4.42-4.33(m,1H),3.75-
3.50(m,6H),3.06(dd,J=13.8,4.4Hz,1H),2.90(dd,J=13.8,3.9Hz,1H),2.81(dd,J=13.7,9.6Hz,1H),2.65(dd,J=13.8,9.9Hz,1H),2.58-2.52(m,2H),2.48-2.36(m,2H).
TetII-YGFGGHNMR(400MHz,DMSO)δ10.33(s,1H),9.14(s,1H),8.32(t,J=5.8Hz,1H),8.21-8.11(m,4H),8.11-8.02(m,2H),7.72(d,J=1.7Hz,1H),7.66-7.53(m,2H),7.33(dd,J=8.6,
1.7Hz,1H),7.28-7.21(m,4H),7.20-7.13(m,1H),7.06-7.00(m,2H),6.70-6.61(m,2H),5.9
8-5.86(m,1H),5.30-5.14(m,2H),4.60(m,2H),4.57-4.49(m,1H),4.42-4.33(m,1H),3.75-
3.50(m,6H),3.06(dd,J=13.8,4.4Hz,1H),2.90(dd,J=13.8,3.9Hz,1H),2.81(dd,J=13.7,9.6Hz,1H),2.65(dd,J=13.8,9.9Hz,1H),2.58-2.52(m,2H),2.48-2.36(m,2H).
[0103] 实施例22：含有四氮唑的短肽Tet(III)-GA的合成
[0104] 利用短肽固相合成的方法，将实施例9中的Fmoc保护的氨基酸依次替换为Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Gly-OH，同时将四氮唑Tet(I)-OH替换为5mmol Tet(III)-OH，反1
应条件和处理如实施例9中Tet(I)-GFF的合成。Tet(III)-GA：Total Yield:43%.H NMR(300MHz,DMSO)δ8.91(t,J=5.7Hz,1H),8.31-8.30(m,3H),8.18-8.07(m,4H),7.70-7.6
13
0(m,3H),4.29-4.23(m,1H),4.04-3.88(m,2H),1.30(d,J=7.2Hz,3H); C NMR(75MHz,DMSO):174.0,168.5,165.7,163.9,136.1,136.0,130.3,130.1,128.9,128.4,126.5,120.0,47.5+ +
,42.3,17.3;MS(ESI)calcd.for C19H18N6O4=394.14，[M+H],found395.08,[2M+Na],found81
0.92.
应条件和处理如实施例9中Tet(I)-GFF的合成。Tet(III)-GA：Total Yield:43%.H NMR(300MHz,DMSO)δ8.91(t,J=5.7Hz,1H),8.31-8.30(m,3H),8.18-8.07(m,4H),7.70-7.6
13
0(m,3H),4.29-4.23(m,1H),4.04-3.88(m,2H),1.30(d,J=7.2Hz,3H); C NMR(75MHz,DMSO):174.0,168.5,165.7,163.9,136.1,136.0,130.3,130.1,128.9,128.4,126.5,120.0,47.5+ +
,42.3,17.3;MS(ESI)calcd.for C19H18N6O4=394.14，[M+H],found395.08,[2M+Na],found81
0.92.
[0105] 实施例23：含有四氮唑的短肽Tet(III)-GG的合成
[0106] 利用短肽固相合成的方法，将实施例9中的Fmoc保护的氨基酸依次替换为Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Gly-OH，同时将四氮唑Tet(I)-OH替换为5mmol Tet(III)-OH，反1
应条件和处理如实施例9中Tet(I)-GFF的合成。Tet(III)-GG:Total Yield:47%.H NMR(300MHz,DMSO)δ8.99(t,J=6.0Hz,1H),8.32-8.25(m,3H),8.18-8.11(m,4H),7.72-7.6
13
0(m,3H),3.97(d,J=6.3Hz,2H),3.81(d,J=5.7Hz,2H); C NMR(75MHz,DMSO):171.2,169.3,
165.8,163.9,136.1,136.0,130.4,130.2,128.9,128.5,126.5,120.0,42.5,40.7;MS(ESI)calcd.for C18H16N6O4=380.12,[2M–H]-,found759.42.
应条件和处理如实施例9中Tet(I)-GFF的合成。Tet(III)-GG:Total Yield:47%.H NMR(300MHz,DMSO)δ8.99(t,J=6.0Hz,1H),8.32-8.25(m,3H),8.18-8.11(m,4H),7.72-7.6
13
0(m,3H),3.97(d,J=6.3Hz,2H),3.81(d,J=5.7Hz,2H); C NMR(75MHz,DMSO):171.2,169.3,
165.8,163.9,136.1,136.0,130.4,130.2,128.9,128.5,126.5,120.0,42.5,40.7;MS(ESI)calcd.for C18H16N6O4=380.12,[2M–H]-,found759.42.
[0107] 实施例24：含有四氮唑的短肽Tet(III)-GF的合成
[0108] 利用短肽固相合成的方法，将实施例9中的Fmoc保护的氨基酸依次替换为Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Gly-OH，同时将四氮唑Tet(I)-OH替换为5mmol Tet(III)-OH，反应条1
件和处理如实施例9中Tet(I)-GFF的合成。Tet(III)-GF:Yield:36%.H NMR(300MHz,DMSO):8.89(t,J=5.7Hz,1H),8.30-8.09(m,7H),7.74-7.62(m,3H),7.29-7.20(m,5H),4.51-4.
13
44(m,1H),4.00-3.84(m,2H),3.10-2.88(m,2H); C NMR(75MHz,DMSO):172.8,168.8,165.7,163.9,137.4,136.1,136.0,130.3,130.2,129.2,128.9,128.4,128.2,126.6,126.5,120.-
0,53.5,42.3,36.8;MS(ESI)calcd.for C22H25N6O4=470.17,[2M–H],found939.42.[0109] 实施例25：含有四氮唑的短肽Tet(III)-AA的合成
件和处理如实施例9中Tet(I)-GFF的合成。Tet(III)-GF:Yield:36%.H NMR(300MHz,DMSO):8.89(t,J=5.7Hz,1H),8.30-8.09(m,7H),7.74-7.62(m,3H),7.29-7.20(m,5H),4.51-4.
13
44(m,1H),4.00-3.84(m,2H),3.10-2.88(m,2H); C NMR(75MHz,DMSO):172.8,168.8,165.7,163.9,137.4,136.1,136.0,130.3,130.2,129.2,128.9,128.4,128.2,126.6,126.5,120.-
0,53.5,42.3,36.8;MS(ESI)calcd.for C22H25N6O4=470.17,[2M–H],found939.42.[0109] 实施例25：含有四氮唑的短肽Tet(III)-AA的合成
[0110] 利用短肽固相合成的方法，将实施例9中的Fmoc保护的氨基酸依次替换为Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Ala-OH，同时将四氮唑Tet(I)-OH替换为5mmol Tet(III)-OH，反应条1
件和处理如实施例9中Tet(I)-GFF的合成。Tet(III)-AA:Yield:44%.H NMR(300MHz,DMSO)8.71(d,J=7.5Hz,1H),8.30-8.24(m,3H),8.18-8.11(m,4H),7.73-7.61(m,3H),4.62-4.5
13
2(m,1H),4.29-4.19(m,1H),1.38(d,J=6.9Hz,3H),1.31(d,J=7.2Hz,3H); C NMR(75MHz,DMSO):174.1,172.2,165.3,163.9,136.2,136.1,130.3,130.1,128.8,128.6,126.4,120.0,4-
8.8,47.6,17.9,17.2;MS(ESI)calcd.for C20H20N6O4=408.15,[2M–H],found815.25.[0111] 实施例26：含有四氮唑的短肽Tet(III)-AG的合成
件和处理如实施例9中Tet(I)-GFF的合成。Tet(III)-AA:Yield:44%.H NMR(300MHz,DMSO)8.71(d,J=7.5Hz,1H),8.30-8.24(m,3H),8.18-8.11(m,4H),7.73-7.61(m,3H),4.62-4.5
13
2(m,1H),4.29-4.19(m,1H),1.38(d,J=6.9Hz,3H),1.31(d,J=7.2Hz,3H); C NMR(75MHz,DMSO):174.1,172.2,165.3,163.9,136.2,136.1,130.3,130.1,128.8,128.6,126.4,120.0,4-
8.8,47.6,17.9,17.2;MS(ESI)calcd.for C20H20N6O4=408.15,[2M–H],found815.25.[0111] 实施例26：含有四氮唑的短肽Tet(III)-AG的合成
[0112] 利用短肽固相合成的方法，将实施例9中的Fmoc保护的氨基酸依次替换为Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Ala-OH，同时将四氮唑Tet(I)-OH替换为5mmol Tet(III)-OH，反应条1
件和处理如实施例9中Tet(I)-GFF的合成。Tet(III)-AG:Yield:48%H NMR(300MHz,DMSO)8.75(d,J=7.8Hz,1H),8.30-8.24(m,3H),8.17-8.10(m,4H),7.72-7.60(m,3H),4.64-4.5
13
4(m,1H),3.88-3.72(m,2H),1.39(d,J=7.2Hz,3H); C NMR(75MHz,DMSO):172.7,171.2,165.3,163.9,136.2,136.1,130.3,130.2,128.8,128.6,126.4,120.0,48.9,40.7,17.9;MS(ES-
I)calcd for C19H18N6O4=394.14,[2M–H],found787.25.
件和处理如实施例9中Tet(I)-GFF的合成。Tet(III)-AG:Yield:48%H NMR(300MHz,DMSO)8.75(d,J=7.8Hz,1H),8.30-8.24(m,3H),8.17-8.10(m,4H),7.72-7.60(m,3H),4.64-4.5
13
4(m,1H),3.88-3.72(m,2H),1.39(d,J=7.2Hz,3H); C NMR(75MHz,DMSO):172.7,171.2,165.3,163.9,136.2,136.1,130.3,130.2,128.8,128.6,126.4,120.0,48.9,40.7,17.9;MS(ES-
I)calcd for C19H18N6O4=394.14,[2M–H],found787.25.
[0113] 实施例27：含有四氮唑的短肽Tet(III)-AF的合成
[0114] 利用短肽固相合成的方法，将实施例9中的Fmoc保护的氨基酸依次替换为Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Ala-OH，同时将四氮唑Tet(I)-OH替换为5mmol Tet(III)-OH，反应条1
件和处理如实施例9中Tet(I)-GFF的合成。Tet(III)-AF Yield:45%H NMR(300MHz,DMSO)8.68(d,J=7.5Hz,1H),8.28(d,J=8.7Hz,2H),8.21-8.16(m,3H),8.11(d,J=8.4Hz,2H),7.7
4-7.62(m,3H),7.26-7.18(m,5H),4.61-4.52(m,1H),4.48-4.41(m,1H),3.11-2,91(m,2H),
13
1.33(d,J=7.2Hz,3H); C NMR(75MHz,DMSO):172.8,172.2,165.2,163.9,137.4,136.1,136.0,130.3,130.2,129.2,128.9,128.6,128.1,126.5,126.4,120.0,53.5,48.8,36.6,17.7;
-
MS(ESI)calcd for C26H24N6O4=484.19,[2M–H],found967.42.
件和处理如实施例9中Tet(I)-GFF的合成。Tet(III)-AF Yield:45%H NMR(300MHz,DMSO)8.68(d,J=7.5Hz,1H),8.28(d,J=8.7Hz,2H),8.21-8.16(m,3H),8.11(d,J=8.4Hz,2H),7.7
4-7.62(m,3H),7.26-7.18(m,5H),4.61-4.52(m,1H),4.48-4.41(m,1H),3.11-2,91(m,2H),
13
1.33(d,J=7.2Hz,3H); C NMR(75MHz,DMSO):172.8,172.2,165.2,163.9,137.4,136.1,136.0,130.3,130.2,129.2,128.9,128.6,128.1,126.5,126.4,120.0,53.5,48.8,36.6,17.7;
-
MS(ESI)calcd for C26H24N6O4=484.19,[2M–H],found967.42.
[0115] 实施例28：含有四氮唑的短肽Tet(III)-GABA-Gly的合成
[0116] 利用短肽固相合成的方法，将实施例9中的Fmoc保护的氨基酸依次替换为Fmoc-Gly-OH，Fmoc-GABA-OH，同时将四氮唑Tet(I)-OH替换为5mmol Tet(III)-OH，反1
应条件和处理如实施例9中Tet(I)-GFF的合成。Tet(III)-GABA-Gly Yield:54%H NMR(300MHz,DMSO)12.54(s,1H),8.869(t,J=5.7Hz,1H),8.27-8.16(m,5H),8.07(d,J=8.4Hz,2H),7.73-7.61(m,3H),3.75(d,J=6.0Hz,2H),3.34-3.28(m,2H),2.23(d,
13
J=7.5Hz,2H),1.79(m,2H); C NMR(75MHz,DMSO):172.3,171.4,165.4,163.9,136.6,
136.1,130.2,128.6,128.2,126.5,120.0,40.6,39.0,32.7,25.2;MS(ESI)calcd.for C20H20N6O4=408.15,found815.42.
应条件和处理如实施例9中Tet(I)-GFF的合成。Tet(III)-GABA-Gly Yield:54%H NMR(300MHz,DMSO)12.54(s,1H),8.869(t,J=5.7Hz,1H),8.27-8.16(m,5H),8.07(d,J=8.4Hz,2H),7.73-7.61(m,3H),3.75(d,J=6.0Hz,2H),3.34-3.28(m,2H),2.23(d,
13
J=7.5Hz,2H),1.79(m,2H); C NMR(75MHz,DMSO):172.3,171.4,165.4,163.9,136.6,
136.1,130.2,128.6,128.2,126.5,120.0,40.6,39.0,32.7,25.2;MS(ESI)calcd.for C20H20N6O4=408.15,found815.42.
[0117] 实施例29：含有四氮唑的短肽Tet(IV)-YIGSR的合成
[0118] 利用短肽固相合成的方法，将实施例9中的Fmoc保护的氨基酸依次替换为Fmoc-Arg（Pbf）-OH，Fmoc-Ser（tBu）-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Ile-OH，Fmoc-Tyr（tBu）-OH，同时将四氮唑Tet(I)-OH替换为5mmol Tet(IV)-OH，反应条件和处理如实施例9中+Tet(I)-GFF的合成。Tet(IV)-YIGSR：HRMS(ESI)calcd for C43H55N13O9Na920.4138[M+Na];
found920.4135.
found920.4135.
[0119] 实施例30：含有四氮唑的短肽Tet(IV)-AA的合成
[0120] 利用短肽固相合成的方法，将实施例9中的Fmoc保护的氨基酸依次替换为Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Ala-OH，同时将四氮唑Tet(I)-OH替换为5mmol Tet(IV)-OH，反应条件1
和处理如实施例9中Tet(I)-GFF的合成。Tet(IV)-AAH NMR(300MHz,DMSO)10.34(s,1H),
8.18-8.07(m,6H),7.89-7.86(m,2H),7.63-7.58(m,3H),4.38-4.28(m,1H),4.25-4.15(m,1
13
H),2.64-2.58(m,2H),2.49-2.46(m,2H),1.28(d,J=7.5Hz,3H),1.20(d,J=6.9Hz,3H); C NMR(75MHz,DMSO):173.9,172.1,171.1,170.9,164.3,140.9,130.9,130.8,129.3,126.6,12
6.5,120.6,119.7,47.7,47.4,31.6,29.9,18.1,17.1;
和处理如实施例9中Tet(I)-GFF的合成。Tet(IV)-AAH NMR(300MHz,DMSO)10.34(s,1H),
8.18-8.07(m,6H),7.89-7.86(m,2H),7.63-7.58(m,3H),4.38-4.28(m,1H),4.25-4.15(m,1
13
H),2.64-2.58(m,2H),2.49-2.46(m,2H),1.28(d,J=7.5Hz,3H),1.20(d,J=6.9Hz,3H); C NMR(75MHz,DMSO):173.9,172.1,171.1,170.9,164.3,140.9,130.9,130.8,129.3,126.6,12
6.5,120.6,119.7,47.7,47.4,31.6,29.9,18.1,17.1;
[0121] 实施例31：含有四氮唑的短肽Tet(IV)-GA的合成
[0122] 利用短肽固相合成的方法，将实施例9中的Fmoc保护的氨基酸依次替换为Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Gly-OH，同时将四氮唑Tet(I)-OH替换为5mmol Tet(IV)-OH，反应条件1
和处理如实施例9中Tet(I)-GFF的合成。Tet(IV)-GAH NMR(300MHz,DMSO)10.36(s,1H),
8.21-8.07(m,6H),7.91-7.86(m,2H),7.63-7.58(m,3H),4.28-4.18(m,1H),3.75-3.72(dd,
13
J1=5.7Hz,J2=1.8Hz,2H),2.67-2.63(m,2H),2.52-2.49(m,2H),1.27(d,J=7.2Hz,3H; C NMR(75MHz,DMSO):173.9,172.6,171.1,168.7,164.3,140.9,131.0,130.8,129.3,126.6,126.
5,120.6,119.7,47.4,41.8,31.6,30.0,17.2;
和处理如实施例9中Tet(I)-GFF的合成。Tet(IV)-GAH NMR(300MHz,DMSO)10.36(s,1H),
8.21-8.07(m,6H),7.91-7.86(m,2H),7.63-7.58(m,3H),4.28-4.18(m,1H),3.75-3.72(dd,
13
J1=5.7Hz,J2=1.8Hz,2H),2.67-2.63(m,2H),2.52-2.49(m,2H),1.27(d,J=7.2Hz,3H; C NMR(75MHz,DMSO):173.9,172.6,171.1,168.7,164.3,140.9,131.0,130.8,129.3,126.6,126.
5,120.6,119.7,47.4,41.8,31.6,30.0,17.2;
[0123] 实施例32：含有四氮唑的短肽Tet(IV)-GG的合成
[0124] 利用短肽固相合成的方法，将实施例9中的Fmoc保护的氨基酸依次替换为Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Gly-OH，同时将四氮唑Tet(I)-OH替换为5mmol Tet(IV)-OH，反应条件1
和处理如实施例9中Tet(I)-GFF的合成。Tet(IV)-GGH NMR(300MHz,DMSO)10.37(s,1H),
8.25(t,J=6.0Hz),8.18-8.07(m,5H),7.91-7.87(m,2H),7.64-7.58(m,3H),3.78-3.73(m,4
13
H),2.73-2.63(m,2H),2.54-2.51(m,2H); C NMR(75MHz,DMSO):171.9,171.2,171.1,169.4,164.3,140.9,131.0,130.8,129.3,126.6,126.5,120.6,119.7,41.9,40.6,31.6,30.0.[0125] 实施例33：含有四氮唑的短肽Tet(IV)-GF的合成
和处理如实施例9中Tet(I)-GFF的合成。Tet(IV)-GGH NMR(300MHz,DMSO)10.37(s,1H),
8.25(t,J=6.0Hz),8.18-8.07(m,5H),7.91-7.87(m,2H),7.64-7.58(m,3H),3.78-3.73(m,4
13
H),2.73-2.63(m,2H),2.54-2.51(m,2H); C NMR(75MHz,DMSO):171.9,171.2,171.1,169.4,164.3,140.9,131.0,130.8,129.3,126.6,126.5,120.6,119.7,41.9,40.6,31.6,30.0.[0125] 实施例33：含有四氮唑的短肽Tet(IV)-GF的合成
[0126] 利用短肽固相合成的方法，将实施例9中的Fmoc保护的氨基酸依次替换为Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Gly-OH，同时将四氮唑Tet(I)-OH替换为5mmol Tet(IV)-OH，反应条件1
和处理如实施例9中Tet(I)-GFF的合成。Tet(IV)-GFH NMR(300MHz,DMSO)10.36(s,1H),
8.18-8.06(m,6H),7.91-7.87(m,2H),7.63-7.58(m,3H),7.30-7.16(m,5H),4.48-4.41(m,1
13
H),3.79-3.61(m,2H),3.08-2.85(m,2H),2.66-2.62(m,2H),2.51-2.50(m,2H); C NMR(75MHz,DMSO):172.7,171.6,171.1,168.9,164.3,140.9,137.4,131.0,130.8,129.3,129.1,12
8.2,126.7,126.5,126.4,120.6,119.7,53.4,41.8,36.8,31.6,30.0.
和处理如实施例9中Tet(I)-GFF的合成。Tet(IV)-GFH NMR(300MHz,DMSO)10.36(s,1H),
8.18-8.06(m,6H),7.91-7.87(m,2H),7.63-7.58(m,3H),7.30-7.16(m,5H),4.48-4.41(m,1
13
H),3.79-3.61(m,2H),3.08-2.85(m,2H),2.66-2.62(m,2H),2.51-2.50(m,2H); C NMR(75MHz,DMSO):172.7,171.6,171.1,168.9,164.3,140.9,137.4,131.0,130.8,129.3,129.1,12
8.2,126.7,126.5,126.4,120.6,119.7,53.4,41.8,36.8,31.6,30.0.
[0127] 实施例34：含有四氮唑的短肽Tet(V)-GAGAS的合成
[0128] 利用短肽固相合成的方法，将实施例9中的Fmoc保护的氨基酸依次替换为Fmoc-Ser（tBu）-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Gly-OH，同时将四氮唑Tet(I)-OH替换为5mmol Tet(V)-OH，反应条件和处理如实施例9中Tet(I)-GFF的合成。+
Tet(V)-GAGAS：HRMS(ESI)calcd for C31H33N9O8Na682.2344[M+Na];found682.2345.[0129] 实施例35：含有四氮唑的短肽Tet(VI)-VYGGG的合成
Tet(V)-GAGAS：HRMS(ESI)calcd for C31H33N9O8Na682.2344[M+Na];found682.2345.[0129] 实施例35：含有四氮唑的短肽Tet(VI)-VYGGG的合成
[0130] 利用短肽固相合成的方法，将实施例9中的Fmoc保护的氨基酸依次替换为Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Tyr(tBu)-OH，Fmoc-Val-OH，同时将四氮唑Tet(I)-OH替换为5mmol Tet(VI)-OH，反应条件和处理如实施例9中Tet(I)-GFF的合成。+
Tet(VI)-VYGGG：HRMS(ESI)calcd for C32H39N11O10Na760.2744[M+Na];found760.2742.[0131] 实施例36：含有四氮唑的短肽Tet(VII)-GG的合成
Tet(VI)-VYGGG：HRMS(ESI)calcd for C32H39N11O10Na760.2744[M+Na];found760.2742.[0131] 实施例36：含有四氮唑的短肽Tet(VII)-GG的合成
[0132] 利用短肽固相合成的方法，将实施例9中的Fmoc保护的氨基酸依次替换为Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Gly-OH，同时将四氮唑Tet(I)-OH替换为5mmol Tet(VII)-OH，反应条1
件和处理如实施例9中Tet(I)-GFF的合成。Tet(VII)-GG：H NMR(300MHz,DMSO)12.48(s,
1H),δ8.69(t,J=6.0Hz,1H),8.21–8.01(m,5H),7.71(d,1H,J=7.1Hz),7.28(dd,1H,J=7.1,6.3Hz),7.13(d,1H,J=6.3Hz)，3.88(d,J=6.5Hz,2H),3.73(d,J=5.5Hz,2H)。
件和处理如实施例9中Tet(I)-GFF的合成。Tet(VII)-GG：H NMR(300MHz,DMSO)12.48(s,
1H),δ8.69(t,J=6.0Hz,1H),8.21–8.01(m,5H),7.71(d,1H,J=7.1Hz),7.28(dd,1H,J=7.1,6.3Hz),7.13(d,1H,J=6.3Hz)，3.88(d,J=6.5Hz,2H),3.73(d,J=5.5Hz,2H)。
[0133] 实施例37：含有四氮唑的短肽Tet(VIII)-GG的合成
[0134] 利用短肽固相合成的方法，将实施例9中的Fmoc保护的氨基酸依次替换为Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Gly-OH，同时将四氮唑Tet(I)-OH替换为5mmol Tet(VIII)-OH，反应条1
件和处理如实施例9中Tet(I)-GFF的合成。Tet(VIII)-GG：H NMR(300MHz,DMSO)δ8.99(t,J=6.0Hz,1H),8.32-8.25(m,1H),8.18–8.07(m,4H),3.97(d,J=6.3Hz,2H),3.81(d,J=5.
7Hz,2H)。
件和处理如实施例9中Tet(I)-GFF的合成。Tet(VIII)-GG：H NMR(300MHz,DMSO)δ8.99(t,J=6.0Hz,1H),8.32-8.25(m,1H),8.18–8.07(m,4H),3.97(d,J=6.3Hz,2H),3.81(d,J=5.
7Hz,2H)。
[0135] 实施例38：Tet(I)-GFF的光点击反应
[0136] Tet(I)-GFF在乙腈:水体积比=1:1的溶液中1mM浓度下，在8W302nm手提紫外灯的照射下，60s和120s光照时间下的光点击转换（图2：A）经过HPLC检测，120s时Tet(I)-GFF的转化即大于95%，HRMS(ESI)calcd.for Pyr(I)-GFF C37H35N5O6Na668.2480[M+Na]+,found668.2486。
[0137] 实施例39：Tet(IV)-YIGSR的光点击反应
[0138] Tet(IV)-YIGSR在乙腈：水体积比=1:1的溶液中1mM浓度下与丙烯酰胺（5mM），在8W302nm手提紫外灯的照射下，60s和120s光照时间下的光点击转换（图2：B）经过HPLC检测所示。120s时Tet(IV)-YIGSR的转化即大于95%,HRMS(ESI)calcd.for Pyr(IV)-YIGSR +
C46H60N12O10Na963.4448[M+Na],found963.4463。
C46H60N12O10Na963.4448[M+Na],found963.4463。
[0139] 实施例40：超分子水凝胶成胶因子的最低成胶浓度和对应的pH
[0140] 利用“invert-vial”的方法测试不同的超分子水凝胶成胶因子的最低成交浓度和对应的pH如图3所示。所形成的的水凝胶均能在室温下稳定存在6个月以上，起到了良好的保湿、储水的作用。
[0141] 实施例41:与四氮唑Tet(I)-OH连接的短肽光响应时间
[0142] 与四氮唑Tet(I)-OH连接的短肽的形成的水凝胶通过8W302nm手提紫外灯的照射使得水凝胶瓦解所需的时间用ttrans表示。
[0143] 表1.与四氮唑Tet(I)-OH连接的短肽的光响应时间
[0144]
[0145] 实施例42：Tet(I)-GFF在凝胶中的反应
[0146] 将1.5mg/mL的Tet(I)-GFF水凝胶置于1mm厚的石英比色皿中，用8W302nm手提紫外灯的照射不同的时间(0,10,60,120,300,600s)，经过HPLC监测，如图4所示，反应的转化率分别为0,3%,7%,14%,25%,44%。
[0147] 实施例43：Tet(I)-GFF水凝胶光照下发生凝胶向溶液的转变及微观结构的变化[0148] 将0.8mg/mL的Tet(I)-GFF水凝胶置于1mm厚的石英比色皿中，用8W302nm手提紫外灯的照射不同的时间(0,10,600s)，记录不同时间的凝胶的状态，10s时凝胶的荧光被打开，600s完全破换转换成溶液（图5）。
[0149] 实施例44：Tet(II)-GFRGD水凝胶光照下发生凝胶向溶液的转变
[0150] 将1.5mg/mL的Tet(II)-GFRGD水凝胶置于1mm厚的石英比色皿中，用8W302nm手提紫外灯的照射不同的时间(0,10,600s)，记录不同时间的凝胶的状态，10s时凝胶的状态没有明显改变，荧光打开，600s完全破换转换成溶液，如图6所示。
[0151] 实施例45：基于二取代四氮唑的超分子水凝胶的微观结构
[0152] 超分子水凝胶成胶因子Tet(I)-FF，Tet(I)-GAGAS，Tet(I)-VTEEI，Tet(I)-VYGGG，Tet(I)-YGFGG和Tet(I)-GFRGD形成的水凝胶的微观结构如图7所示，不同的水凝胶均形成了三维网状的纤维结构。
[0153] 实施例46：Tet(I)-GFF水凝胶机械性能及随光照的变化
[0154] 将100μL1.5mg/mL的Tet(I)-GFF水凝胶置于流变仪的样品台上，待凝胶稳定后，设定张力恒定为1%，对凝胶进行频率扫描，记录储能模量和耗能模量的值。结果显示，储能模量为耗能模量的8倍，且随频率变化很小，说明形成了机械性能优异的水凝胶（图8A）。对经过302nm手提紫外灯照射不同时间（10s,60s,120s,300s,600s）的样品进行储能模量和耗能模量的监测表明水凝胶的机械强度随光照时间的增加而不断减小（图8B-8F）。
[0155] 实施例47：Tet(II)-GFRGD细胞毒性的测试
[0156] 1.收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100μL,铺板使待测细胞调密度至5000孔，（边缘孔用无菌PBS填充）。
[0158] 3.5%CO2，37℃孵育1,2,3,5d，分别进行测试。
[0159] 4.每孔加入20μL MTT溶液（5mg/mL，即0.5%MTT），继续培养4h。
[0160] 5.终止培养，小心吸去孔内培养液。
[0161] 6.每孔加入150μL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。
[0162] 7.同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）得到不同浓度的Tet(II)-GFRGD存在下，不同的细胞C2C12及hMSC细胞在不同的培养时间下(1,2,3,5d)均有较高的细胞存活率(图9)，表明基于连有二取代四氮唑的短肽水凝胶具有较好的生物相容性。
[0163] 实施例48：Tet(I)-GFF和Tet(II)-GFRGD水凝胶的光蚀刻
[0164] 将0.8mg/mL的Tet(I)-GFF水凝胶置于2cm的培养皿中，使得水凝胶厚度为1.5mm，紫外光通过预先制备好的光掩模，光照30s，通过倒置荧光显微镜观察得到如图10A所示的图案，绿色的荧光为光点击后产物的荧光。对Tet(II)-GFRGD水凝胶进行同样的样品制备和观察得到图10B所示的图案。
[0165] 实施例49：Tet(I)-GFF水凝胶的用于信息的记录和读取
[0166] 将0.8mg/mL的Tet(I)-GFF水凝胶置于2cm的培养皿中，使得水凝胶厚度为1.5mm，紫外光通过预先制备好的光掩模，光照30s，实现了将信息“NJU”记录在水凝胶上，通过倒置荧光显微镜观察读取信息，得到绿色的“NJU”的图案，绿色的荧光为光点击后产物的荧光（图11）。
[0167] 实施例50：hMSC细胞在Tet(I)-GFF水凝胶的三维培养
[0168] 将含有2*106mL-1hMSC细胞的1.5mg/mL的Tet(I)-GFF水凝胶置于2cm的培养皿中，使得水凝胶厚度为1.5mm，待水凝胶稳定后，在水凝胶上方加入2mL含有10%wt胎牛血清的细胞培养基，培养24h后，吸去培养基，PBS洗涤水凝胶后，对细胞进行钙黄素染色，利用激光共聚焦进行观察（图12）。
[0169] 实施例51：Tet(I)-GFF水凝胶用于生物分子的释放及调控C2C12细胞的分化[0170] 将1mL两份的含有3%wt马血清和一份不含有3%wt马血清的1.5mg/mL的Tet(I)-GFF(1.5mg/mL)水凝胶分别置于6孔中，每个样品三个副孔，待水凝胶稳定后，对其中一份含有3%wt马血清和一份不含有3%wt马血清的水凝胶用8W302nm紫外灯进行光照
2min，将含有C2C12细胞的培养基置于水凝胶上方，培养48h后进行荧光染色及C2C12细胞分化标志物表达含量的检测。
2min，将含有C2C12细胞的培养基置于水凝胶上方，培养48h后进行荧光染色及C2C12细胞分化标志物表达含量的检测。
[0171] C2C12细胞的染色。在Tet(I)-GFF水凝胶上的C2C12细胞用4%wt的多聚甲醛(PFA)固定15min,0.3%wt Triton-X100-PBS室温下处理1h，接着用5%wt的牛血清白蛋白(BSA)处理1h。之后细胞用一抗rabbit polyclonal anti-MyoD antibody(Santa Cruz,1:50in2%BSA)在37℃下培育1.5h，用PBS洗三次，接着用二抗Cy3-labeled Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)(Beyotime Institue of Biotechnology,1:500in2%BSA)在37℃培育1h。PBS洗三次后，用激光共聚焦进行观察（图13）。
[0172] 实施例52：Tet(I)-GFF和Tet(II)-GFRGD水凝胶用于hMSC细胞的三维培养及通过不同的光照时间调控细胞的行为。
[0173] hMSC细胞在Tet(I)-GFF水凝胶(1.5mg/mL)和Tet(II)-GFRGD水凝胶(2.5mg/mL)的三维培养与实施例50类似。将hMSC细胞培育在不经过和经过8W302nm手提紫外灯照射2min的Tet(I)-GFF和Tet(II)-GFRGD水凝胶中的36h后用TRITC-phalloidin（Invitrogen）对细胞进行染色，通过激光共聚焦显微镜进行观察，发现光照光照后的hMSC细胞有伸展的倾向，而Tet(II)-GFRGD水凝胶中后的hMSC细胞呈细长型，伸展更加明显，说明细胞对于三维微环境的改变做出了响应（图14）。
[0174] 实施例53：Tet(II)-GFRGD水凝胶在不同的培养时间及有无光照下对三维培养在水凝胶中的hMSC细胞的影响。
[0175] hMSC细胞在Tet(II)-GFRGD水凝胶(2.5mg/mL)的三维培养与实施例50类似。hMSC细胞在不经过和经过8W302nm手提紫外灯照射120s后的Tet(II)-GFRGD水凝胶中培育不同时间（36h，72h，108h）的形态如图15所示。光照后的hMSC细胞呈伸展状态，而光照前的hMSC细胞保持圆形，说明光照对细胞的微环境的改变促使了细胞的行为的改变。
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