在体内外使用的偶联识别/检测系统
阅读：110发布：2020-12-29
专利汇可以提供在体内外使用的偶联识别/检测系统专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种新型 荧光 团，以及其与称作“适体”的新型核酸分子的组合应用，该适体能够特异性地结合荧光团，从而当荧光团暴露于适宜 波长 的射线下时可以使荧光 信号 增强。本发明还提供了新型荧光团、新型核酸分子以及它们的靶分子所形成分子复合物，以及将多价适体构建体作为目标靶分子的荧光感应器的应用。，下面是在体内外使用的偶联识别/检测系统专利的具体信息内容。
1.一种具有通式(I)结构的化合物：
其中，
Q为S或者O，
Y为O或者N，
Z为N或者，
Ar为芳环或者芳杂环系统，其包含一个或者两个环；
当Y为N时，R1代表C1-8的烃基或者-(CH2)n-R6，其中n为大于或等于1的整数；
R2为甲基，一卤代、二卤代或者三卤代甲基，肟基，邻甲基肟基，亚胺基，最多带有三个(R7-R9)取代基的取代的苯基或者未被取代的苯基，C2-8不饱和烃基，该C2-8不饱和烃基的末端可以可选地被以下基团取代：氨基、酰胺、羧酸、(甲基)丙烯酸酯、酯、烯酮、肟、邻甲基肟基、亚胺、硝基甲烷、腈、酮、一卤、二卤、三卤、硝基、氰基、丙烯腈、丙烯腈-烯酮、丙烯腈-羧酸酯、丙烯腈-酰胺、或者第二个芳环或者芳杂环；
R3-R5分别独立地选自氢、羟基、烷基、烷氧基、氟、氯、溴、氨基、烷氨基、二烷氨基、硫烷基、氰基、巯基、硝基、一卤代、二卤代或者三卤代甲基、酮和羧酸；
R6为氢、表面活性基团、固相表面、或者是可以与表面活性基团或者固相表面相连接的官能团；
R7-R9分别独立地选自氢、羟基、烷基、烷氧基、氟、氯、溴、氨基、烷氨基、二烷氨基、硫烷基、氰基、巯基、硝基、一卤代、二卤代或者三卤代甲基、酮和羧酸；
以及它们的盐；
其中，(i)R3-R5不同时为氢；(ii)R1和R2为甲基，R4和R5为氢时，R3不为羟基、甲氧基和二甲基氨基；以及(iii)R1为甲基，R4和R5为氢，R3为羟基时，R2不为共轭烃链。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中，Ar为苯基、萘基、吡啶基、嘧啶基、吡咯基、呋喃基、苯并呋喃基、噻吩基、苯并噻吩基、噻唑基、苯并噻唑基、咪唑基、苯并咪唑基、恶唑基、苯并恶唑基、嘌呤基、吲哚基、喹啉基、色酮基或者香豆素基。
3.根据权利要求1所述的化合物，其中，Z和Y为氮，Q为氧。
4.根据权利要求1所述的化合物，其中，Ar为苯基，Q为氧，Z和Y为氮。
5.根据权利要求4所述的化合物，其中，R1为甲基、乙基或者(CH2)n-R6，R2为甲基，R3为
3-甲氧基，R4为4-羟基，R5为5-甲氧基。
6.根据权利要求4所述的化合物，其中，R1为甲基、乙基或者(CH2)n-R6，R2为苯基，R3为
3-甲氧基，R4为4-羟基，R5为5-甲氧基。
7.根据权利要求4所述的化合物，其中，R1为甲基，R2为甲基，R3为3-甲氧基，R4为
4-甲氧基，R5为5-甲氧基。
8.根据权利要求4所述的化合物，其中，R3为3-氟、3-氯或者3-溴，R4为4-羟基，R5为5-氟、5-氯或者5-溴。
9.根据权利要求8所述的化合物，其中，R1为甲基、乙基或者(CH2)n-NH2，R2为甲基。
10.根据权利要求8所述的化合物，其中，R1为甲基、乙基或者(CH2)n-NH2，R2为肟基或者邻甲基肟基。
11.根据权利要求4所述的化合物，其中，R2为肟基或者邻甲基肟基。
12.根据权利要求4所述的化合物，其中，R1为甲基，R2为甲基，R3为2-羟基，R4为4-二甲基氨基，R5为氢。
13.根据权利要求4所述的化合物，其中，R1为乙基，R2为三氟甲基，R3为3-甲氧基，R4为4-羟基，R5为5-甲氧基。
14.根据权利要求4所述的化合物，其中，R1为乙基，R2为丙-1-烯基，R3为3-甲氧基，R4为4-羟基，R5为5-甲氧基。
15.一种含有第一结构域的核酸分子，该结构域特异性地结合荧光团，所述荧光团含有位于取代的芳环系统和取代的咪唑啉(硫)酮、恶唑(硫)酮、吡咯啉(硫)酮或呋喃(硫)酮环之间的次甲基桥，其中，核酸分子与荧光团结合可以实质性地提高荧光团在适宜波长射线下的荧光。
16.根据权利要求15所述的核酸分子，其中，荧光团包含通式(I)所示结构的化合物：
其特征在于，
Q为S或者O，
Y为O或者N，
Z为N或者C(H)，
Ar为芳环或者芳杂环系统，其包含一个或者两个环；
当Y为N时，R1代表C1-8的烃基或者-(CH2)n-R6，其中n为大于或等于1的整数；
R2为甲基，一卤代、二卤代或者三卤代甲基，肟基，邻甲基肟基，亚胺基，最多带有三个(R7-R9)取代基的取代的苯基或者未被取代的苯基，C2-8不饱和烃基，该C2-8不饱和烃基的末端可以可选地被以下基团取代：氨基、酰胺、羧酸、(甲基)丙烯酸酯、酯、烯酮、肟、邻甲基肟基、亚胺、硝基甲烷、腈、酮、一卤、二卤、三卤、硝基、氰基、丙烯腈、丙烯腈-烯酮、丙烯腈-羧酸酯、丙烯腈-酰胺、或者第二个芳环或者芳杂环；
R3-R5分别独立地选自氢、羟基、烷基、烷氧基、氟、氯、溴、氨基、烷氨基、二烷氨基、硫烷基、氰基、巯基、硝基、一卤代、二卤代或者三卤代甲基、酮和羧酸；
R6为氢、表面活性基团、固相表面、或者是可以与表面活性基团或者固相表面相连接的官能团；
R7-R9分别独立地选自氢、羟基、烷基、烷氧基、氟、氯、溴、氨基、烷氨基、二烷氨基、硫烷基、氰基、巯基、硝基、一卤代、二卤代或者三卤代甲基、酮和羧酸；
以及它们的盐。
17.根据权利要求16所述的核酸分子，其中，荧光团为取代的苯亚甲基咪唑酮或者取代的吲哚(亚甲基)咪唑酮。
18.根据权利要求15所述的核酸分子，其中，第一结构域包含选自由SEQ ID NOS：1-30组成的组中的核苷酸序列。
19.根据权利要求15所述的核酸分子，其进一步包含一个或者多个其它特异性地结合荧光团的第一结构域。
20.根据权利要求15所述的核酸分子，其中，核酸分子与荧光团的结合是离子依赖性的。
21.根据权利要求20所述的核酸分子，其中，所述离子为一价或者二价离子。
22.根据权利要求15所述的核酸分子，其中，核酸分子与荧光团的结合是温度依赖性的。
23.根据权利要求15所述的核酸分子，其中，核酸分子与荧光团的结合是pH依赖性的。
24.根据权利要求15所述的核酸分子，其进一步包含第二结构域，该第二结构域特异性地结合与荧光团不同的靶标分子。
25.根据权利要求24所述的核酸分子，其中，所述核酸分子包含多个第一结构域，每个第一结构域均与荧光团结合。
26.根据权利要求24所述的核酸分子，其中，所述核酸分子包含多个第一和第二结构域的多联体。
27.根据权利要求24所述的核酸分子，其中，只有在第二结构域与靶标分子结合后，第一结构域才与化合物结合。
28.根据权利要求27所述的核酸分子，其中，所述核酸分子包含SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32，或者SEQ ID NO：33所示的核苷酸序列。
29.根据权利要求18所述的核酸分子，其中，靶标分子选自以下组成的组：ATP、cGMP、生物素、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。
30.根据权利要求18所述的核酸分子，其中，所述靶标分子选自以下组成的组：蛋白质、核酸、脂质、糖类、激素、细胞因子、趋化因子、代谢产物、有机分子，和金属离子。
31.根据权利要求15-17、19-27、29和30中任意一项所述的核酸分子，其中，所述核酸分子包含RNA。
32.根据权利要求15-17、19-27、29和30中任意一项所述的核酸分子，其中，所述核酸分子包含DNA或者修饰的核酸。
33.根据权利要求15所述的核酸分子，其进一步包含：
含有随机的核苷酸序列的第二结构域，其中，第二结构域与靶标分子的特异性结合使得第一结构域形成一种结构，该结构可以使第一结构域特异性地结合荧光团。
34.一种文库，其包含多个权利要求33所述的核酸分子。
35.一种试剂盒，其包含：
荧光团，其包含有位于取代的芳环系统和取代的咪唑啉(硫)酮、恶唑(硫)酮、吡咯啉(硫)酮或呋喃(硫)酮环之间的次甲基桥；和
多个权利要求15所述的核酸分子，所述多个核酸分子中的每一个核酸分当与荧光团结合后，可以引起荧光团不同的荧光发射情况。
36.根据权利要求35所述的试剂盒，其中，所述荧光团为4-(3，5-二甲氧基-4-羟基-苯亚甲基)-1，2-二甲基-咪唑-5-酮。
37.根据权利要求35所述的试剂盒，其中，所述多个核酸分子包含两个或者两个以上如下化合物：4-(3，4，5-三甲氧基苯亚甲基)-1，2-二甲基-咪唑-5-酮；4-(4-羟基-3，
5-二甲氧基苯亚甲基)-1，2-二甲基-咪唑-5-酮；4-(3，5-二氟-4-羟基苯亚甲基)-1，
2-二甲基-咪唑-5-酮；4-(3，5-二氟-4-羟基-苯亚甲基)-1-甲基-2-邻甲基肟基-咪唑啉-5-酮；4-(3，5-二氯-4-羟基苯亚甲基)-1，2-二甲基-咪唑-5-酮；4-(3，5-二溴-4-羟基苯亚甲基)-1，2-二甲基-咪唑-5-酮；4-(2-羟基苯亚甲基)-1，2-二甲基-咪唑-5-酮；4-(2-甲氧基苯亚甲基)-1，2-二甲基-咪唑-5-酮；4-(3-氟-4-羟基-5-甲氧基苯亚甲基)-1，2-二甲基-咪唑-5-酮；4-(4-二甲胺苯亚甲基)-1，2-二甲基-咪唑-5-酮；
4-(4-叔丁基硫苯亚甲基)-1，2-二甲基-咪唑-5-酮；4-(4-甲硫基苯亚甲基)-1，2-二甲基-咪唑-5-酮；4-(4-氰基苯亚甲基)-1，2-二甲基-咪唑-5-酮；4-(3，5-二氟-4-乙酸)苯亚甲基-1，2-二甲基-咪唑-5-酮；4-(4-羟基-3-硝基苯亚甲基)-1，2-二甲基-咪唑-5-酮；4-(4-羟基-3-甲氧基-5-硝基苯亚甲基)-1，2-二甲基-咪唑-5-酮；4-(4-甲氧基-3-硝基苯亚甲基)-1，2-二甲基-咪唑-5-酮；4-(4-溴苯亚甲基)-1，2-二甲基-咪唑-5-酮；4-(4-氯苯亚甲基)-1，2-二甲基-咪唑-5-酮；4-(4-羟基苯亚甲基)-1，2-二甲基-咪唑-5-酮；4-((吲哚-7-基)亚甲基)-1，2-二甲基-咪唑-5-酮；4-((吲哚-3-基)亚甲基)-1，2-二甲基-咪唑-5-酮；4-((吲哚-3-基)亚甲基)-1-甲基-2-苯基-咪唑-5-酮；4-(4-羟基-3，5-二甲氧基苯亚甲基)-1-甲基-2-苯基-咪唑-5-酮；4-(4-二甲胺苯亚甲基)-1-甲基-2-苯基-咪唑-5-酮；4-(4-羟基苯亚甲基)-2-乙酰基-1-甲基-咪唑-5-酮；4-(4-羟基苯亚甲基)-1-甲基-2-丙-1-烯基-咪唑-5-酮；3-(4-(4-羟基苯亚甲基)-4，5-二氢-1-甲基-5-氧代-咪唑-2-基)丙烯酰胺；3-(4-(4-羟基苯亚甲基)-4，5-二氢-1-甲基-5-氧代-咪唑-2-基)丙烯酸；以及甲基3-(4-(4-羟基苯亚甲基)-4，5-二氢-1-甲基-5-氧代-咪唑-2-基)丙烯酸酯。
38.根据权利要求35所述的试剂盒，其中，所述的多个核苷酸分子以矩阵形式固定在底物上。
39.根据权利要求35所述的试剂盒，其中，所述的底物为TIRF流式细胞仪中的底物。
40.根据权利要求35所述的试剂盒，其中，所述的多个核酸分子以两个或两个以上核酸分子的混合物形式存在。
41.一种试剂盒，其包含：
多个荧光团，所述荧光团含有位于取代的芳环系统和取代的咪唑啉(硫)酮、恶唑(硫)酮、吡咯啉(硫)酮或呋喃(硫)酮环之间的次甲基桥；和
多个权利要求15所述的核酸分子，
其中，所述多个核酸分子中的每一个核酸分子均与所述多个荧光团中的至少一个荧光团相结合。
42.根据权利要求41所述的试剂盒，其中，所述多个荧光团包含两个或两个以上所述的多个核酸分子，该多个核酸分子包含两个或者两个以上如下化合物：4-(3，4，5-三甲氧基苯亚甲基)-1，2-二甲基-咪唑-5-酮；4-(4-羟基-3，5-二甲氧基苯亚甲基)-1，
2-二甲基-咪唑-5-酮；4-(3，5-二氟-4-羟基苯亚甲基)-1，2-二甲基-咪唑-5-酮；
4-(3，5-二氟-4-羟基-苯亚甲基)-1-甲基-2-邻甲基肟基-咪唑啉-5-酮；4-(3，5-二氯-4-羟基苯亚甲基)-1，2-二甲基-咪唑-5-酮；4-(3，5-二溴-4-羟基苯亚甲基)-1，
2-二甲基-咪唑-5-酮；4-(2-羟基苯亚甲基)-1，2-二甲基-咪唑-5-酮；4-(2-甲氧基苯亚甲基)-1，2-二甲基-咪唑-5-酮；4-(3-氟-4-羟基-5-甲氧基苯亚甲基)-1，2-二甲基-咪唑-5-酮；4-(4-二甲胺苯亚甲基)-1，2-二甲基-咪唑-5-酮；4-(4-叔丁基硫苯亚甲基)-1，2-二甲基-咪唑-5-酮；4-(4-甲硫基苯亚甲基)-1，2-二甲基-咪唑-5-酮；
4-(4-氰基苯亚甲基)-1，2-二甲基-咪唑-5-酮；4-(3，5-二氟-4-乙酸)苯亚甲基-1，
2-二甲基-咪唑-5-酮；4-(4-羟基-3-硝基苯亚甲基)-1，2-二甲基-咪唑-5-酮；4-(4-羟基-3-甲氧基-5-硝基苯亚甲基)-1，2-二甲基-咪唑-5-酮；4-(4-甲氧基-3-硝基苯亚甲基)-1，2-二甲基-咪唑-5-酮；4-(4-溴苯亚甲基)-1，2-二甲基-咪唑-5-酮；4-(4-氯苯亚甲基)-1，2-二甲基-咪唑-5-酮；4-(4-羟基苯亚甲基)-1，2-二甲基-咪唑-5-酮(“p-HBT”)；4-((吲哚-7-基)亚甲基)-1，2-二甲基-咪唑-5-酮；4-((吲哚-3-基)亚甲基)-1，2-二甲基-咪唑-5-酮；4-((吲哚-3-基)亚甲基)-1-甲基-2-苯基-咪唑-5-酮；4-(4-羟基-3，5-二甲氧基苯亚甲基)-1-甲基-2-苯基-咪唑-5-酮；4-(4-二甲胺苯亚甲基)-1-甲基-2-苯基-咪唑-5-酮；4-(4-羟基苯亚甲基)-2-乙酰基-1-甲基-咪唑-5-酮；4-(4-羟基苯亚甲基)-1-甲基-2-丙-1-烯基-咪唑-5-酮；3-(4-(4-羟基苯亚甲基)-4，5-二氢-1-甲基-5-氧代-咪唑-2-基)丙烯酰胺；3-(4-(4-羟基苯亚甲基)-4，5-二氢-1-甲基-5-氧代-咪唑-2-基)丙烯酸；以及甲基3-(4-(4-羟基苯亚甲基)-4，5-二氢-1-甲基-5-氧代-咪唑-2-基)丙烯酸酯。
43.根据权利要求41所述的试剂盒，其中，所述的多个核苷分子以矩阵形式固定在底物上。
44.根据权利要求41所述的试剂盒，其中，所述的底物为TIRF流式细胞仪中的底物。
45.根据权利要求41所述的试剂盒，其中，所述的多个核酸分子以两个或两个以上核酸分子的混合物形式存在。
46.根据权利要求41或者45所述的试剂盒，其中，所述的多个荧光团以两个或两个以上荧光团的混合物形式存在。
47.一种分子复合物，其包含：
荧光团，其包含位于取代的芳环系统和取代的咪唑啉(硫)酮、恶唑(硫)酮、吡咯啉(硫)酮或呋喃(硫)酮环之间的次甲基桥；和
权利要求15所述的核酸分子，该核酸分子特异性地结合荧光团，其中，跟荧光团特异性结合核酸分子之前相比，荧光团特异性地结合核酸分子后，其在适宜波长射线下的荧光得到了实质性地提高。
48.根据权利要求47所述的分子复合物，其中，荧光团包含通式(I)所示结构的化合物：
其中，
Q为S或者O，
Y为O或者N，
Z为N或者C(H)，
Ar为芳环或者芳杂环系统，其包含一个或者两个环；
当Y为N时，R1代表C1-8的烃基或者-(CH2)n-R6，其中n为大于或等于1的整数；
R2为甲基，一卤代、二卤代或者三卤代甲基，肟基，邻甲基肟基，亚胺基，最多带有三个(R7-R9)取代基的取代的苯基或者未被取代的苯基，C2-8的不饱和烃基，该C2-8的不饱和烃基的末端可以可选地被以下基团取代：氨基、酰胺、羧酸、(甲基)丙烯酸酯、酯、烯酮、肟、邻甲基肟基、亚胺、硝基甲烷、腈、酮、一卤、二卤、三卤、硝基、氰基、丙烯腈、丙烯腈-烯酮、丙烯腈-羧酸盐、丙烯腈-酰胺、或者第二个芳环或者芳杂环；
R3-R5分别独立地选自氢、羟基、烷基、烷氧基、氟、氯、溴、氨基、烷氨基、二烷氨基、硫烷基、氰基、巯基、硝基、一卤代、二卤代或者三卤代甲基、酮和羧酸；
R6为氢、表面活性基团、固相表面、或者是可以与表面活性基团或者固相表面相连接的官能团；
R7-R9分别独立地选自氢、羟基、烷基、烷氧基、氟、氯、溴、氨基、烷氨基、二烷氨基、硫烷基、氰基、巯基、硝基、一卤代、二卤代或者三卤代甲基、酮和羧酸；
以及它们的盐。
49.根据权利要求47所述的分子复合物，其中，R1为甲基、乙基或者(CH2)n-R6，R2为甲基，R3为3-甲氧基，R4为4-羟基，R5为5-甲氧基；并且，所述核酸分子选自SEQ ID NOS：
1-15组成的组。
50.根据权利要求47所述的分子复合物，其中，R1为甲基、乙基或者(CH2)n-R6，R2为甲基，R3为3-卤代，R4为4-羟基，R5为5-卤代，其中卤代基团为氟、氯或者溴；并且所述核酸分子选自SEQ ID NOS：16-19组成的组。
51.根据权利要求47所述的分子复合物，其中，R1为甲基或者(CH2)n-R6，R2为甲基，R3为2-羟基，R4和R5为氢；并且所述核酸分子选自SEQ ID NOS：20-23组成的组。
52.根据权利要求47所述的分子复合物，其中，R1为甲基或者(CH2)n-R6，R2为甲基，R3为2-羟基，R4为4-二甲胺基，R5为氢；并且所述核酸分子选自SEQ ID NOS：24-30组成的组。
53.根据权利要求47所述的分子复合物，其中，所述核酸分子包含RNA。
54.根据权利要求47所述的分子复合物，其中，所述核酸分子包含DNA或者修饰的核酸。
55.根据权利要求47所述的分子复合物，其中，所述核酸分子包含多个可以结合荧光团的第一结构域。
56.根据权利要求47所述的分子复合物，其中，所述核酸分子进一步包含第二结构域，该第二结构域特异性地结合与荧光团不同的靶标分子。
57.根据权利要求56所述的分子复合物，其中，所述核酸分子包含多个第一结构域，每一个第一结构域均与荧光团结合。
58.根据权利要求56所述的分子复合物，其中，所述核酸分子包含多个第一和第二结构域的多联体。
59.根据权利要求56所述的分子复合物，其中，所述核酸分子包含SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32，或者SEQ ID NO：33所示的核苷酸序列。
60.根据权利要求56所述的分子复合物，其中，只有在第二结构域与靶标分子结合后，第一结构域才与荧光团结合，所述分子复合物进一步包含与第二结构域结合的靶标分子。
61.根据权利要求60所述的分子复合物，其中，靶标分子选自由以下组成的组：ATP、cGMP、生物素、和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。
62.根据权利要求60所述的分子复合物，其中，靶标分子选自由以下组成的组：蛋白质、核酸、脂质、糖类、激素、细胞因子、趋化因子、代谢产物、有机分子，和金属离子。
63.一种宿主细胞，其含有权利要求47-62任一项所述的分子复合物。
64.根据权利要求63所述的宿主细胞，其中，所述细胞为离体的。
65.根据权利要求63所述的宿主细胞，其中，所述细胞为体内的。
66.一种构建的DNA分子，其包含编码权利要求31所述RNA分子的第一区域。
67.根据权利要求66所述的构建的DNA分子，其进一步包含启动子，该启动子被可操纵地连接到所述第一区域以调控RNA分子的表达。
68.根据权利要求66所述的构建的DNA分子，其中，所述启动子为组成型启动子。
69.根据权利要求66所述的构建的DNA分子，其中，所述启动子为诱导型启动子。
70.根据权利要求66所述的构建的DNA分子，其进一步包含位于第一区域内的内含子，从构建的DNA分子的转录子中切除出内含子得到RNA分子。
71.根据权利要求66所述的构建的DNA分子，进一步包含与第一区域相连的第二区域，该第二区域编码目标RNA转录子，转录构建的DNA分子可以形成RNA分子，该RNA分子包括目标RNA转录子，该RNA转录子与RNA分子相连接并可以特异性地结合荧光团。
72.一种包含表达载体的表达系统，其中该表达载体中插入了权利要求66-71中任意一项所述的DNA分子。
73.根据权利要求72所述的表达系统，其中，该表达系统为质粒或者感染转化载体。
74.一种转基因宿主细胞，其包含权利要求72所述的表达系统。
75.根据权利要求74所述的转基因宿主细胞，其中，所述宿主细胞为离体的。
76.根据权利要求74所述的转基因宿主细胞，其中，所述宿主细胞为体内的。
77.一种基因构建体，其包含启动子序列和第二DNA序列，其中，所述启动子序列被可操纵地连接到编码权利要求30所述RNA分子的第一DNA序列，所述第二DNA序列含有一个或者多个酶切位点。
78.根据权利要求77所述的基因构建体，其中，所述RNA分子包含多个第一结构域。
79.根据权利要求77所述的基因构建体，其中，所述第二DNA序列包含两个或两个以上的酶切位点。
80.根据权利要求77所述的基因构建体，其中，所述第二DNA序列位于启动子序列和第一DNA序列之间。
81.根据权利要求77所述的基因构建体，其中，所述第一DNA序列位于启动子序列和第二DNA序列之间。
82.一种试剂盒，其包含：
权利要求77所述的基因构建体；
一个或者多个限制性内切酶。
83.权利要求82所述的试剂盒，进一步包含：
说明书，其用于说明如何将编码目标RNA分子的DNA分子插入到第二DNA序列中，以及用于说明如何形成编码转录产物的基因构建体，该转录子含有连接到权利要求31所述RNA分子上的目标RNA分子。
84.一种检测靶标分子的方法，其包含：
第一，在一定条件下，将权利要求27所述的核酸分子暴露给疑似含有靶标分子的介质，如靶标分子存在，在此条件下，第二结构域会特异性的与靶标分子结合；和第二，在一定条件下，将核酸分子和介质暴露给荧光团，该荧光团在取代的芳环系统和取代的咪唑啉(硫)酮、恶唑(硫)酮、吡咯啉(硫)酮或呋喃(硫)酮环之间有次甲基桥，在此条件下，足以使第一结构域在第二结构域与靶标分子结合后特异性地与荧光团结合，从而诱导荧光团形成表现出荧光发射增强的构象；和
通过适宜波长的射线激发荧光团，检测荧光团的荧光，荧光团荧光发射的检测结果可以说明核酸分子和靶标分子的结合情况。
85.根据权利要求84所述的方法，其中，所述介质包含全细胞的胞质，所述暴露包含在全细胞中表达或者引入核酸分子，所述第二次暴露包含将荧光团引入到细胞中。
86.根据权利要求85所述的方法，其中，所述表达包含使用编码核酸分子的转基因转化全细胞。
87.根据权利要求85所述的方法，其中，所述细胞为离体的。
88.根据权利要求85所述的方法，其中，所述细胞为体内的。
89.根据权利要求84所述的方法，其中，所述介质为体外的。
90.根据权利要求84所述的方法，其中，所述检测通过制冷型CCD相机、制冷型像增强CCD相机、单光子计数检测器、双光子计数检测器、分光光度计、荧光活化细胞分选系统、荧光分析仪或者荧光共振能量转移技术完成。
91.根据权利要求84所述的方法，进一步包含生成所述检测的图像结果。
92.一种检测靶标分子的方法，其包含：
形成权利要求60所述的分子复合物；
通过适宜波长的射线激发荧光团；和
检测荧光团的荧光，通过荧光团的荧光验证靶标分子是否存在。
93.根据权利要求92所述的方法，其中，所述的形成是在细胞内完成的。
94.根据权利要求92所述的方法，其中，所述细胞为离体的。
95.根据权利要求92所述的方法，其中，所述细胞为体内的。
96.根据权利要求92所述的方法，其中，所述形成包含：
使用编码核酸分子的转基因转化细胞，从而该细胞表达核酸分子，并使得核酸分子的第二结构域能够与靶标分子发生特异性结合；以及
在可以使得第一结构域结合荧光团的条件下，将荧光团引入到细胞。
97.根据权利要求92所述的方法，其中，所述形成包含将核酸分子和荧光团引入到细胞。
98.根据权利要求92所述的方法，其中，所述检测通过制冷型CCD相机、制冷型像增强CCD相机、单光子计数检测器、双光子计数检测器、分光光度计、荧光活化细胞分选系统、荧光分析仪或者荧光共振能量转移技术完成。
99.根据权利要求92所述的方法，其进一步包含生成所述检测的图像结果。
100.根据权利要求93所述的方法，其进一步包含在将细胞暴露给药物后监测荧光随时间变化的情况。
101.根据权利要求92所述的方法，其中，所述的形成是在体外完成的。
102.根据权利要求101所述的方法，其中，所述的核酸分子固定在底物表面，所述的形成是通过在底物表面上将荧光团和靶标分子引入到核酸分子完成的。
103.根据权利要求101所述的方法，其中，所述的荧光团固定在底物表面，所述的形成是通过在底物表面上将核酸分子和靶标分子引入到荧光团完成的。
104.根据权利要求120或103所述的方法，其中，多个荧光团或者多个核酸分子以矩阵形式结合到底物表面。
105.一种测定目标启动子在细胞内转录的方法，其包含：
将权利要求67所述的DNA构建体引入至细胞；
将基本上无荧光的荧光团引入至细胞；
将能够调节DNA构建体转录的试剂引入至细胞；和
检测细胞内荧光团的荧光，其中荧光的水平表示DNA构建体的转录水平以及试剂对转录水平调节的影响。
106.一种测定目标启动子转录的方法，其包含：
将权利要求67所述的DNA构建体，以及能够调节DNA构建体转录的试剂引入至细胞；
从细胞中回收RNA转录产物；
将基本上无荧光的荧光团引入至回收到的RNA转录产物；和
检测荧光团的荧光，其中荧光的水平表示DNA构建体的转录水平以及试剂对转录水平调节的影响。
107.一种监测RNA的方法，其包含：
将权利要求71所述的第一DNA构建体引入至细胞；和
将第一荧光团引入至细胞，该荧光团在取代的芳环系统和取代的咪唑啉(硫)酮、恶唑(硫)酮、吡咯啉(硫)酮或呋喃(硫)酮环之间包含有次甲基桥，其中，第一荧光团特异性结合由DNA构建体编码的RNA分子的第一结构域，以增强第一荧光团的荧光发射水平；
将细胞暴露于适宜波长的射线，该波长的射线可以诱导与第一结构域或者FRET伴侣分子结合的第一荧光团的荧光发射；和
测定第一荧光团或者FRET伴侣分子的荧光发射，以监测RNA转录子。
108.根据权利要求107所述的方法，其中，所述对RNA的监测包含RNA的转运、降解或者定量。
109.根据权利要求107所述的方法，其中，所述目标RNA为mRNA前体、mRNA、rRNA前体、rRNA、tRNA、hnRNA、snRNA、miRNA，或者长链非编码RNA、PIWI RNA、末端相关的RNA、非编码RNAs、启动子相关的RNAs，和病毒RNAs。
110.根据权利要求107所述的方法，其中，所述DNA构建体的转录产物包含多个第一结构域。
111.根据权利要求110所述的方法，其中，所述多个第一结构域足以对各个RNA分子进行监测。
112.根据权利要求107所述的方法，进一步包含：
将第二DNA构建体引入至细胞，该第二DNA构建体包含编码第二RNA分子的第一区域和与第一区域相连并且编码第二RNA转录子的第二区域，所述第二RNA分子包含特异性结合荧光团的第一结构域，所述荧光团在取代的芳环系统和取代的咪唑啉(硫)酮、恶唑(硫)酮、吡咯啉(硫)酮或呋喃(硫)酮环之间包含有次甲基桥，其中，RNA分子与荧光团结合可以实质性地提高荧光团暴露在适宜波长射线下的荧光，其中构建的DNA分子转录形成RNA分子，该RNA分子包括连接到特异性结合荧光团的第二RNA分子上的目标第二RNA转录子；和
将第二荧光团引入至细胞，其中，第二荧光团特异性的与由第二DNA构建体编码的第二RNA分子的第一结构域结合，以增强第二荧光团的荧光发射水平；
所述暴露包含适宜波长的射线，该适宜波长的射线足以诱导与第二RNA分子的第一结构域或者FRET伴侣分子结合的第二荧光团的荧光发射；和
所述测定包含测定与FRET伴侣分子结合的第二荧光团的荧光发射，以监测第二RNA转录子，其中，第一和第二荧光团或者它们各自的FRET伴侣分子的荧光都是可检测的。
113.一种监测细胞内靶标分子的方法，其包含：
将权利要求27所述的核酸分子引入至细胞，其中，第二结构域与靶标分子结合；
将第一荧光团引入至细胞，该荧光团在取代的芳环系统和取代的咪唑啉(硫)酮、恶唑(硫)酮、吡咯啉(硫)酮或呋喃(硫)酮环之间包含有次甲基桥，其中，第一荧光团特异性的与核酸分子的第一结构域结合，以增强第一荧光团的荧光发射水平；
将细胞暴露于适宜波长的射线下，该适宜波长的射线足以诱导与核酸分子或者FRET伴侣分子结合的第一荧光团的荧光发射；和
测定第一荧光团或者FRET伴侣分子的荧光发射，以监测靶标分子。
114.根据权利要求113所述的方法，其中，所述对靶标分子的监测包含靶标分子的转运、降解或者定量。
115.根据权利要求113所述的方法，其中，靶标分子为蛋白质、核酸、脂质、糖类、激素、细胞因子、趋化因子、代谢产物、有机分子，或者金属离子。
116.根据权利要求113所述的方法，其中，所述核酸分子包含RNA。
117.根据权利要求113所述的方法，其中，所述核酸分子包含DNA或者修饰的核酸。
118.一种监测细胞内靶标分子的方法，其包含：
将编码权利要求27所述的核酸分子的基因引入至细胞，其中，所述第二结构域与靶标分子结合；
将第一荧光团引入至细胞，该荧光团在取代的芳环系统和取代的咪唑啉(硫)酮、恶唑(硫)酮、吡咯啉(硫)酮或呋喃(硫)酮环之间包含有次甲基桥，其中，第一荧光团特异性的与核酸分子的第一结构域结合，以增强第一荧光团的荧光发射水平；
将细胞暴露于适宜波长的射线下，该适宜波长的射线足以诱导与核酸分子或者FRET伴侣分子结合的第一荧光团的荧光发射；和
测定第一荧光团或者FRET伴侣分子的荧光发射，以监测靶标分子。
119.根据权利要求118所述的方法，其中，所述对靶标的监测包含转运、降解或者定量。
120.根据权利要求118所述的方法，其中，靶标分子为蛋白质、核酸、脂质、糖类、激素、细胞因子、趋化因子、代谢产物、有机分子，或者金属离子。
121.根据权利要求118所述的方法，其中，所述核酸分子包含RNA。
122.根据权利要求118所述的方法，其中，所述核酸分子包含DNA或者修饰的核酸。
123.一种筛选可以修饰基因表达的药物的方法，其包含：
在一定条件下，将转基因引入至细胞，该条件可以引起引入基因的转录，转录产物包含权利要求31所述的RNA分子；
将细胞暴露于药物；
将荧光团引入至细胞，该荧光团在取代的芳环系统和取代的咪唑啉(硫)酮、恶唑(硫)酮、吡咯啉(硫)酮或呋喃(硫)酮环之间包含有次甲基桥，其中，荧光团特异性的与RNA分子的第一结构域结合，以增强荧光团的荧光发射水平；
将细胞暴露于适宜波长的射线下，该适宜波长的射线足以诱导与RNA分子或者FRET伴侣分子结合的荧光团的荧光发射；和
测定荧光团或者FRET伴侣分子的荧光发射，如果与其它条件均相同但未暴露于药物的对照细胞相比，荧光发射降低或者消失，则表明药物抑制转基因的表达，如果与其它条件均相同但未暴露于药物的对照细胞相比，荧光发射增强，则表明药物促进转基因的表达。
124.一种筛选可以修饰RNA剪接的药物的方法，其包含：
将包含权利要求70所述DNA构建体的转基因引入至细胞，其中，该转基因的转录得到转录产物，该转录产物包含位于RNA分子的第一和第二部分之间的内含子；
将细胞暴露于药物；
将荧光团引入至细胞，该荧光团在取代的芳环系统和取代的咪唑啉(硫)酮、恶唑(硫)酮、吡咯啉(硫)酮或呋喃(硫)酮环之间包含有次甲基桥，其中，荧光团特异性的与RNA分子的第一结构域结合，以增强荧光团的荧光发射水平；
将细胞暴露于适宜波长的射线下，该适宜波长的射线足以诱导与RNA分子或者FRET伴侣分子结合的荧光团的荧光发射；和
测定荧光团或者FRET伴侣分子的荧光发射，如果与其它条件均相同但未暴露于药物的对照细胞相比，其荧光发射降低或者消失，则表明药物抑制转录产物的正确剪接；如果与其它条件均相同但未暴露于药物的对照细胞相比，其荧光团或者FRET伴侣分子的荧光发射增强，则表明药物促进转录产物的正确剪接。
125.一种筛选可以修饰RNA剪接的药物的方法，其包含：
提供含有RNA转录子的介质、含有剪接酶的剪接体、药物和荧光团；
其中，所述RNA转录子包含具有插入内含子区域的第一和第二外显子，该第一和第二外显子通过切除内含子形成权利要求31所述的RNA分子；和
其中，所述荧光团在取代的芳环系统和取代的咪唑啉(硫)酮、恶唑(硫)酮、吡咯啉(硫)酮或呋喃(硫)酮环之间包含有次甲基桥，其中，该荧光团特异性的与RNA分子的第一结构域结合，以增强荧光团的荧光发射水平，
将介质暴露于适宜波长的射线下，该适宜波长的射线足以诱导与RNA分子或者FRET伴侣分子结合的荧光团的荧光发射；和
测定荧光团或者FRET伴侣分子的荧光发射，如果与其它条件均相同但不含有药物的对照介质相比，其荧光发射降低或者消失，则表明药物抑制转录产物的正确剪接；如果与其它条件均相同但不含有药物的对照介质相比，其荧光发射增强，则表明药物促进转录产物的正确剪接。
126.一种筛选对靶标分子具有活性的药物的方法，其包含：
将权利要求27所述的核酸分子引入至细胞，其中，第二结构域与靶标分子结合；
将第一荧光团引入至细胞，该荧光团在取代的芳环系统和取代的咪唑啉(硫)酮、恶唑(硫)酮、吡咯啉(硫)酮或呋喃(硫)酮环之间包含有次甲基桥，其中，第一荧光团特异性的与核酸分子的第一结构域结合，以增强第一荧光团的荧光发射水平；
将细胞暴露于适宜波长的射线下，该适宜波长的射线足以诱导与核酸分子或者FRET伴侣分子结合的第一荧光团的荧光发射；和
测定第一荧光团或者FRET伴侣分子的荧光发射，其中，与其它条件均相同但不含有药物的细胞相比，其荧光团或者FRET伴侣分子的荧光发射水平发生变化则表示药物改变了靶标分子的活性。
127.一种鉴定可以结合靶标分子的核酸分子的方法，其包含：
提供核酸分子池，池中的每一个核酸分子均包含特异性结合荧光团的第一结构域，该第一荧光团在取代的芳环系统和取代的咪唑啉(硫)酮、恶唑(硫)酮、吡咯啉(硫)酮或呋喃(硫)酮环之间包含有次甲基桥，以及包含随机序列的第二结构域，只有在第二结构域与靶标分子特异性结合后，第一结构域才能特异性的与荧光团结合；
将核酸分子池暴露于靶标分子和荧光团，从而通过第一结构域与荧光团的结合使得荧光团的荧光发射得到提高；
使用适宜波长的光激发荧光团，该适宜波长的光足以诱导连接了第一结构域分子的荧光团的荧光发射；和
测定荧光团的荧光发射，检测到荧光团的荧光表示核酸分子的第二结构域结合了靶标分子。
128.根据权利要求127所述的方法，其中，荧光团结合到固相表面。
129.根据权利要求127所述的方法，其中，在所述暴露核酸分子池之前，首先在无靶标分子的条件下将分子池暴露于荧光团，以从池中去除与荧光团结合的核酸分子。
130.权利要求127所述的方法，进一步包含：
回收核酸分子，该核酸分子在靶标分子存在的条件下能够诱导荧光团的荧光发射；和扩增回收到的核酸分子。
131.根据权利要求130所述的方法，在所述扩增之前，进一步包含：
将回收到的核酸分子暴露于靶标分子的结构类似物；和
从中选择不与所述结构类似物结合的所述回收到的核酸分子的子类别；
其中，所述扩增包含扩增所述回收到的核酸分子的子类别。
132.根据权利要求130所述的方法，其中，所述扩增在扩增产物的核苷酸序列中引入了突变，从而形成第二池核酸分子，该方法进一步包含：
使用第二池核酸分子，重复所述的暴露、激发和测定步骤；和
确定第二池核酸分子中是否有任何核苷酸分子的荧光发射得到了提高。
在体内外使用的偶联识别/检测系统
[0002] 本发明在政府支持下完成，享受美国国立卫生研究院授予的T32CA062948号基金资助。美国政府对本发明享有部分权利。发明领域
[0003] 本发明涉及各种荧光团、特异性结合荧光团的核酸分子(适体)、包含适体和荧光团的分子复合物、以及特异性结合靶标分子的适体，以及以上各项在体外或者体内监测各种分子的活性、转运、或者降解中的应用，以及对它们进行定量监测的应用。本发明还涉及这些复合物的制备方法和应用，以及用于实施这些方法的试剂盒。
发明背景
[0004] RNA曾经被认为是细胞中一种简单的分子。其主要包括转运RNA、核糖体RNA和信使RNA(mRNA)三种类型，一般认为RNA不受信号转导途径的调节，也不在疾病过程中发挥主要作用。然而，近几年来，有新兴的观点认为转录和其它细胞信号转导途径受到如microRNAs和末端相关的RNAs(Han等人，“Promoter-associated RNA Is Required for RNA-directed Transcriptional Gene Silencing in Human Cells，”Proc Natl Acad Sci USA 104：12422-12427(2007))等各种非编码RNAs的调节。此外，新的观点也不再认为mRNA只是简单的在DNA和蛋白质之间起中间体的作用，目前研究发现，mRNA广泛的参与后转录加工过程的各种事件，包括各种类型的剪接反应、无义介导的降解、RNA编辑、外切和内切核苷酸降解、聚腺苷酸化和脱腺苷化。另一引起人们关注的RNA在生物学中的发现是，当富含三核苷酸重复的mRNAs在特定的胞内位点累积时，其会表现出专一的功能获得性毒性(Ranum等人，“Myotonic Dystrophy：)。除以上这些不同的调节途径之外，最近的研究表明RNA成熟过程中RNAs的转运是通过细胞的不同部位完成。例如，新生成的RNA转录子(transcript)可能被搬运至细胞核上专一的胞内位点进行各种加工，包括剪接、无义介导降解或者组装成转运颗粒等加工处理。一些RNAs被转运出细胞核后，会定位于RNA聚集的胞内结构，其包括RNA颗粒、应激颗粒和处理小体(P-小体)(Kiebler等人，“Neuronal RNA Granules：Movers and Makers，”Neuron 51：685-690(2006))。这些RNA调节机制的多样性充分表明，RNA受到一个错综复杂的调节机制网络和和胞内结构的调控，这些胞内结构在基因表达过程中发挥关键作用。
[0005] 在神经元中，RNA调节途径尤为重要。例如，相比于其它任何细胞类型，神经元中，RNA剪接受到更高调节，其RNA剪接过程也更加复杂(Dredge等人，“The Splice of Life：Alternative Splicing and Neurological Disease，”Nat Rev Neurosci.2：43(2001))。相似地，尽管RNA编辑和富含三核苷酸重复的mRNA疾病的相关转录子在生物体中广泛表达，但是RNA编辑和富含三核苷酸重复的mRNA疾病却特异性的主要发生在神经元中(Keegan等人，“Adenosine Deaminases Acting on RNA(ADARs)：RNA-editing Enzymes，”Genome Biol.5：209(2004))。最近对1,328种非编码RNAs(＞200个核苷酸)的分析结果显示，此1,328种非编码RNAs中有64％在大脑中表达，且其中大多数非编码RNAs在不同脑区结构中具有非常专一的表达模式(Mercer等人，“Specific Expression of Long Noncoding RNAs in the Mouse Brain，”Proc Natl Acad Sci USA 105：716-721(2008))。
[0006] “区域”RNA翻译作为RNA调节的一种形式目前受到研究者的广泛关注。在最近一个里程碑式的研究中研究人员提出了一个引人关注的观点，即细胞中RNA定位具有基础性作用，在该研究中，对果蝇胚胎进行高通量基因特异原位杂交的结果显示71％的胞内RNAs表现出特异性并且往往是显著的胞内定位(Lecuyer等人，“Global Analysis of mRNA Localization Reveals a Prominent Role in Organizing Cellular Architecture and Function，”Cell 131：174-187(2007))。RNA定位同时也是神经元的一大特点，在神经元中，mRNAs在轴突和树突富集。这些mRNAs的区域翻译可能是进化中为了适应神经元形态的高度空间极化性质而形成的，神经元空间极化性质的典型特点是轴突和树突从细胞体开始可以发散成千上万微米的距离。在区域翻译中，mRNAs直接在树突和轴突翻译，而且往往是在如1-2μm长的树突棘等特征性的小结构域或者轴突生长锥内的小结构域进行翻译(Steward等人，“Compartmentalized Synthesis and Degradation of Proteins in Neurons，”Neuron 40：347-59(2003))。突触刺激时，RNAs会在RNA颗粒结构和P-小体之间进行动态转运，此转运方式可能对mRNA翻译有调节作用(Zeitelhofer 等人，“Dynamic Interaction Between P-bodies and Transport Ribonucleoprotein Particles in Dendrites of Mature Hippocampal Neurons，”J Neurosci.28：7555-7562(2008))。mRNA总量中只有的一小部分被搬运至轴突或者树突，不连续的3’非翻译区(3’UTR)序列似乎对信号依赖性翻译是必需的(Sutton等人，“Local Translational Control in Dendrites and its Role in Long-term Synaptic Plasticity，”J Neurobiology
64：116-131(2005))。区域翻译可以绕过传送信号至核仁这一费时的过程，直接进行蛋白质的合成，然后再将新合成的蛋白质转运至受体激活的特异性位点(Steward等人，“Compartmentalized Synthesis and Degradation of Proteins in Neurons，”Neuron
40：347-359(2003))。因此，神经元受到区域mRNA翻译的复杂、时间依赖性和空间特异性调节，以满足其功能和形态学的要求。
64：116-131(2005))。区域翻译可以绕过传送信号至核仁这一费时的过程，直接进行蛋白质的合成，然后再将新合成的蛋白质转运至受体激活的特异性位点(Steward等人，“Compartmentalized Synthesis and Degradation of Proteins in Neurons，”Neuron
40：347-359(2003))。因此，神经元受到区域mRNA翻译的复杂、时间依赖性和空间特异性调节，以满足其功能和形态学的要求。
[0007] 绿色荧光蛋白(GFP)为生物医药研究和生物技术带来了革命。GFP的应用，使得定位蛋白质转运和加工过程相关的特定胞内细胞器和细胞内的特定位点成为常规技术。此外，还可用于对细胞器甚至于细胞器内子域的作用进行研究。然而，除了用于细胞内蛋白质的时空定位，GFP还被用于为研究蛋白-蛋白相互作用、胞内粘度和蛋白质降解提供相关信息(Zhang等人，“Creating New Fluorescent Probes for Cell Biology，”Nature Rev Mol Cell Biol 3：906-918(2002)；Neher等人，“Latent ClpX-Recognition Signals Ensure LexA Destruction After DNA Damage，”Genes & Development 17：1084-1089(2003))。GFP还被用于研究蛋白质折叠，以及作为基于细胞和体内测定的关键组分，GFP在生物技术已有大量的应用。GFP及其相关蛋白已被用于生产新型的FRET探针，此探针可以报告胞内分子的胞内定位以及浓度(Zhang等人，“Creating New Fluorescent Probes for Cell Biology，”Nature Rev Mol Cell Biol 3：906-918(2002))。利用生物共轭化学方法使得蛋白质发射荧光的技术已经应用了很长时间，但是此技术需要对蛋白质进行异硫氰酸荧光素等试剂修饰后，才可将其显微注射入细胞。由于GFP和GFP标记蛋白在遗传学上均是可编码的，其可通过转染DNA进行表达，从而使得在任意生物医药研究实验室都可以轻松实现对表达荧光标记蛋白的细胞的制备。除了可以实现GFP标记蛋白的轻松制备之外，由于标记GFP的蛋白相对于标记传统小分子荧光染料的蛋白光学漂白速度要慢的多，因此GFP还广泛的应用于活细胞成像。
[0008] 尽管GFP已被证明是蛋白质细胞生物学研究中十分有价值的工具，但是类似的可用于RNA和小分子可视化且符合简单和直接要求的技术尚未实现。如要模拟GFP的原理实现RNA可视化，此技术将是一项重要的“可实施技术”，仍有许多问题尚待解决。以mRNAs的特异性实时定位相关问题为例，mRNAs在细胞核和核仁进行加工的过程，以及其接下来的运送至细胞质的过程，转运至神经生长锥、棘、轴突、核、细胞器等过程都可被记录，尤其是相关的mRNAs特殊剪接形式、不同的mRNAs编辑以及含有三核苷酸重复的mRNAs。而且，与胞外信号响应的mRNAs的转运时机也可被记录，例如，突触可塑性过程时，mRNAs转运至树突棘的作用以及轴突转向过程中mRNAs在生长锥的作用。树突和轴突中，mRNAs降解调节的作用也可被评估。然而，RNA的可视化技术并不局限于mRNA。除了microRNAs之外，最近的研究表明有大量的Piwi蛋白相作用的RNAs、启动子相关小RNAs(PASRs)、末端相关小RNA(TASRs)(Han等人，Promoter-associated RNA is Required for RNA-directed Transcriptional Gene Silencing in Human Cells，”Proc Natl Acad Sci USA 104：12422-12427(2007))，以及大量其它的非编码小RNAs(Hannon等人，“The Expanding Universe of Noncoding RNAs，”Cold Spring Harb Symp Quant Biol 71：551-564(2006))存在，这些RNAs的具体功能未明，但可预见它们的发现将与microRNAs的发现一样，对分子生物学有着相同重要的影响。很明显，还有许多基础性的问题尚待解决。
[0009] 目前，最普遍使用的研究mRNA定位的技术是原位杂交(Levsky等人，“Fluorescence in situ Hybridization：Past，Present and Future，”J Cell Sci.116：
2833-2838(2003))。此技术已经得到很好的实验验证，但是其不是均相测定，也不能对同一细胞不同时间点的RNA进行监测。为实现对单细胞体内RNA的实时可视化监测，研究者开发了一项在体外利用荧光标记核苷酸合成RNA，然后将其显微注射入细胞的技术(Zhang等人，“Creating New Fluorescent Probes for Cell Biology，”Nat Rev Mol Cell Biol
3：906-918(2002))。但是，此方法技术上实现困难且通量低。另一种方法利用分子信标的技术，分子信标为荧光团和猝灭剂双标记的寡聚核苷酸(Tyagi等人，“Imaging Native Beta-actin mRNA in Motile Fibroblasts，”Biophys J.87：4153-4162(2004))。信标采用茎环结构，由于在其茎的底部，荧光团和猝灭剂距离接近使得信标本身无荧光性。当一个可与信标的环互补的靶标mRNA和信标杂交时，会导致信标荧光团和猝灭剂的分离，从而使得信标表现出荧光性。但是，此种分子信标技术，转染的信标表现出非特异性的核隔离作用，且每一个mRNA要实现可视化均需要定制设计一个信标。由于此种合成方法的固有困难，许多研究小组在尝试开发细胞内遗传可编码的RNA位置的报告子。然而，目前为止，尚未有技术相对简单同时又有特异性可作为常规方法使用，因此RNA成像仍然是触不可及的技术。
2833-2838(2003))。此技术已经得到很好的实验验证，但是其不是均相测定，也不能对同一细胞不同时间点的RNA进行监测。为实现对单细胞体内RNA的实时可视化监测，研究者开发了一项在体外利用荧光标记核苷酸合成RNA，然后将其显微注射入细胞的技术(Zhang等人，“Creating New Fluorescent Probes for Cell Biology，”Nat Rev Mol Cell Biol
3：906-918(2002))。但是，此方法技术上实现困难且通量低。另一种方法利用分子信标的技术，分子信标为荧光团和猝灭剂双标记的寡聚核苷酸(Tyagi等人，“Imaging Native Beta-actin mRNA in Motile Fibroblasts，”Biophys J.87：4153-4162(2004))。信标采用茎环结构，由于在其茎的底部，荧光团和猝灭剂距离接近使得信标本身无荧光性。当一个可与信标的环互补的靶标mRNA和信标杂交时，会导致信标荧光团和猝灭剂的分离，从而使得信标表现出荧光性。但是，此种分子信标技术，转染的信标表现出非特异性的核隔离作用，且每一个mRNA要实现可视化均需要定制设计一个信标。由于此种合成方法的固有困难，许多研究小组在尝试开发细胞内遗传可编码的RNA位置的报告子。然而，目前为止，尚未有技术相对简单同时又有特异性可作为常规方法使用，因此RNA成像仍然是触不可及的技术。
[0010] 最广泛应用的技术是GFP-MS2系统(Bertrand等人，“Localization of ASH1 mRNA Particles in Living Yeast，”Molecular Cell 2：437-445(1998))。这一方法采用两个组成部分：一个重要的蛋白质MS2，其与GFP融合；一段RNA序列，其作为MS2结合元件，插入到感兴趣RNAs的3’非翻译区。GFP-MS2和含有RNAs的在细胞内，GFP-MS2与标记RNA的MS2元件结合，因此这些细胞内的荧光信号代表了RNA-GFP复合物的情况。由于未结合的GFP-MS2会向细胞质弥漫，因此此种方法往往荧光背景值较高。为了消除这一问题，将一个核定位信号(NLS)引入GFP-MS2融合蛋白，从而使得多数的GFP-MS2移入细胞核(Bertrand等人，“Localization of ASH1 mRNA Particles in Living Yeast，”Molecular Cell 2：437-445(1998))。不幸的是，此种改进的结果是GFP-MS2-RNA复合物会产生两个转运信号：
一个在RNA中编码，而另一个是GFP-MS2中的NLS。两种转运信号的存在使得对标记mRNA胞内运动情况的阐释变得复杂化。NLS的另一个缺点即是会引起GFP-MS2在细胞核内的累积，从而导致强烈的核荧光信号，以及因此而阻止了对位于核内的RNAs的分析。由于多数的RNA生物学过程都发生在细胞核内，例如无义介导的降解、RNA编辑、RNA的核转出、剪接、先锋RNA翻译(pioneer RNA translation)和microRNA加工，GFP-MS2的核内累积会妨碍对这些事件的分析。因此，尽管GFP-MS2有一定的实用性，但是其还是不能够适合研究团体的需要。
一个在RNA中编码，而另一个是GFP-MS2中的NLS。两种转运信号的存在使得对标记mRNA胞内运动情况的阐释变得复杂化。NLS的另一个缺点即是会引起GFP-MS2在细胞核内的累积，从而导致强烈的核荧光信号，以及因此而阻止了对位于核内的RNAs的分析。由于多数的RNA生物学过程都发生在细胞核内，例如无义介导的降解、RNA编辑、RNA的核转出、剪接、先锋RNA翻译(pioneer RNA translation)和microRNA加工，GFP-MS2的核内累积会妨碍对这些事件的分析。因此，尽管GFP-MS2有一定的实用性，但是其还是不能够适合研究团体的需要。
[0011] 其它已知的相关技术方法都有重大的局限性。最近发展的关于GFP表达的新策略，其包括以独立的两半形式表达GFP，每一半都分别与一种RNA结合蛋白即蛋白eIF4A的一半相融合(Tyagi，S.“Splitting or Stacking Fluorescent Proteins to Visualize mRNA in Living Cells，”Nat Methods 4：391-392(2007))。含有eIF4A结合位点的RNAs会使得结合的eIF4A一半形成核，其会导致两个GFP半的并置，从而导致稳定GFP复合物的形成。由于GFP复合物需要约30分钟才能成为成熟的荧光种类(Merzlyak等人，“Bright Monomeric Red Fluorescent Protein with an Extended Fluorescence Lifetime，”Nat Methods 4：555-557(2007))，所以此方法不能用于新生RNAs的可视化。另外，GFP复合物一旦形成，此荧光复合物会自发地或者在RNA降解后发生解离，从而导致胞浆荧光背景值处于高水平。
[0012] 一个高度理想化的策略是在没有其他结合蛋白的帮助下RNA序列本身就具有荧光性。一种可能的替代方法是使用可以结合RNA序列的荧光染料来对RNAs进行标记。可以结合其它分子的短的RNA序列又被称为“适体”。已有报道关于，应用SELEX技术，可以结合荧光染料例如荧光素的RNA适体(Holeman，等人“，Isolation and Characterization of Fluorophore-binding RNA Aptamers，”Folding& Design.3：423-431(1998)；Sando等人，“Transcription Monitoring using Fused RNA with a Dye-binding Light-up Aptamer as a Tag：a Blue Fluorescent RNA，”Chem Commun(Camb)33：3858-3860(2008))。但是，这些RNAs都未用于活细胞实验中，原因是结合的和未结合的染料都有荧光性，而且荧光的发射光谱性质也基本相同。因此，如果拥有可以表达能与荧光素结合的适体的细胞，将荧光素加入此细胞介质后，来自于未结合的荧光素的荧光信号会掩盖住与RNA结合的荧光素的荧光信号。相似地，孔雀绿是一种与同源适体结合后具有荧光的染料(Babendure等人，“Aptamers Switch on Fluorescence of Triphenylmethane Dyes，”J Am.Chem.Soc.125：14716-14717(2003))，但是其不能应用于活细胞中，原因就是孔雀绿与细胞膜相互作用后会发射强烈的荧光(Guidry，G.“A Method for Counterstaining Tissues in Conjunction with the Glyoxylic Acid Condensation Reaction for Detection of Biogenic Amines，”J Histochem Cytochem.47：261-264(1999))。另外，孔雀绿还会产生具有细胞毒作用的自由基(Beermann等人，“Chromophore-assisted Laser Inactivation of Cellular Proteins，”Methods in Cell Biology 44：715-732(1994))，其会快速摧毁自身的RNA适体(Grate等人，“Laser-mediated，Site-specific Inactivation of RNA Transcripts，”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96：6131-6136(1999)；Stojanovic等 人，“Modular Aptameric Sensors，”J Am Chem Soc.126：9266-9270(2004))。孔雀绿的这些令人遗憾的特征使得孔雀绿适体在细胞成像中的潜在应用不可能实现。
[0013] 其它的染料也有各种问题。许多的分子在结合核苷酸后表现出荧光性。溴化乙锭和双苯亚甲胺染料可能是最广为人知的两种分子，但是它们与寡聚核苷酸的结合是非特异性的。因此，当在同时含有靶标和非靶标核苷酸分子的细胞环境或者体外介质中使用这些分子时，即使是靶标核苷酸分子不存在，溴化乙锭和双苯亚甲胺染料也会产生荧光信号。菁染料具有强烈的荧光发射特征，甚至于在其与胞膜组分无差别结合后，亦表现出荧光性。因此，菁染料同孔雀绿在应用上存在相同的问题。
[0014] 故开发这样一种荧光团是十分理想的，即其在不存在适体结合时，产生的背景荧光足够低，而且由此适体结合荧光团复合物产生增强的或者修饰的荧光信号，其可以很容易的与末结合的荧光团的荧光信号(如果有的话)区分开来。
[0016] 本发明的第一个方面涉及一种化合物，其在取代的芳环系统和取代的咪唑啉(硫)酮、恶唑(硫)酮、吡咯啉(硫)酮或呋喃(硫)酮环之间包含有次甲基桥，其中，核酸分子与此化合物结合后可以实质性地提高了此化合物在适宜波长射线下的荧光强度。
[0017] 根据本发明的一个实施方式，本发明第一个方面所涉及的化合物具有如下通式I所示的结构：其中，
Q为S或者O，
Y为O或者N，
Z为N或者C(H)，
Ar为芳环或者芳杂环系统，其包含一个或者两个环；
当Y为N时，R1代表C1-8的烃基或者-(CH2)n-R6，其中n为大于或等于1的整数；
R2为甲基，一卤代、二卤代或者三卤代甲基，肟基，邻甲基肟基，亚胺基，带有最多为三个(R7-R9)取代基的取代的苯基或者未被取代的苯基，C2-8的不饱和烃基，该C2-8的不饱和烃基的末端可以可选地被以下基团取代：氨基、酰胺、羧酸、(甲基)丙烯酸酯、酯、烯酮、肟、邻甲基肟基、亚胺、硝基甲烷、腈、酮、一卤、二卤、三卤、硝基、氰基、丙烯腈、丙烯腈-烯酮、丙烯腈-羧酸酯、丙烯腈-酰胺、或者第二个芳环或者芳杂环；
R3-R5分别独立地选自氢、羟基、烷基、烷氧基、氟、氯、溴、氨基、烷氨基、二烷氨基、硫烷基、氰基、巯基、硝基、一卤代、二卤代或者三卤代甲基、酮和羧酸(R3-R5中至少有一个基团是除氢以外的基团)；
R6为氢、表面活性基团、固相表面、或者是可以与表面活性基团或者固相表面相连接的官能团；
R7-R9分别独立地选自氢、羟基、烷基、烷氧基、氟、氯、溴、氨基、烷氨基、二烷氨基、硫烷基、氰基、巯基、硝基、一卤代、二卤代或者三卤代甲基、酮和羧酸；
以及以上化合物的盐。
Q为S或者O，
Y为O或者N，
Z为N或者C(H)，
Ar为芳环或者芳杂环系统，其包含一个或者两个环；
当Y为N时，R1代表C1-8的烃基或者-(CH2)n-R6，其中n为大于或等于1的整数；
R2为甲基，一卤代、二卤代或者三卤代甲基，肟基，邻甲基肟基，亚胺基，带有最多为三个(R7-R9)取代基的取代的苯基或者未被取代的苯基，C2-8的不饱和烃基，该C2-8的不饱和烃基的末端可以可选地被以下基团取代：氨基、酰胺、羧酸、(甲基)丙烯酸酯、酯、烯酮、肟、邻甲基肟基、亚胺、硝基甲烷、腈、酮、一卤、二卤、三卤、硝基、氰基、丙烯腈、丙烯腈-烯酮、丙烯腈-羧酸酯、丙烯腈-酰胺、或者第二个芳环或者芳杂环；
R3-R5分别独立地选自氢、羟基、烷基、烷氧基、氟、氯、溴、氨基、烷氨基、二烷氨基、硫烷基、氰基、巯基、硝基、一卤代、二卤代或者三卤代甲基、酮和羧酸(R3-R5中至少有一个基团是除氢以外的基团)；
R6为氢、表面活性基团、固相表面、或者是可以与表面活性基团或者固相表面相连接的官能团；
R7-R9分别独立地选自氢、羟基、烷基、烷氧基、氟、氯、溴、氨基、烷氨基、二烷氨基、硫烷基、氰基、巯基、硝基、一卤代、二卤代或者三卤代甲基、酮和羧酸；
以及以上化合物的盐。
[0018] 本发明的第二个方面涉及一种含有第一结构域的核酸分子，该第一结构域可与本发明第一个方面所涉及的荧光团分子特异性结合，其中，核酸分子与荧光团结合后可以实质性地提高荧光团在适宜波长射线下的荧光强度。所述核酸分子包括RNA、DNA，和/或修饰的核酸。
[0019] 本发明的第三个方面涉及一种融合的RNA分子，其包含本发明第二个方面所涉及的RNA分子。
[0020] 本发明的第四个方面涉及一种本发明第二个方面所涉及的核酸分子，其还包含第二结构域，该第二结构域可特异性的与不同于荧光团的靶标分子结合。根据本发明的一个实施方式，只有在第二结构域与靶标分子结合后，第一结构域才与荧光团结合。
[0021] 本发明的第五个方面涉及一种核酸分子，其包含第一结构域，该第一结构域可特异性的与本发明第一个方面所涉及的荧光团结合，还包含第二结构域，该第二结构域包含任意的核苷酸序列，其中，第二结构域与靶标分子的特异性结合使得第一结构域形成一种特定结构，该结构可以使得第一结构域可特异性的与荧光团结合。本发明的此方面还包括一种文库，其包含多个核酸分子。
[0022] 本发明的第六个方面涉及一种试剂盒，其包含本发明的第一个方面所涉及的荧光团和本发明第二个方面所涉及的多个核酸分子，其中，所述多个核酸分子中的每一核酸分子其与荧光团结合后，都可以引起荧光团的不同荧光发射情况。
[0023] 本发明的第七个方面涉及一种试剂盒，其包含本发明的第一个方面所涉及的多个荧光团和本发明的第二个方面所涉及的多个核酸分子，其中，所述多个核酸分子中的每一个核酸分子均与多个荧光团中的至少一个相结合。
[0024] 本发明的第八个方面涉及一种分子复合物，其包含本发明的第一个方面所涉及的荧光团和本发明的第二个方面所涉及的核酸分子，该核酸分子特异性的与所述荧光团相结合，其中，荧光团在和核酸分子结合后，其在适宜波长射线下的荧光强度得到了实质性的提高(跟荧光团与核酸分子特异性结合前相比)。本发明的此方面还包括分子复合物，其包含含有多个第一结构域的核苷酸分子。
[0025] 本发明的第九个方面涉及分子复合物，其包含本发明的第一个方面所涉及的荧光团；本发明的第四个方面所涉及的核酸分子，该核酸分子的第一结构域特异性的与所述荧光团相结合，第二结构域特异性的与靶标分子结合，其中，荧光团在和核酸分子结合后，其在适宜波长射线下的荧光强度得到了实质性的提高(跟荧光团与核酸分子特异性结合前相比)。
[0026] 本发明的第十个方面涉及一种宿主细胞，其包含本发明的第八个或者第九个方面所涉及分子复合物。
[0027] 本发明的第十一个方面涉及一种DNA构建体，其包含编码本发明的第二个或者第四个方面所涉及的RNA分子的第一区域。DNA构建体分子可以是分离的转基因形式，也可以是表达载体的形式(也就是，包含合适的调节序列，从而可以使编码的RNA分子进行表达)。
[0028] 本发明的第十二个方面涉及一种本发明的第十一个方面所涉及的DNA构建体，其包含位于第一区域内的内含子，从而可以从构建的DNA分子的转录子切除内含子后得到RNA分子。构建的DNA分子可以是分离的转基因形式，也可以是表达载体的形式(也就是，包含合适的调节序列，从而可以使编码的RNA分子进行表达)。
[0029] 本发明的第十三个方面涉及一种DNA构建体，其包含本发明的第二个或者第四个方面所涉及编码RNA分子的第一区域，以及包含与第一区域相连的第二区域，该第二区域编码目标RNA转录子，从而构建的DNA分子转录形成RNA分子，该RNA分子包括目标RNA转录子，该RNA转录子与RNA分子相连接并可以特异性地结合荧光团。构建的DNA分子可以是分离的转基因形式，也可以是表达载体的形式(也就是，包含合适的调节序列，从而可以使编码的RNA分子进行表达)。
[0030] 本发明的第十四个方面涉及一种转基因的宿主细胞，其包含本发明的第十一个、第十二个或者第十三个方面所涉及的DNA构建体。
[0031] 本发明的第十五个方面涉及一种空的基因构建体，其用于制备本发明的第十三个方面所涉及的DNA构建体。该基因构建体包含启动子序列，该启动子序列可操纵地连接到编码本发明第二个方面所涉及的RNA分子的第一DNA序列，并被连接到含有一个或者多个酶切位点的第二DNA序列。本发明的此方面还包括试剂盒，其包含空的基因构建体，其可用于制备本发明的第十三个方面所涉及的DNA构建体。
[0032] 本发明的第十六个方面涉及一种检测靶标分子的方法，其包含：第一，在一定条件下，将本发明的第四个方面所涉及的核酸分子(此核酸分子的第一结构域只有在其第二结构域与靶标分子结合后，才能与荧光团结合)暴露于疑似含有靶标分子的介质中，如靶标分子存在，在此条件下，第二结构域会特异性的与靶标分子结合；第二，在一定条件下，将核酸分子和介质暴露于荧光团中，该荧光团包含在取代的芳环系统和取代的咪唑啉(硫)酮、恶唑(硫)酮、吡咯啉(硫)酮或呋喃(硫)酮环之间包含有次甲基桥，所用的暴露条件可以使得第一结构域能够在第二结构域与靶标分子结合后特异性的与荧光团结合，从而诱导荧光团形成表现出荧光发射增强的构象；在适宜波长射线下，激发荧光团，检测荧光团的荧光强度，由荧光团荧光发射的检测结果来表示核酸分子和靶标分子的结合情况。
[0033] 本发明的第十七个方面涉及一种检测靶标分子定位的方法，其包含：形成本发明的第九个方面所涉及的分子复合物；在适宜波长射线下，激发荧光团；检测荧光团的荧光强度，由荧光团的荧光强度验证靶标分子是否存在。
[0034] 本发明的第十八个方面涉及一种测定胞内目标启动子转录情况的方法，其包含：将本发明的第十一个方面所涉及的DNA构建体引入至细胞；将基本上无荧光发射的荧光团引入至细胞；将能够调节DNA构建体转录的试剂引入至细胞；以及检测细胞内荧光团的荧光强度，由荧光强度的水平表示DNA构建体的转录水平以及试剂对转录水平调节的影响。
[0035] 本发明的第十九个方面涉及一种测定目标启动子转录情况的方法，其包含：将本发明的第十一个方面所涉及的DNA构建体以及能够调节DNA构建体转录的试剂引入至细胞；从细胞中回收RNA转录子；将基本上无荧光发射的荧光团引入至回收到的RNA转录子；检测荧光团的荧光强度，由荧光强度的水平表示DNA构建体的转录水平以及试剂对转录水平调节的影响。
[0036] 本发明的第二十个方面涉及一种监测RNA的方法，其包含：将本发明的第十三个方面所涉及的第一DNA构建体引入至细胞；将第一荧光团引入至细胞，该荧光团包含在取代的芳环系统和取代的咪唑啉(硫)酮、恶唑(硫)酮、吡咯啉(硫)酮或呋喃(硫)酮环之间包含有次甲基桥，其中，第一荧光团特异性的与DNA构建体分子编码的RNA分子的第一结构域结合，以增强第一荧光团的荧光发射水平；将细胞暴露于适宜波长的射线下，以诱导与第一结构域或者FRET伴侣分子(FRET partner)结合的第一荧光团的荧光发射；以及测定第一荧光团或者FRET伴侣分子的荧光发射，以监测RNA转录子的情况。本发明的此方面在监测RNA转录子的定位、随时间的降解情况以及RNA转录子的定量(基于荧光)上特别有用。而且，同时监测两个或者两个以上的RNA转录子也是可能的。
[0037] 本发明的第二十一个方面涉及一种监测细胞内靶标分子的方法，其包含：将本发明的第四个方面所涉及的核酸分子引入至细胞(此核酸分子的第一结构域只有在其第二结构域与靶标分子结合后，才能与荧光团结合)，其中，第二结构域与靶标分子结合；将第一荧光团引入至细胞，该荧光团在取代的芳环系统和取代的咪唑啉(硫)酮、恶唑(硫)酮、吡咯啉(硫)酮或呋喃(硫)酮环之间包含有次甲基桥，其中，第一荧光团特异性的与核酸分子的第一结构域结合，以增强第一荧光团的荧光发射水平；将细胞暴露于适宜波长的射线下，以诱导与核酸分子或者FRET伴侣分子结合的第一荧光团的荧光发射；以及测定第一荧光团或者FRET伴侣分子的荧光发射，以监测靶标分子的情况。本发明的此方面在监测靶标分子的定位、随时间的降解情况以及靶标分子的定量(基于荧光)上特别有用。而且，同时监测两个或者两个以上的靶标分子也是可能的。
[0038] 本发明的第二十二个方面涉及一种监测细胞内靶标分子的方法，其包含：将编码本发明的第四个方面所涉及的核酸分子的基因引入至细胞(此核酸分子的第一结构域只有在其第二结构域与靶标分子结合后，才能与荧光团结合)，其中，第二结构域与靶标分子结合；将第一荧光团引入至细胞，该荧光团在取代的芳环系统和取代的咪唑啉(硫)酮、恶唑(硫)酮、吡咯啉(硫)酮或呋喃(硫)酮环之间包含有次甲基桥，其中，第一荧光团特异性的与核酸分子的第一结构域结合，以增强第一荧光团的荧光发射水平；将细胞暴露于适宜波长的射线下，以诱导与核酸分子或者FRET伴侣分子结合的第一荧光团的荧光发射；以及测定第一荧光团或者FRET伴侣分子的荧光发射，以监测靶标分子的情况。本发明的此方面在监测靶标分子的定位、随时间的降解情况以及靶标分子的定量(基于荧光)上特别有用。而且，同时监测两个或者两个以上的靶标分子也是可能的。
[0039] 本发明的第二十三个方面涉及一种筛选可以修饰基因表达的药物的方法，其包含：在一定条件下，将转基因引入至细胞，该条件能够引起引入基因的转录，转录子包含本发明的第二个方面所涉及的RNA分子；将细胞暴露于药物；将荧光团引入至细胞，该荧光团在取代的芳环系统和取代的咪唑啉(硫)酮、恶唑(硫)酮、吡咯啉(硫)酮或呋喃(硫)酮环之间包含有次甲基桥，其中，该荧光团特异性的与RNA分子的第一结构域结合，以增强荧光团的荧光发射水平；将细胞暴露于适宜波长的射线下，以诱导与RNA分子或者FRET伴侣分子结合的荧光团的荧光发射；以及测定荧光团或者FRET伴侣分子的荧光发射，如果与其它条件均相同但未暴露于药物的对照细胞相比，荧光发射降低或者消失，则表明药物抑制转基因的表达，如果与其它条件均相同但未暴露于药物的对照细胞相比，荧光发射增强，则表明药物促进转基因的表达。
[0040] 本发明的第二十四个方面涉及一种筛选可以修饰RNA剪接的药物的方法，其包含：将包含本发明的第十二个方面所涉及的DNA构建体的转基因引入至细胞，其中，该转基因转录得到一种转录子，其包含位于RNA分子的第一和第二部分之间的内含子；将细胞暴露于药物；将荧光团引入至细胞，此荧光团在取代的芳环系统和取代的咪唑啉(硫)酮、恶唑(硫)酮、吡咯啉(硫)酮或呋喃(硫)酮环之间包含有次甲基桥，其中，荧光团特异性的与RNA分子的第一结构域结合，以增强荧光团的荧光发射水平；将细胞暴露于适宜波长的射线下，以诱导与RNA分子或者FRET伴侣分子结合的荧光团的荧光发射；测定荧光团或者FRET伴侣分子的荧光发射，如果与其它条件均相同但未暴露于药物的对照细胞相比，其荧光发射降低或者消失，则表明药物抑制转录子的正确剪接；如果与其它条件均相同但未暴露于药物的对照细胞相比，其荧光团或者FRET伴侣分子的荧光发射增强，则表明药物促进转录子的正确剪接。
[0041] 本发明的第二十五个方面涉及一种筛选可以修饰RNA剪接的药物的方法，其包含：提供含有RNA转录子的介质、含有剪接酶的剪接体、药物和荧光团，其中，所述RNA转录子包含具有插入内含子区域的第一和第二外显子，此第一和第二外显子通过切除内含子形成本发明的第二个方面所涉及的RNA分子，其中，所述荧光团在取代的芳环系统和取代的咪唑啉(硫)酮、恶唑(硫)酮、吡咯啉(硫)酮或呋喃(硫)酮环之间包含有次甲基桥，其中，此荧光团特异性的与RNA分子的第一结构域结合，以增强荧光团的荧光发射水平；将介质暴露于适宜波长的射线下，以诱导与RNA分子或者FRET伴侣分子结合的荧光团的荧光发射；测定荧光团或者FRET伴侣分子的荧光发射，如果与其它条件均相同但不含有药物的对照介质相比，其荧光发射降低或者消失，则表明药物抑制转录子的正确剪接；如果与其它条件均相同但不含有药物的对照介质相比，其荧光发射增强，则表明药物促进转录子的正确剪接。
[0042] 本发明的第二十六个方面涉及一种筛选对靶标分子具有活性的药物的方法。此筛选方法包含以下几步：将本发明的第四个方面所涉及的核酸分子引入至细胞(该核酸分子的第一结构域只有在其第二结构域与靶标分子结合后，才能与荧光团结合)，其中，第二结构域与靶标分子结合；将第一荧光团引入至细胞，此荧光团在取代的芳环系统和取代的咪唑啉(硫)酮、恶唑(硫)酮、吡咯啉(硫)酮或呋喃(硫)酮环之间包含有次甲基桥，其中，第一荧光团特异性的与核酸分子的第一结构域结合，以增强第一荧光团的荧光发射水平；将细胞暴露于适宜波长的射线下，以诱导与核酸分子或者FRET伴侣分子结合的第一荧光团的荧光发射；测定第一荧光团或者FRET伴侣分子的荧光发射，其中，与其它条件均相同但不含有药物的细胞相比，如果荧光团或者FRET伴侣分子的荧光发射水平发生变化则表示药物改变了靶标分子的活性。
[0043] 本发明的第二十七个方面涉及一种鉴定可以结合靶标分子的核酸分子的方法，其包含：提供核酸分子池，池中的每一个核酸分子均包含第一结构域，第一结构域可以特异性地结合荧光团，该荧光团在取代的芳环系统和取代的咪唑啉(硫)酮、恶唑(硫)酮、吡咯啉(硫)酮或呋喃(硫)酮环之间包含有次甲基桥；以及含有随机序列的第二结构域，只有在该第二结构域与靶标分子特异性结合后，第一结构域才能与荧光团特异性的结合；将核酸分子池暴露于靶标分子和荧光团，由此使得荧光团的荧光发射在第一结构域与荧光团的结合后提高；使用适宜波长的光激发荧光团，以诱导结合了第一结构域分子的荧光团的荧光发射；以及测定荧光团的荧光发射，由此测得的荧光团的荧光强度表示核酸分子第二结构域与靶标分子的结合情况。本发明的实施例示出了矩阵荧光团的开发，该荧光团在未与核酸适体分子特异性结合时表现出较低的荧光发射，由此获得了一种适体/荧光团复合物，该复合物所含的荧光团只有在与适体发生特异性结合后，其荧光发射开关才被“打开”。这种策略解决了许多现有技术中荧光团的问题，后者无法区分荧光背景。本发明的适体/荧光团复合物对体外和体内的许多研究都非常有用，包括体内监测RNA分子的定位或者降解，以及在体外或者体内系统监测和定量靶标分子的数目。更为重要的是，有别于许多现有技术中应用的染料，本发明所涉及的荧光团是无毒的。本发明的检测操作可以使用现有的光学检测工具实现，与高通量芯片技术或者药物筛选兼容。而且，通过开发一系列的荧光团/适体复合物，由于每个复合物都具有独特的荧光发射光谱，因此利用这些对应每个独立靶标的不同荧光团/适体对，单个细胞内的许多靶标可以同时被定位。基于RNA的小分子传感器的生成表明大范围的增加可被检测到的细胞内分子的数目是可能的，而且其检测到的数目要大于利用目前基于蛋白的FRET传感器所可能检测到的数目。本发明设计了简单的策略来制备可用于活细胞成像的重要信号分子的传感器。先前的基于蛋白的FRET传感器是不能用于活细胞成像的。因此，本发明提供了一种快速、简单和常规的方法来制备任一小分子的传感器。这些传感器应尽快发展其作为简易荧光试剂检测小分子的应用性，发挥其简化测定过程以及基于荧光的高通量筛选的作用。
附图说明
附图说明
[0044] 图1A-1C示出了天然GFP荧光团的结构以及4-(3，5-二甲氧基-4-羟基-苯亚甲基)-1，2-二甲氧基-咪唑-5-酮(“DMHBI”)衍生物的合成路线。图1A示出了DMHBI的合成路线。图1B示出了配基固定化的DMHBI。图1C示出了天然GFP荧光团晶体结构中的氨基酸残基与其周围的氨基酸残基的相互作用。
[0045] 图2A-2D说明非刚性结构的DMHBI没有荧光活性。图2A表明室温下将DMHBI溶解在乙醇中时，其无荧光活性。当降至77°K的乙醇玻璃态温度后，化合物DMHBI具有明显的荧光活性。图2B示出了以甘油浓度作为X轴和以总荧光强度作为Y轴的图。DMHBI的荧光发射强度随着甘油浓度的增加而提高。图2C示出了10μM DMHBI与HEK 293细胞孵化的显微照片。没有观测到DMHBI的非特异性荧光发射。图2D示出了10μM孔雀绿孵育与HEK 293细胞孵化的显微照片。可以观察到，由于孔雀绿的非特异性结合，细胞本身也出现了荧光。
[0046] 图3A-3C示出了筛选和鉴定可以与DMHBI结合并开启DMHBI荧光活性的适体的结果。图3A表明每一循环的SELEX后，适体库荧光强度值增加。X轴代表SELEX循环的数目，Y轴则代表适体库的总荧光强度值。图3B表示与特定的适体结合后的DMHBI的激发和发射光谱图，其中图示3-6表示DMHBI与SEQ ID NO：1所示序列的适体结合，图示13-2表示DMHBI与SEQ ID NO：2所示序列的适体结合。图3C示出了10μm DMHBI，10μm 13-2RNA(SEQ ID NO：1)，以及10μm DMHBI+13-2RNA分别进行紫外辐照处理后的荧光发射情况。结果表明，装有DMHBI+13-2RNA的管可观察到荧光。
[0047] 图4A-4B示出了37℃下自由能预测计算得到的DMHBI适体3-6(图4A，SEQ ID NO：1)和DMHBI适体13-2(图4B，SEQ ID NO：2)的全长二级结构。
[0048] 图5A-5B示出了DMHBI-结合适体的解离常数和熔解温度数据。在图5A中可以看到，随着DMHBI浓度的增加，测定得到的荧光强度值不断提高以形成结合曲线。3-6和13-2的解离常数(Kd)分别为400nM和500nM。图5B为13-2RNA的热变性曲线。
[0049] 图6A-6B示出了钾(图6A)和镁(图6B)的浓度对RNA-DMHBI复合物荧光活性的影响。
[0050] 图7示出了级联的DMHBI适体的荧光强度随着RNA适体重复序列数目的增加而增加。
[0051] 图8示出了预测得到的13-2极小化序列的二级结构，命名为“13-2-min”(SEQ ID NO：3)。
[0052] 图9A-9C表明亲和力成熟可以引起DMHBI适体的亮度和熔解温度增加。图9A示出了适体13-2和亲和力成熟的适体13-2-5的荧光光谱。图9B示出了适体13-2-5的热变性曲线。图9C示出了编码适体13-2-min的DNA克隆(SEQ ID NO：36所示核酸的第4-60核苷酸片段)和以下四个选自13-2掺杂文库的作用于DMHBI的亲和力成熟的克隆之间的可变区域的比对结果：SEQ ID NO：40所示核酸的第25-81核苷酸片段，命名为“13-2-5”；SEQ ID NO：37所示核酸的第25-81核苷酸片段，命名为“13-2-1”；SEQ ID NO：38所示核酸的第25-81核苷酸片段，命名为“13-2-3”；SEQ ID NO：39所示核酸的第25-81核苷酸片段，命名为“13-2-4”。图中也同时示出了可变区域的共有序列(SEQ ID NO：41)。
[0053] 图10为通 过预测 得到的13-2-5极 小化序 列的 二级结 构，命名 为“13-2-5-min”(SEQ ID NO：15)。
[0054] 图11A-11B示出了荧光团3，5-二氟-4-羟基-苯亚甲基-1，2-二甲基-咪唑-5-酮(“DFHBI”)的酚类(phenolic)pKa值降低。图11A示出了荧光团DFHBI的酚盐阴离子形式的结构。图11B示出了DFHBI的pKa曲线，通过以酚盐与酚的吸收光谱峰值的比例来测量。
[0055] 图12A-12D示出了RNA-DFHBI复合物特征。图12A为DFHBI同适体24-1形成的复合物的激发和发射光谱图。图12B为等摩尔量的三种复合物的亮度对比图，这三种复合物分别是适体与荧光团DFHBI、DMHBI和4-二甲基胺苯亚甲基-1，2-二甲基-咪唑啉-5-酮(“DMABI”)形成的复合物。图12C为等摩尔量的24-1-DFHBI复合物与EGFP的亮度对比图。图12D示出了适体24-1和适体24-2的镁依赖性。
[0056] 图13A-13C示出了结合DFHBI的适体可以识别酚盐形式的DFHBI。图13A为pH值分别在6、7和8时，DFHBI的吸收光谱图。图13B为pH值分别在6、7和8时，DFHBI-RNA复合物的激发光谱图。图13C示出了pH值分别在7和8时，跟DFHBI适体孵化的DMHBI的荧光。
[0057] 图14A-14B为预测得到的适体24-1(图14A，SEQ ID NO：17)和适体24-2(图14B，SEQ ID NO：18)的二级结构图。
[0058] 图15A-15B说明DFHBI-适体复合物在活细胞内具有荧光活性。图15A是表达sephadex适体的大肠杆菌细胞与DFHBI共孵化时，相位图和GFP滤片荧光图的叠加图。图15B是表达DFHBI适体的大肠杆菌细胞与DFHBI共孵化时，相和GFP滤片荧光图像的叠加图。
[0059] 图16为波长400nm光激发时，DMHBI：适体复合物的发射光谱图。该适体为2-4(SEQ ID NO：4)、23-11(SEQ ID NO：10)和17-3(SEQ ID NO：6)。该图说明可以根据用于结合荧光团的适体来设计适于每个荧光团的发射光谱。
[0060] 图17A-17B示出了所选的作用于DMABI的适体。图17A示出了DMABI的结构。图17B示出了DMABI在与适体15-1(SEQ ID NO：29)形成复合物后，其激发和发射光谱图。
[0061] 图18A-18D示出了所选的作用于2-羟基苯亚甲基-1，2-二甲基-咪唑啉-5-酮(“o-HBDI”)的适体。图18A示出了o-HBDI的结构。图18B示出了o-HBDI在与适体8-20(SEQ ID NO：23)形成复合物后，其激发和发射光谱图。图18C示出了2-羟基-4-二甲基胺-苯亚甲基-1，2-二甲基-咪唑啉-5-酮(“o-H-DMABI”)的结构。图18D示出了o-H-DMABI在与适体15-1(SEQ ID NO：29)形成复合物后，其激发和发射光谱图。
[0062] 图19A-19D示出了生物模拟N-肟荧光团的适体。图19A示出了现有技术中DsRed荧光团的结构。图19B示出了DsRed的发射光谱(源于Campbell等人，“A Monomeric Red Fluorescent Protein，”Proc.Nat′l Acad.Sci USA 99(12)：7877-7882(2002)，其全部内容通过引用方式并入本申请)。图19C示出了荧光团4-(3，5-二氟-4-羟基-苯亚甲基)-1-甲基-2-(O-甲基)肟基-咪唑啉-5-酮的结构。图19D示出了当存在作用于该分子的RNAs池时，该荧光团的发射光谱。
[0063] 图20A-20B示出了一种多价ATP传感器的设计过程。图20A示出了通过预测得到的适体24-1(SEQ ID NO：56)衍生物的二级结构，并鉴定出其有一个可替换的环和一个强茎。图20B示出了经过修饰的24-1：腺苷传感器结构(SEQ ID NO：32)，其中通过将G突变*为U( 标记)从而减弱了24-1的强茎，并且融合了功能性的ATP适体。
[0064] 图21A-21D示出了荧光团传感器的活性，该荧光团传感器基于24-1的框架结构并通过修饰使其包含了ATP适体和cGMP适体。图21A示出了SEQ ID NO：32的腺苷传感器的响应情况，此传感器识别ATP、ADP和AMP。图21B示出了ATP传感器(SEQ ID NO：31)的响应情况，此传感器特异性地识别三磷酸。图21C示出了SEQ ID NO：33序列所示的cGMP传感器的响应情况。图21D示出了不同传感器在加入分析物后，其相对荧光值的增加情况。
[0065] 图22A-22B示出了一种采用适体13-2的荧光ATP传感器的设计过程。图22A示出了适体13-2(取自mFOLD中的如SEQ ID NO：3所示核酸的4-60核苷酸结构，左图)是如何通过将其与之前所述的ATP-适体进行融合从而对其进行修饰(如右图所示结构)。ATP适体中的一个不稳定的茎通过茎A的入口点与13-2融合，生成SEQ ID NO：62所示的传感器。图22B确证融合的适体构建体可作为ATP依赖性的荧光传感器使用。在无ATP的条件下，即使存在DMHBI，适体也表现出很小的荧光发射(位置较低的曲线)。但是，在加入1mM的ATP后，荧光强度提高了将近30倍(位置较高的曲线)。ATP-结合ATP适体的摩尔荧光强度是13-2母本适体的20％，这说明ATP的结合能够明显地恢复传感器13-2部分的DMHBI结合性能。这些数据结果表明13-2可被用于设计其它分析物依赖的传感器。
[0066] 图23A-23B示出了用于开发新传感器而改进的SELEX方法。图23A示出了基于24-1框架结构的文库。其中N40代表在SEQ ID NO：56所示核酸的第39和40位核苷酸之间插入任意的或者选定的/扩增的40个核苷酸。图23B以示意图的形式示出了选择过程，据此选择可以与目标靶标特异性结合的新适体，选择依据是这些适体可特异性的将24-1适体结合到表面固定化的DFHBI荧光团上。
[0067] 图24A-24C示出了通过SELEX生成新传感器的能力。图24A以示意图的形式示出了开启传感器操作的基本模式。图24B确证在DFHBI存在的条件下，随着生物素量的增加，从SELEX分离出的生物素传感器池表现出靶标依赖性的荧光活性。图24C确证在DFHBI存在的条件下，随着NAD量的增加，从SELEX分离出的NAD传感器池表现出靶标依赖性的荧光活性。
[0068] 图25A-25B示出了一个包含流式细胞仪的TIRF检测系统以及由此检测系统得到的荧光发射图。在TIRF检测系统(图25A)中，光源通过玻片投射光线。玻片连接有流式细胞仪。玻片表面的荧光分子被激发，随后通过安装在下面(也就是与流式细胞仪相反的方向)的适宜的物镜、滤片和相机收集荧光。图25B示出了DMHBI荧光团在与NHS-活化的TIFR玻片通过氨基己基连接臂偶联后，并随后使用1nM的13-2灌注流式细胞仪后(左图)，DMHBI荧光团的荧光发射情况。由图可以看出，暴露于13-2适体时，会导致强烈的荧光信号。流式细胞仪用PBS灌注后，再使用1nM的tRNA进行灌注，导致相同DMHBI点处的荧光信号消失(右图)。这些结果显示了TIRF在检测微量的适体/荧光团复合物的效用。
[0069] 图26A-26C示出了一种用于活细胞的TIRF装置的开发情况。图26A是HEK 293细胞的图像，在该HEK 293细胞中，MS2结合蛋白使用绿色荧光蛋白标记(MBP-GFP)，并使用有或者没有N末端棕榈酰化的序列(palm)进行表达。MBP-GFP在加入palm序列后成为膜定位蛋白。图26B是裂解液的Westernblot图像，该裂解液来自于表达含有或者不含有palm序列的MBP-GFP构建体的细胞。首先将细胞进行裂解，并分成胞膜和胞浆两部分。下一步将胞膜和胞浆两部分用抗GFP的抗体分别进行Western blot评价。Palm序列(+Palm)使MBP-GFP更多的定位于胞膜。图26C是裂解液的Northern blot图像，该裂解液来自于Palm-MBP-GFP和适体24-1共感染的细胞，适体24-1含有或者不含有MS2RNA标记。首先将细胞进行裂解，并分成胞膜和胞浆两部分。下一步利用针对24-1序列的探针将胞膜和胞浆两部分分别进行Northern blot评价。由图可知，含有MS2标记的24-1的细胞中膜结合的24-1RNA的含量得到了增加。
[0070] 图27示出了将荧光RNAs固定于膜上来实现活细胞TIRF显微成像的方法。发明的详细说明
[0071] 本发明涉及新型荧光团，以及它们与新型核酸分子的组合应用，新型核酸分子又称为适体，其可以特异性的与荧光团结合，该适体与荧光团结合后能提高荧光团在适宜波长射线下的荧光信号。本发明还涉及新的荧光团、新的核酸分子以及它们的靶标分子之间形成的分子复合物，以及这些新材料的应用。荧光团及其合成
[0072] 根据本发明的一个方面，新的荧光团在取代的芳环系统和取代的咪唑啉(硫)酮、恶唑(硫)酮、吡咯啉(硫)酮或呋喃(硫)酮环之间包含有次甲基(又称为甲川)桥。重要的是，该次甲基桥包含一个碳原子，该碳原子与取代的咪唑啉(硫)酮、恶唑(硫)酮、吡咯啉(硫)酮或呋喃(硫)酮环上的碳原子形成双键。因此，本发明所得荧光团与现有技术的菁染料不同，后者的特征基团是包含一个聚甲基桥。
[0073] 本发明荧光团的特点在于，在没有结合适体的时候，它的量子产率(quantum yield)很低。优选地，在没有结合特异性的适体时，荧光团的量子产率低于约0.01，更优选，低于约0.001，最优选，低于约0.0001。
[0074] 除可以与特异性的适体结合外，荧光团基本上不能与其它分子结合。所述其它分子包括细胞或者样品中除适体分子以外的分子，适体分子是指具有可以结合荧光团所需要的多聚核苷酸序列的分子。
[0075] 荧光团优选具有水溶性、无毒，且具有细胞渗透性。优选地，荧光团能够以0.1M、1M的浓度溶解在水溶液中；更优选地，荧光团能够以10M的浓度溶解在水溶液中；最优选地，荧光团能够以50M的浓度溶解在水溶液中。优选地，在以上荧光团浓度下孵化细胞时不会影响细胞的存活率。荧光团优选能够通过主动扩散或者被动扩散从细胞膜或者细胞壁迁移至细胞的胞浆或者外周胞质。优选地，荧光团能够透过革兰氏阴性菌的外膜和内膜进行迁移，或者能够透过植物细胞的细胞壁和胞膜进行迁移，亦或者能够透过动物细胞的胞膜进行迁移。
[0076] 在本申请中，术语“提高荧光信号”或者“提高了的信号”(也就是，与特异性的适体结合后)是指，当暴露于适宜激发波长的射线时，荧光团的荧光量子产率的得到了增加，或者荧光信号的最大发射值被改变(相比于乙醇玻璃态时荧光团的最大发射值)，或者两者。量子产率的增加优选至少约1.5倍，更优选至少约5至10倍、至少约20至50倍，更优选至少约100至200倍。本发明还可以达到量子产率的增加倍数超过500倍，甚至1000倍。
[0077] 所述用于激发荧光团的射线可来源于任何适宜的光源，优选可以发射可见光谱或者红外光谱内的射线的光源。该激发射线可以直接来源于射线源(例如，光源)，或者间接来源于另一荧光团(例如，FRET供体荧光团)。关于FRET对的应用将在以下部分作进一步的讨论。
[0078] 本发明优选的荧光团包括以下通式I所示的化合物：其中，
Q为S或者O，
Y为O或者N，
Z为N或者C(H)，
Ar为一个芳环或者芳杂环系统，其包含一个或者两个环；
当Y为N时，R1代表C1-8的烃基或者-(CH2)n-R6，其中n为大于或等于1的整数；
R2为甲基，一卤代、二卤代或者三卤代甲基，肟基，邻甲基肟基，亚胺基，最多带有三个(R7-R9)取代基的取代的苯基或者未被取代的苯基，C2-8的不饱和烃基，该C2-8的不饱和烃基的末端可以可选地被以下基团取代：氨基、酰胺、羧酸、(甲基)丙烯酸酯、酯、烯酮、肟、邻甲基肟、亚胺、硝基甲烷、腈、酮、一卤、二卤、三卤、硝基、氰基、丙烯腈、丙烯腈-烯酮、丙烯腈-羧酸酯、丙烯腈-酰胺、或者第二个芳环或者芳杂环；
R3-R5分别任意地选自氢、羟基、烷基、烷氧基、氟、氯、溴、氨基、烷氨基、二烷氨基、硫烷基、氰基、巯基、硝基、一卤代、二卤代或者三卤代甲基、酮和羧酸；
R6为氢、表面活性基团、固相表面，或者是可以与固相表面上的活性基团相连接的官能团；和
R7-R9分别任意地选自氢、羟基、烷基、烷氧基、氟、氯、溴、氨基、烷氨基、二烷氨基、硫烷基、氰基、巯基、硝基、一卤代、二卤代或者三卤代甲基、酮和羧酸。
Q为S或者O，
Y为O或者N，
Z为N或者C(H)，
Ar为一个芳环或者芳杂环系统，其包含一个或者两个环；
当Y为N时，R1代表C1-8的烃基或者-(CH2)n-R6，其中n为大于或等于1的整数；
R2为甲基，一卤代、二卤代或者三卤代甲基，肟基，邻甲基肟基，亚胺基，最多带有三个(R7-R9)取代基的取代的苯基或者未被取代的苯基，C2-8的不饱和烃基，该C2-8的不饱和烃基的末端可以可选地被以下基团取代：氨基、酰胺、羧酸、(甲基)丙烯酸酯、酯、烯酮、肟、邻甲基肟、亚胺、硝基甲烷、腈、酮、一卤、二卤、三卤、硝基、氰基、丙烯腈、丙烯腈-烯酮、丙烯腈-羧酸酯、丙烯腈-酰胺、或者第二个芳环或者芳杂环；
R3-R5分别任意地选自氢、羟基、烷基、烷氧基、氟、氯、溴、氨基、烷氨基、二烷氨基、硫烷基、氰基、巯基、硝基、一卤代、二卤代或者三卤代甲基、酮和羧酸；
R6为氢、表面活性基团、固相表面，或者是可以与固相表面上的活性基团相连接的官能团；和
R7-R9分别任意地选自氢、羟基、烷基、烷氧基、氟、氯、溴、氨基、烷氨基、二烷氨基、硫烷基、氰基、巯基、硝基、一卤代、二卤代或者三卤代甲基、酮和羧酸。
[0080] 表面活性基团是指，羧酸(其可以通过碳二亚胺进行修饰，从而可以与胺进行反应)、NHS酯、亚胺酸酯、PFP酯、p-硝基苯酯、羟甲基磷、马来酰亚胺、卤代乙酰基团、卤代乙酰胺基团、乙烯砜、酰肼、异氰酸酯、环氧乙烷、环氧化物、巯基、胺、炔基、叠氮化物、酸酐、磺酰氯、酰氯、二甲亚胺、混合的二硫化物、激活的二硫化物，或者硫代亚磺酸酯。可以与固相表面的活性基团相连接的官能团，意指任何具有反应活性的基团，包括但不限于以下基团：羧基、氨基、巯基、醛基、羟基，或者任何适于以上所列表面活性基团的官能团。
[0081] 本发明所涉及的化合物还包含盐类，尤其是酚盐。
[0082] 通式I所示化合物范围内的有些化合物是已知化合物，在此将这些化合物从本申请创新化合物的范围中排除出去，但是这些化合物仍在本申请创新的分子复合物以及它们应用的范围内。这些化合物包含Ar为苯基，且Z和Y为N时的部分化合物。对于这些化合物，(i)R3-R5不同时为氢；(ii)当R1和R2为甲基，R4和R5为氢时，R3不为羟基、甲氧基和二甲基氨基；(iii)当R1为甲基，R4和R5为氢，R3为羟基时，R2不为共轭烃链。此外，本申请中所涉及的通式I所示化合物排除以下文献资料中所公开的化合物：He等人，“Synthesis and Spectroscopic Studies of Model Red Fluorescent Protein Chromophores，”Org.Lett.4(9)：1523-26(2002)；You 等人，“Fluorophores Related to the Green Fluorescent Protein and Their Use in Optoelectornic Devices，”Adv.Mater.12(22)：1678-81(2000)；Bourotte等人，“Fluorophores Related to the Green Fluorescent Protein，”Tetr.Lett.45：6343-6348(2004)。这些文献资料的全部内容均通过引用方式引入到本申请中。
[0083] 含有恶唑酮环的荧光团组成荧光团的一个子类，其包括如下通式Ia所示结构的化合物：其中，Ar以及R2至R6的定义与上文所列相同。
[0084] 通式Ia所示结构的化合物可通过如下路线A或者路线B进行制备。路线A
路线A所示的制备方法可通过使用不同的起始原料来进行优化，但是从本质上来
说，该路线制备方法是按照文献Kojima等人，“Fluorescent Properties of Model Chromophores of Tyrosine-66 Substituted Mutants of Aequorea Green Fluorescent Protein(GFP)，”Tet.Lett.39：5239-5242(1998)所描述的方法进行，该文献的全部内容通过引用方式并入到本申请中。基本上，该路线制备方法包括，在甘氨酸的R2-芳香N衍生物和芳香醛之间形成Erlenmeyer氮杂内酯环的过程。甘氨酸R2-芳香N衍生物可通过Sigma Chemical和其它试剂公司等商业来源获得，或者还可以通过简便的合成自制获得，自制合成甘氨酸R2-芳香N衍生物需首先将甘氨酸的氨基转化为酰氯或者羧酸(参见文献He等人，“Synthesis and Spectroscopic Studies of Model Red Fluorescent Protein Chromophores，”Org.Lett.4(9)：1523-1526(2002)，该文献的全部内容通过引用方式结合到本申请)。同时，许多取代或者未经取代的芳香醛也可通过Sigma Chemical和其它试剂公司等商业来源获得，或者通过简易的合成获得。
路线B
按照路线B所示，通过将芳香醛与马尿酸(或者马尿酸的苯环衍生物)反应得到通
式Ia所示结构的化合物，其中R2为苯环或者取代的苯环。路线B所示方法的反应条件与路线A所示方法的反应条件基本相同(参见文献Follenius-Wund等人，“Fluorescent Derivatives of the GFP Chromophore Give a New Insight into the GFP Fluorescence Process，”Biophysical Journal 85(3)：1839-1850(2003)，该文献的全部内容通过引用方式结合到本申请中)。基本上，路线B与路线A所示方法的不同点在于，在路线B中，取代或者未经取代的马尿酸代替路线A中的原料甘氨酸R2-芳香N衍生物成为反应原料，经此反应原料与芳香醛反应得到通式Ia所示结构的化合物。马尿酸衍生物可使用其对应酸的酰氯合成。可替换地，苯亚甲基咪唑啉酮可通过苯甲醛和(取代的)苯甲酰基甘氨酸反应获得，而(取代的)苯甲酰基甘氨酸可通过甘氨酸与相应的酰氯反应来制备。
路线A所示的制备方法可通过使用不同的起始原料来进行优化，但是从本质上来
说，该路线制备方法是按照文献Kojima等人，“Fluorescent Properties of Model Chromophores of Tyrosine-66 Substituted Mutants of Aequorea Green Fluorescent Protein(GFP)，”Tet.Lett.39：5239-5242(1998)所描述的方法进行，该文献的全部内容通过引用方式并入到本申请中。基本上，该路线制备方法包括，在甘氨酸的R2-芳香N衍生物和芳香醛之间形成Erlenmeyer氮杂内酯环的过程。甘氨酸R2-芳香N衍生物可通过Sigma Chemical和其它试剂公司等商业来源获得，或者还可以通过简便的合成自制获得，自制合成甘氨酸R2-芳香N衍生物需首先将甘氨酸的氨基转化为酰氯或者羧酸(参见文献He等人，“Synthesis and Spectroscopic Studies of Model Red Fluorescent Protein Chromophores，”Org.Lett.4(9)：1523-1526(2002)，该文献的全部内容通过引用方式结合到本申请)。同时，许多取代或者未经取代的芳香醛也可通过Sigma Chemical和其它试剂公司等商业来源获得，或者通过简易的合成获得。
路线B
按照路线B所示，通过将芳香醛与马尿酸(或者马尿酸的苯环衍生物)反应得到通
式Ia所示结构的化合物，其中R2为苯环或者取代的苯环。路线B所示方法的反应条件与路线A所示方法的反应条件基本相同(参见文献Follenius-Wund等人，“Fluorescent Derivatives of the GFP Chromophore Give a New Insight into the GFP Fluorescence Process，”Biophysical Journal 85(3)：1839-1850(2003)，该文献的全部内容通过引用方式结合到本申请中)。基本上，路线B与路线A所示方法的不同点在于，在路线B中，取代或者未经取代的马尿酸代替路线A中的原料甘氨酸R2-芳香N衍生物成为反应原料，经此反应原料与芳香醛反应得到通式Ia所示结构的化合物。马尿酸衍生物可使用其对应酸的酰氯合成。可替换地，苯亚甲基咪唑啉酮可通过苯甲醛和(取代的)苯甲酰基甘氨酸反应获得，而(取代的)苯甲酰基甘氨酸可通过甘氨酸与相应的酰氯反应来制备。
[0085] 通式Ia所示结构的化合物，也可以通过使用目标芳香甘氨酸在R2位引入共轭的烃基侧链，而所需的芳香甘氨酸可通过相应的酰氯来制备获得。
[0086] 含有咪唑酮环的荧光团组成荧光团的另一个子类，其包括如下通式Ib所示结构的化合物：其中，Ar以及R1至R6的定义与上文所列相同。此类化合物可通过如下路线C的方法，利用通式Ia所示结构的化合物与伯胺反应制得：
路线C
基本上，通式Ia所示结构的化合物，其氮杂内酯环在碱性条件下，经胺解和环化生成终产物，即通式Ib所示结构的化合物。
路线C
基本上，通式Ia所示结构的化合物，其氮杂内酯环在碱性条件下，经胺解和环化生成终产物，即通式Ib所示结构的化合物。
[0087] 此类化合物其相应的恶唑硫酮也可通过上述路线C所示制备恶唑酮的方法制备，其区别仅在于后者使用的反应原料甘氨酸衍生物在结构上带有一个硫氰酸，而不是一个羧酸或者一个巯基马尿酸(Ya等人，“Cyclization of Thiohippuric Acid in the Presence of a Vilsmeier reagent，”Khimiya Geterotsiklicheskikh Soedinenii 1：36-9(1980)，该文献的全部内容通过引用方式结合到本申请中)。恶唑硫酮亦可通过路线C所示的方法转化为相应的咪唑啉硫酮。作为替代地，在适当的条件下，使用P2S5可以将恶唑酮和咪唑酮的酮基转化为硫酮(参见文献Badr等人，Indian J.Chem.，Section B：Organic Chemistry Including Medicinal Chemistry，vol.18B(3)，240-242(1979)，该文献的全部内容通过引用方式结合到本申请中)。
[0088] 含有呋喃酮环的荧光团组成荧光团的另一个子类，其包括如下通式Ic所示结构的化合物：其中，Ar以及R2至R6的定义与上文所列相同。此类化合物可通过与路线A所示方法相似的方法制备，其区别在于，在使用与路线A基本相同的条件制备此类化合物时，原路线A方法的反应原料甘氨酸的R2-芳香N衍生物被替换为R2-芳香丙酸(参见文献Bourotte等人，“Fluorophores Related to the Green Fluorescent Protein，”Tetr.Lett.45：
6343-6348(2004)，该文献的全部内容通过引用方式结合到本申请中)。
6343-6348(2004)，该文献的全部内容通过引用方式结合到本申请中)。
[0089] 含有吡咯啉酮环的荧光团组成荧光团的另一个子类，其包括如下通式Id所示结构的化合物：其中，Ar以及R1至R6的定义与上文所列相同。该类化合物可通过通式Ic所示结构的化合物与醋酸铵在浓氨水下反应制得(参见文献Bourotte等人，“Fluorophores Related to the Green Fluorescent Protein，”Tetr.Lett.45：6343-6348(2004)，该文献的全部内容通过引用方式结合到本申请中)。
[0090] 此类化合物其相应的呋喃硫酮也可通过上述路线所示制备呋喃酮的方法制备，其区别在于，后者使用的反应原料丙酸衍生物在结构上带有硫氰酸基团，而非羧酸基团。作为替代地，在适当的条件下，使用P2S5可以将呋喃酮和吡咯啉酮的酮基转化为硫酮(参见文献Badr等人，Indian J.Chem.，Section B：Organic Chemistry Including Medicinal Chemistry，vol.18B(3)，240-242(1979)，该文献的全部内容通过引用方式结合到本申请中)。吡咯啉硫酮亦可通过路线C所示的方法转化为相应的咪唑啉硫酮。
[0091] 化合物的进一步多样化可通过利用二氧化硒(二氧己环回流)将通式I结构所示化合物的R2甲基基团转化为醛基基团来实现。反应得到的醛可进一步通过Wittig反应转化为C2-8不饱和烃，优选地转化为共轭烃。基本上，在强碱条件下，将反应得到的醛与三苯基膦反应(例如Ph3P＝R10，其中的R10为不饱和烃)。Wittig反应试剂中存在的不饱和烃，可选择地用任意目标的官能团进行末端取代，优选的官能团是：氨基、酰胺、羧酸、(甲基)丙烯酸酯、酯、烯酮、肟、邻甲基肟、亚胺、硝基甲烷、腈、酮、一卤、二卤、三卤、硝基、氰基、丙烯腈、丙烯腈-烯酮、丙烯腈-羧酸酯、丙烯腈-酰胺，或者第二个芳环或芳杂环。这些试剂均可通过商业购买获得或者由本领域技术人员通过简易的合成获得。可替换地，反应得到的醛可与羟胺或者甲氧胺衍生物继续反应，具体的反应步骤可参考文献Maly等人，“Combinatorial Target-guided Ligand Assembly：Identification of Potent Subtype-selective c-Src Inhibitors，”Proc Natl Acad Sci USA 97(6)：2419-24(2002)，该文献的全部内容通过引用方式结合到本申请中(参见下面通式IIIa和IIIb所示结构的化合物)。醛还可与硝基甲烷反应，形成丙烯腈基团，此反应具体步骤可参考已有文献(参见文献Muratore等人，“Enantioselective Bronsted Acid-catalyzed N-acyliminium Cyclization Cascades，”J Am Chem Soc 131(31)：10796-7(2009)；
Crowell and Peck，J.Am.Chem.Soc.75：1075(1953)，该文献的全部内容通过引用方式结合到本申请中)。此外，醛还可以与亲核的含氰基分子发生Knoevenagel缩合反应，得到含有不同官能团的丙烯腈基团，这些亲核的含氰基分子如2-氰乙酰胺、丙二腈氰乙酸甲酯、氰基乙酸等(，该文献的全部内容通过引用方式结合到本申请中)。
Crowell and Peck，J.Am.Chem.Soc.75：1075(1953)，该文献的全部内容通过引用方式结合到本申请中)。此外，醛还可以与亲核的含氰基分子发生Knoevenagel缩合反应，得到含有不同官能团的丙烯腈基团，这些亲核的含氰基分子如2-氰乙酰胺、丙二腈氰乙酸甲酯、氰基乙酸等(，该文献的全部内容通过引用方式结合到本申请中)。
[0092] 可替换地，R2位甲基可被一卤代、二卤代或者三卤代甲基所取代。卤素取代的乙酰胺十分易得，并且与芳香醛有很强的反应活性。
[0093] 在通式I所示结构的化合物(包括通式Ia-Id结构所示的化合物)中，除了以上指出的Ar为苯基的情况外，Ar还可以是任意的单环或者多环(包括稠环)结构。优选的Ar基团包括取代的苯环、萘环、吡啶环、嘧啶环、吡咯环、呋喃环、苯并呋喃环、噻吩环、苯并噻吩环、噻唑环、苯并噻唑环、咪唑环、苯并咪唑环、恶唑环、苯并恶唑环、嘌呤环、吲哚环、喹啉环、色酮环或者香豆素环。这些Ar基团的取代基可以是一种或者多种以下基团：羟基、烷基、烷氧基、氟、氯、溴、氨基、烷氨基、二烷氨基、硫烷基、氰基、巯基、硝基、一卤代、二卤代或者三卤代甲基、酮和羧酸。封端R2基团的芳基或者芳杂基也可以是任一以上所提及的Ar基团。
[0094] 通式Ib所示的化合物类别中的一类优选化合物是，通式II所示的三取代苯亚甲基咪唑酮：其中，X为氟、氯或者溴，R1和R2的
定义与通式I中的相同。通式II所示结构代表的化合物中，R1优选为甲基、乙基、或者(CH2)6-NH2，R2为甲基、肟基或者邻甲基肟基。通式Ib所示的化合物类别中的另一类优选化合物是，通式IIIa和IIIb所示的化合物，其中R2为肟基和邻甲基肟基：
(IIIa) (IIIb)
其中，R1和R2-R5的定义与通式I中的相同。制备得到的示例性荧光团如下所示，其在无适体结合的条件下表现出较低的量子产率：
4-(3，4，5-三甲氧基苯亚甲基)-1，2-二甲基-咪唑-5-酮(“TMBI”)；
4-(4-羟基-3，5-二甲氧基苯亚甲基)-1，2-二甲基-咪唑-5-酮(“DMHBI”)；
4-(3，5-二氟-4-羟基苯亚甲基)-1，2-二甲基-咪唑-5-酮(“DFHBI”)
4-(3，5-二氟-4-羟基-苯亚甲基)-1-甲基-2-(O-甲基)肟基-咪唑啉-5-酮；
4-(3，5-二氯-4-羟基苯亚甲基)-1，2-二甲基-咪唑-5-酮；
4-(3，5-二溴-4-羟基苯亚甲基)-1，2-二甲基-咪唑-5-酮；
4-(2-羟基苯亚甲基)-1，2-二甲基-咪唑-5-酮(“o-HBI”)；
4-(2-甲氧基苯亚甲基)-1，2-二甲基-咪唑-5-酮；
4-(3-氟-4-羟基-5-甲氧基苯亚甲基)-1，2-二甲基-咪唑-5-酮；
4-(4-(二甲基氨基)苯亚甲基)-1，2-二甲基-咪唑-5-酮(“DMABI”)；
4-(4-(t-硫丁基)苯亚甲基)-1，2-二甲基-咪唑-5-酮；
4-(4-(甲硫基)苯亚甲基)-1，2-二甲基-咪唑-5-酮；
4-(4-氰基苯亚甲基)-1，2-二甲基-咪唑-5-酮；
4-(3，5-二氟-4-乙酸酯)苯亚甲基-1，2-二甲基-咪唑-5-酮；
4-(4-羟基-3-硝基苯亚甲基)-1，2-二甲基-咪唑-5-酮；
4-(4-羟基-3-甲氧基-5-硝基苯亚甲基)-1，2-二甲基-咪唑-5-酮；
4-(4-甲氧基-3-硝基苯亚甲基)-1，2-二甲基-咪唑-5-酮；
4-(4-溴苯亚甲基)-1，2-二甲基-咪唑-5-酮；
4-(4-氯苯亚甲基)-1，2-二甲基-咪唑-5-酮；
4-(4-羟基苯亚甲基)-1，2-二甲基-咪唑-5-酮(“p-HBI”)；
4-((吲哚-7-基)亚甲基)-1，2-二甲基-咪唑-5-酮；
4-((吲哚-3-基)亚甲基)-1，2-二甲基-咪唑-5-酮；
4-((吲哚-3-基)亚甲基)-1-甲基-2-苯基-咪唑-5-酮；
4-(4-羟基-3，5-二甲氧基苯亚甲基)-1-甲基-2-苯基-咪唑-5-酮；
4-(4-(二甲基氨基)苯亚甲基)-1-甲基-2-苯基-咪唑-5-酮；
4-(4-羟基苯亚甲基)-2-乙酰基-1-甲基-咪唑-5-酮；
4-(4-羟基苯亚甲基)-1-甲基-2-丙-1-烯基-咪唑-5-酮；
3-(4-(4-羟基苯亚甲基)-4，5-二氢-1-甲基-5-氧代-咪唑-2-基)丙烯酰胺；
3-(4-(4-羟基苯亚甲基)-4，5-二氢-1-甲基-5-氧代-咪唑-2-基)丙烯酸；和
甲基3-(4-(4-羟基苯亚甲基)-4，5-二氢-1-甲基-5-氧代-咪唑-2-基)丙烯酸酯。
定义与通式I中的相同。通式II所示结构代表的化合物中，R1优选为甲基、乙基、或者(CH2)6-NH2，R2为甲基、肟基或者邻甲基肟基。通式Ib所示的化合物类别中的另一类优选化合物是，通式IIIa和IIIb所示的化合物，其中R2为肟基和邻甲基肟基：
(IIIa) (IIIb)
其中，R1和R2-R5的定义与通式I中的相同。制备得到的示例性荧光团如下所示，其在无适体结合的条件下表现出较低的量子产率：
4-(3，4，5-三甲氧基苯亚甲基)-1，2-二甲基-咪唑-5-酮(“TMBI”)；
4-(4-羟基-3，5-二甲氧基苯亚甲基)-1，2-二甲基-咪唑-5-酮(“DMHBI”)；
4-(3，5-二氟-4-羟基苯亚甲基)-1，2-二甲基-咪唑-5-酮(“DFHBI”)
4-(3，5-二氟-4-羟基-苯亚甲基)-1-甲基-2-(O-甲基)肟基-咪唑啉-5-酮；
4-(3，5-二氯-4-羟基苯亚甲基)-1，2-二甲基-咪唑-5-酮；
4-(3，5-二溴-4-羟基苯亚甲基)-1，2-二甲基-咪唑-5-酮；
4-(2-羟基苯亚甲基)-1，2-二甲基-咪唑-5-酮(“o-HBI”)；
4-(2-甲氧基苯亚甲基)-1，2-二甲基-咪唑-5-酮；
4-(3-氟-4-羟基-5-甲氧基苯亚甲基)-1，2-二甲基-咪唑-5-酮；
4-(4-(二甲基氨基)苯亚甲基)-1，2-二甲基-咪唑-5-酮(“DMABI”)；
4-(4-(t-硫丁基)苯亚甲基)-1，2-二甲基-咪唑-5-酮；
4-(4-(甲硫基)苯亚甲基)-1，2-二甲基-咪唑-5-酮；
4-(4-氰基苯亚甲基)-1，2-二甲基-咪唑-5-酮；
4-(3，5-二氟-4-乙酸酯)苯亚甲基-1，2-二甲基-咪唑-5-酮；
4-(4-羟基-3-硝基苯亚甲基)-1，2-二甲基-咪唑-5-酮；
4-(4-羟基-3-甲氧基-5-硝基苯亚甲基)-1，2-二甲基-咪唑-5-酮；
4-(4-甲氧基-3-硝基苯亚甲基)-1，2-二甲基-咪唑-5-酮；
4-(4-溴苯亚甲基)-1，2-二甲基-咪唑-5-酮；
4-(4-氯苯亚甲基)-1，2-二甲基-咪唑-5-酮；
4-(4-羟基苯亚甲基)-1，2-二甲基-咪唑-5-酮(“p-HBI”)；
4-((吲哚-7-基)亚甲基)-1，2-二甲基-咪唑-5-酮；
4-((吲哚-3-基)亚甲基)-1，2-二甲基-咪唑-5-酮；
4-((吲哚-3-基)亚甲基)-1-甲基-2-苯基-咪唑-5-酮；
4-(4-羟基-3，5-二甲氧基苯亚甲基)-1-甲基-2-苯基-咪唑-5-酮；
4-(4-(二甲基氨基)苯亚甲基)-1-甲基-2-苯基-咪唑-5-酮；
4-(4-羟基苯亚甲基)-2-乙酰基-1-甲基-咪唑-5-酮；
4-(4-羟基苯亚甲基)-1-甲基-2-丙-1-烯基-咪唑-5-酮；
3-(4-(4-羟基苯亚甲基)-4，5-二氢-1-甲基-5-氧代-咪唑-2-基)丙烯酰胺；
3-(4-(4-羟基苯亚甲基)-4，5-二氢-1-甲基-5-氧代-咪唑-2-基)丙烯酸；和
甲基3-(4-(4-羟基苯亚甲基)-4，5-二氢-1-甲基-5-氧代-咪唑-2-基)丙烯酸酯。
[0097] 如果荧光团的细胞通透性不佳，可通过对酚结构进行酰化来提高其细胞通透性，酚结构的酰化不会影响荧光团的荧光活性，因为形成的酰基基团可快速的被细胞内的酯酶酶切降解(Carrigan等人，“The Engineering of Membrane-permeable Peptides，”Anal Biochem.341：290-298(2005)，该文献的全部内容通过引用方式结合到本申请中)。对于一些低细胞通透性的荧光团，其O-酰基的形成一般可通过将荧光团与适当的酰氯反应来实现，例如肉豆蔻酰氯、辛酰氯或者丁酰氯。当形成的酰基基团没有立即被酶切降解时，则它们可能在事实上会提高各种RNA-荧光团复合物的荧光强度。适体
[0098] 本发明还涉及在本领域中称为适体的核酸分子。适体是一类单链核酸分子，其二级结构可以具有一个或者多个茎(即碱基互补区域)，以及一个或者多个沿着茎方向的非碱基互补区域。这些非碱基互补区域可以沿着茎方向以凸出或者环(例如内环)的形式存在和/或者在一个或多个茎的末端以环的形式存在(例如发夹环)。这些核酸适体具有特异性的与特定分子结合的能力，其通过某种相互作用与相应的靶标分子非共价结合，例如静电引力、偶极相互作用、氢键、范德华力、静电相互作用、堆积相互作用或者以上各种相互作用的任意结合等。
[0100] 鉴定适宜的核酸适体通常包括从核酸分子池或者文库中选择出能够与特定靶标分子结合，并且具有高亲和力(例如Kd＜500nM)和结合特异性的适体，供选择的核酸分子池或者文库中的核酸包含长度可变化的或者是确定的随机区域。例如，在本发明中鉴定适宜的核酸适体可以采用现有的体外选择和扩增方法，即SELEX方法来实现。SELEX方法的具体步骤在以下文献中有详细描述：Gold等人申请的第5,270,163号美国专利；文 献 Ellington and Szostak，“In Vitro Selection of RNA Molecules that Bind Specific Ligands，”Nature 346：818-822(1990)；以及文献Tuerk and Gold，“Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment：RNA Ligands to Bacteriophage T4 DNA Polymerase，”Science 249：505-510(1990)，以上文献的全部内容均通过引用方式结合到本申请中。一种已知的模板-引物系统(Bartel等人.，“HIV-1 Rev Regulation Involves Recognition of Non-Watson-Crick Base Pairs in Viral RNA，”Cell 67：
529-536(1991)，该文献的全部内容通过引用方式结合到本申请中)可用来生成RNA分子，所得的RNA分子在其5’恒定区和3’恒定区之间有一段由38-40个随机碱基组成的的区域。
529-536(1991)，该文献的全部内容通过引用方式结合到本申请中)可用来生成RNA分子，所得的RNA分子在其5’恒定区和3’恒定区之间有一段由38-40个随机碱基组成的的区域。
[0101] 合成的寡聚核苷酸模板可通过聚合酶链式反应(“PCR”)进行扩增，进而转录生成最初的RNA池。假设10％的RNA分子无阻断双链合成和转录的化学损伤，则该RNA池13
将会包含大于3x 10 个不同的序列。尽管还有其它的适宜方法可以使用，但因为滤过结合(filter binding)可以应用于大部分蛋白靶标，所以可以用它作为区分装置。将所选的初级RNA适体克隆到任意常规的子克隆载体，然后利用任意的双脱氧法类方法进行测序。其次，每个初级RNA适体的二级结构都可利用例如MulFold或者mFOLD等计算机程序进行预测(文献Jaeger等人，“Improved Predictions of Secondary Structures for RNA，”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：7706-7710(1989)，和文献Zuker，“On Finding All Suboptimal Foldings of an RNA Molecule，”Science 244：48-52(1989)，以上每篇文献的全部内容均通过引用方式结合到本申请中)。为了定位RNA适体及其靶标上的结合位点以及进一步提高适体的结合亲和力，可通过制备替换或者缺失突变体的方法进行突变研究，如本申请相应实施例所记载。
将会包含大于3x 10 个不同的序列。尽管还有其它的适宜方法可以使用，但因为滤过结合(filter binding)可以应用于大部分蛋白靶标，所以可以用它作为区分装置。将所选的初级RNA适体克隆到任意常规的子克隆载体，然后利用任意的双脱氧法类方法进行测序。其次，每个初级RNA适体的二级结构都可利用例如MulFold或者mFOLD等计算机程序进行预测(文献Jaeger等人，“Improved Predictions of Secondary Structures for RNA，”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：7706-7710(1989)，和文献Zuker，“On Finding All Suboptimal Foldings of an RNA Molecule，”Science 244：48-52(1989)，以上每篇文献的全部内容均通过引用方式结合到本申请中)。为了定位RNA适体及其靶标上的结合位点以及进一步提高适体的结合亲和力，可通过制备替换或者缺失突变体的方法进行突变研究，如本申请相应实施例所记载。
[0102] 进一步优化SELEX实验所得到的适体从而获得性能改进后的第二代适体(文献Eaton 等 人，“Post-SELEX Combinatorial Optimization of Aptamers，”Bioorg.Med.Chem.5：1087-1096(1997)，该文献的全部内容通过引用方式结合到本申请中)。如相应实施例中所示，对初级SELEX克隆进行一轮亲和力成熟培养可以产生五个适体，每个适体相比原来的适体都具有更高的荧光活性和更高的量子产率，其中最佳适体的荧光活性和量子产率可以达到原来适体的两倍。因此，在使用适体进行细胞类的实验之前，可以先针对以下方面对适体进行优化：·寻找SELEX克隆中最小的适体序列，以鉴定出有关于亲和力成熟的结构域。这种优化方法可以得到更理想，更小的适体，而这种适体将更有利于标记RNAs。
·更重要的是确定，适体是否对目标荧光团具有选择性，或者适体是否会跟结合其它适体的荧光团相结合。具有交叉反应活性的荧光团，在涉及包含两个RNA-荧光团复合物的双色成像实验中是个问题。
·适体-荧光团复合物的荧光活性需要通过亲和力成熟手段来进行优化。这可以避免不期望的感染或者FRET。
·此外，相比于使用单一适体标记RNA，使用多联(multiple tandem)适体标记RNA可提高所标记的RNA的荧光活性。应尽可能使适体标记不对适体与特定荧光团或者目标靶标分子特异性结合的能力受到影响。
·更重要的是确定，适体是否对目标荧光团具有选择性，或者适体是否会跟结合其它适体的荧光团相结合。具有交叉反应活性的荧光团，在涉及包含两个RNA-荧光团复合物的双色成像实验中是个问题。
·适体-荧光团复合物的荧光活性需要通过亲和力成熟手段来进行优化。这可以避免不期望的感染或者FRET。
·此外，相比于使用单一适体标记RNA，使用多联(multiple tandem)适体标记RNA可提高所标记的RNA的荧光活性。应尽可能使适体标记不对适体与特定荧光团或者目标靶标分子特异性结合的能力受到影响。
[0103] 如果观测到任何交叉反应，则可以制备一个掺杂文库，使用该文库进行“阴性选择”，又称作“反向SELEX”。已有大量的研究先例表明，阴性选择对适体具有高选择性，甚至可以从密切相关的分子中选择出适体(参见文献Tuerk等人，“Using the SELEX Combinatorial Chemistry Process to Find High Affinity Nucleic Acid Ligands to Target Molecules，”Methods Mol Biol.67：219-230(1997)；Rink等 人，“Creation of RNA Molecules that Recognize the Oxidative Lesion 7，8-dihydro-8-hydroxy-2′-deoxyguanosine(8-oxodG)in DNA，”Proc Natl Acad Sci USA 95：11619-11624(1998)；Haller 等 人，“In vitro Selection of a 7-Methyl-guanosine Binding RNA that Inhibits Translation of Capped mRNA Molecules，”Proc Natl Acad Sci USA 94：
8521-8526(1997)；Edwards等人，“DNA-oligonucleotide Encapsulating Liposomes as a Secondary Signal Amplification Means，”Anal Chem.79：1806-1815(1997)；以上每一篇文献的全部内容均通过引用方式结合到本申请中)。为实现阴性选择，可以对与染料-琼脂糖结合的RNAs进行清洗处理，清洗所用的缓冲液包含有其它荧光团。这一过程可以除去那些具有不想要的交叉反应活性的适体。剩下的仍然结合在琼脂糖柱上的RNAs将在接下来的步骤中使用目标荧光团将其洗脱下来，洗脱下来的RNAs使用经典的SELEX方法进行扩增。重复上述步骤，直到获得的克隆不会结合和激活非期望的荧光团产生荧光为止。
8521-8526(1997)；Edwards等人，“DNA-oligonucleotide Encapsulating Liposomes as a Secondary Signal Amplification Means，”Anal Chem.79：1806-1815(1997)；以上每一篇文献的全部内容均通过引用方式结合到本申请中)。为实现阴性选择，可以对与染料-琼脂糖结合的RNAs进行清洗处理，清洗所用的缓冲液包含有其它荧光团。这一过程可以除去那些具有不想要的交叉反应活性的适体。剩下的仍然结合在琼脂糖柱上的RNAs将在接下来的步骤中使用目标荧光团将其洗脱下来，洗脱下来的RNAs使用经典的SELEX方法进行扩增。重复上述步骤，直到获得的克隆不会结合和激活非期望的荧光团产生荧光为止。
[0104] 还可以通过在重复选择(re-selection)期间的所有步骤中使用严格的冲洗条件的方式来完成对适体的优化，这些严格的冲洗条件包括使用高温(37℃或者45℃)冲洗缓冲液、温和的变性剂、低盐和高盐含量的洗涤剂等。由于量子产率可以反应RNA在构象上固定激发态荧光团的效率，RNA适体与荧光团结合的越紧密则量子产率越高，也即RNA-荧光团复合物的荧光活性越强。此处所建议的严格的冲洗条件是为了能够选择出与荧光团更加紧密结合的适体，从而提高量子产率。选择出能够与荧光团具有更高亲和力的RNA适体的其它的好处在于，在活细胞实验中需要较低的荧光团浓度，因为较低的荧光团浓度可以降低荧光团本身潜在的脱靶或者细胞毒性。因为多数与小分子结合的适体，其结合时的亲和力较为温和，即一般Kd值要大于10nM(参见文献Famulok等人，“Nucleic Acid Aptamers-from Selection in vitro to Applications in vivo，”Accounts of Chemical Research 33：591-599(2000)，此文献的全部内容通过引用结合到本申请中)，所以可以认为上述较高的亲和力不会影响其对光漂泊的耐受力。
[0105] 另一种优化方法是在掺杂过程中使用更小的偏差。例如，文库可以使用2∶1∶1∶1的掺杂比例来代替5∶1∶1∶1的掺杂比例。这一方法可以获得更多个
与母体适体存在实质性差异的文库成员。
与母体适体存在实质性差异的文库成员。
[0106] 也可以对SELEX方法进行改进，从而使得可以通过选择性地区分适体池的方式来鉴定出具有结合亲和力的适体所组成的池。上述改进方法已经详细记载在Shi等人申请公开号为2004/0053310的美国专利，该专利的全部内容通过引用方式结合到本申请中。
[0107] 单链DNA适体在体外应用时更有优势，因为其更易于合成且具有更强的稳定性。最近的研究表明，适当的缓冲条件以及对RNA分子中糖环的一定修饰可以使得RNAs更稳定(参见文献Osborne等人.，“Aptamers as Therapeutic and Diagnostic Reagents：
Problems and Prospects，”Curr Opin Chem Biol.1：5-9(1997)；Faria等人.，“Sugar Boost：When Ribose Modifications Improve Oligonucleotide Performance，”Current Opinion in Molecular Therapeutics 10：168-175(2008)，以上每一篇文献的全部内容均通过引用方式结合到本申请中)。此外，在添加适宜的RNA酶抑制剂后，RNAs芯片即使在有组织提取物存在时亦表现出稳定(参见文献Collett等人.，“Functional RNA Microarrays for High-throughput Screening of Antiprotein Aptamers，”Anal Biochem.338：113-123(2005)，该文献的全部内容通过引用方式结合到本申请中)。此外，作为优化和稳定化处理的一部分，稳定化发夹的引入可以明显增加细胞内适体的水 平(参 见文 献Blind等 人“Cytoplasmic RNA Modulators of an Inside-out Signal-transduction Cascade，”Proc Natl Acad Sci USA 96：3606-3610(1999)，该文献的全部内容通过引用方式结合至本申请中)。不管如何，本发明可以通过经济的方法合成能够开启荧光团荧光的DNA适体序列，该适体序列可以为传感器在溶液相和芯片(微矩阵)类的分析中的稳定性提供附加保证。
Problems and Prospects，”Curr Opin Chem Biol.1：5-9(1997)；Faria等人.，“Sugar Boost：When Ribose Modifications Improve Oligonucleotide Performance，”Current Opinion in Molecular Therapeutics 10：168-175(2008)，以上每一篇文献的全部内容均通过引用方式结合到本申请中)。此外，在添加适宜的RNA酶抑制剂后，RNAs芯片即使在有组织提取物存在时亦表现出稳定(参见文献Collett等人.，“Functional RNA Microarrays for High-throughput Screening of Antiprotein Aptamers，”Anal Biochem.338：113-123(2005)，该文献的全部内容通过引用方式结合到本申请中)。此外，作为优化和稳定化处理的一部分，稳定化发夹的引入可以明显增加细胞内适体的水 平(参 见文 献Blind等 人“Cytoplasmic RNA Modulators of an Inside-out Signal-transduction Cascade，”Proc Natl Acad Sci USA 96：3606-3610(1999)，该文献的全部内容通过引用方式结合至本申请中)。不管如何，本发明可以通过经济的方法合成能够开启荧光团荧光的DNA适体序列，该适体序列可以为传感器在溶液相和芯片(微矩阵)类的分析中的稳定性提供附加保证。
[0108] 相比RNA，使用DNA将更加容易实现SELEX(参见文献该文献其全部内容通过引用方式结合至本申请中)。2’-羟基的缺失基本上不会损害DNA折叠或者形成结构。确实，SELEX方法已经被用于鉴定某些DNAs，这些DNAs能够与小分子结合，也能与蛋白质结合，同时其结构亦是以RNA适体为基础的。因此，可开发DNA适体，将其应用于类似的突变和截短研究，从而鉴定出用于上面所述的13-2的进入点和分析物传感器。
[0109] 在本申请中，术语“核酸”包括DNA和RNA，且两者均以D和L对映体的形式存在，此外还包括两者的衍生物(包括但不限于，2’-氟-、2’-氨基、2’氧-甲基、5’碘-和5’-溴-修饰的多聚核苷酸)。使用含有修饰核苷酸的核酸(参见文献Kubik等人，“Isolation and Characterization of 2’fluoro-，2’amino-，and 2’fluoro-amino-modified RNA Ligands or Human IFN-gamma that Inhibit Receptor Binding，”J.Immunol.159：259-267(1997)；Pagratis 等 人，“Potent 2’-amino，and 2’-fluoro-2’-deoxy-ribonucleotide RNA Inhibitors of Keratinocyte Growth Factor，”Nat.Biotechnol.15：68-73(1997)，以上每一篇文献的全部内容均通过引用方式结合到本申请中)，以及L型核酸(亦称为Spiegelmers ，其是天然D型核酸的对映体(参见文献Klussmann等人，“Mirror-image RNA that Binds D-adenosine，”Nat.Biotechnol.14：1112-1115(1996)，以及文献Williams等人，“Bioactive and nuclease-resistant L-DNA Ligand of Vasopressin，”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：11285-11290(1997)，以上每一篇文献的全部内容均通过引用方式结合到本申请中)以提高核酸的生物稳定性。此外，还可以用多肽骨架来替代糖-磷酸骨架，从而形成肽核酸(PNA)。肽核酸的使用也在本发明的范围内。
[0110] 根据本发明的一个实施方式，核酸分子包含第一结构域---适体，其可以特异性地结合荧光团，该荧光团在取代的芳环系统和取代的咪唑啉(硫)酮、恶唑(硫)酮、吡咯啉(硫)酮或呋喃(硫)酮环之间包含有次甲基桥。优选地，该荧光团是指如上述通式I(Ia-Id)、II或者III中任意通式所代表的化合物。核酸分子一旦结合荧光团后，其会诱导荧光团形成特定构象，该构象可以使得荧光团在暴露于适宜波长射线实质性地增强荧光发射。
[0111] 本发明所述的核酸适体同时包括单价适体和多价适体，前者只包含一个结合荧光团的第一结构域，而后者包含一个以上的适体结构域。
[0112] 根据本发明的一个实施方式，多价适体可以包括多个第一结构域，每一分子的所述多个第一结构域可以结合多个相同的荧光团化合物。该多价适体可以以同种类型的适体所组成的多联体形式存在，其中的适体都与一种类型的荧光团相结合。已被证实可以提高荧光发射的多联体的实例包括，2mers、4mers、8mers、12mers、16mers和32mers。在形成以上多联体的过程中，可以通过适宜长度的连接臂区域来隔开多个适体结构域，这些连接臂区域可以防止结构域与其靶标荧光团之间的空间相互影响。可替换地，多联体可以包含多种类型的适体，这些适体分别与不同的荧光团结合，这种结合方式可以得到混合的荧光发射效应。
[0113] 能够与荧光团DMHBI特异性结合的示例性适体分子如下所示：适体3-6(SEQ ID NO：1)
GGGAGAUACGCUCUAGAAUUCAAUUGCAUGGUGGUCUGGGACAGACGUGU
GGACGGCACACAGCGUGAGGCUUUGGUGGGUUAUGGCUGUCAUGCGAGAU
AGCUCGAGCAAUGC
适体13-2(SEQ ID NO：2)
GGGCUAUUUCUGGAGGGGCGCUACAUGAAAGUGGUGGUUGGGUGCGGUCG
GAGAUAGCUCGAGCAAUGC
适体13-2-min(SEQ ID NO：3)
GGGCUAUUUCUGGAGGGGCGCUACAUGAAAGUGGUGGUUGGGUGCGGUCG
GAGAUAGCUC
适体2-4(SEQ ID NO：4)
UGAAACCUAGAGUUAUGCCAGGCUCUGAGCCUGCUUCGGCAGGUGCUAUG
AUCGCCAGCGGUAUGCAGUCCG
适体4-19(SEQ ID NO：5)
UGAAAUGACAGUACAGUGGAGGGUGCNGUACUGCUUCGGCAGGGAAGGGG
CGCUGUUCUUGUCUCAUAUCCG，其中每个对应位点的N为C或者U。
适体17-3(SEQ ID NO：6)
UGAAGAGCAGUAGCGAGUAGUUCACAANAGCUGCUUCGGCAGGAUCUUGU
AGGAAGUAAAUGUGCAAAUCCG，其中每个对应位点的N为C或者U。
适体17-17(SEQ ID NO：7)
UGAAANNAAAUAUUCGGGAUANAUANNAUUACUGCUUCGGCAGANAGCGG
UUAAUUNUUGNAANUCNAAUCCCG，其中每个对应位点的N为C或者U。
适体18-16(SEQ ID NO：8)
UGAANGGACUCGUCUGGCNGGAUGGGCGNGUGGUACUGCUUUCGGGCAGG
AUNGGGUAUAACGGUANANGCNC，其中每个对应位点的N为C或者U。
适体23-7(SEQ ID NO：9)
UGAAAUGACAGUACAGUGGAGGGUGCGGUACUGCUUCGGCAGGGAAGGGG
CGCUGUUCUUGUCUCAUAUCCG
适体23-11(SEQ ID NO：10)
GGGAGACGCAACUGAAUGAAAUGACAGUACAGUGGAGGGUGCGGUACUGC
UUCGGCAGGGAAGGGGCGCUGUUCUUGUCUCAUAUCCGUAACUAGUCGCG
UCAC
适体13-2-1(SEQ ID NO：11)
GGGUAUCCGGAAUCUUAUACAUUGUUAUGUCUGGAGGGGCGCCGCAUGAA
CGCGGUGGUGAGGUGCGGUCGGAUAUAACUGGUGGAGUGCAAGAGUCUGA
GCACACUGG
适体13-2-3(SEQ ID NO：12)
GGGUAUCCGGAAUCUUAUACAUUGCUAUUUCUGGAGGGGCGCCCCAUGAA
AGGGGUGGUUGAGAGCGGUCGGAGAUAGCGGAAACAGUGCAAGAGUCUGA
GCACACUGG
适体13-2-4(SEQ ID NO：13)
GGGUAUCCGGAAUCUUAUACAUUGCUAUUGUUGGAGGGGCGCUACGUGAA
AGUGGUGGUACGGUGCGGUCGGCAAUAGCUCGUAUAGUGCAAGAGUCUGA
GCACACUGG
适体13-2-5(SEQ ID NO：14)
GGGUAUCCGGAAUCUUAUACAUUGCUCUGUUUGGAGGGGCGCUACUUUCA
AGUAGUGGUUGAGUGCGGUCGAACAGAGCUUGGGCGUUGCAAGAGUCUGA
GCACACUGG
适体13-2-5-min(SEQ ID NO：15)
GGGUAUCCGGAAUCUUAUACAUUGCUCUGUUUGGAGGGGCGCUACUUUCA
AGUAGUGGUUGAGUGCGGUCGAACAGAGCUUGGGCGUUGCAAGAGUC
GGGAGAUACGCUCUAGAAUUCAAUUGCAUGGUGGUCUGGGACAGACGUGU
GGACGGCACACAGCGUGAGGCUUUGGUGGGUUAUGGCUGUCAUGCGAGAU
AGCUCGAGCAAUGC
适体13-2(SEQ ID NO：2)
GGGCUAUUUCUGGAGGGGCGCUACAUGAAAGUGGUGGUUGGGUGCGGUCG
GAGAUAGCUCGAGCAAUGC
适体13-2-min(SEQ ID NO：3)
GGGCUAUUUCUGGAGGGGCGCUACAUGAAAGUGGUGGUUGGGUGCGGUCG
GAGAUAGCUC
适体2-4(SEQ ID NO：4)
UGAAACCUAGAGUUAUGCCAGGCUCUGAGCCUGCUUCGGCAGGUGCUAUG
AUCGCCAGCGGUAUGCAGUCCG
适体4-19(SEQ ID NO：5)
UGAAAUGACAGUACAGUGGAGGGUGCNGUACUGCUUCGGCAGGGAAGGGG
CGCUGUUCUUGUCUCAUAUCCG，其中每个对应位点的N为C或者U。
适体17-3(SEQ ID NO：6)
UGAAGAGCAGUAGCGAGUAGUUCACAANAGCUGCUUCGGCAGGAUCUUGU
AGGAAGUAAAUGUGCAAAUCCG，其中每个对应位点的N为C或者U。
适体17-17(SEQ ID NO：7)
UGAAANNAAAUAUUCGGGAUANAUANNAUUACUGCUUCGGCAGANAGCGG
UUAAUUNUUGNAANUCNAAUCCCG，其中每个对应位点的N为C或者U。
适体18-16(SEQ ID NO：8)
UGAANGGACUCGUCUGGCNGGAUGGGCGNGUGGUACUGCUUUCGGGCAGG
AUNGGGUAUAACGGUANANGCNC，其中每个对应位点的N为C或者U。
适体23-7(SEQ ID NO：9)
UGAAAUGACAGUACAGUGGAGGGUGCGGUACUGCUUCGGCAGGGAAGGGG
CGCUGUUCUUGUCUCAUAUCCG
适体23-11(SEQ ID NO：10)
GGGAGACGCAACUGAAUGAAAUGACAGUACAGUGGAGGGUGCGGUACUGC
UUCGGCAGGGAAGGGGCGCUGUUCUUGUCUCAUAUCCGUAACUAGUCGCG
UCAC
适体13-2-1(SEQ ID NO：11)
GGGUAUCCGGAAUCUUAUACAUUGUUAUGUCUGGAGGGGCGCCGCAUGAA
CGCGGUGGUGAGGUGCGGUCGGAUAUAACUGGUGGAGUGCAAGAGUCUGA
GCACACUGG
适体13-2-3(SEQ ID NO：12)
GGGUAUCCGGAAUCUUAUACAUUGCUAUUUCUGGAGGGGCGCCCCAUGAA
AGGGGUGGUUGAGAGCGGUCGGAGAUAGCGGAAACAGUGCAAGAGUCUGA
GCACACUGG
适体13-2-4(SEQ ID NO：13)
GGGUAUCCGGAAUCUUAUACAUUGCUAUUGUUGGAGGGGCGCUACGUGAA
AGUGGUGGUACGGUGCGGUCGGCAAUAGCUCGUAUAGUGCAAGAGUCUGA
GCACACUGG
适体13-2-5(SEQ ID NO：14)
GGGUAUCCGGAAUCUUAUACAUUGCUCUGUUUGGAGGGGCGCUACUUUCA
AGUAGUGGUUGAGUGCGGUCGAACAGAGCUUGGGCGUUGCAAGAGUCUGA
GCACACUGG
适体13-2-5-min(SEQ ID NO：15)
GGGUAUCCGGAAUCUUAUACAUUGCUCUGUUUGGAGGGGCGCUACUUUCA
AGUAGUGGUUGAGUGCGGUCGAACAGAGCUUGGGCGUUGCAAGAGUC
[0114] 能够与荧光团DFHBI特异性结合的示例性适体分子如下所示：适体24-4(SEQ ID NO：16)
GGGAGACGCAACUGAAUGAACGGGGUAAAUAGGCGUGGGUCGGGUCCUGC
UUCGGCAGUUGAGUGUGAGAGCGAACUCUGUAGUUCCGCGUAACUAGUCG
CGUCAC
适体24-1(SEQ ID NO：17)
GGGAGACGCAACUGAAUGAACCUGUAGAACGACUUGGUCGGGUCAGCUGC
UUCGGCAGCUUCGAGAAUAGAGUGUGGGGUCGUAUCCGCGUAACUAGUCG
CGUCAC
适体24-2(SEQ ID NO：18)
GGGAGACGCAACUGAAUGAAAUGGUGAAGGACGGGUCCAGGUGUGGCUGC
UUCGGCAGUGCAGCUUGUUGAGUAGAGUGUGAGCUCCGCGUAACUAGUCG
CGUCAC
适体10-6(SEQ ID NO：19)
UGAAUGAACGGGGUAAAUAGGCGUGGGUCGGGUCCUGCUUCGGCAGUUGA
GUGUGAGAGCGAACUCUGUAGUUCCG
GGGAGACGCAACUGAAUGAACGGGGUAAAUAGGCGUGGGUCGGGUCCUGC
UUCGGCAGUUGAGUGUGAGAGCGAACUCUGUAGUUCCGCGUAACUAGUCG
CGUCAC
适体24-1(SEQ ID NO：17)
GGGAGACGCAACUGAAUGAACCUGUAGAACGACUUGGUCGGGUCAGCUGC
UUCGGCAGCUUCGAGAAUAGAGUGUGGGGUCGUAUCCGCGUAACUAGUCG
CGUCAC
适体24-2(SEQ ID NO：18)
GGGAGACGCAACUGAAUGAAAUGGUGAAGGACGGGUCCAGGUGUGGCUGC
UUCGGCAGUGCAGCUUGUUGAGUAGAGUGUGAGCUCCGCGUAACUAGUCG
CGUCAC
适体10-6(SEQ ID NO：19)
UGAAUGAACGGGGUAAAUAGGCGUGGGUCGGGUCCUGCUUCGGCAGUUGA
GUGUGAGAGCGAACUCUGUAGUUCCG
[0115] 能够与荧光团o-HBI特异性结合的示例性适体分子如下所示：适体J2-6(SEQ ID NO：20)
UGAAAAUGGCAAAAUAUUCGAGAANCUGGUCUGCUUCGGCAGGAUUCUCC
AAGGGGUAGAUCGUGUAUUCCG，其中每个对应位点的N为C或者U。
适体J2-18(SEQ ID NO：21)
UGAAAAUGUNNNAUNCGAGNCNGNAUUNAGCUGCUUCGGCAGAANGNUCU
CCCANAGCUNNUGNCAAAUCCG，其中每个对应位点的N为C或者U。
适体S8-9(SEQ ID NO：22)
UGAAAAUGUAUAGUCGGAUGUGCNGANUNNACUGCUUCGGCAGCUUAGAU
GUAUGCAGCUGCUCGGGAGUCCG，其中每个对应位点的N为C或者U。
适体S8-20(SEQ ID NO：23)
UGAAUCUCCGUGUCAGGGCAGAGCAGGGCGCUGCUUCGGCAGAUAAUGUA
UAGUCGGGAUCGCUGAACUCCG
UGAAAAUGGCAAAAUAUUCGAGAANCUGGUCUGCUUCGGCAGGAUUCUCC
AAGGGGUAGAUCGUGUAUUCCG，其中每个对应位点的N为C或者U。
适体J2-18(SEQ ID NO：21)
UGAAAAUGUNNNAUNCGAGNCNGNAUUNAGCUGCUUCGGCAGAANGNUCU
CCCANAGCUNNUGNCAAAUCCG，其中每个对应位点的N为C或者U。
适体S8-9(SEQ ID NO：22)
UGAAAAUGUAUAGUCGGAUGUGCNGANUNNACUGCUUCGGCAGCUUAGAU
GUAUGCAGCUGCUCGGGAGUCCG，其中每个对应位点的N为C或者U。
适体S8-20(SEQ ID NO：23)
UGAAUCUCCGUGUCAGGGCAGAGCAGGGCGCUGCUUCGGCAGAUAAUGUA
UAGUCGGGAUCGCUGAACUCCG
[0116] 能够与荧光团DMABI特异性结合的示例性适体分子如下所示：适体N19-4(SEQ ID NO：24)
UGAACGAAUAGGUGGAGGUUGCNCUGUUUUCUGCUUCGGCAGGUUAAAGA
UUGGUACUCAUCACGGUGUCCG，其中每个对应位点的N为C或者U。
适体N19-10(SEQ ID NO：25)
UGAACAGUUUCGUGCAGUUUGAAAUGUAGGCUGCUUCGGCAGGAUAGGUG
UGGAGGUGGAUGUCCGGGUCCG
适体N9-1(SEQ ID NO：26)
UGAACCCUGAAAAGAGGGAAGGCCUGGNUUGCUGCUUCGGCAGGGGAUUG
AUCAGGGUGCACGUUGCUGUCCG
适体N9-6(SEQ ID NO：27)
UGAAGCCUUGAAAUAGUAGUGAUCGAGUGGCUGCUUCGGCAGACUCUGAG
UGUGGCUAUACGUGAUCGUCCG
适体N11-3(SEQ ID NO：28)
UGAAAAAGUGGUAUUUNAAAUUCNANUUANCUGCUUCGGCAGACGACGGG
GGGGCNNGUNUUGGANGAUCCG，其中每个对应位点的N为C或者U。
适体N15-1(SEQ ID NO：29)
UGAAUGUNGCAUAAUUGANGGANGAUNCAUGCUGCUUCGGCAGUUGGGUG
UAAAAAUGGAANGAGGUCNUAUCCG，其中每个对应位点的N为C或者U。
适体N8-4(SEQ ID NO：30)
UGAAUCCAGGGGUGGUCGGUGGNNGGAGCGCUGCUUCGGCAGUGAGCUGG
GGAGUUCAGUCAAUGUGGUCCG，其中每个对应位点的N为C或者U。
UGAACGAAUAGGUGGAGGUUGCNCUGUUUUCUGCUUCGGCAGGUUAAAGA
UUGGUACUCAUCACGGUGUCCG，其中每个对应位点的N为C或者U。
适体N19-10(SEQ ID NO：25)
UGAACAGUUUCGUGCAGUUUGAAAUGUAGGCUGCUUCGGCAGGAUAGGUG
UGGAGGUGGAUGUCCGGGUCCG
适体N9-1(SEQ ID NO：26)
UGAACCCUGAAAAGAGGGAAGGCCUGGNUUGCUGCUUCGGCAGGGGAUUG
AUCAGGGUGCACGUUGCUGUCCG
适体N9-6(SEQ ID NO：27)
UGAAGCCUUGAAAUAGUAGUGAUCGAGUGGCUGCUUCGGCAGACUCUGAG
UGUGGCUAUACGUGAUCGUCCG
适体N11-3(SEQ ID NO：28)
UGAAAAAGUGGUAUUUNAAAUUCNANUUANCUGCUUCGGCAGACGACGGG
GGGGCNNGUNUUGGANGAUCCG，其中每个对应位点的N为C或者U。
适体N15-1(SEQ ID NO：29)
UGAAUGUNGCAUAAUUGANGGANGAUNCAUGCUGCUUCGGCAGUUGGGUG
UAAAAAUGGAANGAGGUCNUAUCCG，其中每个对应位点的N为C或者U。
适体N8-4(SEQ ID NO：30)
UGAAUCCAGGGGUGGUCGGUGGNNGGAGCGCUGCUUCGGCAGUGAGCUGG
GGAGUUCAGUCAAUGUGGUCCG，其中每个对应位点的N为C或者U。
[0117] 根据本发明的另一个实施方式，多价核酸适体分子可以包含一个或者多个第一结构域，其中每一分子的所述第一结构域可以特异性结合多个相同的荧光团化合物，还包含一个或者多个第二结构域，该第二结构域可以特异性地结合目标靶标分子(也就是不同于荧光团的分子)。本申请还涉及这些双结构域适体分子组成的多联体，多联体具有如(第一结构域---第二结构域)m所示结构，其中m是大于1的整数。每个功能性双结构域传感器的第一结构域可以是相同的或者不同的。同样地，每个功能性双结构域传感器的第二结构域可以是相同的或者不同的。
[0118] 目标靶标分子可以是任意生物材料或者小分子，其包括，但不仅限于，蛋白质、核酸、脂质、糖类、激素、细胞因子、趋化因子、代谢产物、有机分子，和金属离子。目标靶标分子可以是一种与病情或者病原体感染相关的分子。
[0119] 蛋白质或者多肽靶标可以是任意长度的，其包括但不仅限于以下分子：磷蛋白、脂质修饰的蛋白、亚硝基化的蛋白、亚磺酸化的蛋白、酰化的蛋白、甲基化的蛋白、脱甲基化的蛋白、C末端酰胺化的蛋白、生物素化的蛋白、甲酰化的蛋白、γ-羧基化饰的蛋白、谷酰胺化的蛋白、甘氨酸化的蛋白、碘化的蛋白、羟基化的蛋白、异戊烯化的蛋白、硫辛酰化的蛋白(包括，异戊烯化、豆蔻酰化、法尼基化、十六酰化或者香叶基化)、与核苷酸例如ADP核糖共价连接的蛋白(ADP-核糖基化)或者与黄素共价连接的蛋白、氧化的蛋白、磷脂酰肌醇基团修饰的蛋白、焦谷氨酸酯修饰的蛋白、硫酸化的蛋白、硒化蛋白、与另一蛋白共价连接的蛋白(包括，小泛素化、类泛素化、泛素化，或者ISGylation)、瓜氨酸化的蛋白、去酰胺化的蛋白、烯烃化蛋白、二硫键桥联的蛋白、蛋白水解酶切后的蛋白、脯氨酸外消旋化了的蛋白、经上述修饰处理后获得的任意多肽序列，以及经过一种或者多种构象变化的蛋白。此外，含有突变的蛋白或者多肽可以从其野生型中鉴别出来。含有两个或者两个以上分子的复合物，复合物包括但不仅限于，含有以下相互作用：蛋白-蛋白相互作用、蛋白-辅因子相互作用、蛋白-小分子抑制剂相互作用、蛋白-小分子激活剂相互作用、蛋白-小分子相互作用、蛋白-离子相互作用、蛋白-RNA相互作用、蛋白-DNA相互作用、DNA-DNA相互作用、RNA-DNA相互作用、RNA-RNA相互作用、修饰的核酸分子-DNA或者修饰的核酸分子-RNA相互作用，以及适体-适体相互作用。此外，含有突变的核酸可以从其野生型中鉴别出来。核酸靶标可以是任意类型的核酸，其包含，但不限于，DNA、RNA、LNA、PNA、基因组DNA、病毒DNA、合成的DNA、碱基或者碳骨架经过修饰的DNA、mRNA、非编码RNA、PIWI RNA、末端相关RNA、启动子相关RNA、tRNA、rRNA、microRNA、siRNA、转录后修饰的RNA、合成的RNA、碱基或者碳骨架经过修饰的RNA、病毒RNA、细菌RNA、RNA适体、DNA适体、核酶和脱氧核酶。
[0121] 脂质靶标包含，但不限于，磷脂、糖脂、单甘油脂、双甘油脂、三甘油脂、甾醇、脂肪酯、类脂、磷酸甘油脂、鞘脂类、甾醇脂、醇脂、糖脂质、聚酮、花生酸类、前列腺素、白三烯类、血栓素、N-酰基乙醇胺脂、大麻素、花生四烯酸乙醇胺类、萜类和脂多糖类。
[0122] 细胞分子靶标包含，但不限于，糖类、单糖类、多糖类、半乳糖、果糖、葡萄糖、氨基酸、多肽、核酸、核苷酸类、核苷类、环核苷酸、多聚核苷酸、维生素类、药物、抑制剂、单原子离子(例如镁离子、钾离子、钠离子、锌离子、钴离子、铅离子、钙离子等)、多原子离子(例如磷酸根离子)、自由基(例如氧自由基或者过氧化氢自由基)，以及含碳气体(例如二氧化碳、一氧化碳等)。
[0123] 靶标亦可以是全细胞或者是表达于全细胞表面的分子。示例性的细胞包含，但不限于，肿瘤细胞、细菌细胞或者正常细胞。靶标亦可以是病毒颗粒。
[0124] 以上这些类型的靶标生物分子所对应的许多适体，在以往研究中已经被鉴定出来，并且可以被并入至本发明所涉及的多价核酸适体构建体中。例如，其它已知的RNA适体包含，但不限于，T4 RNA聚合酶的RNA配基、HIV反转录酶的RNA配基、噬菌体R17外壳蛋白的RNA配基、神经生长因子的RNA配基、HSV-1 DNA聚合酶的RNA配基、大肠杆菌(Escherichia coli)核糖体蛋白S1的RNA配基、HIV-1 Rev蛋白的RNA配基(Gold等人申请的专利号为5,270,163的美国专利，其全部公开内容通过引用方式结合到本申请中)；枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)核糖核酸酶P的RNA配基(Schmidt等人
申请的专利号为5,792,613的美国专利，其全部公开内容通过引用方式结合到本申请中)；ATP的RNA配基和生物素的RNA配基(Szostak等人申请的专利号为5,688,670的美国专利，其全部公开内容通过引用方式结合到本申请中)；朊蛋白的RNA配基(参见文献 Weiss等人，“RNA Aptamers Specifically Interact with the Prion Protein PrP，”J.Virol.71(11)：8790-8797(1997)，该文献的全部内容通过引用方式结合到本申请中)；丙型肝炎病毒蛋白NS3的RNA配基(参见文献Kumar等人，“Isolation of RNA Aptamers Specific to the NS3 Protein of Hepatitis C Virus from a Pool of Completely Random RNA，”Virol.237(2)：270-282(1997)；Urvil 等 人，“Selection of RNA Aptamers that Bind Specifically to the NS3 Protein of Hepatitis C Virus，”Eur.J.Biochem.248(1)：130-138(1997)；Fukuda等 人，“Specifc RNA Aptamers to NS3 Protease Domain of Hepatitis C Virus，”Nucleic Acids Symp.Ser.37：
237-238(1997)，以上每一篇文献的全部内容均通过引用方式结合到本申请中)；氯霉素RNA配基(参见文献Burke等人，“RNA Aptamers to the Peptidyl Transferase Inhibitor Chloramphenicol，”Chem.Biol.4(11)：833-843(1997)，该文献的全部内容通过引用方式结合到本申请中)；S-腺苷甲硫氨酸的腺苷基团的RNA配基(参见文献Burke and Gold，“RNA Aptamers to the Adenosine Moiety of S-Adenosyl Methionine：Structural Inferences from Variations on a Theme and the Reproducibility of SELEX，”Nucleic Acids Res.25(10)：2020-2024(1997)，该文献的全部内容通过引用方式结合到本申请中)；蛋白激酶C的RNA配基(参见文献Conrad等人，“Isozyme-Specific Inhibition of Protein Kinase C by RNA Aptamers，”J.Biol.Chem.269(51)：32051-32054(1994)；
Conrad and Ellington，“Detecting Immobilized Protein Kinase C Isozymes with RNA Aptamers，”Anal.Biochem.242(2)：261-265(1996)，以上每一篇文献的全部内容均通过引用方式结合到本申请中)；枯草杆菌蛋白酶的RNA配基(参见文献Takeno等人，“RNA Aptamers of a Protease Subtilisin，”Nucleic Acids Symp.Ser.37：249-250(1997)，该文献的全部内容通过引用方式结合到本申请中)；酵母RNA聚合酶II的RNA配基(参见文献Thomas等人，“Selective Targeting and Inhibition of Yeast RNA Polymerase II by RNA Aptamers，”J.Biol.Chem.272(44)：27980-27986(1997)，该文献的全部内容通过引用方式结合到本申请中)；人体激活蛋白C的RNA配基(参见文献Gal等人，“Selection of a RNA Aptamer that Binds to Human Activated Protein C and Inhibits its Protein Function，”Eur.J.Biochem.252(3)：553-562(1998)，该文献的全部内容通过引用方式结合到本申请中)；维生素B12的RNA配基(参见文献Lorsch and Szostak，“In vitro Selection of RNA Aptamers Specific for Cyanocobalamin，”Biochem.33(4)：
973-982(1994)，该文献的全部内容通过引用方式结合到本申请中)。本领域研究人员不断地鉴定和分离出其它的RNA适体，这些RNA适体也可以被并入到本发明所涉及的多价适体构建体中。
申请的专利号为5,792,613的美国专利，其全部公开内容通过引用方式结合到本申请中)；ATP的RNA配基和生物素的RNA配基(Szostak等人申请的专利号为5,688,670的美国专利，其全部公开内容通过引用方式结合到本申请中)；朊蛋白的RNA配基(参见文献 Weiss等人，“RNA Aptamers Specifically Interact with the Prion Protein PrP，”J.Virol.71(11)：8790-8797(1997)，该文献的全部内容通过引用方式结合到本申请中)；丙型肝炎病毒蛋白NS3的RNA配基(参见文献Kumar等人，“Isolation of RNA Aptamers Specific to the NS3 Protein of Hepatitis C Virus from a Pool of Completely Random RNA，”Virol.237(2)：270-282(1997)；Urvil 等 人，“Selection of RNA Aptamers that Bind Specifically to the NS3 Protein of Hepatitis C Virus，”Eur.J.Biochem.248(1)：130-138(1997)；Fukuda等 人，“Specifc RNA Aptamers to NS3 Protease Domain of Hepatitis C Virus，”Nucleic Acids Symp.Ser.37：
237-238(1997)，以上每一篇文献的全部内容均通过引用方式结合到本申请中)；氯霉素RNA配基(参见文献Burke等人，“RNA Aptamers to the Peptidyl Transferase Inhibitor Chloramphenicol，”Chem.Biol.4(11)：833-843(1997)，该文献的全部内容通过引用方式结合到本申请中)；S-腺苷甲硫氨酸的腺苷基团的RNA配基(参见文献Burke and Gold，“RNA Aptamers to the Adenosine Moiety of S-Adenosyl Methionine：Structural Inferences from Variations on a Theme and the Reproducibility of SELEX，”Nucleic Acids Res.25(10)：2020-2024(1997)，该文献的全部内容通过引用方式结合到本申请中)；蛋白激酶C的RNA配基(参见文献Conrad等人，“Isozyme-Specific Inhibition of Protein Kinase C by RNA Aptamers，”J.Biol.Chem.269(51)：32051-32054(1994)；
Conrad and Ellington，“Detecting Immobilized Protein Kinase C Isozymes with RNA Aptamers，”Anal.Biochem.242(2)：261-265(1996)，以上每一篇文献的全部内容均通过引用方式结合到本申请中)；枯草杆菌蛋白酶的RNA配基(参见文献Takeno等人，“RNA Aptamers of a Protease Subtilisin，”Nucleic Acids Symp.Ser.37：249-250(1997)，该文献的全部内容通过引用方式结合到本申请中)；酵母RNA聚合酶II的RNA配基(参见文献Thomas等人，“Selective Targeting and Inhibition of Yeast RNA Polymerase II by RNA Aptamers，”J.Biol.Chem.272(44)：27980-27986(1997)，该文献的全部内容通过引用方式结合到本申请中)；人体激活蛋白C的RNA配基(参见文献Gal等人，“Selection of a RNA Aptamer that Binds to Human Activated Protein C and Inhibits its Protein Function，”Eur.J.Biochem.252(3)：553-562(1998)，该文献的全部内容通过引用方式结合到本申请中)；维生素B12的RNA配基(参见文献Lorsch and Szostak，“In vitro Selection of RNA Aptamers Specific for Cyanocobalamin，”Biochem.33(4)：
973-982(1994)，该文献的全部内容通过引用方式结合到本申请中)。本领域研究人员不断地鉴定和分离出其它的RNA适体，这些RNA适体也可以被并入到本发明所涉及的多价适体构建体中。
[0125] 根据本发明的另一个实施方式，本发明的多价核酸适体分子包含第一结构域，该第一结构域基本上只有在第二结构域与靶标分子结合后，才与荧光团结合。如实施例中所示，该类型的多价核酸适体分子中，第二结构域具有稳定的结构并可以结合靶标分子，而第一结构域以及核酸分子中与第一结构域相邻的区域所具有的结构基本上没有结合荧光团的能力(或者说是与荧光团亲和力极低)。但是，当第二结构域与靶标分子结合后，第一结构域的二级结构发生变化，使得第一结构域的结构具有以高亲和力的方式结合荧光团的能力。靶标分子结合所引起的一个结果是，荧光团结合第一结构域，通过暴露于适宜波长的射线其会发射出荧光发射信号。这种类型的多价适体可以用作“开启”传感器。
[0126] 如所附的实施例所示，该实施例中的多价适体传感器是专门针对生物分子ATP、腺苷、cGMP、生物素和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(“NAD”)设计的。NAD和生物素传感器是通过SELEX方法并利用从头传感器(de novo sensor)筛选的方式开发得到，获得的SELEX产物包括生物素-特异性的传感器池和NAD-特异性的传感器池。来自SELEX池的各个克隆成员代表可选择的传感器构建体，这些构建体是生物素-特异性的或者NAD-特异性的“开启”传感器。本发明的多价适体传感器可以包括，许多特异于其它生物分子(包含上文所列的生物分子)的适体。
[0127] 示例性的ATP“开启”传感器具有SEQ ID NO：31所示的核苷酸序列：GGGAGACGCAACUGAAUGAACCUGUAGAACGACUUGGUCGGGUCAGUGUG
UGGGGAGAUCUACGGAUCUCAGGGCUGUUACGGGAGCUACAUGGAAGGAG
UCCAUGUGUCGUAUGCUUCGAGAAUAGAGUGUGGGGUCGUAUCCGCGUAA
CUAGUCGCGUCAC
UGGGGAGAUCUACGGAUCUCAGGGCUGUUACGGGAGCUACAUGGAAGGAG
UCCAUGUGUCGUAUGCUUCGAGAAUAGAGUGUGGGGUCGUAUCCGCGUAA
CUAGUCGCGUCAC
[0128] 另一种示例性的腺苷“开启”传感器具有SEQ ID NO：32所示的核苷酸序列：CGCAACUGAAUGAACCUGUAGAACGACUUGGUCGGGUCA GGAAGA
AACUGUGGCACUUCGGUGCCAG UCGAGAAUAGAGUGUGGGGUCG
UAUCCGUAACCAGUUGCG
其中，所示序列中的粗体片段代表将腺苷适体连接到DFHBI适体上的J2茎。如实施例
22中所示，J2茎可以被其它的茎替代。
AACUGUGGCACUUCGGUGCCAG UCGAGAAUAGAGUGUGGGGUCG
UAUCCGUAACCAGUUGCG
其中，所示序列中的粗体片段代表将腺苷适体连接到DFHBI适体上的J2茎。如实施例
22中所示，J2茎可以被其它的茎替代。
[0129] 示例性的cGMP“开启”传感器具有SEQ ID NO：33所示的核苷酸序列：GGGAGACGCAACUGAAUGAACCUGUAGAACGACUUGGUCGGGUCAGCCCU
GCGAUGCAGAAAGGUGCUGACGACACAUCUUCGAGAAUAGAGUGUGGGGU
CGUAUCCGCGUAACUAGUCGCGUCAC
GCGAUGCAGAAAGGUGCUGACGACACAUCUUCGAGAAUAGAGUGUGGGGU
CGUAUCCGCGUAACUAGUCGCGUCAC
[0130] 根据另一个实施方式，本发明的多价核酸适体分子包含第一结构域，该第一结构域基本上只有在第二结构域未与靶标分子结合时，才与荧光团结合。在该类型的多价核酸适体分子中，第二结构域带有稳定的结构并具有结合靶标分子的能力，而第一结构域或者核酸分子中与第一结构域相邻的区域带有一特定结构，该特定结构能够以充分地高亲和力的方式结合荧光团。但是，当第二结构域与靶标分子结合后，第一结构域的二级结构发生变化，使得第一结构域的结构基本上不再具有以高亲和力的方式结合荧光团的能力。靶标分子结合所引起的一个结果是，荧光团与第一结构域解离，即使暴露于适宜波长的射线下，荧光团也不会再发射出荧光发射信号(或者仅仅发射出基本上可以视为消失水平的荧光)。这种类型的多价适体可以用作“关闭”传感器。
[0131] 如下面所述，本发明所涉及的单价和多价适体可以用作传感器，以跟踪细胞或者体外样品中目标融合核酸分子的存在、定位或者数量；以测定细胞或者体外样品中目标靶标分子的存在、定位或者数量；以用于高通量药物筛选，从而对药物调节特定细胞功能的能力进行评估，例如转录水平或者剪接，或者对药物调节靶标分子的活性或者有效性的能力进行评估；以用于目标分析物或者基因的检测；以及通过使用改进的SELEX方法，用于从头筛选目标的特定靶标的传感器分子。
[0132] 通过将本发明的核酸适体分子进一步与已经融合了特定信号分子或者信号作用分子进行融合，还可以将本发明的核酸适体分子导入到特定的胞内位置。该应用已在附图27和所附的实施例中进行了说明。
[0133] 根据另一个实施方式，本发明所涉及的多价核酸适体构建体包含一个或者多个第一结构域，每一分子的所述第一结构域可以特异性地结合多个相同的荧光团化合物，该多价核酸适体构建体还包含第二结构域，该第二结构域包含随机的核酸序列。术语“随机”是指，整个第二结构域或者仅是其一部分所包含的核酸序列是随机生成的，而非事前已知的。因此，第二结构域的一部分可能含有已知序列，但是第二结构域的整体序列却是未知的。可以按照之前所述的方法，将这种类型的多价适体构建体制备用作“开启”传感器，而且这种类型的构建体还可以用于从头筛选和鉴定对目标的靶标分子具有亲和力的适体。如本申请以下部分所记载，这些多价核酸适体构建体可以在进行改进的SELEX方法的过程中生成。
因此，本发明也涉及一种包含这些多价核酸适体构建体的文库。在该文库中，优选原始文库的每一个成员都含有唯一的或者基本上是唯一的随机序列(也就是与原始文库中的其它随机序列不同，或者只有很少的随机序列相同)。
分子复合物
因此，本发明也涉及一种包含这些多价核酸适体构建体的文库。在该文库中，优选原始文库的每一个成员都含有唯一的或者基本上是唯一的随机序列(也就是与原始文库中的其它随机序列不同，或者只有很少的随机序列相同)。
分子复合物
[0134] 本发明的另一个方面涉及分子复合物，其利用本发明所述的荧光化合物和核酸适体所形成，核酸适体可以特异性地结合荧光化合物，使得暴露于适宜波长射线下时，荧光团的荧光活性显著增强(即相比于荧光团特异性结合核酸适体之前)。
[0135] 根据本发明的一个实施方式，如之前所述，核酸分子可以包含一个或者多个第一结构域，因而分子复合物可由核酸分子和一个或者多个荧光化合物形成，所述一个或多个荧光化合物可以与核酸分子中存在的至少一个或者所有的(可选地)第一结构域结合。这些分子复合物可在体外以分离的形式存在，或者是在将核酸分子(或者，编码该核酸分子的基因构建体或者表达系统)引入至宿主细胞后在体内存在。
[0136] 根据另一个实施方式，核酸分子可以是多价的，其包含一个或者多个第一结构域，以及第二结构域，该第二结构域特异性地结合目标靶标分子。因而，分子复合物可以包含核酸分子、靶标分子(被第二结构域特异性地结合)，以及一个或者多个可以结合第一结构域的荧光化合物。这些分子复合物可在体外以分离的形式存在，或者是在将核酸分子(或者，编码该核酸分子的基因构建体或者表达系统)引入至宿主细胞后在体内存在。
[0137] 根据另一个实施方式，核酸分子可以是多价的，其包含多个适体传感器多联体(concatemers)，多联体中的每一个单体包含第一结构域和第二结构域。因而，分子复合物可以包含核酸分子、多个靶标分子(被所述多个第二结构域特异性地结合)，以及多个可以结合所述多个第一结构域的荧光化合物。这些分子复合物可在体外以分离的形式存在，或者是在将核酸分子(或者，编码该核酸分子的基因构建体或者表达系统)引入至宿主细胞后在体内存在。
[0138] 体外或者体内形成的以上这些类型的分子复合物的特定实施例已经记载在本申请所附的实施例部分。尽管本申请所附的实施例中提到的是体内宿主细胞，但本领域研究人员应该了解的是，宿主细胞可以存在于整个生物有机体，优选非人体组织。
[0139] 为了在胞内形成分子复合物，将荧光团引入至细胞，在细胞中其能够同与其可以特异性结合的适体发生相互作用(并被结合)。根据一种方法，可以通过将细胞或者样品与荧光团一起孵化的方式，从而实现细胞或者样品与荧光团的接触。荧光团会被细胞吸收，并在整个细胞中自由扩散。根据另一种方法，荧光团可以被注射入细胞或者被输入到包含该细胞的植物、胚胎、哺乳动物，或者转基因动物。基因构建体
[0140] 本发明所涉及的RNA适体分子可利用重组构建体分别在体外或者体内制备得到，重组构建体包含能够编码本发明所述的RNA适体分子的转基因。不管是使用体外转录还是使用适宜体内表达的转基因，这些基因构建体可通过已知的重组技术来制备获得。
[0141] 本发明的另一方面涉及一种构建的DNA分子，其包含编码本发明所述RNA适体分子的第一区域。
[0142] 根据本发明的一个实施方式，构建的DNA分子编码RNA融合产物。该产物由编码目标RNA分子的一段DNA和编码RNA适体分子的另一段DNA分子连接形成，所述RNA适体分子可以特异性地结合本发明的荧光团。如上所述，RNA适体分子可以包含结合荧光团的结构域的多联体。
[0143] 根据另一个实施方式，构建的DNA分子编码本发明的分子传感器，其由编码靶标分子特异性的RNA适体分子的一段DNA分子和编码特异性地结合本发明荧光团的RNA适体分子的另一段DNA分子连接形成。这些连接在一起的RNA序列可以按照前面所提到的方式来相互协作，从而获得“开启”传感器或者“关闭”传感器。根据又一个实施方式，可以制备一种空构建体以用来制备RNA融合产物。该空构建体包含有编码RNA适体分子的DNA片段，其所编码的RNA适体分子可以特异性地结合本发明的荧光团，其还包含有适宜的调节序列(如下文所述)和限制性内切酶插入位点，该插入位点可以用来在接下来的步骤中插入所需的DNA分子(编码目标RNA分子)。如上所述，RNA适体分子可以包含结合荧光团的结构域的多联体。限制性内切酶插入位点可以包含一个或者多个酶切位点，从而可以在空构建体中插入任何想要的DNA编码序列。限制性内切酶插入位点优选位于启动子序列和编码适体的DNA序列之间。根据另一个实施方式，构建的DNA分子编码本发明的RNA适体，但是，在编码RNA适体的DNA片段区域存在内含子。该内含子在空间上对RNA适体编码区域进行了分割，在没有合适剪接体的情况下进行转录，将无法得到功能性的适体分子。而在有合适剪接体的情况下，从构建的DNA分子的转录子中切除内含子，可以得到本发明的RNA适体分子。可以通过已知的DNA连接技术来制备DNA分子。DNA连接利用DNA连接酶，通过在DNA链上的5′磷酸基团与另一个DNA链上的3′羟基之间催化形成磷酸二酯键，从而将DNA片段共价连接在一起。典型地，连接反应需要强还原环境和ATP。一般反应中使用的T4DNA连接酶亦是制备本发明DNA分子的示例性DNA连接酶。本发明的DNA分子构建完成后，将其按照本申请以下部分记载的方式插入到宿主细胞中。
[0147] 本发明DNA分子的转录需要有启动子存在，启动子是一段DNA序列，其可以引导RNA聚合酶的结合从而促进RNA的合成。相应地，本发明的DNA分子可以包含可操纵地连接到第一区域的启动子，以控制RNA适体的表达。
[0148] 真核生物启动子的DNA序列与原核生物有很大区别。具体而言，真核生物启动子及其相应的遗传信号在原核系统中不能被识别且不具有功能，反之亦然，原核生物启动子及其相应的遗传信号在真核系统中不能被识别且不具有功能。
[0149] 启动子可以在“强度”上进行变化，术语“强度”是指其启动转录过程的能力。为了达到较高的转录水平，使用较强的启动子是理想的。根据所使用的宿主细胞系统，可以选择使用众多适宜的启动子中的任意一个启动子。例如，在大肠杆菌中进行克隆表达时，大肠杆菌噬菌体或者质粒以及启动子都可以被用来实现相连DNA片段的高水平转录，所述启动子如T7噬菌体启动子、lac启动子、trp启动子、recA启动子、核糖体RNA启动子、大肠杆菌噬菌体lambda的启动子PR和PL以及其它启动子，其包含，但不限于，启动子lacUV5、ompF、bla、lpp以及其类似物。此外，由重组DNA或者其它的DNA合成技术得到的杂交启动子trp-lacUV5(tac)或者其它的大肠杆菌启动子，也可以用来进行插入基因的转录。
[0150] 可以选择那些在没有特异性诱导的情况下就可以抑制启动子作用的细菌宿主细胞株和表达载体。在特定操纵子存在时，为使插入的DNA可以有效转录，加入特异性的诱导剂是必要的。例如，加入乳糖或者IPTG(异丙基-β-D-硫代吡哺半乳糖苷)可诱导lac操纵子发挥作用。许多其它的操纵子，例如trp、pro等，其受到不同条件的调控。
[0151] 如上所述，调节序列的一种类型是启动子位于DNA分子的上游或者5’端和编码序列之间。就如本申请以下部分所记载的，根据所需活性的不同，可以选择合适的启动子，从而使得不仅仅能在体外生成RNA适体，而且还能在体内即细胞或者组织中生成RNA适体。由于体内生成RNA适体的过程受到遗传调节，故优选的启动子类型是一种诱导型的启动子，此类启动子可响应特定的条件，进而诱导DNA分子的转录，从而使得RNA适体可以按照期望的方式进行表达(即在特定组织或者时间和/或发育阶段进行表达)。
[0152] 优选的用于本发明构建的DNA分子的启动子包括，T7启动子、SUP4 tRNA启动子、RPR1启动子、GPD启动子、GAL1启动子、hsp70启动子、Mtn启动子、UAShs启动子，及它们的功能性片段。T7启动子是一种典型的短DNA序列，其可被噬菌体T7的T7 RNA聚合酶所识别和利用。T7 RNA聚合酶可以通过大规模纯化和商业来源获得。T7启动子启动的转录反应可以用于本发明分子复合物的体外大规模生产(参见文献Milligan等人，“Oligoribonucleotide Synthesis Using T7 RNA Polymerase and Synthetic DNA Templates，”Nucleic Acids Res.15(21)：8783-8798(1987)，该文献的全部内容通过引用方式结合到本申请中)。SUP4tRNA启动子和RPR1启动子能够被酵母Saccharomyces cerevisiae的RNA聚合酶驱动，并适于进行长度小于400个核苷酸的RNA的高表达tyr
(参见文献Kurjan等人，Mutation at the Yeast SUP4 tRNA Locus：DNA Sequence Changes in Mutants Lacking Suppressor Activity，”Cell 20：701-709(1980)；Lee等 人，“Expression of RNase P RNA in Saccharomyces cerevisiae is Controlled by an Unusual RNA Polymerase III Promoter，”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：
6986-6990(1991)，以上每篇文献的全部内容均通过引用方式结合到本申请中)。在酵母中，
3-磷酸甘油醛脱氢酶(GPD)启动子是一种组成型启动子，其可被RNA聚合酶驱动(参见文献Bitter等人，“Expression of Heterologous Genes in Saccharomyces cerevisiae from Vectors Utilizing the Glyceraldehyde-3-phosphate Dehydrogenase Gene Promoter，”Gene 32：263-274(1984)，该文献的全部内容通过引用方式结合到本申请中)。
在酵母中，半乳糖激酶(GAL1)启动子是一种高度诱导型启动子，其可被RNA聚合酶II驱动(参见文献Johnston and Davis，“Sequences that Regulate the Divergent GAL1-GAL10 Promoter in Saccharomyces cerevisiae，”Mol.Cell.Biol.4：1440-1448(1984)，该文献的全部内容通过引用方式结合到本申请中)。在真核生物中，热激启动子是一种热诱导型启动子，其可被RNA聚合酶II驱动。热激处理后，RNA聚合酶II转录主要热激基因的次数在数分钟内能够快速增加100倍以上。另一由RNA聚合酶II驱动，且可在本发明中使用的诱导型启动子是金属硫蛋白(Mtn)启动子，该启动子受到诱导后，其转录增加的量级能够在数小时内接近达到热激启动子受诱导后转录增加的量级(参见文献Stuart等人，“A 12-Base-Pair Motif that is Repeated Several Times in Metallothionine Gene Promoters Confers Metal Regulation to a Heterologous Gene，”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：7318-7322(1984)，该文献的全部内容通过引用方式结合到本申请中)。
(参见文献Kurjan等人，Mutation at the Yeast SUP4 tRNA Locus：DNA Sequence Changes in Mutants Lacking Suppressor Activity，”Cell 20：701-709(1980)；Lee等 人，“Expression of RNase P RNA in Saccharomyces cerevisiae is Controlled by an Unusual RNA Polymerase III Promoter，”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：
6986-6990(1991)，以上每篇文献的全部内容均通过引用方式结合到本申请中)。在酵母中，
3-磷酸甘油醛脱氢酶(GPD)启动子是一种组成型启动子，其可被RNA聚合酶驱动(参见文献Bitter等人，“Expression of Heterologous Genes in Saccharomyces cerevisiae from Vectors Utilizing the Glyceraldehyde-3-phosphate Dehydrogenase Gene Promoter，”Gene 32：263-274(1984)，该文献的全部内容通过引用方式结合到本申请中)。
在酵母中，半乳糖激酶(GAL1)启动子是一种高度诱导型启动子，其可被RNA聚合酶II驱动(参见文献Johnston and Davis，“Sequences that Regulate the Divergent GAL1-GAL10 Promoter in Saccharomyces cerevisiae，”Mol.Cell.Biol.4：1440-1448(1984)，该文献的全部内容通过引用方式结合到本申请中)。在真核生物中，热激启动子是一种热诱导型启动子，其可被RNA聚合酶II驱动。热激处理后，RNA聚合酶II转录主要热激基因的次数在数分钟内能够快速增加100倍以上。另一由RNA聚合酶II驱动，且可在本发明中使用的诱导型启动子是金属硫蛋白(Mtn)启动子，该启动子受到诱导后，其转录增加的量级能够在数小时内接近达到热激启动子受诱导后转录增加的量级(参见文献Stuart等人，“A 12-Base-Pair Motif that is Repeated Several Times in Metallothionine Gene Promoters Confers Metal Regulation to a Heterologous Gene，”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：7318-7322(1984)，该文献的全部内容通过引用方式结合到本申请中)。
[0153] 在哺乳动物细胞中，转录的起始需要合适的启动因子，其包括但不限于，β-珠蛋白、GAPDH、β-actin、肌动蛋白、Cstf2t、SV40、MMTV、金属硫蛋白-1、腺病毒Ela、CMV前早期、免疫球蛋白重链启动子和增强子，以及RSV-LTR。真核基因转录的终止涉及RNA链在特定位点的剪切，在剪切发生前转录反应终止。而且，真核基因转录的终止过程也随着催化基因转录的RNA聚合酶的不同而有所变化。如何选择合适的3’转录终止区是本领域技术人员的已知技术，其可通过常规技术实现。
[0154] RNA分子的空间控制可通过组织特异性的启动子来实现，对此启动子的要求是其必须能够被RNA聚合酶II驱动。通过可以引起不同基因在不同细胞中进行转录的机制，可以在动物和植物中产生大量不同类型的细胞，许多特定的动物细胞在组织培养中生长时可以维持自身特性不变。组织特异性的启动子包含有特殊的基因开关机制，该基因开关机制可以被RNA聚合酶II驱动并可用于驱动编码本发明分子复合物的转录模板，从而可以提供一种限制分子复合物在特定组织中进行表达的机制。根据需要，可以选择各种类型的组织特异性的启动子。
[0155] 对于植物细胞中的基因表达，合适的启动子包括但不限于，nos启动子、小亚基核酮糖二磷酸羧化酶基因、小亚基叶绿素A/B结合多肽、花椰菜花叶病毒的35S启动子，以及分离自植物基因的启动子，包括Pto启动子本身(参见文献Vallejos，等人，“Localization in the Tomato Genome of DNA Restriction Fragments Containing Sequences Homologous to the rRNA(45S)，the major chlorophyllA/B Binding Polypeptide and the Ribulose Bisphosphate Carboxylase Genes，”Genetics 112：93-105(1986)(披露了小亚基材料)，该文献的全部内容通过引用方式结合到本申请中)。花椰菜花叶病毒的nos启动子和35S启动子已为本领域技术人员所知。
[0156] 此外，构建的DNA分子还可以包含可操纵的3’调控区，该调控区选自那些能够确保正确的转录终止并且在植物细胞中进行表达时能够确保mRNA正确的多聚腺苷酸化。已知许多3’调节区都可用在植物中进行操纵。示例性的3’调节区包括但不限于，胭脂碱合成酶3’调节区(参见文献Fraley，等人，“Expression of Bacterial Genes in Plant Cells，”Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA，80：4803-4807(1983)，该文献的全部内容通过引用方式结合到本申请中)，和花椰菜花叶病毒3’调节区(参见文献Odell，等人，“Identification of DNA Sequences Required for Activity of the Cauliflower Mosaic Virus 35S Promoter，”Nature，313(6005)：810-812(1985)，该文献其全部内容通过引用方式结合到本申请中)。实际上，已知的可用在植物中进行操纵的3’调节区都可以确保本发明构建的DNA分子的编码序列的正确表达。
[0157] 本发明的DNA分子构建完成后，利用传统的重组DNA技术，将其插入至宿主细胞。一般来讲，该步骤包括将DNA分子插入到与其异源的(也就是，非正常存在的)表达系统中。该异源的DNA分子按照正确的有意方向插入到表达系统或者载体。该载体包含一些必要的组成构件，这些组成构建可以确保该载体在细胞内能够持续存在，并且可以使那些能够翻译成本发明分子复合物的RNA分子进行转录。
[0158] Cohen和Boyer享有的，专利号为4,237,224的美国专利，描述了利用限制性内切酶剪切和DNA连接酶连接的方法，制备重组质粒形式的表达系统的方法，该专利的全部公开内容通过引用方式结合到本申请中。然后将这些重组质粒通过转化和转染的方法引入培养物，并实现在培养物中的复制，此培养物包含生长在组织培养液中的原核生物体和真核细胞。
[0159] 利用将质粒转染入被病毒感染的细胞的方法，可以得到重组病毒。
[0160] 合适的载体包括但不限于如下病毒载体，例如lambda载体系统：gt11、gt WES.tB、Charon 4；和质粒载体，例如pBR322、pBR325、pACYC177、pACYC184、pUC8、pUC9、pUC18、pUC19、pLG339、pR290、pKC37、pKC101、SV 40、pBluescript II SK+/-或者KS+/-(参见目录“Stratagene Cloning Systems”Catalog(1993)，此目录由Stratagene，La Jolla，Calif编写，目录全部内容通过引用方式结合到本申请中)、pQE、pIH821、pGEX、pET系列(参见文献Studier等人，“Use of T7 RNA Polymerase to Direct Expression of Cloned Genes，”Gene Expression Technology，vol.185(1990)，该文献的全部内容通过引用方式结合到本申请中)、pIIIEx426RPR、pIIIEx426 tRNA(参加文献Good and Engelke，“Yeast Expression Vectors Using RNA Polymerase III Promoters，”Gene 151：209-214(1994)，该文献的全部内容通过引用方式结合到本申请中)、p426GPD(参见文献Mumberg等人“Yeast Vectors for the Controlled Expression of Heterologous Proteins in Different Genetic Background，”Gene 156：119-122(1995)，该文献的全部内容通过引用方式结合到本申请中)、p426GAL1(参见文献Mumberg等人，“Regulatable Promoters of Saccharomyces cerevisiae：Comparison of Transcriptional Activity and Their Use for Heterologous Expression，”Nucl.Acids Res.22：5767-5768(1994)，该文献的全部内容通过引用方式结合到本申请中)、pUAST(参见文献Brand and Perrimon，“Targeted Gene Expression as a Means of Altering Cell Fates and Generating Dominant Phenotypes，”Development 118：401-415(1993)，该文献的全部内容通过引用方式结合到本申请中)，以及以上任意载体的衍生物。适宜的载体还在不断地被开发和鉴定出来。
[0161] 许多宿主-载体系统可以被用于表达DNA分子。主要地，载体系统必须能够与所使用的宿主细胞相兼容。宿主-载体系统包括但不限于如下所列：噬菌体DNA、质粒DNA或者粘粒DNA转化的细菌；微生物，例如含有酵母载体的酵母；病毒例如痘苗病毒、腺病毒、腺相关病毒、反转录病毒载体等感染的哺乳动物细胞系统；病毒(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；和细菌感染或者粒子轰击(即基因枪)转化的植物细胞。这些载体的表达组成构件在强度和特异性上相互有区别。根据所用宿主细胞系统的不同，可以使用众多适宜的转录组件中的任意一种。
[0162] 一旦构建的DNA分子克隆入表达系统，其即可被转入宿主细胞。由于载体/宿主细胞系统的不同，上述构建的DNA分子转入宿主细胞的过程可通过多种转化形式来完成，例如转化、转导、接合转移、转移或者电转化。DNA序列克隆入载体的操作采用现有领域的标准方法进行，此标准方法来源于书籍Maniatis等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Springs Laboratory，Cold Springs Harbor，New York(1982)，该书的全部内容通过引用方式结合到本申请中。合适的宿主细胞包括但不限于，细菌、酵母、哺乳细胞、昆虫细胞、植物细胞，以及上述宿主细胞的类似物。宿主细胞优选的存在于细胞培养物种(体外)，或者存在于整个生物体内(体内)。
[0163] 适合于本发明的哺乳动物细胞包括但不限于，COS(例如ATCC No.CRL 1650或者1651)、BHK(例如ATCC No.CRL 6281)、CHO(ATCC No.CCL 61)、HeLa(例如ATCC No.CCL 2)、
293(ATCC No.1573)、CHOP、NS-1细胞，和直接从哺乳动物器官回收得到的原代细胞。对于从哺乳动物器官回收得到的原代细胞，根据需要可以将其再次引入到原哺乳动物体内。
293(ATCC No.1573)、CHOP、NS-1细胞，和直接从哺乳动物器官回收得到的原代细胞。对于从哺乳动物器官回收得到的原代细胞，根据需要可以将其再次引入到原哺乳动物体内。
[0164] 多种因素的共同作用使得细胞内功能性RNA适体的高水平表达变得十分复杂，这些因素包含RNA的稳定性、短半衰期和细胞靶向中的难题。然而，在最近几年时间里，以上研究难点却取得了实质性的突破。第一次证明了适体在活细胞中的功能包括核靶(Klug等人，“In Vitro and In Vivo Characterization of Novel mRNA Motifs that Bind Special Elongation Factor SelB，”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：6676-6681(1997)；Shi等 人，“RNA Aptamers as Effective Protein Antagonists In a Multicellular Organism，”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96：10033-10038(1999)；Thomas等人，“Selective Targeting and Inhibition of Yeast RNA Polyrmerase II by RNA Aptamers，”J.Biol.Chem.272：27980-27986(1997)，以上所有文献的全部内容都通过引用方式结合到本申请中)。适体在哺乳动物细胞核内的作用也被成功揭示出来(Symensma等人，“Polyvalent Rev Decoys Act as Artificial Rev-Responsive Elements，”J.Virol.73：4341-4349(1999)，该文献的全部内容通过引用方式结合到本申请中)。近来，已经开发出了胞质标记适体的有效方法。例如，已经开发出了利用人tRNA启动序列的技术，该人tRNA可以高效地调控核导出从而将功能性的嵌合RNA适体导出到胞质(Chaloin等人，“Endogenous Expression of a High-Affinity Pseudoknot RNA Aptamer Suppresses Replication of HIV-1，”Nucl.Acids Res.30：4001-4008(2002)，该文献的全部内容通过引用方式结合到本申请中)。功能性的RNA适体还可通过脂质体直接运送到胞质(Theis等人，“Discriminatory Aptamer Reveals Scrum Response Element Transcription Regulated by Cytohesin-2，”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101：11221-11226(2004)，该文献的全部内容通过引用方式结合到本申请中)。最后，最近人们通过将其与高度稳定的转录子进行融合的方法，实现了适体的高
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水平表达(每个细胞表达了1x10 个分子)(Choi等人“，Intracellular Expression of the T-cell Factor-1 RNA Aptamer as an Intramer，”Mol.Cancer Ther.5：2428-2434(2006)，该文献的全部内容通过引用方式结合到本申请中)。
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水平表达(每个细胞表达了1x10 个分子)(Choi等人“，Intracellular Expression of the T-cell Factor-1 RNA Aptamer as an Intramer，”Mol.Cancer Ther.5：2428-2434(2006)，该文献的全部内容通过引用方式结合到本申请中)。
[0165] 适合于转化的植物组织包含叶、根、茎尖、合子胚和体胚，以及花药。其中最优选的适于转化的植物组织是来源于花药培养物的胚状体。在适宜的条件下，本发明的表达系统可用于转化任意植物组织，且转化后的细胞可在整个植株中分化。
[0166] 将本发明的DNA分子转化入植物细胞和/或者植物培养细胞、组织、悬液等的一种方法是宿主细胞的粒子轰击(又称基因枪转化)。该技术已经记载在Sanford等人的，专利号分别为4,945,050，5,036,006和5,100,792的三件美国专利中，这三件美国专利的全部公开内容通过引用方式结合到本申请中。另一种将DNA分子引入至宿主细胞的方法是将原生质体与其它的实体进行融合，这些实体包含有本发明的DNA分子，其可以是微细胞、细胞、溶酶体或者其它可融合的脂质包裹实体(Fraley等人，“Expression of Bacterial Genes in Plant Cells，”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：4803-4807(1983)，该文献的全部内容通过引用方式结合到本申请中)。本发明的DNA分子可通过电转化的方法引入至植物细胞和/或者植物培养细胞、组织、悬液等(Fromm等人，“Expression of Genes Transferred into Monocot and Dicot Plant Cells by Electroporation，”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：5824(1985)，该文献的全部内容通过引用方式结合到本申请中)。
[0167] 在生产转基因植物的过程中，可以利用显微注射针，将如上所描述的载体中的构建的DNA直接显微注射入植物细胞，从而实现重组DNA的机械转移(Crossway，“Integration of Foreign DNA Following Microinjection of Tobacco Mesophyll Protoplasts，”Mol.Gen.Genetics 202：179-85(1985)，该文献的全部内容通过引用方式结合到本申请中)。利用聚乙二醇同样可以实现遗传物质向植物细胞的转移(Krens等人，“In Vitro Transformation of Plant Protoplasts with Ti-Plasmid DNA，”Nature296：72-74(1982)，该文献的全部内容通过引用方式结合到本申请中)。可替代地，利用根瘤农杆菌的Ti质粒或者发根农杆菌Ri质粒将遗传序列引入至适宜的植物细胞，这两个质粒可以通过农杆菌感染植物细胞的方式进入植物细胞内，进而稳定的整合到植物基因组中(Schell，“Transgenic Plants as Tools to Study the Molecular Organization of Plant Genes，”Science 237：1176-83(1987)，该文献的全部内容通过引用方式结合到本申请中)。转化完成后，转化得到植物细胞必须经再生筛选，此过程可以参照如下书籍所描述的经典技术步骤进行：Evans等人，Handbook of Plant Cell Cultures，Vol.1，MacMillan Publishing Co.，New York(1983)；和 Vasil(ed.)，Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants，Acad.Press，Orlando，Vol.I(1984)和Vol.III(1986)，以上每一部参考书籍的全部内容均通过引用方式结合到本申请中。
使用方法
使用方法
[0168] 在各种使用方法中，出于各种目的的需要，都可以如本申请以下部分所记载的对本发明的分子复合物的形成(例如，荧光团:适体复合物，或者荧光团:适体:靶标分子复合物)进行鉴别、量化和监测。通过测定荧光团或者FRET伴侣分子(例如，供体或者受体)的荧光输出来检测以下样品中分子复合物的形成：无细胞的样品(例如细胞提取物或者裂解液)、组织或者组织提取物、体液、血清、血液和血制品、环境样品或者全细胞。
[0169] 不管预期的使用目的，在将荧光团和适体暴露于另一种荧光团和适体后，均需要使用合适的射线源来激发荧光团。为激发样品，此射线源可以单独使用，或者同光学纤维和任意的光波导联合使用。合适的射线源包括但不限于，经过滤的广谱光源(例如钨灯或者氙弧灯)、激光光源，例如气体激光器、固相晶体激光器、半导体二极管激光器(其中包含多量子管、分布反馈和垂直腔面发射激光器)、染料激光器、金属蒸汽激光器、自由电子激光器和使用任意其它物质作为增益介质的激光器。常规的气体激光器包含氩离子、氪离子和混合气体(例如氩气和氪气混合)离子激光器，其发射射线的波长分别为氩离子：455、458、466、476、488、496、502、514和528nm；氪离子：406、413、415、468、476、482、520、531、568、
647和676nm。在气体激光器中还包含一种氦氖激光器，其能够发射波长为543、594、612和
633nm的射线。源于固相晶体激光器的典型输出射线的波长包含532nm(倍增Nd:YAG)和
408/816nm(源于钛宝石的倍增/初级射线)。源于半导体二极管激光器的典型输出射线的波长包含635、650、670和780nm。亦可以使用红外射线光源。
647和676nm。在气体激光器中还包含一种氦氖激光器，其能够发射波长为543、594、612和
633nm的射线。源于固相晶体激光器的典型输出射线的波长包含532nm(倍增Nd:YAG)和
408/816nm(源于钛宝石的倍增/初级射线)。源于半导体二极管激光器的典型输出射线的波长包含635、650、670和780nm。亦可以使用红外射线光源。
[0170] 分子复合物的激发波长和发射检测波长是可以变化的，其依赖的因素有所用的荧光团以及与荧光团结合的核酸适体分子。如所附的实施例所记载，不同的适体分子对单个荧光团的发射光谱的影响会有所差异，从而得到非常独特的发射光谱。
[0171] 通过任一合适的检测系统，均可以实现发射光谱的检测。示例性的检测系统包括但不限于，冷CCD相机、增强型冷CCD相机、单光子计数检测器(例如PMT或者APD)、双光子技术检测器、分光光度计、荧光活化细胞分选(FACS)系统、荧光板、荧光共振能量转移和其它检测荧光团光子释放的方法或者其它检测分子荧光共振能量转移的激发的方法。
[0172] 在一个实施方式中，检测器通过透镜系统例如光学显微镜光学连接，以接收荧光团:适体复合物的发射荧光。在另一个实施方式中，使用一种光学纤维耦合器，其中光学纤维的入口位于非常接近于生物传感器的底物表面的位置，在该底物的上面或者下面。在另一个实施方式中，光学纤维提供了用于核酸传感器分子结合所需的底物，而生物传感器是作为光学纤维整体的一部分而存在的。
[0173] 在一个实施方式中，玻璃或者塑料毛细管的内表面提供了用于荧光团或者核酸传感器分子结合所需的底物。此毛细管的截面可以是圆形的也可以是矩形的，且可以是任意尺寸的。含有生物传感器的毛细管可以整合到一种微流体液体工作站系统，这种工作站系统能够向传感器管中注射不同的洗液、缓冲液和含有分析物的溶液。荧光团或者核酸传感器分子的编码，可以通过沿着毛细管轴向对其进行纵向分析表征来实现，以及围绕毛细管内壁周围对这些分子进行放射状的分析表征来实现。激发过程可以通过将激光源(例如利用一种来源于如VCSEL的成形的输出光束作为激光源)偶联到形成毛细管的玻璃或者塑料层来实现。偶联的激发光会在管的内表面/溶液表面之间的界面发生TIR作用，从而能够选择性地激发连接于管壁的荧光标记生物传感器，而不会激发本体溶液。在一个实施方式中，使用透镜耦合的或者邻近耦合的大面积分隔(像素化)检测器例如CCD进行检测。在一个特定的实施方式中，使用扫描(即纵向的/轴向的和水平的)显微镜物镜/发射光滤器的组合，将生物传感器底物成像到CCD检测器上。在一个不同的实施方式中，将在其前部带有一发射过滤器的高分辨率的CCD检测器设置在非常接近毛细管的位置处，从而可以实现对荧光团:核酸适体复合物的直接成像。在一个不同的实施方式中，使用截断面为椭圆形的镜像管腔进行高效检测。传感器管沿着管腔的一个焦点轴设置，而侧窗PMT则沿着另一个焦点轴设置并在其前部带有一发射滤器。从生物传感器管发射出的任意方向的光都将被收集到管腔中，并聚焦到PMT窗上。
[0174] 在另一个实施方式中，利用分光光度计(例如一个荧光分光光度计)对分子复合物的光学性质进行分析。分光光度计可以对激发波进行波长辨别，并可利用单色仪(即衍射光栅)，或者波长带通滤波器进行检测。在这一实施方式中，分子复合物中的荧光团，在其所使用的荧光团的最大吸收波长下进行激发，激发后，在被检测复合物最适合的发射波长下进行荧光强度的测定。如果激发光的强度远大于发射荧光的强度，那么被检测系统检测到的或者被其放大的甚至很少量的激发光都会使较弱的生物传感器的荧光发射信号变的模糊。在一个实施方式中，生物传感器分子以溶液形式存在，通过吸管将其转入(手动或者机器操作)到分光光度计内的微量板中的容器或者试管中。在另一个实施方式中，分光光度计是多功能板读数器，其具有检测光学变化的能力，该光学变化是指荧光强度或者发射光强度(在一个或者多个波长下)、时间分辨率的荧光、荧光偏振(FP)、吸收(反光和透光)等变化，所述分光光度计例如Fusion多功能板读数器系统(Packard Biosciences，Meriden，Conn)。这一系统可以用于检测生物传感器的光学变化，此生物传感器或者在溶液中，其与孔板的微孔表面相结合，或者固定于固相底物的表面(例如芯片的玻璃底物表面)。这种类型的多孔板/多底物检测系统在与自动化液体处理和样品控制器相连接后，特别适用于高通量和微量检测。
[0175] 在有些实施方式中，核酸传感器分子或者荧光团与底物相连，例如以玻片或者以微矩阵的形式，因而为了能够检测到低荧光强度的信号，最好是可以消除任何杂散的光或者背景光。在一个实施方式中，利用合适的光学识别技术，例如短暂激发或者共焦成像，对微量样品体积(大约10nl)进行检测，从而进行空间辨别。进一步地，利用样品和检测器之间的窄带滤波器，将背景光最小化，以及利用暗屏蔽作用从检测系统中消除掉任何环境光。
[0176] 在一个实施方式中，通过短暂波激发实现本发明分子复合物(荧光团:核酸适体复合物或者荧光团:核酸适体:靶标分子复合物)的空间辨别，其是将分子复合物以垂直于底物接触面的方向与底物相连。这一实施方式如图25A所示。短暂波激发利用的是电磁能，当电磁波在较高和较低折射率材料之间发生完全地内部反射时，其会传播入较低指数的折射介质中。在该实施方式中，一个准直激光束以大于全反射(TIR)临界角的角度入射在底物/溶液的界面上(荧光团:核酸适体复合物或者荧光团:核酸适体:靶标分子复合物固定于此)。这一过程可通过将光导入到适宜形状的棱镜或者光学纤维来实现。在棱镜条件下，如图25A所示，将底物光学连接(通过折射率匹配液)到棱镜上表面，从而使得TIR会在底物/溶液界面发生，此界面上固定有分子复合物。使用此种方法，激发可以定位在几百个纳米内的底物/溶液界面上，从而消除来自于分析物本体溶液、光学或者底物的自发荧光背景。靶标识别是通过对分子复合物荧光发射变化的监测实现的，即是否在强度或者极化上存在变化。界面平面上(即横向)的空间辨别是通过光学系统实现的。
[0177] 如图25A所示的实施例，提供了一种TIRF短暂波长激发光学识别的方法，其利用的检测系统包含普通的荧光显微镜。可以采用任意和TIRF相兼容的荧光显微镜。TIRF激发光或者激光的照射角度可以设置为从样品上方向下照射到样品上(如图25所示)，或者穿过物镜向上照射到样品上。利用NHS-活化的玻片，对适体或者荧光团进行固定化可以得到有效的结果。含有游离氨基(在R1位)的荧光团可以用来同NHS-玻片反应。可以对RNA的5’端用氨基进行修饰从而使其可以进行NHS反应，修饰可以在存在氨基修饰的GTP类似物(商业购买得到)的条件下进行T7合成的方式来完成。
[0178] 在上述一些实施方式中，检测系统的输出端优选与处理器相连，该处理器可用于处理检测器检测到的光学信号。处理器可以是个人计算机的形式，其包含输入/输出(I/O)卡，该卡通过数据总线与处理器相连。CPU/处理器接受并处理数字输出信号，并可以将其与存储检测到的输出信号的存储器相连。存储器可以是随机存取储存器(RAM)和/或者只读存储器(ROM)，其和其它的常规集成电路一起用在一个单板计算机上，这些技术都是本领域技术人员所熟知的。此外，该存储器还可以包括软盘、硬盘、CD ROM或者其它的计算机可读介质，该计算机可读介质可以通过磁力、光学、或者其它的连接有一个或多个处理器的读/写系统读写。存储器可以包含使用说明，其写在软件包(用于图像处理)中，如本申请所述，其可用在本发明的一个或者多个方面。
[0179] 除了可以特异性的与荧光团结合之外，大量的适体已经被证明其与靶标荧光团的亲和力受到环境条件的调节。
[0180] 根据一个实施方式，适体对荧光团的亲和力具有部分的或者全部的离子依赖性，2+ +
也就是任何单价或者二价离子。实例表明适体对Mg 或者K 具有敏感性。其它实例鉴定出了能够与其它的离子特异性结合的适体，此适体可插入到本发明的传感器中。这些适体包括但不限于，对锌离子特异性的适体(Rajendran等人，“Selection of Fluorescent Aptamer Beacons that Light Up in the Presence of Zinc，”Anal.Bioanal.
Chem.390(4)：1067-1075(2008)，该文献的全部内容通过引用方式结合到本申请中)、对钴离子特异性的适体(Breaker等人，“Engineered Allosteric Ribozymes as Biosensor Components，”Curr.Op.in Biotech 13(1)：31-39(2002)，该文献的全部内容通过引用方式结合到本申请中)和对铅离子特异性的适体(Brown等人，“A Lead-dependent DNAzyme with a Two-step Mechanism，”Biochem.42(23)：7152-7161(2003)，该文献的全部内容通过引用方式结合到本申请中)。
也就是任何单价或者二价离子。实例表明适体对Mg 或者K 具有敏感性。其它实例鉴定出了能够与其它的离子特异性结合的适体，此适体可插入到本发明的传感器中。这些适体包括但不限于，对锌离子特异性的适体(Rajendran等人，“Selection of Fluorescent Aptamer Beacons that Light Up in the Presence of Zinc，”Anal.Bioanal.
Chem.390(4)：1067-1075(2008)，该文献的全部内容通过引用方式结合到本申请中)、对钴离子特异性的适体(Breaker等人，“Engineered Allosteric Ribozymes as Biosensor Components，”Curr.Op.in Biotech 13(1)：31-39(2002)，该文献的全部内容通过引用方式结合到本申请中)和对铅离子特异性的适体(Brown等人，“A Lead-dependent DNAzyme with a Two-step Mechanism，”Biochem.42(23)：7152-7161(2003)，该文献的全部内容通过引用方式结合到本申请中)。
[0181] 根据另一实施方式，适体对荧光团的亲和力具有温度依赖性。因此，当温度非常高时，进行滴定发现不存在结合现象，而当温度较低时，我们发现了很高的结合率。基于特定适体-荧光团对的性质，可以通过测定荧光输出的方式来确定系统内温度的高低。具有这一性质的适体可以作为传感器使用(以下将做讨论)，以确定环境温度。
[0182] 根据另一实施方式，适体对荧光团的亲和力具有部分的pH依赖性。在接近中性pH时，适体相当稳定，但是当pH较高或者较低时，适体折叠或者荧光团和适体之间的相互作用会受到干扰，从而反映在荧光发光上，即随着pH远离中性的变化，我们也会测量到荧光发光的变化。具有这一性质的适体可以作为传感器使用(以下将做讨论)，以测定环境的pH值。
[0183] 含有第一和第二结构域的多价适体可以用于介质或者样品中靶标分子的检测。检测方法是，在一定条件下，将本发明的核酸适体分子暴露于疑似含有靶标分子的介质中，在该条件下可以使得第二结构域特异性的与靶标分子结合(如果靶标分子存在)，并且在一定条件下将该核酸分子和介质暴露于本发明的荧光团中，在该条件下可以使得第一结构域在靶标分子与第二结构域结合后其可以特异性的与荧光团结合，从而诱导荧光团形成一种构象，该构象表现出荧光发射增强的特征。通过在合适波长射线下激发荧光团(或者FRET受体分子)后测定荧光团的荧光活性，从而对分子复合物的形成进行检测，检测到荧光就说明核酸分子和靶标分子已经结合，进而可以说明靶标分子存在。
[0184] 这一实施方式可以在全细胞中进行，具体可通过将核酸适体分子引入到全细胞中或者通过转化带有编码核酸适体分子的转基因的全细胞的方式来进行。可以将荧光团引入到全细胞的环境，在该环境中荧光团很容易被吸收。这一实施方式亦可在非细胞的环境中进行。测定过程的图像亦可以通过以上描述的检测系统获得或者生成。
[0185] 本发明的这一方面特别适用于芯片模式，在用于芯片中时可以将核酸适体分子固定在底物表面(即固相载体)的离散位置。用于形成芯片表面的固相载体可以包括但不限于，玻璃、金属和陶瓷载体。核酸适体分子的固定可以通过使用5’-生物素连接到链霉素包被的玻璃上来实现(ArrayIt公司)。在这些系统中，荧光团以溶液形式存在，并且在靶标分子与表面-结合适体的第二结构域结合后，荧光团会附于玻璃表面，从而形成荧光团:适体:靶标复合物，该复合物可以被例如TIRF检测到。传感器可以以任意矩阵形式进行点样，也就是微黑子矩阵或者设置成其它形状或者表面上的设计，从而可以使得传感器按照空间位置确定的方式来进行定位。这可以实现，在与含有一种或多种已知或未知浓度的靶标分子的混合物进行接触后，可以对特异于不同靶标分子的一种或一系列传感器进行分析。在用含有已知量的靶标分析物的适宜溶液对荧光信号进行校准处理后，荧光强度可以用来确定浓度。
[0186] 用于监测转录组的芯片是常规工具，其使生物学发生了彻底变革，但是用于蛋白质组的相似方法目前仍不可得。本发明的系统和方法可以获得蛋白质-传感器芯片。该用于蛋白质检测的新型平台在推进蛋白分析在众多领域中的应用方面有巨大潜力。例如，这些芯片可用来分析一组特定蛋白，例如临床相关的生物标记物，或者用于分析蛋白质组的大类别，例如具有特定功能的蛋白质组。目前的芯片技术主要是利用一组抗体来实现的，为了使蛋白结合抗体后能够被检测到，需要对生物样品中的蛋白用荧光染料进行标记，荧光染料例如Cy5-NHS。因为标记操作可能会对抗体识别的抗原决定部位产生影响，因此这是一个问题。相反地，本发明的传感器芯片不需要靶标标记，这是因为传感器仅在靶标分子与传感器的第二结构域结合后，其才能与荧光团结合(在其第一结构域)。本发明的芯片模式已经克服了困扰抗体分析的许多问题，因为：(1)适体传感器分子成本低；(2)寡聚核苷酸能够非常方便地连接到芯片表面；(3)可以可靠地合成寡聚核苷酸的同源物，而这对抗体而言是一种挑战；(4)相较于抗体，寡聚核苷酸的稳定性增加；(5)适体-蛋白质相互作用的高度特异性，这通常包含大的表面(Stoltenburg等人，“SELEX-A Revolutionary Method to Generate High-affinity Nucleic Acid Ligands，”Biomolecular Engineering24：381-403(2007)；Hermann and Patel，“Adaptive Recognition by Nucleic Acid Aptamers，”Science 287：820-825(2000)，以上每一篇文献的全部内容都通过引用方式结合到本申请中)而非像抗体中的短的表位，而非小的抗原决定簇；和(6)样品前期准备方便，因为利用这些蛋白传感器获得荧光信号不需要使用荧光染料对样品进行标记处理。可替代地，靶标蛋白和传感器的结合能够充分的诱导荧光信号(在溶剂相荧光团存在的条件下)，从而大大的简化蛋白混合物的分析过程。
[0187] 因此，暴露于靶标和荧光团后分子复合物形成，而荧光团经光照刺激，将会在矩阵表面的特定位置表现出荧光发射。使用合适的绘图软件，当荧光发射信号存在时，以阳性标记标识分子，以表示在测试样品中存在靶标分子。如上所述，经可靠的校准处理完成后，还可以进行定量测定。
[0188] 本发明的另一个方面涉及应用多价适体对靶标分子的位置进行监测，尤其是在全细胞中的位置，其中此多价适体含有第一和第二结构域。本发明的这一方面包括形成分子复合物(荧光团:适体:靶标分子)、使用合适波长的光激发荧光团，以及测定荧光团的荧光发射，其中荧光团的荧光发射可以验证靶标分子的存在。在全细胞中，该实施方式可通过将核酸适体分子引入到全细胞中或者通过转化带有表达核酸适体分子的转基因的全细胞的方式来进行。一旦进入细胞内，核酸适体分子将会特异性的通过第二结构域与靶标分子结合。可以将荧光团引入到全细胞的环境中，荧光团在该环境中很容易被吸收。测定过程的图像亦可以通过以上描述的检测系统获得或者生成。
[0189] 编码RNA适体分子的DNA构建体可以用于测定目标启动子在细胞内的转录情况。这可以通过，先将DNA构建体或者编码RNA适体分子的转基因引入到细胞，然后将荧光团引入到细胞，再根据测定得到的细胞内荧光发光的量来确定适体:荧光团复合物是否形成。
[0190] 本发明的这一方面可以用于筛选试剂，筛选依据是其调节DNA构建体转录的能力以及调节含有和DNA构建体相同启动子的天然基因转录的能力。当筛选试剂时，要将试剂引入到细胞，优选在引入荧光团之前。在适当的时间间隔(为了保证核酸适体转录)后，将荧光团引入到细胞。当检测到细胞内的荧光团:适体复合物的荧光与其它条件都相同但未经处理的对照细胞的荧光相比出现增加或者降低，则说明试剂改变了启动子的转录水平。
[0191] 在一个可替换的实施方式中，可以将相同的DNA构建体应用在体外检测中，其中将DNA构建体和试剂都引入到细胞但不引入荧光团。不同的是，首先从细胞中回收转录子(利用已知的细胞裂解和RNA收集方法)，然后再将荧光团引入到回收得到的RNA转录子中。荧光团可以和适宜的检测工具的固相表面相结合，检测工具可以是例如TIRF系统或者如上所描述的其它类型的检测器。当检测到回收转录子内的荧光团:适体复合物的荧光与从其它条件都相同但未经处理的对照细胞中回收得到的转录子的荧光相比出现增加或者降低，则说明试剂改变了启动子的转录水平。
[0192] 本发明的另一个方面涉及监测细胞内的RNA分子。本发明的这一方面包括使用本发明的DNA构建体，该DNA构建体可以表达RNA融合物，该RNA融合物含有本发明的RNA适体以及与其相连的目标RNA分子。将DNA构建体引入至细胞并转录后，再将本发明的荧光团引入至细胞。这可以使得RNA融合分子中的RNA适体部分特异性的与荧光团相结合(形成适体:荧光团复合物)，并且增强了荧光团的荧光发射。RNA融合分子的检测(包含其位置、数量或者降解情况)可以通过将细胞暴露于合适波长的射线下，以诱导复合物内荧光团的荧光发射，进而测定荧光团或者FRET伴侣分子荧光发射的方式来实现。荧光发射的(亚)细胞位置表示了转录子的位置。同时，随着时间推移，荧光发射的任何降低都可以表明转录子的降解反应。后者可以通过回收RNA转录子并使用例如RT-PCR技术测定RNA融合物的方式来进行验证。最后，荧光发射水平与存在的RNA融合分子的量有关联。
[0193] 在这一实施方式中，拟监测的RNA产物可以是各种功能的各种RNA分子。包括但不限于，前体mRNA、mRNA、前体rRNA、rRNA、tRNA、hnRNA、snRNA、miRNA或者长的非编码RNA、PIWI RNA、末端相关RNA、非编码RNA、启动子相关RNA和病毒RNAs。
[0194] 为了增强荧光信号，可以通过RNA适体多联体将多个荧光团锚定在一起，其中所述多个荧光团都可以与一种RNA转录子结合。
[0195] 此外，本发明的这一方面特别适用于同时评估多种RNA分子的转运或者降解情况。根据锚定的不同适体:荧光团复合物的发射谱，上述应用是可能的。因此，本发明的这一方面可以包括将第二DNA构建体引入至细胞，其中，该第二DNA构建体可以编码不同的RNA融合分子，该RNA融合分子包含不同的本发明RNA适体(或者它的多联体)，该RNA适体(或者它的多联体)与不同的目标RNA转录子相连。在将DNA构建体引入至细胞并转录后，将本发明的第二荧光团引入至细胞，也就是可以被第二RNA融合分子中存在的适体特异性结合而不能被第一RNA融合分子中存在的适体结合的荧光团，或者相反。这可以使得转录子中的RNA适体部分特异性的与荧光团相结合(形成适体:荧光团复合物)，从而增强荧光团的荧光发射。荧光发射的检测方法如上所述。同时对不同发射峰进行检测，可以实现同时测定两种复合物的定位或者共定位。
[0196] 本发明的另一个方面涉及监测细胞内的靶标分子。本发明的这一方面可以通过利用核酸适体分子来实现，该核酸适体分子包含如上所述的第一和第二结构域，其中第一结构域只有在第二结构域特异性与靶标分子结合后其才能与荧光团特异性结合。将本发明的核酸适体分子和荧光团引入至细胞，在靶标分子存在的条件下，会形成荧光团:适体:靶标复合物，该复合物能够增强荧光团的荧光发射。将细胞暴露于合适波长的射线下，以诱导复合物中结合的荧光团或者FRET适体分子的荧光发射；然后测定荧光团或者FRET伴侣分子的荧光发射，从而监测靶标分子。根据这一方法，荧光发射的胞内位置指示了靶标分子的位置，荧光发射随时间的下降表明靶标分子存在降解反应，而荧光发射随时间的增加表明靶标分子存在累积作用。靶标分子的定量与测定的荧光发射的水平相关。
[0197] 本发明这一方面所涉及的靶标分子可以是任何之前所述的蛋白质、脂质、糖类、激素、细胞因子、趋化因子、代谢产物、有机分子，或者金属离子。
[0198] 本发明这一方面的实现方式可以是，通过将核酸适体直接引入至细胞来完成，或者可替换地将编码核酸适体分子的基因引入至细胞来完成。
[0199] 本发明的另一个方面涉及一种筛选可以改变基因表达的药物的方法。这一方面可以通过利用编码本发明RNA适体分子的转基因来实现。该转基因带有目标启动子，该启动子的活性可以通过被筛选药物来进行监测。在将转基因引入至细胞后，将该细胞暴露于药物和本发明的荧光团，从而有效地将这些化合物引入至细胞中。其后，通过以下方法来测定RNA适体的转录水平：通过将细胞暴露于合适波长的射线下，诱导与RNA适体分子或者FRET伴侣分子结合的荧光团产生荧光发射，随后再如之前所述的方法对荧光团或者FRET伴侣分子的荧光发射进行测定。相对于其它条件都相同但未经药物暴露处理的对照细胞，药物处理过的细胞荧光发射的减少或者消失，表明药物能够抑制转基因的表达。相对于其它条件都相同但未经药物暴露处理的对照细胞，药物处理细胞荧光发射的增加，表明药物能够促进转基因的表达。
[0200] 本发明的另一个方面涉及一种筛选可以改变RNA剪接的药物的方法。这一方面可以通过利用编码本发明RNA适体分子的转基因来实现，其中，该转基因的RNA转录子包含内含子，该内含子经正确剪切后可以产生成熟的RNA分子，该RNA分子是具有功能活性的本发明的荧光团-结合RNA适体。这一方法可以通过以下方式实现：将转基因引入至细胞并将细胞暴露于药物，开始转录从而使得在剪接开始时细胞中同时存在未成熟的转录子和药物。也可以将本发明的荧光团引入至细胞，如果经正确剪接则成熟的RNA适体可以特异性的与荧光团结合，从而增强荧光团的荧光发射。可以通过以下方式来确定是否存在(或不存在)正确剪接：将细胞暴露于合适波长的射线下，从而诱导荧光团(被成熟的RNA适体分子结合)或者它的FRET伴侣分子的荧光发射，进而测定荧光团或者FRET伴侣分子的荧光发射。相对于其它条件都相同但未经药物暴露处理的对照细胞，药物处理过的细胞荧光发射的减少或者消失，表明药物能够抑制转录子的正确剪接。相对于其它条件都相同但未经药物暴露处理的对照细胞，药物处理过的细胞荧光发射的增强，表明药物能够促进转录子的正确剪接。
[0201] 本发明的这一方面亦可以在体外进行。基本上，提供一种介质，该介质含有未成熟的RNA转录子(带有内含子)、含有合适的剪接酶的剪接体、欲筛选的药物和荧光团。如上所述，未成熟的RNA转录子包含带有内含子插入区域的第一和第二外显子，并且，当切除内含子时所述第一和第二外显子可以形成本发明的RNA适体分子。将介质暴露于合适波长的射线下，诱导与RNA适体分子(FRET伴侣分子)结合的荧光团的荧光发射，然后再测定荧光团或者FRET伴侣分子的荧光发射。相对于其它条件都相同但缺少药物的介质，药物处理过的介质荧光发射的减少或者消失，表明药物能够抑制转录子的正确剪接。相对于其它条件都相同但缺少药物的介质，药物处理过的介质荧光发射的增加，表明药物能够促进转录子的正确剪接。
[0202] 而本发明的另一个方面涉及一种筛选对靶标分子具有活性(即能够增强或者减弱靶标分子的活性)的药物的方法。这一方法可以通过以下方式来实现：将本发明的核酸适体分子引入到细胞内或者在细胞内进行表达，该核酸适体分子包含如上所述的第一和第二结构域，其中第一结构域只有在第二结构域特异性的与靶标分子结合后才能与荧光团特异性结合。将一种以上所述类型的荧光团也引入到细胞中，当靶标分子与第二结构域结合后，该荧光团可以特异性的与核酸分子的第一结构域结合，从而增强第一荧光团的荧光发射。将细胞暴露于合适波长的射线下，诱导复合物中结合的荧光团或者FRET适体分子的荧光发射，然后测定荧光团或者FRET伴侣分子的荧光发射，从而确定靶标分子的活性是否被药物改变。将其它条件都相同但缺少药物的细胞与药物处理过的细胞比较，当它们在荧光团或者FRET伴侣分子的荧光发射上存在差异时，则表明药物改变了靶标分子的活性。
[0203] 本发明的另一个方面涉及从头生成(de novo)用于特定靶标的适体类传感器，本领域中没有任何有关于该适体可用于此类特定靶标的提示。这一过程利用改进的SELEX方法来实现，其中，池中的每一个核酸分子都含有部分去稳化的适体分子，该适体分子含有可以特异性结合本发明的荧光团的第一结构域，以及包含有全部或者部分随机序列的第二结构域。通过对第一结构域进行去稳化处理，从而使得只有在第二结构域与靶标分子结合后，第一结构域才能特异性的与荧光团相结合。图23A示出了24-1适体，其改进后可用于SELEX类的方法以进行传感器开发。
[0204] SELEX方法可以通过以下方式实现，将核酸分子池暴露于靶标分子和荧光团(由此使得荧光团的荧光发射在第一结构域与荧光团结合后被增强)。用合适波长的光照射荧光团，诱导与第一结构域结合的荧光团的荧光发射，测定荧光团的荧光发射，从而为是否有池中的成员能够与靶标分子结合(通过其第二结构域)提供指示。
[0205] 可以将池中的RNA成员过荧光团-结合琼脂糖来进行“预筛”。这一过程可以移除文库中仍然保留组成型荧光团-结合活性的成员(也就是，甚至当功能活性的第二结构域不存在时，仍然能和靶标结合的文库成员)。下一步，将池暴露于荧光团-结合琼脂糖中，在这一步骤中，孵化缓冲液中不加入靶标。所有冲洗液都包含靶标。冲洗后后，使用相同的缓冲液进行洗脱，但该缓冲液不含有靶标。因此，能够和荧光团结合的任何RNAs都依赖于欲洗脱的靶标。回收RNAs进行随后的SELEX筛选循环，从而富集靶标调节的传感器。和上述实施方式相同，筛选出的每个池，在含有靶标或者不含靶标条件下分别进行检测，随后分离得到表现出靶标依赖性荧光的各个克隆。
[0206] 为了保证传感器不会对结构相关的分子产生响应，可以使用一个阴性筛选。为了实现这一目的，可以将这些结构相关的分子也加入到洗脱缓冲液中，如果它们能够促进荧光团的结合，则它们将会保留在琼脂糖中(没有被这些结构相关的分子改变的传感器构建体将会被洗脱出去)。试剂盒
[0207] 本发明的另一个方面涉及各种可以实施本发明的试剂盒。试剂盒的组份可以根据所需的应用而变化，本发明所确定的任意试剂都可以包含在一个或者多个试剂盒中。如本申请以下所述，试剂盒的组分可以在独立容器中分开包装也可以混合在一起。同时还可以提供使用方法说明。
[0208] 例如，根据一个实施方式，试剂盒可以包含一种本发明的荧光团以及多个核酸适体或者编码这些适体的遗传构建体。可以设计遗传构建体进行RNA转运研究或者多价传感器分子的表达研究。不管采用何种适体构建方法，都可以选择能够结合一个荧光团的适体组份，从而使得多个核酸适体中的每一个适体都会引起该荧光团的不同荧光发射特征。通过这种方法，可以将一种荧光团用于多个同时的检测。
[0209] 根据这一实施方式，多个核酸适体可以分别提供，例如分装在不同的容器中或者其还可以作为混合物或者作为各种混合物提供，从而使得每种混合中的相同荧光团具有不同的混合的荧光发射图谱。
[0210] 这种类型试剂盒的一个实施例，如所附实施例中所记载的，其包含荧光团DMHBI和适体产物，该适体产物至少包含最小适体序列，所述最小适体序列是指适体23-11、2-4、17-3、13-2和3-6以及它们的混合物中的至少两条序列。
[0211] 根据另一实施方式，试剂盒可以包含一个或者多个荧光团，其固定在底物上以进行SELEX筛选。底物可以是适于FTIR的流细胞。
[0212] 根据另一个实施方式，试剂盒可以包含一个或者多个核酸适体，其固定在底物的表面。底物可以含有多个核酸适体，所述多个核酸适体以离散形式分布从而形成矩阵。核酸适体保留在矩阵上的点可以是任意期望的形状。
[0213] 根据另一实施方式，试剂盒可以包含多个不同的本发明荧光团，以及多个不同的本发明核酸分子，所述核酸分子可以特异性的与所述多个荧光团中的至少一个结合。优选地，每个荧光团只含有一个单价的或者多价的核酸适体分子。为了使得它们可以组合使用，所以每个荧光团:适体对都应具有不同的发射光谱从而使得每个荧光团:适体对都可以被独立地检测到。如所附实施例所示，多个不同的适体/荧光团复合物可以产生不同的发射光谱。多种颜色可以使得同时对多种RNAs进行成像，并可以用来开发出蛋白质-RNA和RNA-RNA FRET系统。
[0214] 例如，通过使用带有可以与FRET相兼容的不同荧光团的多传感器分子，可以实现对RNA或者DNA与荧光蛋白、RNAs或者其它分子的相互作用进行检测。当适宜的受体荧光团与受体荧光团足够接近时会出现FRET。因此，荧光蛋白、RNA、DNA或者其它分子和RNA-荧光团复合物之间的相互作用，可以通过测定受体光激发引起的FRET荧光发射来实现。类似于这一方法的测定方法，可以用于检测荧光团分子和RNA结合的比率，所述RNA使用RNA-荧光团复合物在体内和体外装置中进行标记。在一个类似的应用中，RNA-荧光团复合物作为供体，而荧光蛋白、RNA、DNA，其它分子作为受体。在这些情形中，RNA-荧光团复合物先被激发，然后检测FRET发射从而确认是否存在相互作用。在本申请中，FRET伴侣分子是指FRET受体或者FRET供体，其与本发明所涉及的荧光团/适体复合物结合使用。
[0215] 根据另一实施方式，试剂盒可以包含如上所述的本发明的空的遗传构建体，以及一个或者多个以下组件：一个或者多个限制性内切酶、一个或者多个本发明的荧光团化合物(其可以可操纵地连接所述构建体编码的适体序列)和说明书，该说明书介绍了如何将编码目标RNA分子的DNA分子插入到限制性位点，从而形成编码包含有连接到RNA适体分子的目标RNA分子的转录子的遗传构建体。实施例
[0216] 以下实施例用于描述本发明的实施，而不对本申请所要求保护的发明范围产生任何限制。实施例1 GFP-模拟荧光团的合成
[0217] 合成4-亚芳基-5-咪唑啉酮(例如绿色荧光蛋白中发现的那些化合物)的最广泛使用的方法最初是由Kojima等人开发的(“Fluorescent Properties of Model Chromophores of Tyrosine-66 Substituted Mutants of Aequorea Green Fluorescent Protein(GFP)，”Tet.Lett.39：5239-5242(1998)，该文献的全部内容通过引用方式结合到本申请中)，该方法包括在N-乙酰甘氨酸和4-羟基苯甲醛之间进行Erlenmeyer氮内酯(azlactone)形成反应。得到的氮内酯先进行氨解，然后在碱性条件下进行环化，从而形成终产物4-羟基苯亚甲基-5-咪唑啉酮(HBI)。
[0218] 合成新型荧光团3，5-二甲氧基-4-羟基苯亚甲基-5-咪唑啉酮(DMHBI)的方法与上述合成方法基本相同，只是所使用的起始原料选用不同的取代苯甲醛。加入这些替代物可以为RNA提供额外的作用位点，从而使得RNA适体更容易固定荧光团进而诱导荧光发射。
[0219] 如图1A所示，DMHBI合成的起始原料是可以通过商业渠道获得的3，5-二甲氧基-4-羟基苯甲醛，将该原料在醋酸酐回流的条件下，与N-乙酰甘氨酸和醋酸钠进行反应。将N-乙酰甘氨酸(0.65g，0.005mol)，醋酸钠(0.5g，0.005mol)，3，5-二甲氧基-4-羟基苯甲醛(1.00g，0.005mol)和醋酸酐(10ml)在90℃下搅拌反应。(反应1小时后，薄层层析色谱观察到产物斑点。)反应2小时后，停止加热，将混合液降至室温。搅拌条件下，将冰冷的乙醇缓慢加入到悬浮液中，在4℃下避光反应过夜。得到的晶状固体(亮黄色结晶)依次用20ml乙醇(-20℃，1X)、20ml热水(3X)、20ml己烷(1X)进行冲洗，最后进行真空干燥。
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最后获得数克产物，产率为70％。H NMR(400MHz，CHCl3-d4)δ2.37(s，3H，CH3)，2.41(s，3H，CH3)，3.89(s，6H，甲氧基碳)，7.27(s，1H，桥碳)，7.44(d，2H，芳环)。
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最后获得数克产物，产率为70％。H NMR(400MHz，CHCl3-d4)δ2.37(s，3H，CH3)，2.41(s，3H，CH3)，3.89(s，6H，甲氧基碳)，7.27(s，1H，桥碳)，7.44(d，2H，芳环)。
[0220] 纯化处理后的氮内酯随后在乙醇中与碳酸钾和过量的甲胺一起回流，以进行一步氨解(one pot aminolysis)和再环化反应。通过以下步骤来合成4-(4-羟基-3，5-二甲氧基苯亚甲基)-1，2-二甲基-咪唑-5-酮：将氮内酯(1.24g，0.05mol)与15ml乙醇、1ml40％的甲胺水溶液和700mg碳酸钾回流4小时。反应完毕，将反应混合液冷却至室温，用1M
1
HCl冲洗，然后使用柱色谱进行浓缩纯化，产物的产率为64％。H NMR(400MHz，CHCl3-d4)δ2.37(s，3H，CH3)，3.11(s，3H，CH3)，3.89(s，6H，甲氧基碳)，6.91(s，1H，桥碳)，7.62(d，
2H，芳环)。
实施例2 树脂固定化荧光团的合成
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HCl冲洗，然后使用柱色谱进行浓缩纯化，产物的产率为64％。H NMR(400MHz，CHCl3-d4)δ2.37(s，3H，CH3)，3.11(s，3H，CH3)，3.89(s，6H，甲氧基碳)，6.91(s，1H，桥碳)，7.62(d，
2H，芳环)。
实施例2 树脂固定化荧光团的合成
[0221] 为了进行SELEX筛选以及获得可以和本发明所选定的荧光团相结合的RNAs，需要提供一种将选定的荧光团固定到树脂上的方法。因此，我们开发了一种用于获得包含有氨烷基连接臂的荧光团的通用合成机制。氨烷基连接臂可以和通过商业渠道获得的NHS-活化树脂相连接(图1B)。
[0222] 首先将氮内酯中间体(实施例1制备获得)与N-叔丁氧羰基(BOC)-1，6-己二胺反应进行氨解和接下来的环化。BOC-保护的产物先经硅胶纯化处理，然后在二氯甲烷下用三氟乙酸(TFA)处理以除去BOC基团。硅胶纯化处理后获得纯的荧光团，该荧光团带有己基连接臂和游离的氨基，该游离氨基可以和氨基-反应活性的树脂相连接。
[0223] 随后将带有连接臂的DMHBI和NHS-活化的琼脂糖树脂偶联。首先，将荧光团用DMSO溶解使其浓度达到40mM，然后再用100mM pH为7.5的HEPES缓冲液进行稀释，使DMSO最终浓度达到5％，DMHBI最终浓度达到2mM。将最终得到的荧光团溶液加入到NHS-活化的琼脂糖中，在此之前NHS-活化的琼脂糖已经使用2倍体积的冰冷缓冲液进行了预平衡。树脂和荧光团在4℃下避光反应过夜。第二天，轮流使用酸性和碱性洗液对树脂进行充分冲洗，然后存放在70％的醋酸钠(NaAc)乙醇溶液中，存放条件的pH为5.4，存放温度为4℃。
由于DMHBI具有特定的吸收光谱，在中性环境下，其最大吸收波长为400nm，因此可以很容易地对结合了琼脂糖的荧光团的量进行测定。分别测定在与琼脂糖反应之前和之后的荧光团偶联溶液的吸光度(A400)。利用根据标准溶液确定的DMHBI的消光系数，计算出95％的修饰荧光团实现了与NHS-琼脂糖的偶联。计算结果表明，每1ml树脂可以结合将近5μmol荧光团。
实施例3 新型GFP-模拟荧光团的荧光特性
由于DMHBI具有特定的吸收光谱，在中性环境下，其最大吸收波长为400nm，因此可以很容易地对结合了琼脂糖的荧光团的量进行测定。分别测定在与琼脂糖反应之前和之后的荧光团偶联溶液的吸光度(A400)。利用根据标准溶液确定的DMHBI的消光系数，计算出95％的修饰荧光团实现了与NHS-琼脂糖的偶联。计算结果表明，每1ml树脂可以结合将近5μmol荧光团。
实施例3 新型GFP-模拟荧光团的荧光特性
[0224] 对于GFP，其发光团位于蛋白β-筒体结构的内部，且通过与一些氨基酸残基的直接相互作用使得发光团形成刚性结构(图1C)。蛋白可以使得发光团呈非弹性定位，这是引起荧光量子产率变大的原因。相似地，只有当其结构被固化溶剂刚性化后，合成的GFP发光团4-羟基苯亚甲基-1，2-二甲基-咪唑-5-酮(“HBDI”)才具有明亮的荧光(Niwa等人，“Chemical Nature of the Light Emitter of the Aequorea Green Fluorescent Protein，”Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 93：13617-13622(1996)，该文献的全部内容通过引用方式结合到本申请中)。因此，为了验证DMHBI是否也展现出固定化-依赖的荧光特性(该特性可以在天然荧光团中观察到)，我们进行了DMHBI固定化。实验开始时先将DMHBI溶解到乙醇中，然后将该溶液用液氮速冻得到乙醇玻璃态基质。同天然GFP荧光团的报道相同，取代的荧光团在室温下无荧光活性，但是冷冻后，其荧光活性显著增强(图2A)。
[0225] 为了更精确地评价固定化对DMHBI荧光活性的影响，制备10μMDMHBI水溶液，并对其在递增甘油浓度条件下的荧光光谱进行测定。众所周知，甘油能够以一种可预测的方式影响水溶液的粘度，因而递增的粘度对于DMHBI荧光活性的影响可以很容易的测定出来。我们观察到随着甘油浓度的增加，荧光强度逐步上升(图2B)。重要的是，在甘油浓度为20％时，观察到非常有限的荧光活性，此时溶液的粘度水平和胞浆相当(Endre and Kuchel，“Viscosity of Concentrated Solutions and of Human Erythrocyte Cytoplasm Determined from NMR Measurement of Molecular Correlation Times；The Dependence of Viscosity on Cell Volume，”Biophys.Chem.24：337-356(1986)，该文献的全部内容通过引用方式结合到本申请中)。
[0226] 对DMHBI荧光特性的进一步分析显示，在生理pH(7.4)的高粘度溶液中，荧光团的最大激发波长为400nm，最大发射波长为460nm。该分析结果与先前有关合成的GFP发光团的荧光谱数据相符合，其不能进行激发态的质子转移反应，而质子转移反应则是GFP蛋白中绿色光谱发射的关键反应。原始的GFP蛋白其最大激发波长为400nm。产生这一结果的原因是发光团的酚羟基在中性pH和原始蛋白的背景下保持质子化状态。酚盐的去质子化会使得最大激发波长到达约475nm。
[0227] 以往对传统的荧光发光RNA结合的染料的研究主要集中在三苯甲基烷类染料，例如孔雀绿。但是，这些研究发现，传统荧光染料很多都可与细胞内的组分发生相互作用，从而导致细胞产生非特异性荧光，故这些研究都被中断。为了评价本发明的荧光团是否会在细胞内产生非特异性结合，我们将HEK 293细胞与10μM的DMHBI共孵化，并应用倒置荧光显微镜进行可视化测定。相比于仅使用溶媒进行处理的细胞，荧光团处理过的细胞在背景荧光方面没有出现荧光增强的现象(图2C)。相反地，用10μM的孔雀绿染料处理的细胞，其荧光发光与对照物相比显著增加(图2D)。这一结果确证DMHBI与孔雀绿不同，其不会发生非特异性结合，因此DMHBI将是活细胞成像的有效工具。实施例4 能够调节DMHBI荧光团荧光活性的RNA适体的鉴定
[0228] 我们使用SELEX技术对能够结合DMHBI的RNAs进行鉴定。SELEX最早开发是在大约15年前(Famulok等人，“Nucleic Acid Aptamers-from Selection in vitro to Applications in vivo，”Accounts of Chemical Research 33：591-599(2000)，该文献的全部内容通过引用方式结合到本申请中)。SELEX是一种分离具有理想活性的新型核苷酸的技术方法。从开发起始以来，寻找能够与配基特异性结合并且具有高亲和力的RNAs的研究已经揭露了许多RNA分子，其能够和很多靶标分子结合，这些靶标分子包含蛋白质、糖类、维生素、辅因子、核酸、氨基酸以及甚至于离子。在一个典型的SELEX筛选实验中，合成14 15
10 -10 个不同的RNAs，并将这些RNAs与固定化的配基共孵化。充分冲洗后，用含有游离配基的缓冲液冲洗特异性结合固定化配基的RNAs。洗脱下来的RNAs沉淀后，用RT-PCR方法进行扩增。扩增产物用于生成更多的RNA，整个过程重复数次，以筛选出呈现高亲和力的RNAs。由于原始文库庞大的组合多样性以及RNAs形成多样三级结构的能力，这一方法能够获得10到100个不同的RNAs，这些RNAs能与任意给定的小分子结合(Gold等人，“Diversity of Oligonucleotide Functions，”Ann.Rev.Biochem.64：763-797(1995)，该文献的全部内容通过引用方式结合到本申请中)。通常地，这些配基与适体结合，其亲和力低到微摩尔以致亚纳摩尔级。因为这一原因，所以在本发明中使用SELEX方法来鉴定和DMHBI具有高亲和力的RNAs。
10 -10 个不同的RNAs，并将这些RNAs与固定化的配基共孵化。充分冲洗后，用含有游离配基的缓冲液冲洗特异性结合固定化配基的RNAs。洗脱下来的RNAs沉淀后，用RT-PCR方法进行扩增。扩增产物用于生成更多的RNA，整个过程重复数次，以筛选出呈现高亲和力的RNAs。由于原始文库庞大的组合多样性以及RNAs形成多样三级结构的能力，这一方法能够获得10到100个不同的RNAs，这些RNAs能与任意给定的小分子结合(Gold等人，“Diversity of Oligonucleotide Functions，”Ann.Rev.Biochem.64：763-797(1995)，该文献的全部内容通过引用方式结合到本申请中)。通常地，这些配基与适体结合，其亲和力低到微摩尔以致亚纳摩尔级。因为这一原因，所以在本发明中使用SELEX方法来鉴定和DMHBI具有高亲和力的RNAs。
[0229] 最初的SELEX文库通过含有70个核苷酸的随机序列设计获得，该序列的两端分别含有恒定序列，每个SELEX筛选循环后，对其进行RT-PCR扩增。5’和3’恒定序列包含限制性酶切位点，分别可用EcoRI和XhoI进行切割。这些限制性酶切位点的存在，可以使得对文库的亚克隆进行筛选并使得在每个循环后对文库的完整性进行核对检查。
[0230] 文库中的成员都是单链DNA序列，其来自Keck Oligo Synthesis Core Facility at Yale University(New Haven，CT)。长的化学合成文库因为存在碱基配对效率的误差，所以经常含有截短的产物，一种常规的方法是使用凝胶电泳先除去这些截短的产物。因此，一部分原始文库在10％TBE-尿素丙烯酰胺凝胶上进行电泳从而纯化全长DNA产物。利用紫外屏蔽技术对全长DNA条带进行可视化观察，然后将凝胶切下，利用破碎和和浸泡方法从凝胶中回收DNA。
[0231] 将纯化处理后的ssDNA文库进行PCR扩增，同时利用生成dsDNA模板进行RNA的体外合成。文库扩增过度将会诱导文库成员产生偏爱并降低文库的复杂性，因此为了避免文库扩增过度，文库PCR扩增反应的条件是使用稍大的PCR反应体积(10ml)，进行共计14个循环，dsDNA的PCR产物用DNA分离柱进行纯化，以除去蛋白质、引物和盐类。PCR反应中加入5’T7 RNA聚合酶启动子序列，以用于体外RNA的合成反应。
[0232] 下一步，将制备好的dsDNA文库用于SELEX实验以富集能够与DMHBI结合的RNAs。14
简单地说，在大的T7 RNA聚合酶转录反应中对2.5x 10 条不同的DNA序列进行转录。DNase处理后，使用醋酸铵沉淀RNAs，然后用75％冷乙醇洗涤。空气干燥后，将RNA小球重新悬浮到1X筛选缓冲液中，该缓冲液含有40mM HEPES·KOH pH 7.4、150mM KCl、5mM MgCl2和5％DMSO。将RNA加热至75℃变性5分钟，然后快速转移到冰浴中进行冷却。
简单地说，在大的T7 RNA聚合酶转录反应中对2.5x 10 条不同的DNA序列进行转录。DNase处理后，使用醋酸铵沉淀RNAs，然后用75％冷乙醇洗涤。空气干燥后，将RNA小球重新悬浮到1X筛选缓冲液中，该缓冲液含有40mM HEPES·KOH pH 7.4、150mM KCl、5mM MgCl2和5％DMSO。将RNA加热至75℃变性5分钟，然后快速转移到冰浴中进行冷却。
[0233] 为了除去可以结合琼脂糖亲和基质或者可以识别DMHBI树脂连接臂部分的RNAs，首先将RNA文库与“模拟”树脂共孵化。该“模拟”树脂由NHS-活化的琼脂糖组成，NHS-活化的琼脂糖预先用游离的己胺进行处理，处理条件与DMHBI树脂偶联反应完全相同。然后，将RNAs与DMHBI琼脂糖共孵化，孵化结束后用筛选缓冲液进行充分地筛选。池中能够与DMHBI直接结合的序列将保留在树脂上，而不能结合的序列会在洗涤步骤中被除去。结合的RNAs用含有2mM游离DMHBI的筛选缓冲液进行洗脱。在两个小时的洗脱过程中，RNAs被洗脱下来，从而确保了高亲和力适体的富集。使用含有游离DMHBI的筛选缓冲液，而不是含有RNA变性试剂例如EDTA或者热的筛选缓冲液洗脱RNAs，这进一步确保了筛选得到的RNAs不需要亲和力基质或者不需要结合用的氨基己基连接臂。
[0234] 洗脱下来的RNAs依次进行乙醇沉淀、反转录、PCR扩增和体外转录，从而得到一个新池以用于下一个循环。数个循环后，缩短孵育时间并减小树脂的体积，进一步筛选出对DMHBI亲和力最高的适体。在后几个循环中，为了剔除低亲和力和中等亲和力的适体，洗涤步骤将更加严格，包括使用DMHBI本身进行简单洗涤。以往研究证明简单的预洗脱步骤将有助于富集低解离速率，亦即高亲和力的适体的富集(Davis and Szostak，“Isolation of High-Affinity GTP Aptamers from Partially Structured RNA Libraries，”Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 99(18)：11616-11621(2002)，该文献的全部内容通过引用方式结合到本申请中)。循环5到10的过程中，DMHBI洗涤步骤的次数和孵育时间都缓慢增加。
[0235] SELEX筛选的每一个循环后，我们都合成了32P-UTP标记的RNA，并使用此RNA来指示RNA和微珠的结合情况。在有些SELEX循环中，我们检测到了大量与树脂结合的同位素标记RNA。5个循环过后，接近有一半的RNA文库成员与DMHBI琼脂糖结合。为了判断那些是够开启DMHBI荧光活性的RNA适体是否同样被富集，将来源于每个循环的RNA与DMHBI共孵化。如图3A所示，从第5个循环开始。RNA表现出开启DMHBI荧光活性的能力。然而，DMHBI-诱导的池的活性甚至在10个循环后仍然十分微弱(图3A)，此结果可以反映出RNA池包含了仅是少量的这样的适体，该适体的结合方式有助于开启DMHBI荧光活性。进一步的筛选循环导致文库整体荧光发光的降低，故第10个循环中的克隆被筛选出来。对来源于循环10的50个独立克隆进行测定，结果显示尽管多数克隆能够与DMHBI琼脂糖结合，但是没有克隆具有开启DMHBI荧光活性的能力。因此，为加快筛选速度，对10个克隆的40个池进行了筛选，结果显示仅有两个池发现具有开启DMHBI荧光活性能力的成员。通过对5循环中的5个池进行筛选从而对这些池进行去卷积处理后，然后鉴定各个克隆，其中两个特定的RNAs被鉴定出能够开启DMHBI荧光活性。这些克隆以其鉴定出来的池命名为3-6和13-2，以下列出它们的编码DNA序列：
克隆3-6(SEQ ID NO：34)
GGGAGATACGCTCTAGAATTCAATTGCATGGTGGTCTGGGACAGACGTGTGG
ACGGCACACAGCGTGAGGCTTTGGTGGGTTATGGCTGTCATGCGAGATAGCT
CGAGCAATGC
克隆13-2(SEQ ID NO：35)
GGGAGATACGCTCTAGAATTCAATTTGCGTATTGAGACAGGGCCGCGCTATT
TCTGGAGGGGCGCTACATGAAAGTGGTGGTTGGGTGCGGTCGGAGATAGCTC
GAGCAATGC
克隆3-6(SEQ ID NO：34)
GGGAGATACGCTCTAGAATTCAATTGCATGGTGGTCTGGGACAGACGTGTGG
ACGGCACACAGCGTGAGGCTTTGGTGGGTTATGGCTGTCATGCGAGATAGCT
CGAGCAATGC
克隆13-2(SEQ ID NO：35)
GGGAGATACGCTCTAGAATTCAATTTGCGTATTGAGACAGGGCCGCGCTATT
TCTGGAGGGGCGCTACATGAAAGTGGTGGTTGGGTGCGGTCGGAGATAGCTC
GAGCAATGC
[0236] 适体3-6和13-2表现出几乎相同的激发光谱，其最大激发波长约为400nm(图3B)。有趣的是，我们发现，尽管这两个克隆的发射光谱稍有差别，3-6最大发射峰约在
535nm处，而13-2约在525nm处，但是以摩尔比比较，这两个克隆表现出几乎相同的荧光亮度。这一结果表明这些发射上的差异可能是荧光计读出水平造成的假象。这些结果表明RNA的结构能够对荧光颜色做出细微的变化，已知这一现象在许多不同的荧光蛋白突变体中出现，但是在适体中从未发现过此类现象。这提出了令人兴奋的可能性，即可以对这些RNAs进行修饰，从而使得在使用单一荧光团的情况下可以获得更宽范围的颜色。以下实施例13将对此做详细描述。
535nm处，而13-2约在525nm处，但是以摩尔比比较，这两个克隆表现出几乎相同的荧光亮度。这一结果表明这些发射上的差异可能是荧光计读出水平造成的假象。这些结果表明RNA的结构能够对荧光颜色做出细微的变化，已知这一现象在许多不同的荧光蛋白突变体中出现，但是在适体中从未发现过此类现象。这提出了令人兴奋的可能性，即可以对这些RNAs进行修饰，从而使得在使用单一荧光团的情况下可以获得更宽范围的颜色。以下实施例13将对此做详细描述。
[0237] 从图3C可以看出，两个克隆的荧光发光亮度均大大增强。在毫摩尔浓度下，单独存在的适体和DMHBI均不具有荧光活性。然而，将两者混合后，形成的适体-荧光团复合物会表现出亮绿色荧光发光，其可以很容易地被肉眼观察到。
[0238] 这一实例确证SELEX筛选可以用于搜寻RNA适体，该RNA适体能够特异性的与本发明的新型荧光团结合，并引起这些新型荧光团的荧光发射增加。SELEX筛选因此可以被用于鉴定能够和本申请中所描述的其它荧光团结合的适体。实施例5 利用截短研究鉴定最小的适体结构域
[0239] 能够诱导DMHBI荧光发光的RNA适体鉴定出来后(实施例5)，下一步即是鉴定出结合和诱导荧光发光是必须的最小结构域。3-6和13-2RNA序列整体包括恒定区域在内其长度大于100个核苷酸(参见图4A(SEQ ID NO：1)和图4B(SEQ ID NO：2))。
[0240] 因为其中的一个目的即是将这些适体合并到mRNA的3’UTR(在体内控制着mRNA的转运)，因此鉴定出最小可能的序列，从而排除对mRNA结构的任何影响是十分重要的。采用以下方法来截短适体，一次性在5’或者3’端截去5个核苷酸，然后测定此新的截短适体诱导DMHBI荧光发光的能力。与文献中已报道的多数适体不同，3-6和13-2对截短反应高度敏感，其恒定区也很敏感。如要保证荧光发光无显著性损失，克隆3-6不能容忍任何截短，而克隆13-2仅仅能容忍适度的截短，可以截短到60个核苷酸(图8)。由于克隆13-2能够被截短(得到13-2-min)，而且其荧光发光活性稍强于3-6，故我们在以下的实施例中选择使用克隆13-2。实施例6 DMHBI-适体复合物的性质
[0241] 对DMHBI的荧光团诱导适体之间相互作用进行研究的第一步，是确定它们之间的结合亲和力。因为RNA和DMHBI的结合会引起荧光发光，所以可以通过向适体溶液中滴加递增量的DMHBI来确定解离常数(Kd)。为了校正DMHBI背景荧光的任何增加现象，可以单独对相同浓度的DMHBI溶液的荧光发光进行测定，然后再从结合数据中减去该背景数据。最后，用这些测定结果来推测RNA-荧光团解离常数。DMHBI能结合3-6和13-2，且两者的解离常数几乎一致，均为500nM(图5A)。
[0242] 也可以通过荧光来测定这些适体的热变性(thermal unfolding)。适体的热变性数据表明适体13-2的熔解温度(Tm)约在45℃(图5B)，说明在37℃时，培养细胞中的这些RNA-荧光团复合物保持折叠状态。有趣的是，随着温度从25℃到37℃的逐步上升，适体3-6会缓慢地呈现荧光发光增强，最后随着温度的进一步增加，其会快速地变成打开状态。这一结果表明在25℃时，3-6可能具有多种稳定构象，而仅有其中的一个具有和荧光团结合的能力。但是，在37℃时，荧光团结合构象会变得更加具有热动力学倾向性，从而使得其荧光发光增强。
[0243] 荧光黄(Lucifer Yellow)和Cascade Yellow是两种已知量子产率的荧光团，以这两者作为标准，比较吸光度对总荧光曲线中相对斜率的变化情况。计算单独DMHBI的变化值，以及DMHBI与适体13-2复合物的变化值，然后根据这些值来确定引起荧光增强的主要原因。如预料的一样，未结合的DMHBI和结合的DMHBI的摩尔消光系数保持相对恒定，-1 -1 -1 -1分别为13,164M cm 和15,358M cm 。但是，量子产率会大幅度增加，未结合的DMHBI为
0.0006，适体-DMHBI复合物为0.08，增幅超过100倍。通过测定产物的消光系数和量子产率计算得到总亮度，其从0.008增加到1.23，增幅达150倍。尽管亮度不及GFP，但这些复合物相对于一些低亮度的荧光蛋白衍生物(例如mHoneydew)来说，其亮度还是相当可观的。
更为重要的是，量子产率和亮度的倍数级增加对于检测适体-荧光团复合物绰绰有余。
0.0006，适体-DMHBI复合物为0.08，增幅超过100倍。通过测定产物的消光系数和量子产率计算得到总亮度，其从0.008增加到1.23，增幅达150倍。尽管亮度不及GFP，但这些复合物相对于一些低亮度的荧光蛋白衍生物(例如mHoneydew)来说，其亮度还是相当可观的。
更为重要的是，量子产率和亮度的倍数级增加对于检测适体-荧光团复合物绰绰有余。
[0244] 由于DMHBI-适体可以应用在细胞中对RNA进行活细胞成像，我们对RNA-DMHBI复合物对不同溶剂条件的耐受力进行了测定。首先，测定适体对反映细胞内环境的缓冲液的耐受力，此缓冲液呈中性pH，含有150mM KCl和5mM MgCl2。但是，已知细胞内环境的pH和离子情况都是变化的，故同时也测定了13-2对这些变化的耐受力。
[0245] 13-2对pH值耐受力的测定根据以下方法进行。在活细胞中，不同的胞内细胞器之间的pH值在5-8范围内变化。适体-荧光团复合物对pH变化的敏感性，将阻碍其在活细胞中的应用。事实上，与野生型(wt)GFP相关的众多问题中的一个即是其对pH敏感。因为RNAs和wtGFP的荧光性质十分相似，因此评价本发明复合物是否对pH变化敏感是十分必要的。在存在过量DMHBI下，13-2在pH值6-8的范围内仍保留其荧光活性。
[0246] 适体13-2：DMHBI荧光团对钾离子水平的依赖性也进行了测定。筛选条件是150mM KCl，此钾离子浓度反映了胞浆中单价离子的浓度。单价离子选用钾离子，而非更加通用的NaCl，原因在于，已知一些RNA结构需要钾离子在其结构中，使用钾离子将更好的反映胞浆条件。由图6A可知，相比于镁离子水平，降低钾离子浓度将会对13-2：DMHBI荧光团有更加巨大的影响。将钾离子替换为其它的单价离子，例如NaCl，不能恢复荧光发光，这意味着特+定的K-RNA相互作用对于适体13-2诱导DMHBI荧光发光而言是必须的。但是，当选择其它的RNA适体和荧光团结合时，这种现象可能就不存在。
[0247] 其次，测定镁离子对于RNA-诱导的DMHBI荧光发光的重要性。筛选条件是包含5mM MgCl2；但是胞内游离镁离子的浓度被认为要低很多，大约在0.5mM-0.1mM。尽管增加镁离子的浓度没有影响荧光发光，但是从缓冲液中移除镁离子将会使荧光发光降低大约25％(图6B)。甚至于在镁离子不存在时，荧光发光依然保留，这说明适体13-2的折叠不完全依赖于二价离子。令人些许惊奇的是，多数报道的小分子适体，其结合均需要一定水平的二价离子。
[0248] 这些测定的结果确证了13-2：DMHBI复合物在活细胞的pH/离子条件范围内，能够发射荧光。实施例7 适体多联体对DMHBI荧光的影响
[0249] 同GFP相比，13-2的量子产率较低，因此在细胞内，单一的适体可能难于实现可视化。因此，可以考虑将多个适体单元级联起来，从而增加每个适体分子的相对荧光强度。为了评价增加串联重复的13-2序列是否能够增加荧光强度，我们制备了13-2RNA单体、二聚体或者三聚体，并对它们进行了比较。我们还制备了与RNA分子等摩尔浓度的荧光团分子。结果如图7所示，随着级联适体数目的增加，荧光发射的水平呈现线性增强趋势。这些结果说明，多个DMHBI分子与级联的适体结合后，DMHBI分子之间不会出现相互猝灭的现象，而相互猝灭现象是多个荧光团与单个蛋白分子结合后经常发生的一种荧光猝灭现象。因此，如果将多个荧光团-结合适体单元串联连接，也就实现了本发明的增加荧光发光的目的。
此外，结果还显示，即使13-2适体单元的串联重复大于32，亦不会出现交叉干扰而且也不会出现由荧光共振能量转移或者串联适体内部之间相互作用导致的异常低荧光强度。这一结果使得，可以通过将适体多联体直接或者间接连接到目标靶标分子，从而实现对小量分子甚至单个分子的监测。
实施例8 优化DMHBI适体
此外，结果还显示，即使13-2适体单元的串联重复大于32，亦不会出现交叉干扰而且也不会出现由荧光共振能量转移或者串联适体内部之间相互作用导致的异常低荧光强度。这一结果使得，可以通过将适体多联体直接或者间接连接到目标靶标分子，从而实现对小量分子甚至单个分子的监测。
实施例8 优化DMHBI适体
[0250] 为使DMHBI适体成为活细胞RNA成像的有效工具，需要增加RNA-DMHBI复合物的亮度。为了达到上述目的，我们采用定向设计和随机诱变相结合的方法对适体13-2的突变体进行了筛选，以期能够得到可与DMHBI结合且结合后使得DMHBI的荧光发光进一步增强的适体13-2突变体。例如，如果RNA-荧光团复合物采取更加的刚性结构以阻断荧光团的非辐射衰减或者简单地设计具有较高量子产率的具有荧光活性的荧光团，均可以增加量子产率。
[0251] 通过仔细地对13-2极小化序列(命名为“13-2-min”，SEQ ID NO：3)预测得到的二级结构进行分析，从而对适体13-2进行优化，所述适体的极小化序列能够诱发最大的荧光发光。预测得到的13-2-min的二级结构见图8。研究中注意到有数个弱的结构点，对其进行单点突变研究并测试了它们对荧光强度的影响。首先，极小化结构域具有数个茎泡(stem-bulge)连接，这些连接被G-U碱基对所封闭，将该碱基对突变成G-C碱基对。然后，将任意其它的G-U碱基对也替换成G-C碱基对。最后，将任意A-U碱基对也替换成G-C碱基对。通过前述方法发现了数个可以在DMHBI结合适体后引起DMHBI荧光增强的突变。为了确定这些突变一起使用时是否会有进一步的协同作用，先选出几个最好的突变体，然后将它们组合在一起进行检测。检测结果总结在表1中。总的来说，鉴定出了3个关键突变，当它们组合使用时可以使得RNA-荧光团复合物的荧光强度增加2倍。表1：13-2-min序列(SEQ ID NO：3)的突变以及这些突变对DMHBI荧光的影响
[0252] 下一步，通过随机突变和体外筛选的组合技术按照无偏差方式对适体13-2进行优化。为了达到上述目的，我们采用了适体筛选常用的一种方法即亲和力成熟方法。在DMHBI筛选中使用的原始亲本文库是一段含有70个随机核苷酸的核酸序列。该原始亲本文42
库对应着10 个可能的不同序列。然而，由于用于SELEX的寡聚核苷酸文库需要微摩尔的
14 15
数量级，故在此原始亲本文库中，仅有其中的一部分用于体外转录，且每次仅采样10 -10个不同的RNAs。这是每次采样的潜在序列片段在时间上的一个划分。通过亲和力成熟的方法可以对序列空间进行更加充分的采样，并且在采样过程中形成一个对13-2序列有偏差的新文库。
库对应着10 个可能的不同序列。然而，由于用于SELEX的寡聚核苷酸文库需要微摩尔的
14 15
数量级，故在此原始亲本文库中，仅有其中的一部分用于体外转录，且每次仅采样10 -10个不同的RNAs。这是每次采样的潜在序列片段在时间上的一个划分。通过亲和力成熟的方法可以对序列空间进行更加充分的采样，并且在采样过程中形成一个对13-2序列有偏差的新文库。
[0253] 在该过程中，13-2DNA序列在化学上被重新合成，从而使得序列中每个位点的突变水平为30％。这一序列合成过程是通过向每种亚磷酰胺溶液中掺杂10％的每种其它碱基来实现的。换句话说，在DNA合成的每一步骤中，不再需要使用由四种dNTP以每种占25％的比例所形成的混合物来制备适体，取而代之的是直接使用13-2中所存在的dNTP与其它另三种dNTPs按照7∶1∶1∶1比例所形成的混合物。由此种方法得到一个完整的含有14
10 个不同序列的新文库，该文库中的所有序列与DMHBI结合的能力都潜在增加。
10 个不同序列的新文库，该文库中的所有序列与DMHBI结合的能力都潜在增加。
[0254] 当使用此文库进行SELEX时，需要使用更加剧烈的洗涤条件，其包含将缓冲液预热至37℃，更大的洗涤液体积，以及洗涤所用缓冲液盐浓度更高。以往的筛选步骤中，荧光发光仅在后期几个循环中才能检测到，且强度很弱，而在本发明此筛选步骤中，荧光发光在早期几个循环中就能检测到，而且强度很高。第5个循环后，单克隆被筛选出来。每个具有荧光活性的克隆的最大发射波长为525nm。数打克隆被筛选出来，结果显示其中四个克隆的荧光要比原始的13-2更亮。以下列出这四个克隆的编码DNA序列：克隆13-2-1(SEQ ID NO：36)
GGGTATCCGGAATCTTATACATTGTTATGTCTGGAGGGGCGCCGCATGAACG
CGGTGGTGAGGTGCGGTCGGATATAACTGGTGGAGTGCAAGAGTCTGAGCAC
ACTGG
克隆13-2-3(SEQ ID NO：37)
GGGTATCCGGAATCTTATACATTGCTATTTCTGGAGGGGCGCCCCATGAAAG
GGGTGGTTGAGAGCGGTCGGAGATAGCGGAAACAGTGCAAGAGTCTGAGCA
CACTGG
克隆13-2-4(SEQ ID NO：38)
GGGTATCCGGAATCTTATACATTGCTATTGTTGGAGGGGCGCTACGTGAAAG
TGGTGGTACGGTGCGGTCGGCAATAGCTCGTATAGTGCAAGAGTCTGAGCAC
ACTGG
克隆13-2-5(SEQ ID NO：39)
GGGTATCCGGAATCTTATACATTGCTCTGTTTGGAGGGGCGCTACTTTCAAGT
AGTGGTTGAGTGCGGTCGAACAGAGCTTGGGCGTTGCAAGAGTCTGAGCACA
CTGG
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CGGTGGTGAGGTGCGGTCGGATATAACTGGTGGAGTGCAAGAGTCTGAGCAC
ACTGG
克隆13-2-3(SEQ ID NO：37)
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克隆13-2-4(SEQ ID NO：38)
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ACTGG
克隆13-2-5(SEQ ID NO：39)
GGGTATCCGGAATCTTATACATTGCTCTGTTTGGAGGGGCGCTACTTTCAAGT
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CTGG
[0255] 克隆13-2-5是以上这些克隆中最为引人瞩目的，其荧光发光是13-2的近两倍(图9A所示)。此外，13-2-5的Tm在45℃附近(图9B)，该性质使得13-2-5在用于37℃下活细胞成像时更加稳定。掺杂文库得到的克隆与13-2-min的比对实验证明，在所有的克隆之间存在多个共有区域，此结果表明这些区域在荧光识别中发挥很重要作用(图9C，SEQ ID NO：40)。
[0256] 克隆13-2-5的预测二级结构与13-2-min整体结构有多处近似区，两者都包含茎泡基序序列。13-2-5的截短分析表明5’恒定区和整个随机序列部分是必要。3’恒定区可以部分移除，且不会降低荧光发光，3’恒定区部分移除后得到一个较小序列，命名为13-2-5-min(图10，SEQ ID NO：15)。使用相同方法进行定向突变，系统性地产生数个可以细微地增加荧光强度的点突变。表2列出了这些突变，以及这些突变对DMHBI荧光的影响。
表213-2-5-min序列(SEQ ID NO：15)的突变以及这些突变对DMHBI荧光的影响
实施例9具有降低的酚pKa的新型荧光团的合成
表213-2-5-min序列(SEQ ID NO：15)的突变以及这些突变对DMHBI荧光的影响
实施例9具有降低的酚pKa的新型荧光团的合成
[0257] 多数常用的GFP类荧光团，例如增强型GFP(eGFP)，其主要以高吸收的酚盐形式存在。RNA-DMHBI适体的荧光光谱意味着所有的荧光团均以酚羟基的形式存在，而无一例酚盐形式的荧光团，这同时表明RNA-荧光团复合物更类似于原始的wt GFP，而与增强型GFP(eGFP)区别较大。RNA磷酸骨架的负电荷属性可以解释这一现象。只有少数的现有文献报道过作用于带负电荷分子的RNA适体，而且多数情况下，所报道的作用于这些带负电荷分子的RNA适体并非直接与负电荷相互作用。因此，对于DMHBI所进行的进一步选择，似乎很难获得酚盐结合适体，因为在中性pH值下存在过多的酚形式。为了使亮度显著增强，需要选择能够和特殊荧光团的酚盐形式结合的适体。
[0258] 为了突破上述限制，我们设计了一种新型的荧光团，即使用多个氟基取代DMHBI的甲氧基基团。预测结果表明，氟的高电负性将会对苯亚甲基环产生诱导作用，从而导致酚羟基的pKa值降低。确实地，已有文献报道，酚环上氟基的引入效应能够降低酚的pKa，降低约数个pH单位(Gross and Seybold“，Substituent Effects on the Physical Properties and pKa of Phenol，”Int.J.Quantum Chem.85(4-5)：569-579(2001)，该文献的全部内容通过引用方式结合到本申请中)。为了合成此新型荧光团，我们使用与DMHBI合成同样的氮内酯环合成方法，只是换作3，5-二氟-4-羟基苯甲醛作为起始原料。如上所述，在碱性条件下，氮内酯环与甲胺或者N-Boc-1，6-己二胺反应，分别生成带有配基和连接臂形式的3，5-二氟-4-羟基苯亚甲基-咪唑啉-5-酮(DFHBI)荧光团。
[0259] 通过酚和酚盐所存在的截然不同的吸收峰，对DFHBI的pKa进行计算。氟的引入会导致上述两个峰值的蓝移，即对于酚，其最大吸收峰达到363nm，对于酚盐其最大吸收峰达到420nm，但是两者的峰值比仍然具有pH依赖性，且pKa值约为6.0(图11B)。这种pH值的显著下降也保证在生理pH下，多数的荧光团分子将以其酚盐形式存在。
[0260] 同DMHBI荧光团相同，在非粘性溶液中，DFHBI的荧光发光可以忽略不计，而在乙醇玻璃态和高甘油浓度时，DFHBI有强烈的荧光发光。此外，当被引入到HEK 293细胞时，DFHBI不会产生荧光，这也证明了它可以应用在涉及活细胞的方法中。实施例10 利用预先结构化的文库对DFHBI的新型适体进行筛选
[0261] 为了鉴定能够与DFHBI结合的RNAs，使用DFHBI-衍生化的琼脂糖进行SELEX筛选。但是，与DMHBI适体的筛选不同，DFHBI适体文库不是完整的随机文库。作为替代地，对原始RNA文库进行如下部分结构化处理：编码4-bp茎的12-nt序列用稳定的UUCG环进行封闭，每一端都连接有26个随机碱基。然后使用实施4所描述的方法进行SELEX筛选。
[0262] 每个SELEX循环后，对文库的荧光发光进行测定。与DMHBI筛选结果即每个循环后都观测到荧光发光渐进上升不同，此例SELEX筛选的荧光发光在第4个循环后呈指数级上升，而在第6个循环后荧光发光快速稳定而不再变化。这一结果表明，部分结构化处理后的文库相比完全随机文库(DMHBI筛选中使用)会有更多潜在的目标。循环6和7中的克隆被筛选出来，并鉴定出数打目标。由测序结果发现，多数的目标是冗余的，其中只有三个特定序列，这三个序列能够诱导DFHBI荧光发光。以下列出这三个特定序列的编码DNA序列：克隆10-6(SEQ ID NO：42)
GGGAGACGCAACTGAATGAATGAACGGGGTAAATAGGCGTGGGTCGGGTCC
TGCTTCGGCAGTTGAGTGTGAGAGCGAACTCTGTAGTTCCGTAACTAGTCGCG
TCAC
克隆24-1(SEQ ID NO：43)
GGGAGACGCAACTGAATGAACCTGTAGAACGACTTGGTCGGGTCAGCTGCTT
CGGCAGCTTCGAGAATAGAGTGTGGGGTCGTATCCGCGTAACTAGTCGCGTC
AC
克隆24-2(SEQ ID NO：44)
GGGAGACGCAACTGAATGAAATGGTGAAGGACGGGTCCAGGTGTGGCTGCTT
CGGCAGTGCAGCTTGTTGAGTAGAGTGTGAGCTCCGCGTAACTAGTCGCGTC
AC
实施例11 DFHBI-适体复合物的性质
GGGAGACGCAACTGAATGAATGAACGGGGTAAATAGGCGTGGGTCGGGTCC
TGCTTCGGCAGTTGAGTGTGAGAGCGAACTCTGTAGTTCCGTAACTAGTCGCG
TCAC
克隆24-1(SEQ ID NO：43)
GGGAGACGCAACTGAATGAACCTGTAGAACGACTTGGTCGGGTCAGCTGCTT
CGGCAGCTTCGAGAATAGAGTGTGGGGTCGTATCCGCGTAACTAGTCGCGTC
AC
克隆24-2(SEQ ID NO：44)
GGGAGACGCAACTGAATGAAATGGTGAAGGACGGGTCCAGGTGTGGCTGCTT
CGGCAGTGCAGCTTGTTGAGTAGAGTGTGAGCTCCGCGTAACTAGTCGCGTC
AC
实施例11 DFHBI-适体复合物的性质
[0263] DFHBI的所有三个适体能够发射绿色荧光，通过肉眼可观察到。氟的引入会导致DFHBI荧光发光的微弱蓝移，最大激发波长和最大发射波长分别达到460nm和500nm(图12A)。DFHBI的所有三个适体拥有相同的发射光谱，然而24-1和24-2的荧光强度约为10-6的两倍。因此，我们仅对这两个更为亮的克隆进行进一步的性质鉴定。与DMHBI或者DMABI的适体相比，DFHBI的适体更加明亮，其荧光强度约比前两者高6倍(图12B)。亮度增加主要是因为，量子产率从DMHBI-RNA复合物的0.08增加到了DFHBI-RNA复合物的0.6。DFHBI-1 -1
的消光系数未发生改变，在未结合和结合的荧光团之间约为26,000M cm 。
的消光系数未发生改变，在未结合和结合的荧光团之间约为26,000M cm 。
[0264] 制备等摩尔量的24-1-DFHBI复合物溶液和eGFP溶液，以测定它们的相对荧光强度。24-1RNA的亮度仅比EGFP弱三倍(图12C)，此结果表明24-1的亮度在细胞内十分易于观察到。将24-1和24-2在不同的溶剂条件下进行孵化，结果亦表明至少24-2会在细胞内正确的折叠。当pH值在7到8之间变化时，24-1和24-2两种适体几乎未受影响。将pH值降至6.0后，会导致荧光强度下降50％，这可能是因为适体对去质子化形式DFHBI(pKa＝6.0)的偏好造成的。与13-2不同，24-1和24-2的荧光发射均不需要单价离子；然而，2+
将KCl变为NaCl会导致发射谱红移10nm。另一方面，Mg 离子是需要的，且24-1和24-2
2+
对Mg 离子的需要量均要比13-2大(图12D)。24-1和24-2荧光发光的最优MgCl2浓度为25mM，当MgCl2浓度降至5mM(进行SELEX筛选时的MgCl2浓度)后，上述两者的荧光发光仅有微弱降低。然而，当将MgCl2浓度由5mM降至更加接近生理浓度的0.5mM后，上述两种适体的荧光发光会下降50％。将MgCl2浓度进一步降低，当MgCl2浓度降至约0.01mM时
24-1的荧光发光会完全消失，而24-2的荧光发光会降至45％荧光强度并不再发生变化。
将KCl变为NaCl会导致发射谱红移10nm。另一方面，Mg 离子是需要的，且24-1和24-2
2+
对Mg 离子的需要量均要比13-2大(图12D)。24-1和24-2荧光发光的最优MgCl2浓度为25mM，当MgCl2浓度降至5mM(进行SELEX筛选时的MgCl2浓度)后，上述两者的荧光发光仅有微弱降低。然而，当将MgCl2浓度由5mM降至更加接近生理浓度的0.5mM后，上述两种适体的荧光发光会下降50％。将MgCl2浓度进一步降低，当MgCl2浓度降至约0.01mM时
24-1的荧光发光会完全消失，而24-2的荧光发光会降至45％荧光强度并不再发生变化。
[0265] 荧光发光的大幅度增加不能解释为适体对荧光团亲和力的增加，因为24-1和24-2对DFHBI的结合常数在600nM左右，该值与测定的13-2-DMHBI结合的Kd值相似。因此，这些RNA-荧光团复合物亮度的增加更可能是因为其荧光团的内在亮度增加所致，也就是可能是因为在中性pH时，DFHBI主要以去质子化形式存在，因而与eGFP的荧光团有很多相似之处。为了确认这些适体是否与酚盐结合而并非与酚结合，分别测定pH为6、7和8时，DFHBI的酚羟基吸收峰转变为酚盐吸收峰的改变率，并将该结果与在不同pH水平时的激发谱的改变作比较。当pH值由6变为8时，吸收谱峰峰值比发生变化，而激发谱的峰值比却无改变。事实上，当pH从7降至6后，吸收谱会产生一个蓝移的肩峰，而激发谱未出现此类似肩峰。在pH值为6.0时，酚盐激发峰的总强度会略有下降，这可能主要是由于RNA的变性和/或者去质子化DFHBI浓度的降低造成的，因为发射谱也出现相应比例下降(图13B)。
[0266] 对DMHBI的研究也进一步发现，24-1确与DFHBI的酚盐形式结合。在这些实验中，将24-1与10μM的DMHBI，分别在pH值为7或8时共孵化，并在孵化结束后，分别在400nm(代表酚羟基的激发波长)或者470nm(代表酚盐的激发波长)下进行激发。如图13C所示，在pH值为7时，两种激发波长下的荧光发射均很弱，此结果表明当多数的荧光团质子化后，24-1与DMHBI的结合会十分微弱。然而，在pH值为8时，如只有约50％的DMHBI被去质子化，470nm激发的24-1的荧光发光会表现出显著上升，而400nm激发的荧光发光依然很弱。这些实验结果表明24-1仅能与去质子化的DMHBI相互作用。因此，24-1是直接与酚盐基团作用。
[0267] 24-1和24-2对任意截短反应都有抗性，包括恒定区域的截短反应。对于24-1来说，从序列末端移除一些残基似乎并未对由mFOLD预测的结构有任何影响(Zuker，“On Finding All Suboptimal Foldings of an RNA Molecule，”Science 244：48-52(1989)，该文献的全部内容通过引用方式结合到本申请中)。预测的24-1和24-2序列的二级结构分别如图14A和图14B所示。实施例12 DFHBI适体的活细胞成像
[0268] 本发明的RNA-荧光团复合物的光物理性质对于活细胞成像十分有用。因为可以将抗猝灭剂例如DABCO或者“Fluoromount”加入到样品中，所以固定细胞中对荧光团进行可视化是十分有效的。但是，这些试剂不能加入到活细胞中，所以在活细胞成像时，胞内的小分子探针表现出闪烁特性，并快速光漂白。这些效应反映出潜在的可逆转换变为长期的暗态(就如使用GFP荧光团时出现的情形)(Zumbusch，“Single Molecule Spectroscopy of the Green Fluorescent Protein，”Single Molecules 2：287-288(2001)；Jung等人，“The Role of Dark States in the Photodynamics of the Green Fluorescent Protein Examined with Two-Color Fluorescence Excitation Spectroscopy，”J.Phys.Chem.A 104：873-877(2000)，以上每一篇文献的全部内容均通过引用方式结合到本申请中)，同时还包括光氧化的破坏(Longin等人，“Comparison of Anti-fading Agents Used in Fluorescence Microscopy：Image Analysis and Laser Confocal Microscopy Study，”J Histo Cytochem 41：1833-1840(1993)；Rasnik等人，“Nonblinking and Long-lasting Single-molecule Fluorescence Imaging，”Nat Methods 3：891-893(2006)，以上每一篇文献的全部内容均通过引用方式结合到本申请中)。这是一大限制，尤其是在数目较小的分子成像时表现最为明显(Nie等人，“Optical Detection of Single Molecules，”Annual Rev.Biophys.Biomol.Structure 26：567-596(1997)；Weiss，“FluorescenceSpectroscopy of Single Biomolecules，”Science 283：1676-1683(1999)，以上每一篇文献的全部内容均通过引用方式结合到本申请中)。
[0269] 本发明的RNA-荧光团复合物十分特殊，其不存在上述问题。由于DMHBI荧光团并未与适体共价结合，故如果RNA-荧光团复合物发生光漂白，此DMHBI荧光团会解离出，并与溶液中的荧光团进行替换。实际上，RNA-结合的DMHBI在溶液中似乎可以快速地达到与DMHBI的平衡，因为复合物的Kd值(500nM)表明，即使将扩散限制的解离速率考虑在内其解离速率ζ1/2似乎都小于0.1秒(Silverman，“The Organic Chemistry of Enzyme-catalyzed Reactions，”New York：Academic Press，(2002)，该文献的全部内容均通过引用结合方式到本申请中)。这一特性可以使得实现更强的光照强度和更长时间的连续成像。
[0270] 进行另一项实验，以确认这些更亮的RNA-荧光团复合物是否能够在活细胞内被检测到。在进行此实验前，通过将编码24-1或者24-2的DNA和谷光氨肽转移酶S(GST)3’端开放阅读框架连接起来，制备得到一段转基因。当被导入到大肠杆菌E.coli后，这些转基因能够分别确保GST：24-1融合mRNA和GST：24-2融合mRNA的表达。最后使用带有常规GFP滤波器的倒置荧光显微镜对细菌进行可视化观察。但是没有检测到信号。
[0271] 使用针对适体序列的探针进行Northern印迹杂交，结果显示RNAs被全部表达且在细胞内未发生降解。因此，可以推测，在长mRNA分子的情形时，RNA可能会发生变性或者错误折叠。为了稳定序列，可以将其融合到tRNA序列的中间从而使得赖氨酸去稳定它的结构。已有文献报道，这一融合技术能够提高一些在细菌中表达的适体的稳定性和正确折叠(Ponchon and Dardel，“Recombinant RNA Technology：The tRNA Scaffold，”Nature Methods 4(7)：571-6(2007)，该文献的全部内容通过引用方式结合到本申请中)。然后使用含有对照适体的tRNA盒子对细胞进行转化，对照适体结合到sephadex上或者结合适体的荧光团上。与对照表达细胞株比较，表达24-1或者24-2适体的大肠杆菌E.coli有显著的荧光发光(分别如图15A和图15B所示)。在细胞中，24-2的亮度比24-1高约5倍。实施例13 其它DMHBI适体的筛选
[0272] 在对作用于DMHBI的适体的原始筛选中，我们鉴定出了两种特定的适体，两个适体的发射谱最大值有轻微的位移(525nm和535nm)。这一结果表明，与蛋白质相同，RNAs能够对荧光团施加不同的环境，从而导致其光谱学的改变。
[0273] 为了进一步探索这一观点，对原始的DMHBI荧光团进行重复SELEX筛选。但是，筛选条件有两处改变。第一，使用的是部分结构化处理的文库。如之前实施例10所述，与原始的完全随机文库相比，该文库可以得到更多的目标。第二，原始筛选的pH值为7.4，现将筛选条件的pH值提高到8.5，这会产生新的结构。筛选的其它方面都按照之前描述的方式来进行。10个循环的SELEX筛选结束后，鉴定出5个新的能够开启DMHBI荧光发射的适体。下面列出这些适体的编码DNA序列：
克隆23-11(SEQ ID NO：57)
GGGAGACGCAACTGAATGAAATGACAGTACAGTGGAGGGTGCGGTACTGCTT
CGGCAGGGAAGGGGCGCTGTTCTTGTCTCATATCCGTAACTAGTCGCGTCAC
克隆17-3(SEQ ID NO：58)，其中N为C或者T
GGGAGACGCAACTGAATGAAGAGCAGTAGCGAGTAGTTCACAANAGCTGCT
TCGGCAGGATCTTGTAGGAAGTAAATGTGCAAATCCGTAACTAGTCGCGTCA
C
克隆2-4(SEQ ID NO：59)
GGGAGACGCAACTGAATGAAACCTAGAGTTATGCCAGGCTCTGAGCCTGCTT
CGGCAGGTGCTATGATCGCCAGCGGTATGCAGTCCGTAACTAGTCGCGTCAC
克隆17-17(SEQ ID NO：60)，其中N为C或者T
GGGAGACGCAACTGAATGAAANNAAATATTCGGGATANATANNATTACTGCT
TCGGCAGANAGCGGTTAATTNTTGNAANTCNAATCCCGAACTAGTCGCGTCA
C
克隆18-16(SEQ ID NO：61)，其中N为C或者T
GGGAGACGCAACTGAATGAANGGACTCGTCTGGCNGGATGGGCGNGTGGTA
CTGCTTTCGGGCAGGATNGGGTATAACGGTANANGCNCTAACTAGTCGCGTC
AC
克隆23-11(SEQ ID NO：57)
GGGAGACGCAACTGAATGAAATGACAGTACAGTGGAGGGTGCGGTACTGCTT
CGGCAGGGAAGGGGCGCTGTTCTTGTCTCATATCCGTAACTAGTCGCGTCAC
克隆17-3(SEQ ID NO：58)，其中N为C或者T
GGGAGACGCAACTGAATGAAGAGCAGTAGCGAGTAGTTCACAANAGCTGCT
TCGGCAGGATCTTGTAGGAAGTAAATGTGCAAATCCGTAACTAGTCGCGTCA
C
克隆2-4(SEQ ID NO：59)
GGGAGACGCAACTGAATGAAACCTAGAGTTATGCCAGGCTCTGAGCCTGCTT
CGGCAGGTGCTATGATCGCCAGCGGTATGCAGTCCGTAACTAGTCGCGTCAC
克隆17-17(SEQ ID NO：60)，其中N为C或者T
GGGAGACGCAACTGAATGAAANNAAATATTCGGGATANATANNATTACTGCT
TCGGCAGANAGCGGTTAATTNTTGNAANTCNAATCCCGAACTAGTCGCGTCA
C
克隆18-16(SEQ ID NO：61)，其中N为C或者T
GGGAGACGCAACTGAATGAANGGACTCGTCTGGCNGGATGGGCGNGTGGTA
CTGCTTTCGGGCAGGATNGGGTATAACGGTANANGCNCTAACTAGTCGCGTC
AC
[0274] 令人惊讶的是，尽管所有的适体在400nm处拥有相同的激发光谱，但每一个适体的发射光谱却变化很大(图16)。克隆23-11是所有适体中最亮的，其荧光亮度为原始适体13-2的两倍，且其发射光谱与13-2十分相似。另一方面，克隆17-3有更多红移发射光谱，且其最大峰值在550nm(图16)。克隆2-4拥有最与众不同的光谱，其发射峰值为460nm处在蓝光范围(图16)。之所以称其与众不同，是因为目前为止，所有蓝移的GFP-变异体都是通过将酪氨酸变为苯丙氨酸或者色氨酸从而除去酚盐来实现的。因此，对于含有酚羟基的荧光团，其是否会因为在激发状态下酚羟基的pKa显著下降，从而使其更有能力发射蓝色荧光这一点还是未知的。克隆18-16和17-17两者的荧光发射与23-11类似，其峰值约在
535nm。
实施例14 苯亚甲基环经修饰的荧光团的合成及其适体的鉴定
535nm。
实施例14 苯亚甲基环经修饰的荧光团的合成及其适体的鉴定
[0275] 可用于产生不同的适体-荧光团复合物的光谱的第二种方法是对荧光团本身进行修饰。将DMHBI的邻甲氧基基团替换为氟，可以观察到DMHBI激发光谱和发射光谱的较大变化。因此，可以认为将荧光团的苯亚甲基部分进行进一步修饰将可以得到更大的频谱差异。
[0276] 购买获得多种不同的苯甲醛，并测定它们的吸收光谱，从而鉴定出具有最感兴趣的光谱位移的苯甲醛。这些起始醛类包括：3，4，5-三甲氧基-、3，4，5-三羟基-、3，4-二羟基-、4-氰基-、4-巯基-、4-二甲氨基-、3-硝基-4-羟基-、2-硝基-4-羟基-、和3，5-二氯-4-羟基-苯甲醛。此次研究的主要目的是为了得到具有更多红移发射的荧光团，因为此种荧光团对活细胞成像是十分理想的。然而，以上所提到的绝大多数化合物与DMHBI和DFHBI相比都是产生蓝移吸收光谱。如前面关于DMHBI和DFHBI的实施例中所描述的，这些荧光团以及它们的适体尽管仍然是有用的，但是这些荧光团并不能满足此次分析的主要目的。正因如此，所以只选择4-二甲基氨基苯甲醛进行进一步研究。
[0277] 通过三步反应合成4-二甲基氨基苯亚甲基-5-咪唑啉酮(DMABI)(图17A)。首先，如实施例1中所记载的使用乙酰甘氨酸合成了氮内酯。但是，第二步反应进行的并不顺利。多次尝试在碱性条件下与甲胺反应，但是都没有生成环化的咪唑啉酮产物。替代地，主要产物是酰胺和乙酯开环的的混合物。因此，为了避免与乙醇发生副反应，选择在二氧己环中回流来进行氨解。反应一个小时后，除去溶剂，经核磁谱(NMR)验证得到的酰胺结构正确，且纯度大于95％。无需进一步纯化处理，直接将酰胺在干燥的二氯甲烷(DCM)条件下进行再环化反应，反应原料为二甲基吡啶和三氟甲磺酸三甲基硅酯(TMSOtf)。己胺修饰的DMABI采用相似的合成方法进行合成，然后将得到的该修饰的DMABI按照实施例2所记载的方式与NHS-琼脂糖相偶联。
[0278] SELEX筛选使用的文库为部分结构化处理的文库，筛选条件与筛选DFHBI适体时的条件相似(实施例10)。筛选共进行8个循环，鉴定出了7个能够使DMABI的荧光发射增强的特定序列。尽管这7个克隆的荧光谱存在细微差异，但是所有这些与DMABI结合的适体其最大激发波长在475nm和485nm之间，而其最大发射波长在505nm和515nm之间。不同克隆之间其荧光强度也存在一些变化，其中最亮的克隆为15-1(图17B)，其荧光强度与13-2-5近于等同。以下列出这些DMABI适体的编码DNA序列：
克隆19-4(SEQ ID NO：45)，其中每一位置的N为C或者T
GGGAGACGCAACTGAATGAACGAATAGGTGGAGGTTGCNCTGTTTTCTGCTT
CGGCAGGTTAAAGATTGGTACTCATCACGGTGTCCGTAACTAGTCGCGTCAC
克隆19-10(SEQ ID NO：46)，其中每一位置的N为C或者T
GGGAGACGCAACTGAATGAACAGTTTCGTGCAGTTTGAAATGTAGGCTGCTT
CGGCAGGATAGGTGTGGAGGTGGATGTCCGGGTCCGTAACTAGTCGCGTCAC
克隆9-1(SEQ ID NO：47)，其中每一位置的N为C或者T
GGGAGACGCAACTGAATGAACCCTGAAAAGAGGGAAGGCCTGGNTTGCTGC
TTCGGCAGGGGATTGATCAGGGTGCACGTTGCTGTCCGTAACTAGTCGCGTC
AC
克隆9-6(SEQ ID NO：48)，其中每一位置的N为C或者T
GGGAGACGCAACTGAATGAAGCCTTGAAATAGTAGTGATCGAGTGGCTGCTT
CGGCAGACTCTGAGTGTGGCTATACGTGATCGTCCGTAACTAGTCGCGTCAC
克隆11-3(SEQ ID NO：49)，其中每一位置的N为C或者T
GGGAGACGCAACTGAATGAAAAAGTGGTATTTNAAATTCNANTTANCTGCTT
CGGCAGACGACGGGGGGGCNNGTNTTGGANGATCCGTAACTAGTCGCGTCAC
克隆15-1(SEQ ID NO：50)，其中每一位置的N为C或者T
GGGAGACGCAACTGAATGAATGTNGCATAATTGANGGANGATNCATGCTGCT
TCGGCAGTTGGGTGTAAAAATGGAANGAGGTCNTATCCGTAACTAGTCGCGT
CAC
克隆8-4(SEQ ID NO：51)，其中任一位置的N均为C或者T
GGGAGACGCAACTGAATGAATCCAGGGGTGGTCGGTGGNNGGAGCGCTGCT
TCGGCAGTGAGCTGGGGAGTTCAGTCAATGTGGTCCGTAACTAGTCGCGTCA
C
实施例15 o-HBDI的RNA适体的鉴定
克隆19-4(SEQ ID NO：45)，其中每一位置的N为C或者T
GGGAGACGCAACTGAATGAACGAATAGGTGGAGGTTGCNCTGTTTTCTGCTT
CGGCAGGTTAAAGATTGGTACTCATCACGGTGTCCGTAACTAGTCGCGTCAC
克隆19-10(SEQ ID NO：46)，其中每一位置的N为C或者T
GGGAGACGCAACTGAATGAACAGTTTCGTGCAGTTTGAAATGTAGGCTGCTT
CGGCAGGATAGGTGTGGAGGTGGATGTCCGGGTCCGTAACTAGTCGCGTCAC
克隆9-1(SEQ ID NO：47)，其中每一位置的N为C或者T
GGGAGACGCAACTGAATGAACCCTGAAAAGAGGGAAGGCCTGGNTTGCTGC
TTCGGCAGGGGATTGATCAGGGTGCACGTTGCTGTCCGTAACTAGTCGCGTC
AC
克隆9-6(SEQ ID NO：48)，其中每一位置的N为C或者T
GGGAGACGCAACTGAATGAAGCCTTGAAATAGTAGTGATCGAGTGGCTGCTT
CGGCAGACTCTGAGTGTGGCTATACGTGATCGTCCGTAACTAGTCGCGTCAC
克隆11-3(SEQ ID NO：49)，其中每一位置的N为C或者T
GGGAGACGCAACTGAATGAAAAAGTGGTATTTNAAATTCNANTTANCTGCTT
CGGCAGACGACGGGGGGGCNNGTNTTGGANGATCCGTAACTAGTCGCGTCAC
克隆15-1(SEQ ID NO：50)，其中每一位置的N为C或者T
GGGAGACGCAACTGAATGAATGTNGCATAATTGANGGANGATNCATGCTGCT
TCGGCAGTTGGGTGTAAAAATGGAANGAGGTCNTATCCGTAACTAGTCGCGT
CAC
克隆8-4(SEQ ID NO：51)，其中任一位置的N均为C或者T
GGGAGACGCAACTGAATGAATCCAGGGGTGGTCGGTGGNNGGAGCGCTGCT
TCGGCAGTGAGCTGGGGAGTTCAGTCAATGTGGTCCGTAACTAGTCGCGTCA
C
实施例15 o-HBDI的RNA适体的鉴定
[0279] 已经进行了很多尝试对原始HBI发光团的化学结构进行修饰，以改变发光团的光物理性质，以及研究突变对GFP的发光团形成残基突的作用。这些研究中的一些专注于制备发光团的红移变异体。例如，Tonge和其同事描述了，在咪唑啉酮环上带有烯碳取代的4-羟基苯亚甲基咪唑啉酮(HBDI)衍生物的合成方法和光谱学特征(He等人，“Synthesis and Spectroscopic Studies of Model Red Fluorescent Protein Chromophores，”Org.Lett.4(9)：1523-26(2002)，该文献的全部内容通过引用方式结合到本申请中)。然而，即使这些化合物中红移最大的化合物4-羟基苯亚甲基-1-甲基-2-戊-1，3-二烯-1-基-咪唑啉酮其在中性水溶液中的最大发射波长也只有523nm。这些化合物的红移很小，并且其烯碳取代增加了化合物的非极性，使得这些化合物成为很差的切入点。
[0280] 最近的一项研究显示，HBDI的o-羟基衍生物(o-HBDI)(图18A)相比于其p-羟基形式具有更强的红移发射谱(Chen等人，“Ortho Green Fluorescence Protein Synthetic Chromophore；Excited-state Intramolecular Proton Transfer via a Seven-membered-ring Hydrogen-bonding System，”J.Am.Chem.Soc.，129(15)：
4534-4535(2007)，该文献的全部内容通过引用方式结合到本申请中)。这一化合物的红移发射最大波长能够达到605nm，其红移发射强的原因在于其咪唑啉酮环上o-OH和亚氨基N之间的分子内质子转移。较大的红移正是研究所感兴趣的。因此，合成游离的和琼脂糖结合的o-HBDI，并筛选与这些分子作用的RNAs。在8个循环的SELEX筛选过后，筛选出4个特定的RNA序列，它们均能与o-HBDI结合并且可以增强o-HBDI的荧光发光。以下列出通过该SELEX筛选分离得到的适体的编码DNA序列：
克隆2-6(SEQ ID NO：52)，其中每一位置的N为C或者T
GGGAGACGCAACTGAATGAAAATGGCAAAATATTCGAGAANCTGGTCTGCTT
CGGCAGGATTCTCCAAGGGGTAGATCGTGTATTCCGTAACTAGTCGCGTCAC
克隆2-18(SEQ ID NO：53)，其中每一位置的N为C或者T
GGGAGACGCAACTGAATGAAAATGTNNNATNCGAGNCNGNATTNAGCTGCT
TCGGCAGAANGNTCTCCCANAGCTNNTGNCAAATCCGTAACTAGTCGCGTCA
C
克隆8-9(SEQ ID NO：54)，其中每一位置的N为C或者T
GGGAGACGCAACTGAATGAAAATGTATAGTCGGATGTGCNGANTNNACTGCT
TCGGCAGCTTAGATGTATGCAGCTGCTCGGGAGTCCGTAACTAGTCGCGTCA
C
克隆8-20(SEQ IDNO：55)
GGGAGACGCAACTGAATGAATCTCCGTGTCAGGGCAGAGCAGGGCGCTGCTT
CGGCAGATAATGTATAGTCGGGATCGCTGAACTCCGTAACTAGTCGCGTCAC
4534-4535(2007)，该文献的全部内容通过引用方式结合到本申请中)。这一化合物的红移发射最大波长能够达到605nm，其红移发射强的原因在于其咪唑啉酮环上o-OH和亚氨基N之间的分子内质子转移。较大的红移正是研究所感兴趣的。因此，合成游离的和琼脂糖结合的o-HBDI，并筛选与这些分子作用的RNAs。在8个循环的SELEX筛选过后，筛选出4个特定的RNA序列，它们均能与o-HBDI结合并且可以增强o-HBDI的荧光发光。以下列出通过该SELEX筛选分离得到的适体的编码DNA序列：
克隆2-6(SEQ ID NO：52)，其中每一位置的N为C或者T
GGGAGACGCAACTGAATGAAAATGGCAAAATATTCGAGAANCTGGTCTGCTT
CGGCAGGATTCTCCAAGGGGTAGATCGTGTATTCCGTAACTAGTCGCGTCAC
克隆2-18(SEQ ID NO：53)，其中每一位置的N为C或者T
GGGAGACGCAACTGAATGAAAATGTNNNATNCGAGNCNGNATTNAGCTGCT
TCGGCAGAANGNTCTCCCANAGCTNNTGNCAAATCCGTAACTAGTCGCGTCA
C
克隆8-9(SEQ ID NO：54)，其中每一位置的N为C或者T
GGGAGACGCAACTGAATGAAAATGTATAGTCGGATGTGCNGANTNNACTGCT
TCGGCAGCTTAGATGTATGCAGCTGCTCGGGAGTCCGTAACTAGTCGCGTCA
C
克隆8-20(SEQ IDNO：55)
GGGAGACGCAACTGAATGAATCTCCGTGTCAGGGCAGAGCAGGGCGCTGCTT
CGGCAGATAATGTATAGTCGGGATCGCTGAACTCCGTAACTAGTCGCGTCAC
[0281] 这4个序列的最大激发波长均为400nm，最大发射波长均为590nm(图18B)。但是，尽管结合的o-HDBI与未结合的o-HDBI相比，其红色荧光增强的百分比非常惊人，但是这些RNA-荧光团复合物的总的荧光强度仍然太微弱，所以这些荧光团亦不能用于活细胞成像。导致这一微弱荧光强度的一个原因在于这些荧光团的酚羟基/酚盐的比例，这与DMHBI荧光团的情形相同。不幸的是，与产生大的红移有关的分子内氢键取决于质子化的羟基。因此，通过吸电子基团降低pKa值这有可能会引起更亮的荧光，但同时也会阻碍红移。游离o-HBDI的pKa约为10。这一pKa值充分表明在酚羟基的氢原子和亚氨基的氮原子之间存在相互作用。
[0282] 为了尝试在提高亮度的同时不影响羟基的pKa(形成分子内氢键)，合成o-HBDI的4-二甲基氨基衍生物(o-H-DMABI)(图18C)以确定氨基是否会进一步提高荧光团的亮度。
当将最初选择出的能够与DMABI或者o-HBDI结合的适体，与o-H-DMABI共孵化后，荧光发射将完全回移至500nm左右，无红移峰出现(图18D)。
实施例16 N-肟基修饰的荧光团的合成以及其适体的生成
当将最初选择出的能够与DMABI或者o-HBDI结合的适体，与o-H-DMABI共孵化后，荧光发射将完全回移至500nm左右，无红移峰出现(图18D)。
实施例16 N-肟基修饰的荧光团的合成以及其适体的生成
[0283] 在通过增加荧光团的红移荧光发射从而增加荧光团复合物的荧光发射和特异性的尝试失败后，现在采用一种生物模拟的方法来设计荧光团。截至目前，多数的红移荧光团主要是基于荧光团DsRed的，其是一种从珊瑚(Discosoma spp.)中提取的亮红色荧光蛋白。DsRed作为广泛应用的GFP的一种补充，已经被证明十分有用，主要原因在于其具有显著的红移激发和红移发射，其红移激发和红移发射的最大波长分别为558nm和583nm(图19B)。与GFP类似，DsRed类的荧光团是通过内源三肽(Q66Y67G68)的自动催化和分子内环化形成的。然而，尽管DsRed和GFP荧光团拥有相同的4-HBDI核，但DsRed类的荧光团却与GFP类的荧光团有所不同，这在于DsRed咪唑啉酮环的2位存在酰亚胺基团。这一基团增加了荧光团的共轭作用，从而引起DsRed的红移光谱学特性。
[0284] 由于酰亚胺对于亲核攻击很敏感，使得基于此结构合成荧光团不具有可行性。替代地，通过将亚胺改为N-肟基基团，设计一种生物模拟荧光团(图19C)。为了制备O-甲基肟衍生物，先将酚羟基用叔丁基二甲基氯硅烷(TBS-Cl)进行保护。具体方法是，将咪唑啉酮DMHBI或者DFHBI(1当量)溶于干燥的二氯甲烷中，向此溶液中加入二异丙基乙胺(2当量)和TBS-Cl(2当量)，室温搅拌两个小时。反应结束后，将混合液浓缩，最后用色谱柱纯化(硅胶柱，展开剂为乙酸乙酯∶己烷＝4∶1)。根据Yampolsky等人的方法，在二氧己环回流的条件下，用二氧化硒将TBS保护的产物的R2基团氧化成醛基(“Synthesis and Properties of the Red Chromophore of the Green-to-Red Photoconvertible Fluorescent Protein Kaede and Its Analogs，”Bioorganic Chem.36(2)：96-104(2008)，该文献的全部内容通过引用方式结合到本申请中)。反应1小时后，将反应液滤除固体硒并小心倒出，浓缩后直接用于下步反应。在最后一步中，将将醛(1当量)用干燥的二甲基甲酰胺溶解，向此溶液中加入吡啶(2当量)和甲氧胺盐酸盐(2当量)，混合液室温搅拌过夜。反应结束后，将混合液用乙酸乙酯稀释，然后依次用1M HCl、水和饱和NaCl洗涤。将洗涤完毕的混合液浓缩，最后用色谱柱纯化(硅胶柱，展开剂为二氯甲烷∶甲醇＝20∶1)。
[0285] 通过SELEX筛选可与荧光团作用的RNAs，从而得到适体池，这些适体可以诱导荧光团的荧光增强。实施例17 ATP、腺苷酸和cGMP的RNA传感器的定向设计
[0286] 基于荧光共振能量转移(FRET)的传感器是生物技术和生物医学研究的重要工具，其能够报告细胞内小分子的空间和时间位置。多种胞内信号分子的基于FRET的传感器已被开发出来，这些胞内信号分子例如cAMP、钙离子、过氧化氢、IP3、PIP2和许多其它的重要胞内信号分子(Medintz，“Recent Progress in Developing FRET-based Intracellular Sensors for the Detection of Small Molecule Nutrients and Ligands，”Trends Biotechnol.24(12)：539-42(2006)，该文献的全部内容通过引用方式结合到本申请中)。对于这些传感器的关键要求是，必须存在可以特异性地结合分子的蛋白，该蛋白一旦与分子结合就会发生构象改变。FRET传感器通常是融合蛋白，其包含小分子敏感的结构域和遗传编码的FRET对，例如CFP和YFP(Medintz，“Recent Progress in Developing FRET-based Intracellular Sensors for the Detection of Small Molecule Nutrients and Ligands，”Trends Biotechnol.24(12)：539-42(2006)，该文献的全部内容通过引用方式结合到本申请中)。小分子的结合会引起FRET对附近发生变化，从而改变FRET。只要与小分子结合的蛋白存在，并且该蛋白能够发生构象改变，这一方法就是有用的。此外，当结合形式和未结合形式之间的FRET差异很小时，精密的显微技术也是必需的(Medintz，“Recent Progress in Developing FRET-based Intracellular Sensors for the Detection of Small Molecule Nutrients and Ligands，”Trends Biotechnol.24(12)：539-42(2006)，该文献的全部内容通过引用方式结合到本申请中)。
[0287] 化学和生物医学研究主要关注的问题在于开发简单、敏感和特异性的传感器，以用于体外和体内分析物的检测。一种简单和可重复的制作分析物传感器的方法将会对生物医学研究和生物技术的很多方面产生本质上的影响，这些方面包括细胞信号研究和药物筛选。
[0288] 由于上述提到的目前基于FRET传感器的限制，需要开发一种对基本上任意小分子分析物都是敏感的方法。所谓定向的方法是生成RNA适体其通过和小分子结合开启DFHBI荧光发光。已经有许多先例提到了设计小分子来影响RNAs的功能，包含小分子调节的核酶(Tang等人，“Rational Design of Allosteric Ribozymes，”Chem Biol.4(6)：453-9(1997)；Soukup等人，“Design of Allosteric Hammerhead Ribozymes Activated by Ligand-induced Structure Stabilization，”Structure 7(7)：783-91(1999)，以上每一篇文献的全部内容通过引用方式结合到本申请中)、小分子调节的转录激活因子(Buskirk等 人，“In vivo Evolution of an RNA-based Transcriptional Activator，”Chem Biol.10(6)：533-40(2003)，该文献的全部内容通过引用方式结合到本申请中)，以及能够影响孔雀绿-结合适体的荧光发光的小分子(Stojanovic等人，“Modular Aptameric Sensors，”J Am Chem Soc.126(30)：9266-70(2004)，该文献的全部内容通过引用方式结合到本申请中)。这些方法都典型地依赖于关键的茎或者茎环的失稳效应，其主要表现在关键的茎或者茎环被那些融合到将被敏感的适体或者分析物中的经过弱化的茎替代。因此，在分析物不存在时，茎保持只有部分关闭的形式，并降低RNA的功能。但是，一旦荧光团结合后，亚稳态的茎都被聚拢起来，结构被加强，进而使得RNA的功能得以恢复。
[0289] 因为DFHBI适体的筛选是利用带有恒定茎环区域的文库进行的，所以这个茎环不太可能和荧光团直接发生作用。替代地，这个茎环仅仅发挥结构性作用。事实上，对于24-1或者24-2，当使用其它的非常稳定的茎环替换这个环时，检测到的荧光信号损失都很小。因为24-1的二级结构预测结果显示其茎环会封闭一泡状突起，而24-2的稳定茎环后面却还带有多个茎，故选择24-1用于下步分析。研究发现，对于24-1，其茎环基本上可以被替换成任意的核苷酸组合，只要保留其茎环形成序列即可(图20A)。此外，环可以被替换成任意的核苷酸序列，而不会影响荧光发光。
[0290] 对折叠的茎环结构的需要是一个重大的发现，因为传统的茎折叠研究证明折叠的原因是为了形成黄素单核苷酸(FMN)、ATP和茶碱调节的核酶(Tang等人，“Rational Design of Allosteric Ribozymes，”Chem Biol.4(6)：453-9(1997)；Soukup 等 人 .，“Design of Allosteric Hammerhead Ribozymes Activated by Ligand-induced Structure Stabilization，”Structure 7(7)：783-91(1999)，以上每一篇文献的全部内容都通过引用方式结合到本申请中)。在这些分析物调节的核酶中，核酶的茎被一种来自分析物结合适体的茎所替换(Soukup等人，“Design of Allosteric Hammerhead Ribozymes Activated by Ligand-induced Structure Stabilization，”Structure 7(7)：783-91(1999)，该文献的全部内容通过引用方式结合到本申请中)。当序列中碱基对为G-U和A-U时，茎的稳定性会下降，故茎的折叠易受到适体折叠条件的影响，和许多适体相同，这些适体在未结合分析物时，主要以未折叠的形式存在，而在分析物结合后，适体会折叠成一个致密的结构。分析物的存在导致适体的折叠，同时将适体中形成茎的链聚拢起来，从而增强了核酶的活性。
[0291] 经预测，适体24-1的普通茎环可以作为研究其它适体的切入点。为了实现上述目标，我们将弱化的突变引入到茎环，进而评估其对荧光发光的影响。将这些弱化的突变随着*腺苷适体引入(图20B，以 表示)，从而形成24-1：ATP适体融合物，其可以结合DFHBI。
[0292] 在存在DFHBI的条件下，将这些RNAs融合物与ATP一起孵化，或者在没有ATP的情况下进行孵化，结果表明这些融合物可以作为ATP的有效的荧光传感器(图21A)。其中最为有效的传感器是，通过单突变将茎中的G-C碱基变为稳定性较弱的G-U碱基对所获得的传感器(图20B)。24-1同样可与一些带有各种弱化茎的适体融合。通过这种融合，可以发现能够同时对ATP(特异性针对三磷酸)和环GMP敏感的传感器，其与分析物结合后，荧光强度会明显增加。实施例18利用适体13-2定向设计ATP传感器实施例8中所描述的突变研究证明，对
于适体13-2，只要保证保留其茎环形成序列，其茎环A(见图22A)可以被任意诱导突变。利用同实施例17相同的方法(针对24-1的)，将茎环A作为切入点引入ATP适体，同时伴随着茎失稳作用。通过修饰的茎A，将ATP-结合适体简单的融合到13-2中，从而形成13-2：
ATP适体融合物(SEQ ID NO：62)，其能够和DMHBI结合。
于适体13-2，只要保证保留其茎环形成序列，其茎环A(见图22A)可以被任意诱导突变。利用同实施例17相同的方法(针对24-1的)，将茎环A作为切入点引入ATP适体，同时伴随着茎失稳作用。通过修饰的茎A，将ATP-结合适体简单的融合到13-2中，从而形成13-2：
ATP适体融合物(SEQ ID NO：62)，其能够和DMHBI结合。
[0294] 24-1：ATP适体融合物可作为一种传感器，该传感器能够反映ATP浓度增加与其相应的荧光发光增加之间的关系(图22B)。这些数据表明13-2可以转变成一种分析物调节的荧光传感器。实施例19 利用SELEX方法从头生成荧光传感器
[0295] 实施例17和18所描述的定向设计方法，可以用于简单、敏感和特异性的传感器的开发，以供体外和体内分析物的检测。然而，定向设计需要掌握序列的知识和适体(用于融合)的预测结构，且其也未必可以预测出最为敏感的融合物构建体。开发一种用于生成针对任意分子的新型传感器的普遍适用的方法将会是本质上的一种进步，该方法甚至于对那些还不存在已知适体的分子同样适用。这种方法的发展使得人们可以对溶液中的分子或者在细胞中表达的分子进行检测。
[0296] 一种基于SELEX的方法可以用于筛选分析物调节的荧光传感器。例如，该基于SELEX的方法可以采用24-1适体架构作为随机文库的基础。这个文库保留了多数的24-1结构，只是对围绕关键茎环的区域做了修饰，即在围绕茎环的区域中插入了一个40个核苷酸的随机区域。
[0297] 该筛选方法的设计策略如图23B所示。该策略的第一步是，先将RNAs通过DFHBI琼脂糖，从而对RNAs进行“预筛”。这一步将会移除文库中所有保留的组成型DFHBI-结合活性的文库成员。在下一步中，流出物可以重新与DFHBI琼脂糖结合，其中只有目标分析物被加入到孵化缓冲液中。所有洗液都含有分析物。洗涤完成后，使用相同的缓冲液进行洗脱，但此缓冲液中不含有分析物。因此，能够和DFHBI结合的任何RNAs的发现均依赖于欲洗脱的分析物。这些RNAs回收后，用于下步SELEX筛选循环，从而达到富集分析物调节的传感器的目的。如上文所述，在存在DFHBI并含有分析物或者不含有分析物的条件下，对每一个池的荧光进行检测，并将那些表现出分析物依赖性的荧光发光的各个克隆分离出来。
[0298] 重要的是，为了确保传感器不会对结构相关的分子产生效应，需要进行阴性筛选。例如，针对ATP的传感器不应探测到腺苷、ADP、AMP或者NAD。为了实现这一目的，可以将这些分子也加入到洗脱缓冲液中，从而使得如果它们能够促进DFHBI结合，则它们将会保留在DFHBI琼脂糖中(而那些没有被这些结构相关的分子所改变的传感器构建体将会被洗脱出来)。
[0299] 为了证明上述原则，我们采用1μM的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)或者1μM的生物素作为目标分析物，实施上述筛选策略。在8个循环过后，对以后每个循环时文库的荧光发光进行测定，测定条件是NAD或者生物素存在时文库的荧光发光，以及NAD或者生物素不存在时文库的荧光发光。对于NAD和生物素筛选，在前4个循环中，通过结合各自的分析物而导致的荧光发光的改变基本上不存在。然而，第5个循环后，对于NAD和生物素两者筛选，通过分析物结合而导致荧光发光细微的增加现象均开始出现。这一荧光发光增加的现象清楚地表明存在一个或者多个克隆，这些克隆只有在存在特异性分析物的条件下，才能够诱导DFHBI的荧光发光。这一荧光发光增加的现象在循环6-8时趋于稳定，不再变化。使用本发明所描述的方法，对这些克隆池进行筛选，并鉴定出单个克隆，将会得到能够作为分析物调节的荧光传感器的适体(图24A)。
[0300] 将筛选出的生物素-特异性传感器分子池，用浓度递增的生物素进行滴定，进而得到DFHBI：适体池荧光发射的一个线性增加曲线(图24B)。测得的EC50值为400μM。
[0301] 将筛选出的NAD-特异性传感器分子池，用浓度递增的NAD进行滴定，进而得到DFHBI：适体池荧光发射的一个线性增加曲线(图24C)。测得的EC50值为100μM。
[0302] 对这些传感器进行测序，并可以对其进行突变学研究以提高它们的性能。实施例20 全内角反射荧光(TIRF)显微检测平台的建立
[0303] 为了简化对传感器与荧光团结合后的荧光发光的检测，将一种基于棱镜的全内角反射荧光(TIRF)显微系统作为工具，用于13-2结合DMHBI复合物的荧光发光的检测(图25A)。TIRF的设备和原理已众所周知。其设备包含：波导管，光源产生的光通过此波导管传播；流式细胞，其形成在波导管的一面上；带有相机的显微镜以及其它的成像设备，其设置在与流式细胞相反的波导管的另一面。采用玻片作为波导管，应用己胺衍生物和标准的玻璃偶联技术，将DMHBI偶联到玻璃表面，得到的结果如图25B所示。在对照RNA存在时，玻璃表面的荧光发光是可以忽略不计的，但是当暴露于适体13-2后，其荧光发光会显著增强(图25B，比较左右两幅图片)。这一结果揭示TIRF具有检测溶液中低水平RNA的能力。
[0304] 该TIRF检测系统能够实现蛋白芯片的前期制备和后期应用。尤其是，芯片可用于对一组特异性蛋白质进行检测，例如临床相关的生物标记物，或者可用于对蛋白质组的一大部分进行检测，例如具有特异功能特征的蛋白质。为了使蛋白质能够在与微矩阵化的抗体结合后被检测到，来源于生物样品的蛋白质必须用荧光染料进行标记，例如Cy5-NHS标记，因此目前的蛋白质芯片技术需要复杂的样品准备操作。因为标记操作也可能会对抗体识别的抗原决定簇产生影响，因此这一过程有可能会是有问题的。但是，本发明的基于TIRF的芯片系统解决了这些问题。尤其是，上述实施例中所描述的荧光传感器能够克服这些技术性挑战，原因在于：(1)荧光传感器成本低；(2)可以容易地将寡聚核苷酸通过荧光传感器连接到芯片上；(3)可以可靠地合成各种同质的寡聚核苷酸，这对抗体而言是一种挑战；(4)相比于抗体，寡聚核苷酸的稳定性更高；(5)适体-蛋白质相互作用的高度特异性，这一过程涉及到的是大的表面而并非像抗体那样小的抗原决定簇；以及(6)样品前期准备方便---利用本发明的传感器获得荧光信号，不需要对目标蛋白进行荧光染料标记这一样品前处理步骤。蛋白和传感器的结合能够充分的诱导荧光信号，从而大大简化了蛋白混合物的分析过程。
[0305] 截至目前，还没有应用了芯片扫描仪的TIRF问世。但是，技术进步和与之伴随的成本下降都促成了一些基于TIRF的测定方法和工具设备的出现。相较于普通的标准扫描仪(每立方微米100-200个荧光团)，基于TIRF的扫描仪一般都具有较高的敏感性(例如对于Genorama QuattroImager，其每立方微米小于5个荧光团)。本发明所涉及的蛋白质2
芯片就充分利用了TIRF高度敏感性的特征。如果在一个微点上传感器的密度是106/μm，而传感器的EC50为10nM，则蛋白浓度在1pM就会产生每立方微米100个荧光团的荧光信号，这一信号值要远远高于TIRF的敏感水平。因此，正如所看到的，在传统的DNA芯片中，可以应用TIRF测定荧光信号。TIRF在需要测定低水平的分析物时尤其有效。
芯片就充分利用了TIRF高度敏感性的特征。如果在一个微点上传感器的密度是106/μm，而传感器的EC50为10nM，则蛋白浓度在1pM就会产生每立方微米100个荧光团的荧光信号，这一信号值要远远高于TIRF的敏感水平。因此，正如所看到的，在传统的DNA芯片中，可以应用TIRF测定荧光信号。TIRF在需要测定低水平的分析物时尤其有效。
[0306] 当适体在细胞中表达时，TIRF亦可应用于增强荧光适体的信号。如果RNA适体在细胞中表达，并且定位于细胞膜，则TIRF可用于检测结合于胞膜并且与染料连接的RNAs。这一方法降低了细胞内的自发荧光，从而可以使研究人员可以对较弱的信号进行检测。定位细胞胞膜上的RNA适体的一种策略是使用MS2 RNA序列。为实现这一策略，我们首先表达了带有MS2 RNA序列标记的适体24-1。MS2 RNA是一种噬菌体RNA，其能够专一和紧密的与MS2结合蛋白(此蛋白仅发现于噬菌体中)结合(SenGupta等人，“Three-hybrid System to Detect RNA-protein Interactions in vivo，”Proc.Natl Acad.Sci USA 93：
8496-8501(1996)，该文献的全部内容通过引用方式结合到本申请中)。
8496-8501(1996)，该文献的全部内容通过引用方式结合到本申请中)。
[0307] MS2结合蛋白可以通过，使用带有N末端棕榈化(palm)序列的蛋白进行标记的方式定位在细胞膜(Skene and Virag，“Posttranslational Membrane Attachment and Dynamic Fatty Acylation of a Neuronal Growth Cone Protein，GAP-43，”J.Cell Biol108：613-625(1989)，该文献的全部内容通过引用方式结合到本申请中)。分别在含有palm序列或者不含palm序列的细胞内，表达带有GFP标记的MS2结合蛋白，实验结果也确证了上述MS2结合蛋白定位过程。图26A显示只有当palm序列存在时，GFP信号才可以重新定位在HEK 293细胞的胞膜上。因此，palm-MS2结合蛋白和24-1-MS2 RNA传感器共表达时，MS2 RNA和结合蛋白将发生相互作用，从而将RNA定位于细胞膜。使用5S核糖体RNA的Pol III启动子表达RNAs，该RNAs包含5S RNA的约前100个核苷酸，这100个核苷酸作为定位组件用来保证RNA能够进入胞质，从而与MS2结合蛋白发生相互作用(Paul等人，“Localized Expression of Small RNA Inhibitors in Human Cells，”Mol.Ther.7(2)：
237-247(2003)，该文献的全部内容通过引用方式结合到本申请中)。在HEK 293细胞中表达蛋白和RNA融合物，然后进行亚细胞分离从而将细胞膜组分从胞质组分中分离出来，这一实验也确证的上述过程。将胞膜组分和胞质组分分别应用Western免疫印迹(使用anti-GFP抗体)和Northern免疫印迹(24-1的探针)进行对比实验。实验结果如图26B所示，仅在palm阳性的细胞中，GFP才定位于胞膜。如图26C所示，与仅表达MS2结合蛋白的细胞比较，24-1RNA会在能够表达palm-MS2结合蛋白的细胞的胞膜中富集。如图27所示，未来开发的靶向分子的传感器也可以锚定在胞膜上。
实施例21 应用定向进化对适体序列进行修饰
237-247(2003)，该文献的全部内容通过引用方式结合到本申请中)。在HEK 293细胞中表达蛋白和RNA融合物，然后进行亚细胞分离从而将细胞膜组分从胞质组分中分离出来，这一实验也确证的上述过程。将胞膜组分和胞质组分分别应用Western免疫印迹(使用anti-GFP抗体)和Northern免疫印迹(24-1的探针)进行对比实验。实验结果如图26B所示，仅在palm阳性的细胞中，GFP才定位于胞膜。如图26C所示，与仅表达MS2结合蛋白的细胞比较，24-1RNA会在能够表达palm-MS2结合蛋白的细胞的胞膜中富集。如图27所示，未来开发的靶向分子的传感器也可以锚定在胞膜上。
实施例21 应用定向进化对适体序列进行修饰
[0308] 可用于调节特定荧光团荧光发射性质的另一种方法可以是定向进化出能够诱导荧光团荧光发光的适体。定向进化方法是由Shaner等人提出的(“Improved Monomeric Red，Orange and Yellow Fluorescent Proteins Derived from Discosoma sp.Red Fluorescent Protein，”Nat Biotechnol.22：1567-1572(2004)，该文献的全部内容通过引用方式时结合到本申请中)。基本上，Shaner等人描述的这种方法包括，使用随机突变和FACS筛选来获得带有广谱荧光颜色的GFP变异体。将定向进化方法应用于本发明中，使用这种方法对13-2-DMHBI复合物的荧光发射进行优化。然后再根据以下方法开发得到红移和蓝移的13-2变异体：在Jurkat细胞中对突变的13-2文库进行多轮表达，然后按照Shaner等人的方法选出那些具有期望荧光发射的细胞。
[0309] 另一种类似的筛选方法，不进行FACs步骤，而是应用掺杂的文库，例如13-2的掺杂文库，进而基于它们的波长而不是荧光强度对克隆进行筛选。将红移最大的克隆挑选出来，并使用这些克隆建立一个新的掺杂文库。将此步骤重复数次，直至适体-荧光团复合物的荧光发射接近于都在红光通道中。每一个筛选循环都会使文库的荧光发射位移5-10nm，此速率与Shaner等人的定向进化实验结果相同。RNA-DMHBI复合物的荧光发射在一个范围内也是合理的，这种情况的一个先例即是视蛋白的“光谱调谐”现象，在该现象中同样的发光团即视网膜的发光团，能够根据发光团的微环境变化而吸收红、绿或者蓝光，其中所述发光团的微环境变化受到与其共价连接的特定视蛋白调控。图13示出了一组适体引起荧光团发射变化的情况。
[0310] 可以组合使用上述这些方法来开发出一组荧光团/适体复合物，这些复合物可以用于进行SELEX筛选实验并最终应用在对适体标记的RNAs进行可视化，例如在活细胞实验中。实施例22 腺苷酸传感器J茎的突变学研究
[0311] 实施例17所描述的腺苷酸传感器，含有图20B所示的J茎，在此对该茎进行替换修饰，并对修饰后传感器分子的荧光发光性质进行了研究。在SEQ ID NO：32中，supra即J茎的序列以粗体字显示。表3列出了相应的替换序列。表3 SEQ ID NO：32表示的腺苷酸传感器的茎替换突变
[0312] 从在提供理想的腺苷酸响应时是否依然能够保留所有荧光这一方面来判断，J2茎是最优的茎之一。J2D茎能够达到69％的适体24-1的荧光。所有的茎均能够使传感器分子表现出腺苷酸响应的荧光发光。实施例23 应用RNA-荧光团复合物可视化细胞中的mRNAs以及轴突中mRNA转运情况的方法
[0313] 近来，有研究发现RhoA转录子定位于轴突生长锥上，RhoA mRNA的翻译是为了介导生长锥Semaphorin 3A(Sema3A)的塌陷效应。RhoA转录子以颗粒结构定位于轴突生长锥，而且和在轴突中相同，在丝状伪足也发现了RhoA转录子(Wu等人，“Local Translation of RhoA Regulates Growth Cone Collapse，”Nature 436：1020-1024(2005)，该文献的全部内容通过引用方式结合到本申请中)。使用Sindbis病毒构建体表达RhoA融合RNAs的研究也发现，RhoA通过位于RhoA的3’UTR中的靶向组件对生长锥进行靶向。
[0314] 本发明的适体：荧光团复合物可用于监测轴突转向过程中，RhoAmRNA的定位以及其在生长锥中的转运对于梯度Sema3A的应答情况。可以将RhoA mRNA克隆到一个或者多个质粒构建体中，这些质粒构建体可以使RhoARNA o和一系列的适体标签组成融合物进行表达。应用多个串联13-2适体进行标记。以pcDNA3.1作为亲本质粒，将适体序列导入多个克隆位点，而空余位点用于克隆RhoA cDNA。得到的质粒构建体转染到脊神经节(DRG)神经元。
[0315] 通过活细胞显微技术对适体-RhoA融合物的mRNA的位置进行监测。在显微镜的环境槽中使用Mattek玻璃底培养皿。为了验证RhoA融合物的mRNA进行了表达，将神经元原位固定，并用适体特异性探针进行杂交实验。需要确定的是，活细胞条件下观察到的融合物-RhoA的mRNA位置是否模拟原位杂交实验中观察到的mRNA的内源位置。因为RhoA的翻译会介导Sema3A在生长锥中的作用，所以对RhoA颗粒在已经过Sema3A刺激处理的神经元中的移动进行监测。通过皮升微量注射器(picosyringe)将Sema3A注射到远离轴突100μm的位置处，注射时的流速约为1nl/min。一小时后轴突会从注射口处转向。因为RhoA会在轴突远离信号的位置介导细胞骨架收缩反应，所以RhoA mRNA可能会迁移到轴突的这一面从而定位后面的蛋白使其处于轴突的正确区域。因此，对带有标记的RhoA mRNA在轴突中的转运进行监测，轴突中微量吸管使用Sema3A或者载体进行填充。如果Sema3A能够诱导RhoA RNA转运到生长锥塌陷位点，则表明Sema3A受体(丛蛋白A/神经毡蛋白)能够发出mRNA募集信号，从而此过程也作为这一受体复合物的一条新的意外的信号效应途径。与原位杂交实验不同，活细胞成像可以确定以下方面：出现在生长锥塌陷边缘RhoA颗粒是否来源于生长锥中在先已经存在的颗粒，或者来源于轴突中的颗粒，或者是否成形于未结合的mRNAs。此外，还可以建立RhoA转运和轴突转向的时间关系。因此，RNA可视化技术可以对mRNA在轴突中的作用进行研究，而这对原位杂交技术而言是不可能的。实施例24 应用NAD传感器对细胞内NAD水平进行动态变化监测
[0316] 将实施例19所描述的NAD传感器用于细胞内NAD水平的动态变化监测。近来，有研究显示，β-烟酰胺核糖以及一系列相关的酰胺、酯和羧酸核苷可以提高胞内的NAD水平20％-270％，这可以通过HPLC方法测定(Yang等人，“Syntheses of Nicotinamide Riboside and Derivatives：Effective Agents for Increasing Nicotinamide Adenine Dinucleotide Concentrations in Mammalian Cells，”J Med Chem.50：6458-6461(2007)，该文献的全部内容通过引用方式结合到本申请中)。对于应用NAD传感器和这些同样的NAD-诱导试剂，需要解决的问题是确定这些化合物是如何快速提高NAD水平的，以及由此引起的NAD水平增加可以持续多长时间。
[0317] 为了实现上述目标，将NAD-响应的RNA在细胞中进行表达。通常使用质粒对适体进行表达，启动子选用Pol II或者Pol III，上述条件可以使适体RNA在胞质中进行高表达(Paul等人，“Localized Expression of Small RNA Inhibitors in Human Cells，”Mol Ther.7：237-247(2003)，该文献的全部内容通过引用方式结合到本申请中)。适体表达细胞是含有质粒(启动子是Pol II或者Pol III任一类型)的HEK293细胞，表达水平通过Northern免疫印迹进行监测。能够得到最高水平RNA适体水平表达的质粒用于进行NAD成像。
[0318] 然后，分别在没有DMHBI的条件下和存在DMHBI的条件下，对基线荧光水平进行评估。此外，用FK866抑制内源NAD水平，其中FK866是一种烟酰胺磷酸核糖基转移酶的抑制剂(Khan等人，“Nicotinamide Adenine Dinucleotide Metabolism as an Attractive Target for Drug Discovery，”Expert Opin Ther Targets.11：695-705(2007)，该文献的全部内容通过引用方式结合到本申请中)。可以预期抑制NAD水平将会减弱传感器的荧光发光。下一步，测定不同酰胺、酯，以及β-烟酰胺核糖的酸核苷衍生物的作用。将转染的HEK293细胞用这些NAD前体进行处理，可以检测到总荧光发光增强，从而证明传感器有合适的功能。由于荧光发光的变化可以反映细胞体积的变化，因此将细胞用表达蓝铜(一种蓝色荧光蛋白)的质粒共转染。绿色传感器的荧光经标准化处理后成为蓝色荧光。对绿色荧光发光的时间过程和水平进行监测，发现NAD前体能够最为快速的提高NAD水平。这些实验有帮于确定这些化合物中的哪些化合物最适于发挥补充作用，从而可以为以后测定神经元中的NAD水平奠定基础。
[0319] 本申请中所记载的所有技术特征(包含任何所附的权利要求、摘要和附图)，和/或公开的任何方法或者工艺的所有步骤，都可以和以上所述各方面中的任意方面以任何方式进行组合，但不包括其中至少有些特征和/或步骤存在相互排斥的组合。
[0320] 本申请描述了本发明的基本概念，本领域技术人员非常清楚前述的详细描述仅为示例之目的，而不对本申请构成任何限制。虽然本申请未作明确记载，但本发明可以存在各种变化和改进。此外，除非在权利要求中进行了特别限定，否则所列举的处理单元或者序列的顺序，或者数字、字母或者其它标识的使用，并非是要将所要求的工艺限定为任何次序。本申请在此已经提出了这些变化和改进，它们都在本发明的精神和范围内。因此，本发明仅受以下所附的权利要求及其等同物限制。
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