改良的从微藻类产生岩藻黄质和/或多糖的方法
阅读：123发布：2020-10-28
专利汇可以提供改良的从微藻类产生岩藻黄质和/或多糖的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了一种从微藻类产生岩藻黄质和/或多糖的方法和其纯化的岩藻黄质用于药物、 化妆品 、营养食品以及食品组合物中的用途。，下面是改良的从微藻类产生岩藻黄质和/或多糖的方法专利的具体信息内容。
1.一种改良的从微藻类产生岩藻黄质和/或多糖的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)使用诱导剂培养所述微藻类培养基以使细胞快速生长，从而增强岩藻黄质和/或多糖的产生；
(b)收获所述藻类培养物并干燥以产生干培养物；
(c)进行气压研磨以使所述藻类的细胞壁破裂；
(d)萃取所述干培养物以产生富含岩藻黄质和/或多糖的萃取物；以及
(e)将萃取混合物分离成生物质部分和富含岩藻黄质的含油树脂和/或富含多糖的萃取物，并且任选地进一步纯化所述富含岩藻黄质的含油树脂和/或富含多糖的萃取物。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述藻类培养物是选自褐指藻属、等鞭金藻属、双眉藻属、透镜舟形藻、不定舟形藻以及角毛藻属。
3.如权利要求1所述的方法，其中使用选自以下的应力条件培养所述微藻类：氮或硝酸盐饥饿、磷饥饿、光饥饿、选择特定的光波长、在培养期间改变光波长(从蓝色-绿色变成绿色-红色)、加入H2O2、施加热、使用较高pH值、加入氯离子、加入植物激素、将所述培养基暴露于臭氧以及所述应力条件的组合。
4.如权利要求1所述的方法，其中在开放、封闭或半封闭的系统中培养微藻类。
5.如权利要求1所述的方法，其中通过离心和任选地再次离心将所述微藻类从水性混合物中分离，随后干燥，来收获所述微藻类。
6.如权利要求5所述的方法，其中通过离心将水与所述微藻类分离来收获所述微藻类，其规模取决于所述微藻类物种和所述培养基的盐度。
7.如权利要求5所述的方法，其中通过至少一种选自以下的方法来干燥所述藻类培养物：冻干、喷雾干燥、蒸发、空气或真空干燥、暴露于热空气、耐火窗带式干燥、在烘箱中干燥以及所述方法的组合。
8.如权利要求5所述的方法，其中通过加入选自以下的打粉剂或防结块剂进行所述干燥工艺：硬脂酸镁、乳糖、卵磷脂、滑石、羟丙基甲基纤维素、微晶纤维素、海藻酸钠、铝硅酸钠、硅酮氢氧化物、壳聚糖以及所述打粉剂或防结块剂的组合。
9.如权利要求5所述的方法，其中将所收获的生物质浓缩成固体，用水洗涤以降低盐度，并且任选地再次离心以得到含有10-45％固体的产物。
10.如权利要求5所述的方法，其中使用通过所述收获的生物质的离心和任选地再次离心而获得的上清液来纯化所分泌的多糖。
11.如权利要求1所述的方法，其中通过使用至少一种有机溶剂和/或超临界流体(SCF)液体CO2萃取，使岩藻黄质与蛋白质分离。
12.如权利要求11所述的方法，其中用于萃取的所述至少一种有机溶剂是选自乙醇、异丙醇、正丁醇、乙醚、二异丙醚、正戊烷、正己烷、正庚烷、环己烷、石油醚、四氢呋喃、甲基四氢呋喃、乙腈、丙酮、甲基乙基酮、甲基异丁基酮、乙酸乙酯、乙酸正丙酯、乙酸异丙酯以及所述溶剂的混合物。
13.如权利要求11所述的方法，其中将磷酸加入用于萃取的所述溶剂中。
14.如权利要求11所述的方法，其中使用选自豆油、玉米油、葵花油、芝麻油以及其组合的食用油作为用于所述萃取的溶剂或作为共溶剂。
15.如权利要求1所述的方法，所述方法得到在所述干生物质中含有至少1.5％岩藻黄质且在所述萃取物中含有至少10％岩藻黄质的产物。
16.如权利要求11所述的方法，其中使在所述萃取之后剩余的浆料溶于热水中以能够纯化多糖。
17.如权利要求11所述的方法，其中在所述SCF萃取之前或之后，使用例如蛋白酶的酶将所干燥的生物质进行酶促处理，和/或用热水和/或通过热蒸汽萃取，和/或通过用缓冲溶液洗涤来处理，和/或进行处理以使结合至所述岩藻黄质的所述蛋白质变性。
18.如权利要求1所述的方法，其中通过选自以下的方法来分离和纯化所述多糖：过滤、使用天然二氧化硅珠粒作为用于过滤的介质进行的柱上凝胶过滤、离子交换色谱法、包括制备型TLC或制备型HPLC的液相色谱法以及所述方法的组合。
19.如权利要求1所述的方法，其中通过额外的SCF程序，任选地与液相色谱法组合，将所述富含岩藻黄质的含油树脂进一步提纯并且与脂肪酸分离，从而得到纯化的岩藻黄质。
20.一种如权利要求19所述的岩藻黄质的用途，所述岩藻黄质作为活性药物成分，单独或与其它活性成分组合用于制剂中，用于预防、改善或治疗选自以下的病状或疾病：癌症；
代谢综合症，包括超重、肥胖症、高血胆固醇LDL、高血甘油三酯、II型糖尿病、胰岛素抵抗型糖尿病、高血糖；动脉粥样硬化；痴呆；阿尔茨海默病；记忆丧失；多发性硬化症；抑郁症，包括环境应力、热应力以及全身神经保护。
21.一种如权利要求19所述的岩藻黄质的用途，所述岩藻黄质单独或与其它活性成分组合用于例如软膏、凝胶、乳膏、溶液、乳液以及洗剂的供局部或其它施用形式用的化妆品制剂中，以抵抗衰老、使皮肤增白以及保护皮肤。
22.一种制备包含如权利要求19所述的岩藻黄质的药物组合物的方法，所述方法是通过将所述岩藻黄质与至少一种选自以下的其它活性成分混合来进行：吸收促进剂、粘合剂、膨胀剂、载体、包覆剂、稀释剂、崩解剂、增量剂、填充剂、调味剂、润滑剂、表面活性剂以及润湿剂。
23.一种制备包含如权利要求19所述的岩藻黄质和/或多糖的营养食品、膳食补充剂或食品制剂的方法，所述方法是通过将所述岩藻黄质和/或多糖与选自以下的食品成分混合来进行：糖和淀粉、膳食纤维、脂质、氨基酸、例如蛋白分离物或蛋白水解物的蛋白质、乳酸、维生素以及矿物质。
改良的从微藻类产生岩藻黄质和/或多糖的方法
技术领域
[0002] 发明背景
[0003] 微藻类是能够通过光合作用自发生长的自养性光合微生物。微藻类在海洋水介质中和淡水或微咸水中以及多种陆地栖息地中生长。在淡水或海洋中发现的大部分微藻类物种一般是自养性的，即它们只能通过光合作用来生长。对于这些物种来说，其环境中存在有机含碳基质或有机物质是不利的，且不促进生长。但是，发现某些微藻类物种不是严格自养性的。因此，这些物种中是异养性的一些物种能够在完全不存在光下通过发酵(即通过使用有机物质)进行生长。
[0004] 光合作用对于生长来说仍然是必不可少的其它微藻类物种能够从光合作用和微藻类环境中存在的有机物质获得双重益处。这些中间物种据说是兼养的，并且在光与有机物质存在下都可以培养。
[0005] 岩藻黄质是一种叶黄素，发现其是拥有褐色或绿色的褐藻的叶绿体中的一种色素。其属于类胡萝卜素家族，并具有结构类似于β-胡萝卜素的分子。岩藻黄质在人体中并不具有类维生素活性，并且相信其充当抗氧化剂。人食用岩藻黄质可带来若干健康益处。
[0006] 岩藻黄质主要吸收在可见光谱的蓝绿色至黄绿色部分中的光，在约510-525nm达到峰值，并在450至540nm范围内吸收。岩藻黄质大量存在于褐海藻(来自褐藻纲(Phaeophyceae)的大藻类)和硅藻(来自硅藻门(Bacillariophyta)的微藻类)中。其还存在于例如等鞭金藻属(Isochrysis sp.)的金褐色微藻类中。
[0007] 岩藻黄质的结构式如下：
[0008]
[0009] 岩藻黄质的化学式是C42H58O6，且其化学名称是乙酸[(1S,3R)-3-羟基-4-[(3E,5E,7E,9E,11E,13E,15E)-18-[(1R,3S,6S)-3-羟基-1,5,5-三甲基-7-氧杂双环[4.1.0]庚烷-
6-基]-3,7,12,16-四甲基-17-侧氧基十八碳-1,3,5,7,9,11,13,15-亚辛烯基]-3,5,5-三甲基环己基]酯。
6-基]-3,7,12,16-四甲基-17-侧氧基十八碳-1,3,5,7,9,11,13,15-亚辛烯基]-3,5,5-三甲基环己基]酯。
[0010] 除构成其独特结构的7个共轭双键、环氧基、羟基、酮羰基以及羧基酯部分之外，岩藻黄质在其分子中还具有丙二烯部分。
[0012] 如公布WO2014/003740和WO2014/078459中所述，例如岩藻黄质的类胡萝卜素可以有效地加速重量减轻。一种典型的制剂包括脂肪阻断剂、填充剂组分、胰岛素敏化剂以及脂肪生长抑制剂，其中脂肪阻断剂可以包括例如岩藻黄质的类胡萝卜素或石榴酸。此用途可能是因为人体能够将岩藻黄质的代谢物长时间储存在脂肪细胞中，此在抑制脂肪细胞分化和增殖的同时还可能诱发脂肪流失。
[0013] 另外，岩藻黄质具有其它的健康益处，例如纠正肌肉组织中葡萄糖代谢的异常，此可以帮助糖尿病患者并通过当前未经证实的机制降低人胆固醇和甘油三酯的水平。已经注意到人体补充岩藻黄质会降低血压、减少肝脏脂肪储存并且降低肝酶值。
[0014] 若干研究小组已经研究岩藻黄质的消炎作用、抗感受伤害作用以及抗癌作用。一项研究已经表明岩藻黄质除其抗癌作用之外，还可能对氧化应激相关的疾病具有作用，其抗癌作用在一些情况下是通过抑制明胶分解酶MMP-9的表达和通过抑制黑色素瘤细胞的移动性来诱发多种癌细胞的细胞凋亡或对癌细胞的侵入发挥抑制作用进行的。
[0015] 举例来说，L.J Martin在“Mar Drugs,2015年7月31日；13(8)；4784-98中在标题为“Fucoxanthin and its metabolite fucoxanthinol in cancer prevention and treatment”的文章中描述了胃肠道的消化酶将岩藻黄质主要代谢成岩藻黄醇。这些化合物已经显示具有许多有益的健康作用，包括抗诱变作用、抗糖尿病作用、抗肥胖作用、消炎作用以及抗肿瘤作用。在此综述中，作者阐明了岩藻黄质和岩藻黄醇依据不同癌症类型的作用机制。当前的发现表明这些化合物有效地治疗和/或预防癌症发生和侵袭。
[0016] 使用海藻产生岩藻黄质具有若干缺点。岩藻黄质在海藻的多个部分中的含量低，即占干重的约0.01-0.3％。因此，以商业规模从海藻萃取岩藻黄质是麻烦的，因为产生1Kg 5％岩藻黄质含油树脂要使用约两吨的干海藻(产率0.0025％)。另外，收获海藻限于秋季和冬季，且无法在其它季节进行，因此，生产工厂无法全年以全部容量运行。另一个问题是关于无法控制日益受到污染的海洋中海藻的生长条件。此外，在海洋中生长的海藻往往螯合污染物，例如重金属(例如汞和镉)、碘、多环芳香烃(PAH)以及放射性污染物。
[0017] 因此，微藻类更适于产生岩藻黄质。但是，目前本领域中已知的用于从微藻类产生岩藻黄质的方法得到的产物的产率和纯度相对较低。举例来说，C.M.Reddy等人在美国公布2015/0140619中描述了从微藻类等鞭金藻属产生生物燃料。岩藻黄质是此过程的副产物，其效率较低，因为分离的岩藻黄质的浓度极低，即0.3-2mg/g。
[0018] 因此，本领域中需要一种有效的产生岩藻黄质的方法，其将以相对较高的产率提供高纯度的岩藻黄质。本发明提供了这类方法。发明概要
[0019] 本发明提供了一种改良的以高产率和高纯度产生岩藻黄质和/或多糖的方法。
[0020] 根据本发明的一些实施方案，本文公开的方法提供了富含岩藻黄质和/或多糖的干微藻类粉末，和/或富含岩藻黄质和例如多不饱和脂肪酸(PUFA)的其它化合物的含油树脂，和/或富含多糖和/或硫酸化多糖的溶液。
[0021] 申请人已经研发出一种改良的从微藻类产生岩藻黄质和/或多糖的方法，所述方法包括以下步骤：
[0022] (a)使用诱导剂培养微藻类培养基以使细胞快速生长，从而增强岩藻黄质和/或多糖的产生；
[0023] (b)收获藻类培养物并干燥以产生干培养物；
[0025] (d)萃取干培养物以产生富含岩藻黄质和/或多糖的萃取物；以及
[0027] 根据本发明的优选实施方案，本文提供的方法得到在干生物质中含有约1.5％岩藻黄质且在萃取物中含有至少约10％岩藻黄质的粗产物。
[0028] 根据本发明的一些实施方案，通过选自以下的方法将岩藻黄质与多糖分离且纯化：过滤、使用例如天然二氧化硅珠粒作为用于过滤的介质进行的柱上凝胶过滤、离子交换色谱法、包括制备型TLC或制备型HPLC的液相色谱法以及所述方法的组合，从而得到高纯度的岩藻黄质。
[0029] 根据本发明的一些实施方案，通过例如液相色谱法获得的高纯度的岩藻黄质单独或与其它活性成分组合用于制剂中，用于预防、改善或治疗选自以下的病状或疾病：癌症；代谢综合症，包括超重、肥胖症、高血胆固醇LDL、高血甘油三酯、II型糖尿病、胰岛素抵抗型糖尿病、高血糖；动脉粥样硬化；痴呆；阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease)；记忆丧失；多发性硬化症；抑郁症，包括环境应力、热应力以及全身神经保护。
[0030] 本发明提供了药物组合物，其含有如本文所述产生的高纯度的岩藻黄质，与药学上可接受的赋形剂和任选地其它治疗剂混合。
[0031] 根据一些实施方案，可以调配成剂型的本发明的药物组合物例如呈片剂、丸剂、粉剂、颗粒剂、糖衣丸、液体、悬浮液、乳液、颗粒剂、胶囊、栓剂、注射制剂(溶液和悬浮液)、贴片等施用。
[0032] 根据一些实施方案，本发明的岩藻黄质单独或与其它活性成分组合用于例如软膏、凝胶、乳膏、溶液、乳液以及洗剂等的供局部或其它施用形式用的化妆品制剂中，以抵抗衰老、使皮肤增白、保护皮肤以及用于其它化妆品用途。
[0033] 在一些实施方案中，包含本发明的岩藻黄质的药物组合物是通过将所述岩藻黄质与至少一种选自以下的其它活性成分混合来制备：吸收促进剂、粘合剂、膨胀剂、载体、包覆剂、稀释剂、崩解剂、增量剂、填充剂、调味剂、润滑剂、表面活性剂、润湿剂等。
[0034] 根据一些实施方案，包含本发明的岩藻黄质的营养食品、膳食补充剂或食品制剂是通过将所述岩藻黄质和/或多糖与例如以下的食物成分混合来制备：糖和淀粉、膳食纤维、脂质、氨基酸、例如蛋白分离物或蛋白水解物的蛋白质、乳酸、维生素、矿物质以及其它常用于此类制剂中的成分。
[0035] 根据一些实施方案，本发明的膳食补充剂可以包括例如饮料、汤、零食、乳制品等。
[0036] 图示简单说明
[0037] 图1描绘使用丙酮/甲醇/己烷作为溶剂的岩藻黄质HPLC校准曲线。
[0038] 图2描绘使用乙腈作为溶剂的岩藻黄质HPLC校准曲线。
[0039] 图3描绘浓度为3.686mg/mL的岩藻黄质溶液的HPLC色谱图。
[0040] 图4描绘叶绿素A校准曲线。
[0041] 图5描绘在450nm下叶绿素A的HPLC色谱图。
[0042] 图6描绘包括叶绿素A的经过冷冻干燥的萃取的岩藻黄质含油树脂的色谱图。
[0043] 图7描绘在硝酸盐饥饿下在100L的户外平板中的等鞭金藻属生长曲线，其表示为累积的岩藻黄质％相对于时间(天)。
[0044] 图8描绘在硝酸盐饥饿下在100L的户外平板中的等鞭金藻属生长曲线，其表示为干重(DW)相对于时间(天)。
[0045] 图9描绘等鞭金藻属(在加入植物生长素下诱导)生长曲线，其表示为干重(DW)相对于时间(天)。
[0046] 图10描绘等鞭金藻属(在蓝绿色光饥饿和高pH值下诱导)生长曲线，其表示为岩藻黄质％相对于时间(天)。
[0047] 图11描绘双眉藻属(Amphora sp.)(在加入植物生长素下诱导)生长曲线，其表示为干重(DW)相对于时间(天)。
[0048] 图12描绘双眉藻属(在蓝光饥饿和高pH值下诱导)生长曲线，其表示为干重(DW)相对于时间(天)。
[0049] 发明详述
[0050] 本发明提供了一种改良的以高产率和高纯度产生岩藻黄质和/或多糖的方法。
[0051] 根据本发明的一些实施方案，本文公开的方法提供了富含岩藻黄质和/或多糖的干微藻类粉末，和/或富含岩藻黄质和例如多不饱和脂肪酸(PUFA)的其它化合物的固体含油树脂，和/或富含多糖和/或硫酸化多糖的溶液。
[0052] 申请人已经研发出一种改良的从微藻类产生岩藻黄质和/或多糖的方法，所述方法包括以下步骤：
[0053] (a)使用诱导剂培养微藻类培养基以使细胞快速生长，从而增强岩藻黄质和/或多糖的产生；
[0054] (b)收获藻类培养物并干燥以产生干培养物；
[0055] (c)进行气压研磨以使藻类的细胞壁破裂；
[0056] (d)萃取干培养物以产生富含岩藻黄质和/或多糖的萃取物；以及(e)将萃取混合物分离成生物质部分和富含岩藻黄质的含油树脂和/或富含多糖的萃取物，并且任选地进一步纯化所述富含岩藻黄质的含油树脂和/或富含多糖的萃取物。
[0058] 根据本发明，如本文所用，术语上清液是指通过离心或沉淀获得的剩余溶液或液体。
[0059] 根据本发明，如本文所用，校准曲线是一种通过将未知样品与一组已知浓度的样品比较来确定未知样品中的物质的浓度的方法。
[0060] 根据本发明，如本文所用，超临界流体萃取(SFE)是一种使用超临界流体作为萃取溶剂，将一种组分(萃取物)与另一组分(基质)分离的方法。萃取是从固体基质萃取，但也可以从液体萃取。SFE可以用于从产物去除不需要的物质(例如脱咖啡因)或者收集所需产物(例如香精油)。通常，液体二氧化碳(CO2)是最常用的超临界流体之一。
[0062] 根据本发明，如本文所用，术语生长培养基是指生长介质或培养基，其是通过使用来源于植物和微生物培养物的特定细胞类型来支持微生物或细胞或者小的植物生长的液体或凝胶混合物，用于例如微藻类和微生物的生长。
[0063] 根据本发明的一方面，微藻类是选自褐指藻属(Phaeodactykum sp.)、等鞭金藻属、双眉藻属、透镜舟形藻(Naviculla lensi)、不定舟形藻(Naviculla incerta)以及角毛藻属(Chaeotocerous sp.)。
[0064] 根据本发明的另一方面，培养微藻类是在诱导生长，因此能够使细胞快速发育并大量获得细胞的培养基中进行。
[0065] 根据本发明的一些实施方案，使用选自以下的应力条件(诱导岩藻黄质合成和累积)培养微藻类：氮或硝酸盐饥饿、磷饥饿、光饥饿、选择特定的光波长、在培养期间改变光波长(例如从蓝色-绿色变成绿色-红色)、加入H2O2、施加热、使用较高pH值(高达9.0)、加入氯离子、加入植物激素(例如植物生长素和细胞分裂素)、将培养基暴露于臭氧以及所述应力条件的组合。
[0066] 根据本发明的一些实施方案，在开放、封闭或半封闭系统中培养微藻类。
[0067] 根据本发明的一特定实施方案，培养微藻类在开放系统中进行。
[0068] 根据本发明的一特定实施方案，培养微藻类在封闭系统中进行。
[0069] 根据本发明的一特定实施方案，培养微藻类在半封闭系统中进行。
[0070] 图7-12显示例如硝酸盐饥饿、使用较高温度(施加热)、使用较高pH值(高达9.0)和改变光的波长(颜色)(变成蓝色-绿色或绿色-红色)的应力因素的组合抑制藻类生长，以及诱导岩藻黄质的累积。例如图8、11以及12中的干物质(DW)的累积迅速，直至第6天，此后其变得恒定。
[0071] 实施例3证明诱导硝酸盐饥饿对等鞭金藻属的影响以及诱导光波长的改变对在加入植物生长素下生长的等鞭金藻属的影响，如表1中所详述：
[0072] 表1
[0073]参数 诱导硝酸盐饥饿 诱导光波长的改变
干重增加 每天0.75g/L 每天1.4g/L
岩藻黄质增加 每天8.38mg/L 每天16.41mg/L
岩藻黄质诱导 每天1.57mg/L 每天11.77mg/L
收获的岩藻黄质 79.2mg/L 176.7mg/L
干重增加 每天0.75g/L 每天1.4g/L
岩藻黄质增加 每天8.38mg/L 每天16.41mg/L
岩藻黄质诱导 每天1.57mg/L 每天11.77mg/L
收获的岩藻黄质 79.2mg/L 176.7mg/L
[0074] 实施例3进一步证明诱导硝酸盐饥饿对双眉藻属的影响以及诱导光波长的改变和使用高pH值对在植物生长素下生长的双眉藻属的影响，如下表2中所详述：
[0075] 表2
[0076]
[0077]
[0078] 根据本发明的特定实施方案，在第一培养阶段期间例如细胞分裂素和植物生长素的植物油菜素类固醇激素的加入引起较高的生物质获得速率。
[0079] 根据本发明的一特定实施方案，通过例如在工业离心机中离心将微藻类从水性混合物中分离，随后干燥，来收获微藻类。
[0081] 根据本发明的另一方面，通过例如离心将水与微藻类分离来收获微藻类，其规模取决于微藻类物种和培养基的盐度。
[0082] 根据本发明的另一方面，将所收获的生物质浓缩成固体，接着用水洗涤以降低盐度，并且任选地再次离心以得到含有至少10％固体、优选至少30％固体且最优选至少45％固体的产物。
[0083] 根据本发明的另一方面，使用通过所收获的生物质的离心和任选地再次离心而获得的上清液来纯化所分泌的多糖。
[0084] 根据本发明的一些实施方案，使用有机溶剂和/或超临界流体(SCF)，例如液体CO2，使岩藻黄质与蛋白质分离并萃取。
[0085] 根据本发明的一些实施方案，用于萃取的溶剂是选自乙醇、异丙醇、正丁醇、乙醚、二异丙醚、正戊烷、正己烷、正庚烷、环己烷、石油醚、四氢呋喃、甲基四氢呋喃、乙腈、丙酮、甲基乙基酮、甲基异丁基酮、乙酸乙酯、乙酸正丙酯、乙酸异丙酯以及所述溶剂的混合物。
[0086] 根据本发明的一方面，将磷酸加入用于萃取的溶剂中。
[0087] 根据本发明的一些实施方案，使用选自豆油、玉米油、葵花油、芝麻油以及其组合的食用油作为用于萃取的溶剂或作为共溶剂。
[0090] 根据本发明的另一方面，使用在约500-1000巴范围内的萃取压力和在约50-100℃范围内的温度使溶剂通过干藻类基质。
[0091] 根据本发明的另一方面，O2与生物质比率在30:1与500:1之间。
[0092] 根据本发明的另一方面，CO2流速在每小时100-700Kg之间。
[0093] 根据本发明的一些实施方案，任选地通过加入选自以下的打粉剂或防结块剂进行干燥工艺：硬脂酸镁、乳糖、卵磷脂、滑石、羟丙基甲基纤维素、微晶纤维素、海藻酸钠、铝硅酸钠、硅酮氢氧化物、壳聚糖等等以及所述打粉剂或防结块剂的组合。
[0094] 根据本发明的一些实施方案，通过额外的SCF萃取程序(例如多达5次萃取)，任选地与液相色谱法组合，将富含岩藻黄质的含油树脂进一步提纯。
[0095] 根据本发明的另一方面，使在例如第五次萃取程序之后剩余的浆料溶于热水中以能够纯化多糖。
[0096] 根据本发明的优选实施方案，本文提供的方法得到在干生物质中含有约1.5％岩藻黄质且在萃取物中含有至少约10％岩藻黄质的粗产物。
[0097] 根据本发明的一些实施方案，在SCF萃取之前或之后，使用例如蛋白酶的酶将所干燥的生物质进行酶促处理，和/或用热水和/或通过热蒸汽萃取，和/或通过用缓冲溶液洗涤来处理，和/或进行处理以使结合至岩藻黄质的蛋白质变性。
[0098] 根据本发明的另一方面，使剩余的浆料(例如在第五次萃取之后)溶于热水和/或酸性水溶液中。
[0099] 根据本发明的一些实施方案，通过选自以下的方法来分离岩藻黄质与多糖并纯化：过滤、使用例如天然二氧化硅珠粒作为用于过滤的介质进行的柱上凝胶过滤、离子交换色谱法、包括制备型TLC或制备型HPLC的液相色谱法以及所述方法的组合，从而得到高纯度的岩藻黄质。
[0100] 根据本发明的一些实施方案，通过例如液相色谱法获得的高纯度的岩藻黄质单独或与其它活性成分组合用作膳食补充剂，或用作制剂中的活性药物成分，用于预防、改善或治疗选自以下的病状或疾病：癌症；代谢综合症，包括超重、肥胖症、高血胆固醇LDL、高血甘油三酯、II型糖尿病、胰岛素抵抗型糖尿病、高血糖；动脉粥样硬化；痴呆；阿尔茨海默病；记忆丧失；多发性硬化症；抑郁症，包括环境应力、热应力以及全身神经保护。
[0101] 本发明提供了药物组合物，其含有如本文所述获得的高纯度的岩藻黄质，与药学上可接受的赋形剂和任选地其它治疗剂混合。
[0102] 根据一些实施方案，例如调配成剂型的本发明的药物组合物例如呈片剂、丸剂、粉剂、颗粒剂、糖衣丸、液体、悬浮液、乳液、颗粒剂、胶囊、栓剂、注射制剂(溶液和悬浮液)、贴片等施用。
[0103] 根据本发明的一些实施方案，高纯度的岩藻黄质单独或与其它活性成分组合用于例如软膏、凝胶、乳膏、溶液、乳液、洗剂等的供局部或其它施用形式用的化妆品制剂中，以抵抗衰老、使皮肤增白、保护皮肤以及用于其它化妆品用途。
[0104] 在一些实施方案中，包含本发明的岩藻黄质的药物组合物是通过将所述岩藻黄质与至少一种选自以下的其它活性成分混合来制备：吸收促进剂、粘合剂、膨胀剂、载体、包覆剂、稀释剂、崩解剂、增量剂、填充剂、调味剂、润滑剂、表面活性剂、润湿剂等。
[0105] 根据本发明的一些实施方案，包含本发明的岩藻黄质和/或多糖的营养食品、膳食补充剂或食品制剂是通过将所述岩藻黄质和/或多糖与例如以下的食物成分混合来制备：糖和淀粉、膳食纤维、脂质、氨基酸、例如蛋白分离物或蛋白水解物的蛋白质、乳酸、维生素、矿物质以及其它常用于此类制剂中的成分。
[0106] 根据本发明的一些实施方案，本发明的营养食品、膳食补充剂或食品制剂可以包括例如饮料、汤、零食、乳制品等。
[0107] 现提及以下实施例，所述实施例与以上描述一起用于说明本发明，而非限制本发明的范围。本领域的普通技术人员将显而易见本发明的其它目标、优点以及新颖特征。实施例
[0108] 实施例1
[0109] 此实施例详述微藻褐指藻野生型菌株646的培养。
[0110] 将微藻褐指藻野生型菌株646在琼脂平板和管中在人造光下培养并转移到锥形烧瓶和5升圆形玻璃烧瓶中。接着将培养物转移到3升柱中并培养。已经研究照明条件(遮荫对比全日照)、干重累积和岩藻黄质累积之间的相关性。下表3详述加入具有30g/L初始浓度和30mg/L最终浓度的液体原料的生长培养基化合物。
[0111] 将34g盐共混物与硝酸钾、磷酸二氢钾以及微量元素共混物一起加入980mL去离子水。体积调至1L且对混合物进行热压处理。冷却后，加入各1mL的柠檬酸铁和20mM Tris缓冲液(pH 7.6)。下表3详述加入的化合物的初始浓度。
[0112] 表3
[0113]化合物 初始浓度
盐共混物 34g/L
KNO3 2g/L
KH2PO4 70mg/L
柠檬酸铁 1ml/L
柠檬酸 42.8μM
Na2SiO39H2O 1ml/L
微量元素共混物 1ml/l
维生素(可溶性) 0.5ml/L
盐共混物 34g/L
KNO3 2g/L
KH2PO4 70mg/L
柠檬酸铁 1ml/L
柠檬酸 42.8μM
Na2SiO39H2O 1ml/L
微量元素共混物 1ml/l
维生素(可溶性) 0.5ml/L
[0114] 下表4详述加入1L溶液中的微量元素的量和初始浓度：
[0115] 表4
[0116]化合物 量(g) 初始浓度，μM
ZnSO4 7H2O 0.22 0.77
CuSO4 5H2O 0.08 0.31
Na2MoO4 2H2O 0.39 1.61
H3BO3 2.86 46.3
MnCl2 4H2O 1.81 9.15
CO(NO3)2 6H2O 0.05 0.17
ZnSO4 7H2O 0.22 0.77
CuSO4 5H2O 0.08 0.31
Na2MoO4 2H2O 0.39 1.61
H3BO3 2.86 46.3
MnCl2 4H2O 1.81 9.15
CO(NO3)2 6H2O 0.05 0.17
[0117] 下表5详述加入的维生素的量和初始浓度：
[0118] 表5
[0119]化合物 量 初始浓度
维生素B12 1ml 1g/L
生物素 1ml 1g/L
硫胺HCl 200mg 0.2g/L
维生素B12 1ml 1g/L
生物素 1ml 1g/L
硫胺HCl 200mg 0.2g/L
[0120] 实施例2
[0121] 此实施例详述柱中岩藻黄质的产生。
[0122] 四个柱各装载初始浓度0.4g/L的原液。柱1号是每天遮荫50-60％，直至17:00小时。柱2号通过用绿色-红色滤光器过滤而使光散射至“绿色”波长组。柱3号通过用蓝色滤光器过滤而使光散射至“蓝色”波长组。柱4号未遮荫，而是经受全日照。在24-25℃的温度与1％CO2的通量下进行培养。下表6包括在培养两周之后测量的结果的数据。
[0123] 表6
[0124]
[0125] 实施例3
[0126] 此实施例描述微藻等鞭金藻属野生型的培养。
[0127] 将微藻等鞭金藻属野生型在琼脂平板和管中在人造光下培养并转移到锥形烧瓶和5L圆形玻璃烧瓶中。接着将培养物转移至7L塑料套筒中以形成最大浓度为6g/L的溶液并且在全日照下培养。收集培养物并稀释至2g/L的浓度并且在塑料袋中接种。已经研究照明条件(波长)、干重累积和岩藻黄质产生之间的相关性。
[0128] 下表7详述生长培养基的内含物，其中初始原料浓度是30g/L且最终原料培养基浓度是30mg/L。
[0129] 表7
[0130]
[0131]
[0132] 将34g盐共混物与硝酸钾(KNO3)和磷酸二氢钾(KH2PO4)和微量元素共混物一起加入980mL去离子水。体积调至1L且对混合物进行热压处理。冷却后，加入各1mL的柠檬酸铁和20mM Tris缓冲液(pH 7.6)。
[0133] 实施例4
[0134] 此实施例展示等鞭金藻属和双眉藻属的培养。
[0135] 等鞭金藻属和双眉藻属的菌落在皮氏培养皿(petri dish)中在琼脂上生长。将物质转移至含有人造海水培养基的管中。将培养物从试管稀释到烧瓶中，并且进一步稀释到聚乙烯套筒中，并在人造光和注射富含1％CO2的过滤空气下生长。
[0137] 每日从培养物取样并测定其干重和岩藻黄质浓度。生长一般分成两个阶段。首先，生长条件设定成支持生物质的最佳和快速生长和获得。在快速生长5-7天之后，将藻类转移到第二产生阶段——岩藻黄质诱导阶段。
[0138] 实施例5
[0139] 此实施例详述套筒中岩藻黄质的产生。
[0140] 四个套筒以2g/L的初始浓度接种。第一套筒是每天遮荫50-70％，直至17:00小时。第二套筒通过用绿色-红色滤光器过滤而使光散射至“绿色”波长组。第三套筒通过用蓝色滤光器过滤而使光散射至“蓝色”波长组。第四个未遮荫，而是经受全日照。下表8详述生长
10天之后的数据：
10天之后的数据：
[0141] 表8
[0142]
[0143] 实施例6
[0144] 此实施例详述收获、后加工以及萃取。
[0145] 使用离心机收集和沉降藻类培养物。将含有约30％固体的粒状藻类糊状物用淡水洗涤并再悬浮在水中，同时混合、冷冻以及冷冻干燥。在冷冻干燥之后，将1％二氧化硅加入生物质粉末中，通过气压研磨进一步提纯和均质化。通过超临界流体CO2萃取来萃取含有2％岩藻黄质(84g)的干生物质粉末(4.2Kg)。
[0146] 下表9概述SCF-CO2萃取结果：
[0147] 表9
[0148]
[0149] Fuco＝岩藻黄质
[0150] 含有84g(2％)岩藻黄质的4.2Kg生物质粉末的SCF萃取产生606g岩藻黄质含油树脂(分离器1)+95.7g岩藻黄质含油树脂(分离器2)＝701.7克含有11.2％岩藻黄质的岩藻黄质含油树脂。因此，岩藻黄质的回收率是：74.8g(分离器1)+4.0g(分离器2)＝78.8g岩藻黄质(93.8％)。
[0151] 实施例7
[0152] 此实施例详述使用有机溶剂萃取岩藻黄质。
[0153] 将生物质粉末在无水乙醇中在周围温度下孵育两次，历时4小时，并萃取。通过用己烷进行液/液萃取来分配萃取物。通过真空蒸馏来去除溶剂。
[0154] 实施例8
[0155] 此实施例详述用于分析岩藻黄质的HPLC方法。
[0156] 样品溶于丙酮/甲醇/己烷的1:1:1溶剂混合物中或乙腈中，并且分别在相同溶剂混合物或溶剂中稀释。在岩藻黄质的峰值吸光度水平(450nm)下测量O.D值。
[0157] 关于通过HPLC分离岩藻黄质的数据：
[0158] 柱：C18 250X4.6
[0159] 波长：450nm
[0160] 流速：0.8mL/min
[0161] 采样器温度：15℃；柱温：28℃
[0162] 流动相：(A)-甲醇85％+0.5M乙酸铵；(B)-乙腈:水(90:10)；(C)-乙酸乙酯[0163] 运行时间：35min
[0164] 下表10详述所用的HPLC梯度：
[0165] 表10
[0166]时间(min) A(％) B(％) C(％)
0 60 40 0
2 0 100 0
7 0 80 20
17 0 50 50
21 0 30 70
29.5 0 100 0
30 60 40 0
0 60 40 0
2 0 100 0
7 0 80 20
17 0 50 50
21 0 30 70
29.5 0 100 0
30 60 40 0
[0168] 除非本文中另外指示或上下文明显相矛盾，否则在描述本发明的上下文中(特别是在以下权利要求书的上下文中)使用术语“一(a/an)”和“所述”以及类似指示物将视为涵盖单数与复数。除非另作说明，否则术语“包含”、“具有”、“包括”以及“含有”将视为开放性术语(即意指“包括但不限于”)。除非本文中另外指示，否则本文中的数值范围的叙述仅仅意图用作个别地提及在所述范围内的每个独立值的一种速记方法，并且每个独立值并入说明书中，如同本文中个别地叙述其一般。除非本文中另外指示或者与上下文明显矛盾，否则本文描述的所有方法都可以按任何合适的顺序进行。除非另外要求，否则关于本文提供的任何和所有实施例或示例性语言(例如“例如”)的使用仅仅是为了更好地说明本发明，而不是对本发明的范围施加限制。说明书中的语言不应被看作是指示任何未要求的要素是实施本发明所必要的。
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 一种连续型超临界流体色谱仪智能控制系统 | 2020-05-15 | 919 |
| 超临界流体色谱分离纯化肠激酶工艺 | 2020-05-12 | 142 |
| 一种使用超临界流体色谱制备薄荷脑的方法 | 2020-05-12 | 484 |
| 一种使用超临界流体色谱纯化阿奇霉素的方法 | 2020-05-13 | 467 |
| 通过亚临界或超临界流体色谱纯化羧酸的方法 | 2020-05-13 | 106 |
| 一种应用于超临界流体色谱系统的自动背压阀 | 2020-05-14 | 632 |
| 利用超临界流体色谱分离旋光异构体的方法 | 2020-05-14 | 85 |
| 超临界流体色谱用的固定相 | 2020-05-11 | 460 |
| 超临界流体色谱/质谱联用仪附件 | 2020-05-16 | 16 |
| 超临界流体色谱/质谱联用仪附件 | 2020-05-17 | 897 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈