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具有半衰期延长多肽的融合蛋白

阅读：275发布：2020-05-11

专利汇可以提供具有半衰期延长多肽的融合蛋白专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且提供了一种融合蛋白，该融合蛋白包含i) 生物活性多肽；和ii) 半衰期延长多肽部分，所述半衰期延长多肽部分包含独立地选自根据SEQ ID NO:1:X1-X2-X3-X4-X5-X6-D-X8-X9-X10-X11(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列的2-80个单元，其中，独立地：X1为P或不存在；X2为V或不存在；X3为P或T；X4为P或T；X5为T或V；X6为D、G或T；X8为A、Q或S；X9为E、G或K；X10为A、E、P或T；并且X11为A、P或T。半衰期延长多肽部分具有总体上未折叠的构象并且提供具有可以避免肾脏清除的大的流体动力学半径的融合蛋白。因此，融合蛋白的生物半衰期被增加并且生物活性多肽的生物学作用可以因此被延长。，下面是具有半衰期延长多肽的融合蛋白专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种融合蛋白，所述融合蛋白包含：
i)生物活性多肽；和
ii)半衰期延长多肽部分，所述半衰期延长多肽部分包含2-80个单元，每一个单元独立地选自由根据SEQ ID NO:1:X1-X2-X3-X4-X5-X6-D-X8-X9-X10-X11(SEQ ID NO:1)的所有氨基酸序列组成的组，
其中，独立地，
X1为P或不存在；
X2为V或不存在；
X3为P或T；
X4为P或T；
X5为T或V；
X6为D、G或T；
X8为A、Q或S；
X9为E、G或K；
X10为A、E、P或T；
X11是A、P或T
其中所述融合蛋白整体上不与胆盐刺激性脂肪酶对应。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述半衰期延长肽部分形成2-80个单元诸如
4-80个单元的连续序列。
3.根据权利要求1或2所述的融合蛋白，所述融合蛋白包含多于一个半衰期延长多肽部分，每一个多肽部分包含2-80个单元。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的融合蛋白，其中所述半衰期延长多肽部分或所述多于一个半衰期延长部分中的至少一个位于所述生物活性多肽的N-末端或C-末端。
5.根据权利要求1至3中任一项所述的融合蛋白，其中所述半衰期延长多肽部分或所述多于一个半衰期延长多肽部分中的至少一个构成向所述生物活性多肽的氨基酸序列中的插入物或所述生物活性多肽的氨基酸序列的一部分的替换物。
6.根据前述权利要求中任一项所述的融合蛋白，其中所述半衰期延长多肽部分包含选自由SEQ ID NO:2-11组成的组的一个或更多个氨基酸序列的2-80个单元。
7.根据权利要求6所述的融合蛋白，其中所述半衰期延长多肽部分包含至少一个选自由SEQ ID NO:12-21和57-66组成的组的氨基酸序列。
8.根据权利要求6所述的融合蛋白，其中所述半衰期延长多肽部分由选自由SEQ ID NO:12-21和57-66组成的组的氨基酸序列组成。
9.根据权利要求6所述的融合蛋白，其中所述半衰期延长多肽部分包含选自由SEQ ID NO:100-105组成的组的氨基酸序列。
10.根据权利要求9所述的融合蛋白，其中所述半衰期延长多肽部分由选自由SEQ ID NO:100-105组成的组的氨基酸序列组成。
11.根据前述权利要求中任一项所述的融合蛋白，其中所述半衰期延长多肽部分包含
6-70个单元，诸如10-51个单元，例如7-18个单元。
12.根据前述权利要求中任一项所述的融合蛋白，所述融合蛋白具有至少3.8nm的流体动力学半径。
13.根据前述权利要求中任一项所述的融合蛋白，所述融合蛋白具有通过尺寸排阻色谱确定的在溶液中至少60kDa的表观尺寸。
14.根据前述权利要求中任一项所述的融合蛋白，其中根据SEQ ID NO:1的所述氨基酸序列是人类起源的。
15.根据权利要求14所述的融合蛋白，其中所述半衰期延长多肽部分对应于天然存在的人类氨基酸序列。
16.根据前述权利要求中任一项所述的融合蛋白，其中每一个单元包含至多一个O-糖基化。
17.根据前述权利要求中任一项所述的融合蛋白，所述融合蛋白包含多于一个生物活性多肽。
18.一种延长生物活性多肽的生物半衰期的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供编码根据权利要求1至17中任一项所述的融合蛋白的多核苷酸；
b)将所述多核苷酸引入细胞中；
c)在允许所述融合蛋白表达的条件下维持所述细胞；以及
d)分离所述融合蛋白。
19.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码根据权利要求1至17中任一项所述的融合蛋白。
20.一种表达载体，所述表达载体包含根据权利要求19所述的多核苷酸。
21.一种细胞，所述细胞包含根据权利要求20所述的表达载体。
22.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1至17中任一项所述的融合蛋白以及药学上可接受的载体，所述药物组合物任选地被配制用于皮下施用或静脉内施用。
23.根据权利要求1至17中任一项所述的融合蛋白，用于作为药物使用，所述药物任选地被皮下施用或静脉内施用到受试者。
24.根据权利要求1至17的任一项中定义的半衰期延长多肽用于增加生物活性多肽的生物利用度的用途。

说明书全文

具有半衰期延长多肽的融合蛋白

发明领域

[0001] 本发明涉及包含半衰期延长多肽的融合蛋白，以及这样的半衰期延长多肽和融合蛋白的用途。

[0002] 背景

[0003] 治疗性蛋白和肽通常受到短的体内半衰期的阻碍。特别地，较小的蛋白和肽容易通过经由肾脏的过滤从循环清除。由于生物制剂(biologics)最通常通过静脉内(i.v.、iv)注射或皮下(s.c.、sc)注射来施用，每次给药(each dose)之间的时间跨度非常重要。同时，这些施用途径，特别是静脉内注射，通常需要医疗保健专业人员的帮助并且对患者而言还可能是不舒适的，甚至是疼痛的，并且因此更频繁的给药增加了患者的不适和不便，并且需要医疗保健资源。这与小分子药物的给药形成了鲜明的对比，所述小分子药物通常可以通过侵入性较低的途径施用，诸如口服、鼻内或局部施用，按照需要经常施用，费力和不便要少得多。

[0004] 解决生物制剂或生物药物从循环快速清除的问题的最早的尝试之一是将聚乙二醇(PEG)聚合物链化学附接到蛋白或肽，以增加药物的流体动力学半径(hydrodynamic radius)，这转化为在溶液中的增加的表观尺寸，使得它达到不容易被肾脏清除的尺寸。这项被称为PEG化(PEGylation)的技术已经显示出是成功的，并且目前被用于批准的药物产品中。然而，化学附接的步骤为制造增加了另一个处理步骤，导致制造的药物的成本增加。此外，PEG部分的附接可在蛋白或肽的多个位点处发生，导致产物的不均匀性极大地增加，其中PEG链的位置在个体分子间变化。PEG聚合物本身的性质也增加了一定程度的不均匀性，因为该聚合物不是单分散的，而是具有相似但不相等的长度的PEG聚合物的集合。

[0005] 与最初认为的PEG是非免疫原性的并且甚至还能够降低与它连接的分子的免疫原性相反，后来已经发现PEG是免疫原性的。在一个实例中，这导致与它连接的药物的清除显著增加(PEG-尿酸酶；Ganson NJ等,2005)。

[0006] 为了去除另外的制造步骤并产生单分散的产品，如Amunix Inc和XL-Protein GmbH等公司已经开发了基于随机非重复蛋白序列的半衰期延长技术，所述随机非重复蛋白序列可以被用作融合配偶体(partner)以延长治疗性蛋白和肽的生物半衰期(Podust等2016J Control Release，Schlapschy等2013Protein Eng Des Sel)。

[0007] 延长生物制剂的生物半衰期的另一种途径是与呈具有长半衰期的血清蛋白的形式的配偶体融合，两种最常见的融合配偶体是人类血清白蛋白(HSA)和人类抗体的Fc部分。特别地，Fc结构域已经被广泛用作半衰期延长融合配偶体。HSA和Fc二者足够大以避免肾脏清除，并且还受益于涉及与这些蛋白结合的新生儿Fc受体的再循环途径，从而使它们的半衰期进一步延长超过仅通过降低的肾脏清除可实现的半衰期(Kontermann RE.Half-life extended biotherapeutics.Expert Opin Biol Ther.2016)。人类起源的这样的融合配偶体也意味着在人类患者中的低免疫原性响应。

[0008] 然而，尽管存在上文描述的进展，本领域中对延长生物制剂的半衰期的新方法/手段仍然存在需要。

[0009] 发明概述

[0010] 本发明的一个目的是至少部分减少或避免现有技术的问题，并且提供延长蛋白和肽的生物半衰期的新方法/手段。

[0011] 根据本公开内容对本领域技术人员将明显的这些目的和其他目的通过如在所附权利要求书中定义的和如本文一般性公开的本发明的不同方面来实现。

[0012] 在一个方面中，本发明涉及融合蛋白，该融合蛋白包含

[0013] i)生物活性多肽；和

[0014] ii)半衰期延长多肽部分，所述半衰期延长多肽部分包含2-80个单元，每一个单元独立地选自由根据SEQ ID NO:1:X1-X2-X3-X4-X5-X6-D-X8-X9-X10-X11(SEQ ID NO:1)的所有氨基酸序列组成的组，

[0015] 其中，独立地，

[0016] X1为P或不存在；

[0017] X2为V或不存在；

[0018] X3为P或T；

[0019] X4为P或T；

[0020] X5为T或V；

[0021] X6为D、G或T；

[0022] X8为A、Q或S；

[0023] X9为E、G或K；

[0024] X10为A、E、P或T；

[0025] X11是A、P或T。

[0026] 2-80个单元在上文陈述的SEQ ID NO:1的定义内可以是相同的或不同的。换句话说，半衰期延长多肽部分包含2至80个单元，其中每一个单元是独立地选自由落在SEQ ID NO:1的定义内的个体序列组成的组的氨基酸序列。优选地，每一个单元可以是独立地选自由SEQ ID NO:2-11组成的组的氨基酸序列。

[0027] 本发明人出乎意料地发现，基于或衍生自人类胆盐刺激性脂肪酶(bile-salt stimulated lipase；BSSL)的C-末端结构域的如上文定义的多肽部分，当与待用作治疗剂的蛋白或肽融合时，可以提供优异的半衰期延长部分。半衰期延长多肽部分在生理条件下具有总体上未折叠的构象，并且提供具有大的流体动力学半径的融合蛋白，并且因此避免或至少降低生物活性多肽的肾脏清除率。因此，包含半衰期延长多肽部分的融合蛋白可以具有与单独的生物活性多肽的生物半衰期相比延长的生物半衰期。

[0028] 根据本发明，融合蛋白整体上不是胆盐刺激性脂肪酶，并且生物活性多肽不与胆盐刺激性脂肪酶的催化结构域对应。

[0029] 如本文使用的，表述“融合的”和“融合”是指相同种类的化学实体诸如肽、多肽、蛋白或核酸序列的两个或更多个部分的人工连接。如本文提及的融合蛋白通常包含具有不同起源的至少两个多肽部分；例如，可衍生自BSSL的半衰期延长多肽部分，和不是BSSL的生物活性多肽。本发明的融合蛋白通常是非天然存在的实体，并且不与人类BSSL对应。本发明的融合蛋白还可以被称为嵌合蛋白。“嵌合蛋白”被理解为意指由核苷酸序列编码的杂合蛋白，该核苷酸序列由初始编码不同蛋白的两个或更多个完整或部分基因组成，所述不同蛋白可以来自相同或不同物种。本发明的融合蛋白或嵌合蛋白通过重组DNA技术产生。

[0030] 表述“生物半衰期”是指血液、血清或血浆中的所讨论的物质的浓度减少到初始浓度的一半所花费的时间。生物半衰期可以根据本领域技术人员已知的常规方法来确定。例如，生物半衰期可以基于血清、血浆或全血中的浓度来确定。

[0031] 如本文使用的，术语“生物活性多肽”是指在体内发挥期望的生物活性的多肽。在本文的上下文中，“生物活性”是指多肽在体内可以导致治疗作用的任何活性，并且可以被例举为结合活性。非限制性实例包括酶促活性、激动剂活性和拮抗剂活性。通常，生物活性多肽是生物药物，也被称为生物制剂。生物活性多肽通常不是人类BSSL或任何其他物种的BSSL，或部分或完全不与人类BSSL或任何其他物种的BSSL对应。

[0032] 优选地，半衰期延长多肽部分在至少一种物种(通常是人类)中将生物活性多肽的生物半衰期延长至少1.5倍。换言之，融合蛋白优选地具有为单独的生物活性多肽的生物半衰期至少1.5倍的生物半衰期。例如，融合蛋白可以将生物活性多肽的生物半衰期延长至少1.8倍、至少2倍、至少3倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍或至少50倍。由于增加的生物半衰期，生物活性多肽的作用可以被延长。

[0033] 从给药的角度，使用如本文公开的半衰期延长多肽部分允许较低频率的施用，这对患者以及从经济的角度是有益的。例如，通过每周仅一次施用而不是一周两次施用药物，可以获得相同或相似的生物学作用或治疗作用。对于患者特别是需要到医院或诊所接受治疗的那些患者，和/或其中施用是身体上不舒适或甚至疼痛的情况，这样的差异意味着巨大的改进。另外，通过较少给药和/或给药之间的较长时间段，可以避免由施用方式导致的不良反应；例如，对于皮下注射，可以减少或避免诸如疼痛、湿疹和皮疹的注射部位反应，并且对于静脉内施用，可以减少或避免涉及例如发热或恶心的输注反应。

[0034] 本发明中使用的半衰期延长多肽的另一个益处在于，由于半衰期延长多肽中的大量亲水性残基，融合蛋白的亲水性增加。增加的亲水性可以(相对于生物活性多肽本身的生物利用度)提高融合蛋白的生物利用度，并且增加全身性浓度，潜在地允许较小剂量和/或较不频繁的给药(smaller and/or less frequent doses)。如本文使用的，“生物利用度”是指在经由与静脉内施用不同的途径施用之后到达全身性循环的物质的剂量分数。

[0035] 增加的亲水性的另一个实际意义是皮下施用可以是替代静脉内施用的现实选择。在可能的情况下，皮下施用通常优于静脉内输注，因为与静脉内施用相比，皮下注射通常是更快速、不舒适感较低并且需要较少的医学训练来执行。

[0036] 另外，根据本发明的融合蛋白的增加的亲水性还可以是粗表达产物纯化期间的优点。发现使用疏水相互作用色谱(HIC)使用梯度洗脱，根据本发明的实施方案的融合蛋白比生物活性多肽本身更早地被洗脱。这被认为是一种潜在的非常有用的作用，其可以是涉及不期望的宿主细胞蛋白与生物活性多肽同时洗脱的问题的解决方案。因此，降低获得高纯度的融合蛋白所需要的色谱单元操作的数目可以是可能的。

[0037] 使用本文描述的半衰期延长多肽的另一个优点是，其允许基于所得的融合蛋白的根据在溶液中的流体动力学半径的尺寸(或表观尺寸)，更精确地预测所得的融合蛋白的生物半衰期，因为融合蛋白生物半衰期的增加可能排他地或至少主要地依赖于尺寸增加。事实上，如本发明的实施方案中使用的半衰期延长多肽部分可以不与主要再循环受体新生儿Fc受体结合，并且因此可以避免蛋白尺寸和通过受体相互作用再循环之间的复杂相互作用，这种复杂相互作用否则会使生物半衰期的预测和微调非常不确定。

[0038] 半衰期延长肽部分可以形成如SEQ ID NO:1中定义的一个或更多个序列的2-80个单元，诸如4-80个单元的连续序列。在实施方案中，融合蛋白可以包含多于一个半衰期延长多肽部分，每一个多肽部分包含2-80个如上文定义的单元。这样的多于一个半衰期延长多肽可以具有相同的长度(具有相同数目的单元)，或可以具有不同的长度。可选地，融合蛋白可以仅包含一个半衰期延长多肽，该半衰期延长多肽通常具有4-80个如上文定义的单元。

[0039] 在实施方案中，半衰期延长多肽部分可以位于所述生物活性多肽的氨基末端(N-末端)处或羧基末端(C-末端)处。在多于一个半衰期延长多肽的情况中，至少一个所述半衰期延长多肽部分可以位于所述生物活性多肽的N-末端或C-末端。

[0040] 可选地或另外地，半衰期延长多肽部分可以构成向生物活性多肽的氨基酸序列中的插入物或生物活性多肽的氨基酸序列的一部分的替换物。在多于一个半衰期延长多肽的情况中，至少一个所述半衰期延长多肽部分可以任选地被定位为向生物活性多肽的氨基酸序列中的插入物或生物活性多肽的氨基酸序列的一部分的替换物。可以在生物活性多肽的三级结构的表面暴露的环(loop)中进行插入或替换，使得构成向生物活性多肽的氨基酸序列中的插入物或生物活性多肽的氨基酸序列的一部分的替换物的半衰期延长多肽部分暴露于融合蛋白的表面上。

[0041] 在本发明的实施方案中，SEQ ID NO:1的残基X3和X4中的至少一个可以为P。在一些实施方案中，SEQ ID NO:1的X4和X5中的至少一个可以为T。在一些实施方案中，SEQ ID NO:1的X10和X11中的至少一个可以为A或P。在一些实施方案中，X1为P并且X2为V。

[0042] 在本发明的实施方案中，半衰期延长多肽部分可以包含独立地选自由SEQ ID NO:2-11组成的组的一个或更多个氨基酸序列的2-80个单元。这些序列代表SEQ ID NO:1的人类变体。发现在体外和通过计算机评价的基于选自SEQ ID NO:2-11的重复单元的氨基酸序列具有低免疫原性潜力。因此，在免疫反应方面，预期由这样的单元组成的半衰期延长多肽部分将被人类受试者良好耐受。

[0043] 在一些实施方案中，与人类起源的天然存在的序列的通常情况一样，半衰期延长多肽部分可以在其N-末端具有SEQ ID NO:2。例如，半衰期延长多肽部分可以包含呈以下顺序的至少4个连续单元：[SEQ ID NO:3]–[SEQ ID NO:4]–[SEQ ID NO:5]–[SEQ ID NO:5]，任选地前面为SEQ ID NO:2。

[0044] 在本发明的实施方案中，半衰期延长多肽部分可以包含至少一个选自SEQ ID NO:12-21或57-66的序列。例如，半衰期延长多肽部分可以选自由SEQ ID NO:12-21和57-66组成的氨基酸序列的组。可选地，半衰期延长多肽部分可以包含选自由SEQ ID NO:12-21和
57-66组成的组的序列的多于一个拷贝例如2个或3个任选地连续的拷贝。

[0045] 在实施方案中，半衰期延长多肽部分可以包含选自由SEQ ID NO:100-105组成的组的氨基酸序列或由选自由SEQ ID NO:100-105组成的组的氨基酸序列组成。

[0046] 在本发明的实施方案中，半衰期延长多肽部分可以包含根据SEQ ID NO:1的一个或更多个氨基酸序列的至少4个、至少6个、至少8个、至少10个或至少17个单元。此外，在本发明的实施方案中，半衰期延长多肽部分可以包含根据SEQ ID NO:1的一个或更多个氨基酸序列的多达8个、多达10个、多达18个、多达34个、多达51个、多达68个或多达70个单元。因此，例如，半衰期延长多肽部分可以包含根据SEQ ID NO:1的一个或更多个氨基酸序列的7至18个单元，诸如独立地选自由SEQ ID NO:2-11组成的组的7至18个单元。

[0047] 通常地，半衰期延长多肽，或在融合蛋白包含多于一个半衰期延长多肽的情况中，至少一个半衰期延长多肽包含根据SEQ ID NO:1的至少两个不同的氨基酸序列。

[0048] 在本发明的实施方案中，半衰期延长多肽可以与生物活性多肽融合，所述生物活性多肽单独地具有至少5kDa的在溶液中的表观尺寸。特别地，对于小的生物活性多肽，本发明的半衰期延长多肽可具有巨大益处，因为它可以将尺寸增加得足够大以避免肾脏清除。如通过尺寸排阻色谱确定的，融合蛋白整体上通常可以具有至少60kDa的在溶液中的表观尺寸。在实施方案中，融合蛋白在溶液中的表观尺寸是单独的生物活性多肽在溶液中的表观尺寸的至少1.5倍并且高达300倍大。关于流体动力学半径，融合蛋白整体上可以展现出至少3.8nm的流体动力学半径。在实施方案中，融合蛋白的流体动力学半径可以是单独的生物活性多肽的流体动力学半径的至少1.25倍大，例如两倍大。

[0049] 由半衰期延长多肽提供的表观尺寸增加可以至少部分地由半衰期延长多肽的非结构化或未折叠的构象来解释。例如，半衰期延长多肽可能缺乏二级结构元件诸如α-螺旋和β-片层，并且因此半衰期延长多肽可以被表征为对融合蛋白的α-螺旋和/或β-片层含量无贡献。

[0050] 在本发明的实施方案中，根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列可以是人类起源的。例如，半衰期延长多肽部分可以对应于天然存在的人类氨基酸序列。使用人类起源的序列可以是有益的，因为预期其在人类受试者中贡献较低的免疫原性。事实上，下文实施例14确认了由选自SEQ ID NO:2-11的重复单元组成的半衰期延长多肽部分在人类中具有低免疫原性潜力。尽管如此，还设想了包含或对应于其他物种的天然存在的重复单元的序列单独地或与人类起源的重复单元组合地用于在半衰期延长多肽中使用。特别地，这样的其他物种包括非人类灵长类动物，例如大猩猩(gorilla)、黑猩猩、猩猩(orangutan)、倭黑猩猩和猕猴(macaque)。

[0051] 在本发明的实施方案中，根据SEQ ID NO:1的每一个重复单元具有一个或至多一个潜在的O-糖基化位点。此外，当半衰期延长多肽部分已经在哺乳动物表达系统中产生时，每一个单元可以包含至多一个O-糖基化，并且通常大多数但不是所有的所述单元各自包含一个O-糖基化。例如，一定数目或份额的所述单元可能缺乏糖基化。虽然一些糖基化可以是有益的，因为它可进一步促成尺寸增加，但是非特异性或未知的糖基化模式可能在蛋白表征期间带来实际问题。因此，根据本发明的实施方案的半衰期延长多肽部分的有限并且相对良好定义的糖基化模式在这方面是有益的。然而，在一些实施方案中，特别是在融合蛋白在非哺乳动物细胞中产生的情况下，半衰期延长多肽部分可完全缺乏糖基化。

[0052] 融合蛋白可以包含至少一个生物活性多肽。在实施方案中，融合蛋白可以包含多于一个生物活性多肽，诸如两个生物活性多肽。

[0053] 融合蛋白中的期望通过与半衰期延长多肽部分融合来延长其半衰期的一个或更多个生物活性多肽可以选自由激素、生长因子、细胞因子、酶、配体、结合物(binder)、辅因子、抗体和抗体片段诸如抗原结合片段(Fab)组成的组。在一些实施方案中，生物活性多肽可以是受体激动剂。在其他实施方案中，生物活性多肽可以是受体拮抗剂。

[0054] 融合蛋白可以具有相对于单独的生物活性多肽的生物半衰期被延长至少1.5倍的生物半衰期。

[0055] 在另一个方面中，本发明提供了一种延长生物活性多肽的生物半衰期的方法，或一种产生根据上文提及的本发明的第一个方面的融合蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：

[0056] a)提供多核苷酸(通常为DNA构建体)，所述多核苷酸编码如上文描述的包含生物活性多肽和半衰期延长多肽部分的融合蛋白；

[0057] b)将所述多核苷酸引入细胞中；

[0058] c)将所述细胞维持在允许所述融合蛋白表达的条件下；以及

[0059] d)分离所述融合蛋白。

[0060] 在一些实施方案中，细胞是哺乳动物细胞。哺乳动物表达系统中的表达可以是有益的，因为其可以提供融合蛋白的糖基化。在其他实施方案中，细胞可以是非哺乳动物真核细胞，诸如酵母细胞、植物细胞或非哺乳动物动物细胞。在又其他实施方案中，细胞可以是原核细胞，诸如大肠杆菌(E.coli)。

[0061] 在一些实施方案中，融合蛋白可以与α2,6-唾液酸转移酶(α2,6-sialyltransferase)(EC:2.4.99.1；另一个名称是B细胞抗原CD75)共表达。这样的方法可以包括以下步骤：

[0062] i)提供多核苷酸(通常为DNA构建体)，所述多核苷酸编码α2,6-唾液酸转移酶或促进内源性α2,6-唾液酸转移酶的表达，

[0063] ii)将所述多核苷酸引入细胞中，该细胞可以是上文的步骤b)中用于表达根据本发明的实施方案的融合蛋白的相同细胞，以及

[0064] iii)将所述细胞维持在还允许所述α2,6-唾液酸转移酶表达的条件下。

[0065] 多核苷酸可以是上文步骤a)的编码融合蛋白的相同构建体。可选地，多核苷酸可以是不同的DNA构建体。在使用分别编码融合蛋白和编码α2,6-唾液酸转移酶或促进α2,6-唾液酸转移酶的表达的不同DNA构建体的实施方案中，DNA构建体可以同时或在不同的时间点引入同一细胞中。可选地，可以使用不同的细胞，在该情况中，细胞可以被一起培养，并且因此被一起维持在允许融合蛋白和α2,6-唾液酸转移酶同时或依次表达的条件下。

[0066] 在其他方面中，本发明提供了编码如本文描述的融合蛋白的多核苷酸、包含这样的多核苷酸的表达载体以及包含这样的表达载体的细胞，所述细胞可以是哺乳动物细胞或非哺乳动物细胞。

[0067] 在另一个方面中，本发明提供了包含如本文描述的融合蛋白和药学上可接受的载体的药物组合物。在实施方案中，药物组合物可以被配制用于皮下施用和/或用于静脉内施用。

[0068] 在又另一个方面中，本发明提供了融合蛋白，所述融合蛋白用于作为药物使用并且特别是用于作为预期被皮下施用到受试者的药物使用。

[0069] 在另外的方面中，本发明涉及如本文定义的半衰期延长多肽用于增加生物活性多肽的生物半衰期的用途，以及如本文定义的半衰期延长多肽用于增加生物活性多肽的生物利用度的用途。如上文提及的，本文描述的半衰期延长多肽部分的明显益处是，由于半衰期延长多肽中大量的亲水性残基，所得的融合蛋白的亲水性增加。增加的亲水性可以提高生物利用度并且增加全身性浓度(例如，血清浓度)，潜在地允许较小剂量或较不频繁的给药。增加的亲水性的另一个实际意义是，对于某些生物活性多肽，皮下施用可以是替代静脉内施用的现实选择。

[0070] 应注意，本发明涉及权利要求中陈述的特征的所有可能组合。

[0071] 附图简述

[0072] 图1是根据本发明实施方案的编码生物活性多肽的基因(白色)和编码半衰期延长多肽部分的一个或更多个基因(阴影)的示意图。

[0073] 图2是根据本发明实施方案的融合蛋白的计算机生成的图。

[0074] 图3a和图3b是图示了根据本发明实施方案的不同融合蛋白的尺寸和半衰期延长部分中的重复单元的数目之间的关系，并且与单独的生物活性多肽的尺寸进行比较的图。图3a示出了溶液中的表观分子量(Y-轴)对重复单元的数目(X-轴)。图3b示出了流体动力学半径(Y-轴)对重复单元的数目(X-轴)。

[0075] 图4是示出大肠杆菌中产生的根据本发明实施方案的融合蛋白的SDS-PAGE分析的结果的图像。

[0076] 图5a-5c是示出了根据本发明实施方案的融合蛋白的终末半衰期(terminal half-life)(Y-轴)随尺寸变化的图，所述尺寸分别由融合蛋白在溶液中的表观尺寸(图5a)、融合蛋白的流体动力学半径(图5b)和半衰期延长多肽部分的重复单元的数目(图5c)表示。

[0077] 详述

[0078] 人类泌乳乳腺和胰腺产生一种脂肪分解酶，胆盐刺激性脂肪酶(BSSL)，其也被称为胆盐激活脂肪酶(BAL)或羧酸酯脂肪酶(CEL)(EC3.1.1.13)。该蛋白以两个结构域排列：一个大的球状氨基末端结构域和一个较小但延伸的羧基末端(C-末端)结构域(关于综述，参见例如Wang&Hartsuck(1993)Biochim.Biophys Acta 1166:1-19)。本发明人出乎意料地发现，基于或衍生自人类BSSL的C-末端结构域的重复序列可以与生物活性蛋白或肽成功融合并且赋予融合配偶体增加的生物半衰期，从而延长融合配偶体在体内的生物学作用或治疗作用，如下文实施例中证明的。

[0079] 人类BSSL的C-末端结构域由式“PVPPTGDSGAP”的重复单元或与式“PVPPTGDSGAP”相似的重复单元组成。下文实施例1中的表2列出了来自人类BSSL变体的重复单元。C-末端结构域的最常见形式包含18个重复单元(UniProt条目P19835)。然而，关于重复单元的数目和个体重复单元的氨基酸序列两个方面，人类群体中存在差异。此外，每一个重复单元具有一个可以被O-糖基化的位点，增加了区域的亲水性和尺寸( 等Arch.Biochem.Biophys.1997)。然而，结构域的C-末端是疏水的，并且已经显示出结合到BSSL的活性位点中并导致酶的自动抑制(auto-inhibition)。该疏水部分的最常见的人类序列是“QMPAVIRF”(Chen等Biochemistry1998)。

[0080] 先前已经推测，C-末端结构域可能负责BSSL的体内稳定性，例如在生理条件下其对酸变性和聚集的耐受性(Loomes等,Eur.J.Biochem.1999,266,105-111)。相反，胆固醇酯酶结构的另一项研究显示，富集了Pro、Asp、Glu、Ser和Thr残基的C-末端结构域使人联想到短暂存在(short-lived)的蛋白中富含PEST的序列，表明由于C-末端结构域中的重复序列，蛋白可能具有短的体内半衰期(Kissel等,Biochimica et Biophysica Acta 1989,1006)。

[0081] 在本发明中，包含如本文定义的基于或衍生自人类BSSL的C末端结构域的半衰期延长多肽部分的融合蛋白的生物半衰期延长被认为主要是由于蛋白的流体动力学半径增加。然而，还设想了可能促成生物半衰期增加的其他机制。

[0082] 如本文使用的，表述“融合的”和“融合”是指相同种类的化学实体诸如肽、多肽、蛋白或核酸序列的两个或更多个部分的人工连接。如本文提及的融合蛋白通常包含可以具有不同起源的至少两个多肽部分；例如，不是BSSL的生物活性多肽，和可以衍生自BSSL的半衰期延长多肽部分。通常，融合可以包含呈任何顺序并且在任何位置处的融合的部分；然而，如本领域技术人员理解的，基因的融合通常符合读框地(in-frame，in-line)进行，使得融合的基因的开放阅读框(ORF)被维持。

[0083] 图1示意性图示了编码根据本发明实施方案的融合蛋白的核酸构建体，该核酸构建体包含编码生物活性多肽的基因(白色条)和编码半衰期延长多肽部分的基因(虚线条)。出于简洁，未标记出其他元件诸如启动子或增强子序列等，尽管本领域技术人员将理解这样的元件可以根据需要被包括。例如，编码生物活性多肽的基因之前可以是用于在哺乳动物细胞中表达的信号肽或用于在大肠杆菌中表达的信号肽或甲硫氨酸残基。

[0084] 如图1中示出的，编码半衰期延长多肽部分的基因可以位于编码生物活性多肽的基因的C-末端(图1b)、N-末端(图1c)、或N-末端和C-末端二者(图1d)。可选地，编码半衰期延长多肽部分的序列可以定位在编码生物活性多肽的基因的边界内(符合读框地定位)。在这样的实施方案中，编码半衰期延长多肽部分的序列可以任选地存在于多个位点处，例如如图1f中示出的三个位点处，或如期望地存在于更多个位点处，只要插入不破坏生物活性多肽的三级结构或折叠结构。一个或更多个半衰期延长部分的符合读框地定位可以与N-末端融合和/或C-末端融合组合。

[0085] 构成半衰期延长多肽部分的一个或更多个融合配偶体的一个或更多个生物活性多肽可以是任何生物活性多肽或生物活性多肽的组合，所述生物活性多肽或生物活性多肽的组合可以适合于治疗或预防任何状况或紊乱，其中生物功能需要生物活性多肽的一定的全身性浓度。

[0086] 通常，生物活性多肽是生物药物，也被称为生物制剂。合适的生物活性多肽的实例包括肽激素、生长因子、细胞因子、酶、辅因子、配体、结合物(包括天然结合物和人工结合物)以及抗体和抗体片段。在本发明的实施方案中，生物活性多肽可以是受体激动剂。在其他实施方案中，生物活性多肽可以是受体拮抗剂。

[0087] 生物活性多肽本身可以是天然存在的多肽，或它可以是非天然存在的多肽。然而，与半衰期延长多肽部分融合后，得到的融合蛋白将始终是非天然存在的实体。生物活性多肽不是人类BSSL的一部分使得融合蛋白将对应于天然BSSL蛋白。包含天然存在的多肽或非天然存在的多肽的融合蛋白可以以重组方式产生或化学地合成，例如如下文实施例中描述的。

[0088] 图2图示了根据本发明实施方案的融合蛋白(下文的实施例的PSI0540，由SEQ ID NO:38表示的融合蛋白)，其中生物活性多肽由球状折叠的结构域表示(在该实施例中为IL-1Ra)，并且半衰期延长多肽部分在生物活性多肽的C-末端处形成尾部，该实施例的半衰期延长多肽由根据SEQID NO:57的17个重复单元表示。生物活性多肽在它的C-末端部分处经由肽接头(此处为[G4S]3)连接到半衰期延长多肽，所述肽接头将生物活性多肽的C-末端连接到半衰期延长多肽的N-末端并且因此形成尾部的近端部分。然而，如上文参考图1解释的，半衰期延长多肽部分不必然位于生物活性多肽的C-末端处。在本发明的实施方案中，半衰期延长多肽部分可以位于生物活性多肽的N-末端处(图1c)，或者半衰期延长部分可以各自分别位于N-末端和C-末端处(图1d)。在其他实施方案中，一个或更多个半衰期延长多肽可以被插入到生物活性多肽内的位置处(图1e)，例如插入到位于生物活性多肽的表面暴露的环中的位置。

[0089] 在一些实施方案中，半衰期延长多肽部分可以替换生物活性多肽的特定序列区段(segment)。例如，当被定位为插入物(insert)时，半衰期延长多肽部分可以替换生物活性多肽上的表面暴露的环的一部分。可选地，半衰期延长多肽可以替换生物活性多肽的整个结构域(诸如N-末端结构域或C-末端结构域)或内部结构域。

[0090] 在又其他实施方案中，符合读框地插入的半衰期延长多肽部分可以与N-末端部分、C-末端部分、或N-末端和C-末端半衰期延长多肽部分二者组合(图1f)。值得注意的是，在包括位于不同位置处的多于一个半衰期延长部分的本发明的实施方案中，每一个这样的半衰期延长部分可以独立地如本文描述的被定义。除非另有说明，每一个这样的半衰期延长部分可以包含根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列的4至80个单元。

[0091] 最后，本发明不限于使用单个生物活性多肽作为融合配偶体；而是，如图1g中图示的，设想了在一些实施方案中，融合蛋白可以包含由接头分隔和/或如图1g的实例中的由半衰期延长多肽分隔的多于一个生物活性多肽。可选地或另外地，一个或更多个半衰期延长多肽部分还可以位于融合蛋白的N-末端或C-末端处。

[0092] 在多于一个生物活性多肽的情况中，这些生物活性多肽可以是相同的或不同的。例如，融合蛋白可以包含任选地由接头或间隔区(spacer)序列和/或半衰期延长多肽部分分隔的两种不同的生物活性多肽。可选地，融合蛋白可以包含三种不同的生物活性多肽。在包括多于一个生物活性多肽的融合蛋白的实施方案中，这些生物活性多肽之一可以选自由生长因子、细胞因子、酶和配体组成的组，并且剩余的一个或更多个生物活性多肽可以选自抗体或抗体片段。作为一个实例，半衰期延长多肽部分可以被定位为不同抗原结合区之间的接头。

[0093] 根据本发明，用于与生物活性多肽融合的半衰期延长多肽部分包含含有2-80个重复单元的氨基酸序列，每一个单元独立地选自由SEQ ID NO:1:X1-X2-X3-X4-X5-X6-D-X8-X9-X10-X11(SEQ ID NO:1)定义的氨基酸序列的组，

[0094] 其中，独立地，

[0095] X1为P或不存在；

[0096] X2为V或不存在；

[0097] X3为P或T；

[0098] X4为P或T；

[0099] X5为T或V；

[0100] X6为D、G或T；

[0101] X8为A、Q或S；

[0102] X9为E、G或K；

[0103] X10为A、E、P或T；

[0104] X11是A、P或T。

[0105] 如本文使用的，“单元”是指如上文定义的根据SEQ ID NO:1的通式的氨基酸序列，包括例如根据SEQ ID NO:2-11的任何序列的存在。半衰期延长多肽包含2至80个这样的单元，所述单元在上文陈述的定义内可以是相同的或不同的。尽管个体单元之间的氨基酸序列存在一些差异，半衰期延长多肽的单元仍可以被称为“重复单元”，并且因此“重复单元”不应被排他地理解为一种且相同序列的重复。换句话说，半衰期延长多肽部分包含2至80个单元，其中每一个单元是独立地选自由落在SEQ ID NO:1的定义内的个体序列组成的组的氨基酸序列。

[0106] 半衰期延长多肽部分可以包含至少18个氨基酸(对应于均为SEQ ID NO:1的9聚体形式的两个单元)并且通常多达880个氨基酸(对应于全部为SEQ ID NO:1的11聚体形式的80个单元)的连续序列。重复单元可以彼此连续，尽管还可能的是，重复单元由短间隔序列分隔。例如，两个重复单元可以被不与SEQ ID NO:1对应的多达10个氨基酸残基分隔；例如，短间隔序列可以是式(G4S)2的肽接头。在一些实施方案中，间隔序列可以多达5个氨基酸残基。在一些实施方案中，一个或更多个氨基酸残基可以位于两个重复单元之间，例如以赋予期望的功能诸如N-糖基化位点，或以提供用于另一种类型的修饰的位点，例如使用单个Cys残基。在一些实施方案中，接头，诸如一个或更多个G4S接头，可以被用作相邻重复单元之间的间隔序列。因此，考虑到这种可能性，包含多达80个重复单元的连续序列可以长于880个氨基酸，例如多达900个氨基酸或多达1000个氨基酸。

[0107] 半衰期延长多肽部分的重复单元由SEQ ID NO:1定义，SEQ ID NO:1基于BSSL C-末端结构域的人类变体的重复单元并且允许在位置X3、X4、X5、X6、X8、X9、X10和X11处的氨基酸残基的一些变化。相比而言，位置X1、X2和X7处的残基是固定的，尽管位置X1和X2可以不存在。在实施方案中，X1和X2二者是不存在的，并且在这样的实施方案中，重复单元由仅9个氨基酸组成。

[0108] 包含2至80个单元(重复单元)的半衰期延长多肽部分通常包含通常由SEQ ID NO:1定义的氨基酸序列基序的若干种变体，诸如根据SEQ ID NO:1的至少两种不同的变体。例如，在其中半衰期延长多肽部分包含至少4个单元的本发明的实施方案中，它可以包含SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5中的每一个的至少一个单元。在其中半衰期延长多肽部分包含至少2个单元的本发明的实施方案中，这些单元可以独立地选自由SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5组成的组。有益地，半衰期延长多肽部分可以包含SEQ ID NO:
3-5(按此顺序)，任选地前面为SEQ ID NO:2。根据SEQ ID NO:2的单元可以特别地位于半衰期延长多肽部分的N-末端处，代表半衰期延长多肽部分的第一个单元。虽然重复单元的其他特定变化形式(例如根据SEQ ID NO:3-11的单元)可以重复出现，但SEQ ID NO:2，如果存在的话，通常作为半衰期延长多肽部分的首个重复单元仅出现一次。

[0109] 半衰期延长多肽部分的构象通常是非结构化的。例如，在本发明的实施方案中，半衰期延长多肽对融合蛋白的α-螺旋和/或β-片层含量无贡献，如通过圆二色性或FTIR(傅里叶变换红外光谱)确定的。

[0110] 在本发明的实施方案中，由SEQ ID NO:1定义的重复单元是人类起源的，并且优选地半衰期延长多肽部分的所有重复单元对应于人类BSSL的C-末端结构域的变体的天然存在的重复单元。这样的重复单元由SEQ ID NO:2-11表示(参见实施例中的表2)。在本发明的实施方案中，半衰期延长多肽部分的所有重复单元选自由SEQ ID NO:2-11例如SEQ ID NO:3-11组成的组。即，半衰期延长多肽部分可以包含2-80个单元，每一个单元独立地选自由SEQ ID NO:2-11例如SEQ ID NO:3-11组成的组。使用人类起源的序列可以是有益的，因为预期人类起源的序列与具有非人类起源或部分人类起源的重复单元的半衰期延长部分(无论是所基于的多肽或现有技术中使用的其他序列)相比在人类受试者中贡献较低的免疫原性。如下文实施例14中更详细描述的，衍生自人类起源的示例性半衰期延长多肽的肽都不被呈递到来自人类健康供体的抗原呈递细胞上。这表明由选自SEQ ID NO:2-11的重复单元组成的半衰期延长多肽部分在人类中具有低免疫原性潜力。

[0111] 此外，在本发明的实施方案中，半衰期延长多肽部分包含对应于天然存在的人类重复单元序列的重复单元序列或由对应于天然存在的人类重复单元序列的重复单元序列组成。这样的天然人类重复单元序列的实例在SEQ ID NO:12-21和57-66中展示。通常，这样的序列包含[SEQ ID NO:2]–[SEQ ID NO:3]–[SEQ ID NO:4]–[SEQ ID NO:5]–[SEQ ID NO:5](按此顺序)作为前五个重复单元，或者可选地，包含[SEQ ID NO:3]–[SEQ ID NO:4]–[SEQ ID NO:5]–[SEQ ID NO:5](按此顺序)作为前四个重复单元。

[0112] 因此，在本发明的实施方案中，半衰期延长多肽部分包含根据SEQ ID NO:12-21或57-66中的任何一个的氨基酸序列。在一些实施方案中，半衰期延长多肽部分由多于一个以下序列组成：SEQ ID NO:12-21或57-66中的任一个。例如，半衰期延长多肽部分可以由根据SEQ ID NO:12-21或57-66中的任一个(例如SEQ ID NO:57)的氨基酸序列的三个连续重复或拷贝(contiguous multiples or copies)组成。SEQ ID NO:57包含根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列的17个单元，并且因此SEQ ID NO:的三拷贝重复(three-copy multiple)包含至少51个单元。然而，应注意，半衰期延长多肽部分的重复单元可以独立地选自根据SEQ ID NO:1的所有单元，并且因此本发明不限于重复的单元的特定序列。因此，例如，51个单元的半衰期延长多肽部分不必然由三个拷贝的17个单元的序列形成，而是可以由根据SEQ ID NO:1的单元的任何组合形成，并且特别地由选自SEQ ID NO:2-11的重复单元的任何组合形成。

[0113] 在实施方案中，具有至少34个单元的半衰期延长多肽部分可以包含选自由SEQ ID NO:100-105组成的组的氨基酸序列或由选自由SEQ ID NO:100-105组成的组的氨基酸序列组成。例如，34个单元的半衰期延长多肽部分可以由根据SEQ ID NO:100或SEQ ID NO:101的序列组成；51个单元的半衰期延长多肽可以由根据SEQ ID NO:102或SEQ ID NO:103的序列组成；并且68个单元的半衰期延长多肽部分可以由根据SEQ ID NO:104或SEQ ID NO:105的序列组成。

[0114] 发现如上文定义的每一个重复单元携带一个潜在的O-糖基化位点。即，在允许糖基化的哺乳动物环境中表达后，每一个重复单元可以在至多一个预先确定的位置处，通常在苏氨酸(T,Thr)残基处被糖基化。对于SEQ ID NO:2-11的重复单元，表2中指示了O-糖基化的潜在位点(参见实施例1)。可存在聚糖的数目的上限值，该上限值低于单元的总数目。即，通常，不是全部(less than all)的半衰期延长多肽部分的单元被糖基化。例如，在17个单元的序列(诸如SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:19)中，通常仅10个单元被糖基化。因此，在实施方案中，大多数单元可以被糖基化，而少数单元可以不被糖基化。此外，糖基化的程度(例如糖基化的单元与非糖基化的单元的比率等)可能根据已知量度，例如通过适当选择表达系统和/或控制生产细胞的培养或表达条件来调整。

[0115] 如上文提及的，包含根据本发明的半衰期延长多肽部分的融合蛋白受益于与单独的生物活性多肽的生物半衰期相比增加的生物半衰期。增加的生物半衰期主要是由于融合蛋白相对于单独的生物活性多肽的尺寸增加。根据本发明的融合蛋白的尺寸足够大以减少由肾脏从循环清除(肾脏清除)。

[0116] 肾小球膜的大多数孔的半径为4.5nm-5nm。膜带负电荷并且因此带负电荷的蛋白较不易于被肾脏清除。例如，在流体动力学半径为2.5nm时，带负电荷的分子可以被显著保护免于肾脏清除，而中性分子则需要3.5nm的尺寸来获得相似的保护免于肾脏清除(Haraldsson等Physiological Reviews 88(2)451-487)。对于不带电荷的球状蛋白，肾脏清除的尺寸限值为分子量约60kDa(低于该限值时蛋白被分泌出)。

[0117] 如例如通过多角度光散射(MALS)确定的蛋白的实际分子量对应于基于氨基酸组成和任何结合的聚糖的理论分子量。相反，蛋白在溶液中的表观尺寸(或表观分子量)可以通过例如如下文实施例4中描述的尺寸排阻色谱(SEC)确定，并且产生对应于球状蛋白的实际分子量的蛋白的表观分子量或表观尺寸。对于不具有球状构象的蛋白和肽，实际分子量可能与在溶液中的表观分子量或表观尺寸有差异。

[0118] 通常，非球状蛋白或多肽可以在溶液中展现出大于其实际分子量的的表观尺寸。在通常具有非结构化、未折叠的构象的本发明的半衰期延长多肽部分的情况中，本发明人发现如通过SEC确定的，每一个重复单元代表约9kDa(图3a，下文将更详细地描述)，尽管实际分子量为仅约1kDa。因此，融合蛋白在溶液中的表观尺寸可以由于包含在根据本发明实施方案的融合蛋白中的每一个单元而增加约9kDa。

[0119] 总而言之，如通过SEC确定的，融合蛋白在溶液中可以具有为单独的生物活性多肽的尺寸的至少1.5倍、至少1.8倍、至少2倍、至少3倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、或至少50倍且高达10倍、高达20倍、高达40倍、高达60倍、高达80倍、高达100倍、高达200倍、高达
250倍、高达270倍并且甚至高达300倍大的表观尺寸。自然，增加的倍数将取决于所讨论的生物活性多肽的尺寸。然而，对于在范围从6kDa至60kDa表观尺寸内的生物活性多肽，融合蛋白可以具有至少1.5倍并且高达约250倍大的表观尺寸。对于较小的生物活性肽，例如约
3kDa，仍然可以优选的是，旨在使尺寸增加不超过250倍，例如约240倍。

[0120] 半衰期延长多肽部分和融合蛋白的尺寸还可以分别由流体动力学半径定义，所述流体动力学半径还被称为斯托克斯半径(Stokes radius)，以纳米(nm)量度。在溶液中的表观尺寸和流体动力学半径二者通过尺寸排阻色谱(SEC)确定，例如如下文实施例4中描述的。

[0121] 根据上文已经关于在溶液中的表观尺寸描述的，融合蛋白的流体动力学半径通常足够大以避免肾脏清除。为了比较，具有肾脏清除的限值以上的尺寸的人类血清白蛋白具有3.8nm的流体动力学半径。融合蛋白可以具有为单独的生物活性多肽的流体动力学半径的至少1.25倍大或至少1.5倍大的流体动力学半径。例如，融合蛋白的流体动力学半径可以代表单独的生物活性多肽的流体动力学半径的至少2倍、3倍、5倍、10倍、20倍或50倍的增加。融合蛋白的流体动力学半径可以为生物活性多肽的流体动力学半径的高达8倍、高达10倍、高达12倍、高达30倍或甚至高达100倍大。发现半衰期延长多肽部分的每个重复单元通常促成流体动力学半径增加0.11nm。

[0122] 除了半衰期延长多肽部分中的重复单元的数目之外，多肽部分在融合蛋白内的位置也可能影响尺寸增加。例如，预期与作为插入物位于生物活性多肽的氨基酸序列内的半衰期延长部分(例如形成表面环)相比，半衰期延长多肽部分的N-末端或C-末端定位提供了更大的流体动力学半径。

[0123] 此外，半衰期延长部分的未折叠结构不仅本身提供了大的流体动力学半径，而且因为重复单元的许多氨基酸的亲水特征，它可以通过水分子与半衰期延长多肽部分的结合来促成尺寸增加，以进一步增加流体动力学半径。

[0124] 最后，一些重复单元的糖基化可以进一步促成更大的尺寸，如下文实施例4中证明的。发现与不具有糖基化的重复单元的相同序列相比，17个重复单元的半衰期延长多肽部分展示出另外60-70kDa的表观尺寸。

[0125] 图3图示了根据本发明的多种实施方案的重复单元的数目和在溶液中的表观尺寸之间的关系。在这些实施方案中，如下文实施例中描述的，生物活性多肽与不同长度(不同数目的单元：分别为17个、34个和51个)的半衰期延长多肽部分融合。本发明人已经发现在溶液中的尺寸和重复单元的数目之间的相关性在研究范围内是线性的。还发现一个单元在溶液中的尺寸对应于具有9kDa的分子量的球状蛋白。因此，可以预测通过添加给定数目的单元实现的尺寸增加。例如，具有80个重复单元的多肽部分将具有对应于分子量为约720kDa的球状蛋白的在溶液中的表观尺寸。此外，已经发现线性关系还被转化为融合蛋白的药代动力学性质，如图5a-5c中示出的，其中将融合蛋白的终末半衰期相对于在溶液中的表观尺寸制图(参见实施例8)。这些见解可以被用于通过与如本文描述的半衰期延长多肽部分融合来微调生物制剂的药代动力学性质，特别是半衰期和平均停留时间，其中多肽部分具有一定的尺寸，其被设计以提供期望的体内半衰期。对于每一种生物活性多肽，可以关于生物活性多肽本身的尺寸和半衰期、施用途径、给药量和期望的给药间隔来选择根据重复单元的数目的半衰期延长多肽的尺寸；尽管如此，经证明的尺寸(图5a、图5b)和单元的数目(图5c)之间的线性关系允许合理设计用于感兴趣的特定融合蛋白的期望的半衰期延长多肽。

[0126] 值得注意的是，同样在肾脏清除的尺寸限值(对于不带电荷的球状蛋白为约60kDa)以上，融合蛋白在溶液中的表观尺寸的增加可以是有用的，因为它仍然促成生物半衰期的增加(参见实施例8)。然而，对于本身已经具有至少60kDa的在溶液中的表观尺寸的生物活性多肽，将表观尺寸增加为至少2倍使得融合蛋白将具有单独的生物活性多肽的表观尺寸的至少两倍的表观尺寸可以是期望的。

[0127] 对于批准上市的治疗产品，准确的表征是必要的监管要求，并且对于糖基化的蛋白，必须知晓任何聚糖的准确位置。本发明的半衰期延长多肽部分的每个单元携带至多一个O-糖基化位点的事实可以促进对在哺乳动物系统中表达的融合蛋白的表征。

[0128] 用于表征根据本发明的半衰期延长多肽的合适的蛋白酶是在酸性残基谷氨酸(Glu,E)和天冬氨酸(Asp,D)后裂解的胃蛋白酶。然而，由于聚糖与蛋白酶的空间干扰，胃蛋白酶将通常不在糖基化的残基附近裂解，所以，携带O-糖基化的重复单元与未糖基化的单元相比将具有不同的裂解模式。基于这个知识并且考虑到有限的和相对可预测的糖基化模式，与潜在被糖基化至大的程度或未知程度的半衰期延长部分相比，使用已建立的方法诸如色谱方法和质谱表征本发明的融合蛋白被极大地简化，使本发明的融合蛋白在哺乳动物系统中的工业表达更实际可行。

[0129] 半衰期延长多肽部分的糖基化的另一个潜在优点是糖基化可以提供增加对融合蛋白的免疫耐受性的方法/手段。以α2,6-连接的末端唾液酸结束的O-聚糖可以与CD22或Siglec-10结合，CD22和Siglec-10是唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素(Siglec)家族的两种抑制性受体。这些受体通过使来自B细胞受体(BCR)的信号衰减(damping)起作用，这可导致发展出针对融合蛋白的B细胞耐受性。人类蛋白的聚糖具有α2,6-连接的末端唾液酸和α2,3-连接的末端唾液酸二者。为了增加在人类起源的细胞中表达的融合蛋白中的具有α2,6-连接的末端唾液酸的唾液酸含量，感兴趣的融合蛋白可以与α2,6-唾液酸转移酶共表达。由于不存在α2,6-唾液酸转移酶表达，在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中产生的融合蛋白仅具有α
2,3-连接。为了将α2,6-连接的末端唾液酸引入在CHO细胞中产生的融合蛋白的O-聚糖中，感兴趣的融合蛋白可以与α2,6-唾液酸转移酶共表达。

[0130] 如上文参考图2指示的，融合蛋白可以包含将生物活性多肽连接到一个或更多个如本文描述的半衰期延长多肽部分的接头，通常为肽接头。因此，在本发明的实施方案中，融合蛋白还包含位于生物活性多肽的氨基酸序列和半衰期延长多肽部分的氨基酸序列之间的肽接头。例如，肽接头可以选自-GS-和-(G4S)n-，其中n是从1至5的整数，通常从1至3，或从2至3。接头的使用可以是有益的，因为它可以降低新表位(neo epitope)的出现，或在n为至少2的情况中防止新表位的形成和随后由免疫系统的抗原呈递细胞结合这样的新表位。

[0131] 本文描述的融合蛋白可以使用原核表达系统或真核表达系统，诸如哺乳动物表达系统，使用本领域技术人员已知的常规方法，通过重组技术产生。下文的实施例2描述了其中半衰期延长多肽部分与生物活性多肽融合的融合蛋白的克隆和产生。应注意，本发明决不限于使用实施例2的那些菌株和细胞类型；相反，用于产生融合蛋白的合适的细胞系是本领域技术人员已知的，并且实例包括大肠杆菌、毕赤酵母(Pichia pastoris)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、藻类、苔藓细胞、植物细胞诸如胡萝卜细胞以及哺乳动物细胞诸如CHO、HEK-293和HT1080。

[0132] 关于编码半衰期延长多肽部分的DNA构建体的设计，使用合成的基因可以是有益的，所述合成的基因通过包括待编码的每个氨基酸的不同或所有的密码子变体利用遗传密码的冗余性。因为高度重复的序列的表征可能存在问题，使用更多可变的DNA序列可以促进核酸组分的表征。

[0133] 根据本发明的融合蛋白具有与单独的生物活性多肽的尺寸相比增加的流体动力学半径和在溶液中的表观尺寸。结果，肾脏清除的降低至少部分地是由于尺寸增加，改变了融合蛋白的药代动力学性质。最值得注意的是，生物半衰期被延长，如下文实施例8-10和实施例15中证明的。这些实施例还显示，半衰期延长多肽部分的半衰期延长作用随着该部分的长度(单元的数目，特别参见图5c)而变化。

[0134] 优选地，半衰期延长多肽部分在至少一种物种(通常为人类)中将生物活性多肽的生物半衰期延长至少1.5倍。换言之，融合蛋白优选地具有为单独的生物活性多肽的生物半衰期的至少1.5倍的生物半衰期。例如，融合蛋白可以将生物活性多肽的生物半衰期延长至少1.8倍、至少2倍、至少3倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍或至少50倍，并且高达500倍或更低，诸如60倍。例如，对于具有少于1小时的生物半衰期的生物活性多肽，生物半衰期可以被延长高达500倍，而对于具有1小时以上的生物半衰期的生物活性多肽，如果生物半衰期被延长高达60倍可能是足够的。

[0135] 从药代动力学角度看，尽可能延长生物半衰期可以是期望的。然而，因为已经显示出半衰期延长作用与半衰期延长部分的尺寸成正比，并且出于多种原因诸如生物活性多肽的产生的可行性或生物活性的阻碍，非常大的半衰期延长多肽部分可能是不期望的，给定生物活性多肽的半衰期延长可能必须与其他要求相平衡，并且因此最佳半衰期延长可小于本发明可实现的理论最大半衰期延长。例如，可以期望的是，使用不多于三个半衰期延长多肽部分，每个部分为80个单元(即分布于三个部分的总计240个单元)，或不多于两个半衰期延长多肽部分，每个部分为80个单元(即分布于两个部分的总计160个单元)。半衰期延长多肽部分的可选的可设想的上限值可以是两个部分(例如，一个部分在N-末端处并且一个部分在C-末端处)，每个部分为68个单元。

[0136] 此外，半衰期延长多肽部分可以向融合蛋白提供增加的溶解度。特别地，半衰期延长多肽部分的亲水性质可以是有益的，因为它可以相对于单独的生物活性多肽的生物利用度增加皮下施用的融合蛋白的生物利用度。在这样的情况中，融合蛋白的增加的溶解度可以促进在注射后向血流转移，而不是保留在组织细胞外基质中。这可意味着，对于由于有限的生物利用度而原本需要静脉内施用的一些生物活性多肽，如果生物活性多肽与如本文描述的半衰期延长多肽部分融合，那么皮下施用可以是现实的选择。

[0137] 因此，本发明中使用的半衰期延长多肽部分可以被用作延长生物活性多肽的生物半衰期以及可能调整生物活性多肽的其他药代动力学性质的方法/手段。

[0138] 本发明的融合蛋白可以被配制成药物组合物，用于在治疗和/或预防状况、紊乱或疾病中使用。如本文使用的，术语“组合物”应被理解为包括固体形式和液体形式。优选地，组合物可以是适合于例如通过注射或口服向患者(例如，哺乳动物)施用的药物组合物。药物组合物通常包括根据本发明的融合蛋白和至少一种药学上可接受的运载体或代用品(substituent)。药物组合物可以例如包含盐、pH调节剂、油、防腐剂、渗透活性剂中的任何一种及其任何组合。

[0139] 药物组合物可以被配制成用于任何施用途径，包括静脉内、皮下、经鼻、口服和局部施用。例如，组合物可以被配制用于静脉内施用或皮下施用。

[0140] 待治疗的状况、紊乱或疾病不受半衰期延长多肽的限制；而是，融合蛋白用于治疗特定状况、紊乱或疾病的适用性可以仅由生物活性多肽确定，所述生物活性多肽可以是现有的生物药物。可以受益于与本文描述的半衰期延长多肽部分融合的合适的生物活性多肽的实例包括生长因子、细胞因子、酶、配体、结合物和抗体片段。

[0141] 本发明的融合蛋白可以被用于治疗状况、紊乱或疾病的方法中，该方法包括向患有所述状况、紊乱或疾病的患者施用融合蛋白的步骤，所述融合蛋白包含与如本文描述的半衰期延长多肽部分融合的可用于治疗所述状况、紊乱或疾病的生物活性多肽。患者通常是哺乳动物，诸如人类。在该方法中，与包括施用单独的生物活性多肽的治疗方案相比，施用可以不太频繁地发生。例如，包含生物活性多肽阿那白滞素(Met-huIL-1Ra)的通常经由皮下注射每天施用。然而，IL-1Ra和如本文描述的半衰期延长多肽部分的融合蛋白可以将生物半衰期增加至少2倍，使得融合蛋白可以每隔一天施用，或将生物半衰期增加至少3倍或至少7倍使得融合蛋白可以一周施用两次或甚至一次。对于一些生物活性多肽，诸如生长激素，可以期望甚至进一步延长每次给药之间的时间段；例如，设想了每月给药一次。

[0142] 本发明将在以下实施例中被进一步描述。实施例

[0143] 实施例1：人类起源的重复单元的鉴定

[0144] 对胆盐刺激性脂肪酶(BSSL)的催化结构域对比美国国家健康研究院(National Institute of Health(NIH),USA)的非冗余蛋白序列数据库进行了blast搜索，并且鉴定了包含全部或一部分的C-末端重复非结构化结构域的人类起源的蛋白的10种报道的蛋白序列。

[0145] 材料与方法

[0146] NIH的blast被用于搜索与具有UniProt ID P19835(登录号CEL_HUMAN)的胆盐刺激性脂肪酶的催化结构域匹配的人类起源的蛋白。

[0147] 结果

[0148] BLAST搜索导致发现了包含催化结构域的重要部分和C-末端重复非结构化结构域的重要部分二者的10个条目。结构域中重复单元的数目不同并且注意到重复单元的序列中的一些变异性，关于不同的命中(hit)参见表1。每一个重复结构域由9个残基的截短序列起始，而最普遍的重复单元为11个残基长。在下文的表中，出于清楚起见，重复单元以“～”符号分隔。非结构化结构域的最终序列链段(stretch)与重复单元不共享序列相似性，并且在表1中加下划线。在所附序列表中，重复部分(即，不包括加下划线的疏水基序)由SEQ ID NO:12-21表示。

[0149] 表1.人类BSSL-CTD的变体

[0150]

[0151]

[0152] 下文表2列出了人类起源的重复单元的独特序列，参考了所附序列表中的序列身份编号。第一个序列中不存在的残基以短横线标记。对O-糖基化的潜在位点加下划线。

[0153] 表2.对应于在人类BSSL-CTD中发现的重复单元的单元。对潜在的糖基化位点加下划线。

[0154]SEQ ID NO 序列
SEQ ID NO：2 --PTVTDQEAT
SEQ ID NO：3 PVPPTGDSEAT
SEQ ID NO：4 PVPPTGDSETA
SEQ ID NO：5 PVPPTGDSGAP
SEQ ID NO：6 PVPPTGDAGPP
SEQ ID NO：7 PVTPTGDSETA
SEQ ID NO：8 PVPPTGDSEAA
SEQ ID NO：9 PVPPTDDSKEA
SEQ ID NO：10 PVPPTGDSGPP
SEQ ID NO：11 PVPPTGDSKEA

[0155] 因此，在人类群体中存在多种长度的C-末端结构域。此外，重复单元的顺序可以在人类群体中变化。这可以隐含着重复单元的顺序和整个结构域基序的长度的变化是被允许的。每个单元携带一个可以被O-糖基化的位点。

[0156] 最普遍的人类形式是由以下重复单元的序列的组合组成的：

[0157] [SEQ ID NO：2]-[SEQ ID NO：3]-[SEQ ID NO：4]-[SEQ ID NO：5]-[SEQ ID NO：5]-[SEQ ID NO：5]-[SEQ ID NO：5]-[SEQ ID NO：5]-[SEQ ID NO：5]-[SEQ ID NO：5]-[SEQ ID NO：5]-[SEQ ID NO：6]-[SEQ ID NO：5]-[SEQ ID NO：5]-[SEQ ID NO：7]-[SEQ ID NO：
5]-[SEQ ID NO：8]-[SEQ ID NO：9]

[0158] 以不同的方式表示：

[0159] [SEQ ID NO：2]-[SEQ ID NO：3]-[SEQ ID NO：4]-[SEQ ID NO：5]x8-[SEQ ID NO：6]-[SEQ ID NO：5]×2-[SEQ ID NO：7]-[SEQ ID NO：5]-[SEQ ID NO：8]-[SEQ ID NO：9][0160] 实施例2：融合蛋白的克隆和产生

[0161] 本实施例描述了用于克隆和产生在下文的实施例中使用的不同形式的融合蛋白的一般策略。

[0162] 材料与方法

[0163] DNA构建体：编码包括半衰期延长多肽的融合蛋白的集合的DNA序列(参见下文表3)经密码子优化用于在大肠杆菌中表达或在人类(Expi293)细胞中表达，并且由Thermo Fisher Scientific的Invitrogen GeneArt基因合成服务合成。基因被克隆到表达载体中，用于随后在大肠杆菌中或在Expi293细胞中表达。

[0164] 表3.融合蛋白和相应核苷酸序列的概述

[0165]

[0166] 培养和纯化：用包含编码重组融合蛋白的基因片段的表达载体转化大肠杆菌细胞，并且然后使用补料分批技术在生物反应器中或在摇瓶中培养，随后是蛋白表达和通过离心收获细胞。将细胞沉淀储存在-20℃或直接经历渗透冲击，释放的蛋白通过离心变澄清(clarified)并且储存在-20℃。重组融合蛋白的表达还使用Expi293表达系统(Thermo Fisher Scientific)基本上根据制造商的方案进行。在转染表达载体后6天通过离心收获上清液，并且将其储存在-70℃。表4列出了编码的蛋白序列。

[0167] 将冷冻的大肠杆菌细胞沉淀重悬浮，并且然后通过声处理破坏，并且随后通过离心然后过滤(0.22μm)去除细胞碎片。在纯化前，将来自Expi293培养物的渗透冲击样品和上清液解冻并过滤(0.22μm)。使用常规色谱方法诸如亲和色谱、离子交换色谱、疏水相互作用色谱和尺寸排阻色谱纯化包含重组融合蛋白的每个上清液。用于在动物研究中使用的重组融合蛋白还经历使用Detoxi-凝胶内毒素去除柱(Pierce,目录号20344)的内毒素去除纯化。纯化的融合蛋白经缓冲液交换到PBS，并且除非另有说明，否则PBS还是随后实验中使用的配制缓冲液(formulation buffer)。通过用考马斯蓝染色的SDS-PAGE分析融合蛋白的纯度，并且使用质谱(HPLC/MS或MALDI-TOF/MS)分析每种蛋白的分子量。

[0168] 结果

[0169] 所有的融合蛋白在大肠杆菌或Expi293细胞中表达为可溶的蛋白。图4示出了通过SDS-PAGE分析的分别包含51个和68个重复单元的Met-huIL-1Ra在大肠杆菌中的表达的结果。泳道I：SeeBlue Plus 2标志物，10μl。泳道II：M-IL1RA 51个重复单元，收获的细胞，Bugbuster/rLysozyme/Bensonase处理的，7μl。泳道III：M-IL1RA 51个重复单元，渗透冲击(osmotic shock)材料，1.5μl。泳道IV：M-IL1RA 51个重复单元，渗透冲击材料，3μl。泳道V：M-IL1RA 68个重复单元，收获的细胞，Bugbuster/rLysozyme/Bensonase处理的，7μl。泳道VI：M-IL1RA 68个重复单元，渗透冲击材料，1.5μl。泳道VII：M-IL1RA 68个重复单元，渗透冲击材料，3μl。融合蛋白的位置用两条短线标记出。

[0170] 纯化得到具有高纯度的蛋白制备物，其通过SDS-PAGE，用考马斯蓝染色进行分析。通过质谱分析确定每一种融合蛋白的正确身份和分子量。

[0171] 表4.蛋白名称、表达系统和产生的蛋白的SEQ ID。

[0172]

[0173] 结论

[0174] 通过构建合成的基因，随后在大肠杆菌或哺乳动物系统中表达，并且使用常规技术纯化至高纯度，可以产生包含不同长度的半衰期延长多肽的融合蛋白。

[0175] 实施例3：融合蛋白的化学合成

[0176] 本实施例描述了用于通过化学合成产生在下文的其他实施例中使用的不同形式的多肽的一般策略。

[0177] 材料与方法

[0178] GLP-1(7-37)(BachemAG，目录号H5102)、GLP-2(1-33)(BachemAG，目录号H-7742)、GLP-1(7-37)-半衰期延长多肽(2个单元，每个单元11个残基)、GLP-2(1-33)-半衰期延长多肽(1个单元)、GLP-2(1-33)-半衰期延长多肽(2个单元)的化学合成形式从BACHEM AG订购。将冻干的蛋白溶解在pH 7的包含25mM NaP和125mM NaCl的缓冲液中，该缓冲液具有10mg/mL的目标浓度。C5结合化合物PSI0400及其PEG化的形式PSI0489也从BACHEM AG订购，将PSI0489以35mg/ml的浓度溶解于上文提及的缓冲液中，并且将PSI0400以29mg/ml的浓度溶解。蛋白的细节总结在表5中。

[0179] 表5.化学合成的融合蛋白的名称和序列

[0180]PSI编号描述序列
PSI0400 Z06175(N52S，D53E) SEQ ID NO：50
PSI0489 Z06175-Cys-PEG(L30kDa) [SEQ ID NO：51]-PEG-L30K
PSI0611 GLP-2BSSL CTD 22aa SEQ ID NO：52
PSI0612 GLP-2BSSL CTD 11aa SEQ ID NO：53
PSI0614 GLP-1(7-37)BSSL CTD 22aa SEQ ID NO：54
PSI0632 GLP-1(7-37) SEQ ID NO：55
PSI0633 GLP-2(1-33) SEQ ID NO：56

[0181] 使用质谱(HPLC/MS或MALDI-TOF/MS)确定化学合成的蛋白的完整性和身份。

[0182] 结果

[0183] 包含半衰期延长多肽的化学合成的蛋白全部可以以期望的浓度溶解，而GLP-1在10mg/mL展示出一些沉淀，并且GLP-2仅可以以该浓度的一半即5mg/mL溶解。这显示出半衰期延长多肽重复单元的亲水性质，以及通过将蛋白与这些序列融合来增加蛋白的溶解度的效用。PSI0400和PSI0489二者可以容易地溶解至20mg/ml以上的浓度。通过质谱分析确定每种变体的正确身份和分子量。

[0184] 结论

[0185] 肽和半衰期延长多肽的融合可以通过化学合成产生。包含半衰期延长多肽的融合蛋白通过允许产生具有更高浓度的溶液明显展示出增加的溶解度。

[0186] 实施例4：融合蛋白的生物物理表征

[0187] 本实施例描述了使用未融合的蛋白或肽和PEG化的蛋白作为参考，对包含半衰期延长多肽的融合蛋白的生物物理特征方面(诸如在溶液中的表观尺寸和分子量)的表征，以及通过尺寸排阻色谱(SEC)和柱校准(column calibration)和多角度光散射(MALS)确定在溶液中的流体动力学半径。

[0188] 材料与方法

[0189] 融合蛋白、未融合的蛋白和PEG化的蛋白在溶液中的尺寸通过使用校准的柱Superdex 200Increase 3.2/300(GE Healthcare Life Sciences)在 Micro(GE Healthcare Life Sciences)上的分析型凝胶过滤评估。柱用包含尺寸范围为6kDa至669kDa的8种球状蛋白和Blue Dextran 2000的凝胶过滤校准试剂盒LMW(代码号28-4038-
41，GE Healthcare Life Sciences)和校准试剂盒HMW(代码号28-4038-42，GE Healthcare Life Sciences)，使用在25℃的温度以75μl/min的流速的25mM NaP和125mM NaCl pH 7.0的运行缓冲液校准。溶液中的相应尺寸和流体动力学半径可以通过Handbook of Size Exclusion Chromatography Priciples and Methods的附录10(订单号18-1022-18，GE Healtcare Life Sciences)中描述的方法从校准的柱上的蛋白的洗脱体积计算。

[0190] 感兴趣的蛋白在与校准期间相同的条件下分析。蛋白的分子量通过MALS-RI系统确定：静态光散射检测器DAWN HELEOS 8+和示差折射仪Optilab T-rEX，以及连接到使用AdvanceBio SEC 300A2.7μm 7.8×300mm柱(Agilent部件号：PL1180-5301,Agilent Technologies)的Agilent 1100HPLC(Agilent Technologies)的Astra 6 软件(Wyatt Technology Europe,Germany)。柱温度为30℃，并且运行缓冲液为PBS,pH 7.0，流速为0.7mL/min。

[0191] 结果

[0192] 表6、表7和表8分别展示了IL-1Ra融合物、分子融合物以及GLP-1和GLP-2肽的结果。

[0193] 表6.基于IL-1Ra的分子

[0194]

[0195] 表7.基于的分子

[0196]

[0197] 表8.合成的GLP-1/GLP-2肽

[0198]

[0199] 另外地，图3a和图3b图示了不同分子的尺寸和半衰期延长部分中的单元的数目之间的关系：菱形显示出Met-huIL-1Ra(值“0”表示不存在半衰期延长多肽部分)以及单个IL-1Ra与半衰期延长多肽部分的融合物的半径，方形显示出PSI0400及其与半衰期延长多肽部分的融合物的半径，三角形显示出GLP-1及其与半衰期延长多肽部分的融合物的半径，并且叉形显示出GLP-2及其与半衰期延长多肽部分的融合物的半径。

[0200] 图3a示出了根据洗脱体积(SEC)确定的表观分子量，即在溶液中的表观尺寸(尽管在图中简洁地表示为“MW”)随半衰期延长多肽部分的单元数目的变化。图3b示出了与图3a中相同样品的流体动力学半径随半衰期延长多肽部分的单元数目的变化。

[0201] 结论

[0202] 观察到半衰期延长多肽融合物的长度与在溶液中的尺寸的相关性：每个单元为11个残基，实际分子量为平均1kDa，由于其未折叠的性质，对应于在溶液中的MW 9kDa的球状蛋白的尺寸。

[0203] 要注意的是，白蛋白的流体动力学半径或斯托克斯半径为3.8nm，考虑到白蛋白本身在肾脏清除的尺寸限值以上的事实，白蛋白可以用作避免肾脏清除所需要的最小尺寸的标志物。

[0204] 融合蛋白在哺乳动物系统中接受的糖基化进一步增加了融合蛋白的尺寸，如糖基化的PSI0540:BB1596与具有相同氨基酸序列的未糖基化的PSI0540:BB1595相比的尺寸增加明显示出的。

[0205] 实施例5：使用基于细胞的测定的体外药理学活性分析。

[0206] 正常人类皮肤成纤维细胞(NHDF)通过产生IL-6响应于IL-1β，该特征可以被开发用于体外阻断研究。在本实验中，在NHDF测定中测试了IL-1Ra和半衰期延长多肽的重组融合蛋白阻断IL-1β的能力。

[0207] 材料与方法

[0208] 在用蛋白处理之前三天接种细胞。蛋白(根据本发明的实施方案的重组IL-1Ra融合蛋白，PEG化的Met-huIL-1Ra或阿那白滞素/Met-huIL-1Ra)被稀释至100nM的起始浓度，并且随后在9μM重组人类血清白蛋白(rHSA)的存在下在无血清生长培养基中1:4连续稀释9次得到100nM至0.38pM的浓度范围。在3.4pM Il-1β的攻击剂量的存在下测试具有半衰期延长多肽和Met-huIL-1Ra的重组IL-1Ra融合蛋白，并且将细胞与蛋白在37℃孵育22小时，随后收获培养基。将收获的培养基稀释41×，然后使用人类IL-6ELISA试剂盒(R&D System)按照制造商的推荐分析IL-6含量。使用XLfit分析数据，并且从浓度-响应曲线计算IC50值。

[0209] 结果

[0210] IL-1β诱导的来自NHDF细胞的IL-6释放由IL-1Ra融合蛋白、PEG化的Met-huIL-1Ra以及由阿那白滞素/Met-huIL-1Ra以浓度依赖性方式降低。来自这些实验的结果被展示在表9中。

[0211] 表9.IL-1信号传导的体外抑制

[0212]

[0213] 结果显示出，由IL-1β诱导的细胞因子分泌响应通过具有半衰期延长多肽的重组IL-1Ra融合物的拮抗作用而以浓度依赖性方式降低，导致IL-6从NHDF细胞释放降低。

[0214] 结论

[0215] 与半衰期延长多肽的融合以尺寸依赖性方式降低IL-1Ra的活性，但没有消除生物学功能。

[0216] 实施例6：C5缺乏血清中的溶血活性的抑制

[0217] 关于经典补体途径功能及其受PSI0493(SEQ ID NO:37)、PSI0489([SEQ ID NO:51]-PEG30K)和PSI0400(SEQ ID NO:50)的抑制的研究，绵羊红细胞从Alsever溶液(Alsever’s solution，Swedish National Veterinary Institute)中的新鲜绵羊全血制备，并且然后用兔抗绵羊红细胞抗血清(Sigma)处理以成为抗体致敏的绵羊红细胞(EA)。整个过程在无菌条件下进行。所有其他试剂来自商业来源。

[0218] 体外测定在96孔U形微量滴定板中，通过连续添加测试蛋白、补体血清和EA悬浮液来运行。所有试剂在50μL/孔且在pH 7.3-7.4的总反应体积中的最终浓度为：0.15mM CaCl2；0.5mM MgCl2；3mM NaN3；138mM NaCl；0.1％明胶；1.8mM巴比妥钠；3.1mM巴比妥酸；5百万个EA；在合适的稀释度的补体蛋白C5血清以及在期望的浓度的C5结合多肽。

[0219] 将研究的蛋白与上文描述的补体血清在冰上预孵育20min，然后通过添加EA悬浮液开始反应。允许溶血反应在搅拌期间在37℃进行45min，并且然后通过添加100μl包含0.02％Tween 20的冰冷盐水来终止。将细胞离心至底部并且将对应于100μl上清液的上层部分转移到具有半区和平底孔的透明微板。使用微量滴定板读取仪在415nm的波长处以光密度分析反应结果。

[0220] 测试的C5结合多肽的抑制效力(IC50值)通过在添加到C5耗尽血清的受控浓度的人类C5的存在下应用相同的测定来定义。对于高度有效的抑制剂(低纳摩尔至亚纳摩尔)，反应混合物的最终C5浓度被控制在0.1nM。结果被展示在表10中。

[0221] 表10.测试的C5结合多肽的抑制效力

[0222]序列名称单元的数目 IC 50(nM)
SEQ ID NO:37 PSI0493 17 0.5
SEQ ID NO:50 PSI0400 0 2.9
[SEQ ID NO:51]-PEG30K PSI0489:PEG30K -(PEG30K) 1.5

[0223] 结论

[0224] 与半衰期延长多肽的融合不影响C5缺乏血清中的溶血活性的抑制。

[0225] 实施例7：与人类C5的结合

[0226] 材料与方法

[0227] 使用Biacore T200仪器(GE Healthcare)分析C5结合多肽对人类C5的结合亲和力。根据制造商的方案使用胺偶联化学将人类C5(A403,Quidel Corporation)偶联到CM5 传感器芯片(900RU)。偶联通过以在10mM Na-乙酸盐缓冲液pH 5(GE Healthcare)中7.5μg/mL的浓度注射hC5来进行。参考室(reference cell)用相同的试剂处理，但没有注射人类C5。C5结合多肽与固定化的hC5的结合用单循环动力学方法来研究，其中在25℃在30μL/min的流速在同一循环中相继注射五个浓度的样品(通常在HBS-EP缓冲液(10mM HEPES pH 7.4、
150mM NaCl、3mM EDTA、0.005％表面活性剂P20,GE Healthcare)中25nM、12.5nM、6.25nM、
3.12nM和1.56nM)，在注射之间没有再生。减去来自参考室的数据以补偿本体折射率(bulk refractive index)变化。在大多数情况中，还包括HBS-EP的注射作为对照，使得传感图是双空白的(double blanked)。将表面在HBS-EP缓冲液中再生。动力学常数使用Biacore T200评价软件1.0版的Langmuir 1:1分析模型从传感图计算。

[0228] 结果

[0229] 得到的KD值在表11中列示。

[0230] 表11.在Biacore中与固定化的人类补体C5的结合

[0231]序列名称单元的数目 Biacore KD(nM)
SEQ ID NO:37 PSI0493 17 2.4
SEQ ID NO:50 PSI0400 0 0.5
[SEQ ID NO:51]-PEG30K PSI0489:PEG30K (PEG30K) 1.4

[0232] 结论

[0233] 尽管在实施例6中没有观察到溶血活性的差异，但如在本实施例中由Biacore设备测量的，与C5的结合受融合蛋白的轻微影响。PEG化的分子展示出与溶血抑制匹配的结合亲和力。

[0234] 实施例8：体内药代动力学

[0235] 在本实施例中，IL-1Ra融合蛋白PSI0540(SEQ ID NO:38)、PSI0541(SEQ ID NO:39)、PSI0542(SEQ ID NO:40)、PSI0545(SEQ ID NO:43)、PSI0547(SEQ ID NO:45)和PSI0551(SEQ ID NO:49)的药代动力学在雄性大鼠中的单剂量研究中评价。

[0236] 材料与方法

[0237] 测试项目：PSI0540、PSI0541、PSI0542、PSI0545、PSI0547和PSI0551。所有六个测试物以25mM磷酸钠和250mM 氯化钠,pH 7.0中的溶液构成。

[0238] 存活阶段(in-life phase)：在静脉内和皮下单剂量施用之后的雄性Sprague-Dawley大鼠中研究药代动力学性质。每个剂量组的测试的剂量水平和动物的数目被展示在表12中。

[0239] 表12：在雄性Sprague-Dawley大鼠中的单剂量PK研究中测试的IL-1Ra融合蛋白的剂量水平。关于融合蛋白的细节，参见表4、表6和表9。

[0240]

[0241] 将皮下剂量以5ml/kg的给药体积注射到颈部区域中。将静脉内剂量以2.5ml/kg的给药体积注射到尾侧静脉中。使用不具有血清凝血活化剂的标准小瓶从舌下神经丛收集血液样品。在s.c.施用之后，在给药前以及在给药后的20min和1小时、4小时、8小时、24小时、30小时、48小时、72小时和96小时收集用于血清制备的血液样品，除了剂量水平为24mg/kg的PSI0545和剂量水平为30mg/kg的PSI0547，在该情况中在给药前以及在给药后的20min和
1小时、4小时、8小时、24小时、48小时、72小时、96小时和120小时收集样品。在静脉内施用之后，在给药前以及在给药后的5min和20min以及1小时、4小时、8小时、24小时、30小时、48小时和72小时收集用于血清制备的血液样品，除了剂量水平为12mg/kg的PSI0545和剂量水平为15mg/kg的PSI0547，在该情况中在给药前以及给药后的5min和20min以及1小时、4小时、8小时、24小时、48小时、72小时和96小时收集血液样品。

[0242] 定量ELISA：通过酶联免疫吸附测定(ELISA)进行大鼠血清样品中的修饰的阿那白滞素水平的确定。以PBS(Medicago)中0.25μg/ml，每孔50μl，在RT 2小时，将多克隆山羊抗人类IL-1RA抗体(AF280,R&D Systems)包被到微板(96孔高结合半区板，Corning 3690)上。未结合的多克隆抗体使用微板洗涤器(MultiWash+,Molecular Devices)用2×150μl PBS-Tween(Medicago)洗涤掉，并且将150μl的在PBS中的1％酪蛋白阻断剂(Thermo Scientific)添加到孔，在RT持续2小时。

[0243] 相对于补充有0.5％酪蛋白和1％大鼠正常血清的PBS中稀释的标准物，对从100倍和以上的稀释度的血清样品进行分析。对于每一种构建体，通过40ng/ml和20pg/ml之间的2倍稀释系列制备标准物。血清样品初始在补充有0.5％酪蛋白的PBS中稀释100倍，随后在补充有0.5％酪蛋白和1％大鼠正常血清(Adlego)的PBS中连续稀释。步骤1/5中的样品的连续稀释使用液体处理机器人(Biomek 4000,Beckman Coulter)在聚丙烯板(Corning 3365)中制备。

[0244] 未结合的阻断蛋白通过用2×150μl PBS-Tween洗涤去除，并且将25μl的样品和标准物移液到孔并且在RT以600rpm振荡孵育1小时，随后在+4℃孵育过夜。在用3×150μl PBS-Tween洗去任何未结合的物质后，将50μl的对人类IL-1RA特异性的生物素缀合的多克隆检测抗体(BAF280,R&D Systems)添加到孔并且在RT孵育2小时。检测抗体在补充有0.5％酪蛋白的PBS中稀释到0.4μg/ml。用3×150μl PBS-Tween洗去未结合的检测抗体，并且将50μl的HRP标记的链霉亲和素(MabTech)添加到孔并且在RT以400rpm振荡孵育1小时。将SA-HRP缀合物在补充有0.5％酪蛋白的PBS中1/10000稀释。在用3×150μl PBS-Tween洗涤以去除任何未结合的SA-HRP缀合物之后，将50μl的底物溶液(Easy Blue Enhanced TMB Substrate,Medicago)添加到孔，并且以与结合的阿那白滞素构建体的量成比例地显色。在大约30min后，通过将25μl的2M HCl添加到孔终止显色，并且在微板读取器(SpectraMax i3,Molecular Devices)中，以540nm作为用于板背景的参考波长，在450nm处测量颜色的密度。

[0245] 用四参数逻辑函数产生标准曲线(对于MS Excel，使用XLfit的公式200)。将读数浓度乘以样品的稀释倍数，以获得纯血清中的浓度。

[0246] 药代动力学分析：药代动力学分析基于来自每个剂量组的平均血清浓度对时间的数据。观察到的最大浓度(Cmax)和达到最大血清浓度的时间(tmax)直接从生物分析浓度对时间的数据获取。其他药代动力学参数：剂量归一化的Cmax(Cmax/剂量)、浓度对时间曲线下面积(AUC)、清除率(CL)、皮下施用后的表观清除率(CL/F)、稳态时表观分布体积(Vss)、平均停留时间(MRT)和终末半衰期(t1/2z)，通过使用Phoenix WinNonlin软件6.3版(Pharsight Corp.,USA)的非房室分析来估计。皮下生物利用度(F)的计算使用Microsoft Excel进行。

[0247] 结果

[0248] PSI0540、PSI0541、PSI0542、PSI0545、PSI0547和PSI0551在大鼠中的单剂量药代动力学参数估计值被展示在表13和表14中。

[0249] 由于生物分析异常，未确定PSI0551的清除率和其他静脉内药代动力学参数。对于其他五个测试物，静脉内给药后的结果显示清除率(ml/h·kg)以排列顺序增加：PSI0547(SEQ ID NO:45)(3.73)

[0250] 皮下给药后的结果显示，六个测试物中，PSI0547具有最低的清除率、最高的剂量归一化的Cmax和最长的平均停留时间。与AUC成反比的清除率CL/F(ml/h·kg)以排列顺序增加：PSI0547(SEQ ID NO:45)(12)

[0251] 表13：iv施用后的药代动力学参数估计值。

[0252]

[0253] *未确定的；由于生物分析异常，将估计值判断为不可靠的。

[0254] a测试的两个剂量的平均估计值；括号中分别为4 mg/kg和12 mg/kg的估计值。

[0255] b测试的两个剂量的平均估计值；括号中分别为5 mg/kg和15 mg/kg的估计值。

[0256] 表14：sc施用后的药代动力学参数估计值。

[0257]

[0258] *剂量归一化的Cmax，单位为nM/nmol/kg

[0259] **由于缺乏可靠的i.v.暴露数据，未确定皮下生物利用度

[0260] a测试的两个剂量的平均估计值；括号中分别为8mg/kg和24mg/kg的估计值。

[0261] b测试的两个剂量的平均估计值；括号中分别为10mg/kg和30mg/kg的估计值。

[0262] 此外，将在静脉输注融合蛋白PSI0540、PSI0542、PSI0545和PSI0547(分别包括具有17个、34个、34个和51个单元的半衰期延长多肽部分的M-IL-1Ra)后的估计的终末半衰期t1/2z(小时)相对于根据相对于球状蛋白校准的洗脱体积的表观尺寸(图5a)、在溶液中的流体动力学半径(图5b)和半衰期延长多肽部分的重复单元的数目(图5c)制图。PSI0162(Met-huIL-1Ra)被包括作为参考。

[0263] 结论

[0264] 半衰期延长多肽的半衰期延长性质被显示为随结构域的长度变化，具有51个单元的PSI0547一致地显示出最佳性质。总体地，包含两个IL-1Ra分子的融合蛋白展示出比相应的单个融合蛋白更短的半衰期。此外，发现化合物的生物利用度不随添加的半衰期延长多肽的长度降低。而是，分别在PSI0540、PSI0542、PSI0545、PSI0547和PSI0541和PSI0551的系列中注意到与具有相同结构的较小融合蛋白相比，较大的融合蛋白中的增加的生物利用度的趋势。

[0265] 实施例9：Met-huIL-1Ra及其PEG化的变体的体内药代动力学

[0266] 该比较实施例描述了在雄性大鼠中的两项单独研究中，Met-huIL-1Ra和分别用线性10kDa PEG、线性20kDa PEG和线性30kDa PEG在N-末端处PEG化的Met-huIL-1Ra的药代动力学研究。

[0267] 材料与方法

[0268] 这两项单独研究遵循与实施例8中相同的总体设计。将具有或不具有PEG的Met-huIL-1Ra蛋白施用到雄性Sprague-Dawley大鼠，对于皮下部分n＝3，对于静脉内部分n＝1。采样时间点为如下：皮下采样–0(给药前)、15min、30min、1hr、2hr、4hr、6hr、8hr、24hr、
48hr、72hr、96hr、120hr和144hr；静脉内取样–0(给药前)、5min、20min、1hr、2hr、4hr、6hr、
8hr、24hr、48hr、72hr、96hr、120hr和144hr。血清样品中的蛋白的浓度通过夹心ELISA使用标准试剂和标准方案确定。

[0269] 结果

[0270] 大鼠中的单剂量药代动力学参数估计值被展示在表15和表16中。

[0271] 表15.静脉内施用后的药代动力学参数估计值

[0272]

[0273] 表16.皮下施用后的药代动力学参数估计值

[0274]

[0275] 结论

[0276] 清除率(CL)随PEG的尺寸增加而降低(442(Met-huIL-1Ra)>22.2(L10k)>9.43(L20k)>6.93(L30k))。平均停留时间随PEG的尺寸增加而增加(IV:0.20(Met-huIL-1Ra)<4.9(L10k)～5.3(L20k)<11(L30k)；SC：2.2(Met-huIL-1Ra)<26(L10k)＝26(L20k)<37(L30k))。皮下给药后的生物利用度(F)随PEG的尺寸增加而减小；PEG缀合物的这种性质与半衰期延长多肽的作用相反，其中具有更长半衰期延长多肽的融合蛋白实际上展现出更大的生物利用度。对于所有的PEG，在24小时观察到最大血浆水平。

[0277] 实施例10：C5结合多肽的变体的药代动力学性质的比较研究

[0278] 在本比较实施例中，在雄性大鼠中的三项单剂量研究中评价了根据本发明的实施方案的融合蛋白、C5结合蛋白和PEG化的C5结合蛋白(PSI0493、PSI0489和PSI0257)的药代动力学。

[0279] 材料与方法

[0280] 三项研究遵循相同的总体设计，在雄性Sprague-Dawley大鼠中使用单静脉(iv)或皮下(sc)剂量(每种施用途径和蛋白N＝3)。在以下标称时间点获取用于制备用于确定PSI0257浓度的血清的血液样品：0(给药前)、5min、20min、1hr、2hr、4hr、8hr、12hr、24hr、48hr、96hr和168hr。对于PSI0489和PSI0493，在0小时(给药前)、给药后的5min(仅IV)、
15min(仅SC)、1hr、4hr、8hr、24hr、48hr、72hr、120hr和192hr获取血液样品。通过胃蛋白酶消化随后使用对于全部三种融合蛋白共同的合成放射性同位素标记的肽进行LC/LC/MS/MS分析来确定PSI0257、PSI0489和PSI0493血清浓度。从实际测量和标称时间点绘制了单独的浓度对时间谱。血清中的最大PSI0257、PSI0489或PSI0493浓度Cmax以及施用之后达到该最大血清浓度的时间tmax从个体数据确定。个体药代动力学谱经历非房室分析以计算终末半衰期t1/2z、平均停留时间(MRT)、血浆浓度-时间曲线下从零时间到无穷的面积AUC∞、和清除率CL。

[0281] 结果

[0282] 结果总结在表17中。

[0283] 表17.静脉内或皮下施用后的药代动力学参数估计值。

[0284]

[0285] 结论

[0286] 包含根据本发明的实施方案的半衰期延长多肽的融合蛋白的t1/2z被延长至20h，与单独的亲本分子的6h相比，具有9倍更高的AUC∞并且因此清除率降低9倍。与在C-末端中的Cys处与30kDa线性PEG化学缀合的相同靶向分子PSI0489相比，终末半衰期为20h相比于45h。这与实施例4、表7中展示的数据一致，其中对于包括半衰期延长多肽的融合蛋白，靶的尺寸增加为10×，但对于PEG化的靶，靶的尺寸增加为24×。

[0287] 实施例11：基于抗体片段的融合蛋白的克隆和产生

[0288] 本实施例描述了用于克隆和产生卢利珠单抗(Ruplizumab)抗体片段序列与如本文公开的半衰期延长多肽的融合蛋白的一般策略。半衰期延长多肽与抗体片段的轻链(LC)或重链(HC)融合。本实施例中产生的融合蛋白被用于下文实施例12至15中。

[0289] 材料与方法

[0290] DNA构建体：编码具有或不具有半衰期延长多肽的抗体片段的集合的DNA序列经密码子优化，用于在大肠杆菌或CHO细胞中表达，并且由Thermo Fisher Scientific的Invitrogen GeneArt基因合成服务合成(对于对应于不包括信号传导肽的成熟蛋白序列的区域的核苷酸序列，参见下文表18)。将基因克隆到表达载体中用于随后在大肠杆菌、Expi293细胞或ExpiCHO细胞中表达。对于PSI0716、PSI0717、PSI0762和PSI0761，使用双顺反子载体以掺入重链和轻链二者的核苷酸序列。

[0291] 表18.基于抗体片段的融合蛋白和相应核苷酸序列的概述

[0292]

[0293]

[0294] 培养和纯化：用包含编码重组抗体片段或融合蛋白的基因片段的表达载体转化大肠杆菌细胞，并且然后使用补料分批技术在生物反应器中或在摇瓶中培养，随后进行蛋白表达和通过离心收获细胞。将细胞沉淀储存在-20℃或直接经历渗透冲击，释放的蛋白通过离心变澄清并且储存在-20℃。重组抗体片段或融合蛋白的表达使用Expi293和ExpiCHO表达系统(Thermo Fisher Scientific)基本上按照制造商的方案进行。在转染表达载体后6天通过离心收获上清液，并且储存在-70℃。表19列出了编码的蛋白序列。

[0295] 将冷冻的大肠杆菌细胞沉淀重悬浮，并且然后通过声处理破坏，并且随后通过离心然后过滤(0.22μm)去除细胞碎片。在纯化前，将来自ExpiCHO和Expi293培养物的渗透冲击样品和上清液解冻并过滤(0.22μm)。使用常规色谱方法纯化包含重组抗体片段或融合蛋白的每个上清液。用于动物研究的重组融合蛋白还经历使用Detoxi-凝胶内毒素去除柱(Pierce,目录号20344)的内毒素去除纯化。纯化的抗体片段或融合蛋白经缓冲液交换到PBS，并且除非另有说明，否则PBS还是随后实验中使用的配制缓冲液。通过用考马斯蓝染色的SDS-PAGE分析融合蛋白的纯度，并且使用质谱(HPLC/MS或MALDI-TOF/MS)分析每种蛋白的分子量。

[0296] 结果

[0297] 纯化得到具有高纯度的蛋白制备物，其通过SDS-PAGE，用考马斯蓝染色进行分析。通过质谱分析确定每种融合蛋白的正确身份和分子量。

[0298] 下文表19列出了产生的蛋白的氨基酸序列。半衰期延长多肽与卢利珠单抗Fab的轻链(下表中的LC)或重链(下表中的HC)或轻链和重链二者的C-末端融合。

[0299] 结论

[0300] 通过构建合成的基因，随后在哺乳动物或细菌系统中表达，并且使用常规技术纯化至高纯度，可以产生包含抗体片段和不同长度的半衰期延长多肽的融合蛋白。

[0301] 表19.产生的蛋白的描述、表达系统和SEQ ID NO。

[0302]

[0303]

[0304]

[0305] 实施例12：融合蛋白的生物物理表征

[0306] 本实施例描述了使用未融合的蛋白和PEG化的蛋白作为参考，对包含卢利珠单抗Fab和半衰期延长多肽的融合蛋白的生物物理特征方面的表征，诸如在溶液中的表观尺寸和分子量(MW)，以及通过尺寸排阻色谱(SEC)和柱校准和多角度光散射(MALS)确定溶液中的流体动力学半径。

[0307] 材料与方法

[0308] 融合蛋白、未融合的蛋白和PEG化的蛋白在溶液中的尺寸通过使用校准的柱Superdex 200Increase 3.2/300(GE Healthcare Life Sciences)在 Micro(GE Healthcare Life Sciences)上的分析型凝胶过滤评估。柱用包含尺寸范围为6kDa至669kDa的8种球状蛋白和Blue Dextran 2000的凝胶过滤校准试剂盒LMW(代码号28-4038-
41，GE Healthcare Life Sciences)和校准试剂盒HMW(代码号28-4038-42，GE Healthcare Life Sciences)，使用在25℃的温度以75μl/min的流速的25mM NaP和125mM NaCl pH 7.0的运行缓冲液校准。溶液中的相应尺寸和流体动力学半径可以通过Handbook of Size Exclusion Chromatography Priciples and Methods的附录10(订单号18-1022-18，GE Healtcare Life Sciences)中描述的方法从校准的柱上的蛋白的洗脱体积计算。蛋白的分子量通过连接的MALS-RI系统确定：静态光散射探测器miniDawn Tristar和示差折射仪Optilab rEX和Astra V软件(Wyatt Technology Europe,Germany)。

[0309] 感兴趣的蛋白在与校准期间相同的条件下分析。

[0310] 结果

[0311] 表20展示了融合蛋白和参考蛋白的结果。

[0312] 表20.卢利珠单抗Fab融合蛋白和参考蛋白的表征

[0313]

[0314] 结论

[0315] 观察到融合蛋白中包含的半衰期延长多肽的总长度与融合蛋白在溶液中的尺寸的相关性：在溶液中的尺寸不取决于半衰期延长多肽的位置，因为如果半衰期延长多肽的所有单元与重链(HC)、轻链(LC)融合，或者如果相同数目的单元分布在Fab的重链和轻链二者之间，那么不同融合蛋白的尺寸是相似的。

[0316] 已经注意到白蛋白的流体动力学半径或斯托克斯半径在肾脏清除的尺寸限值以上，为3.8nm。这可以用作避免肾脏清除所需要的最小的尺寸限值。上文测试的所有融合蛋白具有在白蛋白的尺寸以上的尺寸。

[0317] 实施例13：与人类CD40的结合

[0318] 本实施例描述了卢利珠单抗Fab与半衰期延长多肽的融合蛋白的结合特征，其中卢利珠单抗、未融合的Fab蛋白和靶向人类CD40L的另一种Fab被用作参考蛋白。

[0319] 材料与方法

[0320] 使用OctetRED96仪器(Pall/ForteBio)分析了包含卢利珠单抗Fab和半衰期延长多肽的融合蛋白对人类CD40配体(CD40L或CD154)的结合亲和力。通常在2.5nM至80nM的浓度范围内以1:2的逐步增量(step increment)测试用第二代抗人类Fab-CH1(FAB2G,Pall/ForteBio)传感器固定的多肽与人类CD40L的细胞外部分(在大肠杆菌中以重组方式产生的aa 108-261)的结合。

[0321] 通常，对于每个浓度的CD40L，监测缔合持续180s，随后监测解离600s。传感器在每一个周期之间在pH 2通过3×10s脉冲再生，并且每个传感器的数据参照缓冲液暴露。动力学常数使用软件“八位位组系统数据分析，第10.0版(Octet System Data Analysis,Release 10.0)-动力学模块”(ForteBio,Pall Life Sciences)的Langmuir 1:1分析物模型(全局拟合)从传感器图计算。

[0322] 结果

[0323] 得到的KD值在表21中列示。当解离在600s监测时间内低于5％(kd<1e-4)时，该值被用作KD。

[0324] 表21.固定化的人类Fab融合蛋白与人类CD40L的结合

[0325]

[0326] 结论

[0327] Fab与半衰期延长多肽的融合对所述Fab与人类CD40L的可溶性部分的亲和力不具有可测量的影响。所有测试的融合蛋白对人类CD40L的亲和力与对照蛋白卢利珠单抗和培达利组单抗(Dapirolizumab)Fab相当。

[0328] 实施例14：体外和计算机免疫原性倾向研究

[0329] 本实施例旨在鉴定存在于PSI0699(SEQ ID NO:69/SEQ ID NO:70)中的潜在免疫原性区域。ProImmune 抗原呈递测定由ProImmune(UK)进行。免疫原性区域通过鉴定将由单核细胞来源的树突状细胞天然处理并且随后由MHC抗原呈递系统呈递的肽来确定。利用基于质谱LC/MS/MS的分析进行推定的免疫原性肽的检测。

[0330] 材料与方法

[0331] ProImmune 抗原呈递测定被用于鉴定存在于PSI0699中的潜在免疫原性区域。潜在免疫原性区域通过鉴定由单核细胞来源的树突状细胞天然处理并且随后由第二类MHC分子(HLA-DR)呈递的肽来确定。本测定中使用的树突状细胞从11名具有存在于人类群体中的HLA类型的足够覆盖的正常健康血液供体分离。推定的免疫原性肽通过基于LC/MS/MS的分析测序质谱来鉴定。

[0332] 使用软件TEPredict(Antonets&Maksyutov TEpredict:Software for T-Cell Epitope Prediction Molecular Biology,2010,Vol.44,No.1,pp.119–127)进行计算机免疫原性分析。

[0333] 结果

[0334] 总体上，存在在测定中鉴定出的4种潜在免疫原性肽，1种来自PSI0699的Fab的重链并且3种来自该Fab的轻链。这些潜在免疫原性肽中的2种先前被公开为潜在Tregitope序列，其被称为Treg 134，其包括这两种肽。所有肽起源于分子的抗体衍生部分的恒定区。在测定中没有衍生自半衰期延长多肽的免疫原性肽被呈递。

[0335] 此外，计算机评价没有预测出来自半衰期延长多肽的任何肽具有与任何MHC类分子结合的倾向。然而，计算机分析预测，来自Fab部分的另外的肽可能与多种MHC分子结合，包括来自推断Fab的靶特异性的可变区的肽。

[0336] 结论

[0337] 因为在目前的测定设置中没有来自半衰期延长多肽的肽被呈递，关于半衰期延长多肽的免疫原性的潜力被判断为低。因为在测定中仅许多抗体共同的区域被呈递，总体的免疫原性潜力也被判断为低。先前公开的Tregitope肽的呈递同样表明低响应。

[0338] 实施例15：基于Fab的融合蛋白的药代动力学性质的比较研究

[0339] 在本实施例中，评估了PSI0699(SEQ ID NO:69/SEQ ID NO:70)和PSI0701(SEQ ID NO:73)的静脉内和皮下药代动力学性质，包括未融合的CD40L Fab(PSI0698，卢利珠单抗Fab(SEQ ID NO:67/SEQ ID NO:68))作为对照。

[0340] 材料与方法

[0341] 研究遵循相同的总体设计，对于PSI0699和PSI0701二者，在雄性Sprague-Dawley大鼠中使用单静脉内(IV)或皮下(SC)剂量(每种施用途径和蛋白N＝3)。对于PSI0698，仅进行实验的IV部分。

[0342] 对于PSI0699和PSI0701，IV实验的剂量和时间点为如下：2mg/kg:5min和20min以及1小时、4小时、8小时、24小时、48小时、72小时、96小时和120小时。对于SC实验，使用4mg/kg的剂量，并且在以下这些时间点获取血液样品：20min和1小时、4小时、8小时、24小时、48小时、72小时、96小时、120小时和168小时。对于PSI0698的IV实验，使用13mg/kg的剂量并且在以下时间点抽取血液：5min和20min以及1小时、2小时、4小时、8小时、24小时、30小时和48小时。PSI0698、PSI0699和PSI0701血清浓度通过Meso Scale Discovery平台(Meso Scale Diagnostics)上的夹心测定来确定。活性药物使用生物素化的CD40L捕获，并且使用山羊中产生的钌缀合的抗人类IgG(Fab特异性)抗体(I5260,Sigman-Aldrich)检测。从实际血清浓度测量和标称时间点绘制了单独的浓度对时间谱。血清中的最大PSI0698、PSI0699和PSI0701浓度Cmax以及施用之后达到该最大血清浓度的时间tmax从个体数据确定。其他暴露和药代动力学参数估计值通过非房室分析(使用Phoenix WinNonlin 8.0)确定；即AUC(血浆浓度-时间曲线下从时间0至无穷的面积)、CL(清除率)、CL/F(SC施用之后的清除率)、Vss(稳态时表观分布体积)、MRT(平均停留时间)和t1/2z(终末半衰期)。皮下生物利用度F基于个体AUC/剂量(SC)除以中位AUC/剂量(IV)计算。

[0343] 结果

[0344] IV实验的结果总结在表22中并且SC实验的结果总结在表23中。

[0345] 表22.静脉内单剂量后的中位(范围)PK参数估计值。

[0346]

[0347] 表23.皮下单剂量后的中位(范围)PK参数估计值。

[0348]

[0349] 结论

[0350] PSI0699和PSI0701的清除率比CD40L Fab的CL低多于100倍。PSI0699和PSI0701的静脉内PK的特征分别是低清除率和小的分布体积。PSI0699和PSI0701二者显示出相对高的SC生物利用度，在给药后24hr或48hr观察到Cmax水平，并且然后单相地下降，t1/2z为32hr-55hr的范围。基于中位估计值，PSI0699显示出与PSI0701相比稍高的生物利用度(68％对
50％)、较长的生物半衰期(53hr对40hr)和C168h/剂量水平(1.6对0.96)。

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具有半衰期延长多肽的融合蛋白

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