一种药物缀合物和提高药物分子半衰期的方法
阅读：758发布：2020-05-13
专利汇可以提供一种药物缀合物和提高药物分子半衰期的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种药物缀合物和提高药物分子 半衰期 的方法，所述药物缀合物为药物分子被结合有半 抗原 的小分子修饰，所述半抗原是指存在内源性 抗体 的半抗原。本发明将半抗原分子修饰在药物分子上，被修饰后的药物分子可以和针对此类半抗原内源性抗体特异性结合，从而显著提升药物分子在体内的半衰期。，下面是一种药物缀合物和提高药物分子半衰期的方法专利的具体信息内容。
1.一种药物缀合物，其特征在于，药物分子被结合有半抗原的小分子修饰，所述半抗原是指存在内源性抗体的半抗原。
2.根据权利要求1所述的药物缀合物，其特征在于，所述结合有半抗原的小分子由半抗原、连接臂和耦合域组成。
3.根据权利要求2所述的药物缀合物，其特征在于，所述半抗原包括为2,4-二硝基苯、鼠李糖或α-Gal。
4.根据权利要求2所述的药物缀合物，其特征在于，所述连接臂包括分子量低于1000的聚乙二醇链或分子量低于100的短碳链。
5.根据权利要求2所述的药物缀合物，其特征在于，所述耦合域包括氨基、羧基、-LPXTGn-、聚合度1～10的寡聚甘氨酸或点击化学反应基团；所述-LPXTGn-为-亮氨酸-脯氨酸-X-苏氨酸-n个甘氨酸，X为任意氨基酸，n＝1～10。
6.根据权利要求1所述的药物缀合物，其特征在于，所述药物分子为蛋白药物或小分子药物；所述蛋白药物选自纳米抗体、affibody或其它具备抗原结合功能的抗体片段，所述小分子药物选自线性肽或环肽。
7.根据权利要求6所述的药物缀合物，其特征在于，所述纳米抗体选自抗EGFR纳米抗体，抗HER2纳米抗体，抗VEGFR纳米抗体，抗PSMA纳米抗体，抗PD-L1纳米抗体，抗CD20纳米抗体或抗MUC1纳米抗体；所述affibody选自抗EGFR affibody，抗HER2 affibody，抗VEGFR affibody，抗PSMA affibody，抗PD-L1 affibody，抗CD20 affibody或抗MUC1 affibody；所述其它具备抗原结合功能的抗体片段选自Fab、ScFv、或Fv；所述线性肽选自氨基酸个数为3～50的肽、所述环肽选自氨基酸个数为5～60的肽。
8.根据权利要求1所述的药物缀合物，其特征在于，所述药物缀合物选自以下(1)～(6)任一：
(1)药物分子氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示，结合有半抗原的小分子为修饰位点为药物分子C端；
(2)药物分子氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示，结合有半抗原的小分子为修饰位点为该药物分子的N端；
(3)药物分子氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示，结合有半抗原的小分子为修饰位点为药物分子的C端；
(4)
(5)
(6)
9.一种提高药物分子半衰期的方法，其特征在于，将结合有半抗原的小分子修饰到药物分子上，所述药物分子、结合有半抗原的小分子如权利要求1所述。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，修饰方法选自酶法修饰、化学法修饰或化学酶法修饰。
一种药物缀合物和提高药物分子半衰期的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种药物缀合物和提高药物分子半衰期的方法，属于制药工程领域。
背景技术
[0002] 药物分子的药代动力学是该药物的一个重要参数，不同的药物由于分子量、构型的区别，往往具备不同的血清半衰期。传统的单克隆抗体药物由于分子量巨大，且具备和新生儿受体FcRn相互作用的能力，其半衰期可达20天左右。然而，许多其它的蛋白药物，如纳米抗体(nanobody)、affibody和抗体片段，以及小分子药物，如线性肽和环肽等，它们的血清半衰期往往只有几分钟到几小时不等。导致治疗时用量大，频率高，可能给患者带来诸多不便。因此，延长这些药物分子的半衰期具有重要意义。
[0003] 已经有多种手段被用于延长药物分子的半衰期，如PEG化、引入非天然氨基酸、和抗体的Fc端或白蛋白进行融合，这些方法，或降低药物分子的亲和性，或引起不期望的免疫原性，或生产繁琐，产率低下，都给研究人员带来了不同程度的困扰。因此，需要一种新的延长半衰期方法，以缓解或解决上述问题。
发明内容
[0004] 本发明目的是提供一种利用内源性抗体的策略，用以延长药物分子的半衰期。
[0005] 本发明的目的通过以下技术方案实现：
[0006] 一种药物缀合物，药物分子被结合有半抗原的小分子修饰，所述半抗原是指存在内源性抗体的半抗原。
[0007] 在一种实施例中，本发明所述的结合有半抗原的小分子由半抗原、连接臂和耦合域构成。
[0008] 本发明所述半抗原是指存在内源性抗体的半抗原，该半抗原可以与相应的内源性抗体特异性结合，从而达到延长药物分子半衰期的目的，在一种实施例中，所述内源性抗体优选为抗DNP抗体，抗Rha抗体等，即在一种实施例中，所述的半抗原为2,4-二硝基苯、鼠李糖、α-Gal等。
[0009] 本发明所述的连接臂用于连接半抗原和结合域，为了便于合成均一的产物以及避免潜在的毒性和不期望的免疫原性，在一种实施例中，所述连接臂优选为分子量低于1000的低聚乙二醇(分子量小于1000)，在一种实施方式中，所述连接臂为分子量低于100的短碳链。在一种实施方式中，所述短碳链表示-(CH2)m-,其中m为1～6。
[0010] 本发明所述的耦合域为可以将该分子锚定在药物分子的基团，在一种实施方式中，其包括但不限于适用于酰胺缩合反应和转肽反应的氨基(-NH2)或羧基(-COOH)，适用于Sortase A反应的Sortag(LPXTGn,所述-LPXTGn-为-亮氨酸-脯氨酸-X-苏氨酸-n个甘氨酸，X为任意氨基酸，n＝1～10)或者寡聚甘氨酸(聚合度为1～10)，适用于点击化学反应的点击化学反应基团。
[0012] 本发明所述药物分子为蛋白药物或小分子药物；在一种实施例中，所述蛋白药物选自纳米抗体、affibody或其它具备抗原结合功能的抗体片段，优选为纳米抗体；在一种实施例中，所述小分子药物选自线性肽或环肽。
[0013] 本发明所述的纳米抗体(nanobody,Nb)是指衍生于骆驼科重链抗体的抗原结合区域，可列举的实例包括但不限于抗EGFR纳米抗体(氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)，抗HER2纳米抗体(氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)，抗VEGFR抗体(氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示)，抗PSMA纳米抗体((氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示)，抗PD-L1纳米抗体(氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示)，抗CD20纳米抗体(氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示)和抗MUC1纳米抗体(氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示)。
[0014] 本发明所述的affibody为模拟金黄色葡萄球菌种的Protein A得到，是指由58个氨基酸残基组成的功能类似于抗体的亲和性配体，可列举的实例包括但不限于抗EGFR affibody(氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示)，抗HER2affibody(氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示)，抗VEGFR affibody(氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示)抗PSMA affibody(氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示)，抗PD-L1affibody(氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示)，抗CD20affibody(氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示)和抗MUC1affibody(氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示)。
[0015] 本发明所述的其它具备抗原结合功能抗体片段为来源于传统抗体具有抗原抗体结合反应性的片段，例如抗原结合片段(Fab),单链抗体片段(ScFv)或Fv片段，可列举的实例包括但不限于抗EGFR抗体、抗HER2抗体、抗PSMA抗体、抗PD-L1抗体、抗CD20抗体、抗MUC1抗体等的上述抗体片段。
[0016] 本发明所述的小分子药物可以为本领域常见的线性肽或环肽药物，在一种优选的实施例中，本发明所述的线性肽为氨基酸个数为3～50的线性肽。在一种优选的实施例中，本发明所述的环肽为氨基酸个数为5～60的环肽。
[0017] 本发明所述药物分子的修饰位点只要是在不影响原药物的主要性质位点，均可以，优选为不影响药物本身亲和性的位点，可根据本领域公开的序列功能进行常规的选择；例如，大多药物蛋白的N末端或C末端，某些肽类药物的N端或C端，以及某些肽类药物中已经被证实修饰对活性基本无影响的氨基酸位点，例如艾塞那肽的12和27位氨基酸。
[0018] 本发明所述的药物分子进行修饰时，可以根据修饰反应的特点进行常规的衍生，例如为了纯化或者为了反应的进行，在N端或C端引入本领域常规设计的序列片段，这些序列片段可以根据具体的修饰方法或者实验目的进行常规的选择。
[0019] 在本发明的一种具体实施方式中，药物分子为抗EGFR的纳米抗体(SEQ ID NO.1)C端引入LPETGGHHHHHH的衍生物，氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示，所述EGFR为人表皮生长因子受体1；结合有半抗原的小分子为 修饰位点为纳米抗体的C端。在本实施例中，药物分子C端引入LPETGGHHHHHH，可以用于修饰过程中纯化和Sortase A的反应。
[0020] 在本发明的一种具体实施方式中，药物分子为抗HER2的affibody(SEQ ID NO.9)在N端引入LLQS，C端引入HHHHHH用于纯化的衍生物，氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示，所述HER2为人表皮生长因子受体2；结合有半抗原的小分子为 修饰位点为该affibody的N端。在本实施例中，药物分子在Seq.No.9的基础上在N端引入LLQS可以用于mTGase反应，在C端引入HHHHHH可以用于纯化。
[0021] 在本发明的一种具体实施方式中，药物分子为抗HER2的抗体片段(ScFv片段)，氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示，所述HER2为人表皮生长因子受体2；结合有半抗原的小分子为 修饰位点为为该蛋白的C端。
[0022] 在本发明的一种具体实施方式中，药物分子为LHRH肽，所述缀合物为[0023] 在本发明的一种具体实施方式中，药物分子为NGR环肽，所述药物缀合物为[0024] 在本发明的一种具体实施方式中，药物分子为艾塞那肽，所述药物缀合物为[0025] 本发明还提供一种提高药物分子半衰期的方法，将结合有半抗原的小分子修饰到药物分子上，所述半抗原是指存在内源性抗体的半抗原。
[0026] 本发明所述的提高药物分子半衰期的方法中的半抗原、小分子、修饰位置等如前所述。
[0027] 本发明所述的修饰方法可以为本领域常见的修饰方法，在一种实施例中，优选为酶法修饰、化学法修饰或化学酶法修饰。
[0028] 本发明所述的酶法修饰可以为本领域常见的酶法修饰，在一种实施例中，为转肽酶(Sortase A)催化的修饰或谷氨酰胺转移酶(mTGase)催化的修饰。
[0029] 本发明所述的化学法修饰可以为本领域常见的化学法修饰，在一种实施例中，为点击化学反应或酰胺缩合反应。
[0030] 本发明所述的化学酶法修饰为酶法修饰和化学法修饰两种修饰方法的联合使用。
[0031] 在本发明的一种具体实施方式中，药物分子为抗EGFR的纳米抗体，氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示，通过sortase A酶将含DNP的小分子修饰在该纳米抗体上，所述EGFR为人表皮生长因子受体1；结合有半抗原的小分子为修饰位点为纳米抗体的C端(Sortase A
可以特异性识别LPXTG序列，从T和G之间进行切割，并将切割后的产物耦合到上述结合有半抗原的小分子上)。
可以特异性识别LPXTG序列，从T和G之间进行切割，并将切割后的产物耦合到上述结合有半抗原的小分子上)。
[0032] 在本发明的一种具体实施方式中，药物分子为抗HER2的affibody，氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示，通过mTGase酶法将含Rha的小分子修饰在该affibody上。所述HER2为人表皮生长因子受体2；结合有半抗原的小分子为 修饰位点为该affibody的N端(mTGase可以特异性识别氨基酸序列LLQS，并将上述结合有半抗原的小分子共价耦合到LLQS中的Q上)。
[0033] 在本发明的一种具体实施方式中，药物分子为抗HER2的抗体片段，氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示，通过化学酶法将含Rha的小分子修饰在该抗原结合片段上。所述HER2为人表皮生长因子受体2；结合有半抗原的小分子为 修饰位点为为该蛋白的C端(首先在C端利用Sortase A修饰上叠氮基团，在利用点击化学反应将带有炔基的上述小分子耦合到蛋白上)。
[0034] 在本发明的一种具体实施方式中，药物分子为LHRH肽，氨基酸序列为Glp-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2；通过点击化学法将含Rha的小分子修饰在该寡肽上。所述LHRH为促黄体酮激素释放激素。结合有半抗原的小分子为
[0035] 形成的缀合物为：
[0036]
[0037] 在本发明的一种具体实施方式中，药物分子为NGR环肽，通过酰胺缩合法将含DNP的小分子修饰在该环肽上。所述NGR为天冬酰胺-甘氨酸-精氨酸。形成的药物缀合物为[0038] 在本发明的一种具体实施方式中，药物分子为艾塞那肽(线性肽)，通过sortase A酶法将含Rha的小分子修饰在该多肽上。形成的药物缀合物为
[0039] 本发明相对于现有技术的优势：
[0040] (1)本发明所述的药物缀合物，一方面基本不影响该药物分子活性，另一方面在小鼠体内可以将相应药物分子半衰期提高100～1000倍，明显优于现有技术用于提高半衰期的修饰，极大程度上解决了这些药物分子半衰期极短的问题。
[0042] 图1：质谱和蛋白电泳表征。(A)质谱图，DNP-1PEG-GGG小分子质谱；(B)蛋白电泳(SDS-PAGE)图，泳道M：Marker，泳道1：纯化后的抗EGFR nanobody。
[0043] 图2：酶联免疫反应(ELISA)和流式细胞表征。(A)nanobody和DNP-nanobody的ELISA结果；(B)nanobody和DNP-nanobody的流式细胞结果。
[0044] 图3：半衰期评估，nanobody和DNP-nanobody的小鼠体内半衰期测定结果。
[0045] 图4：质谱和蛋白电泳表征。(A)质谱图，Rha-2PEG-NH2小分子质谱；(B)蛋白电泳(SDS-PAGE)图，泳道M：Marker，泳道1：纯化后的抗HER2affibody。
[0046] 图5：酶联免疫反应(ELISA)和流式细胞表征。(A)affibody和Rha-affibody的ELISA结果；(B)affibody和Rha-affibody的流式细胞结果。
[0047] 图6：半衰期评估，affibody和Rha-affibody的小鼠体内半衰期测定结果。
[0048] 图7：质谱和蛋白电泳表征。(A)质谱图，Rha-5PEG-叠氮小分子质谱；(B)蛋白电泳(SDS-PAGE)图，泳道M：Marker，泳道1：纯化后的抗HER2scFV。
[0049] 图8：酶联免疫反应(ELISA)和流式细胞表征。(A)scFv和Rha-scFv的ELISA结果；(B)scFv和Rha-scFv的流式细胞结果。
[0050] 图9：半衰期评估，scFv和Rha-scFv的小鼠体内半衰期测定结果。
[0051] 图10：质谱表征。(A)[D-Lys6]-LHRH质谱；(B)LHRH-Rha质谱。
[0052] 图11：竞争性流式细胞表征。LHRH和LHRH-Rha的竞争性流式细胞结果。
[0053] 图12：半衰期评估，LHRH和LHRH-Rha的小鼠体内半衰期测定结果。
[0054] 图13：质谱表征。NGR-DNP质谱。
[0055] 图14：竞争性流式细胞表征。NGR和NGR-DNP的竞争性流式细胞结果。
[0056] 图15：半衰期评估，NGR和NGR-DNP的小鼠体内半衰期测定结果。
[0057] 图16：质谱表征。(A)Ex4类似物质谱；(B)Ex4-Rha质谱。
[0058] 图17：细胞增殖实验。Ex4和Ex4-Rha的细胞增殖实验结果。
[0059] 图18：半衰期评估，Ex4和Ex4-Rha的小鼠体内半衰期测定结果。
具体实施方式
[0060] 下面结合实施例对本发明做进一步说明，应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，凡在本发明的构思前提下对本发明制备方法的简单改进都属于本发明的保护范围之内。下面实施例未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域的公知手段。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
[0061] 实施例1：
[0062] Sortase A酶法将DNP修饰在抗EGFR nanobody(SEQ ID No.15)上。
[0063] DNP小分子(DNP-6PEG-GGG)的合成方式如下：
[0064]
[0065] 目标产物的质谱图如图1-A所示。其中DNP-6PEG-GGG检测到的分子量为619.2580(M+H+)，和预测一致，表明所合成的产物正确。
[0066] 发酵实施方式为：将编码抗EGFRnanobody的基因克隆至pET28a商业载体上并转化至商业宿主E.coliBL21(DE3)。挑取单菌落进行接种，接种培养基为LB，并添加0.1％的卡那霉素，37℃过夜培养；按1-10％的量进行转接，发酵培养基为TB培养基，待OD＝0.6-1.2时进行诱导，IPTG终浓度为0.1-1.0mM,温度转为16-30℃，诱导24h。发酵结束后进行离心，弃置培养基，用缓冲液(10-100mM Tris-Hcl或者PBS，pH 7-8)进行重悬，并用超声进行破壁，破壁后取破壁上清用镍柱进行纯化，并用脱盐柱或者超滤或者透析进行脱盐。纯化脱盐后的纳米抗体跑胶进行验证，如图1-B所示，SDS-PAGE显示只有一条带，且分子量和预测相符(16.7kDa)。
[0067] 合成DNP-纳米抗体偶联物(DNP-nanobody)的实施方式为：在SortaseA的作用下，在Tris-HCl缓冲液当中对nanobody进行DNP的修饰，在4-37℃，反应10-120min，反应后未反应的nanobody用Ni+磁珠进行去除，多余的小分子则通过透析或者排阻法除去，产物经纯化(可以通过透析、超滤和排阻过滤)后无菌过滤后保存在-20℃备用。
[0068] 酶联免疫吸附实验(ELISA)的实施方案为：①将纯化后nanobody和纯化后的DNP-nanobody 96孔板4℃铺板过夜；②洗涤后2％BSA室温封闭2h；③抗DNP抗体37℃处理1h；④相应HRP酶标记二抗37℃处理1h；⑤TMB试剂盒检测结果。结果如图2-A所示，DNP-nanobody所在孔的吸收值明显高于nanobody,表明DNP已经被成功修饰到nanobody上。
[0069] 流式细胞实验的实施方案为：①用胰酶消化细胞(A431(EGFR高表达)，MCF7(EGFR低表达))，流式液重悬计数，稀释细胞到4*105个，取100μL细胞(即40000个细胞)加到无菌EP管②加入终浓度为50nM的nanobody或DNP-nanobody,对于空白组(Negative)，加入对应体积的PBS,并在所有组中立即加入终浓度为20μg/mL的抗myc标签抗体，冰上孵育30min③用流式缓冲液彻底温和洗涤细胞，重悬，用Accuri C6仪器进行分析检测。流式结果如图2-B所示，相对于空白对照，加入nanobody或DNP-nanobody，A431荧光明显增加，且两者增加程度相差无几，另一方面，MCF7则无明显增加，这说明了DNP修饰的不影响nanobody对细胞表面的EGFR的特异性结合。
[0070] 半衰期的实施方案为：尾静脉注射nanobody至正常小鼠和DNP-OVA免疫小鼠(模拟人体内存在抗DNP抗体)，尾静脉注射DNP-nanobody至正常小鼠和DNP-OVA免疫小鼠(模拟人体内存在抗DNP抗体)，在不同时间点从上述小鼠腿静脉取血，分离血清，ELISA法测定不同时间点下nanobody或者DNP-nanobody的吸收值，并根据标准曲线换算成相应的血清浓度。结果如图3所示，nanobody在正常小鼠和免疫小鼠中的血清半衰期仅为9.4和9.5min,相差无几，而DNP-nanobody虽然在正常小鼠中的血清半衰期也仅为12.5min，但在免疫小鼠中的血清半衰期达到了29.3h,使得nanobody的半衰期提高了140倍左右，表明该策略可以显著改善nanobody的半衰期。
[0071] 实施例2：
[0072] mTGase酶法将Rha修饰在二聚抗HER2affibody(SEQ ID NO.16)上。
[0073] Rha小分子(Rha-2PEG-NH2)的合成方式如下：
[0074]
[0075] 目标产物的质谱图如图4-A所示。其中Rha-2PEG-NH2检测到的分子量为296.1708(M+H+)，和预测一致，表明所合成的产物正确。
[0076] 发酵实施方式为：将编码抗HER2affibody的基因克隆至pET28a商业载体上并转化至商业宿主E.coliBL21(DE3)。挑取单菌落进行接种，接种培养基为LB，并添加0.1％的卡那霉素，37℃过夜培养；按1-10％的量进行转接，发酵培养基为TB培养基，待OD＝0.6-1.2时进行诱导，IPTG终浓度为0.1-1.0mM,温度转为16-30℃，诱导24h。发酵结束后进行离心，弃置培养基，用缓冲液(10-100mM Tris-Hcl或者PBS，pH 7-8)进行重悬，并用超声进行破壁，破壁后取破壁上清用镍柱进行纯化，并用脱盐柱或者超滤或者透析进行脱盐。纯化脱盐后的纳米抗体跑胶进行验证，如图4-B所示，SDS-PAGE显示只有一条带，且分子量和预测相符(14.8kDa)。
[0077] 合成Rha和affibody偶联物(Rha-affibody)的实施方式为：在mTGase的作用下，在含1mM抗环血酸的PBS缓冲液当中对affibody进行Rha的修饰，在4-37℃，反应10-120min，多余的小分子则通过透析或者排阻法除去，产物经纯化(可以通过透析、超滤和排阻过滤)后无菌过滤后保存在-20℃备用。
[0078] 酶联免疫吸附实验(ELISA)的实施方案为：①将纯化后affibody和纯化后的Rha-affibody 96孔板4℃铺板过夜；②洗涤后2％BSA室温封闭2h；③抗Rha抗体37℃处理1h；④相应HRP酶标记二抗37℃处理1h；⑤TMB试剂盒检测结果。结果如图5-A所示，Rha-affibody所在孔的吸收值明显高于affibody,表明Rha已经被成功修饰到affibody上。
[0079] 流式细胞实验的实施方案为：①用胰酶消化细胞(SKBR3(HER2高表达)，MCF7(HER2低表达))，流式液重悬计数，稀释细胞到4*105个，取100μL细胞(即40000个细胞)加到无菌EP管②加入终浓度为50nM的affibody或Rha-affibody,对于空白组(Negative)，加入对应体积的PBS,并在所有组中立即加入终浓度为20μg/mL的抗His标签抗体，冰上孵育30min③用流式缓冲液彻底温和洗涤细胞，重悬，用Accuri C6仪器进行分析检测。流式结果如图5-B所示，相对于空白对照，加入affibody或Rha-affibody，SkBR3荧光明显增加，且两者增加程度相差无几，另一方面，MCF7则无明显增加，这说明了Rha修饰的不影响affibody对细胞表面的HER2的特异性结合。
[0080] 半衰期的实施方案为：尾静脉注射affibody至正常小鼠和Rha-OVA免疫小鼠(模拟人体内存在抗Rha抗体)，尾静脉注射Rha-affibody至正常小鼠和Rha-OVA免疫小鼠(模拟人体内存在抗Rha抗体)，在不同时间点从上述小鼠腿静脉取血，分离血清，ELISA法测定不同时间点下affibody或者Rha-affibody的吸收值，并根据标准曲线换算成相应的血清浓度。结果如图6所示，affibody在正常小鼠和免疫小鼠中的血清半衰期仅为6.4和6.3min,相差无几，而Rha-affibody虽然在正常小鼠中的血清半衰期也仅为6.4min，但在免疫小鼠中的血清半衰期达到了34.7h,使得affibody的半衰期提高了320倍左右，表明该策略可以显著改善affibody的半衰期。
[0081] 实施例3：
[0082] 化学酶法将Rha修饰在抗HER2ScFv(SEQ ID No.17)上。
[0083] Rha小分子(Rha-5PEG-炔基)的合成方式如下：
[0084]
[0085] 目标产物的质谱图如图7-A所示。其中Rha-5PEG-炔基检测到的分子量为619.2580(M+H+)，和预测一致，表明所合成的产物正确。
[0086] 发酵实施方式为：将编码抗HER2ScFv的基因克隆至pET21d商业载体上并转化至商业宿主E.coliBL21BLX。挑取单菌落进行接种，接种培养基为LB，并添加0.1％氨苄青霉素，37℃过夜培养；按1-10％的量进行转接，发酵培养基为LB培养基，待OD＝0.6-1.2时进行诱导，IPTG终浓度为0.1-1.0mM,温度转为16-30℃，诱导24h。发酵结束后进行离心，弃置培养基，用缓冲液(10-100mM Tris-Hcl或者PBS，pH 7-8)进行重悬，并用超声进行破壁，破壁后取破壁上清用镍柱进行纯化，并用脱盐柱或者超滤或者透析进行脱盐。纯化脱盐后的纳米抗体跑胶进行验证，如图7-B所示，SDS-PAGE显示只有一条带，且分子量和预测相符(30.1kDa)。
[0087] 合成Rha-单链抗体偶联物(Rha-ScFv)的实施方式为：在SortaseA的作用下，在Tris-HCl缓冲液当中对ScFv先进行叠氮修饰(所用小分子为GGG-N3)，在4-37℃，反应10-120min，反应后未反应的ScFv用Ni+磁珠进行去除，多余的小分子则通过透析或者排阻法除去，产物经纯化(可以通过透析、超滤和排阻过滤)后用于后续点击化学反应。点击化学反应的条件为在硫酸铜、维生素C钠催化的条件下，Rha-5PEG-炔基与ScFv-叠氮在室温下反应获得Rha-ScFv，多余的小分子则通过透析或者排阻法除去，最终产物经纯化(可以通过透析、超滤和排阻过滤)后无菌过滤后保存在-20℃备用。
[0088] 酶联免疫吸附实验(ELISA)的实施方案为：①将纯化后ScFv和纯化后的Rha-ScFv96孔板4℃铺板过夜；②洗涤后2％BSA室温封闭2h；③抗Rha抗体37℃处理1h；④相应HRP酶标记二抗37℃处理1h；⑤TMB试剂盒检测结果。结果如图8-A所示，Rha-ScFv所在孔的吸收值明显高于ScFv,表明Rha已经被成功修饰到ScFv上。
[0089] 流式细胞实验的实施方案为：①用胰酶消化细胞(SKBR3(HER2高表达)，MCF7(HER2低表达))，流式液重悬计数，稀释细胞到4*105个，取100μL细胞(即40000个细胞)加到无菌EP管②加入终浓度为50nM的ScFv或Rha-ScFv,对于空白组(Negative)，加入对应体积的PBS,并在所有组中立即加入终浓度为20μg/mL的抗myc标签抗体，冰上孵育30min③用流式缓冲液彻底温和洗涤细胞，重悬，用Accuri C6仪器进行分析检测。流式结果如图8-B所示，相对于空白对照，加入ScFv或Rha-ScFv，SKBR3荧光明显增加，且两者增加程度相差无几，另一方面，MCF7则无明显增加，这说明了Rha修饰的不影响ScFv对细胞表面的HER2的特异性结合。
[0090] 半衰期的实施方案为：尾静脉注射ScFv至正常小鼠和Rha-OVA免疫小鼠(模拟人体内存在抗Rha抗体)，尾静脉注射Rha-ScFv至正常小鼠和Rha-OVA免疫小鼠(模拟人体内存在抗Rha抗体)，在不同时间点从上述小鼠腿静脉取血，分离血清，ELISA法测定不同时间点下ScFv或者Rha-ScFv的吸收值，并根据标准曲线换算成相应的血清浓度。结果如图9所示，ScFv在正常小鼠和免疫小鼠中的血清半衰期仅为34.0和33.9min,相差无几，而Rha-ScFv虽然在正常小鼠中的血清半衰期也仅为33.1min，但在免疫小鼠中的血清半衰期达到了62.7h,使得ScFv的半衰期提高了120倍左右，表明该策略可以显著改善ScFv的半衰期。
[0091] 实施例4：
[0092] 点击化学法将Rha修饰在寡肽LHRH上。
[0093] 合成LHRH-鼠李糖偶联物(LHRH-Rhamnose，LHRH-Rha)的实施方式为：
[0094] 基于LHRH构效关系的研究，在不影响其活性的基础上，在6位甘氨酸的位置进行带叠氮基团(-N3)的D型赖氨酸(D-Lys(N3))的取代，成为[6-D-Lys(N3)]-LHRH多肽分子(其氨基酸序列为：焦谷氨酸-组氨酸-色氨酸-丝氨酸-酪氨酸-D型赖氨酸(侧链带叠氮基团-N3)-亮氨酸-精氨酸-脯氨酸-甘氨酸-氨基，Glp-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys(N3)-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2)，其中，Glp为焦谷氨酸。
[0095] 选取Rink-amide MBHA树脂作为固相载体，基于Fmoc合成策略，按照Glp-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2的序列(其中，Glp为焦谷氨酸，无Fmoc保护)，利用TBTU作为缩合剂，从C端Gly开始到N端Glp逐步缩合。序列合成后，加入切割试剂(TFA:Tis:H2O＝95:2.5:2.5)将多肽从树脂上切割下来。利用冰乙醚沉淀得到粗肽，再通过HPLC进行纯化，获得多肽[D-Lys6]-LHRH，质谱验证(图10-A),[M+H+]为1280.8，为正确产物。
[0096] 合成鼠李糖Rha衍生物的实施方式为：Rha分子进行寡聚聚乙二醇连接臂进行组装，该连接臂的另一端为炔基通过点击反应偶联到上述LHRH多肽衍生物中，合成的化合物为 合成路线如下：
[0097]
[0098] 随后在硫酸铜、维生素C钠催化的条件下，Rha衍生物与LHRH衍生物通过点击反应获得LHRH-Rha偶联产物，质谱验证偶联成功。表示为LHRH-Rha(见图10-B，质谱分子量[M+H+]为1567.2)。
[0099] 竞争性流式细胞实验实施方式为：①用胰酶消化细胞(MCF7(LHRH高表达)，UCI1075
(LHRH不表达))，流式液重悬计数，稀释细胞到4×10个，取100μL细胞(即40000个细胞)加到无菌EP管，加入荧光标记的抗LHRH受体抗体②立即加入终浓度为250nM的LHRH或LHRH-Rha，对于空白组(阳性对照)，加入对应体积的PBS，冰上孵育1h③用流式缓冲液彻底温和洗涤细胞，重悬，用Accuri C6仪器进行分析检测。如图11所示,LHRH和LHRH-Rha均可以竞争性抑制抗LHRH受体抗体和LHRH受体的结合，且抑制效果抑制，表明修饰上鼠李糖后并不影响LHRH的特异性靶向功能。
(LHRH不表达))，流式液重悬计数，稀释细胞到4×10个，取100μL细胞(即40000个细胞)加到无菌EP管，加入荧光标记的抗LHRH受体抗体②立即加入终浓度为250nM的LHRH或LHRH-Rha，对于空白组(阳性对照)，加入对应体积的PBS，冰上孵育1h③用流式缓冲液彻底温和洗涤细胞，重悬，用Accuri C6仪器进行分析检测。如图11所示,LHRH和LHRH-Rha均可以竞争性抑制抗LHRH受体抗体和LHRH受体的结合，且抑制效果抑制，表明修饰上鼠李糖后并不影响LHRH的特异性靶向功能。
[0100] 半衰期实验的实施方案为：尾静脉注射LHRH至正常小鼠和Rha-OVA免疫小鼠(模拟人体内存在抗Rha抗体)，尾静脉注射LHRH-Rha至正常小鼠和Rha-OVA免疫小鼠(模拟人体内存在抗Rha抗体)，在不同时间点从上述小鼠腿静脉取血，分离血清，超高效液相色谱法测定不同时间点下LHRH或者LHRH-Rha的响应值，并根据标准曲线换算成相应的血清浓度。结果如图12所示，LHRH在正常小鼠和免疫小鼠中的血清半衰期仅为2.2和2.6min,相差无几，而LHRH-Rha虽然在正常小鼠中的血清半衰期也仅为2.6min，但在免疫小鼠中的血清半衰期达到了38.9h,使得LHRH的半衰期提高了1000倍左右，表明该策略可以显著改善LHRH的半衰期。
[0101] 实施例5：
[0102] 酰胺缩合法将DNP修饰在NGR环肽上。
[0103] NGR多肽即含天门冬酰胺酸-精氨酸-甘氨酸序列的多肽。由于NGR环肽比线形肽具备更高的CD13亲和性，因此，本发明设计合成了基于NGR的环肽分子，将DNP的结构偶联到NGR上，通过招募抗DNP的抗体来提高NGR环肽的血清半衰期。
[0104] 合成NGR-DNP偶联物的逆合成分析如下：
[0105]
[0106] 先合成肽链1GGGCNGRC(G、C、N、R分别代表氨基酸甘氨酸、半胱氨酸、天门冬酰胺、精氨酸)，以Fmoc-Cys(Acm)-Wang resin(0.1mmol)树脂为固相载体将树脂在固相合成管中溶胀过夜，加入20％哌啶/DMF溶液(5ml)在摇床上摇15min脱去Fmoc，然后将Fmoc-Arg-OH(0.25mmol)，HBTU(0.25mmol),Dipea(0.5mmol)溶于5mlDMF溶液，加入树脂中，摇床上摇2h，以茚三酮溶液监测是否连上。再次脱去Fmoc保护基，重复上述步骤直到肽链合成。
[0107] 然后再在HBTU(0.25mmol),Dipea(0.5mmol)溶于的环境下，将物质2和3加入树脂反应2h，监测反应结束。化合物4的合成：将化合物4在95％的三氟乙酸TFA溶液(TFA:Tis:H2O＝95:2.5:2.5)中，反应2h切去树脂，用大量冰乙醚沉淀离心，除去乙醚，冻干。HPLC监测。化合物5的合成：将化合物5溶于乙酸中，加入碘I2氧化，反应2-3h。
[0108] HPLC监测反应进行，反应结束后用水猝灭，三氯甲烷CHCl3洗涤多次除去大多数碘I2。水相抽干后以半制备柱纯化。图13为化合物NGR-DNP的质谱结果，可见，有预测分子量1219.61(M+H+)的峰出现，表明产物合成成功
[0109] 竞争性流式细胞实验实施方式为：①用胰酶消化细胞(HUVEC(CD13高表达)，MCF7(CD13不表达))，流式液重悬计数，稀释细胞到4×105个，取100μL细胞(即40000个细胞)加到无菌EP管，加入荧光标记的抗CD13抗体②立即加入终浓度为250nM的NGR环肽或NGR-DNP，对于空白组(阳性对照)，加入对应体积的PBS，冰上孵育1h③用流式缓冲液彻底温和洗涤细胞，重悬，用Accuri C6仪器进行分析检测。如图14所示,NGR和NGR-DNP均可以竞争性抑制抗CD13抗体和HUVEC的结合，且抑制效果抑制，表明修饰上DNP后并不影响NGR的特异性靶向功能。
[0110] 半衰期实验的实施方案为：尾静脉注射NGR至正常小鼠和DNP-OVA免疫小鼠(模拟人体内存在抗DNP抗体)，尾静脉注射NGR-DNP至正常小鼠和DNP-OVA免疫小鼠(模拟人体内存在抗DNP抗体)，在不同时间点从上述小鼠腿静脉取血，分离血清，超高效液相色谱法测定不同时间点下NGR或者NGR-DNP的响应值，并根据标准曲线换算成相应的血清浓度。结果如图15所示，NGR在正常小鼠和免疫小鼠中的血清半衰期仅为19.4和19.9min,相差无几，而NGR-DNP虽然在正常小鼠中的血清半衰期也仅为18.8min，但在免疫小鼠中的血清半衰期达到了49.3h,使得NGR的半衰期提高了160倍左右，表明该策略可以显著改善NGR的半衰期。
[0111] 实施例6：
[0112] Sortase A酶催化将Rha修饰在艾塞那肽上。
[0113]
[0114] 首先合成可被Sortase A艾塞那肽(Ex4)类似物：肽的合成采用Fmoc全保护策略，并使用CEM多肽固相合成仪来进行。合成使用的树脂为Fmoc-Ser-(tBu)-Wang resin，其负载量为0.323mmol/g。在每次氨基酸的缩合中，使用Fmoc全保护策略氨基酸为5eq，DIPEA(N,N-二异丙基乙胺，溶于N-甲基吡咯烷酮)为10eq，并且使用TBTU(苯并三氮唑-N,N,N,N-四甲基脲六硼酸盐，溶于N,N-二甲基甲酰胺)5eq，微波90℃缩合。粗产物通过HPLC纯化产物并使用MALDI-TOF MS表征。表征结果如图16-A所示，检测分子量为4830.3表明合成的肽正确。
[0115] 再将Rha小分子通过Sortase A酶修饰到上述合成的艾塞那肽类似物上，反应条件为：在含有0.15M NaCl，10mM CaCl2和2mMβ-巯基乙醇的Tris缓冲液(0.3M，pH＝7.4)中37℃反应2h。反应结束后得到Ex4-Rha,其质谱图如图16-B所示，检测分子量为：5077.3；表明合成正确。
[0116] 细胞实验的实施方案：将100μl INS-1细胞接种于96孔板中(10000/孔)。每孔加入STZ 5mM，在此基础上分别接种PBS、艾塞那肽标准品、艾塞那肽类似物1以及EX4-Rha各100nM，每组5个平行。孵育12h后，向INS-1细胞中加入10μL/cell cck-8溶液并使用酶标仪测定在450nm吸收光度。由图17结果可以看出，只加入STZ的对照组细胞活性被明显抑制。艾塞那肽(Ex4)与艾塞那肽类似物之间的活性差别不明显，证明在C端修饰LPETGGS序列不会明显降低艾塞那肽生物活性。Rha-Ex4与艾塞那肽的活性相似，表明小分子对艾塞那肽的活性影响有限。
[0117] 半衰期实验的实施方案为：尾静脉注射Ex4至正常小鼠和Rha-OVA免疫小鼠(模拟人体内存在抗Rha抗体)，尾静脉注射Ex4-Rha至正常小鼠和Rha-OVA免疫小鼠(模拟人体内存在抗Rha抗体)，在不同时间点从上述小鼠腿静脉取血，分离血清，超高效液相色谱法测定不同时间点下Ex4或者Ex4-Rha的响应值，并根据标准曲线换算成相应的血清浓度。结果如图18所示，Ex4在正常小鼠和免疫小鼠中的血清半衰期仅为3.5和3.7min,相差无几，而LHRH-Rha虽然在正常小鼠中的血清半衰期也仅为4.0min，但在免疫小鼠中的血清半衰期达到了34.3h,使得Ex4的半衰期提高了550倍左右，表明该策略可以显著改善Ex4的半衰期。
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