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具有延长的半衰期的药物融合体和缀合物

阅读：37发布：2020-05-14

专利汇可以提供具有延长的半衰期的药物融合体和缀合物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及具有改良的血清半衰期的药物融合体和缀合物。这些融合体和缀合物包含免疫球蛋白（抗体）单个可变结构域和促胰岛素分子和/或肠降血糖素和/或肠肽分子。本发明另外涉及包含这样的药物融合体和缀合物的应用、制剂、组合物和装置。本发明也涉及组合物，其包含超过一个作为融合体或缀合物的一部分而存在的促胰岛素分子和/或肠降血糖素和/或肠肽分子，也涉及所述组合物的应用和制剂。，下面是具有延长的半衰期的药物融合体和缀合物专利的具体信息内容。

权利要求

1. 一种组合物，所述组合物包含单个融合体或缀合物，其中所述融合体或缀合物包含下述分子，或由其组成：（a）至少2种分子，所述分子选自：促胰岛素分子和/或肠降血糖素和/或肠肽分子，且它们作为与（b）的融合体或缀合物存在，（b）蛋白或肽，其延长所述促胰岛素分子和/或肠降血糖素和/或肠肽分子的半衰期。
2. 根据权利要求1所述的组合物，其中所述延长半衰期的蛋白或肽是结合血清白蛋白、例如人血清白蛋白的蛋白或肽。
3. 根据权利要求2所述的组合物，其中所述延长半衰期的蛋白包含特异性地结合血清白蛋白、例如人血清白蛋白的结构域抗体（dAb）。
4. 一种组合物，所述组合物包含至少2种单独的融合体或缀合物，且其中每种单独的融合体或缀合物包含下述分子，或由其组成：（a）一种或多种分子，所述分子选自：促胰岛素分子和/或肠降血糖素和/或肠肽分子；其作为与（b）的融合体或缀合物存在，（b）蛋白或肽，其延长所述促胰岛素分子和/或肠降血糖素和/或肠肽分子的半衰期。
5. 根据权利要求4所述的组合物，其中所述延长半衰期的蛋白或肽是结合血清白蛋白、例如人血清白蛋白的蛋白或肽。
6. 根据权利要求5所述的组合物，其中所述延长半衰期的蛋白包含特异性地结合血清白蛋白、例如人血清白蛋白的结构域抗体（dAb）。
7. 根据任一项前述权利要求的组合物，其中所述促胰岛素分子和/或肠降血糖素中的至少一种选自：GLP-1、PYY、艾塞那肽；或是它们的功能变体、类似物、突变体或衍生物的保留促胰岛素分子和/或肠降血糖素活性的肽。
8. 根据任一项前述权利要求的组合物，其中至少一种肠降血糖素选自：（a）具有图1（i）（SEQ ID NO 9）所示的氨基酸序列的GLP-1 (7-37) A8G突变体或其突变体、衍生物或类似物，（b）具有图1（j）（SEQ ID NO 10）所示的氨基酸序列的艾塞那肽-4分子或其突变体、衍生物或类似物；和（c）具有图1（s）（SEQ ID NO 19）所示的氨基酸序列的PYY肽或其突变体、衍生物或类似物。
9. 根据任一项前述权利要求所述的组合物，其中所述特异性地结合血清白蛋白的结构域抗体（dAb）选自：DOM 7h-14 (Vk)结构域抗体（dAb）（DOM 7h-14的氨基酸序列显示为图1（h）: SEQ ID NO 8），或DOM 7h-14 -10(Vk)结构域抗体（dAb）（DOM 7h-14-10的氨基酸序列显示为图1（o）: SEQ ID NO 15），和具有R108C突变的DOM 7h-14 -10(Vk)结构域抗体（dAb）（DOM 7h-14-10 R108C的氨基酸序列显示为图1（r）SEQ ID NO 18）；
和7h-11-15 AlbudAb（DOM 7h-11-15的氨基酸序列显示为图1（p）: SEQ ID NO 16）和
7h-11-15 R108C AlbudAb（DOM 7h-11-15 R108C的氨基酸序列显示为图1（T）: SEQ ID NO 47）；或这样的dAb，其结合在血清白蛋白上的相同表位，或其与它们中的任一种竞争与血清白蛋白的结合。
10. 根据任一项前述权利要求所述的组合物，其另外包含氨基酸连接物或化学连接物，所述连接物连接促胰岛素分子和/或肠降血糖素分子和/或肠肽和结合血清白蛋白的dAb。
11. 根据权利要求10所述的组合物，其中所述氨基酸连接物选自：具有图1（k）（SEQ ID NO 11）所示的氨基酸序列的螺旋连接物，具有图1（l）（SEQ ID NO 12）所示的氨基酸序列的gly-ser连接物，或PEG连接物。
12. 根据权利要求11所述的组合物，其中所述PEG连接物具有图3所示的PEG连接物结构。
13. 根据任一项前述权利要求所述的组合物，其中所述促胰岛素分子和/或肠降血糖素和/或肠肽分子存在于所述dAb的N-端或C-端中的任一端或两端处。
14. 根据任一项前述权利要求所述的组合物，其中一个或多个促胰岛素分子和/或肠降血糖素和/或肠肽存在于所述dAb的C端处，且另外，一个或多个促胰岛素分子和/或肠降血糖素和/或肠肽分子存在于所述dAb的N端处。
15. 根据任一项前述权利要求所述的组合物，其包含一种或多种在下面指出的肽-AlbudAb分子：图1a-1g（SEQ ID NO 1-7）；和图1m-1n（SEQ ID NO 13-14）；和图1u -1v（SEQ ID NO 48-49）；和图3或Dom7h-11-15 (R108C) - PEG - 3-36 PYY（赖氨酸在第
10位）（具有图3所示的结构，但是AlbudAb组分是Dom7h-11-15 (R108C)）。
16. 根据权利要求3或权利要求6所述的组合物，其包含：（a）DAT0115分子（具有在图1b: SEQ ID NO 2中所示的氨基酸序列），和（b）或（c）中的任一项：（b）Dom7h-14-10 (R108C) - PEG - 3-36 PYY（赖氨酸在第10位）（具有图3所示的结构），作为组合的制备物，用于同时地、分开地或相继地使用，（c）Dom7h-11-15 (R108C) - PEG - 3-36 PYY（赖氨酸在第10位）（具有图3所示的结构，但是AlbudAb组分是Dom7h-11-15 (R108C)）。
17. 根据任一项前述权利要求所述的组合物，其中通过向所述蛋白或肽上连接选自下述的额外分子：PEG基团、血清白蛋白、转铁蛋白、转铁蛋白受体或至少其转铁蛋白-结合部分、抗体Fc区域，或通过缀合抗体结构域，将所述延长半衰期的蛋白或肽被进一步格式化，以增加它的流体动力学尺寸。
18. 根据任一项前述权利要求所述的组合物，其中所述融合体或缀合物包含另外的肽或多肽部分。
19. 根据任一项前述权利要求所述的组合物，其中所述融合体或缀合物包含额外的dAb部分，所述dAb部分具有与选自下述的AlbudAb相同或不同的结合特异性：Dom7h-14、Dom7h-11-15或任一种Dom 7h-14-10 dAb。
20. 根据权利要求19所述的组合物，其中所述额外的dAb与Dom7h-14、Dom7h-11-15或任一种Dom 7h-14-10 dAb竞争结合。
21. 根据任一项前述权利要求所述的组合物，其中所述融合体或缀合物在人类中具有
12小时或更长、例如12-21天的消除半衰期。
22. 根据任一项前述权利要求所述的组合物，其中所述融合体或缀合物以在约5微摩尔至约1皮摩尔范围内的KD结合人血清白蛋白。
23. 一种药物组合物，其包含与药学上或生理上可接受的载体、赋形剂或稀释剂相组合的根据任一项前述权利要求所述的组合物。
24. 根据权利要求23所述的组合物，其包含其它治疗剂或活性剂。
25. 一种组合物，所述组合物包含（a）根据权利要求1-24中任一项所述的组合物，和（b）其它治疗剂或活性剂；它们用于分开地、相继地或并行地施用给受试者。
26. 一种组合物，所述组合物包含2种或更多种根据权利要求3或6所述的融合体或缀合物作为组合的制备物，用于同时地、分开地或相继地用于治疗中，所述融合体或缀合物各自包含下述分子，或由其组成：（a）一个或多个促胰岛素分子和/或肠降血糖素和/或肠肽分子，其作为与（b）的融合体或缀合物存在，（b）特异性地结合血清白蛋白的结构域抗体（dAb）。
27. 根据任一项前述权利要求所述的组合物，其用于治疗或预防代谢性疾病或障碍。
28. 根据权利要求27所述的组合物，其中所述疾病或障碍选自：高血糖症、葡萄糖耐受不良、β细胞缺乏、糖尿病（I型或II型糖尿病或妊娠糖尿病）、肥胖症、特征在于进食过量的疾病。
29. 根据权利要求1-28中任一项所述的组合物在药物制备中的应用，所述药物用于治疗或预防代谢性疾病或障碍。
30. 根据权利要求1-28中任一项所述的组合物在药物制备中的应用，所述药物用于通过皮下、静脉内或肌肉内注射递送给受试者。
31. 根据权利要求1-28中任一项所述的组合物在药物制备中的应用，所述药物用于肠胃外、口服、直肠、透粘膜、皮下注射、眼、肺或胃肠道递送。
32. 一种治疗或预防代谢病的方法，所述方法包括，给患者施用治疗或预防有效量的根据权利要求1-28中任一项所述的组合物。
33. 一种口服的、可注射的、可吸入的或可雾化的制剂，其包含根据权利要求1-28中任一项所述的组合物。
34. 一种栓剂形式的持续释放制剂，其包含根据权利要求1-28中任一项所述的组合物。
35. 一种冷冻干燥制剂，其包含根据权利要求1-28中任一项所述的组合物。
36. 一种递送装置，其包含根据权利要求1-28中任一项所述的组合物。
37. 一种分离的或重组的核酸，其编码根据权利要求1-28中任一项所述的融合体。
38. 一种核酸，其编码根据权利要求15所述的融合体。
39. 一种载体，其包含根据权利要求37或38所述的核酸。
40. 一种非胚胎宿主细胞，其包含根据权利要求37或38所述的核酸或根据权利要求
39所述的载体。
41. 一种治疗或预防患者的与高血糖有关的代谢性疾病或障碍的方法，所述方法包括，给所述患者施用治疗或预防有效量的根据权利要求1-28中任一项所述的组合物。
42. 根据权利要求41所述的方法，其中所述疾病或障碍选自：高血糖症、葡萄糖耐受不良、β细胞缺乏、糖尿病（I型或II型糖尿病或妊娠糖尿病）、肥胖症、特征在于进食过量的疾病。
43. 一种在患者中刺激胰岛素产生和/或增加胰岛素敏感性的方法，所述方法包括，给所述患者施用至少一个剂量的根据权利要求1-28中任一项所述的组合物。
44. 一种治疗或预防肿瘤生长、例如胰腺肿瘤生长的方法，所述方法包括，给所述患者施用治疗或预防有效量的根据权利要求1-28中任一项所述的组合物；或包含PYY和AlbudAb的单个融合体或缀合物，例如本文所述那些中的任一种。
45. 一种治疗或预防胰腺炎的方法，所述方法包括，给所述患者施用治疗或预防有效量的根据权利要求1-28中任一项所述的组合物；或包含PYY和AlbudAb的单个融合体或缀合物。
46. 根据权利要求44或45所述的方法，其中所述PYY是3-36 PYY，且所述AlbudAb是本文所述那些中的任一种。

说明书全文

具有延长的半衰期的药物融合体和缀合物

[0001] 本发明涉及具有改良的血清半衰期的药物融合体和缀合物。这些融合体和缀合物包含免疫球蛋白（抗体）单个可变结构域和促胰岛素(insulinotropic)分子和/或肠降血糖素(incretin)和/或肠肽(gut peptide)分子。本发明另外涉及包含这样的药物融合体和缀合物的应用、制剂、组合物和装置。本发明也涉及组合物，其包含超过一个作为融合体或缀合物的一部分而存在的促胰岛素分子和/或肠降血糖素和/或肠肽分子，也涉及所述组合物的应用和制剂。

背景技术

[0002] 许多药物具有能用于治疗和/或诊断目的的活性，但由于给药时，它们迅速地从机体清除，因此具有有限的价值。例如，许多具有治疗用途活性的多肽通过肾脏迅速地从循环中清除。因此，为了获得想要的治疗效果或频繁的给药方案，必须施用大剂量。需要具有改良的药代动力学性质的改良的治疗剂和诊断剂。

[0003] 一类这样的在体内或体循环中具有短半衰期的药物是肠降血糖素激素诸如胰高血糖素-样肽1以及艾塞那肽（exendin）（例如艾塞那肽-4）和其它肠肽诸如PYY。

[0004] 胰高血糖素-样肽（GLP）-1是一种肠降血糖素激素，具有有效的葡萄糖-依赖性的促胰岛素作用和胰高血糖素抑制（glucagonostatic）作用、对胰腺β细胞的营养作用和对胃肠分泌和运动的抑制作用，这些结合起来来降低血浆葡萄糖和减小血糖波动幅度。此外，通过其提高饱腹感的能力，GLP-1会降低摄食量，因此限制体重增加，甚至可以引起体重减轻（Drucker (2002) Gastroenterology 122:531-544, Giorgiano等人 (2006) Diabetes Research and Clinical Practice 74:S152-155), Holt (2002) Diabetes/Metabolism Research and Reviews 18:430-441）。总之，这些作用会赋予GLP-1独特的特征，被认为用作抗糖尿病剂是相当理想的，特别是由于其抗高血糖作用的葡萄糖依赖性会使严重低血糖的任何风险最小化。然而，它的药代动力学/药效动力学特征使得天然GLP-1在治疗上是无用的。因此，尽管连续给药时GLP-1最有效，但是单次皮下注射具有短期效果。GLP-1对体内酶降解是高度敏感的，二肽基肽酶IV（DPP-IV）的裂解可能是最相关的，因为这快速发生，并产生非促胰岛素的代谢物（Metlein (1999) Regulatory Peptides85:9-244）。因此，基于对影响其代谢稳定性和药代动力学/药效动力学特征的因素的理解，利用GLP-1的治疗潜能的策略已经成为热切研究的焦点。

[0005] 已经进行了广泛的工作，尝试以使其降解减缓同时仍然保持生物活性的方式抑制肽酶或修饰GLP-1。WO05/027978公开了具有延长作用特征的GLP-1衍生物。WO02/46227公开了异种融合蛋白，其包括与GLP-1或类似物融合的多肽（例如，白蛋白）（这些类似物的公开内容通过引用并入本文，作为可用于本发明中的GLP-1类似物的实例）。WO05/003296、WO03/060071、WO03/059934公开了氨基融合蛋白，其中GLP-1已经与白蛋白融合，以尝试增加激素的半衰期。

[0006] 肽YY是由神经内分泌细胞响应于饲喂而释放的一种短（36个氨基酸）蛋白。循环中的PYY浓度在餐后增加，并在禁食时降低。它通过NPY受体发挥它的作用，从而抑制胃能动性和增加结肠中的水和电解质吸收。它由回肠和结肠中的神经内分泌细胞响应于膳食而分泌，且已经被证实会减少食欲（Ballantyne (2006) Obesity Surgery 16:651-658, Batterham (2003) New England Journal of Medicine 349:941-8, Boey等人 (2007) Peptides 28:390-395, 和Karra等人 (2009) Journal of Physiology 587:19-25）。

[0007] 艾塞那肽-4是在钝尾毒蜥（Gila monster）的唾液中发现的一种激素。它是GLP-1的激动剂，并且还具有非常有效的促胰岛素效应。与GLP-1相比，艾塞那肽-4具有远远更长的体内半衰期。

[0008] 在葡萄糖代谢和胰岛素分泌的调节中，它表现出与人胰高血糖素-样肽-1（GLP-1）类似的生物学性质。艾塞那肽-4会增加胰腺β-细胞的葡萄糖-依赖性的胰岛素分泌，抑制不适当地升高的胰高血糖素分泌，并减慢胃排空（DeFronzo等人(2005）Diabetes Care 28:5:1092-100, Edwards等人 (2001）American Journal of Physiology:Endocrinology and Metabolism 281:E155-162, Kolterman等人 (2003）Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 88(7）:3082-9, 和Nielsen等人(2004）Regulatory Peptides 117:77-88）。

[0009] 在医学领域，存在对改良的组合物的巨大需求，所述组合物包含肠降血糖素和/或促胰岛素剂和/或肠肽剂（诸如GLP-1肽、PYY、艾塞那肽）或具有促胰岛素作用和/或肠降血糖素作用和/或减食欲作用的其它药剂，且其可以用于医学中，例如用于治疗和/或预防代谢病症诸如糖尿病和肥胖症。

[0010] 因而需要提供新的治疗性组合物，其包含含有肠降血糖素/促胰岛素分子/肠肽的药剂（例如GLP-1、艾塞那肽-4、PYY），以提供更有效的和更长持续时间的体内作用，同时维持它们的低毒性和治疗益处。

发明内容

[0011] 本发明因而提供了：（a）组合物，所述组合物包含单个分子（例如单个融合体或缀合物）（或由其组成），所述单个分子包含选自肠降血糖素和/或促胰岛素剂和/或肠肽的分子的组合（即2种或更多种），它们例如作为融合体（化学的或遗传的）或作为缀合物存在；或者，（b）组合物，所述组合物包含2种或更多种单独的分子，其中每种单独的分子包含一种或多种肠降血糖素和/或促胰岛素剂和/或肠肽。这些组合物（a）和/或（b）也可以包含其它蛋白或多肽，例如延长半衰期的蛋白或多肽或肽，例如其可以结合血清白蛋白（例如人血清白蛋白），例如dAb（结构域抗体），例如结合血清白蛋白（例如人血清白蛋白）的dAb（Albudab™）。

[0012] 在一个实施方案中，本发明提供了一种组合物，所述组合物包含单个融合体（化学的或遗传的）或单个缀合物分子（或由其组成），其中所述融合体或缀合物包含下述分子，或由其组成：（a）2种或更多种分子，所述分子选自：促胰岛素分子和/或肠降血糖素分子和/或肠肽（例如肽YY (PYY)肽、3-36 PYY、艾塞那肽-4、GLP例如GLP-1例如GLP-1 (7-37) A8G突变体），它们作为与（b）的单个融合体或缀合物存在，（b）结构域抗体（dAb），其特异性地结合血清白蛋白（例如DOM 7h-14 (Vk)结构域抗体（dAb）（DOM 7h-14的氨基酸序列显示为图1（h）: SEQ ID NO 8），或例如DOM 7h-14 -10(Vk)结构域抗体（dAb）（DOM 7h-14-10的氨基酸序列显示为图1（o）: SEQ ID NO 15，或DOM 7h-11-15（DOM 7h-11-15的氨基酸序列显示为图1（P）: SEQ ID NO 16），或例如具有R108C突变的DOM 7h-14 -10(Vk)结构域抗体（dAb）（DOM 7h-14-10 R108C的氨基酸序列显示为图1（r）SEQ ID NO 18），或例如DOM 7h-11 -15(Vk)结构域抗体（dAb），或例如具有R108C突变的DOM 7h-11 -15(Vk)结构域抗体（dAb）（DOM 7h-11-15 R108C的氨基酸序列显示为图1（t）: SEQ ID NO 47）。在一个实施方案中，所述融合体或缀合物不是2xGLP-1 (7-37) A8G DOM7h-14 dAb融合体（DAT0114，具有图1（a）: SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列）。

[0013] 在另一个实施方案中，所述单个融合体或缀合物包含下述分子，或由其组成：PYY（例如PYY 3-36）和艾塞那肽（例如艾塞那肽-4）和一种或多种结合血清白蛋白（例如人血清白蛋白）的dAb，例如本文所述的Albudab™中的任一种。在一个实施方案中，所述单个融合体具有图1（u）: SEQ ID NO 48所示的氨基酸序列。

[0014] 在另一个实施方案中，本发明另外提供了组合物，以及当它们单独施用时或与任意合适的药用赋形剂或添加剂一起配制时，它们的应用（例如用于本文中关于组合所述的任意用途）；所述组合物包含本文所述的或公开的单独的融合体或缀合的分子中的任一种，或由其组成。

[0015] 本发明也提供了核酸，其编码本文所述的任意单独的融合体。

[0016] 在上述方面的一个实施方案中，所述肠降血糖素/促胰岛素分子/肠肽分子可以是不同的肠降血糖素/促胰岛素分子/肠肽分子，或它们可以是相同的。结合血清白蛋白的TMdAb（即AlbudAb ）也可以是在例如WO 2006/059106或WO 05/118642或WO 2008096158或PCT/EP2009/053640或USSN 61/163,990中描述或提及的那些中的任一种。

[0017] 在另一个实施方案中，本发明另外提供了一种组合物，所述组合物包含2种或更多种单独的融合体或缀合物（或由其组成），且其中每种单独的融合体或缀合物包含下述分子，或由其组成：（a）一种或多种分子，所述分子选自：促胰岛素分子和/或肠降血糖素分子和/或肠肽（例如PYY肽、3-36 PYY、艾塞那肽-4、GLP例如GLP-1例如GLP-1 (7-37) A8G突变体），它们作为与（b）的融合体或缀合物存在，（b）结构域抗体（dAb），其特异性地结合血清白蛋白（例如DOM 7h-14 (Vk)结构域抗体（dAb）（DOM 7h-14的氨基酸序列显示为图1（h）: SEQ ID NO 8），或例如DOM 7h-14 -10(Vk)结构域抗体（dAb）（DOM 7h-14-10的氨基酸序列显示为图1（o）: SEQ ID NO 15，或DOM 7h-11-15（DOM 7h-11-15的氨基酸序列显示为图1（P）: SEQ ID NO 16），或例如具有R108C突变的DOM 7h-14 -10(Vk)结构域抗体（dAb）（DOM 7h-14-10 R108C的氨基酸序列显示为图1（r）SEQ ID NO 18），或例如DOM
7h-11 -15(Vk)结构域抗体（dAb），或例如具有R108C突变的DOM 7h-11 -15(Vk)结构域抗体（dAb）（DOM 7h-11-15 R108C的氨基酸序列显示为图1（t）: SEQ ID NO 47）。在一个实施方案中，该组合物可以包含一种或多种选自下述的分子：在图1a-1g和图1m-1V和还在图3中的那些，还有以及Dom7h-11-15 (R108C) - PEG - 3-36 PYY（赖氨酸在位置10）分子（其具有图3所示的结构，但是所述AlbudAb组分是Dom7h-11-15 (R108C) AlbudAb）。

[0018] 这样的包含2种或更多种如上所述的融合体或缀合物（或由其组成）的组合物可以是组合的制备物，所述制备物用于同时地、分开地或相继地用于治疗中，例如用于治疗或预防代谢病，诸如高血糖症、葡萄糖耐受不良、β细胞缺乏、糖尿病（例如I型或II型糖尿病或妊娠糖尿病）、非酒精性脂肪变态性肝病（steatotic liver disease）、多囊卵巢综合征、高脂血症或肥胖症或特征在于进食过量的疾病，和/或用于调节能量消耗。

[0019] 当一起或顺序地施用时，本发明的融合体或缀合物可以表现出协同作用（协同作用是指，当施用时它们的作用超过当单独施用时各自的简单累加作用），例如作为组合的制备物，用于同时地、分开地或相继地用于治疗中，例如用于治疗或预防代谢病，诸如高血糖症、葡萄糖耐受不良、β细胞缺乏、糖尿病（例如I型或II型糖尿病或妊娠糖尿病）、非酒精性脂肪变态性肝病、多囊卵巢综合征、高脂血症或肥胖症或特征在于进食过量的疾病，和/或用于调节能量消耗。

[0020] 协同作用也可以源自超过一个肠降血糖素或促胰岛素分子或肠肽在一个分子上的存在，或源自AlbudAb和肠降血糖素或促胰岛素分子或肠肽的相互作用。

[0021] 在根据本发明的任一种组合物中，所述肠降血糖素和/或促胰岛素分子和/或肠肽可以选自例如：PYY肽，例如3-36或13-36；艾塞那肽-4，GLP例如GLP-1例如GLP-1 (7-37) A8G突变体，或它们可以是这些肽的突变体、类似物或衍生物，例如它们可以保留肠降血糖素/促胰岛素活性。GLP、PYY、艾塞那肽可以是在WO 2006/059106中描述的那些中的任一种。这些肽的突变体、类似物或衍生物可以是保留肠降血糖素和/或促胰岛素活性的那些。

[0022] 当作为与dAb的融合体（或缀合物）存在时，促胰岛素分子和/或肠降血糖素和/或肠肽分子（例如PYY、艾塞那肽、GLP-1等）可以连接至所述dAb的N-端或C-端，或连接在dAb序列内的某点处。在一个实施方案中，一种或多种肠降血糖素和/或促胰岛素分子和/或肠肽分子作为与dAb的N端的融合体（或缀合物）存在，并且一种或多种肠降血糖素和/或促胰岛素分子和/或肠肽分子也作为与dAb的C端的融合体（或缀合物）存在。

[0023] 氨基酸连接物或化学连接物也可以任选地存在，其连接促胰岛素分子和/或肠降血糖素和/或肠肽分子（例如艾塞那肽-4和/或GLP-1）与例如dAb。所述连接物可以是例如螺旋连接物，例如图1（k）: SEQ ID NO 11所示的序列的螺旋连接物，或它可以是gly-ser连接物，例如具有在图1（l）: SEQ ID NO 12中所示的氨基酸序列。

[0024] 或者，所述连接物可以是例如PEG连接物，例如在图3中所示的PEG连接物。

[0025] 在某些实施方案中，本发明的融合体（或缀合物）可以包含其它分子，例如其它肽或多肽。

[0026] 在一个实施方案中，本发明提供了一种组合物，所述组合物包含下述2种单独的分子，或由其组成：（a）遗传融合体，它是：艾塞那肽-4、(G4S)3连接物、7h-14 AlbudAb（DAT 0115，其具有在图1b:SEQID NO 2中所示的氨基酸序列）；和
（b）肽缀合物，它是：经由赖氨酸（导入在PYY的第10位）和4个重复的PEG连接物与C-端酰胺化的PYY3-36缀合的Dom7h-14-10 (R108C) AlbudAb。直线代表连接物，该连接物共价地连接至Dom7h-14-10 (R108C) AlbudAb的游离C端半胱氨酸和在PYY序列的第10位处的赖氨酸。该肽缀合物的氨基酸序列和结构如下（且也显示在图3中）：
（SEQ ID NO 37）
其中Dom7h-14-10(R108C)的C端半胱氨酸通过连接物共价地连接至PYY肽中的赖氨
酸上。

[0027] 所述化学连接物具有下述结构：上述两种分子可以作为组合的制备物存在，所述制备物适合同时地、分开地或相继地用于本文所述的治疗中：（a）遗传融合体，它是：艾塞那肽-4、(G4S)3连接物、7h-14 AlbudAb（DAT 0115，其具有在图1b中所示的氨基酸序列）；和（b）肽缀合物，它是：经由赖氨酸和4个重复的PEG连接物与PYY3-36缀合的Dom7h-14-10 (R108C) AlbudAb（其具有图3所示的结构）。

[0028] 或者，在上述的组合物中，所述肽缀合物（b）（其具有图3所示的结构）可以被下述分子替换：Dom7h-11-15 (R108C) - PEG - 3-36 PYY（赖氨酸在第10位）（其具有图3所示的结构，但是所述AlbudAb组分是Dom7h-11-15 (R108C)）。

[0029] 在另一个替代方案中，在上述的组合物中，所述肽缀合物（b）（其具有图3所示的结构）可以被下述分子替换：具有图1（v）: SEQ ID NO 49所示的氨基酸序列的PYY-Dom7h-14-10融合体。

[0030] 在另一个实施方案中，本发明提供了一种组合物，所述组合物包含下述分子，或由其组成：PYY（例如PYY 3-36）和艾塞那肽（例如艾塞那肽-4）和一种或多种AlbudAb，例如本文所述的任一种AlbudAb。在一个实施方案中，所述单个融合体具有图1（u）: SEQ ID NO 48所示的氨基酸序列。

[0031] Dom 7h-14是结合血清白蛋白的人免疫球蛋白单个可变结构域或dAb (Vk)，且它的氨基酸序列如图1（h）: SEQ ID NO 8所示。Dom7h-14 dAb的CDR区在图1（h）: SEQ ID NO 8所示的氨基酸序列中标有下划线。

[0032] Dom 7h-14-10是结合血清白蛋白的人免疫球蛋白单个可变结构域或dAb (Vk)，且它的氨基酸序列如图1（o）: SEQ ID NO 15所示。Dom7h-14-10 dAb的CDR区在图1（o）: SEQ ID NO 15所示的氨基酸序列中标有下划线。

[0033] Dom 7h-11-15是结合血清白蛋白的人免疫球蛋白单个可变结构域或dAb (Vk)，且它的氨基酸序列如图1（p）: SEQ ID NO 16所示。Dom7h-11-15 dAb的CDR区在图1（p）: SEQ ID NO 16所示的氨基酸序列中标有下划线。

[0034] 具有R108C突变的Dom 7h-14-10是结合血清白蛋白的人免疫球蛋白单个可变结构域或dAb (Vk)，且它的氨基酸序列如图1（R）: SEQ ID NO 18所示。

[0035] 具有R108C突变的Dom 7h-11-15是结合血清白蛋白的人免疫球蛋白单个可变结构域或dAb (Vk)，且它的氨基酸序列如图1（t）所示。

[0036] R108C突变表示这样的突变，其中在未突变序列中的C端精氨酸被半胱氨酸替换，且在本发明的一个方面，本文所述的任一种AlbudAb可以具有该突变。

[0037] 本文使用的“融合体”表示这样的融合蛋白：其包含结合血清白蛋白的dAb作为第一部分，且包含促胰岛素分子和/或肠降血糖素和/或肠肽分子作为其他部分。所述结合血清白蛋白的dAb和所述促胰岛素分子和/或肠降血糖素和/或肠肽分子可以作为单个连续多肽链的离散部件（部分）存在。所述dAb和肠降血糖素/ 促胰岛素分子/肠肽部分可以通过肽键直接互相键合，或通过合适的氨基酸或肽或多肽连接物相连。在适当时，可以存在其它部分，例如肽或多肽（例如第三、第四）和/或连接物序列。所述dAb可以是在相对于所述肠降血糖素/促胰岛素分子/肠肽分子的N-端位置、C-端位置或内部。在某些实施方案中，所述融合蛋白含有一个或超过一个（例如1个至约20个）dAb部分。

[0038] 本文使用的“缀合物”表示这样的组合物：其包含结合血清白蛋白的dAb，促胰岛素分子/肠降血糖素/肠肽分子与所述dAb共价地或非共价地键合。所述促胰岛素分子/ 肠降血糖素/肠肽分子可以直接地或通过合适的连接物部分间接地共价键合所述dAb。所述促胰岛素分子/ 肠降血糖素/肠肽分子可以键合在dAb的任意合适的位置（诸如氨基-端、羧基-端），或通过合适的氨基酸侧链（例如，赖氨酸的ε氨基，或半胱氨酸的硫醇基，无论是天然存在的还是工程化的）进行键合。或者，所述促胰岛素分子/ 肠降血糖素/肠肽分子可以直接地（例如，静电相互作用、疏水相互作用）或间接地（例如，通过互补的结合配偶体（例如，生物素和抗生物素蛋白）的非共价结合，其中一个配偶体共价地键合促胰岛素分子/ 肠降血糖素分子，且互补的结合配偶体共价地键合所述dAb）非共价地键合所述dAb。所述dAb可以是在相对于所述肠降血糖素/促胰岛素分子/肠肽分子的N-端位置、C-端位置或内部。在某些实施方案中，所述缀合物蛋白含有一个或超过一个（例如1个至约20个）dAb部分。

[0039] 本发明也提供了组合物，所述组合物包含编码本文所述的融合体的核酸，例如，包含在图2中所示的核酸。

[0040] 也提供了包含这些核酸的宿主细胞，例如非-胚胎宿主细胞，例如原核或真核（诸如哺乳动物）宿主细胞，诸如大肠杆菌或酵母宿主细胞。

[0041] 本发明另外提供了一种生产本发明的融合体的方法，所述方法包括：在适合表达所述重组核酸的条件下，维持宿主细胞，诸如上述的那些，所述宿主细胞包含编码本发明的融合体的重组核酸和/或构建体，由此生产融合体。

[0042] 本发明也提供了药物组合物，其包含本发明的组合物。

[0043] 本发明另外提供了本发明的组合物，其用于医学中，例如用于治疗例如代谢性疾病或病症，诸如高血糖症、葡萄糖耐受不良、β细胞缺乏、糖尿病（例如1型或2型糖尿病或妊娠糖尿病）、非酒精性脂肪变态性肝病、多囊卵巢综合征、高脂血症或肥胖症或特征在于进食过量的疾病（例如它可以用于抑制食欲或调节能量消耗）、胰腺炎，也用于预防肿瘤生长例如胰腺肿瘤生长（例如胰腺癌），且所述用途包括：给所述个体施用治疗有效量的本发明的组合物。本发明也提供了包含本文所述的任一种PYY AlbudAb的组合物（无论单独使用，还是联合使用），其用于治疗和/或预防胰腺炎，也用于预防肿瘤生长例如胰腺肿瘤生长（例如胰腺癌）。

[0044] 本发明也提供了一种治疗个体的方法，所述个体具有疾病或障碍，诸如本文所述的那些，例如代谢性疾病或病症，诸如高血糖症、葡萄糖耐受不良、β细胞缺乏、糖尿病（例如1型或2型糖尿病或妊娠糖尿病）、非酒精性脂肪变态性肝病、多囊卵巢综合征、高脂血症或肥胖症或特征在于进食过量的疾病（例如它可以用于抑制食欲或调节能量消耗）、胰腺炎，也用于预防肿瘤生长例如胰腺肿瘤生长（例如胰腺癌），也用于预防肿瘤生长例如胰腺肿瘤生长；所述方法包括：给所述个体施用治疗有效量的本发明的组合物。

[0045] 根据本发明可以治疗或预防的其它代谢性疾病或病症包括、但不限于：胰岛素抗性、胰岛素缺乏、超高胰岛素血症、高血糖症、血脂异常、高脂血症、高酮血症、高胰增血糖素血症、高血压、冠状动脉疾病、动脉粥样硬化、肾衰竭、神经病（例如，自主神经病、副交感神经神经病和多神经病）、视网膜病变、白内障、代谢障碍（例如，胰岛素和/或葡萄糖代谢障碍）、内分泌障碍、肥胖症、体重减轻、肝障碍（例如，肝病、肝脂肪变态、肝硬化和与肝移植有关的障碍）和与这些疾病或障碍有关的病症。

[0046] 另外，使用本发明的化合物可以预防或治疗的与糖尿病有关的病症包括、但不限于：高血糖症、肥胖症、糖尿病视网膜病变、单神经病、多神经病、动脉粥样硬化、溃疡、心脏病、中风、贫血、坏疽（例如，脚和手的坏疽）、阳痿、感染、白内障、肾功能减退、自主神经系统功能失常、受损的白细胞功能、腕管综合征、Dupuytren挛缩和糖尿病酮症酸中毒。

[0047] 本发明也提供了用于治疗或预防与高血糖有关的疾病的方法，所述方法包括：给患者或受试者施用至少一剂量的本发明的组合物，例如药物组合物。

[0048] 当在本申请中述及患者或受试者时，这可以是指人或非人患者或受试者。

[0049] 本发明另外涉及：使用本发明的缀合物或融合体，调节患者中的胰岛素响应性的方法，以及增加细胞的葡萄糖摄取的方法，和调节细胞的胰岛素敏感性的方法。也提供了刺激胰岛素合成和释放的方法，增强脂肪、肌肉或肝组织对胰岛素摄取的敏感性的方法，刺激葡萄糖摄取的方法，减慢消化过程的方法，减少食欲的方法，调节能量消耗的方法，或阻断患者中胰高血糖素的分泌的方法，所述方法包括：给所述患者施用本发明的组合物，例如施用至少一剂量的本发明的组合物，例如药物组合物。

[0050] 本发明的组合物（例如药物组合物）可以单独施用，或与其它分子或部分联合施TM用，所述其它分子或部分例如：多肽、治疗蛋白（例如Albiglutide ，它是与人血清白蛋白分子共价连接的2个GLP-1分子）和/或分子（例如，胰岛素和/或其它蛋白（包括抗体）、肽或小分子，它们调节患者中的胰岛素敏感性、体重、心脏病、高血压、神经病、细胞代谢和/或葡萄糖、胰岛素或其它激素水平）。在具体实施方案中, 本发明的缀合物或融合体与胰岛素（或胰岛素衍生物、类似物、融合蛋白或促分泌剂）联合施用。

[0051] 本发明也提供了本发明的组合物，其用于治疗疾病或障碍，诸如上述那些中的任一种，例如代谢障碍，诸如高血糖症、胰腺炎、糖尿病（1或2型糖尿病，或妊娠糖尿病）或肥胖症或特征在于肠运动过度的疾病，且也用于预防肿瘤生长例如胰腺肿瘤生长（例如胰腺癌）。

[0052] 本发明也提供了本发明的组合物用于生产药剂的应用，所述药物用于治疗疾病或障碍，诸如上述那些中的任一种，例如代谢障碍，诸如高血糖症、糖尿病（1或2型或妊娠糖尿病）或肥胖症、胰腺炎或特征在于肠运动过度的疾病，以及例如胰腺肿瘤生长（例如胰腺癌）。

[0053] 本发明也涉及本文所述的组合物用于治疗、诊断或预防的应用。

[0054] 本发明的组合物（例如组合物的dAb组分）可以进一步格式化（formatted）成具有更大的流体动力学尺寸，以进一步延长半衰期，例如，通过连接PEG基团、血清白蛋白、转铁蛋白、转铁蛋白受体或至少其转铁蛋白-结合部分、抗体Fc区域，或通过缀合抗体结构域。例如，结合血清白蛋白的dAb可以格式化成抗体的更大抗原结合片段（例如，格式化成Fab、Fab’、F(ab)2、F(ab’)2、IgG、scFv）。

[0055] 在本公开内容描述的本发明的其它实施方案中，作为在本发明的融合体中使用“dAb”的替代，预见到，技术人员可以使用这样的结构域，其包含特异性地结合血清白蛋白的dAb的CDR，例如结合血清白蛋白的Dom7h-14或Dom 7h-14-10或Dom 7h-14-10 R108C的CDR（例如，所述CDR可以移植到合适的蛋白支架或骨架上，例如affibody、SpA支架、LDL受体A类结构域或EGF结构域）。本公开内容作为整体应当相应地解释，以提供这样的替代dAb的结构域的公开。

[0056] 在某些实施方案中，本发明提供了根据本发明的组合物，其包含双-特异性配体或多-特异性配体，所述配体包括根据本发明的第一dAb（其结合血清白蛋白，例如本文所述那些中的任一种，例如Dom7h-14）和第二dAb（其具有与第一dAb相同或不同的结合特异性）和任选地在多-特异性配体的情况下的其它dAb。第二dAb（或其它dAb）可以任选地结合不同的靶物，例如FgFr 1c或CD5靶物。

[0057] 在本发明的其它实施方案中，所述dAb组分可以是在WO 2008096158或WO05118642中公开的任一种dAb，它们的细节通过引用并入本文。

[0058] 因而，在一个方面，本发明提供了用于通过肠胃外给药来递送的本发明的组合物，所述肠胃外给药例如：通过皮下注射、肌肉内注射或静脉内注射、吸入、鼻递送、透粘膜（例如舌下）递送、经皮递送、透皮递送、经口递送、递送至患者的胃肠道、直肠递送或眼递送。在一个方面，本发明提供了本发明的融合体或缀合物在药物制备中的应用，所述药物用于下述递送：皮下注射、或肌肉内递送、透皮递送、吸入、静脉内递送、鼻递送、透粘膜递送、经口递送、递送至患者的胃肠道、直肠递送或眼递送。

[0059] 在一个方面，本发明提供了通过皮下注射、肌肉内注射或静脉内注射、吸入、鼻递送、透粘膜（例如舌下）递送、经皮递送、透皮递送、经口递送、递送至患者的胃肠道、直肠递送或眼递送来递送给患者的方法，其中所述方法包括：给患者施用药学有效量的本发明的融合体或缀合物。

[0060] 在一个方面，本发明提供了口服的、可注射的、可吸入的、可雾化的、局部的或眼的制剂，其包含本发明的融合体或缀合物。所述制剂可以是片剂、丸剂、胶囊、液体或糖浆剂或软膏剂。在一个方面，所述组合物可以口服给药，例如作为饮料，例如作为用于治疗肥胖的体重减轻饮料来销售。在一个方面，本发明提供了一种用于直肠递送给患者的制剂，所述制剂可以提供为例如栓剂。

[0061] 例如，可以如在WO 03/002136（通过引用并入本文）中所述，制备用于GLP-1化合物的肠胃外给药的组合物。

[0062] 例如，通常可以如在欧洲专利号272097（授权给Novo Nordisk A/S）或在WO93/18785（都通过引用并入本文）中所述，制备用于某些肽的鼻给药的组合物。

[0063] 术语“受试者”或“个体”在本文中被定义为包括动物，如哺乳动物，包括、但不限于，灵长类动物（例如人）、牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔子、豚鼠、大鼠、小鼠或其它牛科、羊科、马科、犬科、猫科、啮齿动物或鼠科物种。

[0064] 本发明也提供了一种试剂盒，其用于将根据本发明的组合物施用给受试者（例如，人患者），所述试剂盒包含本发明的组合物、药物递送装置和任选的使用说明书。所述组合物可以提供为制剂，诸如冷冻干燥的制剂。在某些实施方案中，所述药物递送装置选自：注射器、笔式注射装置、吸入器、鼻内或眼给药装置（例如，mister、眼或鼻滴管）和无针注射装置。

[0065] 本发明的组合物（例如缀合物或融合体）可以低压冻干（lyophilized）进行储存，并在使用前在合适的载体中重构。可以使用任意合适的低压冻干方法（例如，喷雾干燥、饼干燥）和/或重构技术。本领域技术人员会理解，冷冻干燥和重构可以导致不同程度的抗体活性损失，且可能必须调节使用水平来补偿。在一个具体实施方案中，本发明提供了一种组合物，其包含本文所述的低压冻干的（冷冻干燥的）组合物。优选地，低压冻干的（冷冻干燥的）组合物在再水合时，其活性损失不超过约20%、或不超过约25%、或不超过约30%、或不超过约35%、或不超过约40%、或不超过约45%、或不超过约50%（例如，对血清白蛋白的结合活性）。活性是在低压冻干之前产生组合物效果所需要的组合物的量。例如，获得并维持希望的血清浓度希望的时间段所需要的缀合物或融合体的量。可以在低压冻干之前使用任意合适的方法测定组合物的活性，并可以在再水合之后使用相同方法测定活性，以测定损失的活性的量。

[0066] 本发明也提供了包含本发明的组合物的持续释放制剂，这样的持续释放制剂可以包含与下述物质相组合的本发明的组合物：例如透明质酸、微球或脂质体和其它药学上或药理学上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂。这样的持续释放制剂可以是例如栓剂形式。

[0067] 在一个方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含本发明的组合物和药学上或生理上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。附图说明

[0068] 图1：是下述氨基酸序列的图解：（a）DAT0114（SEQ ID NO 1），（b）DAT0115（SEQ ID NO 2），（c）DAT0116（SEQ ID NO 3），（d）DAT0117（SEQ ID NO 4），（e）DAT0118（SEQ ID NO 5），（f）DAT0119（SEQ ID NO 6）（g）DAT0120（SEQ ID NO 7）（h）Dom7h-14（SEQ ID TMNO 8）（（Albudab ））（CDR标有下划线），（i）GLP-1 7-37 A(8)G（SEQ ID NO 9），（j）艾塞那肽-4（SEQ ID NO 10），（k）螺旋连接物（SEQ ID NO 11）（l）Gly-ser连接物（SEQ ID NO
12），（m）艾塞那肽4、(G4S)3、连接物DOM7h-14-10融合体（DMS7139:SEQ ID NO 13），（n）艾塞那肽4、(G4S)3、连接物DOM7h-11-15融合体（DMS7143:SEQ ID NO 14），（o）DOM7h-14-10TM
（SEQ ID NO 15），（p）DOM7h-11-15（Albudab ）（SEQ ID NO 16），（q）OmpT AWA 信号肽（前TM
导序列）（SEQ ID NO 17），（r）DOM 7H-14-10 R108C突变体（Albudab ）（SEQ ID NO 18），（s）PYY 3-36（用PEG衍生化在10位处的赖氨酸）（SEQ ID NO 19）（t）7h-11-15R108CTM
（Albudab ）（SEQ ID NO 47）；（u）DAT0116R108C:190 PYY（SEQ ID NO 48）；（V）PYY-Dom
7h-14-10 AlbudAb的遗传融合体（SEQ ID NO 49）。

[0069] 图2：是下述核酸序列的图解：（a）DAT0114（哺乳动物构建体）（SEQ ID NO 20），（b）DAT0115（哺乳动物构建体）（SEQ ID NO 21），（c）DAT0115（为大肠杆菌构建体优化）（SEQ ID NO 22），（d）DAT0116（哺乳动物构建体）（SEQ ID NO 23），（e）DAT0116（为大肠杆菌构建体优化）（SEQ ID NO 24），（f）DAT0117（哺乳动物构建体）（SEQ ID NO 25），（g）DAT0117（为大肠杆菌构建体优化）（SEQ ID NO 26），（h）DAT0118（哺乳动物构建体）（SEQ ID NO 27），（i）DAT0119（哺乳动物构建体）（SEQ ID NO 28），（j）DAT0120（哺乳动物构建体）（SEQ ID NO 29），（k）Dom7h-14（SEQ ID NO 30），（l）艾塞那肽4、(G4S)3、连接物DOM7h-14-10融合体（DMS7139:SEQ ID NO 31），（m）艾塞那肽4、(G4S)3、连接物DOM7h-11-15融合体（DMS7143:SEQ ID NO 32）（n）Dom 7h-14-10（SEQ ID NO 33），（o）Dom 7h-11-15（SEQ ID NO 34），（p）Omp AWA信号肽（SEQ ID NO 35），（q）Dom 7h-14-10 R（108）C（SEQ ID NO 36）。

[0070] 图3：显示了一种肽缀合物，它是：经由赖氨酸和4个重复的PEG连接物与PYY3-36缀合的Dom7h-14-10 (R108C) AlbudAb。该分子用于在实施例7-9中详述的实验中。（SEQ ID NO 37）。

[0071] 图4：显示了在用肽-AlbudAb治疗的DIO小鼠中，体重随时间的变化。

[0072] 图5：显示了在用肽-AlbudAb治疗的DIO小鼠中，食物摄入随时间的变化。

[0073] 图6：显示了在用肽-AlbudAb治疗的DIO小鼠中的身体脂肪%。（基线和在第15天时）。

[0074] 图7：显示了在用肽-AlbudAb治疗的小鼠中，DIO小鼠的体脂量和瘦体重的变化（基线相对于15天）。

[0075] 图8：显示了在用肽-AlbudAb治疗的DIO小鼠中，内分泌分析物的测量结果。

[0076] 图9：显示了在用肽-AlbudAb的组合和对照治疗的DIO小鼠中，肝的组织病理学的变化。

[0077] 图10：显示了在用肽-AlbudAb治疗的db/db小鼠中，糖基化的血红蛋白A1c的测量结果。

[0078] 图11：显示了在用肽-AlbudAb治疗的db/db小鼠中% HbA1c的变化（基线相对于第16天）。

[0079] 图12：显示了在用肽-AlbudAb治疗的db/db小鼠中的血浆胰岛素水平（在第16天）。

[0080] 图13：显示了在用肽-AlbudAb治疗的db/db小鼠中，体重随时间的变化。

[0081] 图14：显示了在用肽-AlbudAb治疗的db/db小鼠中，食物摄入随时间的变化。

[0082] 图15：显示了前导序列的氨基酸序列：（a）ompA（大肠杆菌衍生的）（SEQ ID NO38），（b）ompA-AMA（人工序列）（SEQ ID NO 39），（c）ompA-AWA（人工序列）（SEQ ID NO
40），（d）ompT（大肠杆菌衍生的）（SEQ ID NO 41），（e）ompT-AMA（人工序列）（SEQ ID NO
42），（f）GAS（酿酒酵母衍生的）（SEQ ID NO 43），（g）GAS-AMA（人工序列）（SEQ ID NO
44），（h）GAS-AWA（人工序列）（SEQ ID NO 45）（i）Pel B（胡萝卜软腐欧文氏菌）（SEQ ID NO 46）。

具体实施方式

[0083] 在本说明书中已经参照实施方案描述了本发明，描述方式使得本说明书能够既清楚又简明。但是应当理解，在不偏离本发明的情况下，可以对这些实施方案进行各种组合或分开。

[0084] 除非另有说明，否则本文所用的所有科技术语都具有本领域（例如细胞培养、分子遗传学、核酸化学、杂交技术和生物化学）普通技术人员公知的相同含义。将标准技术用于分子、遗传和生化方法（一般参见Sambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版(1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.和Ausubel等, Short Protocols in Molecular Biology (1999)第4版, John Wiley & Sons, Inc.，所述文献通过引用并入本文）和化学方法。

[0085] 本文使用的术语“促胰岛素剂”（“insulinotropic agents”）是指，能够刺激激素胰岛素、或引起激素胰岛素的刺激、合成或表达或活性的化合物。促胰岛素剂的已知实例包括、但不限于：例如葡萄糖、GIP、GLP、艾塞那肽（例如艾塞那肽-4和艾塞那肽-3）、PYY（例如3-36 PYY）和OXM。

[0086] 本文使用的术语“肠降血糖素”（“incretin”）是指一类胃肠激素，其在葡萄糖水平正常时或特别是升高时，会引起释放的胰岛素的量增加。作为实例，它们包括GLP-1、GIP、OXM、VIP和PP（胰腺多肽）。

[0087] 肠肽（gut peptides）是从肠的不同部件中的不同细胞释放出的一类肽，它们提供信号传递功能，PYY也是肠肽的一个实例。

[0088] 本文关于多肽所用的术语“类似物”是指修饰的肽，其中肽的一个或更多个氨基酸残基已经被其它氨基酸残基置换，和/或其中一个或更多个氨基酸残基已经从肽删除，和/或其中一个或更多个氨基酸残基已经从肽删除，和/或其中一个或更多个氨基酸残基已经添加至肽。这样的氨基酸残基的添加或删除可以发生在肽的N-端和/或肽的C-端，或它们可以在肽内部。使用简单的系统来描述GLP-1的类似物：例如GLP-1 A8G（7-37个氨基酸）指定GLP-1类似物，其中在8位的天然存在的丙氨酸已经被甘氨酸残基置换。使用根据IUPAC-IUB命名法所用的氨基酸标准单字母缩写，描绘肽类似物及其衍生物的通式。

[0089] 当提及多肽使用时，本文使用的“片段”是具有这样氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与整个天然存在的多肽的一部分，但是并非其所有氨基酸序列相同。片段可以是“独立的”，或被包含在更大多肽内，它们作为单个更大多肽中的单个连续区域，形成所述更大多肽的一部分或区域。作为实例，天然存在的GLP-1的片段包括天然存在的氨基酸1-36的氨基酸7-36。此外，多肽的片段也可以是天然存在的部分序列的变体。例如，包含天然存在的GLP-1的氨基酸7-30的GLP-1片段也可以是在它的部分序列内具有氨基酸置换的变体。

[0090] 本发明的合适的促胰岛素剂的实例包括：GLP-1、GLP-1衍生物、GLP-1类似物、或GLP-1类似物的衍生物。另外，它们包括：艾塞那肽-4、艾塞那肽-4类似物和艾塞那肽-4衍生物或片段和艾塞那肽-3、艾塞那肽-3衍生物和艾塞那肽-3类似物、PYY PYY -1衍生物、PYY -1类似物或PYY -1类似物的衍生物、PYY片段（例如3-36和/或13-36 PYY）。

[0091] 本文使用的术语“GLP-1”是指GLP-1 (7-37)、GLP-1（7-36）、GLP-1（7-35）、GLP-1（7-38）、GLP-1（7-39）、GLP-1（7-40）、GLP-1（7-41）、GLP-1类似物、GLP-1肽、GLP-1衍生物、或GLP-1类似物的突变体或片段或衍生物。这样的肽、突变体、类似物和衍生物是促胰岛素剂。

[0092] 例如GLP-1可以是具有图1（i）: SEQ ID NO 9所示的氨基酸序列的GLP-1 (7-37) A8G突变体。

[0093] 在国际专利申请号90/11296（The General Hospital Corporation）中描述了其它GLP-1类似物，该专利申请涉及包含GLP-1（7-36）和其功能衍生物的肽片段，所述肽片段的促胰岛素活性超过GLP-1（1-36）或GLP-1（1-37）的促胰岛素活性，还涉及它们作为促胰岛素剂的应用（通过引用并入本文，特别作为用于本发明中的药物的实例）。

[0094] 国际专利申请号WO 91/11457（Buckley等人）公开了有活性的GLP-1肽7-34、7-35、7-36和7-37的类似物，它们也可以用作根据本发明的GLP-1药物（通过引用并入本文，特别作为用于本发明中的药物或药剂的实例）。

[0095] 本文使用的术语“艾塞那肽-4肽”是指艾塞那肽-4（1-39）、艾塞那肽-4类似物、艾塞那肽-4肽的片段、艾塞那肽-4衍生物、或艾塞那肽-4类似物的衍生物。这样的肽、片段、类似物和衍生物是促胰岛素剂。艾塞那肽-4（1-39）的氨基酸序列如图1（j）: SEQ ID NO 10所示。

[0096] 在PCT专利公开WO 99/25728（Beeley等人）、WO 99/25727 Beeley等人）、WO98/05351（Young等人）、WO 99/40788（Young等人）、WO 99/07404（Beeley等人）和WO
99/43708（Knudsen等人）（都通过引用并入本文，特别作为用于本发明中的药物的实例）中，描述了可用于本发明中的其它艾塞那肽-类似物。

[0097] 本文使用的术语PYY表示这样的肽YY，它是响应于饲喂而释放的一种短（36个氨基酸）蛋白。循环中的PYY浓度在餐后增加，并在禁食时降低。PYY肽的片段（例如活性片段）也可用于本发明中，例如3-36、13-36是保留活性的PYY类似物和衍生物。

[0098] 本文使用的“肽”表示通过肽键连接到一起的约2至约50个氨基酸。

[0099] 本文使用的“多肽”表示通过肽键连接到一起的至少约50个氨基酸。多肽通常包含三级结构，并折叠成功能结构域。

[0100] 本文使用的“展示系统”表示这样的系统，其中对于基于希望的特性（诸如物理的、化学的或功能的特性）的选择，可以得到多肽或肽的集合。所述展示系统可以是多肽或肽（例如，在溶液中，固定化在合适的支持物上）的合适集合。所述展示系统也可以是采用细胞表达系统（例如，在例如转化的、感染的、转染的或转导的细胞中表达核酸文库，和在细胞表面上展示编码的多肽）或无细胞表达系统（例如，乳液区室化和展示）的系统。示例性的展示系统将核酸的编码功能与所述核酸编码的多肽或肽的物理的、化学的和/或功能的特性相关联。当采用这样的展示系统时，可以选择具有希望的物理的、化学的和/或功能的特性的多肽或肽，并可以容易地分离或回收编码选择的多肽或肽的核酸。许多将核酸的编码功能与多肽或肽的物理的、化学的和/或功能的特性相关联的展示系统是本领域已知的，例如，噬菌体展示（噬菌体展示，例如噬粒展示）、核糖体展示、乳液区室化和展示、酵母展示、嘌呤霉素展示、细菌展示、在质粒上展示、共价展示等（参见，例如，EP 0436597（Dyax）, 美国专利号6,172,197（McCafferty等人）, 美国专利号6,489,103（Griffiths等人））。

[0101] 本文使用的“有功能的”（“functional”）描述了具有生物活性（诸如特异性的结合活性）的多肽或肽。例如，术语“有功能的多肽”包括通过它的抗原-结合位点结合靶抗原的抗体或其抗原结合片段。

[0102] 本文使用的“靶配体”表示被多肽或肽特异性地或选择性地结合的配体。例如，当多肽是抗体或其抗原结合片段时，靶配体可以是任意希望的抗原或表位。与靶抗原的结合依赖于有功能的多肽或肽。

[0103] 本文使用的“抗体”是指IgG、IgM、IgA、IgD或IgE或片段（例如Fab、F(ab’)2、Fv、二硫键连接的Fv、scFv、闭合构象多特异性抗体、二硫键连接的scFv、双特异抗体），无论是源自天然地产生抗体的任何物种，还是通过重组DNA技术制备；无论分离自下列哪种样品：血清、B细胞、杂交瘤、转染瘤、酵母或细菌。

[0104] 本文使用的“抗体形式”（“antibody format”）表示任意合适的多肽结构，其中可以掺入一个或更多个抗体可变结构域，从而赋予该结构对抗原的结合特异性。多种合适的抗体形式是本领域已知的，例如，嵌合的抗体、人源化的抗体、人抗体、单链抗体、双特异性的抗体、抗体重链、抗体轻链、抗体重链和/或轻链的同源二聚体和异源二聚体、任意前述物质的抗原-结合片段（例如，Fv片段（例如，单链Fv（scFv）、二硫键连接的Fv）、Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段）、单个抗体可变结构域（例如，dAb、VH、VHH、VL）和任意前述物质的修饰形式（例如，通过共价连接聚乙二醇或其它合适的聚合物或人源化的VHH进行修饰）。

[0105] 短语“免疫球蛋白单个可变结构域”表示独立于其它V区或结构域而特异性地结合抗原或表位的抗体可变结构域（VH、VHH、VL）。免疫球蛋白单个可变结构域可以以含有其它可变区或可变结构域的形式（例如，同源多聚体或异源多聚体）存在，其中其它区域或结构域不是单个免疫球蛋白可变结构域的抗原结合所必需的（即其中免疫球蛋白单个可变结构域与抗原的结合独立于另外的可变结构域）。“结构域抗体”或“dAb”与本文所用的术语“免疫球蛋白单个可变结构域”同义。“单个免疫球蛋白可变结构域”与本文所用的术语“免疫球蛋白单个可变结构域”同义。“单个抗体可变结构域”与本文所用的术语“免疫球蛋白单个可变结构域”同义。在一个实施方案中，免疫球蛋白单个可变结构域是人抗体可变结构域，但是也包括来自其它物种的单个抗体可变结构域，诸如啮齿动物（例如，如在WO 00/29004中所公开的，其内容通过引用整体并入本文）、铰口鲨和骆驼科（Camelid）VHH dAb。骆驼科VHH是这样的免疫球蛋白单个可变结构域多肽：其源自包括骆驼、美洲驼羊、羊驼、单峰骆驼和原驼在内的物种，且生产天然地缺少轻链的重链抗体。所述VHH可以是人源化的。

[0106] “结构域”是折叠的蛋白结构，它具有独立于蛋白的其余部分的三级结构。通常，结构域负责蛋白的离散的功能性质，并且在许多情况下可以添加、去除或转移给其它蛋白，而不丧失该蛋白和/或该结构域的其余部分的功能。“单个抗体可变结构域”是折叠的多肽结构域，其包含抗体可变结构域特有的序列。因此，它包括完整的抗体可变结构域和修饰的可变结构域（例如，其中一个或更多个环已经被不是抗体可变结构域特有的序列所置换），或者已被截短或包含N-端或C-端延伸的抗体可变结构域，以及至少保留全长结构域的结合活性和特异性的可变结构域的折叠片段。

[0107] 术语“文库”表示异源多肽或核酸的混合物。文库由成员组成，每个成员都具有单个多肽或核酸序列。就这一方面而言，“文库”和“集合”同义。文库成员之间的序列差异会造成文库中存在的多样性。文库可以是多肽或核酸的简单混合物的形式，或者可以是用核酸文库转化的生物体或细胞的形式，例如细菌、病毒、动物或植物细胞等。在一个实施方案中，每个单个的生物体或细胞仅含有一个或有限数目的文库成员。在一个实施方案中，将核酸掺入到表达载体中，以表达该核酸所编码的多肽。因此，在一个方面，文库可以是宿主生物体群体的形式，每个生物体含有一个或更多个表达载体拷贝，所述载体含有核酸形式的文库的单个成员，该成员可以被表达而产生其相应的多肽成员。因此，宿主生物体群体具有编码多种多肽的集合的潜力。

[0108] 本文使用的术语“剂量”表示施用给受试者的组合物的量，所述施用是一次性全部施用（单位剂量），或在确定的时间段内的2次或更多次施用。例如，剂量可以表示在1天（24小时）（日剂量）、2天、1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月或6个月或更多个月的过程中施用给受试者的融合体或缀合物的量（例如通过单次施用，或通过2次或更多次施用）。给药之间的间隔可以是任何希望的时间量。

[0109] 短语“半衰期”表示融合体或缀合物的血清或血浆浓度在体内降低50%所需要的时间，例如因为天然机制所致降解和/或清除或隔离。本发明的组合物在体内是稳定的，其半衰期因结合抵抗降解和/或清除或隔离的血清白蛋白分子（例如人血清白蛋白（HSA））而延长。这些血清白蛋白分子是天然存在的蛋白，它们本身在体内的半衰期较长。如果分子的功能活性在体内的持续时间比对延长半衰期的分子不具有特异性的类似分子更长的话，则该分子的半衰期延长。例如，将本发明的包含对人血清白蛋白（HSA）特异性的dAb和肠降血糖素和/或促胰岛素分子和/或肠肽分子（诸如GLP-1、PYY或艾塞那肽）的组合物与相同配体（其中不存在对HSA的特异性，即不结合HSA，但是结合另一种分子。例如，它可以结合细胞上第三靶物）相比较。通常，半衰期延长10%、20%、30%、40%、50%或以上。2x、3x、4x、5x、10x、20x、30x、40x、50x或以上的半衰期延长范围是可能的。或者，或另外，最高达30x、
40x、50x、60x、70x、80x、90x、100x、150x的半衰期延长范围也是可能的。

[0110] 本文使用的“流体动力学尺寸”（“hydrodynamic size”）表示，基于分子在水溶液中的扩散，分子（例如，蛋白分子、配体）的表观尺寸。可以处理蛋白在溶液中的扩散或运动，以衍生出蛋白的表观尺寸，其中所述尺寸由蛋白颗粒的“Stokes半径”或“流体动力学半径”给出。蛋白的“流体动力学尺寸”取决于质量和形状（构象），所以具有相同分子量的两种蛋白可能具有不同的流体动力学尺寸（基于蛋白的总构象）。

[0111] 如下进行两个序列之间的“同源性”或“同一性”或“相似性”（这些术语在本文可互换使用）的计算。为了最佳比较目的，比对序列（例如对于最佳比对，可以在第一和第二氨基酸或核酸序列中的一个或两个中引入缺口，为了比较目的，非同源序列可以忽略不计）。在一个实施方案中，为了比较目的所比对的参照序列的长度是参照序列长度的至少30%、或至少40%、或至少50%、或至少60%、或至少70%、80%、90%、100%。然后，比较在相应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的某个位置被与第二序列中的相应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，那么分子在该位置是相同的（本文所用的氨基酸或核酸“同源性”等同于氨基酸或核酸“同一性”）。两个序列之间的同一性百分比随考虑缺口数和各缺口长度后的序列共享的相同位置数而变化，需要引入这些缺口以进行两个序列的最佳比对。使用采用默认参数的算法BLAST 2 Sequences（Tatusova, T. A. 等人 , FEMS Microbiol Lett, 174:187-188（1999），可以准备和测定氨基酸和核苷酸序列比对以及如本文定义的同源性、相似性或同一性。

[0112] 氨基酸序列的翻译后修饰：已知氨基酸序列的翻译后修饰可以天然地发生，这些可以包括，例如去酰胺化或N端环化或残基的添加或删除。本发明因此包括由这样的翻译后修饰得到的本文公开的序列的变体，例如所述序列的去酰胺化形式。

[0113] 核酸、宿主细胞:本发明涉及分离的和/或重组的核酸，它们编码本文所述的本发明的组合物例如融合体。

[0114] 在本文中称作“分离的”核酸是已经与在它的原始环境中（例如，在细胞中，或在核酸的混合物诸如文库中）的其它物质（例如，其它核酸，诸如基因组DNA、cDNA和/或RNA）分离的核酸。分离的核酸可以分离为载体（例如，质粒）的一部分。

[0115] 在本文中称作“重组的”核酸是已经通过重组DNA方法生产的核酸，所述重组DNA方法包括依赖于人工重组的方法，诸如克隆进载体或染色体中（其中使用例如限制性酶、同源重组、病毒等），以及使用聚合酶链式反应（PCR）制备的核酸。

[0116] 本发明也涉及重组宿主细胞例如哺乳动物或微生物，其包含（一种或更多种）重组核酸或表达构建体，它们包含编码本文所述的本发明的组合物（例如融合体）的核酸。还提供了制备本文所述的本发明的组合物（例如融合体）的方法，所述方法包括：在适合表达融合多肽的条件下，维持本发明的重组宿主细胞，例如哺乳动物或微生物。如果需要，所述方法可以另外包括分离或回收融合体的步骤。

[0117] 例如，使用任意适合选定的宿主细胞的方法（例如，转化、转染、电穿孔、感染），可以将编码本发明组合物（例如本发明的融合多肽）的核酸分子（即，一个或更多个核酸分子）或包含这样的核酸分子的表达构建体（即，一个或更多个构建体）导入合适的宿主细胞中，使得所述核酸分子可操作地连接至一个或更多个表达控制元件（例如，在载体中，在通过细胞中的过程建立的构建体中，整合进宿主细胞基因组中），以制备重组宿主细胞。可以在适合表达的条件下（例如，在有诱导物存在下，在合适的动物中，在补充了适当的盐、生长因子、抗生素、营养补剂等的合适的培养基中），维持得到的重组宿主细胞，由此生产编码的肽或多肽。如果需要，可以分离或回收编码的肽或多肽（例如，从哺乳动物、动物、宿主细胞、培养基、乳汁）。该方法包括在转基因动物的宿主细胞中表达（参见，例如，WO 92/03918, GenPharm International）。随后可以进一步修饰肽或融合蛋白或缀合物，例如化学地或酶促地修饰，这是在表达宿主中、在培养基中，或在纯化过程中或纯化以后，例如通过C端的酰胺化。

[0118] 也可以在合适的体外表达系统中生产本文所述的本发明的组合物（例如融合多肽），例如通过化学合成，或通过任意其它合适的方法。

[0119] 如本文所述和例证的，本发明的组合物（例如融合体和缀合物）通常会以高亲和力结合血清白蛋白。

[0120] 例如，所述融合体或缀合物可以以约5微摩尔至约100 pM（例如约1微摩尔至约100 pM，例如400-800nm，例如约600nm）的亲和力（KD; KD=Koff (kd)/Kon (ka) [通过表面等离子体共振测定]）结合人血清白蛋白。

[0121] 可以在大肠杆菌中或在毕赤酵母物种（例如，巴氏毕赤酵母（P. pastoris））中表达本发明的组合物（例如融合体或缀合物）。在一个实施方案中，当在大肠杆菌(E. coli)中或在毕赤酵母物种（例如，巴氏毕赤酵母）中或在哺乳动物细胞培养物（例如CHO或HEK 293细胞）中表达时，以至少约0.5 mg/L的量分泌融合体。尽管当在大肠杆菌中或在毕赤酵母物种中或在哺乳动物细胞中表达时，本文所述的组合物可以是可分泌的，但是可以使用任意合适的方法来生产它们，所述方法例如合成化学方法或不采用大肠杆菌或毕赤酵母物种的生物生产方法。

[0122] 在某些实施方案中，当施用有效量时，本发明的组合物在动物模型中是有效的，所述动物模型例如在WO 2006 /059106（例如在公开的WO 2006 /059106的第104-105页）中描述的那些，或在本文的实施例中描述的那些。一般而言，有效量是约0.0001 mg/kg至约10 mg/kg（例如，约0.001 mg/kg至约10 mg/kg，例如约0.001 mg/kg至约1 mg/kg，例如约0.01 mg/kg至约1 mg/kg，例如约0.01 mg/kg至约0.1 mg/kg）。本领域技术人员公认所述疾病模型能够预测在人类中的治疗效能。

[0123] 通常，本发明的组合物以纯化形式与药理上或生理学上合适的载体一起使用。通常，这些载体可以包括水性溶液或醇/水溶液、乳剂或混悬剂，任一种包括盐水和/或缓冲介质。胃肠外媒介物可以包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠以及乳酸化的林格液。如果需要在混悬剂中维持多肽复合物的话，则可以从增稠剂中选出合适的生理上可接受的辅料，这些增稠剂例如羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、明胶和海藻酸盐、蔗糖、海藻糖、山梨醇、去污剂诸如吐温-20或吐温-80。

[0124] 静脉内的媒介物包括流体和营养补充剂和电解质补充剂，例如基于林格氏葡萄糖的那些。也可含有防腐剂和其它添加剂，例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体（Mack（1982）Remington’s Pharmaceutical Sciences, 第16版）。各种合适的制剂都可采用，包括延长释放制剂。

[0125] 根据本发明的药物组合物的给药途径可以为本领域普通技术人员公知的任何途径。对于治疗，可以根据标准技术，将本发明的药物融合体或缀合物施用给任何患者。

[0126] 可通过任何合适的方式进行施用，包括肠胃外地、静脉内地、透粘膜的递送（例如舌下）、通过皮下注射、肌肉内地、腹膜内地、口服地、透皮地、透粘膜地、通过肺途径、通过鼻递送、胃肠道递送、直肠递送或眼递送，或者在合适时用导管直接输注。给药的剂量和频率取决于患者年龄、性别和状况、同时施用的其它药物、禁忌和临床医生要考虑的其它参数。按照指示，可以局部给药或全身给药。

[0127] 本发明的组合物可以低压冻干进行储存，并在使用前在合适的载体中重构。已经证实，该技术对于常规免疫球蛋白是有效的，且可以采用本领域已知的冷冻干燥和重构技术。本领域技术人员会理解，冷冻干燥和重构可以导致不同程度的抗体活性损失（例如对于常规免疫球蛋白，IgM抗体倾向于具有比IgG抗体更大的活性损失），且可能必须向上调节使用水平来补偿。

[0128] 对于预防应用而言，例如当施用给具有前驱糖尿病或胰岛素抗性的个体时，也可以以类似或稍低的剂量施用含有本发明的融合体或缀合物的组合物，以预防、抑制或延迟疾病发作（例如，维持缓解或静止状态，或者预防急性期）。熟练的临床医生能够确定合适的给药间隔，以治疗、抑制或预防疾病。当施用本发明的组合物来治疗、抑制或预防疾病时，可以施用最多每天4次、每天1次、每周两次、每周1次、每两周1次、每月1次或每2月1次、每3个月1次、每6个月1次或以更长的间隔，剂量为例如约0.0001 mg/kg至约10 mg/kg（例如，约0.001 mg/kg至约10 mg/kg，例如约0.001 mg/kg至约1 mg/kg，例如约0.01 mg/kg至约1 mg/kg，例如约0.01 mg/kg至约0.1 mg/kg）。

[0129] 用本文所述的组合物进行的治疗被视为“有效”的条件是：相对于治疗前存在的所述征状，或者相对于未用所述组合物或其它合适对照治疗的个体（人或模型动物）中的所述征状，一种或更多种征状或征象减少或减轻（例如减轻至少10%，或在临床评价量表中的至少一个点）。尽管征状随所针对的疾病或障碍的确切性质而明显不同，但是可以由一般熟练的临床医生或技术人员进行测定。

[0130] 类似地，如果相对于未经所述组合物治疗的类似个体（人或动物模型）的所述征状，一种或更多种征状或征象的发作或严重程度延迟、减少或消除，则用本文所述的组合物进行的预防是“有效”的。

[0131] 本发明的组合物可以与其它治疗剂或活性剂（例如其它多肽或肽或小分子）结合施用。这些其它的药剂可以包括各种药物，例如二甲双胍(metformin)、胰岛素、格列酮类(glitazones)（例如罗格列酮(rosaglitazone)）、免疫抑制剂、免疫刺激剂。

[0132] 本发明的组合物可以与一种或更多种额外的治疗剂或活性剂一起施用和/或配制。当本发明的组合物与额外的治疗剂一起施用时，可以在额外的药剂之前、同时、一起或之后，施用所述融合体或缀合物。通常，以提供重叠的治疗效果的方式，施用本发明的组合物和额外的药剂。

[0133] 半衰期:促胰岛素分子和/或肠降血糖素和/或肠肽分子（例如GLP-1、PYY或艾塞那肽配体）的增加的半衰期可用于体内用途中。本发明如下解决了该问题：通过提供促胰岛素剂和/或肠降血糖素和/或肠肽药物（例如GLP和艾塞那肽）的增加的体内半衰期，并从而提供这些分子的功能活性在体内的更长持续时间。

[0134] 如本文所述，与单独的促胰岛素分子和/或肠降血糖素和/或肠肽分子相比，本发明的组合物可以具有显著延长的体内血清或血浆半衰期和/或增加的AUC和/或增加的平均停留时间（MRT）。另外，在本发明的组合物（例如，缀合物或融合体）中，促胰岛素分子和/或肠降血糖素和/或肠肽分子的活性通常基本上不改变。然而，与单独的促胰岛素分子和/或肠降血糖素和/或肠肽分子相比，本发明组合物的活性的某些变化是可接受的，且通常会被本发明组合物的改良的药代动力学性质补偿。例如，本发明的组合物可以以比单独的肠降血糖素/促胰岛素剂更低的亲和力结合靶物，但是与单独的肠降血糖素/促胰岛素剂相比具有大致等效或更优的效能，这是由于所述组合物的改良的药代动力学性质（例如，延长的体内血清半衰期、更大的AUC）。另外，由于本发明的组合物的增加的半衰期，它们可以以比单独的促胰岛素剂和/或肠降血糖素和/或肠肽药物更低的频率施用，例如它们可以每月一次或每周一次地施用给患者，并且与施用单独的促胰岛素分子和/或肠降血糖素和/或肠肽相比，它们也达到促胰岛素分子和/或肠降血糖素和/或肠肽试剂在血液中的更恒定水平，从而实现希望的治疗效果或预防效果。

[0135] 药代动力学分析方法和配体半衰期的测定方法是本领域技术人员所熟知的。细节可以参见：Kenneth, A等人: Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists, 和Peters等人, Pharmacokinetic analysis: A Practical Approach (1996)。也参见：“Pharmacokinetics”, M Gibaldi & D Perron, Marcel Dekker出版, nd2 Rev. ex edition (1982)，它描述了药代动力学参数诸如tα和tβ半衰期和曲线下面积（AUC）。

[0136] 从配体相对于时间的血浆或血清浓度曲线，可以确定半衰期（t½α和t½β）和AUC和MRT。可以使用WinNonlin分析包（可从Pharsight Corp., Mountain View, CA94040, USA得到），例如，建立曲线的模型。在第一阶段（α阶段），配体主要进行在患者中的分布，具有一些消除。第二阶段（β阶段）是末期，这时配体已经分布，且血清浓度随着配体从患者清除而降低。tα半衰期是第一阶段的半衰期，tβ半衰期是第二阶段的半衰期。另外，本领域众所周知的无分区拟合模型也可以用于确定半衰期。

[0137] 在一个实施方案中，本发明提供了根据本发明的包含融合体或缀合物的组合物，其中所述融合体或缀合物在例如人受试者中具有在下述范围内的消除半衰期：约12小时或更长，例如约12小时至约21天，例如约24小时至约21天，例如约2-8天，例如约3-4天。

[0138] 本发明的组合物（即包含本文所述的融合体和缀合物的那些）会提供几个另外的优点。所述结构域抗体组分是非常稳定的，比抗体和抗体的其它抗原-结合片段更小，可以通过在大肠杆菌或酵母（例如，巴氏毕赤酵母）或哺乳动物细胞（例如CHO细胞）中表达来高产量地生产，且可以从人来源文库或从任意希望的物种容易地选择结合血清白蛋白的抗体的抗原-结合片段。因此，可以比通常在哺乳动物细胞中生产的治疗剂（例如，人抗体、人源化的抗体或嵌合的抗体）更容易地生产本发明的包含结合血清白蛋白的dAb的组合物，且可以使用非免疫原性的dAb（例如，人dAb可以用于治疗或诊断人的疾病）。

[0139] 当促胰岛素分子和/或肠降血糖素和/或肠肽分子是含有结合血清白蛋白的dAb的药物组合物的一部分时，可以降低所述促胰岛素分子和/或肠降血糖素和/或肠肽分子的免疫原性。因此，本发明提供了一种组合物，其在含有结合血清白蛋白的dAb的药物组合物的背景下，可以具有更低的免疫原性（例如相对于单独的促胰岛素分子和/或肠降血糖素和/或肠肽分子），或可以是基本上无免疫原性的。因而，这样的组合物可以在一段时间内重复施用给受试者，且具有最小的由受试者的免疫系统产生抗-药物抗体而引起的效能损失。

[0140] 另外，与单独的促胰岛素剂和/或肠降血糖素和/或肠肽试剂相比，本文所述的组合物可以具有增加的安全性特性和更少的副作用。例如，作为dAb的血清白蛋白-结合活性的结果，本发明的融合体和缀合物在血管循环中具有增加的停留时间。另外，本发明的组合物在全身给药（例如，血管内给药）后基本上不能穿过血脑屏障和积累在中枢神经系统中。因此，与单独的促胰岛素剂和/或肠降血糖素和/或肠肽试剂相比，本发明的组合物可以以更大的安全性和更小的副作用来施用。类似地，与单独的药物相比，本发明的组合物可以具有减小的对特定器官（例如，肾脏或肝脏）的毒性。

[0141] 实施例:实施例1: GLP-1（A8G）或艾塞那肽-4和DOM7h-14 AlbudAb的遗传融合体的表达:
8
将艾塞那肽-4或GLP-1 (7-37)（在第8位的丙氨酸被甘氨酸替换（[Gly] GLP-1））作为与DOM7h-14（结合血清白蛋白的结构域抗体（dAb）（AlbudAb），其具有下示的氨基酸序列）的融合体克隆进pTT-5载体（可从加拿大的CNRC得到）中。在每种情况下，GLP-1或艾塞那肽-4是在构建体的5’末端处，dAb是在3’末端处。总之，制备了7个构建体（DAT0114、DAT
0115、DAT0116、DAT 0117、DAT 0118、DAT 0119、DAT 0120），它们具有图1（A-G）所示的氨基酸序列。在GLP-1或艾塞那肽4和dAb之间，没有连接物，或具有gly-ser连接物（G4S x
3）或螺旋连接物（“Design of the linkers which effectively separate domains of a bifunctional fusion protein.”Protein Eng 14(8): 529-32.456）或由GLP-1或艾塞那肽-4和dAb之间的第二个GLP-1部分组成的连接物。所述连接物被包括作为间隔物，以使GLP-1或艾塞那肽-4在空间上与dAb分离，从而防止GLP-1或艾塞那肽-4和GLP-1受体之间的结合的位阻。构建体的序列如图1（A-G）SEQ ID NO 1-7所示。

[0142] 使用碱性裂解，在大肠杆菌中制备无内毒素的DNA（使用无内毒素的质粒Giga试剂盒, 可从Qiagen CA得到），并用于转染HEK293E细胞（可从加拿大的CNRC得到）。每个烧6
瓶使用333ul 293fectin（Invitrogen）和250ug DNA，以1.75x10 细胞/ml，转染进250ml/烧瓶的HEK293E细胞，并在30 ℃表达5天。通过离心，收获上清液，并通过在蛋白L上的亲和纯化进行纯化。使蛋白分批结合树脂（填充在柱上），并用10柱体积的PBS洗涤。用50ml
0.1M甘氨酸pH2洗脱蛋白，并用Tris pH8中和。在SDS-PAGE凝胶上鉴别预期尺寸的蛋白，尺寸如下面的表1所示。

[0143] 表1: DAT0114、DAT 0115、DAT0116、DAT 0117、DAT 0118、DAT 0119、DAT 0120构建体的分子量融合蛋白预期的分子量
DAT0114 18256
DAT0115 16896
DAT0116 15950
DAT0117 19798
DAT0118 15936
DAT0119 15318
DAT0120 18895

[0144] 实施例2: 证实GLP-1和艾塞那肽-4 AlbudAb融合体会结合血清白蛋白:通过表面等离子体共振（Biacore AB，可从GE Healthcare得到），分析GLP-1和艾塞那肽-4 AlbudAb融合体，以得到关于亲和力的信息。使用被血清白蛋白包被的CM5 Biacore芯片（羧甲基化的葡聚糖基质），进行分析。将每种要测试的血清白蛋白（人、大鼠和小鼠血清白蛋白）的约1000个共振单元（RU）在乙酸盐缓冲液pH5.5中固定化。Biocore AB的流动池1是未包被的、阻断的阴性对照，流动池2被人血清白蛋白（HSA）包被（815 RU），流动池3被大鼠血清白蛋白（RSA）包被（826 RU），流动池4被小鼠血清白蛋白（MSA）包被（938 RU）。如上面的实施例所述，在哺乳动物组织培养物中表达测试的每种融合体分子。

[0145] 如下制备融合体分子的浓度范围（在16nM-2 μM范围内）：在BIACORE HBS-EP缓冲液（0.01M HEPES、pH7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.005%表面活性剂P20）中稀释，并流过BIACORE芯片。

[0146] 通过使结合速率（on-rate）和解离速率（off-rate）曲线拟合dAb在KD区域中的浓度所产生的迹线，从BIACORE迹线计算亲和力（KD）。亲和力（KD）总结在下面的表2中：表2: GLP-1和艾塞那肽-4 AlbudAb对人、大鼠和小鼠血清白蛋白的结合
体
合
融
41-h7MODG8A)73-7(1-PLGx2:7110TAD Mn051 Mn007 Mn031
体
合
融
41-h7MOD、
物
接
连
旋
螺、G8A)73-7(1-PLG:0210TAD Mn011 Mn008 Mn011
ASH ASR ASM

[0147] 上面的结果证实，融合体分子保留结合所有类型的血清白蛋白的能力，这表明，它们可能具有延长的体内半衰期。

[0148] 实施例3: GLP-1和艾塞那肽-4 AlbudAb融合体在GLP-1受体结合试验（GLP-1R BA）中是有活性的：5
将融合体缓冲更换至100mM NaVl、20mM柠檬酸盐pH 6.2中。同时，以2 x 10 细胞/mL，将CHO 6CRE GLP1R细胞（用6个驱动萤光素酶报告基因的cAMP反应元件以及用人GLP-1受体稳定转染的CHO K1细胞（可从美国典型组织保藏中心ATCC得到））接种进悬浮介质中。维持悬浮培养24小时。然后在含有2mM L谷氨酰胺的15mM HEPES缓冲液（可从Sigma得到）
5
中稀释细胞（2.5 x 10 细胞/ml），并分配进含有10ul/孔的待测化合物的384-孔平板中。
加入试验对照以后，将平板返回培养箱，在37 ℃和5%CO2温育3h。温育后，如试剂盒所述，将稳定的glo萤光素酶底物（可从Promega得到）加入孔中，并用自粘合平板密封带（Weber Marking Systems Inc. 目录号607780）密封平板。将平板放入读数器（Viewlux, Perkin Elmer）中，并重新温育5分钟，然后读出荧光和绘制结果。在有和没有10uM白蛋白存在下，在浓度范围内测定化合物，在有和没有白蛋白存在下拟合剂量响应曲线。计算EC50，并总结在下面的表3中：
表3: GLP-1和艾塞那肽-4 AlbudAb融合体在GLP-1受体结合试验（GLP-1R BA）中的活性

[0149] 上面的结果证实，测试的所有融合体分子保留结合GLP-1受体的能力。所述结果还证实，在有血清白蛋白存在下，该能力得到保留。因此，这些融合体分子可能保留在体内结合GLP-1受体的能力。

[0150] 实施例4: 在HEK 293哺乳动物组织培养物中表达DAT0115、DAT0116、DAT0117和DAT0120，随后通过蛋白L亲和捕获和离子交换色谱法进行纯化:该实验的目的是，生产用于体内和体外表征的蛋白。如以前所述，在HEK 293E细胞的哺乳动物组织培养物中，从pTT-5载体表达蛋白。简而言之，制备和纯化无内毒素的DNA，并用于转染HEK293E细胞。在摇动培养箱中在30 ℃表达蛋白5天，离心培养物，并收获上清液（含有目标蛋白）。通过在蛋白L琼脂糖流线亲和树脂（树脂GE Healthcare，自制偶联的蛋白L）上的亲和捕获，从上清液纯化蛋白。然后用大约10柱体积的PBS洗涤树脂，再用大约5柱体积的0.1M甘氨酸pH2.0洗脱蛋白。在该情况下（与以前的实施例相比），然后进行其它纯化。将蛋白（在tris-甘氨酸中）缓冲液更换为20mM乙酸盐pH 5.0，然后使用Akta，装载上1个（或平行的2个）在20mM乙酸盐pH 5.0中预平衡的6ml resource S柱（GE healthcare）。用相同的缓冲液洗涤后，通过在20mM乙酸盐pH5.0中的0-0.75M NaCl梯度，洗脱蛋白。然后通过SDS-PAGE电泳和通过质谱法，鉴别正确大小的级分，然后合并，以制备最终的蛋白样品。然后将蛋白缓冲更换至20mM柠檬酸盐、pH6.2、100mM NaCl，并浓缩至0.5-5mg/ml。通过0.2uM 过滤器，过滤蛋白，以确保无菌度。

[0151] 实施例5: PYY (3-36) Dom7h-14-10 (R108C) AlbudAb肽缀合物（它具有图3所示的结构，且它是：经由赖氨酸和4个重复PEG连接物缀合到PYY3-36上的Dom7h-14-10 (R108C) AlbudAb）的生产:如下所述，在大肠杆菌中表达Dom7h-14-10 (R108C) AlbudAb，并纯化：将编码
DOM7h-14-10 (R108C)的基因克隆进载体pET30中。为了能够克隆进表达载体中，通过装配PCR来生产融合体，NdeI限制位点在5’，继之以PEL B前导序列（氨基酸序列显示在图
15（i）SEQ ID NO 46中）。用NdeI和BamHI限制内切核酸酶消化载体和装配PCR，然后使用Quick Ligation试剂盒（NEB），将插入片段连接进载体中。将2微升该连接物用于转化MachI细胞。在恢复生长期以后，将细胞涂布在含有羧苄西林的琼脂平板上，在37 ℃温育过夜。对菌落测序，将含有正确序列的那些用于质粒扩增和分离（Plasmid Mini Prep试剂盒, Qiagen）。用质粒DNA转化BL21（DE3）细胞，将得到的菌落用于表达培养物的接种。如下进行表达：接种装有50ml改良的极好的肉汤培养基（Sigma）的250ml烧瓶，这是在OD=0.1接种，然后在补充了50mg/ml卡那霉素的条件下，在30℃进行培养。在A600 =0.5-1时，用IPTG诱导细胞至50 μM终浓度，继续在23℃培养过夜。然后，通过在3700xg离心1小时，澄清培养物上清液。然后使用蛋白L流线（GE Healthcare, 目录号28-4058-03，蛋白L偶联的），从澄清的上清液中纯化表达的蛋白，并使用0.1M甘氨酸pH2.0，从蛋白L洗脱，然后通过加入1/5洗脱体积的1M Tris pH8.0进行中和。然后，使用0.1M柠檬酸，将蛋白的pH调至pH5，并装载用50mM柠檬酸钠pH5平衡过的30ml Source S柱（GE Healthcare）。使用AktaXpress FPLC（GE healthcare），在150ml内应用50mM柠檬酸钠pH5、1M NaCl的0-100梯度。在SDS-PAGE上分析级分，合并含有最纯产物的那些。将最终的蛋白脱盐进50mM磷酸钠pH6.5、5mM EDTA。

[0152] 然后使用图3所示的PEG连接物，将Dom7h-14-10 (R108C) AlbudAb连接至PYY3-36氨基酸分子（但是具有在10位处的赖氨酸，其可以用PEG连接物衍生）。通过标准的化学合成，制备PYY和PEG。然后使用在PEG连接物末端处的马来酰亚胺，将PYY肽缀合至如上所述制备的DOM7h-14-10 (R108C) AlbudAb的游离半胱氨酸上。

[0153] 通过加入二硫苏糖醇（DTT）至5mM的终浓度，并温育30分钟，还原Dom7h-14-10 (R108C)的游离半胱氨酸，最后脱盐到50mM磷酸钠、pH6.5、5mM EDTA中，以去除DTT。然后将马来酰亚胺活化的肽与蛋白以1:1比例进行混合，并温育，以允许缀合发生。

[0154] 以与上述类似的方式，通过离子交换色谱法，从未反应的Dom7h-14-10 (R108C)纯化缀合物。最后，以与上述类似的方式，使用蛋白L亲和纯化，从游离的肽纯化富含缀合物的级分。对最终的缀合物进行缓冲液更换，并通过SDS-PAGE和质谱法进行分析。

[0155] 实施例6: 艾塞那肽-4和DOM7h-14-10/ DOM7h-11-15 AlbudAb的遗传融合体的表达和纯化：该实验的目的是，有效地表达DMS7139和DMS7143。DMS7139是艾塞那肽-4与
TM
DOM7h-14-10（结合血清白蛋白的结构域抗体（dAb），也称作AlbudAb ）的融合体，DMS7143是艾塞那肽-4与DOM 7h-11-15（结合血清白蛋白的结构域抗体（dAb），也称作AlbudAb）的融合体，在大肠杆菌中，具有正确加工过的N-末端。然后可以在随后的实验中测试融合体的艾塞那肽-4部分的活性和AlbudAb部分的活性。将艾塞那肽-4克隆为与DOM7h-14-10或DOM7h-11-15的融合体，其中艾塞那肽-4肽是在构建体的5’末端，且AlbudAb是在3’末端。共制备2个构建体，各自包括在艾塞那肽-4肽和AlbudAb之间的（Gly4Ser）3连接物。所述连接物被包括作为间隔物，以使艾塞那肽-4在空间上与dAb分离，从而防止艾塞那肽-4和GLP-1受体之间的结合的位阻。构建体的序列如图1（m）和1（n）所示。为了能够克隆进表达载体中，通过装配PCR来生产融合体，NdeI限制位点在5’，继之以修饰的OmpT（OmpT AWA氨基酸序列如图1（q）SEQ ID NO 17所示）信号肽，BamHI位点在3’末端上。OmpT AWA信号肽的最后3个密码子从野生型“TCTTTTGCC”变为“GCTTGGGCC”，其编码AWA，而不是SFA。该变化会改善大肠杆菌信号肽酶在正确位点处的加工。

[0156] 另外，融合体序列直接在肽酶切割位点后开始。NcoI消化位点已经被导入，其与信号肽的最后一个密码子和艾塞那肽-4序列的前2个氨基酸重叠。该变化会促进将来的亚克隆，以及导致具有游离的艾塞那肽-4的N-端末端的融合体的生产。包含上面列出的变化的修饰的pET12a表达载体被命名为pDOM35。用NdeI和BamHI限制内切核酸酶消化载体和装配PCR，然后使用Quick Ligation试剂盒（NEB），将插入片段连接进载体中。将2微升该连接物用于转化MachI细胞。在恢复生长期以后，将细胞涂布在含有羧苄西林的琼脂平板上，在37 ℃温育过夜。对菌落测序，将含有正确序列的那些用于质粒扩增和分离（Plasmid Mini Prep试剂盒, Qiagen）。用质粒DNA转化BL21（DE3）细胞，将得到的菌落用于表达培养物的接种。如下进行表达：接种4 x 0.5升TB Onex培养基（补充了Overnight Express™自身诱导溶液）的培养物、1滴消泡剂（消泡剂A204; Sigma）和100微克/毫升的羧苄西林。在250 rpm搅拌下，在30 ℃温育培养物3夜，然后通过在3700xg离心1小时，澄清培养物上清液。然后使用蛋白L流线（GE Healthcare, 目录号28-4058-03，蛋白L偶联的），从澄清的上清液中纯化表达的蛋白，并使用0.1M甘氨酸pH2.0，从蛋白L洗脱，然后使用0.1体积的1M Tris pH8.0进行中和。接着，浓缩蛋白，并在缓冲液A（20mM醋酸钠-乙酸pH 5.0）中透析，通过在AktaXpress（GE healthcare）上的离子交换色谱法进行纯化。
将蛋白在缓冲液A（无盐缓冲液）中装载上Resource S 6ml柱，然后用缓冲液B梯度（20mM醋酸钠-乙酸pH 5.0 1M NaCl）从0-75% B洗脱，在级分中进行75分钟（in 75 minutes in fractions）。在SDS-PAGE上和通过质谱法分析级分，合并具有正确质量的那些。将最终的蛋白透析进20mM柠檬酸盐0.1M NaCl缓冲液中，并通过SDS-PAGE和质谱法再次确认身份。

[0157] 实施例7: 艾塞那肽-4 AlbudAb（如上所述制备的DAT0115）和PYY (3-36) AlbudAb融合肽（如实施例5所述制备，且具有图3所示的结构）在载黑素细胞功能（melanophore）生物试验中的药理学特性：使用用目标受体转染的细胞，在载黑素细胞功能生物试验中，测定了艾塞那肽-4 AlbudAb（DAT 0115）和PYY(3-36) AlbudAb（如实施例5所述制备，且具有图3所示的结构）的药理学特性。基本上如在Jayawickreme等人 (2005) Current Protocols in Pharmacology 12.9.1-12.9.16中所述，进行生物试验。

[0158] 艾塞那肽-4和PYY (3-36) AlbudAb融合肽的药理学特性如表4所示。结果证实，艾塞那肽-4和PYY (3-36)融合肽保留活化它们的同源受体的人和小鼠形式的能力（艾塞那肽-4 AlbudAb/GLP-1R和PYY (3-36)/ NPY2R）。PYY (3-36) AlbudAb对NPY受体的表观选择性以下述次序排序：NPY2R>NPY5R*>NPY1R>NPY4R（对于人受体）和NPY2R>NPY5R>NPY4R>NPY1R（对于小鼠受体）。当将对NPY2R的肽活性与对相同物种内的其它NPY受体相对比时，选择性值的范围从几百倍至> 1000倍（从表5计算）。

[0159] 表4：艾塞那肽-4 AlbudAb和PYY (3-36) AlbudAb融合蛋白的肽-受体药理学特性

[0160] 实施例8: 与PYY-AlbudAb组合的艾塞那肽-AlbudAb（DAT 0115）（如在实施例5中所述，且具有图3所示的结构）在饮食诱导的肥胖的（DIO）小鼠中造成多个参数的协同效应：
将雄性饮食诱导的肥胖的（DIO）C57BL/6小鼠（Taconic, Hudson, NY）和瘦的（lean）C57BL/6小鼠（Taconic, Hudson, NY）用于所有实验。将DIO C57BL/6小鼠分组圈养，并从断奶时开始由卖主饲喂高脂肪饮食（按千卡计算，45%脂肪）。将DIO小鼠（40-50g体重）和年龄匹配的对照单个圈养，并维持在恒温（大约22 ℃），使用12小时光/暗周期（从早晨5点至下午5点照亮）。小鼠可随意接近食物（对于DIO，Research Diets D12451、45%脂肪；对于瘦型，Lab Diet 5001、13.5%脂肪）和水。所有动物方案得到位于北卡罗来纳州Research Triangle Park的GlaxoSmithKline的公共机构动物护理和使用委员会（institutional animal care and use committee at GlaxoSmithKline in Research Triangle Park, NC）的批准。每天新鲜制备肽-AlbudAb，或一次性制备，并分成等分试样在-70 ℃冷冻。对于组合给药，将药物混合到一起，使得仅需要一次注射。

[0161] 慢性肥胖症效能研究：使DIO C56BL/6小鼠和年龄匹配的瘦对照在室内适应6周，然后开始研究。每2天在下午2-4点之间给动物皮下施用5 ml/kg的剂量体积，持续15天的时段。

[0162] 如下给动物组给药：（a）以0.1 mg/kg，施用PYY-AlbudAb（PYY ED20组）
（b）以1.0 mg/kg，施用PYY-AlbudAb（PYY ED80组）
（c）以0.01 mg/kg，施用艾塞那肽-AlbudAb（DAT 0115）（艾塞那肽ED20组）
（d）以0.1 mg/kg，施用艾塞那肽-AlbudAb（DAT 0115）（艾塞那肽ED80组）
（e）ED 20 combo：施用单次剂量的：与0.01 mg/kg的艾塞那肽-4 -AlbudAb（DAT
0115）相混合的0.1 mg/kg的PYY-AlbudAb
（f）ED 80 combo：施用单次剂量的：与0.1 mg/kg的艾塞那肽-4 -AlbudAb（DAT 0115）相混合的1.0 mg/kg的PYY-AlbudAb
（g）以0. 1mg/kg，施用单独的对照艾塞那肽-4。

[0163] 在开始药物之前，使用3天媒介物引入期，其中第1天是媒介物，后面2天是假注射剂。使用QMR仪器（Echo Medical Systems, Houston, TX.），在开始药物之前3-4天和在第15天，测量基线体脂量（baseline fat mass）和瘦体重（lean mass）。从第一药物剂量之前4天开始，每个星期一、星期三和星期五，测量体重，第一次测量结果用于随机化动物。从第一药物剂量之前4-6天开始，每个周日测量食物漏斗重量，用于计算食物摄入。在开始研究之前，去除造成过度食物溢出的动物。在研究期间，从笼中取出多余的食物，并加入食物漏斗重量，用于提高准确度。8-10只动物（n=8-10）用于瘦对照组，8只动物（n=8）用于所有其它治疗组。在开始药物治疗以后16天，使动物禁食至少4小时，然后通过末端心脏驱血法收集全血、血浆和血清样品。全血用于测定% HbA1c，血浆用于胃肠道激素组，血清用于获得多个临床化学参数。最后，在第16天收集重要的器官和组织（心脏、肾脏、肝脏、肺、胃、十二指肠、结肠、胰腺、褐色脂肪、白色脂肪、尸体），并在10% 中性缓冲的福尔马林中固定，用于宏观和微观组织学检查。

[0164] A）与PYY-AlbudAb组合的艾塞那肽-4-AlbudAb（DAT 0115）对体重的影响上述的所有治疗组表现出明显的且持续的体重减轻。参见图4。对于除了Combo ED80以外的所有治疗组，在7天以后，该效应通常达到平稳状态。直到治疗15天，Combo ED80仍没有达到平稳状态。在第15天，PYY-AlbudAb 0.1 mg/kg剂量（相对于媒介物，2%减少）+ 艾塞那肽-4-AlbudAb 0.01 mg/kg剂量（相对于媒介物，4.5%减少）的加入指示，预见到相对于媒介物对照的6.5%体重减少。但是，当AlbudAb与Combo ED20组相组合时，观察到的体重具有11.2%体重减少，这大于预期的累加值（p<0.05）。

[0165] 对于ED80组，仅在治疗的前7天以后，才观察到对体重的大于累加效应。如果在第7天累加这些治疗效应，则预见到相对于媒介物的20.1%体重减少（PYY-AlbudAb 1.0 mg/kg的7.1%，和艾塞那肽-4-AlbudAb 0.1 mg/kg的13.0% ）。对于在第7天的Combo ED80组，观察到21.6%减少，这相对于预测的累加数据不具有统计显著性。但是，在15天时间点，PYY-AlbudAb 1.0 mg/kg组表现出相对于媒介物的约7.8%减少，且艾塞那肽-4-AlbudAb
0.1 mg/kg组表现出相对于媒介物的16.8%减少；这2个剂量组的累加应已经产生24.6%体重减少。实际上，观察到Combo ED80组的32.8%减少，这是超过预期的累加数据的统计上显著的增加（p<0.05）。

[0166] B）与PYY-AlbudAb组合的艾塞那肽-4-AlbudAb（DAT 0115）对食物摄入变化的影响观察到所有治疗组的食物摄入相对于媒介物对照的一定抑制水平。参见图5。除了Combo ED80组以外的所有治疗组随时间恢复至媒介物对照水平。对于第1和2天，Combo ED20表现出食物摄入偏离基线的每天平均25.1% 抑制（相对于媒介物标准化），尽管2个组的累加具有预期的食物摄入的5.7%适度减少。在所有其它时间点，观察到累加效应。

[0167] 对于ED80剂量组（PYY-AlbudAb 1.0 mg/kg和艾塞那肽-4-AlbudAb 0.1 mg/kg），在早期的时间点观察到对体重的累加效应。但是，从第10天时间点开始，观察到食物摄入的42% 抑制，而如果仅仅累加组合的效应，则预见到食物摄入的17% 抑制（p<0.05）。该效应在研究的剩余时间中持续，且可能在第14天得到最好例证，在这一天，PYY-AlbudAb 1.0 mg/kg组（进食的2.5% 抑制）和艾塞那肽-4-AlbudAb 0.1 mg/kg组（进食的0.8%抑制）的累加预示2组的组合的食物摄入的3.3%抑制（Combo ED80）。最后，在Combo ED80中，观察到食物摄入的19.2%抑制，这相对于所述组合具有累加效应的情况下所预测的值是统计上显著的差异（p<0.05）。联合组中的食物摄入的抑制指示，厌食活性构成PYY-AlbudAb和艾塞那肽-4-AlbudAb的组合的体重减轻机制的至少一部分。

[0168] C. 与PYY-AlbudAb组合的艾塞那肽-4-AlbudAb（DAT 0115）对身体组成变化的影响对于艾塞那肽-4 AlbudAb 0.1 mg/kg组、Combo ED20组和Combo ED80组（所有组相对于媒介物，p<0.01），观察了身体脂肪百分比的绝对变化。参见图6和7。2个Combo治疗组也在15天治疗期中表现出身体脂肪百分比的减少，这与该组合的大于累加效应相一致。
具体地，PYY-AlbudAb 0.1 mg/kg组的身体脂肪百分比下降了1.8%，艾塞那肽-4-AlbudAb
0.01 mg/kg组表现出身体脂肪的0.6%减少，它们任一个都不代表显著的变化（相对于媒介物对照的变化，标准化这2个值）。相比而言，对于Combo ED20治疗组，存在身体脂肪百分比的4.8%减少，这明显超过2.4%的预期累加值（p<0.05）。对于更高的剂量，预期的累加减少是8.6% （PYY-AlbudAb 1.0 mg/kg和艾塞那肽-4-AlbudAb 0.1 mg/kg；减少分别为1.8%和
6.8%）。但是，观察到的在Combo ED80组中的变化是20.0%减少，这明显大于通过累加所预测的值（p<0.05）。

[0169] Combo ED80组从39.5% 身体脂肪下降至18.9% 身体脂肪。在瘦对照和Combo ED80之间，不再存在身体脂肪百分比的显著差异（p=0.43）。因此，Combo ED80组“标准化”回瘦对照，尽管维持在有肥胖倾向的环境中（即接近高脂肪饮食）。这对应着多余身体脂肪的100%减少。

[0170] 对于单一疗法和联合治疗组，观察到体脂量的剂量依赖性的变化。在治疗期内，PYY-AlbudAb 0.1 mg/kg组减少了0.8克体脂量（相对于媒介物对照，p=0.29），而艾塞那肽-4-AlbudAb组减少了1.4克体脂量（相对于媒介物对照，p<0.05）。如果这些治疗具有对体脂量的累加效应，我们预期Combo ED20组会减少2.2克体脂量。但是，Combo ED20组减少了3.8克体脂量，这显著大于预期的累加值（p<0.05）。

[0171] 对于ED80剂量组，进行了类似分析。PYY-AlbudAb 1.0 mg/kg组减少了2.2克身体脂肪（相对于媒介物对照，p<0.01）而艾塞那肽-4-AlbudAb组减少了平均5.7克身体脂肪（相对于媒介物对照，p<0.01）。这2组的累加提示，当组合时，预见到7.9克身体脂肪减少。但是，观察到Combo ED80组的11.3克身体脂肪减少（相对于媒介物对照，p<0.01）。基于累加所预测的数据和观察到的数据之间的差异是统计上显著的（p<0.05）。

[0172] 尽管在治疗组中观察到一些瘦体重减少，对瘦体重的该效应的强度远远小于对体脂量的效应。总之，总体重减少的大约80%是体脂量，这与在使用饮食控制和锻炼的临床试验中观察到的体脂量相对于瘦体重减少之比相一致。

[0173] D. 与PYY-AlbudAb组合的艾塞那肽-4-AlbudAb（DAT 0115）对内分泌分析物的变化的影响（参见图8）对于Combo ED80组，胰岛素水平仅是媒介物对照水平的1/10（在血浆中分别是2617 pg/ml和259 pg/ml，p<0.05）。胰岛素的这种降低是合乎逻辑的，因为所述动物在研究开始和结束时是血糖正常的。也就是说，据推测，降低的胰岛素正在保护免于低血糖症。

[0174] combo ED80组中的瘦素（leptin）水平比媒介物对照组降低了超过90% （对于媒介物，在血浆中51.6 ng/ml；对于Combo ED80，在血浆中4.7 ng/ml，p<0.01）。这与瘦对照水平（在血浆中9.8 ng/ml）相当，这可能是由于Combo ED80组中体脂量的急剧下降。另外，Combo ED20和艾塞那肽-4-AlbudAb 0.1 mg/kg组具有比媒介物对照明显更低的血浆瘦素值（分别是，34.8 ng/ml，p<0.01，和31.4 ng/ml，p<0.01）。这些效应似乎与体脂量的减少有关。

[0175] 胃抑肽（GIP）水平在Combo ED20组中显著降低（相对于媒介物对照，p<0.05），并在Combo ED80组表现出强趋势（相对于媒介物对照，p=0.08）。

[0176] 在Combo ED80组中的胰淀素（amylin）水平（在血浆中68 pg/ml）显著低于媒介物对照（在血浆中250 pg/ml; p<0.01）。此外，Combo ED80胰淀素水平与瘦对照水平（在血浆中87pg/ml）大致相同。Combo ED20组表现出强烈的下降趋势（在血浆中171 pg/ml；相对于媒介物对照，p=0.054），并且艾塞那肽-4-AlbudAb 0.1 mg/kg组明显低于媒介物对照（在血浆中163 pg/ml；p<0.01）。

[0177] 在艾塞那肽-4-AlbudAb单一疗法组中的葛瑞林水平升高至大致等于联合组的水平。这指示，单独的艾塞那肽-4活性最可能引起增加的葛瑞林（ghrelin）暴露。

[0178] 在接受PYY-AlbudAb的动物中，PYY水平升高，这可能是由于在血浆中的施用的肽的直接检测。但是，这些值不能指示在循环中的PYY-AlbudAb的绝对水平。

[0179] E. 与PYY-AlbudAb组合的艾塞那肽-4-AlbudAb（DAT 0115）对血清化学参数的变化的影响总之，在大多数治疗组（包括Combo ED20在内）和在ED80测试的所有组中，观察到血清化学的优良特性。瘦对照组表现出瘦动物和DIO组之间的相对差异。所述值代表所有其它组的变化，因为这些组在开始研究之前从单个群体随机化而来。Combo ED20组表现出对葡萄糖和总胆固醇的一些显著改善，同时表现出改善甘油三酯和丙氨酸转氨酶（ALT）水平的趋势（表5）。

[0180] 对于PYY-AlbudAb 1.0 mg/kg组和艾塞那肽-4-AlbudAb 0.1 mg/kg组，观察到在降低葡萄糖、总胆固醇、总胆红素、肌酸酐、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、丙氨酸转氨酶（ALT）和总蛋白方面的显著改善。但是，这些效应的程度通常低于在组合（Combo ED80）中观察到的程度。Combo ED80组表现出血清化学的许多显著变化。所有这些变化（血尿素氮（BUN）除外）代表将动物从肥胖症的病理态改变成正常瘦态的改善。例如，肝酶丙氨酸转氨酶（ALT）在媒介物对照DIO小鼠中升高，但是Combo ED80治疗使其水平下降了79%，达到瘦对照的水平。其它显著改善包括：HbA1c、总胆固醇、甘油三酯、总胆红素、肌酸酐、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、丙氨酸转氨酶（ALT）和总蛋白。所有这些变化使得DIO血清化学更接近地类似于瘦对照化学，并被认为是有益的。

[0181] F. 与PYY-AlbudAb组合的艾塞那肽-4-AlbudAb（DAT 0115）对组织病理学变化的影响通过锇染色证实的肝脏中的细胞质脂滴，标志着DIO媒介物-对照小鼠中的严重性，其影响大多数肝细胞。在施用Combo ED80的DIO小鼠中，细胞质脂滴大幅减少（最小至不可检测）（参见图9）。在施用Combo ED20、PYY-AlbudAb（1.0 mg/kg）、艾塞那肽-4-AlbudAb（0.1 mg/kg）和艾塞那肽-4（0.1 mg/kg）的DIO小鼠中，观察到类似的变化，其应答量级低于在Combo ED80肝脏中所观察到的。但是，在治疗的DIO小鼠的肝[Combo ED20、Combo ED80、PYY-AlbudAb（1.0 mg/kg）、艾塞那肽-4-AlbudAb（0.1 mg/kg）和艾塞那肽-4（0.1 mg/kg）]、褐色脂肪组织[Combo ED20、Combo ED80、PYY-AlbudAb（1.0 mg/kg）、艾塞那肽-4-AlbudAb（0.01-和0.1 mg/kg）和艾塞那肽-4（0.1 mg/kg）]和肾（仅在Combo ED80中）中，观察到实验物相关的微观变化（由减少的细胞质脂滴组成）。这些组中的这些组织变化与血清转氨酶、总胆固醇、HDL和葡萄糖的减少有关。Combo组ED20和ED80也具有减少的甘油三酯。这些变化与预期的药理学相关，且被认为是有益的。

[0182] 实施例9: 艾塞那肽-AlbudAb（DAT 0115）和PYY-Albudab（如在实施例5中所述，且具有图3所示的结构）组合对db/db 小鼠的糖尿病参数的影响：将雄性db/db C57BL/6J小鼠（Jackson Labs, Bar Harbor, ME）用于所有实验。由卖主将db/db小鼠（B6.Cg-m +/+ Leprdb/J）和对照分组圈养。将db/db小鼠（10-12周龄）和年龄匹配的对照运输至GSK，在这里将它们单个圈养，并维持在恒温（大约22 ℃），使用12小时光/暗周期（从早晨5点至下午5点照亮）。小鼠可随意接近食物（对于db/db和它们的对照，Lab Diet 5K67、16%脂肪）和水。所有动物方案得到位于北卡罗来纳州Research Triangle Park的GlaxoSmithKline的公共机构动物护理和使用委员会（institutional animal care and use committee at GlaxoSmithKline in Research Triangle Park, NC）的批准。每天新鲜制备肽-AlbudAb。通过使用柠檬酸盐媒介物缓冲液（包含100 mM NaCl、
20 mM柠檬酸，pH 6.2）（过滤除菌）稀释主储液，得到药物正确的给药浓度。对于组合给药，将药物混合到一起，使得仅需要一次注射。

[0183] 慢性糖尿病效能研究：使db/db小鼠和年龄匹配的瘦对照在室内适应2周，然后开始研究。每2天在下午2-4点之间给动物皮下施用5 ml/kg的剂量体积，持续15天的时段。在开始药物之前，使用3天媒介物引入期，其中第1天是媒介物，后面2天是假注射剂。使用QMR仪器（Echo Medical Systems, Houston, TX.），在开始药物之前3天和在第15天，测量基线体脂量和瘦体重。从第一药物剂量之前4天开始，每个星期一、星期三和星期五，测量体重。在开始给药前2天，通过尾巴剪断，采取血液样品，以测量进食葡萄糖值和%HbA1c值；该数据用于随机化动物为不同的组。从第一药物剂量之前4-6天开始，每个周日测量食物漏斗重量，用于计算食物摄入。在开始研究之前，去除造成过度食物溢出的动物。在研究期间，从笼中取出多余的食物，并加入食物漏斗重量，用于提高准确度。8只动物（n=8）用于瘦对照组，8只动物（n=8）用于所有其它治疗组。包括成对饲养的对照，其中计算组合ED80组的每天食物摄入，并在第二天将该量的食物施用给成对饲养的组来进食。在开始药物治疗以后16天，使动物禁食至少4小时，然后通过末端心脏驱血法收集全血、血浆和血清样品。全血用于测定% HbA1c，血浆用于胃肠道激素组，血清用于获得多个化学参数。最后，在第16天收集重要的器官和组织（心脏、肾脏、肝脏、肺、胃、十二指肠、结肠、胰腺、褐色脂肪、白色脂肪、尸体），并在10% 中性缓冲的福尔马林中固定，用于宏观和微观组织学检查。

[0184] A. 与PYY-AlbudAb组合的艾塞那肽-4-AlbudAb（DAT 0115）对血红蛋白A1c百分比的变化的影响在18天研究期间，媒介物对照动物使%HbA1c从基线时的平均7.14%增加至第16天之前的平均9.03%。这指示在该时间段期间糖尿病表型的实质进展。参见图10和11。在包括Combo ED20、PYY-AlbudAb 1.0 mg/kg和艾塞那肽-4-AlbudAb 0.1 mg/kg组的多个剂量组中，观察到糖尿病表型进展的抑制（相对于媒介物增加，p<0.05）。仅对于Combo ED80组，观察到%HbA1c的绝对降低（相对于基线，p<0.01）。Combo ED80组从6.83% 糖基化的HbA1c下降至5.16% 糖基化的HbA1c。在瘦的无糖尿病对照和Combo ED80之间，不再存在糖基化的HbA1c的显著差异（p<0.01）。因此，在Combo ED80治疗组中的糖尿病的（db/db）小鼠具有完全正常水平的糖基化的HbA1c百分比，且几乎“标准化”回正常的瘦对照动物。

[0185] 成对饲养的对照（进食与Combo ED80动物的消耗量相同量的食物）没有表现出相对于媒介物对照动物的显著变化（p=0.11）。这指示，食物摄入的抑制不是Combo ED80组中的HbA1c降低的主要机制。

[0186] 在包括PYY-AlbudAb 1.0 mg/kg组（1.16%减少，p<0.05）、艾塞那肽-4-AlbudAb0.1 mg/kg组（0.80%减少，p<0.05）在内的多个组中，以及在Combo ED20组（0.89%减少，p<0.05）和Combo ED80组（3.57%减少，p<0.01）中，观察到糖基化的血红蛋白的显著变化。

[0187] 以类似的方式分析Combo组。PYY-AlbudAb 0.1 mg/kg组和艾塞那肽-4-AlbudAb0.01 mg/kg组没有表现出相对于媒介物对照水平的显著变化，而当组合时（Combo ED20），存在糖基化的HbA1c的0.89%减少。对于ED80剂量组，预期的累加减少是1.96%（对于PYY-AlbudAb 1.0 mg/kg和艾塞那肽-4-AlbudAb 0.1 mg/kg组）。但是，当组合时（Combo ED80组），观察到糖基化的HbA1c的3.57%减少。该降低显著大于通过单一疗法组的累加所预测的降低（p<0.05）。

[0188] B. 与PYY-AlbudAb组合的艾塞那肽-4-AlbudAb（DAT 0115）对血浆胰岛素的变化的影响与媒介物（vehicle）对照相比，低剂量单一疗法治疗组表现出血浆胰岛素水平的增加趋势（PYY-AlbudAb 0.1 mg/kg, p=0.052；艾塞那肽-4-AlbudAb 0.01 mg/kg, p=0.17）。对于Combo ED20组，血浆胰岛素水平达到21307 pg/ml，其显著高于媒介物对照组的在血浆中的9470 pg/ml（p<0.05）。PYY-AlbudAb 1.0 mg/kg组（30467 pg/ml；相对于媒介物对照，p<0.05）和艾塞那肽-4-AlbudAb组（32036 pg/ml；相对于媒介物对照，p<0.01）也具有升高的胰岛素水平（参见图12）。

[0189] 在Combo ED80组中，胰岛素水平是媒介物对照水平的5倍（在血浆中分别是55950 pg/ml和9470 pg/ml，p<0.05）。认为这些格外高的胰岛素水平会引起在这些动物中观察到的葡萄糖降低效应的至少一部分。

[0190] ED80成对饲养的对照组具有4438 pg/ml的血浆胰岛素水平，其明显低于媒介物对照水平（p<0.01），这最可能是由于体重减轻。

[0191] C. 与PYY-AlbudAb组合的艾塞那肽-4-AlbudAb（DAT 0115）对体重增长抑制的影响对于糖尿病研究，也监测了体重。由于db/db 小鼠的快速体重增长，除了体重减轻以外，该模型还可以用于评估体重增长的抑制。该研究指示，PYY-AlbudAb 1.0 mg/kg、艾塞那肽-4-AlbudAb 0.1 mg/kg、Combo ED20和Combo ED80治疗可有效地抑制体重增长。参见图
13。

[0192] 在第15天之前，在PYY-AlbudAb 0.1 mg/kg（其相对于媒介物对照倾向于1.5%减少，p=0.18）和艾塞那肽-4-AlbudAb 0.01 mg/kg（其单独不具有显著作用）已经出现明显的协作。在组合中，Combo ED20组的体重增长明显少于媒介物对照（媒介物的体重增长为9.5%，Combo ED20的体重增长为4.4%；p<0.01）。

[0193] 以类似的方式分析了Combo ED80组。在第15天时，PYY-AlbudAb 1.0 mg/kg组表现出相对于媒介物的5.9%减少，艾塞那肽-4-AlbudAb 0.1 mg/kg组表现出相对于媒介物的9.2%减少；这2个剂量组的累加已经产生15.1%体重减少。实际上，观察到Combo ED80组的26.2%减少，这是超过预期的累加数据的统计上显著的增加（p<0.05）。

[0194] 在前8天中，成对饲养的对照（相对于Combo ED80组成对饲养）表现出12.8%体重减轻，这与在相同时间段内的Combo ED80组（12.3% 体重减轻）相当。但是，在8天以后，成对饲养的对照以与媒介物对照大致相同的速率增加体重，而Combo ED80组维持它们的体重减轻。这导致8.4% （对于成对饲养的组）和16.7%（对于Combo ED80组）的净体重减轻（相对于两组的基线，p<0.01）。该反弹作用和在第15天时得到的体重差异提示，在8天以后，在成对饲养的组和Combo ED80组之间出现代谢差异，这归因于所述组合，而不仅仅归因于对体重的影响。

[0195] D. 与PYY-AlbudAb组合的艾塞那肽-4-AlbudAb（DAT 0115）对食物摄入的抑制的影响在除了PYY-AlbudAb 0.1 mg/kg和艾塞那肽-4-AlbudAb 0.01 mg/kg组以外的所有组中，在15天的时段内，观察到食物摄入的显著减少。参见图14。通常，在前5天期间，食物摄入的抑制更大，在该时间以后，存在每天食物摄入的某种稳定化。在第15天（平均13-15天），Combo ED20、PYY-AlbudAb 1.0 mg/kg和艾塞那肽-4-AlbudAb 0.1 mg/kg组的每天平均食物摄入都是6.9-7.0克。这显著低于媒介物对照组消耗的9.0克食物（p<0.05）。

[0196] 对于Combo ED80组，最初观察到食物摄入的急剧减少。在前5天中，在该组中的动物的每天平均食物摄入小于2克，这远远小于媒介物对照动物的9克（p<0.01）。在第10天时，观察到食物摄入的微小反弹，在此时，食物摄入水平稳定化。在第15天之前，Combo ED80组每天消耗4.8克食物，这是媒介物对照组的食物摄入的大约一半。

[0197] 在观察到进食显著减少的任何组中，食物摄入没有反弹回媒介物对照水平。在治疗组中的食物摄入稳定化，且与研究第10-15天的媒介物对照组大致平行。这提示，这些动物可能保持负能量平衡（假定没有代谢补偿），并且体重可能相对于媒介物对照继续下降。

[0198] 实施例10: PYY3-36 AlbudAb（DMS7620）剂量依赖性地抑制食物摄入，并造成饮食诱导的肥胖的（DIO）小鼠的体重减轻：将雄性饮食诱导的肥胖的（DIO）C57BL/6小鼠（Taconic, Hudson, NY）用于所有实验。
将DIO小鼠单个圈养，并维持在恒定温度和湿度（分别是大约22 ℃和50%），使用12小时光/暗周期（从早晨5点至下午5点照亮）。小鼠可随意接近食物（对于DIO，Research Diets D12451、45%脂肪）和水。所有动物方案得到位于北卡罗来纳州Research Triangle Park的GlaxoSmithKline的公共机构动物护理和使用委员会（institutional animal care and use committee at GlaxoSmithKline in Research Triangle Park, NC）的批准。一次性制备肽-AlbudAb，并分成每天等分试样在-80 ℃冷冻。对于组合给药，将药物混合到一起，使得仅需要一次注射。

[0199] 慢性肥胖症效能研究：使DIO C56BL/6小鼠在室内适应7周，然后开始研究。每2天（隔日）在下午1-3点之间给动物皮下施用5 ml/kg的剂量体积，持续6天的时段。

[0200] 如下给动物组给药：（a）施用3 mg/kg的DMS7620（DMS7620 3 mg/kg组）
（b）施用1 mg/kg的DMS7620（DMS7620 1 mg/kg组）
（c）施用0.3 mg/kg的DMS7620（DMS7620 0.3 mg/kg组）
（d）施用0.1 mg/kg的DMS7620（DMS7620 0.1 mg/kg组）
（e）施用媒介物（柠檬酸盐缓冲液: 20 mM柠檬酸盐和100 mM NaCl）
应当指出，也以0.03 mg/kg、0.01 mg/kg和0.003 mg/kg，给动物施用。但是，这些剂量低于在该研究中的效能阈值。

[0201] 在开始药物之前，使用1天媒介物引入期。从第一药物剂量之前4天开始，经常测量体重，第一次测量结果用于随机化动物。从第一药物剂量之前4天开始，经常测量食物漏斗重量，用于计算食物摄入。在开始研究之前，去除造成过度食物溢出的动物。在研究期间，从笼中取出多余的食物，并加入食物漏斗重量，用于提高准确度。对于所有组，每组使用5只动物（n=5）。

[0202] 实施例10的结果如下面的表6所示。

[0203] A）PYY3-36 AlbudAb（DMS7620）对体重的影响多剂量的PYY3-36 AlbudAb（DMS7620）表现出体重的显著减轻。第6天体重变化百分比是：媒介物对照的0.0%，DMS7620（3 mg/kg）的-10.4%，DMS7620（1 mg/kg）的-4.6%，DMS7620（0.3 mg/kg）的-1.7%，和DMS7620（0.1 mg/kg）的-2.2%。3.0 mg/kg、1.0 mg/kg和0.3 mg/kg剂量的DMS7620明显不同于媒介物对照。

[0204] B）PYY3-36 AlbudAb（DMS7620）对食物摄入的影响与媒介物对照相比，观察到3.0 mg/kg、1.0 mg/kg和0.3 mg/kg剂量的DMS7620的显著食物摄入抑制。在研究过程中的平均每日食物摄入是：媒介物对照的3.09克，DMS7620（3 mg/kg）的1.52克，DMS7620（1 mg/kg）的2.34克，DMS7620（0.3 mg/kg）的2.64克，和DMS7620（0.1 mg/kg）的2.76克。这对应着：DMS7620（3 mg/kg）的51.2%食物摄入减少，DMS7620（1 mg/kg）的20.8%减少，DMS7620（0.3 mg/kg）的11.8%减少，和DMS7620（0.1 mg/kg）的16.6%减少。

[0205] 表6：

[0206] 实施例11: 用艾塞那肽-4和肽YY制备单个AlbudAb融合体将DAT0116克隆进具有N端分泌信号的哺乳动物表达载体pTT5中，并使用诱变寡物
（oligos）的延伸和模板DNA的DPNI消化（Stratagene Quickchange），导入C端半胱氨酸。
验证DNA的序列，并瞬时转染进和HEK293细胞中。

[0207] 使用蛋白L亲和色谱法，分离和纯化哺乳动物细胞上清液，并通过质谱法证实蛋白质量。从4℃贮存库取出蛋白，并在2X20ml浓缩器中浓缩DAT0116R108C至12.5ml。加入DTT至终浓度5mM，将样品温育15分钟。然后将蛋白脱盐进20mM Bis Tris（pH6.57）、5mM EDTA、10% 甘油中。合并脱盐的级分，且对于R108C衍生物，将1/10体积（约2mg）加入含有n-乙基马来酰亚胺的50ml falcon试管中。将剩余的合并的蛋白加入在50ml falcon中的不同质量的PYY肽（批次‘190’）中。将样品在室温滚动温育30分钟，在台式离心机中在4,500rpm离心10分钟，通过SDS-PAGE进行分析，然后在4 ℃保存过夜。

[0208] 在2种R108C衍生物偶联反应中都观察到沉淀，在加入蛋白以后短时间内，样品变得不透明，并在5分钟内形成大斑点。在其它反应中，没有观察到沉淀。

[0209] 过夜贮存后，溶液显得稍微浑浊，但是，在静置后，浑浊和沉淀物难以看出。

[0210] 用50mM醋酸钠pH4.5对样品进行1/5稀释，并以2.5ml/min，应用于2X6ml Resource S柱（预先用0.5M NaOH 净化，并用稀释缓冲液平衡）。上样后，用稀释缓冲液洗涤柱，然后进行50mM醋酸钠pH4.5、1M NaCl的0-100% 梯度。然后用2XPBS洗涤柱，最后用0.5M NaOH净化。

[0211] 分别在多个20ml离心式浓缩器中浓缩醋酸钠级分和2XPBS级分，通过SDS-PAGE进行分析，过滤除菌，并在2X2L柠檬酸钠pH6、100mM NaCl中透析。

[0212] 对蛋白进行MS分析。

[0213] 由于肽对DAT0116R108C:190PYY的轻微污染，将这些蛋白和对应的醋酸钠级分集合重新应用于蛋白L柱。

[0214] 用1XPBS平衡1ml蛋白L柱，并用6M盐酸胍净化。以2ml/min，用1XPBS重新平衡该柱，并应用DAT0115R108C:190 PYY醋酸钠洗脱液。应用后，用100mM柠檬酸钠pH6洗涤该柱，最后用100mM柠檬酸pH2.6洗脱。用100mM柠檬酸钠pH6重新平衡该柱，以类似的方式，应用2XPBS洗脱液，并纯化。用6M盐酸胍净化该柱，并关于DAT0116R108C:190 PYY衍生物重复该过程。

[0215] 将蛋白浓缩至1-1.5ml，并在室温在1.6L 50mM醋酸钠pH6、100mM NaCl中透析过夜。次日早晨，从透析盒取出蛋白，测量OD，将200ul浓缩至20ul，用于SDS-PAGE分析。

[0216] 将艾塞那肽-4 AlbudAb肽YY构建体的样品进行Y2受体试验（以测定肽YY的功能）和GLP-1受体试验（以测定艾塞那肽-4的功能）。表10显示了用n-乙基马来酰亚胺封闭的艾塞那肽-4 AlbudAb（DAT0116 nEM）和用肽YY修饰的艾塞那肽-4 AlbudAb（DAT0116 R108C 190PYY）的活性。肽YY修饰的艾塞那肽-4 AlbudAb融合体显示出比肽对照降低的对Y2受体的活性，和对GLP-1受体的类似效价。PYY肽被包括作为对照。结果如表7所示。

[0217] 表7：

[0218] 实施例12：DOM7h-14-10 AlbudAb和PYY遗传融合体的表达：将PYY 3-36（其具有导入在C-端的一个额外甘氨酸）作为与DOM7h-14-10（一种结合血清白蛋白的结构域抗体（dAb）（AlbudAb），其具有下示的氨基酸序列）的融合体克隆进pET30a载体（可从Novagen（Merck）得到）中。PYY是在该构建体的3’末端处，dAb是在5’末端处。还将TVAAPS连接物导入在dAb和PYY序列之间；包括该连接物作为隔离物，以使所述dAb在空间上与PYY分离，从而防止PYY和NP受体之间的结合的位阻。该构建体的氨基酸序列如下面和图1（v）SEQ ID NO 49所示：
。

[0219] 使用碱性裂解（使用小量制备试剂盒，可从Qiagen CA得到），在大肠杆菌中制备质粒DNA，并用于转化BL21（DE3）细胞（可从Invitrogen得到）。挑取单独的菌落，并在100 ml TB培养基中在37 ℃培养过夜，然后通过1/100稀释，用于接种1 L培养物。培养该培养物，直到OD达到0.7，在此时，通过加入IPTG至终浓度70µM，诱导蛋白表达。将培养物在23 ℃培养过夜，然后离心收获，在-20 ℃保存沉淀物。此后，通过用Bugbuster混合液（12.5ml10x bugbuster（Merck）、112.5 ml PBS、250µl lysonase（Merck）和4个完整的蛋白酶抑制剂片剂（Roche）裂解细胞，制备包涵体。将源自500 ml培养物的沉淀物重新悬浮于100 ml bugbuster混合液中，并在搅拌下在室温温育30分钟，然后在32000g离心20分钟，并抛弃上清液。用在PBS中的2 M脲洗涤沉淀物，然后在32000 g离心15分钟，并抛弃上清液。
然后将沉淀物重新悬浮于原始培养物体积的1/12.5的、在缓冲液B（100 mM NaCl、100 mM Tris-HCl pH 8.0、5% 甘油）中的8 M脲中，在室温搅拌1小时，然后在16000 rpm离心15分钟。在4 ℃保存上清液（包涵体制备物）。

[0220] 通过在重新折叠缓冲液（100 mM MES pH 6.0、60 mM NaCl、0.001% triton-X100）中1/50稀释，使蛋白重新折叠，过滤，然后浓缩。在需要时，通过用100 mM MES pH 6.0、0.001% Triton X-100、30 mM NaCl、1% 乙醇、10µg/ml过氧化氢酶、2.5 mM抗坏血酸钠、1µM氯化铜和80 nM肽基甘氨酸α-酰胺化单加氧酶在室温温育8µM重新折叠的蛋白过夜，实现在C-端处的酰胺化。通过质谱法分析（甘氨酸-延长的融合蛋白的分子量= 16592；C-端酰胺化的融合蛋白的分子量= 16534），证实酰胺化。

[0221] 在HiTrap SPFF阳离子交换柱（在缓冲液Y中平衡过）上进行纯化，并用缓冲液Z的0-100% 梯度洗脱。缓冲液Y = 20 mM柠檬酸钠pH 5.0；缓冲液Z = 20 mM柠檬酸钠pH5.0 + 1 M NaCl。此后，将蛋白缓冲更换至20 mM柠檬酸钠pH 6.2 + 100 mM NaCl中，浓缩，并在-80℃保存。

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体内半衰期改变的生物活性蛋白质偶联物	2020-05-14	388
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具长半衰期的OB蛋白质衍生物	2020-05-11	425
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具有延长的半衰期的药物融合体和缀合物

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