用于表征人膜蛋白的功能和相互作用的病毒体展示阵列
阅读：927发布：2021-01-18
专利汇可以提供用于表征人膜蛋白的功能和相互作用的病毒体展示阵列专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本文提供了重组病毒体阵列，所述重组病毒体阵列包含保留它们的天然构象和/或相互作用的人膜结合蛋白；重组HSV-1病毒体；以及使用方法，包括用于筛选结合人膜结合蛋白的配体和/或药物的高含量、高通量测定，诊断测定， 蛋白质 组测定和 生物 传感器 测定。还提供了重组HSV-1病毒体，所述重组HSV-1病毒体包含包膜，所述包膜包含保留它们的天然构象和/或相互作用的多种异源膜结合蛋白；以及编码异源膜多肽的重组HSV-1细菌人工 染色 体(BAC)克隆。，下面是用于表征人膜蛋白的功能和相互作用的病毒体展示阵列专利的具体信息内容。
1.一种阵列，所述阵列包含基材以及与所述基材的表面稳定缔合的多个重组病毒体微点，其中所述重组病毒体微点包含多个重组病毒体，其中所述重组病毒体包含包膜，所述包膜包含保留它们的天然构象和/或相互作用的多种异源膜结合蛋白。
2.如权利要求1所述的阵列，其中所述重组病毒体是重组单纯疱疹病毒(HSV)病毒体。
3.如权利要求2所述的阵列，其中所述重组HSV病毒体包括单纯疱疹病毒1型(HSV-1)病毒体。
4.如权利要求3所述的阵列，其中所述多种异源膜结合蛋白是人膜结合蛋白。
5.如权利要求4所述的阵列，其中所述膜结合蛋白包括具有单个跨膜结构域的典型的I型膜蛋白。
6.如权利要求5所述的阵列，其中所述典型的I型膜蛋白包括CD4。
7.如权利要求4所述的阵列，其中所述膜结合蛋白包括多次跨越的G蛋白偶联受体
(GPCR)膜蛋白。
8.如权利要求7所述的阵列，其中所述GPCR包括GPR77。
9.如权利要求4所述的阵列，其中所述膜结合蛋白选自由以下组成的组：离子通道、受体酪氨酸激酶、受体丝氨酸/苏氨酸激酶、受体鸟苷酸环化酶、生长因子受体、激素受体及其组合。
10.如权利要求1所述的阵列，其中所述基材包括选自由以下组成的组的物质：陶瓷物质、玻璃、金属、晶体材料、塑料、聚合物或共聚物及其组合。
11.如权利要求10所述的阵列，其中所述基材包括玻璃。
12.如权利要求4所述的阵列，其中所述基材被配置为芯片、载玻片或微板。
13.如权利要求4所述的阵列，其中所述基材的表面被涂覆。
14.如权利要求13所述的阵列，其中所述涂层是增强所述重组病毒体微点或所述膜结合蛋白对所述基材的亲和力的材料。
15.如权利要求14所述的阵列，其中所述涂层选自由以下组成的组：硝酸纤维素、硅烷、硫醇、二硫化物、聚合物、包含共价键合的接头部分的衍生的单层或多层，及其组合。
16.如权利要求4所述的阵列，其中所述基材包括玻璃，并被配置为载玻片，且其中所述基材的表面或其部分用硝酸纤维素来涂覆。
17.如权利要求1-16中任一项所述的阵列，其中所述阵列的至少一个微点或每个微点中的重组病毒体仅包含一种类型的异源膜结合蛋白。
18.如权利要求1-16中任一项所述的阵列，其中所述重组病毒体阵列包含存在于所述重组病毒体阵列的单独的位置处的多种不同的膜结合蛋白。
19.如权利要求18所述的阵列，其中所述阵列的至少两个微点或每个微点包含不同的异源膜结合蛋白。
20.如权利要求1-16中任一项所述的阵列，其中所述阵列的至少两个微点或每个微点中的重组病毒体包括包含包膜的重组病毒体，所述包膜包含两种或更多种不同的异源膜结合蛋白。
21.如权利要求20所述的阵列，其中所述两种或更多种不同的异源膜结合蛋白包括构成异二聚体对的两种不同的膜结合蛋白。
22.如权利要求19所述的阵列，其中所述重组病毒体阵列的一个微点中的一个或更多个重组病毒体的包膜包含不同于由所述重组病毒体阵列的一个或更多个另外的微点中的重组病毒体的包膜包含的一种或更多种膜结合蛋白的膜结合蛋白。
23.如权利要求1-16中任一项所述的阵列，其中由所述阵列的一个微点中的重组病毒体包含的异源膜结合蛋白的类型不同于由相同阵列的一个或更多个不同微点中的重组病毒体包含的异源膜结合蛋白。
24.如权利要求1-16中任一项所述的阵列，其中所述阵列的至少两个微点或每个微点包含同一异源膜结合蛋白的不同变体。
25.如权利要求1-24中任一项所述的阵列，其中所述阵列包括微点的子阵列，其中所述子阵列的至少一个微点或每个微点包含不同的膜结合蛋白，并且其中所述子阵列被重复多次作为较大阵列的部分。
26.如权利要求23所述的阵列，其中一个微点的异源膜结合蛋白与至少一个不同微点的异源膜结合蛋白相关。
27.如权利要求26所述的阵列，其中所述相关的异源膜结合蛋白是同一蛋白家族的成员。
28.如权利要求26所述的阵列，其中所述相关的异源膜结合蛋白是功能上相关的。
29.一种用于制备包含基材的阵列的方法，所述方法包括：
(a)使包含重组病毒体的溶液与基材的表面接触从而将所述溶液转移至所述表面，所述重组病毒体包含多个重组病毒体，其中所述重组病毒体包含包膜，所述包膜包含保留它们的天然构象和/或相互作用的多种异源膜结合蛋白；以及
(b)任选地多次重复接触步骤，以提供在所述表面上的阵列中模式化的重组病毒体微点。
30.如权利要求29所述的方法，其中所述重组病毒体是重组单纯疱疹病毒(HSV)病毒体。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述重组HSV病毒体是单纯疱疹病毒1型(HSV-1)病毒体。
32.如权利要求31所述的方法，其中所述多种异源膜结合蛋白是人膜结合蛋白。
33.如权利要求32所述的方法，其中所述膜结合蛋白是具有单个跨膜结构域的典型的I型膜蛋白。
34.如权利要求33所述的方法，其中所述典型的I型膜蛋白是CD4。
35.如权利要求32所述的方法，其中所述膜结合蛋白是多次跨越的G蛋白偶联受体
(GPCR)膜蛋白。
36.如权利要求35所述的方法，其中所述GPCR是GPR77。
37.如权利要求32所述的方法，其中所述膜结合蛋白的至少一种或每种独立地选自由以下组成的组：离子通道、受体酪氨酸激酶、受体丝氨酸/苏氨酸激酶、受体鸟苷酸环化酶、生长因子受体、激素受体及其组合。
38.如权利要求31所述的方法，其中所述基材包括选自由以下组成的组的物质：陶瓷物质、玻璃、金属、晶体材料、塑料、聚合物或共聚物及其组合。
39.如权利要求38所述的方法，其中所述基材包括玻璃。
40.如权利要求32所述的方法，其中所述基材被配置为芯片、载玻片或微板。
41.如权利要求32所述的方法，其中所述基材的表面的至少部分被涂覆。
42.如权利要求41所述的方法，其中所述涂层是增强所述重组病毒体微点、所述膜结合蛋白或两者对所述基材的亲和力的材料。
43.如权利要求42所述的方法，其中所述涂层选自由以下组成的组：硝酸纤维素、硅烷、硫醇、二硫化物、聚合物、包含共价键合的接头部分的衍生的单层或多层，及其组合。
44.如权利要求32所述的方法，其中所述基材包括玻璃，并被配置为载玻片，且其中所述基材的表面用硝酸纤维素来涂覆。
45.如权利要求29-44中任一项所述的方法，其中所述阵列的至少一个微点或每个微点中的重组病毒体仅包含一种类型的异源膜结合蛋白。
46.如权利要求29-44中任一项所述的方法，其中所述重组病毒体阵列包含存在于所述重组病毒体阵列的单独的位置处的多种不同的膜结合蛋白。
47.如权利要求46所述的方法，其中所述阵列的至少两个微点或每个微点包含不同的异源膜结合蛋白。
48.如权利要求29-44中任一项所述的方法，其中所述阵列的至少一个微点或每个微点中的重组病毒体包括包含包膜的重组病毒体，所述包膜包含两种或更多种不同的异源膜结合蛋白。
49.如权利要求45所述的方法，其中所述两种或更多种不同的异源膜结合蛋白包括涉及异二聚体对的两种不同的膜结合蛋白。
50.如权利要求47所述的方法，其中所述重组病毒体阵列的一个微点中的一个或更多个重组病毒体的包膜包含不同于由所述重组病毒体阵列的一个或更多个另外的微点中的重组病毒体的包膜包含的一种或更多种膜结合蛋白的膜结合蛋白。
51.如权利要求29-44中任一项所述的方法，其中由所述阵列的一个微点中的重组病毒体包含的异源膜结合蛋白是与由相同阵列的一个或更多个不同微点中的重组病毒体包含的异源膜结合蛋白不同的类型。
52.如权利要求29-44中任一项所述的方法，其中所述阵列的至少两个微点或每个微点包含同一异源膜结合蛋白的不同变体。
53.如权利要求29-52中任一项所述的方法，其中所述阵列包括微点的子阵列，其中至少两个子阵列微点或每个子阵列微点包含不同的膜结合蛋白，并且其中所述子阵列被重复多次作为较大阵列的部分。
54.如权利要求51所述的方法，其中一个微点的异源膜结合蛋白与至少一个不同微点的异源膜结合蛋白相关。
55.如权利要求54所述的方法，其中所述相关的异源膜结合蛋白是同一蛋白家族的成员。
56.如权利要求54所述的方法，其中所述相关的异源膜结合蛋白是功能上相关的。
57.一种用于检测异源膜结合蛋白和靶之间的结合事件的方法，所述方法包括使包括包含所述靶的溶液的样品与权利要求1-28中任一项所述的阵列接触，并检测所述异源膜结合蛋白的至少一种或更多种和所述靶之间的结合事件。
58.如权利要求57所述的方法，其中所述靶被标记，且所述检测包括检测标记物的存在。
59.如权利要求58所述的方法，其中所述标记物的检测通过光学检测方法来进行，所述光学检测方法包括可见或红外范围内的吸收、化学发光、荧光、光波导、表面等离子体共振、表面电荷传感器、表面力传感器，或其组合。
60.如权利要求58所述的方法，所述方法还包括在检测之前洗涤所述基材的未结合的靶。
61.如权利要求57所述的方法，其中将所述微点的阵列与针对所述阵列的重组病毒体微点的至少一个或每个中的异源膜结合蛋白的同类标记的靶和未标记的靶一起孵育，并且所述未标记的靶和所述重组病毒体微点中的异源膜结合蛋白之间的结合事件通过测量由于所述同类标记的靶和所述未标记的靶之间的竞争所述标记物的信号的减少来确定。
62.如权利要求61所述的方法，其中在与所述未标记的靶孵育之前将所述标记的同类靶与所述阵列孵育。
63.如权利要求61所述的方法，其中所述靶是未标记的，且所述结合事件通过在界面处的物理性质的变化来确定。
64.如权利要求63所述的方法，其中在所述界面处的物理性质的变化是折射率或电阻抗的变化。
65.如权利要求57所述的方法，其中所述靶是未标记的，且所述靶的结合通过质谱来检测。
66.如权利要求57所述的方法，其中所述异源膜结合蛋白是具有单个跨膜结构域的典型的I型膜蛋白。
67.如权利要求57所述的方法，其中所述异源膜结合蛋白是多次跨越的G蛋白偶联受体(GPCR)膜蛋白。
68.如权利要求57所述的方法，其中所述异源膜结合蛋白选自由以下组成的组：离子通道、受体酪氨酸激酶、受体丝氨酸/苏氨酸激酶、受体鸟苷酸环化酶、生长因子受体以及激素受体。
69.如权利要求57-68中任一项所述的方法，其中当潜在的配体和/或药物候选物被直接筛选以确认其与所述阵列上的多种异源膜结合蛋白的至少一种或每种结合或另外的相互作用的能力时，所述方法包括筛选配体和/或药物。
70.如权利要求69所述的方法，其中多种潜在的配体和/或药物候选物被并行筛选以确认它们与所述阵列上的一种或更多种类型的异源膜结合蛋白结合或另外的相互作用的能力。
71.如权利要求57-68中任一项所述的方法，其中所述方法包括筛选多种蛋白以确认它们结合靶样品的特定组分的能力，所述方法包括直接或间接检测保留在至少一个微点或每个微点处的所述特定组分的存在或量。
72.如权利要求71所述的方法，所述方法还包括表征保留在至少一个微点处的所述特定组分的另外的步骤。
73.如权利要求57-68中任一项的权利要求所述的方法，其中所述方法包括测定蛋白-蛋白结合相互作用，包括将包含待测定结合的至少一种蛋白的样品递送至所述重组病毒体阵列，并直接或间接检测来自所述样品的被保留在至少一个微点或每个微点处的蛋白的存在或量。
74.如权利要求57-68中任一项的权利要求所述的方法，其中所述方法包括并行测定样品中能够与所述重组病毒体阵列上的一种或更多种异源膜结合蛋白反应的多种靶的存在，包括将所述样品递送至所述阵列，并检测所述靶与在至少一个重组病毒体微点或每个重组病毒体微点处的异源膜结合蛋白的相互作用。
75.如权利要求57-68中任一项的权利要求所述的方法，其中所述方法包括并行测定样品中能够结合所述重组病毒体阵列上的一种或更多种异源膜结合蛋白的多种靶的存在，包括直接或间接检测保留在至少一个微点或每个微点处的靶的存在或量。
76.如权利要求57-68中任一项的权利要求所述的方法，其中所述方法包括诊断方法，其中待被测定的所述多种靶的至少一种或每种指示受试者中的疾病状况或病原体的存在。
77.如权利要求76所述的方法，其中递送至所述阵列的所述样品包括生物样品。
78.如权利要求57-68中任一项的权利要求所述的方法，其中所述方法包括检测特异性结合所述阵列的重组病毒体微点的异源膜结合蛋白的抗体。
79.如权利要求57-68中任一项所述的方法，其中包括包含被所述阵列的重组病毒体微点中的异源膜结合蛋白结合的靶的溶液的样品的递送在封闭溶液的递送之前、之后和/或伴随封闭溶液的递送。
80.一种重组病毒体，其中所述重组病毒体包含包膜，所述包膜包含保留它们的天然构象和/或相互作用的多种异源膜结合蛋白。
81.如权利要求80所述的重组病毒体，其中所述重组病毒体是重组单纯疱疹病毒(HSV)病毒体。
82.如权利要求81所述的重组病毒体，其中所述重组HSV病毒体是单纯疱疹病毒1型(HSV-1)病毒体。
83.如权利要求82所述的重组病毒体，其中所述多种异源膜结合蛋白是人膜结合蛋白。
84.如权利要求83所述的重组病毒体，其中所述异源膜结合蛋白是具有单个跨膜结构域的典型的I型膜蛋白。
85.如权利要求84所述的重组病毒体，其中所述典型的I型膜蛋白是CD4。
86.如权利要求83所述的重组病毒体，其中所述异源膜结合蛋白是多次跨越的G蛋白偶联受体(GPCR)膜蛋白。
87.如权利要求86所述的重组病毒体，其中所述GPCR是GPR77。
88.如权利要求83所述的重组病毒体，其中所述异源膜结合蛋白选自由以下组成的组：
离子通道、受体酪氨酸激酶、受体丝氨酸/苏氨酸激酶、受体鸟苷酸环化酶、生长因子受体以及激素受体。
89.一种重组HSV-1细菌人工染色体(BAC)克隆，所述重组HSV-1细菌人工染色体(BAC)克隆编码异源膜多肽。
90.如权利要求89所述的重组HSV-1 BAC克隆，其中所述异源膜结合蛋白是人膜结合蛋白。
91.如权利要求90所述的重组HSV-1 BAC克隆，其中所述异源膜结合蛋白是具有单个跨膜结构域的典型的I型膜蛋白。
92.如权利要求91所述的重组HSV-1 BAC克隆，其中所述典型的I型膜蛋白是CD4。
93.如权利要求90所述的重组HSV-1 BAC克隆，其中所述异源膜结合蛋白是多次跨越的G蛋白偶联受体(GPCR)膜蛋白。
94.如权利要求93所述的重组HSV-1 BAC克隆，其中所述GPCR是GPR77。
95.如权利要求90所述的重组HSV-1 BAC克隆，其中所述异源膜结合蛋白选自由以下组成的组：离子通道、受体酪氨酸激酶、受体丝氨酸/苏氨酸激酶、受体鸟苷酸环化酶、生长因子受体、激素受体及其组合。
96.一种抗体的文库，所述抗体的文库包括：多种不同的抗体，其中所述多种的至少约
10％是膜结合蛋白的抗体。
97.如权利要求96所述的文库，其中所述多种的至少约20％、30％、40％、50％、60％、
70％、80％、90％、95％、99％或100％是膜结合蛋白的抗体。
98.如权利要求96或97所述的文库，其中所述多种膜结合蛋白的抗体的至少一种抗体或每种抗体是单特异性抗体。
99.如权利要求96-98所述的文库，其中所述多种膜结合蛋白的抗体的至少一种抗体或每种抗体具有对其靶膜结合蛋白的至少约10-7M(KD)的结合亲和力。
100.如权利要求99所述的文库，其中所述结合亲和力是至少约10-8M、10-9M、10-10M、10-
11M、10-12M、10-13M、10-14M、10-15M或10-16M。
101.如权利要求96-100所述的文库，其中所述多种膜结合蛋白的抗体的至少一种抗体或每种抗体结合其靶膜结合蛋白的天然形式。
102.如权利要求96-101所述的文库，其中所述多种包括至少约50种不同的抗体。
103.如权利要求102所述的文库，其中所述多种包括至少约75种、100种、125种、150种、
175种、200种、225种、250种、275种、300种、325种、350种、375种、400种、425种、450种、475种、500种、525种、550种、575种、600种、625种、650种、675种、700种、725种、750种、775种、
800种、825种、850种、875种、900种或1000种不同的抗体。
104.如权利要求96-103所述的文库，其中所述多种结合至少约0.5％的人膜结合蛋白质组或人蛋白质组。
105.如权利要求104所述的文库，其中所述多种结合至少约1％、2％、3％、4％、5％、
6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、
30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的人膜结合蛋白组或人蛋白质组。
106.如权利要求96-105所述的文库，其中所述多种膜结合蛋白的抗体的至少一种抗体或每种抗体具有在所述多种膜结合蛋白的抗体的另一种抗体的结合亲和力的至少约20％以内的对其靶的结合亲和力。
107.如权利要求106所述的文库，其中所述多种膜结合蛋白的抗体的至少一种抗体或每种抗体具有在所述多种膜结合蛋白的抗体的另一种抗体的结合亲和力的至少约1％、
2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％或19％以内的对其靶的结合亲和力。
108.如权利要求96-107所述的文库，其中所述多种膜结合蛋白的抗体的至少一种抗体或每种抗体。
109.如权利要求96-108所述的文库，其中所述多种膜结合蛋白的抗体的至少一种抗体或每种抗体是免疫沉淀抗体。
110.如权利要求96-109所述的文库，其中所述多种膜结合蛋白的抗体的至少一种抗体或每种抗体是IgG抗体。
111.一种阵列，所述阵列包括：权利要求96-110所述的抗体的文库，其中至少一种抗体或每种抗体被固定在基材上。
112.如权利要求111所述的阵列，其中所述基材是平面的。
113.如权利要求111所述的阵列，其中所述基材是颗粒。
114.如权利要求111-113所述的阵列，其中所述基材包括固体材料。
115.如权利要求111-113所述的阵列，其中所述基材包括多孔材料。
116.如权利要求111-115所述的阵列，其中所述固定是可逆的。
117.如权利要求111-115所述的阵列，其中所述固定是不可逆的。
118.一种制备权利要求96-110所述的文库的方法，所述方法包括：
(a)用人蛋白质组阵列或人膜结合蛋白质组阵列筛选一种或更多种抗体，所述一种或更多种抗体从产生抗体的细胞分离，所述产生抗体的细胞从用包含一种或更多种膜结合蛋白或膜结合蛋白的抗原的一个或更多个病毒体免疫的动物分离；以及
(b)选择对所述人蛋白质组阵列或人膜结合蛋白质组阵列上的单个靶是单特异性的抗体用于所述文库。
119.如权利要求118所述的方法，所述方法还包括在之前从所述产生抗体的细胞预筛选所述一种或更多种抗体。
120.如权利要求119所述的方法，其中所述预筛选通过免疫细胞化学来进行。
121.如权利要求119所述的方法，其中所述预筛选通过确定来自所述产生抗体的细胞的抗体与包含一种或更多种靶抗原的混合物的结合来进行。
122.如权利要求121所述的方法，其中所述混合物包括粗制裂解物、细胞、蛋白、肽、核酸，或其组合。
123.如权利要求121所述的方法，其中所述混合物包括生物样品。
124.如权利要求121所述的方法，其中所述混合物包括病毒体的混合物。
125.如权利要求119-124所述的方法，其中所述一个或更多个病毒体包含多种膜结合蛋白。
126.如权利要求119-124所述的方法，其中所述一个或更多个病毒体包含多种膜结合蛋白的抗原。
127.如权利要求119-124所述的方法，其中所述一个或更多个病毒体包含至少约100种不同的膜结合蛋白或来自膜结合蛋白的抗原。
128.如权利要求127所述的方法，其中所述一个或更多个病毒体包含至少约200种、300种、400种、500种、600种、700种、800种、900种、1,000种、2,000种、3,000种、4,000种、5,000种、5,500种、5,600种或更多种不同的膜结合蛋白或来自膜结合蛋白的抗原。
129.如权利要求119-128所述的方法，其中所述一个或更多个病毒体包含至少约0.5％的人蛋白质组或人膜结合蛋白质组。
130.如权利要求129所述的方法，其中所述一个或更多个病毒体包含至少约1％、2％、
3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、
19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的人蛋白质组或人膜结合蛋白质组。
131.如权利要求119-130所述的方法，其中所述产生抗体的细胞是B细胞。
132.如权利要求119-131所述的方法，所述方法还包括将所述抗体固定至基材。
133.如权利要求132所述的方法，其中所述基材是平面的。
134.如权利要求132所述的方法，其中所述基材是颗粒。
135.如权利要求132-134所述的方法，其中所述基材包括固体材料。
136.如权利要求132-134所述的方法，其中所述基材包括多孔材料。
137.如权利要求132-136所述的方法，其中所述固定是可逆的。
138.如权利要求132-136所述的方法，其中所述固定是不可逆的。
139.如权利要求119-138所述的方法，其中所述一个或更多个病毒体包含权利要求80-
88所述的重组病毒体。
140.一种鉴定对人膜结合蛋白是单特异性的抗体的方法，所述方法包括：
(a)使多种抗体与人膜结合蛋白质组阵列或人蛋白质组阵列接触，所述人膜结合蛋白质组阵列或人蛋白质组阵列包含靶，所述靶包含人膜结合蛋白；
(b)确定所述多种抗体和存在于所述人膜结合蛋白质组阵列或人蛋白质组阵列上的所述靶之间的结合；以及
(c)当所述抗体结合至所述人膜结合蛋白质组阵列或人蛋白质组阵列上的单个靶时鉴定抗体为单特异性的
其中存在于所述人膜结合蛋白质组阵列或人蛋白质组阵列上的所述靶被包含在病毒体的包膜内。
141.如权利要求118-140所述的方法，其中所述人蛋白质组阵列包含至少约0.5％的人蛋白质组或人膜结合蛋白质组。
142.如权利要求141所述的方法，其中所述人蛋白质组阵列包含至少约1％、2％、3％、
4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、
20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的人蛋白质组或人膜结合蛋白质组。
143.一种鉴定靶的抗体的方法，所述方法包括：
(a)使包含在病毒体的包膜内的靶与权利要求96-110所述的抗体的文库接触；
(b)确定所述包含在病毒体的包膜内的靶和多种抗体之间的结合；以及
(c)当所述包含在病毒体的包膜内的靶与所述文库的抗体结合时，鉴定所述靶的抗体。
144.一种鉴定靶的抗体的方法，所述方法包括：
(a)使包含在病毒体的包膜内的靶与权利要求111-117所述的阵列接触；
(b)确定所述包含在病毒体的包膜内的靶和所述多种抗体之间的结合；以及
(c)当所述包含在病毒体的包膜内的靶与所述阵列的抗体结合时，鉴定所述靶的抗体。
145.一种鉴定靶的方法，所述方法包括：
(a)使包含在病毒体的包膜内的靶与权利要求96-110所述的抗体的文库接触；
(b)确定所述包含在病毒体的包膜内的靶和所述多种抗体之间的结合；以及
(c)当所述包含在病毒体的包膜内的靶与所述文库的抗体结合时，鉴定所述靶。
146.一种鉴定靶的方法，所述方法包括：
(a)使包含在病毒体的包膜内的靶与权利要求111-117所述的阵列接触；
(b)确定所述包含在病毒体的包膜内的靶和多种抗体之间的结合；以及
(c)当所述包含在病毒体的包膜内的靶与所述阵列的抗体结合时，鉴定所述靶。
147.一种鉴定靶膜结合蛋白的配体的方法，所述方法包括：
(a)使包含在病毒体的包膜内的靶膜结合蛋白与配体接触；
(b)确定所述包含在病毒体的包膜内的靶和所述配体之间的结合；以及
(c)当所述包含在病毒体的包膜内的靶与所述配体结合时，鉴定所述配体为所述靶的靶。
148.一种鉴定靶膜结合蛋白的配体的方法，所述方法包括：
(a)使权利要求1-28所述的阵列与配体接触；
(b)确定所述包含在病毒体的包膜内的靶和所述配体之间的结合；以及
(c)当所述包含在病毒体的包膜内的靶与所述配体结合时，鉴定所述配体为所述靶的靶。
149.如权利要求147或148所述的方法，其中所述配体选自由以下组成的组：肽、脂质、脂肪酸、碳水化合物、小分子及其组合。
150.如权利要求147-149所述的方法，其中所述配体包含标记物。
151.如权利要求150所述的方法，其中所述标记物选自由以下组成的组：荧光染料和放射性同位素。
152.如权利要求147-151所述的方法，其中所述标记物是选自由以下组成的组的荧光染料：Fluo8、DiBAC4和ANG-2。
153.如权利要求147-152所述的方法，其中所述鉴定还包括在(a)之后使抗体与所述配体接触。
154.如权利要求147-153所述的方法，其中当与所述靶结合时，所述配体诱导所述靶的构象变化。
155.如权利要求154所述的方法，所述方法还包括使一种或更多种抗体与所述阵列接触。
156.如权利要求154所述的方法，所述方法还包括鉴定所述一种或更多种抗体中的抗体为包含诱导的构象变化的靶的抗体。
157.如权利要求147-156所述的方法，其中所述配体是药物。
158.如权利要求80-88所述的重组病毒体，其中所述膜结合蛋白包含两个或更多个亚基。
159.如权利要求158所述的重组病毒体，其中所述重组病毒体由用表达所述两个或更多个亚基的一种或更多种病毒共感染的宿主细胞来产生。
160.如权利要求159所述的重组病毒体，其中所述重组病毒体将所述两个或更多个亚基展示为复合体。
161.如权利要求80-88或157-160所述的重组病毒体，其中所述膜结合蛋白是工程化膜结合蛋白，所述工程化膜结合蛋白包含反向的拓扑结构使得所述工程化膜结合蛋白的胞质结构域展示在所述重组病毒体的外侧。
用于表征人膜蛋白的功能和相互作用的病毒体展示阵列
[0001] 交叉引用
[0002] 本申请要求于2013年6月21日提交的美国临时申请号61/837,929的权益，该申请通过引用以其整体并入本文。
[0003] 联邦政府资助的研究或开发
[0004] 本发明根据由国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的GM076102、AI063182、RR020839、RC2CA148402、U54HG006434和U24CA160036，在政府支持下做出。政府在本发明中具有一定权利。
[0005] 背景
[0006] 大约三分之一的人蛋白质组包含膜蛋白，所述膜蛋白属于具有多种生物化学活性诸如转运体、通道、受体、识别分子和粘附分子的蛋白家族。膜蛋白是对细胞存活、维持细胞内稳态、细胞信号传导、免疫监视，分子转运和细胞间通讯至关重要的分子。这类蛋白代表了多达70％的用于所有处方药物的治疗靶。因此，使能够表征呈活性构象的膜蛋白以确定它们的生物化学活性的高通量平台的开发将通过简化小分子筛选方法对药物发现具有重要影响。然而，膜蛋白，特别是携带多次通过的(multi-pass)跨膜(TM)结构域的那些，众所周知地难以研究，因为它们不得不嵌入膜中以保持天然构象且许多需要合适的翻译后修饰(PTM)，诸如在细胞分泌途径中的转运期间发生的糖基化。尽管膜蛋白微阵列先前已被报道，使用去垢剂的生物化学纯化限制了通量和随后的操作。(Fang等(2002)J.Am.Chem.Soc.124:2394-5；Tang等(2006)Anal.Chem.78:711-7(2006))。
[0007] 在生物医学界也存在对制备膜蛋白的最高可能质量、可重现抗体试剂的可靠的技术的需求。该技术工艺过程(technology pipeline)的持续改进将直接有益于健康研究界和更大的生物医学界。
[0008] 使用抗体检测单次通过的膜结合蛋白和多次通过的膜结合蛋白可用于鉴定新的生物标志物并进行许多测定。例如，抗体还广泛用于诊断应用，诸如用于临床医学(例如，ELISA和放射免疫测定系统)。在病理学实验室中，细胞和组织的分析包括对组织切片和在流式细胞术分析中使用抗体。抗体还用作治疗剂。
[0009] 抗体的制备可以是昂贵且耗时的，因此用于高通量制备抗体，特别是膜蛋白的高度特异性抗体的更具成本效益和耗时较少的方法是可期望的。本公开内容满足了这些需求，并提供了相关的优势。
[0010] 概述
[0011] 在一些方面，本公开的主题提供了一种阵列，所述阵列包含与基材的表面稳定缔合的多个重组病毒体微点(virion microspot)，其中所述重组病毒体微点包含多个重组病毒体，其中所述重组病毒体包含包膜，所述包膜包含保留它们的天然构象和/或相互作用的多种异源膜结合蛋白。在某些方面，重组病毒体是重组单纯疱疹病毒(HSV)病毒体，例如，单纯疱疹病毒1型(HSV-1)病毒体。在其他方面，所述多种异源膜结合蛋白是人膜结合蛋白，包括具有单个跨膜结构域的典型的I型膜蛋白(例如，CD4)，或多次跨越的G-蛋白偶联受体(GPCR)膜蛋白(例如，GPR77)。在其他方面，膜结合蛋白选自由以下组成的组：离子通道、受体酪氨酸激酶、受体丝氨酸/苏氨酸激酶、受体鸟苷酸环化酶、生长因子受体、和激素受体。
[0012] 在其他方面，阵列的基材包括选自由以下组成的组的物质：陶瓷物质、玻璃、金属、晶体材料、塑料、聚合物或共聚物及其组合。在另外的方面，基材可配置为芯片、载玻片或微板。在仍然另外的方面，基材的表面可被涂覆，例如，其中涂层可以是增强重组病毒体微点或膜结合蛋白对所述基材的亲和力的材料。在一些方面，涂层可选自由以下组成的组：硝酸纤维素、硅烷、硫醇、二硫化物、聚合物和包含共价键合的接头部分的衍生的单层或多层。在一个特定方面，阵列的基材包括玻璃，其中，基材可配置为载玻片，并且其中基材的表面可用硝酸纤维素来涂覆。
[0013] 在一些方面，阵列的至少一个微点或每个微点中的重组病毒体仅包含一种类型的异源膜结合蛋白。在其他方面，重组病毒体阵列包含存在于所述重组病毒体阵列的单独的位置处的多种不同的膜结合蛋白。在另外的方面，阵列的至少一个微点或每个微点包含不同的异源膜结合蛋白。在仍然另外的方面，阵列的至少一个微点或每个微点中的重组病毒体包括包含包膜的重组病毒体，所述包膜包含两种或更多种不同的异源膜结合蛋白，包括其中所述两种或更多种不同的异源膜结合蛋白包括涉及异二聚体对的两种不同的膜结合蛋白。在其他方面，重组病毒体阵列的一个微点中的一个或更多个重组病毒体的包膜包含不同于由所述重组病毒体阵列的一个或更多个另外的微点中的重组病毒体的包膜包含的一种或更多种膜结合蛋白的膜结合蛋白。在另外的方面，由阵列的一个微点中的重组病毒体包含的异源膜结合蛋白的类型不同于由相同阵列的一个或更多个不同微点中的重组病毒体包含的异源膜结合蛋白。在另一个方面，阵列的至少一个微点或每个微点包含同一异源膜结合蛋白的不同变体。在仍然另外的方面，阵列包括微点的子阵列，其中至少一个微点或每个微点包含不同的膜结合蛋白，并且其中，所述子阵列可被重复多次作为较大阵列的部分。在其他方面，一个微点的异源膜结合蛋白可与至少一个不同微点的异源膜结合蛋白相关，例如，其中相关的异源膜结合蛋白是同一蛋白家族的成员和/或是功能上相关的。在一些方面，膜结合蛋白包含两个或更多个亚基。在一些方面，重组病毒体可由用表达两个或更多个亚基的一种或更多种病毒共感染的宿主细胞来产生。在一些方面，重组病毒体将两个或更多个亚基展示为复合体。在一些方面，膜结合蛋白可以是工程化膜结合蛋白，所述工程化膜结合蛋白包含反向的拓扑结构使得所述工程化膜结合蛋白的胞质结构域能够被展示在重组病毒体的外侧。
[0014] 在一些方面，提供了一种用于制备包含与基材的表面稳定缔合的多个重组病毒体微点的阵列的方法，所述方法包括：(a)提供具有表面的基材；(b)提供包含重组病毒体的溶液，所述重组病毒体包含多个重组病毒体，其中所述重组病毒体包含包膜，所述包膜包含保留它们的天然构象和/或相互作用的多种异源膜结合蛋白，所述重组病毒体例如，HSV病毒体，例如，HSV-1病毒体；(c)将针的尖端浸入所述溶液；(d)从所述溶液取出所述尖端，以提供粘附至所述尖端的溶液；(e)使所述溶液与所述表面接触从而将所述溶液从所述尖端转移至所述表面；以及(f)多次重复接触步骤以提供在所述表面上的阵列中模式化的重组病毒体微点。
[0015] 在其他方面，提供了一种用于检测异源膜结合蛋白和靶之间的结合事件的方法，所述方法包括使包括包含所述靶的溶液的样品与重组病毒体阵列接触，并检测异源膜结合蛋白的至少一种或更多种和靶之间的结合事件。靶可以被标记，并且检测步骤可包括通过光学检测方法检测标记物的存在。在另一个方面，微点的阵列可与针对所述阵列的重组病毒体微点中的异源膜结合蛋白的同类(cognate)标记的靶和未标记的靶一起孵育，并且未标记的靶和重组病毒体微点中的异源膜结合蛋白之间的结合事件可通过测量由于同类标记的靶和未标记的靶之间的竞争标记物的信号的减少来确定。在其中靶可以是未标记的情况下，结合事件可通过在界面处的物理性质的变化或通过质谱来确定。
[0016] 在一些方面，当潜在的配体和/或药物候选物可被直接筛选以确定其与阵列上的多种异源膜结合蛋白结合或另外的相互作用的能力时，用于用重组病毒体阵列检测异源膜结合蛋白和靶之间的结合事件的方法包括筛选配体和/或药物。多种潜在的配体和/或药物候选物可并行筛选以确认它们与阵列上的一种或更多种类型的异源膜结合蛋白结合或另外的相互作用的能力。在其他方面，用于检测结合事件的方法包括：
[0017] (a)筛选多种蛋白以确定它们结合靶样品的特定组分的能力，包括直接或间接检测保留在至少一个微点或每个微点处的特定组分的存在或量，任选地还包括表征保留在至少一个微点处的特定组分的另外的步骤；
[0018] (b)检测结合事件包括测定蛋白-蛋白结合相互作用，包括将包含待测定结合的至少一种蛋白的样品递送至重组病毒体阵列，并直接或间接检测来自样品的可被保留在至少一个微点或每个微点处的蛋白的存在或量；
[0019] (c)并行测定样品中能够与重组病毒体阵列上的一种或更多种异源膜结合蛋白反应的多种靶的存在，包括将样品递送至阵列，并检测靶与在至少一个重组病毒体微点或每个重组病毒体微点处的异源膜结合蛋白的相互作用；
[0020] (d)并行测定样品中能够结合重组病毒体阵列上的一种或更多种异源膜结合蛋白的多种靶的存在，包括直接或间接检测保留在至少一个微点或每个微点处的靶的存在或量；
[0021] (e)诊断方法，其中待被测定的多种靶指示受试者中的疾病状况或病原体的存在，例如，其中递送至阵列的样品包括生物样品；和/或
[0022] (f)检测特异性结合阵列的重组病毒体微点中的异源膜结合蛋白的抗体。
[0023] 在以上所列方法的任一种内，包括包含被阵列的重组病毒体微点中的异源膜结合蛋白结合的靶的溶液的样品的递送可在封闭溶液的递送之前、之后和/或伴随封闭溶液的递送。
[0024] 在其他方面，提供了重组病毒体，其中所述重组病毒体包含包膜，所述包膜包含保留它们的天然构象和/或相互作用的多种异源膜结合蛋白，例如，其中所述重组病毒体可以是重组HSV病毒体，例如，其中所述HSV病毒体可以是HSV-1病毒体。在其他方面，所述多种异源膜结合蛋白是人膜结合蛋白，包括具有单个跨膜结构域的典型的I型膜蛋白(例如，CD4)，或多次跨越的G-蛋白偶联受体(GPCR)膜蛋白(例如，GPR77)。在其他方面，膜结合蛋白选自由以下组成的组：离子通道、受体酪氨酸激酶、受体丝氨酸/苏氨酸激酶、受体鸟苷酸环化酶、生长因子受体、和激素受体。
[0025] 在另外的方面，提供了编码异源膜多肽的重组HSV-1细菌人工染色体(BAC)克隆。在特定的方面，HSV-1BAC克隆的异源膜结合蛋白可以是人膜结合蛋白，包括具有单个跨膜结构域的典型的I型膜蛋白(例如，CD4)，或多次跨越的G-蛋白偶联受体(GPCR)膜蛋白(例如，GPR77)。在其他方面，膜结合蛋白选自由以下组成的组：离子通道、受体酪氨酸激酶、受体丝氨酸/苏氨酸激酶、受体鸟苷酸环化酶、生长因子受体、和激素受体。
[0026] 在一些方面，提供了抗体的文库，所述抗体的文库包括：多种不同的抗体，其中所述多种的至少10％是膜结合蛋白的抗体。在一些方面，所述多种的至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％是膜结合蛋白的抗体。在一些方面，多种膜结合蛋白的抗体的至少一种抗体或每种抗体可以是单特异性抗体。在一些方面，多种膜结合蛋白的抗体的至少一种抗体或每种抗体具有对其靶膜结合蛋白的至少10-7M(KD)的结合亲和力。在一些方面，结合亲和力可以是至少10-8M、10-9M、10-10M、10-11M、10-12M、10-13M、10-
14 -15 -16
M、10 M、或10 M。在一些方面，多种膜结合蛋白的抗体的至少一种或每种抗体结合其靶膜结合蛋白的天然形式。
14 -15 -16
M、10 M、或10 M。在一些方面，多种膜结合蛋白的抗体的至少一种或每种抗体结合其靶膜结合蛋白的天然形式。
[0027] 在一些方面，所述多种抗体包括至少50种不同的抗体。在一些方面，所述多种抗体包括至少75种、100种、125种、150种、175种、200种、225种、250种、275种、300种、325种、350种、375种、400种、425种、450种、475种、500种、525种、550种、575种、600种、625种、650种、675种、700种、725种、750种、775种、800种、825种、850种、875种、900种或1000种不同的抗体。
[0028] 在一些方面，所述多种抗体结合至少0.5％的人膜结合蛋白组或人蛋白质组。在一些方面，所述多种抗体结合至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、
60％、70％、80％、90％、或100％的人膜结合蛋白质组或人蛋白质组。在一些方面，多种膜结合蛋白的抗体的至少一种抗体或每种抗体具有可在多种膜结合蛋白的抗体的另一种抗体的结合亲和力的至少20％以内的对其靶的结合亲和力。在一些方面，多种膜结合蛋白的抗体的至少一种抗体或每种抗体具有可在多种膜结合蛋白的抗体的另一种抗体的结合亲和力的至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、
16％、17％、18％或19％以内的对其靶的结合亲和力。在一些方面，多种膜结合蛋白的抗体的至少一种抗体或每种抗体。在一些方面，多种膜结合蛋白的抗体的至少一种抗体或每种抗体可以是免疫沉淀抗体。在一些方面，多种膜结合蛋白的抗体的至少一种抗体或每种抗体可以是IgG抗体。
60％、70％、80％、90％、或100％的人膜结合蛋白质组或人蛋白质组。在一些方面，多种膜结合蛋白的抗体的至少一种抗体或每种抗体具有可在多种膜结合蛋白的抗体的另一种抗体的结合亲和力的至少20％以内的对其靶的结合亲和力。在一些方面，多种膜结合蛋白的抗体的至少一种抗体或每种抗体具有可在多种膜结合蛋白的抗体的另一种抗体的结合亲和力的至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、
16％、17％、18％或19％以内的对其靶的结合亲和力。在一些方面，多种膜结合蛋白的抗体的至少一种抗体或每种抗体。在一些方面，多种膜结合蛋白的抗体的至少一种抗体或每种抗体可以是免疫沉淀抗体。在一些方面，多种膜结合蛋白的抗体的至少一种抗体或每种抗体可以是IgG抗体。
[0029] 在一些方面，提供了阵列，所述阵列包括：本文描述的抗体的文库，其中至少一种抗体或每种抗体可被固定在基材上。在一些方面，基材可以是平面的。在一些方面，基材可以是颗粒。在一些方面，基材包括固体材料。在一些方面，基材包括多孔材料。在一些方面，固定可以是可逆的。在一些方面，固定可以是不可逆的。
[0030] 在一些方面，提供了制备如本文描述的文库的方法，所述方法包括：a)用包含一种或更多种膜结合蛋白或膜结合蛋白的抗原的一个或更多个病毒体免疫动物；b)从所述动物分离产生抗体的细胞；c)从所述产生抗体的细胞分离一种或更多种抗体；d)用人蛋白质组阵列或人膜结合蛋白质组阵列筛选步骤c)的一种或更多种抗体；以及e)选择对人蛋白质组阵列或人膜结合蛋白质组阵列上的单个靶是单特异性的抗体用于文库。在一些方面，所述方法还包括在抗体分离之前从产生抗体的细胞预筛选一种或更多种抗体。在一些方面，预筛选通过进行免疫细胞化学来进行。在一些方面，预筛选通过确定来自产生抗体的细胞的抗体与包含一种或更多种靶抗原的混合物的结合来进行。在一些方面，混合物包括粗制裂解物、细胞、蛋白、肽、核酸、或其组合。在一些方面，混合物包括生物样品。在一些方面，混合物包括病毒体的混合物。在一些方面，一个或更多个病毒体包含多种膜结合蛋白。在一些方面，一个或更多个病毒体包含多种膜结合蛋白的抗原。在一些方面，一个或更多个病毒体包含至少100种不同的膜结合蛋白或来自膜结合蛋白的抗原。在一些方面，一个或更多个病毒体包含至少200种、300种、400种、500种、600种、700种、800种、900种、1,000种、2,000种、3,000种、4,000种、5,000种、5,500种、5,600种或更多种不同的膜结合蛋白或来自膜结合蛋白的抗原。在一些方面，一个或更多个病毒体包含至少0.5％的人蛋白质组或人膜结合蛋白质组。在一些方面，一个或更多个病毒体包含至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、
10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、
45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的人蛋白质组或人膜结合蛋白质组。在一些方面，产生抗体的细胞是B细胞。在一些方面，包括将抗体固定至基材。在一些方面，基材可以是平面的。在一些方面，基材可以是颗粒。在一些方面，基材包括固体材料。在一些方面，基材包括多孔材料。在一些方面，固定可以是可逆的。在一些方面，固定可以是不可逆的。在一些方面，一个或更多个病毒体包括本文描述的任一种重组病毒体。
10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、
45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的人蛋白质组或人膜结合蛋白质组。在一些方面，产生抗体的细胞是B细胞。在一些方面，包括将抗体固定至基材。在一些方面，基材可以是平面的。在一些方面，基材可以是颗粒。在一些方面，基材包括固体材料。在一些方面，基材包括多孔材料。在一些方面，固定可以是可逆的。在一些方面，固定可以是不可逆的。在一些方面，一个或更多个病毒体包括本文描述的任一种重组病毒体。
[0031] 在一些方面，提供了一种鉴定对人膜结合蛋白是单特异性的抗体的方法，所述方法包括：使多种抗体与人膜结合蛋白质组阵列或人蛋白质组阵列接触，所述人膜结合蛋白质组阵列或人蛋白质组阵列包含靶，所述靶包含人膜结合蛋白；确定所述多种抗体和存在于所述人膜结合蛋白质组阵列或人蛋白质组阵列上的靶之间的结合；以及当抗体结合至所述人膜结合蛋白质组阵列或人蛋白质组阵列上的单个靶时鉴定所述抗体为单特异性的，其中存在于所述人膜结合蛋白质组阵列或人蛋白质组阵列上的靶被包含在病毒体的包膜内。在一些方面，人蛋白质组阵列包含至少0.5％的人蛋白质组或人膜结合蛋白质组。在一些方面，人蛋白质组阵列包含至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、
13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、
70％、80％、90％或100％的人蛋白质组或人膜结合蛋白质组。
13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、
70％、80％、90％或100％的人蛋白质组或人膜结合蛋白质组。
[0032] 在一些方面，提供了鉴定靶的抗体的方法，所述方法包括：使包含在病毒体的包膜内的靶与本文描述的抗体的文库接触；确定所述包含在病毒体的包膜内的靶和多种抗体之间的结合；以及当所述包含在病毒体的包膜内的靶与所述文库的抗体结合时，鉴定所述靶的抗体。
[0033] 在一些方面，提供了鉴定靶的抗体的方法，所述方法包括：使包含在病毒体的包膜内的靶与本文描述的阵列接触；确定所述包含在病毒体的包膜内的靶和多种抗体之间的结合；以及当所述包含在病毒体的包膜内的靶与所述阵列的抗体结合时，鉴定所述靶的抗体。
[0034] 在一些方面，提供了鉴定靶的方法，所述方法包括：使包含在病毒体的包膜内的靶与本文描述的抗体的文库接触；确定所述包含在病毒体的包膜内的靶和多种抗体之间的结合；以及当所述包含在病毒体的包膜内的靶与所述文库的抗体结合时，鉴定所述靶。
[0035] 在一些方面，提供了鉴定靶的方法，所述方法包括：使包含在病毒体的包膜内的靶与本文描述的阵列接触；确定所述包含在病毒体的包膜内的靶和多种抗体之间的结合；以及当所述包含在病毒体的包膜内的靶与所述阵列的抗体结合时，鉴定所述靶。
[0036] 在一些方面，提供了鉴定靶膜结合蛋白的配体的方法，所述方法包括：使包含在病毒体的包膜内的靶膜结合蛋白与配体接触；确定所述包含在病毒体的包膜内的靶和所述配体之间的结合；以及当所述包含在病毒体的包膜内的靶与所述配体结合时，鉴定所述配体为所述靶的靶。
[0037] 在一些方面，提供一种鉴定靶膜结合蛋白的配体的方法，所述方法包括：使本文描述的阵列与配体接触；确定包含在病毒体的包膜内的靶和所述配体之间的结合；以及当包含在病毒体的包膜内的靶与所述配体结合时，鉴定所述配体为所述靶的靶。在一些方面，配体选自由以下组成的组：肽、脂质、脂肪酸和小分子。在一些方面，配体包含标记物。在一些方面，标记物选自由以下组成的组：荧光染料和放射性同位素。在一些方面，标记物可以是选自由以下组成的组的荧光染料：Fluo8、DiBAC4和ANG-2。在一些方面，鉴定还包括在(a)之后使抗体与配体接触。在一些方面，当与靶结合时，配体诱导所述靶的构象变化。在一些方面，所述方法还包括使一种或更多种抗体与阵列接触。在一些方面，所述方法还包括鉴定一种或更多种抗体中的抗体为包含诱导的构象变化的靶的抗体。在一些方面，配体可以是药物。
[0039] 通过引用并入
[0040] 在本申请中引用的所有文件或文件的部分，包括但不限于，出版物、专利、专利申请、文章、书籍、手册和专著在此通过引用以其整体明确地并入用于任何目的，其程度如同每个单独的文件被具体和单独地指出通过引用并入一样。
[0041] 例如，为了描述和公开在出版物中描述的试剂盒、组合物和方法的目的，将本文提到的所有出版物和专利通过引用以其整体并入本文，其可与本文描述的方法、试剂盒和组合物关联使用。提供本文讨论的文件仅由于它们的公开内容在本申请的递交日期之前。本文中的任何内容都不被解释为承认在本文描述的本发明人由于在先发明或出于任何其他原因而无权早于此类公开内容。
[0042] 附图简述
[0043] 如此以一般术语描述了本公开的主题，现将参考附图，其不必然按比例绘制，且其中：
[0044] 图1示出了VirD阵列的开发。(A)用于病毒体展示系统的两种策略的示意图。第一种利用了加V5表位标签的CD4或GPR77分子从gB启动子的表达，且第二种使用通过将CD4或GPR77的胞外域融合至糖蛋白C的TM和C-末端的嵌合表达方法。CD4或GPR77信号肽(SP)被示出。表达这些工程化人基因的重组HSV-1病毒用于感染哺乳动物细胞，并且从这些细胞释放的将人膜蛋白掺入病毒体包膜的病毒被纯化并印制在FAST载玻片上。(B)用重组病毒感染的HFT细胞的共聚焦分析，显示了CD4和GPR77的细胞表面表达。gD的细胞表面表达显示了每幅图的插图中相似感染的细胞。从gB启动子表达的CD4和GPR77的细胞内分布通过在细胞透化之后用抗V5抗体染色可视化。放大率是100X。(C)CD4和GPR77在感染的细胞裂解物中的表达和这些蛋白在成熟病毒体中的掺入通过使用抗V5抗体的蛋白印迹分析来证实。(D)CD4的掺入和该分子在病毒体中的构象通过用抗CD4(PE缀合的)抗体标记纯化的病毒体然后通过FACS分析该病毒体来检查。
[0045] 图2示出了对VirD阵列的功能和相互作用测定。VirD阵列的布局在图的中部示出。(A)固定在VirD阵列上的病毒体的完整性通过抗gD抗体和抗VP5抗体来证实。所有七种病毒体显示强的抗gD信号而低的得多的抗VP5信号。对VirD阵列使用1％NP40的温和去垢剂处理显著减少了抗gD信号并增加了抗VP5信号。(B)VirD阵列上的凝集素-聚糖相互作用。荧光标记的凝集素(即，SNA-II、PHA-L、CA和WGA)被探测以表征VirD阵列上的聚糖结构。(C)抗CD4抗体染色。对gB:CD4病毒体和CD4-gC病毒体观察到强的且特异性的信号。(D)抗GPR77抗体染色和GPR77-C5a相互作用。对gB:GPR77病毒体和GPR77-gC病毒体观察到强的且特异性的信号，并且Cy5标记的C5a显示了对GPR77-gC病毒体的强的结合活性，以及对gB:GPR77病毒体的较弱的结合信号，但未显示对其他病毒体的可检测的信号。
[0046] 图3示出了用gB:CD4感染的HFT细胞的共聚焦分析，显示gD和CD4的细胞内分布。使用抗CD4抗体和抗V5抗体两者对CD4染色成像，显示了CD4在细胞内的相似分布。放大率是100X。
[0047] 图4示出了使用针对CD4和GPR77的胞外域的抗体的ELISA实验用于进一步显示HSV病毒体中这些分子的掺入和正确展示。
[0048] 图5示出了可通过抗gD抗体检测到VirD阵列上每个点低至50,000个病毒体(KOS噬斑形成单位)，且抗gD信号在滴度增加至>400,000个病毒体之后开始达到饱和。
[0049] 图6示出了抗gB和抗gC染色，证实了gB蛋白和gC蛋白分别在gB:CD4/GPR77病毒体和CD4/GPR77-gC病毒体中的不存在。NP40处理极大地减少了抗gB和抗gC信号。
[0050] 图7示出了使用表达人GPCR的重组HSV-1病毒作为抗原感染用于抗体制备的宿主产生的针对人GPCR的抗体。
[0051] 详述
[0052] 本公开的主题现将参考附图在下文更充分地被描述，其中本公开的主题的一些而非所有实施方案被示出。同类数始终指同类要素。本公开的主题可以以许多不同的形式来体现并且不应该被解释为限于本文列出的实施方案；相反，提供这些实施方案使得本公开内容将满足适用的法律要求。事实上，本文列出的许多修改形式和其他实施方案将为本公开的主题所属领域内的得益于前述描述和相关附图中展示的教导的技术人员所想到。因此，应该理解，本公开的主题不限于公开的具体实施方案并且修改形式和其他实施方案预期被包括在所附权利要求书的范围内。
[0053] 本文使用的章节标题仅用于组织目的，并且不被解释为限制所描述的主题。
[0054] 应当理解，本文描述的方法和组合物不限于本文描述的特定方法、方案、细胞系、构建体和试剂，并因此可发生变化。还应当理解，本文使用的术语仅是用于描述特定实施方案的目的并且不预期限制本文描述的方法和组合物的范围，本文描述的方法和组合物的范围将仅由所附的权利要求书限制。
[0055] 为了说明，以下参考实例应用描述了若干方面。应该理解，许多具体细节、关系和方法被列出，以提供本文描述的特征的充分理解。然而，相关领域的普通技术人员将容易认识到本文描述的特征可在没有一个或更多个具体细节的情况下或用其他方法来实践。本文描述的特征不受动作或事件的所示顺序限制，因为一些动作可以以不同的顺序和/或与其他动作或事件同时发生。此外，并不是所有示出的动作或事件都是实施根据本文描述的特征的方法所要求的。
[0056] 除非另外定义，本文使用的所有技术术语和科学术语具有与本发明要求保护的主题所属领域的技术人员通常理解的相同的含义。在对于本文的术语存在多个定义的情况下，以本章节的那些为准。当参考URL或其他此类标识符或地址时，应当理解，此类标识符可以改变，并且在因特网上的特定信息可更换，但等效信息可通过搜索互联网找到。对其的参考证明此类信息的可得性和公共传播。
[0057] 应该理解，前述一般性描述和以下详细描述仅是示例性的和说明性的，而不限制任何要求保护的主题。在本申请中，除非另外具体说明，单数的使用包括复数。必须注意，除非上下文另外清楚地指示，如在说明书和所附权利要求书中使用的，单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”包括复数指示物。在本申请中，除非另外说明，“或”的使用意指“和/或”。此外，术语“包括(including)”以及其他形式，诸如“包括(include)”、“包括(includes)”和“包括(included)”的使用不是限制性的(以类似于术语“包含(comprising)”的方式)。
[0058] 术语“约”或“大约”可意指在如由本领域普通技术人员确定的特定值的可接受误差范围之内，其将部分地取决于值如何被测量或确定，即，测量系统的局限性。例如，“约”可意指在本领域中每次实践的1个或多于1个标准差内。可选地，“约”可意指给定值的多达20％、多达10％、多达5％或多达1％的范围。可选地，例如，关于生物系统或过程，该术语可意指在值的数量级内，在值的5倍内，且更优选地在值的2倍内。在特定值在本申请和权利要求书中被描述的情况下，除非另外说明，应假定术语“约”意指在特定值的可接受的误差范围内。
[0059] 此外，当与一个或更多个数值或数值范围关联使用时，术语“约”应理解为指所有此类数值，包括范围内的所有数值以及通过将边界延伸至高于和低于所列出的数值修改该范围。通过端点引述的数值范围包括归入该范围内的所有数值例如全部的整数，包括其分数(例如，1至5的引述包括1、2、3、4和5，以及其分数，例如1.5、2.25、3.75、4.1等)以及在该范围内的任何范围。
[0060] I.重组病毒体阵列
[0061] 本公开的主题至少部分地涉及新的微阵列的开发，所述微阵列包含保留它们的天然构象和/或相互作用的人膜蛋白。如以下更充分描述的，在某些方面，单次通过的人膜蛋白和多次通过的人膜蛋白两者可被工程化为展示在病毒体，例如，单纯疱疹病毒体的包膜中，并且然后纯化的病毒体可被印制在例如玻璃载玻片上，以形成高密度病毒体展示(Virion Display，VirD)阵列，使得展示的蛋白保留它们的天然构象和/或相互作用。
[0062] 因此，在一个实施方案中，本公开的主题提供了一种阵列，所述阵列包含与基材的表面稳定缔合的多个重组病毒体微点，其中所述重组病毒体微点包含多个重组病毒体，其中所述重组病毒体包含包膜，所述包膜包含保留它们的天然构象和/或相互作用的多种异源膜结合蛋白。在特定的实施方案中，异源膜结合蛋白是人膜结合蛋白。
[0063] 阵列
[0064] 阵列可各自包含至少一种包含表面的基材，具有覆盖所述表面的多个重组病毒体微点。阵列上的至少一个重组病毒体微点或每个重组病毒体微点包含多个重组病毒体，其中重组病毒体包含包膜，所述包膜包含保留它们的天然构象和/或相互作用的多种异源膜结合蛋白，例如，人膜结合蛋白。阵列的基材的表面还可被不包含多个重组病毒体的微点覆盖。例如，微点可包含试剂、蛋白质、核酸或充当校准点、对照点等的其他物质。
[0065] 基材的表面上的所有微点的密度可以是至少约1个/cm2或至少约10个/cm2，多达约1000个/cm2或多达约500个/cm2。在某些实施方案中，基材的表面上的所有微点的密度可以是多达约400个/cm2、多达约300个/cm2、多达约200个/cm2、多达约100个/cm2、多达约90个/cm2、多达约80个/cm2、多达约70个/cm2、多达约60个/cm2或多达约50个/cm2。
[0066] 阵列上的微点可以是任何适宜的形状，包括圆形、椭圆体、椭圆形、环形或一些其他类似地弯曲的形状，其中形状在某些实施方案中可以是制备阵列采用的特定方法的结果。微点可以以任何适宜的模式横跨阵列的表面或在阵列的表面上被布置，诸如以行和列以便形成网格、以圆形模式等，其中点的模式通常将以横跨基材的表面的网格形式存在。
[0067] 在阵列中，微点可与基材的表面稳定缔合。“稳定缔合”可意指微点在结合和/或洗涤条件下相对于基材保持它们的位置(例如，当抽取通过空气-水分界面时，微点保留在位置中并保留生物功能)。因此，被微点包含的重组病毒体或其他物质可与基材表面非共价地或共价地稳定缔合。非共价缔合的实例包括非特异性吸附、基于静电的结合(例如离子、离子对相互作用)、疏水性相互作用、氢键相互作用、表面水合力等。共价结合的实例包括在重组病毒体微点和存在于基材表面的官能团(例如-NH2)之间形成的共价键，其中该官能团可天然存在或作为引入的涂层材料的成员存在。
[0068] 在一个实施方案中，阵列的至少一个微点或每个微点中的重组病毒体可仅包含一种类型的异源膜结合蛋白。然而，在某些实施方案中，单个微点可包含重组病毒体，该重组病毒体包含包膜，该包膜包含多种(即，两种或更多种)不同的异源膜结合蛋白。例如，涉及异二聚体对的两种不同的膜结合蛋白可被包含在一个微点中的重组病毒体的包膜中(参见，例如，heterodimerization of some GPCRs for their biological functions；Angers等(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,97:3684-3689)。在其他实施方案中，为了确定异源膜结合蛋白的功能活性，生物膜微点可包括必需的共同效应物(co-effector)和/或衔接子(例如，用于确定GPCR活性)。
[0069] 多核苷酸和多肽
[0070] 如本文所用的，“基因”指包含能够在被转录和翻译之后编码特定蛋白的至少一个开放阅读框的多核苷酸。
[0071] 如本文所用的，“核酸”或“多核苷酸”指核糖核苷(腺苷、鸟苷、尿苷或胞苷；“RNA分子”)或脱氧核糖核苷(脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胸苷、或脱氧胞苷；“DNA分子”)的呈单链形式或双链螺旋的磷酸酯聚合物形式，或其任何磷酸酯类似物，诸如硫代磷酸酯和硫酯。双链DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-RNA螺旋是可能的。术语核酸分子，并且特别是DNA或RNA分子，可仅指该分子的初级和二级结构，并且不将其限于任何特定的三级形式。因此，该术语包括特别是在线性DNA分子或环状DNA分子(例如，限制性片段)、质粒和染色体中发现的双链DNA。在讨论特定的双链DNA分子的结构时，序列可根据仅给出沿着DNA的非转录链的5'至3'方向的序列(即，具有与mRNA同源的序列的链)的一般惯例在本文被描述。“重组DNA分子”可以是经历了分子生物学操作的DNA分子。
[0072] 多核苷酸片段指长度相对于参考核酸减少并且包括在共有部分与参考核酸相同的核苷酸序列的核苷酸序列。根据本公开的主题的此类核酸片段在适当的情况下可被包含在较大的多核苷酸内，所述核酸片段可以是其组分。此类片段包括长度范围是根据本公开的主题的核酸的至少约6个、8个、9个、10个、12个、15个、18个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、30个、39个、40个、42个、45个、48个、50个、51个、54个、57个、60个、63个、66个、70个、75个、78个、80个、90个、100个、105个、120个、135个、150个、200个、300个、500个、720个、900个、1000个或1500个连续的核苷酸的寡核苷酸或可选地由其组成。
[0073] 术语“重组多核苷酸”可指已被人工设计并包括在它们的初始天然环境中未被发现作为连续多核苷酸序列的至少约两个多核苷酸序列的多核苷酸。
[0074] 术语“纯化的多核苷酸”或“纯化的多核苷酸载体”可描述已从其他化合物包括但不限于其他核酸、碳水化合物、脂质和蛋白(诸如在合成多核苷酸中使用的酶)分离的多核苷酸或多核苷酸载体，或从线性多核苷酸分离共价闭合的多核苷酸。当至少约50％，优选地60％至75％的样品展现出单一的多核苷酸序列和构象(线性对比共价闭合的)时，多核苷酸可以是基本上纯的。基本上纯的多核苷酸通常包含约50％，优选地60％至90％重量/重量的核酸样品，更通常约95％，并且优选地是超过约99％纯。多核苷酸纯度或同质性可通过本领域熟知的许多方法来指示，所述方法诸如样品的琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，随后在染色凝胶之后可视化单一多核苷酸条带。为了某些目的，更高的分辨率可通过使用高效液相色谱(HPLC)或本领域熟知的其他方法来提供。
[0075] 术语“多肽”指氨基酸的聚合物，不考虑聚合物的长度；由此，肽、寡肽和蛋白包括在多肽的定义内。该术语也没有指定或排除多肽的翻译后修饰。例如，包括糖基基团、乙酰基基团、磷酸基团、脂质基团等的共价附连的多肽被术语多肽明确涵盖。该定义还包括包含氨基酸的一个或更多个类似物(包括，例如，非天然存在的氨基酸、仅天然存在于不相关的生物系统的氨基酸、来自哺乳动物系统的修饰的氨基酸等等)的多肽，具有置换的连键以及本领域已知的其他修饰(天然存在的和非天然存在两者)的多肽。
[0076] 术语“重组多肽”可指已被人工设计并包括在它们的初始天然环境中未被发现作为连续多肽序列的至少两个多肽序列的多肽，或指已从重组多核苷酸表达的多肽。
[0077] 术语“纯化的多肽”可描述已从其他化合物分离的多肽，所述其他化合物包括但不限于核酸、脂质、碳水化合物和其他蛋白。当样品包含至少约50％，优选地60％至75％的单一的多肽序列时，多肽可以是基本上纯的。基本上纯的多肽通常包含约50％，优选地60％至90％，更优选地95％至99％重量/重量的肽样品。多肽纯度或同质性可通过本领域熟知的许多方法来指示，所述方法诸如样品的琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，随后在染色凝胶之后可视化多肽条带。为了某些目的，更高的分辨率可通过使用HPLC或本领域熟知的其他方法来提供。
[0078] 术语“分离的”需要将材料从其原始环境(例如，天然环境(如果其是天然存在的))移出。例如，存在于活的动物中的天然存在的多核苷酸或多肽不是分离的，但从天然系统中的共存材料的一些或全部分离的相同多核苷酸或DNA或多肽则是分离的。此类多核苷酸可以是载体的部分和/或此类多核苷酸或多肽可以是组合物的部分，并且由于载体或组合物不是其天然环境的部分，仍然是分离的。
[0079] 术语“纯化的”不需要绝对纯度；相反，其预期作为一种相对定义。将起始材料或天然材料纯化至少约一个数量级，优选地两个或三个数量级，且更优选地四个或五个数量级被明确预期。作为实例，从0.1％浓度纯化至10％浓度是两个数量级。
[0080] “纯化的多核苷酸”或“纯化的多核苷酸载体”可描述已从其他化合物包括但不限于其他核酸、碳水化合物、脂质和蛋白(诸如在合成多核苷酸中使用的酶)分离的多核苷酸或多核苷酸载体，或从线性多核苷酸分离共价闭合的多核苷酸。当至少约50％，优选地60％至75％的样品展现出单一的多核苷酸序列和构象(线性对比共价闭合的)时，多核苷酸可以是基本上纯的。基本上纯的多核苷酸通常包含约50％，优选地60％至90％重量/重量的核酸样品，更通常约95％，并且优选地是超过约99％纯。多核苷酸纯度或同质性可通过本领域熟知的许多方法来指示，所述方法诸如样品的琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，随后在染色凝胶之后可视化单一多核苷酸条带。为了某些目的，更高的分辨率可通过使用HPLC或本领域熟知的其他方法来提供。
[0081] 术语“纯化的多肽”可描述已从其他化合物分离的多肽，所述其他化合物包括但不限于核酸、脂质、碳水化合物和其他蛋白。当样品包含至少约50％，优选地60％至75％的单一的多肽序列时，多肽可以是基本上纯的。基本上纯的多肽通常包含约50％，优选地60％至90％，更优选地95％至99％重量/重量的肽样品。多肽纯度或同质性可通过本领域熟知的许多方法来指示，所述方法诸如样品的琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，随后在染色凝胶之后可视化多肽条带。为了某些目的，更高的分辨率可通过使用HPLC或本领域熟知的其他方法来提供。
[0082] 在整个本说明书中，表述“核苷酸序列”可用于无差别(indifferently)指定多核苷酸或核酸。更精确地，表述“核苷酸序列”包括核酸材料本身，并因此不限于在生物化学上表征特定DNA分子或RNA分子的序列信息(即，从四个碱基字母中选择的连续的字母)。
[0083] 如本文可互换使用的，术语“核酸”、“寡核苷酸”和“多核苷酸”包括呈单链或双链形式的多于一个核苷酸的RNA、DNA或RNA/DNA杂合序列。术语“核苷酸”在本文中可用作形容词来描述包括呈单链或双链形式的任何长度的RNA、DNA或RNA/DNA杂合序列的分子。术语“核苷酸”在本文中还可用作名词来指个体核苷酸或核苷酸的变体，意指分子或较大核酸分子中的个体单元，包括嘌呤或嘧啶、核糖或脱氧核糖的糖部分和磷酸基团，或在寡核苷酸或多核苷酸内的核苷酸的情况下的磷酸二酯键。术语“核苷酸”在本文中还可用于涵盖“修饰的核苷酸”，其包含以下修饰中的至少一个：(a)替代性连接基团，(b)嘌呤的类似形式，(c)嘧啶的类似形式，或(d)类似的糖。类似的连接基团、嘌呤、嘧啶和糖的实例，参见例如PCT专利申请公布号WO 95/04064。多核苷酸序列可通过任何已知的方法，包括合成、重组、离体产生或其组合，以及利用本领域已知的任何纯化方法来制备。
[0084] 术语“启动子”指能够控制编码序列或功能性RNA表达的DNA序列。通常，编码序列可位于启动子序列的3'端。启动子可完全源自天然基因，或包括源自自然界中发现的不同启动子的不同元件，或甚至包括合成的DNA区段。本领域技术人员应理解，不同的启动子可指导基因在不同的组织或细胞类型中，或在不同的发育阶段或响应不同的环境或生理条件的表达。引起基因在大多数细胞类型中在大多数时间表达的启动子通常被称为“组成型启动子”。引起基因在特定细胞类型中表达的启动子通常被称为“细胞特异性启动子”或“组织特异性启动子”。引起基因在特定的发育阶段或细胞分化阶段表达的启动子通常被称为“发育特异性启动子”或“细胞分化特异性启动子”。经诱导并引起基因在暴露于诱导启动子的剂、生物分子、化学制品、配体、光等之后或在用诱导启动子的剂、生物分子、化学制品、配体、光处理细胞之后表达的启动子通常被称为“诱导型启动子”或“可调控型启动子(regulatable promoter)”。进一步认识到的是，由于在大多数情况下调控序列的确切边界尚未完全确定，不同长度的DNA片段可具有相同的启动子活性。
[0085] “启动子序列”可以是能够结合细胞中RNA聚合酶并启动下游(3'方向)编码序列转录的DNA调控区。为了定义本公开的主题的目的，启动子序列可在其3'末端以转录起始位点为边界并延伸上游(5’方向)至包括以在背景上可检测的水平启动转录所需的最小数目的碱基或元件。在启动子序列内将发现转录起始位点(例如，通过用核酸酶S1作图方便地确定)以及负责RNA聚合酶的结合的蛋白结合结构域(共有序列)。
[0086] 当RNA聚合酶将编码序列转录为mRNA时，编码序列可在细胞中在转录和翻译控制序列的“控制下”，其可然后被反式RNA剪接(如果编码序列含有内含子)并翻译成由编码序列编码的蛋白。
[0088] 术语“可操作地连接”指核酸序列在单个核酸片段上的缔合，使得一个的功能可受到另一个的影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达时，其可与该编码序列可操作地连接(即，该编码序列可在启动子的转录控制下)。编码序列可以以有义方向或反义方向可操作地连接至调控序列。
[0089] 术语“3'非编码序列”或“3'非翻译区(UTR)”指位于编码序列的下游(3')的DNA序列，并可包括聚腺苷酸化[聚(A)]识别序列和编码能够影响mRNA加工或基因表达的调控信号的其他序列。聚腺苷酸化信号通常被表征为影响聚腺苷酸域(polyadenylic acid tracts)至mRNA前体的3'末端的添加。
[0090] 术语“调控区”意指调控第二核酸序列的表达的核酸序列。调控区可包括天然负责表达特定核酸(同源区)的序列，或可包括负责表达不同蛋白或甚至合成的蛋白(异源区)的不同起源的序列。特别地，序列可以是以特异性或非特异性方式并以可诱导或不可诱导的方式刺激或抑制基因转录的原核、真核或病毒基因的序列或衍生的序列。调控区包括复制起点、RNA剪接位点、启动子、增强子、转录终止序列和指导多肽进入靶细胞的分泌途径的信号序列。
[0091] 术语“引物”指可与靶核苷酸序列互补并用于与靶核苷酸序列杂交的特定的寡核苷酸序列。引物用作由DNA聚合酶、RNA聚合酶或逆转录酶催化的核苷酸聚合的起始点。
[0092] 术语“探针”指可用于鉴定存在于样品中的特定多核苷酸序列的确定的核酸区段，其中核酸区段包含与待鉴定的特定多核苷酸序列互补的核苷酸序列。
[0093] 术语“碱基配对”和“沃森&克里克碱基配对”在本文可互换使用，指这样的核苷酸，所述核苷酸可凭借它们的序列同一性以类似于在双螺旋DNA中发现的胸腺嘧啶或尿嘧啶残基通过两个氢键连接至腺嘌呤残基且胞嘧啶和鸟嘌呤残基通过三个氢键连接的方式彼此氢键键合(参见Berg等(2011)Biochemistry，7th revised international ed.,ISBN-10:1429276355)。
[0094] 术语“互补的”或“其互补物”在本文中用于指遍及整个互补区能够与另一个指定的多核苷酸形成沃森&克里克碱基配对的多核苷酸序列。为了本公开的主题的目的，当第一多核苷酸中的每个碱基与其互补的碱基配对时，第一多核苷酸被认为与第二多核苷酸互补。互补碱基通常是A和T(或A和U)，或C和G。“互补物”在本文中可用作来自“互补多核苷酸”、“互补核酸”和“互补核苷酸序列”的同义词。这些术语适用于多核苷酸对，其仅基于它们的序列而不是两个多核苷酸藉以将实际结合的任何特定的条件组。
[0095] 本公开的主题还涉及本文描述的多核苷酸的变体和片段。作为本文可使用的术语，多核苷酸变体是不同于参考多核苷酸的多核苷酸。多核苷酸的变体可以是天然存在的变体，诸如天然存在的等位基因变体，或它可以是未知的天然存在的变体。此类非天然存在的多核苷酸变体可通过诱变技术包括应用于多核苷酸、细胞或生物体的那些来制备。通常，差异是有限的，使得参考和变体的核苷酸序列整体上是紧密相似的，并且在许多区域是相同的。
[0096] 根据本公开的主题的多核苷酸的变体包括，但不限于与参考多核苷酸或与参考多核苷酸的至少约8个连续的核苷酸的任何多核苷酸片段为至少约70％的同一性，例如，至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的同一性，且优选地与参考多核苷酸或与参考多核苷酸的至少约8个连续的核苷酸的任何多核苷酸片段为至少约99.5％的同一性，且更优选地至少约99.8％的同一性的核苷酸序列。
[0097] 存在于变体多核苷酸中的核苷酸改变可以是沉默的，其意指它们不改变由多核苷酸编码的氨基酸。然而，核苷酸改变还可导致由参考序列编码的多肽中的氨基酸置换、添加、缺失、融合和截短。置换、缺失或添加可涉及一个或更多个核苷酸。变体可在编码区或非编码区或两者中被改变。在编码区中的改变可产生保守的或非保守的氨基酸置换、缺失或添加。
[0098] 特别优选的实施方案是其中多核苷酸编码保留与成熟膜结合蛋白基本上相同的生物学功能和/或活性的多肽的那些。
[0099] 多核苷酸片段指长度相对于参考核酸减少并且包括在共有部分与参考核酸基本上相同的核苷酸序列的核苷酸序列。根据本公开的主题的此类核酸片段在适当的情况下可被包含在较大的多核苷酸内，所述核酸片段可以是其组分。此类片段包括长度范围是根据本公开的主题的核酸的至少约6个、8个、9个、10个、12个、15个、18个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、30个、39个、40个、42个、45个、48个、50个、51个、54个、57个、60个、63个、66个、70个、75个、78个、80个、90个、100个、105个、120个、135个、150个、200个、300个、500个、720个、900个、1000个或1500个连续的核苷酸的寡核苷酸或可选地由其组成。
[0100] 此类片段可以是“独立的(free-standing)”，即，不是其他多核苷酸的部分或与其他多核苷酸融合，或它们可被包含在它们形成其一部分或区域的单个较大的多核苷酸内。事实上，这些片段中的数个可存在于单个较大的多核苷酸内。
[0101] 任选地，此类片段可由长度为至少约8个、10个、12个、15个、18个、20个、25个、35个、40个、50个、70个、80个、100个、250个、500个或1000个核苷酸的连续跨度组成或基本上由其组成。
[0102] 如本文描述的，分离的、纯化的和重组的多肽可包括参考序列的至少约6个氨基酸，优选地至少约8个至10个氨基酸，更优选地至少约12个、15个、20个、25个、30个、40个、50个或100个氨基酸的连续跨度。在其他优选的实施方案中，连续延伸的氨基酸包含突变或功能性突变的位点，所述突变或功能性突变包括多肽序列中氨基酸的缺失、添加、交换或截短。
[0103] 多肽可从人或哺乳动物组织样品来分离或由人或哺乳动物的基因来表达。多肽可使用本领域已知的常规表达方法来制备。编码期望的多肽的多核苷酸可被连入适合于任何便利的宿主的表达载体。将真核和原核宿主系统两者用于形成重组多肽，且本文提供了一些更常用系统的概述。然后，多肽可从裂解的细胞或从培养基中分离并纯化至用于其预期用途所需的程度。纯化可通过本领域已知的任何技术，例如，差分提取(differential extraction)、盐分级分离(salt fractionation)、层析法、离心法等(参见，例如，Abbondanzo等(1993)Methods in Enzymology,Academic Press,New York.第803-823页)。
[0104] 另外，较短的蛋白片段可通过化学合成来制备。可选地，蛋白从人或非人动物的细胞或组织来提取。用于纯化蛋白的方法是本领域已知的，并包括例如，使用去垢剂或离液剂破坏颗粒，随后是差分提取以及通过离子交换层析、亲和层析、根据密度的沉降(sedimentation according to density)及凝胶电泳分离多肽。
[0105] 参考cDNA可用于表达多肽。编码待表达的多肽的核酸可使用常规的克隆技术与表达载体中的启动子可操作地连接。例如，表达载体中的膜结合多肽可包括多肽的完整编码序列或其部分。例如，插入物可编码包含膜结合多肽的至少约10个连续的氨基酸的多肽。
[0106] 如本领域已知的，术语“同一性百分比”可以是两个或更多个多肽序列之间或两个或更多个多核苷酸序列之间的关系，如通过比较序列来确定的。在本领域中，根据具体情况而定，“同一性”还意指多肽或多核苷酸序列之间的序列相关性程度，如通过此类序列的字符串之间的匹配来确定的。“同一性”和“相似性”可通过已知方法容易地计算，所述方法包括但不限于以下中描述的那些：Computational Molecular Biology(Lesk,A.M.，编著)Oxford University Press,New York(1988)；Biocomputing:Informatics and Genome Projects(Smith,D.W.，编著)Academic Press,New York(1993)；Computer Analysis of Sequence Data,Part I(Griffin,A.M.,和Griffin,H.G.，编著)Humana Press,New Jersey(1994)；Sequence Analysis in Molecular Biology(von Heinje,G.，编著)Academic Press(1987)；以及Sequence Analysis Primer(Gribskov,M.和Devereux,J.，编著)Stockton Press,New York(1991)。确定同一性的优选的方法被设计为给予测试的序列之间的最佳匹配。确定同一性和相似性的方法被编成公开可得的计算机程序。序列比对和同一性百分比计算可使用LASERGENE生物信息学计算包中的MegAlign程序来进行(DNASTAR Inc.,Madison,Wis.)。多重序列比对可使用Clustal比对方法(Higgins和Sharp(1989)CABIOS.5:151-153)用缺省参数包括成对比对的缺省参数来进行。
[0107] 术语“序列分析软件”指可用于分析核苷酸或氨基酸序列的任何计算机算法或软件程序。“序列分析软件”可以是商购可得的或独立开发的。代表性序列分析软件将包括但不限于GCG程序包(Wisconsin Package Version 9.0,Genetics Computer Group(GCG),Madison,Wis.)、BLASTP、BLASTN、BLASTX(Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215:403-410，以及DNASTAR(DNASTAR,Inc.,Madison,Wis.)。应当理解，除非另外规定，在本申请的上下文内，当序列分析软件用于分析时，分析的结果将基于提及的程序的“缺省值”。如本文使用的，“缺省值”将意指当首次初始化时软件最初装载的值或参数的任何集合。
[0108] 膜结合蛋白
[0109] 术语“膜结合蛋白”和“膜结合多肽”在本文可互换使用，指单次通过的膜结合蛋白和多次通过的膜结合蛋白二者，例如，人膜结合蛋白。形成部分还为由多核苷酸编码的多肽，以及包含此类多肽的融合多肽。本公开的主题包含了来自人的膜结合多肽，包括由给定的膜结合多肽的参考氨基酸序列组成、基本上由其组成或包含其的分离的或纯化的膜结合多肽、或其变体或片段。
[0110] 在一个实施方案中，膜结合蛋白可以是CD4，一种具有单个TM结构域的典型的I型膜蛋白。CD4是与主要组织相容性复合体Ⅱ类抗原相互作用的T淋巴细胞的充分表征的膜糖蛋白，并且还是人类免疫缺陷病毒的受体(Carr等(1989)J.Biol.Chem.264:21286-95)。
[0111] 在另一个实施方案中，膜结合蛋白可以是GPR77，一种多次跨越的G-蛋白偶联受体(GPCR)膜蛋白。GPR77与鉴定的典型配体(即，补体组分C5a)一起参与固有免疫应答的补体系统(Cain&Monk(2002)J.Biol.Chem.277:7165-9)。
[0112] 另外的示例性膜结合蛋白包括但不限于GPCR(例如，肾上腺素能受体、血管紧张素受体、胆囊收缩素受体、毒蕈碱乙酰胆碱受体、神经降压素受体、甘丙肽受体、多巴胺受体、阿片受体、5-羟色胺受体、生长抑素受体等等)、离子通道(烟碱型乙酰胆碱受体、钠和钾通道等等)、受体酪氨酸激酶、受体丝氨酸/苏氨酸激酶、受体鸟苷酸环化酶、生长因子和激素的受体(表皮生长因子(EGF)受体)、和其他膜结合蛋白。此类蛋白的突变体或修饰形式也可被使用。例如，GPCR的一些单个或多个点突变保留功能且可参与疾病(参见，例如，Stadel等(1997)Trends in Pharmocological Review18:430-437)。
[0113] 在一个实施方案中，在重组病毒体阵列内的多个重组病毒体的包膜仅包含一种类型的保留它们的天然构象和/或相互作用的异源膜结合蛋白。在另一个实施方案中，包膜包含多于一种类型的保留它们的天然构象和/或相互作用的异源膜结合蛋白。例如，一些GPCR进行异二聚化用于它们的生物学功能(Angers等(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,97:3684-3689)。在一个实施方案中，被重组病毒体阵列的一个位置中的多个重组病毒体的一个或更多个的包膜包含的膜结合蛋白不同于被重组病毒体阵列的一个或更多个另外的位置处的多个重组病毒体的一个或更多个的包膜包含的膜结合蛋白。因此，在另一个实施方案中，多种不同的膜结合蛋白可存在于重组病毒体阵列的单独的位置处。在一些实施方案中，重组病毒体阵列包含至少约2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种、13种、14种、15种、16种、17种、18种、19种、20种、25种、30种、35种、40种、45种、50种、55种、60种、65种、70种、75种、80种、85种、90种、95种或100种不同的膜结合蛋白。在其他实施方案中，重组病毒体阵列包含多于约103种不同的膜结合蛋白或多于约104种不同的膜结合蛋白，并可甚至任选地包含多于约105种不同的膜结合蛋白。
[0114] 在另一个实施方案中，尽管包膜可包含多于一种类型的保留它们的天然构象和/或相互作用的异源膜结合蛋白，这些蛋白是相关的。因此，在一个实施方案中，被包膜包含的两种或更多种不同的膜结合蛋白是同一蛋白家族的成员。不同的膜结合蛋白可以是功能上相关的或仅疑似是功能上相关的。在另一个实施方案中，固定的膜结合蛋白的功能可以是未知的，在重组病毒体阵列的单独的位置处的不同膜结合蛋白共享结构或序列的相似性或仅疑似共享结构或序列的相似性。
[0115] 在另一个可选的实施方案中，阵列的至少一个微点或每个微点包含相同类型但不同形式的感兴趣的异源膜结合蛋白，例如，阵列的至少一个微点或每个微点包含同一感兴趣蛋白的不同变体(即，具有不同的点突变、缺失、置换等)，例如，其中阵列的至少一个微点或每个微点包含同一异源膜结合蛋白的不同变体。所得阵列可被用于系统地检查异源膜结合蛋白的结构和功能的关系。
[0116] 在另一个实施方案中，阵列可包含基本上相同的微点(例如，包含相同类型的异源膜结合蛋白的微点)或一系列基本上相同的微点，但在使用中用不同的分析物(靶)来处理。例如，阵列可包括例如10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个或更多个微点的“子阵列”，至少一个微点或每个微点包含不同膜结合蛋白，并且其中子阵列可重复多次，作为较大阵列的一部分。
[0117] 在另一个实施方案中，尽管一个微点的异源膜结合蛋白可与另一个的不同，这些蛋白可以是相关的。例如，在一个实施方案中，两种不同的异源膜结合蛋白是同一蛋白家族的成员。本发明阵列上的不同的异源膜结合蛋白可以是功能上相关的或仅疑似是功能上相关的。然而，在另一个实施方案中，异源膜结合蛋白的功能可以是未知的，且在阵列的不同微点上的不同异源膜结合蛋白共享结构或序列的相似性或仅疑似共享结构或序列的相似性。可选地，异源膜结合蛋白可以是蛋白家族的不同成员的片段。在另外的实施方案中，异源膜结合蛋白共享药理和生理分布或作用的相似性。
[0118] 重组病毒体
[0119] 用于在阵列中使用的重组病毒体可包含包膜，所述包膜包含保留它们的天然构象和/或相互作用的多种异源膜结合蛋白。病毒可以是仅可在生物体的活细胞内复制的小的致病原。病毒颗粒被称为病毒体，通常包括以下几个部分：1)由DNA或RNA构成的遗传物质；2)保护遗传物质的通常称为衣壳的蛋白外壳；以及，在某些情况下，3)当它们在细胞外时包围蛋白外壳的脂质包膜。
[0120] 对于在阵列内的使用，重组病毒体可如在实施例中列出的方法或通过如许多标准实验室手册，诸如Davis等，Basic Methods in Molecular Biology(1986)和Sambrook等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)中描述的制备重组病毒体的其他方法来制备。类似的方法被用于在本文描述的制备重组病毒体的方法中引入感兴趣的异源基因。例如，重组病毒体可在DNA共转染之后使用同源重组来构建，其中细胞可用包含感兴趣的基因的至少两种不同的病毒来共转染，并且子代病毒噬斑可被纯化。重组病毒体的正确基因组织的最终验证可使用针对核酸的探针通过DNA杂交研究来验证。编码异源膜结合蛋白的异源核酸序列可使用标准克隆和筛选技术从天然来源诸如基因组DNA文库来获得，或可使用熟知的和商购可得的技术来合成。
[0121] 在一个实施方案中，异源膜结合蛋白是人膜结合蛋白，且重组病毒体是重组单纯疱疹病毒(HSV)病毒体，例如，单纯疱疹病毒1型(HSV-1)或单纯疱疹病毒2型(HSV-2)，例如，HSV-1。疱疹病毒科(Herpesviridae)可以是在宽范围脊椎动物宿主的细胞核中且甚至在一些无脊椎动物中复制的具有相对大的复杂基因组的包膜双链DNA病毒的家族的名称，所述脊椎动物宿主包括人、马、牛、小鼠、猪、鸡、乌龟、蜥蜴、鱼，所述无脊椎动物诸如牡蛎。所有疱疹病毒的病毒体具有四个结构要素：1)双链DNA的单个线性分子的核心；2)衣壳蛋白外壳；3)包含在DNA核心和包含病毒酶的蛋白衣壳之间的无定形且有时非对称空间的被膜；以及4)包含改变的宿主膜以及许多病毒糖蛋白和其他膜蛋白的包膜。
[0122] HSV病毒基因组如其生命周期一样被充分表征，且多于80种天然编码多核苷酸的功能被主要定义。因为HSV基因组被如此充分表征，它容易地被操作用作基因转移载体，其是一种通过HSV基因通常是连续线性序列的事实被增强的特征。此外，由于它的约一半基因对于生长是非必要的，存在缺失HSV基因组的大区段以适应转基因材料的可能性(Glorioso等in Viral Vectors,Academic Press,New York(Kaplitt&Loewy，编著)1-23(1995))。
[0123] 原发性HSV感染通过将病毒引入宿主细胞开始，其是一种包括两个不同阶段的过程：病毒至细胞表面的附着及病毒包膜与细胞膜的融合。在病毒进入细胞后，它可被转运至细胞核，届时病毒DNA可在裂解性感染的三个不同阶段被释放并转录。HSV感染的附着和融合步骤主要通过病毒包膜的组分来介导，所述病毒包膜是一种包含至少约10种糖蛋白(gB、gC、gD、gE、gG、gH、gl、gJ、gL和gM)和四种非糖基化的整合膜蛋白(UL20、UL34、UL45和UL49.5)的膜结构。在糖蛋白中，gB、gD、gH和gL对野生型疱疹病毒感染它们的宿主细胞是必不可少的，而剩余的对病毒附着或内化是非必要的。在HSV-1进入之前，病毒体通过gC和gB与细胞膜上暴露的糖胺聚糖的结合吸附至细胞表面。然后，进入过程可通过gD与它的同类受体之一诸如疱疹病毒进入介导因子(HVEM)或nectin-1的相互作用来启动。受体结合导致gD中构象改变，触发作为病毒包膜和细胞膜之间融合的效应物的gB和第四包膜糖蛋白gH的激活。
[0124] 在一个实施方案中，HSV-1的KOS毒株可用作野生型病毒。
[0125] 在一个实施方案中，重组病毒体包含一个或更多个转基因表达盒(即，可操作地连接至启动子用于表达的多核苷酸，任选地包括聚腺苷酸化序列或其他加工序列)。此类转基因表达盒包含编码一种或更多种异源膜结合蛋白的多核苷酸序列。
[0126] 在一个实施方案中，用于在重组病毒体阵列内使用的重组HSV-1病毒体可通过将编码异源膜结合蛋白的多核苷酸序列克隆进入可被可操作地连接至HSV-1启动子序列的HSV-1基因组的基因座来制备。例如，多核苷酸序列可以是编码异源膜结合蛋白的全长人开放阅读框(ORF)，且编码异源膜结合蛋白的ORF可被克隆在gB基因座并在强的gB启动子控制下表达。
[0127] 在另一个实施方案中，用于在重组病毒体阵列内使用的重组HSV-1病毒体可通过将编码融合蛋白或嵌合蛋白的多核苷酸序列克隆进入可被可操作地连接至HSV-1启动子序列的HSV-1基因组的基因座来制备，其中融合蛋白包含融合(或附接)至HSV-1包膜蛋白的异源膜结合蛋白或其片段。例如，多核苷酸序列可包含编码融合(或附接)至编码gC的跨膜(TM)结构域和胞质结构域(cytoplasmic domain)的核苷酸序列的异源膜结合蛋白的全长人ORF，且编码融合蛋白的多核苷酸序列可被克隆在gC基因座并在gC启动子控制下表达(参见，例如，Dolter等(1993)J.Virol.67:189-95；Kouvatsis等(2007)Virus Res.123:40-9)。
[0128] 术语“融合”和“嵌合”或“嵌合体”可互换使用，且指通过连接天然未连接在一起的两个或更多个多肽序列产生的多肽或蛋白，或通过连接天然未连接在一起的两个或更多个多核苷酸序列产生的多核苷酸或基因。例如，融合多肽可由编码该融合多肽的单个融合多核苷酸来表达。
[0129] HSV-1包膜糖蛋白天然地位于适合与另外的病毒表面接触的包膜中。因此，用于在重组病毒体阵列内使用的嵌合包膜蛋白可优选地包括天然糖蛋白。因为，gB、gC和gD各自介导病毒至细胞表面的附着，用于在重组病毒体阵列内使用的嵌合蛋白，例如，可包括gB、gC和/或gD，或其片段。
[0130] 包含异源膜结合蛋白的嵌合蛋白也可包括其他非天然元件。例如，异源膜结合蛋白可被掺入嵌合蛋白，附接至接头或间隔区(spacer)多肽。此类间隔区可允许，例如，异源膜结合蛋白被添加至该蛋白而不明显干扰整体蛋白结构。
[0131] 重组HSV病毒体可被修饰以携带异源基因，即除了天然存在于HSV基因组的基因以外的基因。术语“异源基因”指不是源自感兴趣的细胞或生物体的(即，外来的)任何基因，例如，不是源自HSV的基因。异源基因可以是野生型基因的任何等位基因变体，或它可以是突变基因。类似地，“异源蛋白”或“异源多肽”可以是不是源自感兴趣的细胞或生物体的(即，外来的)任何蛋白或多肽，例如，不是源自HSV的蛋白或多肽。
[0132] 异源基因可通过HSV毒株与例如携带侧翼序列为HSV序列的异源基因的质粒载体同源重组被插入HSV基因组。异源基因可被引入适合的质粒载体，并引入宿主细胞且该宿主细胞可用病毒来感染，以产生包含异源膜蛋白的病毒体。可使用本领域熟知的克隆技术将异源基因引入包含HSV序列的适合的质粒载体。异源基因可被插入HSV基因组中的任何位置处，条件是该病毒仍然可用其包含异源蛋白的包膜来增殖。在一个特定的实施方案中，异源基因可被插入内源基因的基因座处，并且可在内源基因的启动子的控制下表达(例如，克隆在gB基因座处并在gB启动子的控制下表达，或克隆在gC基因座处并在gC启动子的控制下表达)。
[0133] 异源基因的转录序列可优选地与允许异源基因表达的控制序列可操作地连接，条件是该病毒仍然可用其包含异源蛋白的包膜增殖。控制序列包括允许异源基因表达的启动子和用于终止转录的信号。启动子可选自在选择的病毒体中有功能的启动子，例如HSV基因的启动子。
[0134] 在一些实施方案中，感兴趣的开放阅读框(ORF)可替换HSV基因组中疱疹病毒gB基因或gC基因的编码区。在一些实施方案中，感兴趣的ORF的表达可被gB启动子或gC启动子严格控制。在一些实施方案中，由宿主中至少一种重组病毒或每种重组病毒产生的人蛋白的量可以是大约相同的。一些病毒严格控制它们的待组装至至少一个病毒体或每个病毒体的包膜蛋白的拷贝数。因此，由病毒表达的蛋白可具有每病毒体大致相同的拷贝数。
[0135] 在一些实施方案中，点制在阵列上的病毒体中存在的蛋白的量可约等于该阵列上一个或更多个其他病毒体中的一个或更多个其他蛋白的量。例如，点制在阵列上的病毒体中存在的蛋白的量可以是该阵列上一个或更多个其他病毒体中的一个或更多个其他蛋白的量的约50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％。
[0136] 表达盒可使用本领域技术人员已知的常规克隆技术来构建(参见，例如，Sambrook等(1989)Molecular Cloning-a laboratory manual；Cold Spring Harbor Press)。此外，特定重组HSV病毒体的构建在实施例中被描述。
[0137] 在一些实施方案中，多个基因的表达可以是有益的。对于此类应用，HSV是唯一适合的，因为它不具有其他病毒载体系统的有限包装能力。因此，多个外源基因可被安置在其基因组中。例如，存在其中这可被实现的至少两种方式。例如，多于一个异源基因和相关的控制序列可被引入特定HSV毒株中。使用以相对方向面对的启动子对(相同或不同的启动子)也将是可能的，这些启动子各自驱动如以上描述的异源基因(相同或不同的异源基因)的表达。可选地，异源基因可被插入HSV基因组内的多个位点处。
[0138] 许多膜蛋白，诸如GPCR，作为异二聚体或异多聚体起作用。在一些实施方案中，使用与表达那些特定膜蛋白的病毒组合共感染细胞的展示这些类型的分子的病毒体可被使用。产生的这些病毒体可将两种膜蛋白诸如GPCR展示为可在细胞中的共表达期间产生的复合体。
[0139] 在一些实施方案中，多次通过的膜结合蛋白，诸如GPCR和通道，可被工程化以基于“正电荷居内”规则(“positive-inside”rule)使其拓扑结构反向。例如，此类工程化膜蛋白的胞质结构域可展示为重组病毒体表面上的胞外域。所得到的重组病毒可用于鉴定与这些膜蛋白的胞质结构域相互作用的蛋白或其他分子。
[0140] 哺乳动物、酵母、昆虫和细菌表达系统是本领域已知的。商购可得的载体和表达系统从多个供应商，包括Genetics Institute(Cambridge,Mass.)、Stratagene(La Jolla,Calif.)、Promega(Madison,Wis.)和Invitrogen(San Diego,Calif.)可得。如果期望增强表达和促进适当的蛋白质折叠，序列的密码子背景和密码子配对可被优化用于在其中该表达载体可被引入的生物体中的表达，如通过Hatfield等，美国专利号5,082,767解释的。
[0141] 在一个优选的实施方案中，本公开的主题涉及编码异源膜多肽的重组HSV-1细菌人工染色体(BAC)克隆。该BAC克隆系统(Shizuya等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89:8794-8797)已被发展至稳定保持基因组DNA的大片段(100-300kb)。
[0142] 在一个实施方案中，质粒pKΔ4B(Cai等(1988)J.Mol.Biol.201:575-88)可在糖蛋白B基因中工程化接头-插入物突变体之后被使用，其中编码gB的氨基酸43至711的DNA序列被缺失，且BglII限制性酶切位点被添加以保持蛋白阅读框(Cai等(1988)J.Mol.Biol.201:575-88)。pKΔ4B质粒可例如用Xho1和BglII来消化，用热敏磷酸酶(antarctic
phosphatase)(NEB)来处理，并与从pKΔ4B扩增的Xho1-BglII PCR片段连接，所述Xho1-BglII PCR片段缺失1-43的所有gB氨基酸(gBΔSS)但保留gB启动子序列(本文中称为质粒pKgBΔSS)。跨越711至796的gB氨基酸的序列然后可通过盒式PCR诱变从pKgBΔSS缺失，将PCR片段作为BglII-BamH1克隆进入pKgBΔSS，且所得的质粒在本文中称为pKgBPR。异源膜结合蛋白然后可从质粒例如从Ultimate ORF集合(Life Technologies)来扩增。编码V5表位的序列可被包括在反向引物中。最终的gB启动子驱动的基因的质粒的序列分析可在引入病毒基因组之前进行，且质粒可用BamH1来线性化用于同源重组。然后，标志物获救和标志物转移测定例如UL28的标志物获救和可操作地连接gB启动子序列的异源膜结合蛋白的标志物转移测定可使用Desai等(Desai等(1994)Virology 204:312-22)描述的方法来进行。
A1.1细胞单层(UL27和UL28转化的细胞；Tengelsen等(1993)J.Virol.67:3470-80)可例如使用磷酸钙沉淀法用感染的细胞DNA(KΔ4BX)和线性化的质粒DNA来共转染。当噬斑开始出现时，细胞单层可被收获，并任选地被冻/融和声处理，并且总病毒子代被滴定。重组病毒可通过对D6细胞(UL27转化的；Cai等(1987)J.Virol.61:714-21)的单噬斑纯化来分离，且另外的噬斑纯化可通过对D6细胞系的有限稀释来进行。
phosphatase)(NEB)来处理，并与从pKΔ4B扩增的Xho1-BglII PCR片段连接，所述Xho1-BglII PCR片段缺失1-43的所有gB氨基酸(gBΔSS)但保留gB启动子序列(本文中称为质粒pKgBΔSS)。跨越711至796的gB氨基酸的序列然后可通过盒式PCR诱变从pKgBΔSS缺失，将PCR片段作为BglII-BamH1克隆进入pKgBΔSS，且所得的质粒在本文中称为pKgBPR。异源膜结合蛋白然后可从质粒例如从Ultimate ORF集合(Life Technologies)来扩增。编码V5表位的序列可被包括在反向引物中。最终的gB启动子驱动的基因的质粒的序列分析可在引入病毒基因组之前进行，且质粒可用BamH1来线性化用于同源重组。然后，标志物获救和标志物转移测定例如UL28的标志物获救和可操作地连接gB启动子序列的异源膜结合蛋白的标志物转移测定可使用Desai等(Desai等(1994)Virology 204:312-22)描述的方法来进行。
A1.1细胞单层(UL27和UL28转化的细胞；Tengelsen等(1993)J.Virol.67:3470-80)可例如使用磷酸钙沉淀法用感染的细胞DNA(KΔ4BX)和线性化的质粒DNA来共转染。当噬斑开始出现时，细胞单层可被收获，并任选地被冻/融和声处理，并且总病毒子代被滴定。重组病毒可通过对D6细胞(UL27转化的；Cai等(1987)J.Virol.61:714-21)的单噬斑纯化来分离，且另外的噬斑纯化可通过对D6细胞系的有限稀释来进行。
[0143] 在另一个实施方案中，KOS BAC37基因组(Gierasch等(2006)J.Virol.Methods 135:197-206)可被转移进TOP10细胞(Stratagene)中，且包含融合至HSV-1包膜蛋白或其片段例如gC的异源膜结合蛋白的嵌合融合蛋白可使用提供的Gene Bridges Red-ET方法和方案(Zhang等(2000)Nat.Biotechnol.18:1314-7)被引入病毒基因组。例如，被gC同源序列包围的卡那霉素盒可被扩增并将卡那霉素基因引入KOS BAC37替换gC基因。可针对链霉素敏感性筛选生长在卡那霉素平板上的菌落，gC融合基因可使用重叠PCR方法(例如，使用表1中列出的引物)来制备，且gC融合多核苷酸可使用RedET引物(例如，如表1中列出的)来扩增并用于替换卡那霉素基因。携带正确融合多核苷酸的成功的分离株可通过PCR测定来鉴定，并且BAC基因组中的插入的基因可在重构感染性病毒之前被测序。携带糖蛋白C嵌合体基因融合物(fusion)的KOS杆粒可使用PureLink核酸纯化试剂盒(Life Technologies)来制备，且杆粒DNA使用Lipofectamine 2000试剂(Life Technologies)被转染进Vero细胞。在噬斑形成之后，感染的细胞的裂解物可用于扩增和制备包含gC融合多肽的重组HSV-1病毒的工作储备液。
[0144] 因此，表达异源基因的纯化的重组HSV病毒体，例如，重组HSV-1病毒体被用于感染宿主细胞，且从宿主细胞释放的重组HSV病毒体然后被纯化用于在如本文别处描述的本公开的阵列的制备中使用(例如，用于印制在FAST载玻片上)。术语“纯化的”不需要材料以排除其他化合物的存在而展现出绝对纯度的形式存在。将起始材料或天然材料纯化至至少约一个数量级，优选地两个或三个数量级，且更优选地四个或五个数量级被明确预期。作为实例，从0.1％浓度纯化至10％浓度是两个数量级。
[0145] 在一个实施方案中，宿主细胞是Vero细胞、转化的Vero细胞系或人包皮成纤维细胞(HFT)细胞。然而，能够增殖HSV病毒体，例如，HSV-1病毒体的任何宿主细胞可被使用(例如，幼小仓鼠肾细胞(BHK-21)、人胚肺细胞(HEL)、人喉癌上皮细胞(Hep-2)等)。
[0146] 尽管重组HSV病毒体，例如，重组HSV-1病毒体可以是优选的，其他包膜病毒也可在重组病毒体阵列内使用。如本文所用的，包膜病毒具有覆盖它们的蛋白衣壳的病毒包膜，并且通常包含磷脂和蛋白，包括病毒糖蛋白。除了HSV-1和HSV-2以外，用于在重组病毒体阵列内使用的另外的示例性包膜病毒可包括但不限于以下病毒科和病毒：逆转录病毒科(Retroviridae)(即慢病毒亚科(Lentivirinae))，诸如人类免疫缺陷病毒(HIV)；黄病毒科(Flaviviridae)，诸如黄病毒属如黄热病病毒(YFV)和登革热病毒，肝炎病毒属如丙型肝炎病毒(HCV)，和瘟病毒属如牛病毒性腹泻病毒(BVDV)；水痘-带状疱疹病毒(VZV)，巨细胞病毒(CMV)或人疱疹病毒6型(HHV-6)；痘病毒科(Poxviridae)，诸如牛痘；嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)，诸如乙型肝炎病毒(HBV)；冠状病毒科(Coronaviridae)，诸如SARS-CoV；正粘病毒科(Orthomyxoviridae)，诸如甲型、乙型和丙型流感病毒；披膜病毒科(Togaviridae)；沙粒病毒科(Arenaviridae)，诸如沙粒病毒；布尼亚病毒科
(Bunyaviridae)，诸如庞塔托鲁病毒(Punta Toro)；副粘病毒科(Paramyxoviridae)，诸如呼吸道合胞体病毒(RSV)或副流感3型病毒；以及弹状病毒科(Rhabdoviridae)。
(Bunyaviridae)，诸如庞塔托鲁病毒(Punta Toro)；副粘病毒科(Paramyxoviridae)，诸如呼吸道合胞体病毒(RSV)或副流感3型病毒；以及弹状病毒科(Rhabdoviridae)。
[0147] 基材
[0148] 阵列的基材可包括至少一个表面，重组病毒体微点的模式可以存在于其上(即，多个重组病毒体微点与基材表面稳定地缔合)。在一个实施方案中，基材可以是玻璃，例如，用硝酸纤维素涂覆的玻璃，例如硝酸纤维素涂覆的载玻片(即，FAST载玻片)。
[0149] 在其他实施方案中，基材包括选自由以下组成的组的物质：陶瓷物质、玻璃、金属、晶体材料、塑料、聚合物或共聚物及其组合。此类基材包括但不限于例如(半)贵金属诸如金或银；玻璃材料诸如钠钙玻璃(soda-lime glass)、派热克斯玻璃(pyrex glass)、维克玻璃(vycor glass)、石英玻璃；金属氧化物或非金属氧化物；硅、磷酸一铵，和其他此类晶体材料；过渡金属；塑料或聚合物，包括树枝状聚合物诸如聚(氯乙烯)、聚(乙烯醇)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(乙酸乙烯酯-马来酸酐)、聚(二甲基硅氧烷)单甲基丙烯酸酯、聚苯乙烯，聚丙烯、聚乙烯亚胺；共聚物，诸如聚(乙酸乙烯酯-共-马来酸酐)、聚(苯乙烯-共-马来酸酐)、聚(乙烯-共-丙烯酸)，或这些的衍生物等。
[0150] 基材可取决于阵列的预期用途采用范围从简单至复杂的多种配置。因此，基材可具有整体载玻片或板配置，诸如矩形或盘配置。标准的微板配置可被使用。在某些实施方案中，基材可具有矩形横截面形状，其具有从约10mm至200mm、通常从约40至150mm且更通常从约75至125mm的长度和从约10mm至200mm、通常从约20mm至120mm且更通常从约25至80mm的宽度，以及从约0.01mm至5.0mm、通常从约0.1mm至2mm且更通常从约0.2至1mm的厚度。
[0151] 在一些实施方案中，表面可以是光滑的或基本上为平面的，或具有不规则性，诸如凹陷和隆起。此外，在微点的模式可存在于其上的表面可以用用于修饰表面的性能的化合物或涂层的一种或更多种不同的层以可期望的方式来修饰。
[0152] 因此，阵列还可包括在包含重组病毒体微点的基材的表面的全部或一部分上的涂层材料。优选地，涂层材料增强了重组病毒体微点对基材的亲和力。
[0153] 在一个实施方案中，涂层材料可以是硝酸纤维素。在其他实施方案中，涂层材料可以是硅烷、硫醇、二硫化物或聚合物。当材料可以是硫醇时，基材可包括涂覆金的表面和/或硫醇包含疏水性部分和亲水性部分。当涂层材料可以是硅烷时，基材包括玻璃，且硅烷可存在末端部分，包括例如，羟基、羧基、磷酸酯、缩水甘油氧基(glycidoxy)、磺酸酯、异氰酸酯、硫醇或氨基基团。
[0154] 在一个可选的实施方案中，涂层材料可以是具有共价键合的接头部分的衍生的单层或多层。单层涂层(例如，包含长链烃部分)可具有引起与基材化学或物理化学键合的硫醇(例如，硫代烷基)、二硫化物或硅烷基团。单层与基材的附连还可通过非共价相互作用或通过共价反应来实现。
[0155] 在一个实施方案中，硫醇可以是硫代烷基化合物并选自由以下组成的组：硫代烷基酸、硫代烷基醇、硫代烷基胺和包含卤素的硫代烷基化合物。例如，硫代烷基化合物可以是硫代烷基酸，例如，16-巯基十六烷基酸。
[0156] 在与基材附接之后，单层可包含至少一种反应性官能团。单层涂层上的反应性官能团的实例包括但不限于羰基、异氰酸酯、卤素、胺或羟基基团。在一个实施方案中，单层涂层上的这些反应性官能团可通过标准化学技术活化为单层涂层上的相应活化的官能团(例如，羧基基团转化为酸酐或酸性卤化物等)。基材上的单层涂层的活化的官能团可以是但不限于用于与接头化合物的末端氨基基团共价偶联的酸酐、N-羟基琥珀酰亚胺酯或其他常见的活化的酯或酸性卤化物。在另一个实施方案中，单层涂层上的活化的官能团可以是但不限于用于与接头化合物的末端羟基基团偶联的酸酐衍生物；用于偶联到接头化合物的氧化的糖残基上的肼衍生物；或用于共价附接至接头化合物的硫醇基团的马来酰亚胺衍生物。为制备衍生的单层涂层，单层涂层上的至少一种末端羧基基团可首先被活化为酸酐基团，且然后与接头化合物反应。可选地，单层涂层上的反应性官能团可与具有活化的官能团的接头化合物反应，所述活化的官能团例如但不限于，用于与单层涂层上的反应性氨基基团共价偶联至的N-羟基琥珀酰亚胺酯、酸性卤化物、酸酐和异氰酸酯。
[0157] 在一个实施方案中，接头化合物具有一个末端官能团、间隔区和膜结合蛋白粘附区域。用于与活化的单层涂层上的活化的官能团反应的末端官能团是例如但不限于卤素、氨基、羟基或硫醇基团。在某些实施方案中，末端官能团选自由以下组成的组：羧酸、卤素、胺、硫醇、烯烃、丙烯酸酯、酸酐、酯、酸性卤化物、异氰酸酯、肼、马来酰亚胺和羟基基团。
[0158] 间隔区可包括但不限于低聚醚/聚醚、寡肽/多肽、低聚酰胺/聚酰胺、低聚胺/聚胺、低聚酯/聚酯、寡糖/多糖、多元醇、多电荷物种或其任何其他组合物。实例包括但不限于乙二醇、肽、甘油、乙醇胺、丝氨酸、肌醇等的低聚物，并且如此使得膜结合蛋白自由粘附至接头部分的粘附区。间隔区性质上可以是亲水性的。在一个实施方案中，间隔区具有n个氧乙烯基团，其中n可在2和25之间。在其他实施方案中，接头化合物的膜粘附区或“疏水性尾部”可以是疏水性的或两亲性的，具有直链或支链的烷基、炔基、烯基、芳基、芳烷基、杂烷基、杂炔基、杂烯基、杂芳基或杂芳烷基。在另一个实施方案中，膜结合蛋白粘附区包括C10至C25直链或支链烷基或杂烷基疏水性尾部。在最优选的实施方案中，疏水性尾部包括C10至C20直链或支链烷基片段。
[0159] 在另一个实施方案中，接头化合物在一端具有末端官能团，在另一端具有间隔区、接头/膜结合蛋白粘附区和亲水性基团。在接头化合物的一端的亲水性基团可以是单个基团或多个亲水性基团的直链或支链，包括但不限于单个羟基基团或多个乙二醇单元的链。
[0160] 在一些实施方案中，本发明提供了阵列(或微阵列)，其包括膜结合蛋白抗体的文库和基材。在一些实施方案中，本发明提供了阵列(或微阵列)，其包括表达或包含膜结合蛋白的病毒体的文库和基材。在一些实施方案中，至少一种或每种膜结合蛋白抗体或病毒体可被固定在基材上。膜结合蛋白抗体或病毒体可以被可逆地或不可逆地固定在基材上。基材可以是平面的或颗粒，并且可包括固体材料或多孔材料。基材可以是有机的或无机的、生物的或非生物的或这些材料的任何组合。
[0161] 在一个实施方案中，基材可以是透明的或半透明的。斑块位于其上的基材的表面的部分可以是优选地平坦的且坚固的或半坚固的。许多材料适用于作为基材。基材可包括硅、二氧化硅、玻璃或聚合物。例如，基材可包含选自由以下组成的组的材料：硅、二氧化硅、石英、玻璃、可控孔度玻璃、碳、氧化铝、二氧化钛、锗、氮化硅、沸石和砷化镓。许多金属诸如金、铂、铝、铜、钛以及它们的合金也是用于阵列的基材的选择。此外，许多陶瓷和聚合物也可被用作基材。可被用作基材的聚合物包括但不限于以下：聚苯乙烯；聚(四)氟乙烯；(聚)偏二氟乙烯；聚碳酸酯；聚甲基丙烯酸甲酯；聚乙烯基乙烯(polyvinylethylene)；聚乙烯亚胺；聚(醚醚)酮；聚甲醛(POM)；聚乙烯基苯酚；聚乳酸；聚甲基丙烯酰亚胺(PMI)；聚烯烃砜(PAS)；聚甲基丙烯酸羟乙酯；聚二甲基硅氧烷；聚丙烯酰胺；聚酰亚胺；共嵌段聚合物；以及光刻胶、聚合的朗缪尔-布洛尔杰特膜(Langmuir-Blodgett films)和LIGA结构也可用作本发明中的基材。
[0162] 在一个实施方案中，不同的抗体或病毒体的微阵列可结合在用聚阳离子聚合物涂覆的玻璃载玻片上。根据本发明的另一方面可形成基材，并且预期用于检测靶跨膜分子与一种或更多种不同的膜结合蛋白抗体的结合。在一个实施方案中，基材包括在其表面上已形成聚阳离子聚合物优选地阳离子多肽，诸如聚赖氨酸或聚精氨酸的涂层的玻璃基材。不同的生物聚合物的微阵列可在聚阳离子涂层上形成，所述生物聚合物的每一种定位在已知的选择的阵列区域，诸如区域。
[0163] 载玻片可通过将聚阳离子聚合物，例如，聚-l-赖氨酸的均匀厚度的膜放置在载玻片的表面上并干燥膜以形成干燥的涂层而被涂覆。添加的聚阳离子聚合物的量可足以在玻璃表面上形成聚合物的至少一个单层。聚合物膜可经由表面上的电负性甲硅烷基-OH基团和聚合物中带电荷的胺基基团之间的静电结合结合至表面。聚-l-赖氨酸涂覆的玻璃载玻片可从例如Sigma Chemical Co.(St.Louis,Mo.)商购获得。
[0164] 适合的微阵列基材还可通过玻璃的化学衍生化制备。在末端Si上具有适当的离去基团的硅烷化合物将共价结合至玻璃表面。衍生化分子可被设计为将所期望的化学过程赋予玻璃基材的表面。此类双功能性试剂的实例可以是氨基丙基三(乙氧基)硅烷，其在分子的三(乙氧基)硅烷部分与玻璃表面反应，同时留出分子的氨基部分为游离的。具有末端氨基基团的表面适合于以与聚赖氨酸涂覆的载玻片相同的方式吸附生物聚合物。末端表面基团的特性可通过进一步的化学反应来修饰。例如，以上实例中末端胺与戊二醛的反应产生末端醛基基团。在诸如通过将蛋白A或蛋白G溶液应用至甲硅烷基化的玻璃点制微阵列之前，另外的修饰层可被应用以实现期望的反应性。结合病毒体和/或多肽的另外的表面是硝酸纤维素涂覆的玻璃载玻片(从Schleicher和Schuell商购可得)，以及结合病毒体/蛋白的塑料，诸如聚苯乙烯。
[0165] 点制的抗体或病毒体可通过非共价键合或共价键合附接。吸附通过点制的多肽与阵列基材之间的静电、疏水、范德华、或氢键相互作用发生。在水性环境中将多肽或病毒体溶液简单应用至表面可足以吸附多肽或病毒体。共价附接可通过在多肽或病毒体上的官能团与化学活化的表面的反应来实现。例如，如果表面已用高反应性亲电子基团诸如醛或琥珀酰亚胺基团活化，未修饰的多肽或病毒体的多肽在胺基(如在赖氨酸残基或末端胺)处反应以形成共价键。
[0166] 当使用共价表面诸如环氧和醛接枝的表面时，病毒体可经由表面糖蛋白的伯胺(例如，赖氨酸残基)共价交联至表面。当硝酸纤维素涂覆的表面(例如，FAST载玻片)可被使用时，病毒体可被吸附或吸收至多孔表面。HSV-1病毒体可以有效地吸附至任何塑料或涂覆的表面。
[0167] 在一些实施方案中，共价表面附接可用于在严格条件下的结合。在一些实施方案中，共价表面附接对于在严格条件下的结合比非共价表面附接更有用。在一些实施方案中，与阵列上每个点的非共价固定的病毒体的量相比，阵列上每个点的共价固定的病毒体的量减少。在一些实施方案中，与阵列上每个点的共价固定的病毒体的量相比，阵列上每个点的非共价固定的病毒体的量增加。在一些实施方案中，共价表面可用来保持低背景信号(例如，Cy3和具有较短波长的其他信道)。在一些实施方案中，共价表面附接被用于某些类型诸如磷酸化的测定。在一些实施方案中，非共价表面诸如FAST载玻片可吸附多于共价表面上每个点的吸附的病毒体数目的每个点的病毒体。在一些实施方案中，非共价表面对于检测低亲和力结合事件而言是比共价表面更好的表面。
[0168] 为了形成微阵列，使用本领域已知的任何适合的方法将定义体积的不同生物聚合物沉积在聚合物涂覆的载玻片上。根据基材的重要特征，当水性样品可在允许样品中标记的配体结合至基材阵列中同类结合配偶体的条件下被应用于基材时，沉积的抗体或病毒体保持非共价结合至涂覆的载玻片表面。
[0169] 在一些实施方案中，至少一个或每个微阵列包含每小于约1cm2的表面积至少约50个、60个、70个、80个、90个、100个、150个、200个、250个、300个、350个、400个、450个、500个、600个、700个、800个、900个、或1000个不同抗体。在一些实施方案中，至少一个或每个微阵列包含每小于约1cm2的表面积至少约50个、60个、70个、80个、90个、100个、150个、200个、
250个、300个、350个、400个、450个、500个、600个、700个、800个、900个、或1000个不同病毒体。在一个实施方案中，微阵列包含在约16mm2的区域中的50个、60个、70个、80个、90个、100个、150个、200个、250个、300个、350个或400个区域，或2.5×103个区域/cm2。还在一个优选的实施方案中，至少一个或每个微阵列区域中的抗体以约0.1毫微微摩尔和100纳摩尔之间的定义的量存在。还在一个优选的实施方案中，至少一个或每个微阵列区域中的病毒体以约0.1毫微微摩尔和100纳摩尔之间的定义的量存在。
250个、300个、350个、400个、450个、500个、600个、700个、800个、900个、或1000个不同病毒体。在一个实施方案中，微阵列包含在约16mm2的区域中的50个、60个、70个、80个、90个、100个、150个、200个、250个、300个、350个或400个区域，或2.5×103个区域/cm2。还在一个优选的实施方案中，至少一个或每个微阵列区域中的抗体以约0.1毫微微摩尔和100纳摩尔之间的定义的量存在。还在一个优选的实施方案中，至少一个或每个微阵列区域中的病毒体以约0.1毫微微摩尔和100纳摩尔之间的定义的量存在。
[0170] 还在一个优选的实施方案中，生物聚合物具有至少约50个单位例如氨基酸、核苷酸等的长度，即，基本上长于可通过多种原位合成方案在高密度阵列中形成的聚合物。
[0171] 制备方法
[0172] 本公开的主题还至少部分地涉及制备包含如本文公开的与基材的表面稳定缔合的多个重组病毒体微点的阵列的方法。阵列可使用本领域熟知的微模式化技术来制备。此类技术可以包括例如微压印(microstamping)(美国专利号5,731,152)、使用PDMS印章的微接触印刷(Hovis等(2000)Langmuir 16：894-897)、毛细管分配设备(美国专利号5,807,522)和微移液设备(美国专利号5,601,980)。
[0173] 在一个实施方案中，可将探针(还被称为“针”)的尖端浸入到重组病毒体的溶液中。尖端可从溶液中移出以提供粘附至尖端的包含重组病毒体的溶液。包含重组病毒体的溶液可与基材的表面接触，从而将包含重组病毒体的溶液从尖端转移至基材表面。
[0174] 如在本公开的主题中使用的“针”可以是任何形状、尺寸和维度。例如，针印刷过程可涉及环形针、四方针、或点针等。在另一个实施方案中，直接接触印刷可涉及单个针印刷或多个针印刷(即，单个针印刷方法涉及源板，或多个针印刷使用以任何格式模式化的多个针的布局阵列)。
[0175] 印刷装置可包括印刷头、板、基材处理单元、XY或XYZ定位平台、环境控制、仪器控制软件、样品跟踪软件等等。此类装置包括，例如，由Cartesian Technologies Inc.出售的套筒针打印机(quill pin-printer)。
[0176] 对于高密度阵列，具有包含多个重组病毒体的重组病毒体微点的基质的印刷重组病毒体微点阵列可被用于将至少一个或每个重组病毒体微点从基质对齐并匹配到相应的源孔(例如，微量滴定板的孔)。
[0177] II.使用方法
[0178] 本公开的主题还涉及用于包含与基材表面稳定缔合的多个重组病毒体微点的阵列的使用方法，其中所述重组病毒体微点包含多个重组病毒体，其中所述重组病毒体包含包膜，所述包膜包含保留它们的天然构象和/或相互作用的多种异源膜结合蛋白，例如，人膜结合蛋白。这些使用方法包括但不限于用于筛选结合膜结合蛋白例如人膜结合蛋白的配体和/或药物的高含量、高通量测定。另外的使用方法包括医学诊断、蛋白质组学和生物传感器测定。
[0179] 对于在方法中使用，样品通常可被递送至阵列，并且样品通常可以是被在阵列的重组病毒体微点中的异源膜结合蛋白结合的流体样品，例如，包含蛋白、多肽、其片段、或感兴趣的任何其他分析物(或“靶”)的溶液。在某些实施方案中，样品可包含生物样品，如以下进一步描述的。
[0180] 与阵列一起使用的测定可以是直接的非竞争性测定或间接的竞争性测定。在非竞争性方法中，对重组病毒体微点中的异源膜结合蛋白上的结合位点的亲和力可被直接地确定。在该方法中，重组病毒体微点中的异源膜结合蛋白被直接暴露于分析物(或“靶”)。分析物可以是标记的或未标记的。如果分析物可以是标记的，检测方法可包括荧光、发光、放射性等。如果分析物是未标记的，结合的检测将基于重组病毒体微点中异源膜结合蛋白的表面上的一些物理性质的改变。此类物理性质可包括，例如，折射率或电阻抗。未标记的靶的结合的检测可包括，例如，质谱。在竞争性方法中，结合位点占用可被间接地确定。在该方法中，阵列的重组病毒体微点中的异源膜结合蛋白被暴露于包含针对阵列的重组病毒体微点中的异源膜结合蛋白的同类标记的靶或配体和未标记的靶的溶液。标记的同类配体和未标记的靶竞争阵列的重组病毒体微点中的异源膜结合蛋白上的结合位点。靶相对于同类配体对重组病毒体微点中的异源膜结合蛋白的亲和力可通过标记的配体的结合的量的减少来确定。靶的结合的检测还可使用夹心测定来进行，其中在初始结合之后，阵列可与包含具有对结合的靶的亲和力的分子诸如标记的抗体的第二溶液一起孵育，且靶的结合的量可基于标记的抗体与异源膜结合蛋白靶复合体的结合的量来确定。靶的结合的检测可使用置换测定来进行，其中在标记的配体的初始结合之后，阵列可与包含感兴趣的化合物的第二溶液一起孵育。靶的结合能力和结合的量基于阵列的重组病毒体微点中的异源膜结合蛋白中预结合的标记的配体的数目的减少来确定。
[0181] 在一个实施方案中，当潜在的配体和/或药物候选物可被直接筛选以确定其与阵列上的多种异源膜结合蛋白结合或另外的相互作用的能力时，阵列可在用于筛选配体和/或药物的方法中使用。可选地，多个潜在的配体和/或药物候选物可并行筛选以确认它们与阵列上的一种或更多种类型的异源膜结合蛋白结合或另外的相互作用的能力。配体和/或药物筛选过程可任选地涉及在潜在的配体和/或药物候选物的存在和不存在两者下测定样品的至少一种分析物或组分与阵列上的一种或更多种异源膜结合蛋白的相互作用诸如结合。这允许待测试以确认其能力的潜在的配体和/或药物候选物充当相互作用或最初被测定的相互作用的抑制剂。
[0182] 在另一个实施方案中，阵列可在用于筛选多种蛋白以确认它们结合靶样品的特定组分的能力的方法中使用。该方法包括将样品递送至包含重组病毒体微点中的异源膜结合蛋白的阵列，并直接或间接检测保留在至少一个或每个微点处的特定组分的存在或量。在一个优选的实施方案中，该方法还包括在检测步骤之前洗涤阵列以从阵列去除样品的任何未结合或非特异性结合的组分的中间步骤。在另一个实施方案中，该方法还包括进一步表征保留在至少一个微点处的特定组分的另外的步骤。
[0183] 在另一个实施方案中，提供了测定蛋白-蛋白结合相互作用的方法，所述方法包括以下步骤：首先，将包含待测定结合的至少一种蛋白的样品递送至重组病毒体阵列；并然后直接或间接检测来自样品的能够被保留在至少一个微点或每个微点处的蛋白的存在或量。
[0184] 另一个实施方案提供了并行测定样品中能够与重组病毒体阵列上的一种或更多种异源膜结合蛋白反应的多种分析物的存在的方法。该方法包括将样品递送至阵列，并检测分析物与至少一个或每个重组病毒体微点处的异源膜结合蛋白的相互作用。
[0185] 在又另一个实施方案中，并行测定样品中能够结合重组病毒体阵列上的一种或更多种异源膜结合蛋白的多种分析物的存在的方法包括将流体样品递送至阵列，并直接或间接检测保留在至少一个或每个微点处的分析物的存在或量。在一个优选的实施方案中，该方法还包括洗涤阵列以从阵列去除样品的任何未结合或非特异性结合的组分的步骤。
[0186] 在另一个实施方案中，当被测定的多种分析物能够指示生物体中的疾病状况或病原体的存在时，重组病毒体阵列可以以诊断方式被使用。在此类实施方案中，可被递送至阵列的样品则将通常包括生物样品。如本文所用的，短语“生物样品”包括从受试者获得的并对过程有用的多种类型的样品。在一个实施方案中，生物样品包括全血、血细胞、血清或血浆。当生物样品包括固体组织样品时，液体样品可通过本领域已知的多种方法包括匀质化、消化和/或提取从该固体组织得到。因此，生物组织样品可包括固体组织样品、液体组织样品、生物流体、抽出物、细胞和细胞碎片。生物样品的具体实例包括但不限于通过手术切除获得的固体组织样品、病理标本、归档样品或活组织检查标本，源自其的组织培养物或细胞及其后代，以及从这些来源的任一个制备的切片或涂片。生物样品的非限制性实例包括从乳房组织、淋巴结和乳腺肿瘤获得的样品。生物样品还包括来源于脊椎动物的身体的任何材料，包括但不限于血液、脑脊液、血清、血浆、尿液、乳头抽出物、细针抽出物、组织灌洗诸如导管灌洗、唾液、痰、腹水流体、肝、肾、乳房、骨、骨髓、睾丸、脑、卵巢、皮肤、肺、前列腺、甲状腺、胰腺、子宫颈、胃、肠、结肠直肠、脑、膀胱、结肠、鼻孔、子宫、精液、淋巴、阴道池、滑液、脊髓液、头颈部、鼻咽肿瘤、羊水、乳汁、肺痰或表面活性物质、尿液、粪便物和生物起源的其他液体样品。
[0187] 在本公开的方法的许多实施方案中，通过本公开的方法诊断的受试者可期望地是人受试者，尽管应该理解，本文描述的方法关于所有脊椎动物物种都是有效的，所述所有脊椎动物物种预期被包括在术语“受试者”中。因此，“受试者”可包括用于医疗目的，诸如用于现存疾病、紊乱、状况的诊断或治疗或用于预防疾病、紊乱或状况的发作的预防性诊断或治疗的人受试者，或用于医疗目的、兽医目的或发育目的的动物受试者。适合的动物受试者包括哺乳动物，哺乳动物包括但不限于灵长类动物，例如，人、猴、猿、长臂猿、黑猩猩、猩猩、猕猴等；牛科动物，例如，牛(cattle)、公牛等；绵羊类动物(ovine)，例如，绵羊等；山羊类动物(caprine)，例如，山羊等；猪类动物(porcine)，例如，猪、家猪(hog)等；马科动物(equine)，例如马、驴、斑马等；猫科动物，包括野生猫和家猫；犬科动物，包括狗；兔形目动物，包括兔、野兔等；以及啮齿类动物，包括小鼠、大鼠、豚鼠等。动物可以是转基因动物。在一些实施方案中，受试者可以是人，包括但不限于，胎儿、新生儿、婴儿、青少年和成年受试者。此外，“受试者”可包括患有或疑似患有疾病、紊乱或状况的患者。因此，术语“受试者”和“患者”在本文可互换地使用。受试者还包括动物疾病模型(例如，在实验中使用的大鼠或小鼠等)。
[0188] 通常，样品(其中样品包括包含被阵列的重组病毒体微点中的异源膜结合蛋白结合的蛋白的溶液)的递送可任选地在封闭溶液的递送之前、之后或伴随封闭溶液的递送。封闭溶液包含将附着至阵列上的非特异性结合位点的蛋白或另外的部分。例如，牛血清白蛋白、奶粉、聚谷氨酸、DNA分子或凝集素的溶液可用作封闭剂。
[0189] 一系列检测方法可适用于该方法。检测可以是定量的、半定量的或定性的。本公开的阵列可与光学检测方法诸如在可见或红外范围内的吸收、化学发光和荧光(包括寿命、偏振、荧光相关光谱(FCS)和荧光共振能量转移(FRET))配合使用。此外，其他检测模式诸如基于光波导(PCT公布WO96/26432和美国专利号5,677,196)、表面等离子体共振、表面电荷传感器和表面力传感器的那些与许多实施方案兼容。
[0190] 在另一个实施方案中，本公开的主题涉及检测特异性结合阵列的重组病毒体微点中的异源膜结合蛋白的抗体的方法。术语“特异性结合”指与任何非靶相比，以至少约五倍更大的亲和力，例如至少约10倍、20倍、50倍或100倍更大的亲和力结合靶(例如，蛋白)的分子或化合物。重组病毒体阵列可用于从可溶性抗体文库或从噬菌体展示文库或核糖体展示文库选择抗体。重组病毒体阵列还可用于如在感染期间或在自身免疫状况中分析患者血清中的少量抗体。
[0191] 如本文所用的，术语“抗体”指包含至少一个结合结构域的多肽或一组多肽，其中抗体结合结构域可由抗体分子的可变域折叠形成，以形成具有与抗原的抗原决定簇的特征互补的内表面形状和电荷分布的三维空间，其允许与抗原免疫反应。抗体包括包含结合结构域的重组蛋白，以及片段，包括Fab、Fab′、F(ab)2和F(ab′)2片段。如本文中所用的，“抗原决定簇”可以是抗原分子的部分，在这种情况下，异源膜结合多肽确定抗原-抗体反应的特异性。“表位”指多肽的抗原决定簇。表位可包含该表位特有的空间构象中的少至3个氨基酸。通常表位由至少约6个此类氨基酸，且更通常至少约8-10个此类氨基酸组成。用于确定组成表位的氨基酸的方法包括x-射线晶体学、2-维核磁共振和表位作图(例如H.Mario Geysen等(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81:3998-4002、PCT专利公布号WO 84/03564以及PCT专利公布号WO 84/03506描述的肽扫描方法)。
[0192] 膜蛋白的抗体和抗体文库
[0193] 本发明还涉及膜蛋白的抗体文库，包括制备、生产、表征和利用抗体的方法和系统。抗体可以是膜蛋白高度特异性的。文库可包含针对膜蛋白的多种不同的抗体，其中抗体由相同的平台制备。文库可包含多种不同的抗体，其中在所述多种或所述多种的子集内，每种抗体可以是膜蛋白的单特异性抗体；结合其靶膜蛋白的天然形式；可以是膜蛋白的单克隆抗体；可以是膜蛋白免疫沉淀抗体；可以是膜蛋白的IgG抗体或膜蛋白的IgG同种型抗体的抗体；具有对其靶膜蛋白的结合亲和力，所述结合亲和力可类似于所述多种抗体中的另-7一种抗体的结合亲和力，具有至少10 M(KD)的对其靶膜蛋白的结合亲和力；或其任何组合。
[0194] 平台
[0195] 抗体的文库可包含由相同平台制备的膜蛋白的多种不同的抗体。在一个实施方案中，抗体的文库包含膜蛋白的多种不同的抗体，其中所述多种的至少约10％可由相同的平台制备。例如，文库可包含膜蛋白的多种不同的抗体，其中所述多种的至少约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％是由相同的平台制备的膜蛋白的抗体。
[0196] 当第一抗体和第二抗体可通过相同方案制备时，抗体被认为由相同平台制备。例如，膜蛋白的多种抗体可由平台制备。在一个实施方案中，动物可用如本文描述的表达不同膜蛋白的多个病毒体来免疫。动物可以是非人动物，诸如牛科动物、鸟类、犬科动物、马科动物、猫科动物、绵羊类动物、猪类动物或灵长类动物。动物可以是哺乳动物，诸如小鼠、大鼠、兔、猫、狗、猴或山羊。
[0197] 表达不同膜蛋白的多个病毒体可包括分离的或未分离的病毒体或其片段，诸如表达或包含一种或更多种异源膜结合蛋白的分离的病毒体。在另一个实施方案中，多个病毒体可包括未分离的病毒体。
[0198] 多个病毒体可构成生物样品。例如，多个病毒体可包含通过本文描述的方法或从生物体或细胞制备的单一病毒体或多个病毒体。生物体或细胞可以是人的或非人的。非人生物体或细胞可以是哺乳动物或哺乳类动物，诸如小鼠、大鼠、兔、猫、狗、猴或山羊。生物样品可以是包含病毒体的组织、血液、血清、血浆、尿液、脑脊液(CSF)、痰、唾液、骨髓、滑液、水状液、羊水、耳垢、乳汁、支气管肺泡灌洗液、精液、前列腺液、考珀液、射精前的液体、女性喷射液、汗液、泪液、囊液、胸膜液、腹膜液、心包液、淋巴液、食糜、乳糜、胆汁、间质液、月经、脓、皮脂、阴道分泌物、粘膜分泌物、粪便水、胰液、来自窦腔的灌洗液、支气管肺抽出物、囊胚腔液、或脐带血。在一个实施方案中，生物样品可以基本上耗尽常见的血清蛋白，诸如，但不限于白蛋白或IgG。耗尽可包括过滤、分级分离或亲和纯化。
[0199] 生物样品可包含含有异源膜蛋白的病毒体或病毒，诸如包膜病毒，例如，免疫缺陷病毒诸如人类免疫缺陷病毒(HIV)，嗜T淋巴细胞病毒诸如人嗜T淋巴细胞病毒(HTLV)，猴免疫缺陷病毒(SIV)，疱疹病毒诸如单纯疱疹病毒(HSV)，麻疹病毒，乳头状瘤病毒(HPV)，腺病毒，牛痘病毒，逆转录病毒科(例如人类免疫缺陷病毒，诸如HIV-1(还称为HTLV-III、LAV或HTLV-III/LAV或HIV-III)以及其他分离株，诸如HIV-LP)；小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)(例如脊髓灰质炎病毒、甲型肝炎病毒；肠道病毒、人柯萨奇病毒、鼻病毒、艾柯病毒)；杯状病毒科(Calciviridae)(例如引起胃肠炎的毒株)；披膜病毒科(Togaviridae)(例如马脑炎病毒、风疹病毒)；黄病毒科(Flaviridae)(例如登革病毒、脑炎病毒、黄热病病毒)；冠状病毒科(coronaviridae)(例如冠状病毒)；弹状病毒科(例如水疱性口炎病毒、狂犬病病毒)；丝状病毒科(Filoviridae)(例如埃博拉病毒)；副粘病毒科(Paramyxoviridae)(例如副流感病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞体病毒)；正粘病毒科(Orthomyxoviridae)(例如流感病毒)；布尼亚病毒科(Bungaviridae)(例如汉坦病毒(Hantaan virus)、布尼亚病毒(bunga virus)、白蛉热病毒属(phlebovirus)和内罗病毒属(Nairo virus))；砂粒病毒科(Arena viridae)(出血热病毒)；呼肠孤病毒科(Reoviridae)(例如呼肠孤病毒、环状病毒(orbiviurs)和轮状病毒)；双核糖核酸病毒科
(Birnaviridae)；嗜肝DNA病毒科(乙型肝炎病毒)；细小病毒科(parvoviridae)(细小病毒)；乳多空病毒科(Papovaviridae)(乳头状瘤病毒、多瘤病毒)；腺病毒科(Adenoviridae)(大多数腺病毒)；疱疹病毒科(单纯疱疹病毒(HSV)1和2、水痘-带状疱疹病毒、巨细胞病毒(CMV)、疱疹病毒)；痘病毒科(Poxviridae)(天花病毒、牛痘病毒、痘病毒)；和虹彩病毒科(Iridoviridae)；以及未分类的病毒(例如海绵状脑病的病原体、丁型病毒性肝炎(delta hepatitis)的病原体)；诺瓦克病毒和相关的病毒，星状病毒或流感病毒。
(Birnaviridae)；嗜肝DNA病毒科(乙型肝炎病毒)；细小病毒科(parvoviridae)(细小病毒)；乳多空病毒科(Papovaviridae)(乳头状瘤病毒、多瘤病毒)；腺病毒科(Adenoviridae)(大多数腺病毒)；疱疹病毒科(单纯疱疹病毒(HSV)1和2、水痘-带状疱疹病毒、巨细胞病毒(CMV)、疱疹病毒)；痘病毒科(Poxviridae)(天花病毒、牛痘病毒、痘病毒)；和虹彩病毒科(Iridoviridae)；以及未分类的病毒(例如海绵状脑病的病原体、丁型病毒性肝炎(delta hepatitis)的病原体)；诺瓦克病毒和相关的病毒，星状病毒或流感病毒。
[0200] 在一个优选的实施方案中，HSV-1可被用于制备本文描述的重组病毒体。然而，其他疱疹病毒也可被使用。当转染进宿主细胞时HSV-1通常不经历潜伏期，使得其便于病毒体制备。HSV-1的遗传优于用于工程化人基因的其他病毒。其他系统，诸如基于杆状病毒和逆转录病毒的那些具有缺点，所述缺点包括用于制备阵列的非理想的病毒体结构(HSV-1产生用于印刷的理想的球形病毒体)、不正确的翻译后修饰、掺入宿主来源的膜蛋白的较低效率或不能掺入宿主来源的膜蛋白以及较低数目的掺入分子。
[0201] 编码具有预测的α螺旋跨膜区的膜蛋白的人基因的数目估计为约5,600个，对应于大约26％的人蛋白编码基因。这些蛋白的绝大部分仅具有一个预测的跨膜区，但也存在具有七个预测的跨膜区的许多蛋白，包括G蛋白偶联受体。多个病毒体可包含具有跨膜结构域的多种膜结合蛋白。例如，跨膜蛋白可包括至少约100种具有跨膜结构域的膜结合蛋白，诸如至少约200种、300种、400种、500种、600种、700种、800种、900种、1,000种、2,000种、3,000种、4,000种、5,000种、5,500种、5,600种或更多种具有跨膜结构域的不同的膜结合蛋白。
[0202] 病毒体的文库可包括具有跨膜结构域的多种膜结合蛋白。例如，病毒体的文库可包括至少约100种具有跨膜结构域的膜结合蛋白，诸如至少约200种、300种、400种、500种、600种、700种、800种、900种、1,000种、2,000种、3,000种、4,000种、5,000种、5,500种、5,600种或更多种具有跨膜结构域的不同的膜结合蛋白。病毒体的文库可代表至少约0.5％、1％、
2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、
19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％或60％的生物体的蛋白质组。病毒体的文库可代表至少约0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、
14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、或60％、70％、
80％、90％或100％的生物体的膜结合蛋白质组。病毒体的文库可包含代表生物体的膜结合蛋白质组的大部分或整个生物体的膜结合蛋白质组的多种膜结合蛋白，所述生物体的膜结合蛋白质组诸如细菌、病毒或真菌蛋白质组。病毒体的文库可包含代表昆虫或哺乳动物诸如小鼠、大鼠、兔、猫、狗、猴、山羊或人的蛋白质组的大部分或整个蛋白质组的多种膜结合蛋白。文库或多种膜结合蛋白还可包括融合蛋白文库，所述融合蛋白文库代表呈未纯化的形式的生物体的膜结合蛋白质组(诸如过表达生物体的膜结合蛋白质组的病毒体的集合)。
2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、
19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％或60％的生物体的蛋白质组。病毒体的文库可代表至少约0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、
14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、或60％、70％、
80％、90％或100％的生物体的膜结合蛋白质组。病毒体的文库可包含代表生物体的膜结合蛋白质组的大部分或整个生物体的膜结合蛋白质组的多种膜结合蛋白，所述生物体的膜结合蛋白质组诸如细菌、病毒或真菌蛋白质组。病毒体的文库可包含代表昆虫或哺乳动物诸如小鼠、大鼠、兔、猫、狗、猴、山羊或人的蛋白质组的大部分或整个蛋白质组的多种膜结合蛋白。文库或多种膜结合蛋白还可包括融合蛋白文库，所述融合蛋白文库代表呈未纯化的形式的生物体的膜结合蛋白质组(诸如过表达生物体的膜结合蛋白质组的病毒体的集合)。
[0203] 探测可通过排列过表达或包含异源膜结合蛋白诸如融合蛋白的病毒体，并测试针对排列的病毒体的抗体或杂交瘤上清液来进行。探测还可通过荧光流式细胞术进行且膜结合蛋白靶通过PCR或病毒体中的重组DNA的序列分析来鉴定。
[0204] 抗体可被选择且选择的抗体可以是高度特异性的单克隆抗体，其仅识别一个跨膜靶，并且不会与该生物体的蛋白质组文库中的其他跨膜靶或非膜蛋白靶交叉反应。制备的分泌这些单克隆抗体的细胞系可被扩大。通过相同平台或方案制备的膜结合蛋白抗体可用于制备或形成膜结合蛋白抗体的文库。
[0205] 当抗体在诸如下面进一步描述的制备文库的方法中通过相同方法或方案制备时，膜结合蛋白抗体也可通过相同平台来制备。
[0206] 单特异性
[0207] 膜结合蛋白抗体的文库可包含多种不同的膜结合蛋白抗体，至少一种或每种抗体具有对其膜结合蛋白靶的特定结合特异性。例如，膜结合蛋白抗体的文库可包含多种不同的膜结合蛋白抗体，其中膜结合蛋白抗体是单特异性的。在一个实施方案中，膜结合蛋白抗体的文库包含多种不同的膜结合蛋白抗体，其中多种膜结合蛋白抗体的至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％可以是单特异性的。
[0208] 如果当在包含多个膜结合蛋白的阵列上孵育时，膜结合蛋白抗体对膜结合蛋白具有大于6的A值和大于3的S值，则膜结合蛋白抗体可以是单特异性的。如果当在包含多个非膜结合蛋白的阵列上孵育时，膜结合蛋白抗体对膜结合蛋白具有大于6的A值和大于3的S值，则膜结合蛋白抗体可以是单特异性的。如果当在包含多个跨膜结合蛋白和非膜结合蛋白的阵列上孵育时，膜结合蛋白抗体对膜结合蛋白具有大于6的A值和大于3的S值，则膜结合蛋白抗体可以是单特异性的。膜结合蛋白抗体的高于跨越整个阵列的平均信号强度的标准差的数值可以是称为A的值。当膜结合蛋白抗体的针对整个阵列的信号强度被排序时，阵列上最高信号和第二高信号之间的差可以是S值。例如，A和S值可通过如下来计算：将来自产生膜结合蛋白抗体的细胞或杂交瘤的单独的上清液组合进12x12二维集合的组，且将这些集合在阵列上孵育(诸如人膜结合蛋白质组微阵列)，且膜结合蛋白抗体被标记(诸如通过Cy5偶联的抗IgG二抗，或检测抗体的任何其他方法)。在洗涤和扫描之后，至少一个点或每个点的信号强度(代表与阵列上的蛋白或抗原结合的膜结合蛋白抗体)作为前景信号与背景信号的比。高于跨越整个阵列的平均信号强度的标准差的数值可以是称为A的值。A>3的重复点(每个蛋白或抗原的复制对)被标记，并且结果解卷积以鉴定存在于单个水平集合和单个垂直集合的交叉处的蛋白或抗原。每个候选高度特异性单克隆膜结合蛋白抗体(即A>3)可针对整个阵列单独地测试，并且对于每个点制的蛋白测量A。信号强度然后被排序，并且阵列上最高信号和第二高信号之间的差可被计算，得到S值。其中A>6且S>3的膜结合蛋白单克隆抗体被鉴定为单特异性膜结合蛋白单克隆抗体(mMAb)。双特异性膜结合蛋白单克隆抗体(dMAb)强烈结合阵列上的两种不同的蛋白并具有A>6且S<3。
[0209] 在一些实施方案中，膜结合蛋白mMAb可具有大于6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100的A值，和/或大于3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100的S值。
[0210] 在一个实施方案中，用于确定膜结合蛋白抗体的单特异性的阵列包括生物体的蛋白质组文库，诸如至少约0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、
60％、70％、80％、90％或100％的生物体的蛋白质组。在一个实施方案中，用于确定膜结合蛋白抗体的单特异性的阵列包括生物体的膜结合蛋白质组文库，诸如至少约0.5％、1％、
2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、
19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的生物体的跨膜蛋白质组。抗原的文库可代表生物体的蛋白质组或跨膜蛋白质组的大部分或整个生物体的蛋白质组或跨膜蛋白质组，所述生物体的蛋白质组或跨膜蛋白质组诸如细菌、病毒、真菌蛋白质组。抗原的文库可代表昆虫或哺乳动物，诸如小鼠、大鼠、兔、猫、狗、猴、山羊或人的蛋白质组或跨膜蛋白质组的大部分或整个蛋白质组或跨膜蛋白质组。例如，生物体的蛋白质组文库可包含至少约11,000种、12,000种、13,000种、14,000种、15,000种、16,000种、
17,000种、18,000种、19,000种或20,000种不同的抗原。例如，生物体的膜结合蛋白文库可包含至少约100种、200种、300种、400种、500种、600种、700种、800种、900种、1,000种、2,000种、3,000种、4,000种、5,000种、5,500种、5,600种或更多种具有跨膜结构域的不同的膜蛋白。
60％、70％、80％、90％或100％的生物体的蛋白质组。在一个实施方案中，用于确定膜结合蛋白抗体的单特异性的阵列包括生物体的膜结合蛋白质组文库，诸如至少约0.5％、1％、
2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、
19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的生物体的跨膜蛋白质组。抗原的文库可代表生物体的蛋白质组或跨膜蛋白质组的大部分或整个生物体的蛋白质组或跨膜蛋白质组，所述生物体的蛋白质组或跨膜蛋白质组诸如细菌、病毒、真菌蛋白质组。抗原的文库可代表昆虫或哺乳动物，诸如小鼠、大鼠、兔、猫、狗、猴、山羊或人的蛋白质组或跨膜蛋白质组的大部分或整个蛋白质组或跨膜蛋白质组。例如，生物体的蛋白质组文库可包含至少约11,000种、12,000种、13,000种、14,000种、15,000种、16,000种、
17,000种、18,000种、19,000种或20,000种不同的抗原。例如，生物体的膜结合蛋白文库可包含至少约100种、200种、300种、400种、500种、600种、700种、800种、900种、1,000种、2,000种、3,000种、4,000种、5,000种、5,500种、5,600种或更多种具有跨膜结构域的不同的膜蛋白。
[0211] 结合亲和力
[0212] 膜结合蛋白抗体的文库可包含具有对其膜结合蛋白靶的特定结合亲和力的多种不同的膜结合蛋白抗体。例如，文库可包含多种不同的膜结合蛋白抗体，其中所述多种的至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％具有特定结合亲和力。例如，多个膜结合蛋白抗体可具有如通过其解离常数(KD)确定的对其靶膜结合蛋白的至少约10-7M，诸如至少约10-8M、10-9M、10-10M、10-11M、10-12M、10-13M、10-14M、10-15M或10-16M的结合亲和力。
[0213] 多种膜结合蛋白抗体可具有如通过其缔合速率常数(kon)测量的结合亲和力，其中多种抗体具有至少约104M-1s-1、至少约5X 104M-1s-1、至少约105M-1s-1、至少约5X 105M-1s-1、至少约106M-1s-1、至少约5X 106M-1s-1、至少约107M-1s-1、至少约5X 107M-1s-1或至少约108M-1s-1的结合亲和力。多种抗体可具有如通过其解离速率常数(koff)测量的结合亲和力，其中多种抗体具有小于103M-1s-1、小于5X 103M-1s-1、小于104M-1s-1、小于5X 104M-1s-1、小于105M-1s-1、小于5X 105M-1s-1、小于106M-1s-1、小于5X 106M-1s-1、小于107M-1s-1、小于5X 107M-1s-1、或小于108M-1s-1、小于5X 107M-1s-1、小于108M-1s-1、小于5X 108M-1s-1、小于109M-1s-1、小于5X 109M-1s-1 10 -1 -1
或小于10 M s 的结合亲和力。
或小于10 M s 的结合亲和力。
[0214] 结合亲和力可通过表面等离子体共振、层析法或本领域已知的任何其他方法来确定。结合亲和力还可通过光学，诸如通过使用检测生物分子相互作用的实时和/或无标记物的方法来确定。在一个实施方案中，斜入射光反射率差法(OIRD)可被使用。
[0215] 膜结合蛋白抗体的文库可包含结合其靶膜结合蛋白的天然形式的多种不同的膜结合蛋白抗体。例如，文库可包含多种不同的膜结合蛋白抗体，其中所述多种的至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％结合其靶膜结合蛋白的天然形式。在一个实施方案中，结合其靶膜结合蛋白的天然形式的多种膜结合蛋白抗体在相同结合条件下不结合其靶膜结合蛋白的变性形式。
[0216] 膜结合蛋白抗体的文库可包含多种不同的膜结合蛋白抗体，其中文库的一种或更多种抗体具有对其靶膜结合蛋白的结合亲和力，所述结合亲和力可类似于所述多种的另一种膜结合蛋白抗体的结合亲和力。例如，膜结合蛋白抗体的文库可包含第一膜结合蛋白抗体和第二膜结合蛋白抗体，其中第一膜结合蛋白抗体具有对第一膜结合蛋白的结合亲和力，所述结合亲和力类似于第二膜结合蛋白抗体对第二膜结合蛋白的结合亲和力。文库的一种膜结合蛋白抗体可具有对其靶膜结合蛋白的结合亲和力，所述结合亲和力可在文库的一种或更多种其他膜结合蛋白抗体的结合亲和力的至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％以内。文库的第一膜结合蛋白抗体可具有对其靶膜结合蛋白的结合亲和力，所述结合亲和力可在文库的一种或更多种其他膜结合蛋白抗体的结合亲和力的至少约20％以内。在一个实施方案中，膜结合蛋白抗体的文库可包含多种不同的膜结合蛋白抗体，其中至少约10％、20％、
30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％的不同的膜结合蛋白抗体具有对其靶膜结合蛋白的结合亲和力，所述结合亲和力可在剩余的多种不同的膜结合蛋白抗体对它们各自的靶膜结合蛋白的结合亲和力的至少约20％以内。
30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％的不同的膜结合蛋白抗体具有对其靶膜结合蛋白的结合亲和力，所述结合亲和力可在剩余的多种不同的膜结合蛋白抗体对它们各自的靶膜结合蛋白的结合亲和力的至少约20％以内。
[0217] 蛋白质组
[0218] 本文还提供了膜结合蛋白抗体的文库，所述膜结合蛋白抗体的文库可包含结合生物体的膜结合蛋白质组的一部分的多种不同的抗体。多种不同的膜结合蛋白抗体可结合至少约0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或
100％的生物体的膜结合蛋白质组。例如，多种不同的膜结合蛋白抗体可结合生物体的至少约100种、200种、300种、400种、500种、600种、700种、800种、900种、1,000种、2,000种、3,000种、4,000种、5,000种、5,500种、5,600种或更多种膜结合蛋白。膜结合蛋白质组可以是细菌、病毒、真菌蛋白质组。膜结合蛋白质组可以是昆虫或哺乳动物，诸如小鼠、大鼠、兔、猫、狗、猴、山羊或人的。在一些实施方案中，膜结合蛋白质组可以是人膜结合蛋白质组。
100％的生物体的膜结合蛋白质组。例如，多种不同的膜结合蛋白抗体可结合生物体的至少约100种、200种、300种、400种、500种、600种、700种、800种、900种、1,000种、2,000种、3,000种、4,000种、5,000种、5,500种、5,600种或更多种膜结合蛋白。膜结合蛋白质组可以是细菌、病毒、真菌蛋白质组。膜结合蛋白质组可以是昆虫或哺乳动物，诸如小鼠、大鼠、兔、猫、狗、猴、山羊或人的。在一些实施方案中，膜结合蛋白质组可以是人膜结合蛋白质组。
[0219] 例如，多种不同的膜结合蛋白抗体可结合至少约0.5％的人膜结合蛋白质组。在一个实施方案中，多种不同的膜结合蛋白抗体可结合至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、
35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的人膜结合蛋白质组。
35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的人膜结合蛋白质组。
[0220] 其他抗体表征
[0221] 膜结合蛋白抗体的文库还可包含多种不同的膜结合蛋白抗体，其中膜结合蛋白抗体是IgG抗体(例如IgG同种型的膜结合蛋白抗体)。例如，膜结合蛋白抗体的文库可包含多种不同的膜结合蛋白抗体，其中膜结合蛋白抗体的至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％可以是IgG膜结合蛋白抗体或IgG同种型的膜结合蛋白抗体。
[0222] 膜结合蛋白抗体的文库还可包含多种不同的膜结合蛋白抗体，其中膜结合蛋白抗体是免疫沉淀膜结合蛋白抗体。例如，膜结合蛋白抗体的文库可包含多种不同的膜结合蛋白抗体，其中抗体的至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％可以是膜结合蛋白免疫沉淀抗体。免疫沉淀膜结合蛋白的膜结合蛋白抗体可以是这样的膜结合蛋白抗体，所述膜结合蛋白抗体与无抗体的阴性对照和抗V5抗体阳性对照相比可从细胞匀浆免疫沉淀靶膜结合蛋白。免疫沉淀的靶膜结合蛋白的检测可通过蛋白印迹进行。免疫沉淀可如下来进行：用澄清的细胞裂解物和大约2μg膜结合蛋白抗体，随后是在4℃孵育2小时，然后添加底物以结合任何膜结合蛋白抗体-蛋白复合体(诸如蛋白-G Dynabead)，并然后在4℃孵育另外的2小时。在孵育之后，底物可诸如用冰冷TBST洗涤两次，将底物转移至新的反应容器中，用冰冷TBST再次洗涤，然后经历SDS-PAGE和蛋白印迹分析。
[0223] 膜结合蛋白种类
[0224] 在一个方面，本发明涉及膜结合蛋白抗体的文库，所述膜结合蛋白抗体的文库包含对特定种类的膜结合蛋白的膜结合蛋白是特异性的多种膜结合蛋白抗体。当膜结合蛋白共享结构特征或拓扑特征中的一个或更多个共同属性时，它们属于一类膜结合蛋白，一种将定义的特征分配为一组结构特征或拓扑特征的集合。属于一类膜结合蛋白的膜结合蛋白可通过搜索共享一个或更多个结构特征和拓扑特征的基因来鉴定。共同属性可以是，例如，共同的结构特征、特定数目的跨膜跨越结构域、共同的拓扑结构、共同的生物学过程或共同的分子功能。
[0225] 关于人膜结合蛋白基因的功能和跨膜蛋白的公开的、同行评审的文献中存在的大量信息已被组织并储存(curated)。在人基因组中大约40,000个转录单位中，其中大约5,600个编码有注释的膜结合蛋白。
[0226] 在一些实施方案中，属于一类蛋白的蛋白是膜结合蛋白。
[0227] 在一些实施方案中，属于一类膜结合蛋白的膜结合蛋白是包含特定数目的跨膜跨越结构域的膜结合蛋白。
[0228] 在一些实施方案中，属于一类膜结合蛋白的膜结合蛋白是包含单个跨膜跨越结构域的膜结合蛋白。
[0229] 在一些实施方案中，属于一类膜结合蛋白的膜结合蛋白是包含两个或更多个跨膜跨越结构域的膜结合蛋白。在一些实施方案中，属于一类膜结合蛋白的膜结合蛋白是包含三个或更多个跨膜跨越结构域的膜结合蛋白。在一些实施方案中，属于一类膜结合蛋白的膜结合蛋白是包含四个或更多个跨膜跨越结构域的膜结合蛋白。在一些实施方案中，属于一类膜结合蛋白的膜结合蛋白是包含五个或更多个跨膜跨越结构域的膜结合蛋白。在一些实施方案中，属于一类膜结合蛋白的膜结合蛋白是包含六个或更多个跨膜跨越结构域的膜结合蛋白。在一些实施方案中，属于一类膜结合蛋白的膜结合蛋白是包含七个或更多个跨膜跨越结构域的膜结合蛋白。
[0230] 在一些实施方案中，属于一类膜结合蛋白的膜结合蛋白是包含构成功能性膜结合蛋白的特定数目的亚基的膜结合蛋白。
[0231] 在一些实施方案中，属于一类膜结合蛋白的膜结合蛋白是包含构成功能性膜结合蛋白的单个亚基的膜结合蛋白。
[0232] 在一些实施方案中，属于一类膜结合蛋白的膜结合蛋白是包含构成功能性膜结合蛋白的两个或更多个亚基的膜结合蛋白。
[0233] 在一些实施方案中，属于一类膜结合蛋白的膜结合蛋白是包含构成功能性膜结合蛋白的三个或更多个亚基的膜结合蛋白。在一些实施方案中，属于一类膜结合蛋白的膜结合蛋白是包含构成功能性膜结合蛋白的四个或更多个亚基的膜结合蛋白。在一些实施方案中，属于一类膜结合蛋白的膜结合蛋白是包含构成功能性膜结合蛋白的五个或更多个亚基的膜结合蛋白。在一些实施方案中，属于一类膜结合蛋白的膜结合蛋白是包含构成功能性膜结合蛋白的六个或更多个亚基的膜结合蛋白。在一些实施方案中，属于一类膜结合蛋白的膜结合蛋白是包含构成功能性膜结合蛋白的七个或更多个亚基的膜结合蛋白。在一些实施方案中，属于一类膜结合蛋白的膜结合蛋白是包含构成功能性膜结合蛋白的八个或更多个亚基的膜结合蛋白。
[0234] 在一些实施方案中，属于一类膜结合蛋白的膜结合蛋白是具有疏水性残基的单个TM延伸的膜结合蛋白，具有TM结构域的NH2-末端侧上的多肽部分暴露在膜的外侧以及COOH-末端部分暴露在细胞质侧，例如，I型膜结合蛋白。在一些实施方案中，膜结合蛋白被细分为Ia型(可切割的信号序列)和Ib型(不具有可切割的信号序列)。
[0235] 在一些实施方案中，属于一类膜结合蛋白的膜结合蛋白是具有疏水性残基的单个TM延伸的膜结合蛋白，具有TM结构域的COOH-末端侧上的多肽部分暴露在膜的外侧以及NH2-末端部分暴露在细胞质侧，例如，II型膜结合蛋白。
[0236] 在一些实施方案中，属于一类膜结合蛋白的膜结合蛋白是在单多肽链中具有多个跨膜结构域的膜结合蛋白，例如，III型膜结合蛋白。在一些实施方案中，膜结合蛋白被细分为a型和b型：IIIa型分子可具有可切割的信号序列，而IIIb型可使得它们的氨基末端暴露在膜的外表面上但不具有可切割的信号序列。
[0237] 在一些实施方案中，属于一类膜结合蛋白的膜结合蛋白是具有构成多次跨膜的组装体(assembly)的多个同源结构域的膜结合蛋白，例如，IV型膜结合蛋白。在一些实施方案中，结构域位于单个多肽链上。在一些实施方案中，结构域位于多于一个个体链上。
[0238] 在一些实施方案中，属于一类膜结合蛋白的膜结合蛋白是α-螺旋膜结合蛋白。在一些实施方案中，属于一类膜结合蛋白的膜结合蛋白是β-桶状膜结合蛋白。
[0239] 在一些实施方案中，属于一类膜结合蛋白的膜结合蛋白是光吸收驱动的转运体，例如，细菌视紫红质样蛋白，其包括视紫红质、细菌光合反应中心和光系统I和II以及来自细菌和叶绿体的捕光复合体。
[0240] 在一些实施方案中，属于一类膜结合蛋白的膜结合蛋白是氧化还原驱动的转运体，例如，跨膜细胞色素b样蛋白：辅酶Q-细胞色素c还原酶(细胞色素bc1)；细胞色素b6f复合体；甲酸脱氢酶、呼吸硝酸还原酶；琥珀酸-辅酶Q还原酶(延胡索酸还原酶)；以及琥珀酸脱氢酶；来自细菌和线粒体的细胞色素c氧化酶。
[0241] 在一些实施方案中，属于一类膜结合蛋白的膜结合蛋白是电化学电位驱动的转运体，例如，质子或钠转位F型和V型ATP酶。
[0242] 在一些实施方案中，属于一类膜结合蛋白的膜结合蛋白是P-P-键水解驱动的转运体，例如，P型钙ATP酶、钙ATP酶调节子受磷蛋白和肌脂蛋白(sarcolipin)。ABC转运体：BtuCD、多药转运体和钼酸盐吸收转运体以及一般分泌途径移位酶(translocases)。
[0243] 在一些实施方案中，属于一类膜结合蛋白的膜结合蛋白是运输体(porter)(单向运输体、同向运输体、逆向运输体)，例如，线粒体载体蛋白；主要易化子超家族(Major Facilitator Superfamily)(甘油-3-磷酸转运体、乳糖通透酶和多药转运体EmrD)；耐药节结化细胞分化超家族(resistance-nodulation-cell division)(多药外排转运体(multidrug efflux transporter)AcrB)；二羧酸/氨基酸：阳离子同向运输体(质子谷氨酸同向运输体)；单价阳离子/质子逆向运输体(钠/质子逆向运输体1NhaA)；神经递质钠同向运输体；氨转运体；以及药物/代谢物转运体(小多药耐药转运体EmrE)。
[0244] 在一些实施方案中，属于一类膜结合蛋白的膜结合蛋白是α-螺旋通道，包括离子通道，例如，电压门控离子通道(voltage-gated ion channel)等，包括钾通道KcsA和KvAP，以及内向整流性钾离子通道Kirbac(inward-rectifier potassium ion channel Kirbac)；大电导机械敏感性通道(large-conductance mechanosensitive channel)，MscL；小电导机械敏感性离子通道(small-conductance mechanosensitive ion channel)(MscS)；corA金属离子转运体；神经递质受体(乙酰胆碱受体)的配体门控离子通道；水通道蛋白；氯离子通道；以及来自细菌外膜的外膜辅助蛋白(多糖转运体)和α螺旋膜结合蛋白。
[0245] 在一些实施方案中，属于一类膜结合蛋白的膜结合蛋白是酶，例如，甲烷单加氧酶；菱形蛋白酶，以及二硫键形成蛋白(DsbA-DsbB复合体)。
[0246] 在一些实施方案中，属于一类膜结合蛋白的膜结合蛋白是具有α-螺旋跨膜锚状物的蛋白，例如，T细胞受体跨膜二聚化结构域、细胞色素c亚硝酸还原酶复合物、类固醇硫酸酯磺基水解酶(steryl-sulfate sulfohydrolase)、stannin、血型糖蛋白A二聚体、丝状病毒(丝状噬菌体)主要外壳蛋白、菌毛蛋白、肺表面活性物质相关蛋白、单胺氧化酶A和B、脂肪酸酰胺水解酶、细胞色素P450氧化酶、皮质类固醇11β-脱氢酶、信号肽肽酶、以及对stomatin同系物特异性的膜蛋白酶。
[0247] 在一些实施方案中，属于一类膜结合蛋白的膜结合蛋白是包含单个多肽链的β-桶状结构，例如，来自八个β链并具有10的剪切数目的β-桶状结构：ompA样跨膜结构域(OmpA)、毒性相关外膜蛋白家族(OmpX)、外膜蛋白W家族(OmpW)、抗微生物肽耐受性和脂质A酰化蛋白家族(PagP)、脂质A脱酰基酶PagL、以及不透光家族孔蛋白(opacity family porin)(NspA)；自转运蛋白结构域；fadL外膜蛋白转运家族，包括脂肪酸转运蛋白FadL；被称为三聚孔蛋白的一般细菌孔蛋白家族；麦芽糖孔蛋白(maltoporin)、或糖孔蛋白；核苷特异性孔蛋白；外膜磷脂酶A1；tonB依赖性受体和它们的插入域(plug domain)。它们是配体门控外膜通道；外膜蛋白OpcA家族；以及外膜蛋白G孔蛋白家族。
[0248] 在一些实施方案中，属于一类膜结合蛋白的膜结合蛋白是包含数个多肽链的β-桶状结构，例如，三聚体自转运蛋白，还被称为三聚体外膜因子的外膜外排蛋白包括TolC和多药耐药蛋白以及mspA孔蛋白和α溶血素。
[0249] 在一些实施方案中，属于一类膜结合蛋白的膜结合蛋白是完整的膜蛋白。在一些实施方案中，属于一类膜结合蛋白的膜结合蛋白是脂质连接蛋白。在一些实施方案中，属于一类膜结合蛋白的膜结合蛋白是外周膜蛋白。
[0250] 在一些实施方案中，属于一类膜结合蛋白的膜结合蛋白呈开放构象。在一些实施方案中，属于一类膜结合蛋白的膜结合蛋白呈封闭构象。
[0251] 在一些实施方案中，属于一类膜结合蛋白的膜结合蛋白是血浆膜结合蛋白。在一些实施方案中，属于一类膜结合蛋白的膜结合蛋白是核膜结合蛋白。在一些实施方案中，属于一类膜结合蛋白的膜结合蛋白是外核膜结合蛋白。在一些实施方案中，属于一类膜结合蛋白的膜结合蛋白是内核膜结合蛋白。在一些实施方案中，属于一类膜结合蛋白的膜结合蛋白是线粒体膜结合蛋白。在一些实施方案中，属于一类膜结合蛋白的膜结合蛋白是线粒体外膜结合蛋白。在一些实施方案中，属于一类膜结合蛋白的膜结合蛋白是线粒体内膜结合蛋白。在一些实施方案中，属于一类膜结合蛋白的膜结合蛋白是内质网膜结合蛋白。在一些实施方案中，属于一类膜结合蛋白的膜结合蛋白是高尔基复合体膜结合蛋白。在一些实施方案中，属于一类膜结合蛋白的膜结合蛋白是内体膜结合蛋白。在一些实施方案中，属于一类膜结合蛋白的膜结合蛋白是过氧化物酶体膜结合蛋白。在一些实施方案中，属于一类膜结合蛋白的膜结合蛋白是溶酶体膜结合蛋白。
[0252] 本发明还提供了包含多种膜结合蛋白特异性的多种膜结合蛋白抗体的文库，其中至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、99％或100％的膜结合蛋白在特定种类诸如以上描述的那些的任一种中。
[0253] 制备抗体的文库的方法
[0254] 本文还提供了制备抗体的文库的方法。在一个实施方案中，该方法包括(a)用表达或包含一种或更多种膜结合蛋白的病毒体或多个病毒体免疫动物；(b)从所述动物分离产生膜结合蛋白抗体的细胞；(c)从所述产生膜结合蛋白抗体的细胞分离一种或多种膜结合蛋白抗体；(d)用蛋白阵列(诸如人蛋白质组阵列或人膜结合蛋白质组阵列)筛选步骤(c)的一种或多种膜结合蛋白抗体；以及(e)选择能够对蛋白质组阵列上的单个靶是单特异性的膜结合蛋白抗体。在一个实施方案中，该方法还可包括在步骤(c)之前从产生膜结合蛋白抗体的细胞预筛选一种或多种膜结合蛋白抗体。
[0255] 动物可以是非人动物，诸如牛科动物、鸟类、犬科动物、马科动物、猫科动物、绵羊类动物、猪类动物或灵长类动物。动物可以是哺乳动物，诸如小鼠、大鼠、兔、猫、狗、猴或山羊。
[0256] 动物可用一种或多种膜结合蛋白来免疫，其中膜结合蛋白被包含在病毒体内，例如被包含在病毒体的包膜内。
[0257] 抗体的文库可包含多种抗体，其中多种抗体的至少一种或每种抗体可特异性结合多种膜结合蛋白。在一些实施方案中，多种抗体的至少约1％至100％可以是通过本文描述的任何方法制备或验证的抗体。在一些实施方案中，多种抗体的至少约1％至100％是通过除了本文描述的方法以外的方法制备的抗体。验证本文描述的任何抗体文库或多种抗体中的一种或更多种抗体、或至少约1％至100％的抗体的方法可包括通过选自包括以下的组的方法分析一种或更多种抗体：免疫沉淀(IP)、免疫组织化学(IHC)、蛋白印迹(WB)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫荧光(IF)、免疫细胞化学(ICC)、siRNA敲低或其任何组合。
[0258] 在一些实施方案，多种抗体中的至少一种或每种抗体可以是单特异性的。在一些实施方案，多种抗体中的至少约1％至100％可以是单特异性的。文库中的至少一种抗体可以是单特异性的。文库中的至少约1％的抗体可以是单特异性的。例如，文库中至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、
19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、
90％、95％或100％的抗体可以是单特异性的。在一个实施方案，抗体文库或多种抗体中的至少一种或每种抗体可以是单特异性的。阵列中至少约一种抗体可以是单特异性的。例如，阵列中至少约2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种、13种、14种、15种、16种、17种、18种、19种、20种、25种、30种、35种、40种、45种、50种、75种、100种、125种、150种、
175种、200种、225种、250种、275种、300种、325种、350种、375种、400种、425种、450种、475种、500种、525种、550种、575种、600种、625种、650种、675种、700种、725种、750种、775种、
800种、825种、850种、875种、900种、1,000种、2,000种、3,000种、4,000种、5,000种、5,500种、5,600种或更多种抗体可以是单特异性的。
19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、
90％、95％或100％的抗体可以是单特异性的。在一个实施方案，抗体文库或多种抗体中的至少一种或每种抗体可以是单特异性的。阵列中至少约一种抗体可以是单特异性的。例如，阵列中至少约2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种、13种、14种、15种、16种、17种、18种、19种、20种、25种、30种、35种、40种、45种、50种、75种、100种、125种、150种、
175种、200种、225种、250种、275种、300种、325种、350种、375种、400种、425种、450种、475种、500种、525种、550种、575种、600种、625种、650种、675种、700种、725种、750种、775种、
800种、825种、850种、875种、900种、1,000种、2,000种、3,000种、4,000种、5,000种、5,500种、5,600种或更多种抗体可以是单特异性的。
[0259] 在一些实施方案中，多种抗体中的至少一种或每种抗体具有对膜结合蛋白的至少约10-7M(KD)的结合亲和力。在一些实施方案中，多种抗体的至少约1％至100％具有对膜结合蛋白的至少约10-7M(KD)的结合亲和力。文库中至少约一种抗体可具有对其靶的至少约10-7M(KD)，诸如至少约10-8M、10-9M、10-10M、10-11M、10-12M、10-13M、10-14M、10-15M或10-16M的结合亲和力。文库中至少约1％的抗体可以是单特异性的并且文库中至少约一种抗体可具有至少约10-7M(KD)的结合亲和力。例如，文库中至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、
9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、
40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的抗体可以-8 -9 -10 -11 -
是单特异性的，并且文库中至少约一种抗体可具有至少约10 M、10 M、10 M、10 M、10
12M、10-13M、10-14M、10-15M或10-16M的结合亲和力。
9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、
40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的抗体可以-8 -9 -10 -11 -
是单特异性的，并且文库中至少约一种抗体可具有至少约10 M、10 M、10 M、10 M、10
12M、10-13M、10-14M、10-15M或10-16M的结合亲和力。
[0260] 多种抗体可包含至少约50种不同的抗体。例如，多种抗体可包含至少约100种、200种、300种、400种、500种、600种、700种、800种、900种、1,000种、2,000种、3,000种、4,000种、5,000种、5,500种、5,600种或更多种不同的抗体。例如，抗体的文库可包括至少约75种、100种、125种、150种、175种、200种、225种、250种、275种、300种、325种、350种、375种、400种、
425种、450种、475种、500种、525种、550种、575种、600种、625种、650种、675种、700种、725种、750种、775种、800种、825种、850种、875种、900种、或1000种抗体。
425种、450种、475种、500种、525种、550种、575种、600种、625种、650种、675种、700种、725种、750种、775种、800种、825种、850种、875种、900种、或1000种抗体。
[0261] 在一些实施方案中，抗体的文库可包含至少约2个相同的一种或更多种抗体。例如，抗体的文库可包含至少约3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、75个、100个、125个、150个、175个、200个、225个、250个、275个、300个、325个、350个、375个、400个、425个、450个、475个、500个、525个、550个、575个、600个、625个、650个、675个、700个、725个、750个、775个、800个、825个、850个、875个、900个或1000个相同的一种或更多种抗体。
[0262] 病毒体的文库包含一种或更多种膜结合蛋白。例如，病毒体的文库可包括至少约100种具有跨膜结构域的膜蛋白，诸如至少约200种、300种、400种、500种、600种、700种、800种、900种、1,000种、2,000种、3,000种、4,000种、5,000种、5,500种、5,600种或更多种具有跨膜结构域的不同的膜蛋白。病毒体的文库可代表至少约0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、
6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、
30％、35％、40％、45％、50％、或60％的生物体的蛋白质组。病毒体的文库可代表至少约
0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、
17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、或60％、70％、80％、90％或
100％的生物体的膜结合蛋白质组。病毒体的文库可包含代表生物体的膜结合蛋白质组的大部分或整个生物体的膜结合蛋白质组的多种膜结合蛋白，所述生物体的膜结合蛋白质组诸如细菌、病毒或真菌蛋白质组。病毒体的文库可包含代表昆虫或哺乳动物诸如小鼠、大鼠、兔、猫、狗、猴、山羊或人的蛋白质组的大部分或整个蛋白质组的多种膜结合蛋白。包含或表达多种膜结合蛋白的病毒体文库还可包括融合蛋白文库，所述融合蛋白文库代表呈未纯化的形式的生物体的膜结合蛋白质组(诸如过表达生物体的膜结合蛋白质组的病毒体的集合)。
6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、
30％、35％、40％、45％、50％、或60％的生物体的蛋白质组。病毒体的文库可代表至少约
0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、
17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、或60％、70％、80％、90％或
100％的生物体的膜结合蛋白质组。病毒体的文库可包含代表生物体的膜结合蛋白质组的大部分或整个生物体的膜结合蛋白质组的多种膜结合蛋白，所述生物体的膜结合蛋白质组诸如细菌、病毒或真菌蛋白质组。病毒体的文库可包含代表昆虫或哺乳动物诸如小鼠、大鼠、兔、猫、狗、猴、山羊或人的蛋白质组的大部分或整个蛋白质组的多种膜结合蛋白。包含或表达多种膜结合蛋白的病毒体文库还可包括融合蛋白文库，所述融合蛋白文库代表呈未纯化的形式的生物体的膜结合蛋白质组(诸如过表达生物体的膜结合蛋白质组的病毒体的集合)。
[0263] 来自动物的产生膜结合蛋白抗体的细胞可以是淋巴样细胞，诸如B细胞。产生膜结合蛋白抗体的细胞可用于制备杂交瘤，例如，融合至永生化细胞诸如骨髓瘤细胞，以制备杂交瘤。
[0264] 在一个实施方案中，可进行预筛选步骤，其中在从产生膜结合蛋白抗体的细胞分离多种膜结合蛋白抗体之前，从产生膜结合蛋白抗体的细胞筛选多种膜结合蛋白抗体。预筛选可通过如下进行：使用产生膜结合蛋白抗体的细胞的血清或上清液，确定来自产生膜结合蛋白抗体的细胞的膜结合蛋白抗体与包含一种或更多种靶膜结合蛋白，诸如天然膜结合蛋白的混合物的结合。预筛选可使用免疫组织化学、免疫细胞化学、ELISA、层析法或本领域已知确定结合的任何其他适合的方法来进行。预筛选可用于选择产生膜结合蛋白抗体的细胞(其可包括已被融合至永生化细胞的分泌膜结合蛋白抗体的细胞，诸如杂交瘤)，用于诸如通过如本文描述的蛋白质组阵列或膜结合蛋白质组阵列的进一步筛选。
[0265] 来自产生膜结合蛋白抗体的细胞的多种膜结合蛋白抗体在经历用生物体的整个或部分蛋白质组或膜结合蛋白质组的进行筛选之前，在具有或不有先前的预筛选步骤的情况下被分离。例如，分离的膜结合蛋白抗体可用至少约0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、
35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的生物体的蛋白质组来筛选。例如，分离的膜结合蛋白抗体可用至少约0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、
11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、
50％、60％、70％、80％、90％或100％的生物体的膜结合蛋白质组来筛选。例如，分离的抗体可用生物体的至少约11,000种、12,000种、13,000种、14,000种、15,000种、16,000种、17,
000种、18,000种、19,000种或20,000种蛋白来筛选。例如，分离的抗体可用生物体的至少约
100种、200种、300种、400种、500种、600种、700种、800种、900种、1,000种、2,000种、3,000种、4,000种、5,000种、5,500种、或5,600种膜结合蛋白来筛选。蛋白质组或膜结合蛋白质组可以是细菌、病毒、真菌蛋白质组。蛋白质组或膜结合蛋白质组可以是昆虫或哺乳动物，诸如小鼠、大鼠、兔、猫、狗、猴、山羊或人的。在一些实施方案中，蛋白质组或膜结合蛋白质组可以是人的。
35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的生物体的蛋白质组来筛选。例如，分离的膜结合蛋白抗体可用至少约0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、
11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、
50％、60％、70％、80％、90％或100％的生物体的膜结合蛋白质组来筛选。例如，分离的抗体可用生物体的至少约11,000种、12,000种、13,000种、14,000种、15,000种、16,000种、17,
000种、18,000种、19,000种或20,000种蛋白来筛选。例如，分离的抗体可用生物体的至少约
100种、200种、300种、400种、500种、600种、700种、800种、900种、1,000种、2,000种、3,000种、4,000种、5,000种、5,500种、或5,600种膜结合蛋白来筛选。蛋白质组或膜结合蛋白质组可以是细菌、病毒、真菌蛋白质组。蛋白质组或膜结合蛋白质组可以是昆虫或哺乳动物，诸如小鼠、大鼠、兔、猫、狗、猴、山羊或人的。在一些实施方案中，蛋白质组或膜结合蛋白质组可以是人的。
[0266] 例如，分离的膜结合蛋白抗体可用至少约0.5％的人蛋白质组来筛选。在一个实施方案中，分离的抗体可用至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、
60％、70％、80％、90％或100％的人蛋白质组来筛选。例如，分离的膜结合蛋白抗体可用至少约0.5％的人膜结合蛋白质组来筛选。在一个实施方案中，分离的抗体可用至少约1％、
2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、
19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的人膜结合蛋白质组来筛选。用于筛选膜结合蛋白抗体的蛋白质组、膜结合蛋白质组或其部分可存在于阵列上。
60％、70％、80％、90％或100％的人蛋白质组来筛选。例如，分离的膜结合蛋白抗体可用至少约0.5％的人膜结合蛋白质组来筛选。在一个实施方案中，分离的抗体可用至少约1％、
2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、
19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的人膜结合蛋白质组来筛选。用于筛选膜结合蛋白抗体的蛋白质组、膜结合蛋白质组或其部分可存在于阵列上。
[0267] 在筛选之后，膜结合蛋白抗体可基于其结合谱来筛选。例如，如果膜结合蛋白抗体结合至蛋白质组或膜结合蛋白质组的单个靶，诸如人蛋白质组阵列的单个靶，那么则可以选择该膜结合蛋白抗体用于本文描述的文库。
[0268] 该方法可用于进行膜结合蛋白抗体的高通量制备。例如，免疫小鼠的病毒体可以以高通量的方式来产生。这可通过以下来进行：1)包含来自基因表达文库的异源膜结合蛋白的病毒体的经指导的产生，其中感兴趣的膜结合蛋白可在病毒体中根据需要来表达。包含用于注射的膜结合蛋白的病毒体可包括亚细胞组分，诸如细胞和细胞内膜、细胞器、颗粒或蛋白复合物，并且可使用差速离心或其他熟知的方法来制备。用脂质双层中的膜结合蛋白的复杂混合物的此类免疫接种可最终产生针对最高度免疫原性膜结合蛋白的膜结合蛋白抗体；在这种情况下，病毒体来源可使用先前分离的抗体被免疫耗竭以去除任何特定抗原性膜结合蛋白。另外，呈它们的天然或变性状态的膜蛋白可通过尺寸排阻、离子交换、疏水性层析或亲和层析进行层析或通过使用单独收集的小部分以用数十种至数百种而不是数千种膜结合蛋白免疫。靶向特定种类的膜结合蛋白的特定技术可被使用。例如，包含参与SNO信号传导的膜结合蛋白的病毒体可通过固定化金属亲和层析(IMAC)来纯化，并且包含膜结合蛋白的不含洗脱的金属的病毒体然后可用作用于免疫的抗原，或包含跨膜磷蛋白的病毒体可与TiO2亲和基质结合并从而被大大地富集。从活的或固定的病毒体直接分离或获得的天然蛋白可以是优选的免疫原的来源。
[0269] 高通量方法还可包括短的时间尺度的免疫以产生分泌膜结合蛋白抗体的淋巴样细胞。例如，动物可用包含多种膜结合蛋白的多个病毒体和佐剂制品通过后足垫的方式来免疫。腘窝淋巴结从免疫后7至21天来收集。经免疫的动物中的淋巴结通过用伊文思蓝在足垫处的注射来直接揭示。
[0270] 高通量方法还可包括在融合标签耐受的小鼠中产生膜结合蛋白抗体。由于许多膜结合蛋白被表达为加标签的融合物，表达融合标签的小鼠品系(活跃地表达融合标签的小鼠)可用于增加针对融合膜结合蛋白的非融合标签组分的特定膜结合蛋白抗体的产量并消除抗融合标签抗体的产生。
[0271] 用于制备膜结合蛋白抗体的高通量方法还可包括产生细胞融合物/杂交瘤用于膜结合蛋白抗体的产生。致敏淋巴样细胞和骨髓瘤细胞被融合，且融合产物被平铺于包含识别期望亚类的免疫球蛋白分子的加荧光标签的膜结合蛋白抗体的半固体培养基(甲基纤维素)上，或平铺进包含加荧光标签的病毒体的半固体培养基中，所述加荧光标签的病毒体包含将标记分泌期望的膜结合蛋白抗体的集落的异源膜结合蛋白。还可使用以上方法的组合。使用倒置荧光显微镜与使用Drummond微毛细管和Drummond WireTrol设备的手工挑选的组合，将荧光标记的集落从半固体培养基获救至液体培养基，随后是个体克隆的长出。
[0272] 任何适合的方法可用于制备本文公开的抗体。例如，包含异源膜结合蛋白或多种异源膜结合蛋白的病毒体可诸如通过本领域已知的任何重组方法体外制备。病毒体组合物还可包含适合的载体或稀释剂，并且可在允许产生抗体的条件下被施用至动物。对于增强动物产生抗体的能力而言，完全或不完全弗氏佐剂还可被施用。病毒体组合物可一天一次或一周一次或更多次，诸如一周一次、一周两次、一周三次、一周四次、一周五次、一周六次或一周七次，或每2至4周一次，诸如每2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周或更久一次被施用。病毒体组合物可被施用一次，或总计约2次至约10次。病毒体组合物可被施用2次、3次、4次、
5次、6次、7次、8次、9次、10次或更多次。施用可通过本领域已知的任何方法，诸如但不限于皮下、腹膜内、静脉、经由足垫等施用。
5次、6次、7次、8次、9次、10次或更多次。施用可通过本领域已知的任何方法，诸如但不限于皮下、腹膜内、静脉、经由足垫等施用。
[0273] 对于制备产生单克隆抗体的细胞，其抗体滴度已被证实的个体动物可被选择，并且在最终免疫之后，诸如在从2至5天之后，它的脾或淋巴结可被收获，并且其中包含的产生抗体的细胞可与骨髓瘤细胞融合以制备产生期望的单克隆抗体的杂交瘤。
[0274] 杂交瘤可通过融合两种类型的细胞，例如，免疫B细胞和培养稳定的骨髓瘤细胞系来产生。这可在促融合化合物诸如PEG的存在下进行。期望的杂交细胞产物可通过利用嘧啶/嘌呤从头合成和补救合成通路的两个代谢途径的存在从未融合的细胞中选择。由于常用的骨髓瘤细胞系已针对对8-氮杂鸟嘌呤或6-硫代鸟嘌呤的耐受性被选择，它们缺乏补救途径，并因此缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)。然而，在缺乏用于生存的补救途径的情况下，这些细胞需要从头合成途径，但其可用氨基蝶呤来阻断。B细胞骨髓瘤杂交体可在氨基蝶呤的存在下生长，因为免疫B细胞提供支持补救的次黄嘌呤(H)和胸苷(T)的过程的野生型酶HPRT。融合反应可因此被平铺在HAT培养基中，以消除未融合的免疫细胞和骨髓瘤细胞，但可容许杂交瘤长出。最有用的骨髓瘤细胞系是诸如X63-Ag8.653、NSW和Sp2/0-Ag-14的那些，其不分泌将污染由B细胞贡献的产物的其自身免疫球蛋白重链或轻链。骨髓瘤细胞的实例包括但不限于NS-1、P3U1、SP2/0、AP-1等细胞。细胞融合可根据已知方法来进行。
[0275] 抗血清中的抗体滴度的测量可例如通过使标记的蛋白和抗血清反应并然后测量结合至抗体的标记试剂的活性来进行。待使用的抗体产生细胞(脾细胞)的数目与骨髓瘤细胞的数目的比例可通过本领域已知的方法被优化并进行。待使用的抗体产生细胞(脾细胞)的数目与骨髓瘤细胞的数目的比例可以为约1:1至约20:1，例如可使用约2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1或20:1的比。PEG，诸如PEG 1000-PEG 6000可以以约10％至约80％，例如10％、15％、20％、25％、
30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或80％的浓度被添加。细胞融合可通过将两种细胞的混合物在约20℃至约40℃，诸如约30℃至约37℃孵育约1分钟至10分钟来有效地进行。例如，两种细胞的混合物可在约20℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、
26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃或40℃孵育约1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10分钟。
30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或80％的浓度被添加。细胞融合可通过将两种细胞的混合物在约20℃至约40℃，诸如约30℃至约37℃孵育约1分钟至10分钟来有效地进行。例如，两种细胞的混合物可在约20℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、
26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃或40℃孵育约1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10分钟。
[0276] 如本领域已知的，多种方法可用于筛选产生针对异源蛋白例如病毒体的异源膜结合蛋白的抗体的杂交瘤。例如，杂交瘤的上清液可被添加至抗体可直接地或连同载体一起被吸附至其的固相(例如，微板)，且然后可添加用放射性物质或酶标记的抗免疫球蛋白抗体(例如，如果小鼠细胞在细胞融合中被使用，则抗小鼠免疫球蛋白抗体可被使用)或蛋白A或蛋白G，以检测针对结合至固相的病毒体的膜结合蛋白的单克隆抗体。可选地，杂交瘤的上清液可被添加至抗免疫球蛋白抗体或蛋白A可被吸附至其的固相，且然后可添加用放射性物质或酶标记的蛋白，以检测针对结合至固相的病毒体的膜结合蛋白的单克隆抗体。
[0277] 单克隆抗体的选择可根据任何已知的方法或其修改形式来进行。可采用添加HAT(次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷)的动物细胞的培养基。只要杂交瘤能够生长，可采用任何选择和生长培养基。例如，包含约1％至20％，诸如1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％胎牛血清(fetal bovine serum)或胎牛血清(fetal calf serum)的RPMI 1640培养基或GIT培养基、用于培养杂交瘤的无血清培养基(SFM-101,Nisei Seiyaku)等可被使用。培养可在约1-10％CO2气体，诸如约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％CO2气体下在20℃至40℃，诸如约20℃、
20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃或40℃持续约5天至3周，诸如约5天、6天、1周、2周或三周来进行。
杂交瘤培养物的上清液的抗体滴度可根据与以上关于抗血清中抗蛋白的抗体滴度描述的相同方式来测量。
20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃或40℃持续约5天至3周，诸如约5天、6天、1周、2周或三周来进行。
杂交瘤培养物的上清液的抗体滴度可根据与以上关于抗血清中抗蛋白的抗体滴度描述的相同方式来测量。
[0278] 生物标志物的单克隆抗体的分离和纯化可根据与常规多克隆抗体的分离和纯化诸如免疫球蛋白的分离和纯化相同的方式来进行，((例如，盐析、醇沉淀、等电点沉淀、电泳、通过离子交换的吸附和解吸附)(例如，DEAE))、超离心、凝胶过滤或特定的纯化方法，其中抗体可与活性吸附剂诸如结合抗原的固相、蛋白A或蛋白G一起被收集，并使结合解离以获得抗体。
[0279] 多克隆抗体可通过任何已知的方法或这些方法的修改形式来制备。例如，可制备包含生物标志物和载体蛋白的生物标志物组合物且动物可通过如描述的病毒体组合物被免疫。包含针对病毒体的膜结合蛋白的抗体的材料可从经免疫的动物中回收且抗体可以被分离并纯化。
[0280] 对于在高通量方法中使用本文描述的病毒体产生的单克隆膜结合蛋白抗体，负责性膜结合蛋白抗原可通过蛋白微阵列解卷积来鉴定。可进行单步解卷积。
[0281] 例如，包含多种膜结合蛋白的多种病毒体被用于制备杂交瘤，二维汇集策略可用于揭示至少一种或每种单克隆膜结合蛋白抗体将识别的膜结合蛋白抗原的身份。杂交瘤的上清液以二维网格排列并以3×3至100×100集合尺寸在水平方向和垂直方向汇集。还可进行三维汇集策略，其中杂交瘤被排列在板组中以产生呈3×3×3至100×100×100格式的板集合以及水平集合和垂直集合。所得集合单独地与蛋白微阵列杂交，并使用微阵列分析软件评分。在二维和三维设计中的每个水平和垂直对共有的阳性结果(击中)或在板、水平和垂直集合(称为三重形式(trio))的3路交叉点处共有的阳性结果(击中)分别被鉴定为被在相同的对或三重形式的交叉点处的单克隆膜结合蛋白抗体识别的膜结合蛋白抗原。当需要时，鉴定的膜结合蛋白抗原通过用相应的膜结合蛋白抗体探测微阵列进行验证。汇集策略可减少表征或制备膜结合蛋白抗体的成本，因为该阵列的成本可能是高的，并使用例如10×10集合将分析100个克隆需要的阵列的数目从100减少至20；对于20X 20集合，它将需要的阵列的数目从400减少至40。3维集合，例如，可筛选4096个杂交瘤的集合，同时16×16×16的3-D策略仅需要48个阵列。使用10×10的策略，可使用820个阵列。
[0282] 在高通量方法中产生的单克隆膜结合蛋白抗体的表征可使用整个蛋白质组微阵列或整个膜结合蛋白质组微阵列来进行。微阵列可用于确定给定的单克隆膜结合蛋白抗体结合至其的特定膜结合蛋白抗原。关于单克隆膜结合蛋白抗体亲和力、与其他抗原或膜结合蛋白抗原的潜在的交叉反应性或缺乏与其他抗原或膜结合蛋白抗原的交叉反应性的关键质量信息都通过阵列来提供。
[0283] 在高通量方法中产生的单克隆膜结合蛋白抗体可来自融合克隆。单克隆膜结合蛋白抗体以期望的量在体外或体内产生。这些可使用多种良好建立的方法进行纯化。
[0284] 基于使用蛋白微阵列的单克隆膜结合蛋白抗体的表征，高质量(例如，高亲和力和低的交叉反应性)的单克隆膜结合蛋白抗体可被选择和用于制备抗体阵列。膜结合蛋白抗体被选择且它们的浓度标准化为类似的滴度。可使用微阵列机器人(例如，Nan print,Array It,Inc.)将它们以多孔形式(例如96孔、384孔或1562孔)，与合适的阳性(例如，稀释的人IgG)和阴性(例如，人Gimp和BSA)对照一起排列以制造抗体微阵列。单克隆膜结合蛋白抗体在不同微阵列配置中的布置可被定制以促进全蛋白质组学范围的研究或全膜结合蛋白质组学范围的研究。
[0285] 使用膜蛋白抗体的文库的方法
[0286] 本文还提供了鉴定针对膜结合蛋白靶的膜结合蛋白抗体的方法，所述方法包括使包含膜结合蛋白靶的病毒体与抗体的文库接触，确定病毒体中的膜结合蛋白靶与多种膜结合蛋白抗体之间的结合；以及当病毒体的膜结合蛋白与文库的膜结合蛋白抗体结合时，鉴定针对病毒体的膜结合蛋白的膜结合蛋白抗体。还提供了鉴定膜结合蛋白靶的方法，所述方法包括使包含膜结合蛋白靶的病毒体与膜结合蛋白抗体的文库接触，确定病毒体的膜结合蛋白靶与多种膜结合蛋白抗体之间的结合；以及当病毒体的膜结合蛋白靶与文库的膜结合蛋白抗体结合时，鉴定膜结合蛋白靶。膜结合蛋白抗体的文库可被附连至基材，使得膜结合蛋白靶可与包含膜结合蛋白抗体的文库的阵列接触。
[0287] 文库可包含诸如以上描述的多种不同的膜结合蛋白抗体。例如，膜结合蛋白抗体的文库可包含通过相同的平台制备的膜结合蛋白抗体。文库可包含多种不同的膜结合蛋白抗体，其中在所述多种或所述多种的子集(诸如所述多种的至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％)内，膜结合蛋白抗体通过相同的平台制备，是单特异性的，结合其靶膜结合蛋白的天然形式；是免疫沉淀膜结合蛋白抗体；是IgG膜结合蛋白抗体(例如，IgG同种型的膜结合蛋白抗体)；具有对其膜结合蛋白靶的结合亲和力，所述结合亲和力可类似于所述多种膜结合蛋白抗体的另一种膜结合蛋白抗体的结合亲和力(例如，在至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、
14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％以内)；至少一种或每种膜结合蛋白抗体具有对其膜结合蛋白靶的至少约10-7M(KD)(例如，诸如至少约10-8M、10-9M、10-10M、10-11M、10-12M、10-
13M、10-14M、10-15M或10-16M)的结合亲和力；或其任何组合。文库可包含至少约50种、75种、100种、125种、150种、175种、200种、225种、250种、275种、300种、325种、350种、375种、400种、
425种、450种、475种、500种、525种、550种、575种、600种、625种、650种、675种、700种、725种、750种、775种、800种、825种、850种、875种、900种或1000种不同的单克隆膜结合蛋白抗体，结合至少约0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、
14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、
80％、90％或100％的生物体的蛋白质组(例如，人蛋白质组)，结合至少约0.5％、1％、2％、
3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、
19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的生物体的膜结合蛋白质组，或其任何组合。
14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％以内)；至少一种或每种膜结合蛋白抗体具有对其膜结合蛋白靶的至少约10-7M(KD)(例如，诸如至少约10-8M、10-9M、10-10M、10-11M、10-12M、10-
13M、10-14M、10-15M或10-16M)的结合亲和力；或其任何组合。文库可包含至少约50种、75种、100种、125种、150种、175种、200种、225种、250种、275种、300种、325种、350种、375种、400种、
425种、450种、475种、500种、525种、550种、575种、600种、625种、650种、675种、700种、725种、750种、775种、800种、825种、850种、875种、900种或1000种不同的单克隆膜结合蛋白抗体，结合至少约0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、
14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、
80％、90％或100％的生物体的蛋白质组(例如，人蛋白质组)，结合至少约0.5％、1％、2％、
3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、
19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的生物体的膜结合蛋白质组，或其任何组合。
[0288] 本文还提供了鉴定对膜结合蛋白，诸如人膜结合蛋白单特异性的膜结合蛋白抗体的方法，所述方法包括：使多种膜结合蛋白抗体与蛋白质组阵列或膜结合蛋白质组阵列，诸如人蛋白质组阵列或人膜结合蛋白质组阵列接触；确定多种膜结合蛋白抗体与存在于蛋白质组阵列上的靶之间的结合；以及鉴定膜结合蛋白抗体为单特异性的。阵列可包含多种蛋白，所述多种蛋白包含至少约0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、
60％、70％、80％、90％或100％的生物体的蛋白质组。例如，蛋白质组阵列可包含生物体的至少约11,000种、12,000种、13,000种、14,000种、15,000种、16,000种、17,000种、18,000种、19,000种或20,000种蛋白。阵列可包含多种膜结合蛋白抗原或膜结合蛋白，所述多种膜结合蛋白抗原或膜结合蛋白包含至少约0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、
10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、
45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的生物体的膜结合蛋白质组。例如，蛋白质组阵列可包含生物体的至少约200种、300种、400种、500种、600种、700种、800种、900种、1,000种、2,000种、3,000种、4,000种、5,000种、5,500种或5,600种膜结合蛋白。生物体可以是细菌、病毒或真菌。生物体可以是昆虫或哺乳动物，诸如小鼠、大鼠、兔、猫、狗、猴、山羊或人。
例如，蛋白质组可包含至少约0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、
12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、
60％、70％、80％、90％或100％的人蛋白质组。例如，膜结合蛋白质组可包含至少约0.5％、
1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、
18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的人膜结合蛋白质组。
60％、70％、80％、90％或100％的生物体的蛋白质组。例如，蛋白质组阵列可包含生物体的至少约11,000种、12,000种、13,000种、14,000种、15,000种、16,000种、17,000种、18,000种、19,000种或20,000种蛋白。阵列可包含多种膜结合蛋白抗原或膜结合蛋白，所述多种膜结合蛋白抗原或膜结合蛋白包含至少约0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、
10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、
45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的生物体的膜结合蛋白质组。例如，蛋白质组阵列可包含生物体的至少约200种、300种、400种、500种、600种、700种、800种、900种、1,000种、2,000种、3,000种、4,000种、5,000种、5,500种或5,600种膜结合蛋白。生物体可以是细菌、病毒或真菌。生物体可以是昆虫或哺乳动物，诸如小鼠、大鼠、兔、猫、狗、猴、山羊或人。
例如，蛋白质组可包含至少约0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、
12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、
60％、70％、80％、90％或100％的人蛋白质组。例如，膜结合蛋白质组可包含至少约0.5％、
1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、
18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的人膜结合蛋白质组。
[0289] 结合可通过本领域已知的技术(例如，放射免疫测定、ELISA(酶联免疫吸附测定)、“夹心”免疫测定、免疫放射测定、凝胶扩散沉淀反应、免疫扩散测定、原位免疫测定(例如，使用胶体金、酶或放射性同位素标记物，例如)、蛋白印迹、沉淀反应、凝集测定(例如，凝胶凝集测定、血凝测定等)、补体固定测定、免疫荧光测定、蛋白A测定以及免疫电泳测定来检测。
[0290] 抗体结合可通过检测一抗的标记物来检测。可选地，一抗可通过检测二抗或试剂与一抗的结合来检测。例如，二抗可被标记。在一些实施方案中，可利用自动检测测定或高通量系统。例如，在捕获微酶联免疫吸附测定(ELISA)中，可通过抗体的固定和随后的直接或间接的比色、荧光、发光或放射性检测结合的、标记的抗原来使得抗体/抗原反应是可测量的。例如，抗原可通过将允许下游检测的生物素或其他标记物被标记。
[0291] 固定的膜结合蛋白抗体通常将结合至展示的单个抗原决定簇。抗原决定簇可诸如通过标记构成抗原决定簇的生物标志物被标记。该反应的特异性将允许在ELISA测量中的定量。ELISA反应可以以高通量格式被使用以经由以下步骤筛选所有杂交瘤上清液。可部署基于除了ELISA以外的原理的筛选测定(例如，抗体微阵列、基于MALDI/MS和/或多通道毛细管电泳的高通量筛选)。ELISA或微阵列数据例如，通过公开的方法来评价。数据分析过程中的目标可以是选择显示具有重要临床参数的最佳集合并对一个分析物组特异性的杂交瘤上清液。
[0292] 微阵列的使用
[0293] 本发明的微阵列可用于医学诊断、药物发现、分子生物学、免疫学和毒理学。
[0294] 根据本发明制备的固定的抗体或病毒体的微阵列可用于多种诊断和筛选应用中的大规模结合测定。在大量靶(例如膜结合蛋白)水平的定量变化的多重测量允许识别由几个至许多不同的靶(例如，膜结合的蛋白质)定义的模式。人们可同时评价许多生理参数和疾病特异性模式。
[0295] 固定的病毒体的阵列还可用于鉴定受体蛋白(诸如GPCR、通道、受体酪氨酸激酶和转运体)的配体，例如，肽、脂质、脂肪酸、小分子等。荧光染料和/或放射性同位素可用于标记这些配体，用于检测配体的结合活性和特异性。特异性识别这些配体的抗体也可用作检测试剂，以确定在固定的病毒体的阵列上的配体-受体结合活性。与受体分子例如荧光染料(例如，Fluo8、DiBAC4和ANG-2)偶联，固定的病毒体的阵列还可用于筛选针对膜蛋白，例如，通道蛋白的药物。例如，至少一种或每种展示特定的人离子通道的多种病毒体可被排列在96孔、384孔、1536孔格式的盘中，使得能够同时针对多种(例如，2-200种)通道蛋白来测定一种药物。例如，已知的配体可在固定的病毒体的阵列上预孵育，随后是抗体结合测定。以这种方式，由于与其配体结合，特异性识别膜蛋白的特定构象的抗体可容易地被鉴定。
[0296] 固定的病毒体的阵列还可用于筛选能够特异性识别膜结合蛋白的胞外域的抗体。例如，通过用重组病毒体免疫小鼠产生的单克隆抗体可在固定的病毒体的阵列上孵育，随后是用标记的二抗的检测步骤。
[0297] 固定的病毒体的阵列还可用于筛选能够特异性识别膜结合蛋白的细胞内结构域或与其相互作用的抗体、配体和结合伴侣。例如，通过用重组病毒体免疫小鼠产生的单克隆抗体可在固定的病毒体的阵列上孵育(其中病毒体展示一个或更多个异源膜结合蛋白细胞内结构域)，随后是用标记的二抗的检测步骤。例如，给定的呈N外-C内拓扑结构的多次通过的膜结合蛋白可被工程化，以从其细胞质环去除正电荷，且一个或更多个带正电荷的残基(例如，赖氨酸和精氨酸)可被添加至其N-末端环区，所述N-末端环区通常展示在细胞的外部。例如，当此类示例性工程化的多次通过的膜结合蛋白在ER中翻译时，带正电荷的N-末端环将被保持面向细胞溶质，产生N内-C外拓扑结构。因此，工程化的多次通过的蛋白的胞质区(endodomain)可展示在病毒体的外部。
[0298] 一个实施方案涉及存在于生物样品中的膜结合蛋白的分离、鉴定和表征。例如，通过将疾病样品和对照样品进行比较，鉴定“疾病特异性膜结合蛋白”可以是可能的。这些膜结合蛋白可用作用于药物开发的靶或作为疾病的分子标志物。
[0299] 抗体阵列可用于监测样品中膜结合蛋白的表达水平，其中此类样品可包括感兴趣的组织的活组织检查样品，培养的细胞，微生物细胞群，生物流体，包括血液、血浆、淋巴液、滑液、脑脊液、细胞裂解物、培养物上清液、羊水等等及其衍生物。特别感兴趣的是生物流体的临床样品，包括血液及其衍生物、脑脊液、尿液、唾液、淋巴液、滑液等等。此类测量可以是定量的、半定量的或定性的。当该测定为定量的或半定量的时，它将优选地包括例如标记的样品和未标记的样品之间，或被不同地标记的样品之间的竞争型格式。
[0300] 检测针对固定的跨膜多肽的靶分子的存在的测定可如下进行，然而该方法不必限于本文列出的那些并包括本领域已知的任何适合的方法。
[0301] 样品、或其部分或等分试样被添加至包含抗体的微阵列。样品可包括如以上描述的多种生物流体或提取物。优选地，包含已知浓度的对照配体的一系列的标准品可与样品或其等分试样并行测定，以用作对照。孵育时间应足够靶分子与多肽结合。通常，从约0.1至3小时，通常1小时，但可以长至一天或更长。
[0302] 在孵育之后，通常可洗涤不溶性支撑物的未结合的组分。通常，适合的pH通常7-8的pH的稀释的非离子去垢剂介质可被用作洗涤介质。可采用用足够体积的从一至六次洗涤，以彻底洗涤存在于样品中的非特异性结合的蛋白。
[0303] 为了检测结合的靶的存在，可以使用多种方法。这些方法可分为三个一般类别。靶本身可用可检测的标记物来标记，且结合的标记物的量被直接测量。可选地，标记的样品可与竞争测定中的不同地标记的或未标记的样品混合。在又另一个实施方案中，样品本身可不被标记，但第二阶段标记的试剂可被添加以定量存在的配体的量。
[0304] 允许直接测量配体结合的标记物的实例包括放射性标记物，诸如3H或125I、荧光剂、染料、珠、化学发光剂、胶体颗粒等。适合的荧光染料是本领域已知的，包括异硫氰酸荧光素(FITC)；罗丹明和罗丹明衍生物；德克萨斯红；藻红蛋白；别藻蓝蛋白；6-羧基荧光素(6-FAM)；2',7'-二甲氧基-4',5'-二氯-6-羧基荧光素(JOE)；6-羧基-X-罗丹明(ROX)；6-羧基-2',4',7',4,7-六氯荧光素(HEX)；5-羧基荧光素(5-FAM)；N,N,N',N'-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)；磺化罗丹明；Cy3；Cy5；等等。优选地，待标记的化合物可与活性染料组合，所述活性染料与配体上存在的基团，例如胺基团、硫醇基团、醛基基团等等反应。
[0305] 在第二阶段的检测可例如通过添加识别跨膜靶的标记的跨膜抗体进行的情况下，标记物可以是能够在添加适合的底物之后提供可检测的产物信号的共价结合的酶。用于在缀合物中使用的适合的酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、苹果酸脱氢酶等。在非商购可得的情况下，此类抗体-酶缀合物通过本领域技术人员已知的技术容易制备。第二阶段的结合试剂可以是以足够的特异性结合跨膜靶分子使得它可与存在的其他组分区分开的任何化合物。在一个优选的实施方案中，第二阶段的结合试剂是配体特异性的抗体(单克隆或多克隆血清)，例如小鼠抗人抗体等等。
[0306] 对于信号的放大，配体可用剂诸如生物素、地高辛等等来标记，其中第二阶段试剂将包括亲和素、链霉亲和素、抗地高辛抗体等等作为适当的标记物。
[0307] 微阵列可例如通过使用扫描激光显微镜，通过荧光术，改进的ELISA酶标仪等等被扫描以检测配体的结合。例如，扫描激光显微镜可使用对于使用的每种荧光团合适的激发线进行单独的扫描。由扫描产生的数字图像然后被组合用于随后的分析。对于任何特定的阵列元件，一种标记物的荧光信号与来自其他标记物DNA的荧光信号的比可被比较，并确定相对丰度。
[0308] 检测靶跨膜分子的微阵列及方法可用于许多筛选、调查和诊断测定。在一个应用中，跨膜抗体的阵列可与来自生物体的总蛋白结合以监测膜结合蛋白的表达用于研究或诊断目的。用一种颜色的荧光团标记来自正常细胞的总蛋白并用另一种颜色的荧光团标记来自病变细胞的总蛋白，并且使两种样品同时结合至相同的阵列，允许差异性膜结合蛋白的表达被测量为两种荧光团强度的比。该二色实验可用于监测在不同组织类型、疾病状态、响应药物或响应环境因子中的表达。
[0309] 在筛选测定例如在确定一种膜结合蛋白或多种膜结合蛋白是否牵涉疾病途径或与疾病特异性表型相关的筛选测定中，测量可由培养的细胞进行。此类细胞可通过添加对感兴趣的靶或通路起作用的药理学活性剂进行实验操作。该应用可对生物学功能的阐明或治疗靶的发现是重要的。
[0310] 对于许多诊断和调查目的而言，测量血液或血清中的靶跨膜分子，例如膜结合蛋白的水平可以是有用的。该应用对与特定诊断或预后相关的临床上有用的跨膜标志物的发现和鉴别可以是重要的。例如，通过并行监测一系列抗体或T细胞受体的特异性，人们可确定跨膜抗体在自身免疫性疾病的过程期间、在感染期间，度过移植物排斥期间等等的水平和动力学。可选地，与感兴趣的疾病相关的新的膜结合蛋白标志物可通过比较正常血液样品和病变血液样品或通过比较在疾病的不同阶段的临床样品被开发。
[0311] 关于生物体的基因组中的膜结合蛋白表达的信息可具有多种应用，包括但不限于通过与表现型诸如疾病的发作、发展、疾病耐受性、疾病易感性或药物反应的相关性以个体化的方式诊断和治疗疾病(还称为“个体化医疗”)。与生物体的基因组中的生物途径相关的膜结合蛋白根据细胞特异性或组织特异性的鉴定和表征还可有助于设计用于具有增强的治疗效力和减少的副作用的疗法的转基因表达构建体。膜结合蛋白的表达根据细胞特异性或组织特异性的鉴定和表征还可有助于开发用于疾病的诊断、预防和治疗的功能性标志物。“疾病”包括但不限于生物体的可期望改变的任何状况、性状或特征。例如，状况可以是物理的、生理的或心理的且可以是有症状的或无症状的。
[0312] 在本发明的另一个实施方案中，将抗体阵列用于检测膜结合蛋白中的翻译后修饰，其在研究信号传导途径和细胞调节中可以是重要的。翻译后修饰可使用对蛋白的特定状态，诸如磷酸化、糖基化、法呢基化等等是特异性的抗体来检测。
[0313] 配体和跨膜多肽之间的这些相互作用的检测可导致医疗诊断。例如，病原微生物的身份可通过未知病原体的样品与包含许多类型的对已知的病原跨膜抗原特异性的跨膜抗体的阵列的结合被明确地建立。
[0314] 试剂盒
[0315] 在一个实施方案中，提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含跨膜抗体的文库。在一个实施方案中，提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含病毒体的文库，所述病毒体包含或表达膜结合蛋白。在一些实施方案中，跨膜抗体或病毒体的文库可被排列在支撑物，例如，96孔或384孔中。在一个实施方案中，试剂盒包含跨膜抗体的微阵列。在一个实施方案中，试剂盒包括病毒体的微阵列，所述病毒体包含或表达膜结合蛋白。试剂盒还可包括：报告物测定底物；用于诱导或抑制特定生物途径的试剂(细胞因子或其他纯化的蛋白、小分子、cDNA、siRNA等等)，和/或数据分析软件。
[0316] 另外，提供了试剂盒，所述试剂盒包括用于进行本发明的方法或用于利用本发明的任何组合物、文库、阵列或物品的组装物进行测试或测定的试剂和使用说明书。试剂盒还可包括使用试剂盒必需的缓冲液、酶、衔接子、标记物、二抗和使用说明书，任选地包括故障排除信息。
[0317] 在又另一个实施方案中，试剂盒可包括诸如本文描述的跨膜抗体的文库和病毒体的文库，所述病毒体包含或表达膜结合蛋白，诸如生物体的蛋白质组或膜结合蛋白质组。试剂盒可包括至少约0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、
70％、80％、90％或100％的生物体的蛋白质组。试剂盒可包括至少约0.5％、1％、2％、3％、
4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、
20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的生物体的膜结合蛋白质组。包含或表达膜结合蛋白的病毒体的文库可代表生物体的蛋白质组的大部分或整个生物体的蛋白质组，所述生物体的蛋白质组诸如细菌、病毒或真菌蛋白质组。包含或表达膜结合蛋白的病毒体的文库可代表昆虫或哺乳动物，诸如小鼠、大鼠、兔、猫、狗、猴、山羊或人的蛋白质组或膜结合蛋白质组的大部分或整个蛋白质组或膜结合蛋白质组。例如，生物体的蛋白质组文库可包含至少约11,000种、12,000种、13,000种、14,000种、15,000种、16,
000种、17,000种、18,000种、19,000种或20,000种不同的抗原。例如，生物体的蛋白质组文库可包含至少约100种、200种、300种、400种、500种、600种、700种、800种、900种、1,000种、
2,000种、3,000种、4,000种、5,000种、5,500种或5,600种膜结合蛋白。
70％、80％、90％或100％的生物体的蛋白质组。试剂盒可包括至少约0.5％、1％、2％、3％、
4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、
20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的生物体的膜结合蛋白质组。包含或表达膜结合蛋白的病毒体的文库可代表生物体的蛋白质组的大部分或整个生物体的蛋白质组，所述生物体的蛋白质组诸如细菌、病毒或真菌蛋白质组。包含或表达膜结合蛋白的病毒体的文库可代表昆虫或哺乳动物，诸如小鼠、大鼠、兔、猫、狗、猴、山羊或人的蛋白质组或膜结合蛋白质组的大部分或整个蛋白质组或膜结合蛋白质组。例如，生物体的蛋白质组文库可包含至少约11,000种、12,000种、13,000种、14,000种、15,000种、16,
000种、17,000种、18,000种、19,000种或20,000种不同的抗原。例如，生物体的蛋白质组文库可包含至少约100种、200种、300种、400种、500种、600种、700种、800种、900种、1,000种、
2,000种、3,000种、4,000种、5,000种、5,500种或5,600种膜结合蛋白。
[0318] 本文公开了可用于本文公开的方法和组合物、可与其联合使用、可用于为本文公开的方法和组合物做准备、或是本文公开的方法以及组合物的产物的分子、材料、组合物和组分。应当理解，当这些材料的组合、子集、相互作用、组等等被公开并且尽管多种个体组合和集合性组合的每一种以及这些分子和化合物的置换的具体参考未能被明确公开，每个都被本文具体包括和描述。例如，如果核苷酸或核酸被公开并讨论，并且讨论了可对许多分子包括核苷酸或核酸做出的许多修饰，除非另有具体的相反指示，核苷酸或核酸以及可能的修饰形式每一种组合和置换被明确包括。该概念适用于本申请的所有方面，包括但不限于制备和使用所公开的方法和组合物的方法中的步骤。因此，如果存在可被进行的多种另外的步骤，应该理解，这些另外的步骤的每一个可与公开的方法的任何特定的实施方案或实施方案的组合一起进行，并且每个此类组合被具体地包括并且应当认为被公开。
[0319] 尽管本文描述的一些实施方案已被本文显示并描述，这些实施方案仅通过示例的方式提供。本领域技术人员现在将会作出许多改变、变化和替换，而不不偏离本文提供的公开内容。应该理解，在实践本文描述的方法中可采用本文描述的实施方案的多种可选形式。
[0320] 除非另外说明，否则本文使用的所有技术术语和科学术语具有与由本公开内容所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。以下参考文献包含了可在本文使用的方法和组合物的实施方案：The Merck Manual of Diagnosis and Therapy，第18版，由Merck Research Laboratories出版，2006(ISBN 0-9119102)；Benjamin Lewin,Genes IX，由Jones&Bartlett Publishing出版，2007(ISBN-13:9780763740634)；Kendrew等(编著)，The Encyclopedia of Mol.Biology，由Blackwell Science Ltd.出版,1994(ISBN 0-632-02182-9)；以及Robert A.Meyers(编著),Mol.Biology and Biotechnology:a
Comprehensive Desk Reference，由VCH Publishers,Inc.出版，1995(ISBN1-56081-569-
8)。
Comprehensive Desk Reference，由VCH Publishers,Inc.出版，1995(ISBN1-56081-569-
8)。
[0321] 本公开内容的标准程序例如在Maniatis等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,USA(1982)；Sambrook等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版),Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,USA(1989)；Davis等，Basic Methods in Molecular Biology,Elsevier Science Publishing,Inc.,New York,USA(1986)；或Methods in Enzymology:Guide to Molecular Cloning Techniques第152卷,S.L.Berger和A.R.Kimmerl(编著),Academic Press Inc.,San Diego,USA(1987))中描述。Current Protocols in Molecular Biology(CPMB)(Fred M.Ausubel，等编著，John Wiley and Sons,Inc.)，Current Protocols in Protein Science(CPPS)(John E.Coligan，等编著，John Wiley and Sons,Inc.)，Current Protocols in Immunology(CPI)(John
E.Coligan，等编著，John Wiley and Sons,Inc.)，Current Protocols in Cell Biology(CPCB)(Juan S.Bonifacino等编著，John Wiley and Sons,Inc.)，Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Technique by R.Ian Freshney，出版社：Wiley-Liss；第5版(2005)，以及Animal Cell Culture Methods(Methods in Cell Biology，第57卷,Jennie P.Mather和David Barnes编著，Academic Press，第1版，1998)。
E.Coligan，等编著，John Wiley and Sons,Inc.)，Current Protocols in Cell Biology(CPCB)(Juan S.Bonifacino等编著，John Wiley and Sons,Inc.)，Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Technique by R.Ian Freshney，出版社：Wiley-Liss；第5版(2005)，以及Animal Cell Culture Methods(Methods in Cell Biology，第57卷,Jennie P.Mather和David Barnes编著，Academic Press，第1版，1998)。
[0322] 应当理解，以下实施例不应该被解释为限于本文描述的具体方法、方案和组合物等等，并因此可变化。本文所用的以下术语仅用于描述具体实施方案的目的，并且不预期限制本文所公开的实施方案的范围。实施例
[0323] 以下实施例已被包括以向本领域普通技术人员提供用于实践代表性实施方案的指导。根据本公开内容和本领域技术人员的一般水平，本领域技术人员可以理解，以下实施例预期仅是示例性的，且可采用许多变化、修改和改变而不偏离本公开的主题的范围。以下合成的描述和具体实施例仅预期用于说明的目的，并且不被解释为以任何方式限制通过其他方法制备本公开内容的化合物。
[0324] 实施例1
[0325] 为了开发展示呈它们的天然构象的人膜结合蛋白的新的高通量平台，利用疱疹病毒体作为制造病毒体展示微阵列(称为VirD阵列)的媒介物。疱疹病毒，例如单纯疱疹病毒1型(HSV-1)，产生包含高拷贝病毒糖蛋白的大的包膜病毒体，所述糖蛋白诸如在圆形病毒体结构中规则地分布的三种主要糖蛋白gB、gC和gD。另外，该病毒的DNA基因组可被遗传操作以表达呈它们的天然构型的外来蛋白或将外来蛋白表达为与病毒蛋白的融合物。开发了用于VirD阵列的两个策略：1)将全长人开放阅读框(ORF)克隆在gB基因座处，并且将基因在强gB启动子的控制下表达；2)将人ORF与gC的跨膜(TM)和胞质结构域融合，并且将gC基因座处的嵌合基因在gC启动子的控制下表达(图1a)。以前的研究还利用了gC嵌合体方法(丙型肝炎病毒糖蛋白E2)以及从gC基因座(CD4)的表达，以将外来蛋白掺入HSV-1病毒体(Dolter等(1993)J.Virol.67:189-95；Kouvatsis等(2007)Virus Res.123:40-9)。gB或gC的不存在不影响病毒在感染的细胞中组装成熟的包膜病毒体的能力(Cai等(1987)J.Virol.61:714-21；Holland等(1984)J.Virol.52:566-74；Homa等(1986)J.Virol.58:281-9)。为了测试两种方法的可行性，选择CD4作为具有单个TM结构域的典型的I型膜蛋白和GPR77作为多次跨越的G-蛋白偶联受体膜蛋白的代表。CD4是充分表征的T淋巴细胞的膜糖蛋白，其与主要组织相容性复合体Ⅱ类抗原相互作用并且还是人类免疫缺陷病毒的受体(Carr等(1989)J.Biol.Chem.264:21286-95)。GPR77与鉴定的典型配体(即，补体组分C5a)一起参与固有免疫应答的补体系统(Cain&Monk(2002)J.Biol.Chem.277:7165-9)。采用两个策略以在HSV-1病毒体中表达和展示这两种人膜蛋白。一个目标是检查这些人膜蛋白的表达以及向HSV-1病毒体中的掺入，并确定这些人膜蛋白在以高密度固定在玻璃表面上的纯化的病毒体中是否保持呈它们的天然形式。
[0326] 重组方法被用来制备四种病毒(参见下面的详细补充材料和方法)。重组病毒gB:CD4和gB:GPR77在天然gB启动子的控制下表达gB基因座处的全长人膜蛋白。V5表位标签也被掺入在两种蛋白的C-末端用于生化检测目的。标示为CD4-gC和GPR77-gC的病毒表达融合至gC的C末端结构域(即，497至511aa)的人膜蛋白，所述gC的C末端结构域(即，497至511aa)包含锚定至病毒被膜所需的TM和短的胞质结构域。类似克隆在gB基因座处的人基因，将gC嵌合体克隆在gC基因座处在天然gC启动子的控制下。
[0327] 为了检查CD4和GPR77是否被表达并通过分泌途径被正确加工，将用重组的且亲本病毒感染的人成纤维细胞用针对CD4、GPR77和HSV-1gD的胞外结构域的抗体染色以确定细胞表面定位(图1b)。gD在感染的细胞的表面上被检测到(图1b；插图)。从gB启动子表达的或作为gC嵌合蛋白表达的CD4显示细胞表面上的相似强的信号。GPR77在细胞表面上被检测到，但取决于其是否从gB启动子表达或作为gC嵌合体表达而具有不同的分布。这些结果显示了如同gD，从HSV-1基因组表达的CD4和GPR77经由典型分泌途径被递送至质膜的表面。CD4和GPR77还展示预期的细胞内分布，如通过用V5抗体染色判断的(图1b；右图)。当用抗CD4或抗V5抗体染色时，CD4的细胞内分布是相似的(图3)。
[0328] 使用总的感染的细胞裂解物的免疫印迹分析获得了至少加V5标签的人蛋白的表达的进一步的生化证据(图1c；左图)。还检查了这些人膜蛋白的病毒体掺入。野生型和gB空(K082)病毒体(Cai等(1987)J.Virol.61:714-21)，以及gB:CD4病毒体、gB:GPR77病毒体被纯化并经历用抗V5抗体的相同的免疫印迹分析。gB:CD4病毒体和gB:GPR77病毒体两者在CD4和GPR77的预期分子量处显示了强的抗V5反应性，而在其他病毒体中未观察到可检测的信号(图1C；右图)。抗gD抗体用作上样对照。总之，这些数据证实了，CD4和GPR77两者被合成并掺入感染的人细胞中产生的病毒体中。
[0329] 为了证明人蛋白可在病毒体掺入之后以正确的方向展示，进行了用识别CD4胞外域的PE标记的抗体染色的纯化的病毒体的流式细胞术分析(图1d)。将Venus荧光蛋白掺入衣壳中的HSV-1重组病毒被用于鉴定和门控纯化的病毒体(参见以下补充材料和方法)。K082病毒体被用作抗体结合特异性的阴性对照。从门控的病毒体群体内检测到的PE荧光的量来判断，85.5％的gB:CD4病毒体标记有PE抗体，且(轻微更多的)96.1％的CD4-gC病毒体结合至PE抗体。这些结果与来自使用相似实验条件的不同病毒体制品的数据一致。该观察结果使用用于检测的化学发光底物使用标准ELISA分析进一步被证实(图4)。如所预期的，所有病毒体制品用抗gD抗体来染色。表达CD4或GPR77的病毒体用各自的抗体来染色。CD4和GPR77抗体与KOS病毒体或K082病毒体存在很少或没有反应性。用抗gD抗体观察到的信号显著更高，因为该单克隆抗体对其抗原的更高的亲和力。综合考虑，这些结果证明，人膜蛋白以可被识别这些蛋白的胞外结构域的抗体识别的正确方向被掺入，表明它们以它们的天然构象嵌入病毒体包膜中。
[0330] 为了测试这些重组病毒体是否可以以高密度被固定在微阵列格式中，同时保持它们的功能完整性，将重组病毒体以不同滴度点制在不同的玻璃表面上。使用抗gD抗体，确定硝酸纤维素涂覆的载玻片(即，FAST)提供每个点低至50,000个病毒体(KOS噬斑形成单位)的最佳检测，且抗gD信号在滴度增加至>400,000个病毒体之后开始达到饱和(图5)。因此，决定将用七种不同的病毒制品以4×4的格式以每个点800,000个病毒体(KOS噬斑形成单位)的滴度来构建VirD阵列。
[0331] 为了可视化和检查玻璃上固定的病毒体的完整性，将这些阵列用抗gD胞外域和抗VP5抗体染色，其中后者识别主要衣壳蛋白VP5。所有七种病毒体显示了强的抗gD信号，但低得多的抗VP5信号，表明固定的病毒体的绝大多数是完整的(图2a中；左图)。该结论由VirD阵列上的抗gD信号在使用NP40的温和去垢剂处理将病毒体包膜剥去之后被大大减少的观察结果进一步支持(图2A；右图)。相比之下，在该处理之后，强的抗VP5信号在所有七种病毒体中被观察到。此外，用抗gB抗体和抗gC抗体染色VirD阵列证实了gB蛋白和gC蛋白分别在gB:CD4/GPR77和CD4/GPR77-gC中的不存在(图6)。
[0332] 由于糖基化对人膜蛋白活性是重要的，采用荧光标记的凝集素(即，SNA-Ⅱ、PHA-L、CA和WGA)以表征VirD阵列上的聚糖结构(Tao等(2008)Glycobiology 18:761-9；Kung等(2009)Mol.Syst.Biol.5:308)。野生型、gB-KO(K082)和gC-KO(gCΔ39)(Homa等(1986)J.Virol.58:281-9)病毒体之间凝集素染色模式的比较表明，gC与gB相比被更为高度地糖基化，因为所有四个凝集素显示了对gC-KO病毒体弱得多的结合信号(图2b)。识别Galβ(1-4)GlcNAc、GalNAcβ(1-4)GlcNAc或NeuAcα(2-6)Galβ(1-4)GlcNAc的凝集素CA染色模式的更加仔细的分析揭示了CD4很可能被糖基化。这是因为CD4-gC(即，gC-)病毒体显示比gC-KO和GPR77-gC(即，gC-)病毒体显著更高的信号。该观察结果通过相同的SNA-II(识别末端Galβ、GalNAcβ或NeuAcα(2-6)Galβ(1-4)GlcNAc)染色模式被进一步支持，因为已知的是，基于在功能糖组学协会(Consortium for Functional Glycomics)(CFG)网关(ISSN:1752-184X)的凝集素特异性数据库，SNA-II应识别与CA识别的相同的聚糖结构或部分的聚糖结构(图
2b)。有趣地，非常相似的聚糖结构NeuAcα(2-3)Galβ(1-4)GlcNAc先前使用质谱方法对在CHO细胞中表达的小鼠CD4被鉴定，间接地支持本文的观察结果(Carr等(1989)
J.Biol.Chem.264:21286-95)。因此，人CD4很可能被NeuAcα(2-6)Galβ(1-4)GlcNAc糖基化。
然而，与GPR77相关的特定聚糖结构未能明确确定，可能是由于在该研究中使用的凝集素的有限数目。无论如何，以上结果表明，病毒体展示的人膜蛋白显示了预期的糖基化。
2b)。有趣地，非常相似的聚糖结构NeuAcα(2-3)Galβ(1-4)GlcNAc先前使用质谱方法对在CHO细胞中表达的小鼠CD4被鉴定，间接地支持本文的观察结果(Carr等(1989)
J.Biol.Chem.264:21286-95)。因此，人CD4很可能被NeuAcα(2-6)Galβ(1-4)GlcNAc糖基化。
然而，与GPR77相关的特定聚糖结构未能明确确定，可能是由于在该研究中使用的凝集素的有限数目。无论如何，以上结果表明，病毒体展示的人膜蛋白显示了预期的糖基化。
[0333] 为了确定固定在玻璃表面的病毒体表面上展示的人CD4和GPR77蛋白是否处于正确的方向，VirD阵列用抗体来染色，每种识别CD4或GPR77的胞外域(图2c和2d)。分别在gB:CD4和CD4-gC、gB:GPR77和GPR77-gC病毒体中观察到强的且特异性的染色信号，表明这些蛋白处于正确的方向且两种膜蛋白展示策略均起作用。
[0334] 最后，为了证明病毒体展示的人膜蛋白呈活性构象，VirD阵列用荧光标记的典型配体，GPR77的补体过敏毒素C5a来探测(参见以下更详细的补充材料及方法)。如在图2d右图中所示，Cy5标记的C5a显示了对阵列上的GPR77-gC病毒体强的结合活性，但对gB:GPR77病毒体较弱的结合信号。在其他病毒体中未观察到可检测的信号，表明VirD阵列上的C5a和GPR77之间的相互作用是高度特异性的。综合考虑，这些结果证明，GPR77在病毒体上正确地展示，并在VirD阵列上保持其功能性构象。
[0335] 使用不同的载体系统以多种格式展示可溶性肽或蛋白是有效的(Li(2000)Nat.Biotechnol.18:1251-6)。在本研究中，显示了VirD阵列的制造，其将人膜蛋白展示展示在以高密度固定在固体玻璃表面的工程化HSV-1病毒体的包膜上。使用抗体和凝集素表明，两种人膜蛋白CD4和GPR77处于正确方向并潜在地被糖基化。通过与其同类配体C5a的结合测定进一步证明了，病毒体展示的GPR77呈其活性构象。VirD阵列方法具有优势，所述优势包括但不限于：1)展示的人膜蛋白嵌入人细胞膜中，其是可帮助保持它们的天然构象的在生理学上更为相关的环境；2)如用GPR77证明的，具有多个TM结构域的膜蛋白可能在病毒体包膜中被正确折叠；3)由于病毒利用了人的分泌途径，展示的人蛋白随着它们通过分泌途径转运可能保持它们的典型翻译后修饰(PTM)；这经由凝集素结合测定被证明；以及4)VirD阵列预期容易地转化为高含量平台，该平台可在单个玻璃载玻片上展示几乎所有的接近它们的天然构象的人膜蛋白。在此类高通量平台被建立之后，其将允许进行针对膜蛋白的新的药物靶鉴定的高通量筛选，以鉴定多种类型的受体的配体，以及表征膜蛋白的PTM。
[0336] 补充材料和方法
[0337] 细胞和病毒.Vero细胞、转化的Vero细胞系和人包皮成纤维细胞(HFT)在补充有10％胎牛血清(fetal calf serum)(Gibco-Invitrogen)的最小基本培养基-α培养基中生长并如Desai等所描述的传代(Desai等(1998)Virology247:115-24)。HFT是用表达人端粒酶的逆转录病毒转导的永生化细胞系(Hahn等(1999)Nature 400:464-8)。D6(UL27转化的)被用作宿主细胞用于从gB基因座表达基因的重组病毒的生长(Cai等(1987)J.Virol.61:
714-21)。A1.1(UL27和UL28转化的)细胞系(Tengelsen等(1993)J.Virol.67:3470-80)用于标志物救援/标志物转移方法以将克隆的人基因引入gB基因座(Desai等(1994)Virology
204:312-22)，并来自匹兹堡大学的Fred Homa的惠赠。亲本野生型病毒毒株KOS(HSV-1)和突变且重组病毒的储备溶液如先前所描述的来制备(Desai等(1998)Virology 247:115-
24)。
714-21)。A1.1(UL27和UL28转化的)细胞系(Tengelsen等(1993)J.Virol.67:3470-80)用于标志物救援/标志物转移方法以将克隆的人基因引入gB基因座(Desai等(1994)Virology
204:312-22)，并来自匹兹堡大学的Fred Homa的惠赠。亲本野生型病毒毒株KOS(HSV-1)和突变且重组病毒的储备溶液如先前所描述的来制备(Desai等(1998)Virology 247:115-
24)。
[0338] 抗体.对人CD4和GPR77反应性的抗体购自Santa Cruz Biotechnology和Sigma-Aldrich。用于流式细胞术分析的PE缀合的抗CD4抗体从BD Biosciences获得。V5单克隆抗体购自Invitrogen Life Technologies。抗HSV-1gB抗体克隆B6和抗gC抗体来自Joseph Glorioso(匹兹堡大学)的惠赠。抗HSV-1gD抗体DL6来自David Johnson(OHSC)和Gary Cohen以及Roz Eisenberg(Penn University)的惠赠。VP5抗体LP12由Tony Minson(University of Cambridge,UK)友好地提供。
[0339] 质粒.质粒pKΔ4B由Cai等(Caiet al.(1988)J.Mol.Biol.201:575-88)在糖蛋白B基因中工程化接头-插入物突变体之后获得。编码gB的氨基酸43至711的DNA序列被缺失，并且添加BglII限制性酶切位点以保持蛋白阅读框。(Cai等(1988)J.Mol.Biol.201:575-88)。pKΔ4B用Xho1和BglII来消化，用热敏磷酸酶(NEB)来处理，并与从pKΔ4B扩增的Xho1-BglII PCR片段连接，所述Xho1-BglII PCR片段缺失从1-43的所有gB氨基酸(gBΔSS)但保留gB启动子序列(表1)。该质粒被命名为pKgBΔSS。跨越711至796的gB氨基酸序列通过盒式PCR诱变从pKgBΔSS缺失。将PCR片段作为BglII-BamH1克隆进pKgBΔSS中并且所得质粒被标示为PKgBPR。人CD4序列和GPR77序列从来自Ultimate ORF集合(Life Technologies)的质粒扩增。编码V5表位的序列被包括在反向引物中(表1)。最终的gB启动子驱动的基因的质粒被标示为pKgB:CD4和pKgB:GPCR77。进行不同质粒的序列分析，然后引入病毒基因组。质粒用BamH1线性化用于同源重组。
[0340]
[0341]
[0342] 标志物救援/标志物转移测定.UL28的标志物救援和gB:人ORF基因的标志物转移使用Desai等人(Desai等(1994)Virology 204:312-22)描述的方法来完成。60mm培养皿中的A1.1细胞单层(1×106个)使用磷酸钙沉淀法用25μl感染的细胞DNA(KΔ4BX)和0.1-0.05μg线性化的质粒DNA进行共转染。当噬斑开始出现时(转染72h之后)，收获细胞单层、冻/融一次、进行声处理和总病毒子代滴定。重组病毒通过在D6细胞上的单个噬斑纯化来分离。另外的噬斑纯化通过对D6细胞系的有限稀释来进行。
[0343] Red-ET重组.将KOS BAC37基因组(Gierasch等(2006)J.Virol.Methods 135:197-206)转移进TOP10细胞(Stratagene)中用于该方法。KOS BAC37由David Leib,Dartmouth University,NH友好地提供。将gC嵌合体融合物工程化进病毒基因组中的程序使用提供的Gene Birdges Red-ET方法和方案(Zhang等(2000)Nat.Biotechnol.18:1314-7)。由gC同源序列包围的卡那霉素盒使用gC-Kan-F和gC-Kan-R引物以及pRPSL-neo作为模板来扩增。该卡那霉素基因被引入KOS BAC37替换gC基因。在下一步骤之前，针对链霉素敏感性筛选卡那霉素平板上生长的菌落。CD4-gC和GPR77-gC融合基因使用表1中列出的引物使用重叠PCR方法制备。CD4-gC和GPR77-gC嵌合体融合物使用表1中列出的RedET引物来扩增，并用于替换卡那霉素基因。携带正确嵌合基因的成功的分离株可通过PCR测定来鉴定，并且BAC基因组中的插入的基因在重构感染性病毒之前被测序。
[0344] 转染杆粒DNA以重构感染性病毒.携带糖蛋白C嵌合基因融合物的KOS杆粒使用PureLink核酸纯化试剂盒(Life Technologies)来制备。使用Lipofectamine 2000试剂(Life Technologies)将杆粒DNA转染进12孔托盘中的Vero细胞(5X 105个)中。噬斑通常在3天之后开始出现，并且将该被感染的细胞的裂解物用于扩增和制备gC嵌合体病毒的每一种的工作储备液。
[0345] 蛋白印迹分析.感染的细胞提取物通过SDS-PAGE在MES缓冲液中分离并根据制造商的方案使用iBlot装置(Life Technologies)转移至iBlot膜(Life Technologies)。在室温伴随温和振荡将转移的膜用封闭缓冲液(具有5％脱脂牛奶的TBS)封闭一小时，并且然后在室温伴随温和振荡与一抗(在封闭缓冲液中1:5000稀释)孵育一小时。伴随振荡将膜用TBS+0.1％吐温20(TBST)缓冲液洗涤5min，持续3次。伴随温和振荡，将HRP缀合的抗小鼠抗体(GE Healthcare)以封闭缓冲液中5,000倍稀释在膜上孵育一小时。伴随振荡，将膜用TBST缓冲液洗涤5min，持续3次，并且与ECL Plus Western Blotting检测试剂(GE Healthcare)一起孵育5min，然后通过ImageQuant LAS 4000成像系统(GE Healthcare)来可视化信号。
[0346] 免疫荧光和共聚焦分析.在LabTek(#1硼硅酸盐玻璃)4孔室载玻片中的HFT细胞(6×105个细胞)以每细胞10个噬斑形成单位(PFU)的感染复数(MOI)来感染。感染的细胞用DPBS(Dulbecco磷酸盐缓冲的盐水)洗涤2X，用在DPBS中的4％多聚甲醛固定25min；用DPBS洗涤2X并用在DPBS中的0.25％triton X-100透化。在透化之后，细胞用在DPBS中的3％BSA洗涤2X，并且在相同的缓冲液中持续30min阻断非特异性反应。对于细胞表面标记，去垢剂透化步骤被省略，并且细胞与封闭缓冲液孵育。将一抗在3％BSA/DPBS中稀释并且将250μl添加至每个室孔持续60min(室温)。随后，细胞用3％BSA/DPBS洗涤3X，并且然后与Cy3标记的二抗(Jackson Laboratories)孵育45min(室温)。然后细胞用3％BSA/DPBS洗涤3X，并且然后在Fluoromount G(EMS)中孵育，然后成像。染色的感染的细胞在Zeiss LSM 510共聚焦显微镜中分析。大多数图像用设置在1Airy单位的针孔来收集。
[0347] 病毒体制备.细胞外病毒体从HFT细胞来制备。通常，将100mm培养皿中的8.6×106个细胞以10PFU/细胞的MOI来感染。在感染后72h收获培养基，在4℃以3500rpm离心30min来澄清。将上清液分层放置在20％蔗糖垫(W/V在生长培养基中)上，并在Beckman SW41(39K持续30min)或SW32(24K持续60min)中离心。在4℃将病毒体团块重悬于PBS中过夜，并然后用于随后的分析。对于VirD阵列印制，将病毒体制品重悬于PBS加35％甘油中。
[0348] 流式细胞术.将细胞外病毒体(150μl体积)与PE缀合的流式抗体(20μl)孵育，并且在黑暗中在室温(tube rocker)孵育一小时。病毒体(将体积用PBS调整至500μl)然后在eppendorf管中以16000g通过20％蔗糖垫(250μl)沉淀60min。将上清液弃去，并且将病毒团块重悬于200μl PBS中。标记的病毒体在BD FACSARIA II仪器中使用DIVA软件(6.1.3版)来分析。
[0349] 酶联免疫吸附测定(ELISA).将病毒体的连续稀释液在Nunc MaxiSorp平底96孔白板中孵育。将封闭的平板在4℃孵育2天。在平台振荡器上将孔用PBS+0.02％吐温-20(PBS+T20)洗涤3X，每次5min，并然后在室温用PBS+T20中的2％BSA封闭60min。在封闭缓冲液中通常1:2000至1:250来制备一抗稀释液并孵育60min。HRP缀合的小鼠二抗以1:1000浓度使用。在一抗和二抗结合之后，将平板用PBS+T20洗涤3X，每次洗涤持续5min。反应根据制造商的程序使用SuperSignal ELISA Pico(Pierce)化学发光底物来定量，并且平板在Glomax光度计中读取以确定相对光单位(425nm)。
[0350] VirD阵列制造.将纯化的病毒体排列在384孔板中，并以4x4模式连同BSA作为阴性对照一起被点制在FAST载玻片(Whatman)上。印制的阵列被储存在-80℃。
[0351] VirD阵列上的抗体测定.在室温伴随温和振荡将VirD阵列用封闭缓冲液(具有3％BSA的TBS)封闭一小时，然后在室温伴随温和振荡与一抗(在封闭缓冲液中1:1000稀释)孵育一小时。伴随振荡，将阵列用TBS+0.1％吐温20(TBST)缓冲液洗涤5min，持续3次。为了可视化人蛋白或病毒蛋白的存在，将Cy5标记的抗小鼠抗体(The Jackson Laboratory)以在封闭缓冲液中的1,000倍稀释在阵列上孵育。伴随振荡将阵列用TBST缓冲液洗涤5min，持续3次，用水短暂冲洗，并通过旋转干燥。最后，将载玻片用GenePix4000B扫描仪(MDS Analytical Technologies)来扫描。
[0352] 对VirD阵列的配体结合测定.在室温伴随温和振荡将VirD阵列在具有1％BSA的TBST中封闭1h。将C5a(Abcam)用Cy5NHS Easter(GE Healthcare)来标记，并在室温伴随温和振荡在VirD阵列上以在配体结合缓冲液(1mM MgCl2、2mM CalCl2、0.2％BSA和25mM HEPES，pH 7.4)中的1μM孵育1h。伴随振荡，将阵列在冰冷的洗涤缓冲液(在10mM HEPES中的0.5M NaCl，pH 7.4)中洗涤5min，持续3次，通过旋转干燥，并如以上所描述的进行扫描。
[0353] VirD阵列上的凝集素结合测定.伴随温和振荡将VirD阵列在具有1％BSA的PBS中封闭1h。凝集素(EY Laboratories)用Cy5NHS Easter(GE Healthcare)来标记，并且在室温伴随温和振荡在VirD阵列上以在具有0.5mM CaCl2和1％BSA的PBS中的1μg/ml孵育1h。伴随振荡，将阵列在PBST中洗涤5min，持续3次，通过旋转干燥，并如以上所描述的进行扫描。
[0354] 实施例2
[0355] 将编码膜结合蛋白的人ORF亚克隆进表达载体.
[0356] 为了将编码膜结合蛋白的人ORF的文库高效亚克隆进多种目的载体中(所有均符合读框(all in frame))而不使用限制性酶，利用了基于噬菌体λ整合蛋白的GATEWAYTM技术(图20)。将代表编码膜结合蛋白的人ORF的集合克隆进GatewayTM入门载体，其允许将插入物TM方便地克隆进多种Gateway 中。目的载体用于靶蛋白在多种宿主包括病毒体、大肠杆菌(E.coli)(图24)、酵母、杆状病毒、CHO细胞和哺乳动物细胞系以及无细胞转录和翻译偶联系统中的表达和功能分析。在获得文库之后，将人膜结合蛋白表达文库亚克隆进病毒体，使能够构建几乎完全的人膜结合蛋白质组微阵列(Hu-MBPM)。
[0357] 随后，亚克隆编码膜结合蛋白(约5,600种)的所有人ORF并且通过限制性酶切消化来证实成功率。用于产生蛋白从其表达的病毒体或表达载体的所有起始克隆，其ORF被完整地测序。200个随机选择的病毒体克隆的点测序显示了100％正确分配至孔，即，提供了集合质量方面的非常高的置信度。该整个集合的5'接合点被测序作为验证步骤。制备了集合的三个重复，入门质粒DNA从其中之一被提取，且该质粒DNA的质量在琼脂糖凝胶上被确定。然后将所得的重组体转化进细菌，且单菌落在包含Amp的LB琼脂板上选择。对于每个重组体，挑选四个单菌落以制备甘油储备液，其中的两个在96孔格式中被进一步处理以提取质粒DNA。所提取的质粒DNA用限制性酶来消化以释放插入物，并在琼脂糖凝胶上运行以检查载体和插入物尺寸作为成功亚克隆的指标。每个限制性酶切消化基于预期的插入物尺寸来评分，并确定成功率。通过测序对超过200个随机选择的LR克隆进行验证。将证实的LR构建体重新排列，以产生病毒体的表达克隆的主集。类似的大规模克隆在细菌表达载体中完成。该实验用人表达载体来重复，包括整个人膜结合蛋白表达文库的5'接合点测序。
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| 多通道表面等离子共振影像传感器 | 2020-05-13 | 410 |
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