[0002] 本申请要求2011年9月20日提交的美国临时
专利申请61/536,902的权益，通过引用将该申请的内容全文纳入本文。
[0004] 1.发明领域
[0005] 本发明属于用于
生物液体中分析物试验的质量对照物领域。
[0007] 临床诊断实验室中通常使用质量对照物材料来监测手动或自动化进行的试验所使用的试验设备、材料和方法的精确度和准确度。常用于测试的分析物的例子是药物、
激素、酶和
抗体；其它对于有经验的生物化学家是显而易见的。用于人样品试验的对照物通常通过向经加工的人基质(如人血清或人尿)添加已知量的目标分析物来制备，采用所述基质是因为诸如这些基质确保所述对照物对所有预期的分析差异与实际患者样品一样灵敏。这些对照物多数通过将完全形成的液体冻干来制备成固体形式，而留给使用者的仅是通过将其溶解在
水中来使该固体再水化的简单任务。
[0008] 市售可得的对照物(无论是供于单一分析物或多重分析物)通常都以双水平(bi-level)或三水平(tri-level)组合的形式提供，以提供高于、接近和低于各试验的医学诊断点的水平。例如，这些对照物多数
指定相关分析物的组(如
肿瘤标志物)，或通过一种类型的检测技术检测的分析物(如通过光度法检测的常规化学分析物或采用干化学测试条通过反射光度法检测的尿分析物)的组。所述对照物通常经设计、开发和优化以用于某些常规测试方法和技术，但不能用于这些常规应用以外的目的，尤其是需要不同浓度水平、不同试验方法和执行所述试验的不同原因的目的。
[0009] 由于试验架构、检测技术和试验供应来源的差异，临床诊断试验可能在以下这些因素上不同：如精确度、准确度、定量的限值、检测的限值、线性度和可报告范围。例如，某些分析物的测定缺少标准化，如医学诊断点特征方面的标准化，因此这些测定中提供的对照物不可完全互换，并且它们不可用于对照物给定范围以外的检测水平上的质量控制。例如，目前供应商之间对于肌
钙蛋白I的可用试验设计针对的诊断点之间的差异高达4倍。患者群也有差异，并且在一些情况下，患者群之间的诊断点差异很大以至于为一个患者群设计的对照物不适于另一个患者群。
发明内容
[0010] 本发明提供可由使用者在使用时制备并且让使用者能够根据特定的试验选择一种或多种分析物的可个体化的质量对照物，从而所述对照物反映对照物水平的数目、各对照物中分析物的浓度、基本基质和影响所述对照物应用的其它因素。因此，本发明涉及用于制备对照物的
试剂盒和用于制备对照物的方法。所述试剂盒物质由水性液体基质和含有所述一种或多种分析物的固体
水溶性珠组成。本文使用的术语“珠”表示球、粒或任何相似大小的固体，即，例如能够被
包装在瓶中并且单独使用或以小量使用的相似大小的固体。除所述分析物以外，珠可独立地含有膨胀剂来增加各珠的结构完整性，外加其它任选的组分以在其重建时帮助控制对照物的性质和质量。水性液体基质(也被称为基本基质)，是盐的水性溶液以及在人的生物液体或水中pH为约4.0～约9.0的缓冲液，并且在水中时，所述溶液优选还含有使基质具有生物学样品属性的人或动物来源的材料。所述珠和基本基质可以被运输并且单独出售或作为试剂盒的部分出售，并且可将它们在用于测试试验材料、设备或过程之前于使用地点即时合并，或由销售商合并且储存以备后用。未合并的珠和基质可在不需要特别的维持条件(如冷藏或冷冻)的情况下被运输和储存。
[0011] 本发明的这些和其它目的、特征和优势在下文中进一步描述。
[0012] 发明详述和所选实施方式
[0013] 可将水溶性的固体珠方便地制成球，而所述球的大小对于本发明的实用性或新颖性并非至关重要且可以变化。在许多情况下，直径为约3mm～约10mm的球是便于使用的。对于待用于单一分析物测定的对照，在本发明的某些实施方式中的各珠将含有所述单一分析物作为珠中仅有的生物来源物质，并且可以通过在单独的和等体积或不等体积的基本基质中溶解不同数量的珠来得到该分析物的不同浓度水平的对照物。本发明范围内的对照物也可通过在所述珠中包含两种或更多种分析物来配制供于多组分试验，即，用于同时检测或分开检测两种或更多种分析物的试验。在此，也可以通过在相同体积的基本基质的不同等份中溶解不同数量的珠来得到两种分析物的不同水平浓度的对照物。供于多组分试验的对照物也可以由含单一分析物的各珠制备，所述通过在单一体积的基本基质中合并不同分析物的珠来进行，从而让使用者对于对照物的设计和使用中更加灵活。可以通过在单独但是等体积的基本基质中使用不同数量的珠，或在不同体积的基本基质中采用相同数量的珠来获得不同水平的各分析物的组。
[0014] 各珠的分析物的量可具有宽变化范围，并且受到重建对照物的体积和各对照物所用的珠的最小数量的控制。例如，给定对照物的组可包含分析物的三个水平，因此单个珠中分析物的量可以是通过在一定体积的基本基质中重建单个珠能够获得含有最低分析物水平的对照物的量。使用者在形成对照组中所制备的水平的数目也可不同，并且在一些情况下少至两个水平就足够了。然而，在大多数情况下，会制备构成分析物的3个或更多个水平的对照物，从而让使用者能够检查试验反应的线性度，并且获得代表大约等于诊断点的水平以及高于和低于诊断点的水平的对照物。
[0015] 在本发明的某些实施方式中，所述珠将含有单一分析物并且不含除配方佐剂以外的其它物质，所述配方佐剂是包含以稀释所述珠中分析物浓度或增强或修饰所述珠的物理性质以及所述珠在基本基质中快速溶解或分散的能
力的物质。配方佐剂可具有如下作用，例如，在储存、运输或操作期间维持珠的物理完整性，使珠、分析物或两者具有化学
稳定性同时仍保持在珠的形式，当珠溶解于基本基质时维持重建对照物的离子强度或pH，或在不干扰检测分析物能力的各方面中的任何方面使重建的对照物具有人类样品的属性。某些珠可以含有两种或更多种分析物，虽然限于单一分析物的珠可以在其重建为对照物时具有更高的灵活性，因为含有两种或更多种分析物的对照物可通过合并各自含有单一分析物的不同的珠来制备，使实验室技术人员能控制或改变相关的量。优选的配方佐剂是不干扰对重建对照物中的分析物的检测的那些，所述干扰通过在不允许一种分析物与另一种分析物分开检测的情况下在与所述分析物的联合检测中遮蔽分析物，或以影响针对分析物测定的灵敏性的任何方式。珠中最好加以避免的物质包括除分析物以外的
蛋白质和免疫球蛋白。
[0016] 一种类型的配方佐剂是膨胀剂。一种或多种膨胀剂会通过帮助珠保持其形状来使珠具有物理完整性。可使用已知实现该效果的常规材料。膨胀剂的示例是甘
氨酸、山梨糖醇、甘露糖醇、乳糖、右旋糖、
白蛋白、卵清蛋白、明胶、多糖(如葡聚糖)，和亲水
聚合物(如聚乙烯基吡咯烷
酮)。在许多情况下，
牛血清白蛋白是特别方便的。对于技术人员，珠制剂中的膨胀剂的合适体积是显而易见的，并且实际值对于本发明的新颖性或实用性并非至关重要。例如，当由水性溶液的冻干物形成珠时，在许多情况下，冻干前的溶液将含有约0.3g～约3g的膨胀剂/分升溶液。
[0017] 另一种类型的配方佐剂是盐，其可以被包含以在珠溶解于基质时维持基本基质的离子强度。因此，珠中盐的最优量将是在基本基质的盐浓度与重建对照物的盐浓度之间至多产生最小差异的量。同样，用由水性溶液的冻干物形成的珠作为示例，在冻干前，水性珠溶液的盐浓度范围可以是约10mM～约300mM。盐本身可以是与生物样品相容并且在对照物中以与在待分析样品中相同方式起作用的任何盐。
氯化钠是用于此类应用的常用盐。
[0018] 第三种类型的配方佐剂是将重建对照物维持在所需pH下的缓冲液。如上述引用的范围所示，所述珠的pH可具有宽变化范围，但是对于用于人和其它
哺乳动物对象的一般试验的对照物，pH范围通常是中性到弱
碱性。在许多情况下，最优pH水平将在约6.2～约8.5的范围内。合适的缓冲剂的示例是三(羟甲基)氨基甲烷(Tris碱)、三(羟甲基)氨基甲烷
盐酸(Tris-HCl)、双(2-羟乙基)亚氨基三-(羟甲基)甲烷(Bis-Tris碱)、双(2-羟乙基)亚氨基三-(羟甲基)甲烷盐酸(Bis-Tris-HCl)和N-2-羟乙基-哌嗪-N-2-乙磺酸(HEPES)。
[0019] 可以通过任何常规方式制备用于本发明的珠，其中最方便的是通过从其中溶解有最终珠组分的水性溶液冻干。在冷冻和
升华之前，溶液的体积可具有宽变化范围，虽然在大多数情况下，约5μL～约1000μL的体积将提供最佳结果。冻干使珠组分免于因暴露于升高
温度所致的降解或使所述降解最小化。
[0020] 在本发明的某些实施方式中的基本基质中包含的人或生物来源物质可以是人血清白蛋白、牛血清白蛋白或任何其它白蛋白或一般与人血清白蛋白类似的蛋白质。当人血清白蛋白或牛血清白蛋白也作为膨胀剂包含在珠中时，其含量优选很低以至于珠在基本基质中溶解时不会导致重建对照物的浓度与重建前的基本基质浓度明显不同。因此，当珠中的膨胀剂是牛血清白蛋白(BSA)而基本基质中的添加剂是人血清白蛋白(HSA)时，从中形成珠(例如，通过冻干)的水溶液中BSA的浓度可以是基本基质中HSA浓度的例如十分之一～三分之一。
[0021] 基本基质可以一定的渗透压提供，该渗透压提供最接近待分析样品的重建对照物。基于这些考虑，渗透压水平可具有宽变化范围，虽然在大多数情况下，采用约50mOsm/kg～约1000mOsm/kg的渗透压可以实现最佳结果。可以通过(如在珠本身中)纳入盐来控制渗透压。再次用氯化钠作为方便的示例，在两者中可以采用相同类型的盐。可(如在所述珠中)方便地采用相同缓冲剂来使基本基质带缓冲。
[0022] 也可以从已经处理以去除可能干扰特定试验的内源性分析物的人和动物来源的物质制备基本基质。这些来源的物质的示例是人
全血、
血浆、血清、尿以及
口腔和滑液。可通过过滤、沉淀、酶和
热处理分解，和色谱分离(如亲和分离、离子交换和尺寸排阻)来实现内源性分析物的去除。
[0023] 基本基质的其它任选组分是稳定剂和抗
微生物剂。稳定剂的示例是蛋白酶
抑制剂、螯合剂、
冷冻保护剂、还原剂、交联剂和
表面活性剂。抗微生物剂的示例是叠氮化钠、环丙沙星、氯霉素、庆大霉素、丁胺卡那霉素、妥布霉素和两性霉素B。对于技术人员，这些添加剂在其应用中的合适的量将是显而易见的。
[0025] 从水性溶液中制备五种不同分析物的单一分析物珠，其中，分析物的浓度比重建对照物中分析物目标浓度高100～200倍，以计入重建后的稀释因子。用于制备珠的各水性溶液的配方示于表I。
[0026] 表I：冻干前的珠组成
[0027]
[0028]
[0029] 从各溶液制备的20个珠各测试4次，每种分析物总共观察80次来确定珠与珠的差异。结果列于表II。
[0030] 表II：单一分析物珠的特征
[0031]
[0032]
[0033] 实施例2.基本基质的制备
[0034] 基本基质通过在水中溶解并混合人血清白蛋白、NaCl和HEPES缓冲液以获得表III所列的浓度来制备。
[0035] 表III：基本基质的组成
[0036]
[0037] 一旦组分溶解，即用稀释的HCl或NaOH将该溶液的pH调至7.8。然后使该溶液在无菌条件下通过0.2μm膜滤器过滤进入250～500mL无菌聚苯乙烯容器中，在小玻璃瓶中各填充3mL或5mL并加盖，然后在2～8℃下储存以防止微生物生长。然后采用市售可得的试验品来测定基本基质中实施例1的各种分析物的水平，并且被发现所述水平低于所述试验的
检测限值。
[0038] 实施例3.对照物的制备和性能
[0039] 通过在
选定体积的基本基质中使选定数量的分析物珠(各有确定浓度和测定浓度)再水化来制备个体化的对照物，以获得各水平的对照物的所需浓度。均在使用时制备的几个三水平单一分析物对照物和一个多重分析物对照物的恢复数据列于表IV，显示各对照物水平所用珠数量、所用基本基质的体积和各对照物水平的所得分析物浓度。
[0040] 表IV：针对三水平对照物检测的分析物水平
[0041]
[0042]
[0043] 通过在35℃、41℃和47℃的升高温度下分别储存未重建的珠的瓶39天、22天和13天来进行
加速的稳定性研究作为对保存期限的预测，其中假定了20千卡/摩尔活性，均将大致等同于2～8℃下4年。然后，使珠在升高温度下孵育一定时间之后重建，然后测定分析物浓度/恢复性。结果示于表V。
[0044] 表V：加速的稳定性研究
[0045]
[0046] 开瓶(使用中)的稳定性研究通过如下方式进行：重建珠并且在2～8℃下的
冰箱中储存含有重建的珠的瓶并在14天中每天将它们从冰箱中移出，允许它们在室温下平衡15分钟，打开瓶并且将它们的内容物暴露于大气，然后在30秒后将其关闭来模拟一般的使用，并且将其放回在2～8℃下的冰箱中。使样品瓶应激14天，并且在研究结束时同时比较分析物恢复性与测试的新鲜重建的珠的分析物恢复性。结果表明在14天的时间内，相比它们的原始值，分析物浓度/活性变化少于10％。
[0047] 在所附的
权利要求书中，术语“一个”或“一种”是用来表示“一个(种)或多个(种)”。当术语“包含”及其各种变体例如“包括”和“含有”位于叙述步骤或要素之前的时候，是用来表示添加其它的步骤或要素是任选的，并且是非排它性的。当术语“基本由……组成”位于叙述物质或一列组分之前时，也用来表示除了这些所列物以外的物质或组分的添加是任选的并且非排他性的，但是可能存在的此类额外物质或组分以痕量或很小以至于不影响本发明的功能性的量存在。本
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